KR20160083610A - 초과(Amomi Tsao-ko)로부터 분리된 화합물 및 이의 항염 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초과로부터 분리한 우수한 염증성 질환 치료 효과가 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 건강기능식품 조성물 및 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 염증성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 염증성 질환 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있으며, 본 발명의 유효성분인 2,8-데카디엔-1,10-디올(2,8-decadiene-1,10-diol) 화합물은 초과 에탄올 추출물의 분획물로부터 분리한 천연물 유래의 화합물로서, 합성 의약품에 비하여 부작용의 염려가 없는 안전한 치료제를 제공할 수 있다.

Description

초과(Amomi Tsao-ko)로부터 분리된 화합물 및 이의 항염 용도{A compound isolated from Amomi Tsao-ko and anti-inflammatory use thereof}

본 발명은 초과로부터 분리한 우수한 염증성 질환 치료 효과가 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 건강기능식품 조성물 및 상기 약학적 조성물을 염증성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 염증성 질환 치료 방법에 관한 것이다.

염증은 조직의 손상, 외부의 자극 또는 다양한 감염원에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로, 혈관과 체액 내의 각종 염증 매개 인자 및 다양한 면역 세포의 유기적 상호작용으로 인한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 세포 침윤 및 체액 삼출, 순환 장애, 조직의 변질 및 과증식 등 일련의 복합적인 병리 현상이다. 염증반응의 과정은 초기에 대식세포가 상처부위로 모여들어 침입한 세균을 공격한 후, 상처부위에 혈장이 축적되고 혈류가 증가되어 발열, 홍반, 부종, 통증 현상 등의 외적 증상이 일어나게 된다. 이러한 염증 반응이 지속적으로 또는 과도하게 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 알러지 질환, 만성 염증 질환)으로 진행되며, 심각한 이상 장애를 초래하게 된다.

대부분의 염증 질환의 치료제로서 널리 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하므로 장기간의 사용에 있어서 제약이 따르는 실정이다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42, pp3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal., Rheumatology., 7, pp139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al., Pharmaceuticals., 3, pp1530-1549, 2010). 따라서, 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없으면서 항염증 효능에 탁월한 새로운 소염 진통제의 개발이 널리 요구되고 있으며, 이는 최근 천연 자원으로부터의 효능 검증을 통한 소재 개발 연구가 활성화되고 있는 이유이기도 하다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로, 화학적 자극에 의하여 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 산화질소(NO)를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 염증반응의 결과로서, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의해 생성된 산화질소의 상기 생리학적인 농도(Supraphysiological concentrations)가 다양한 염증 질환의 병리생물학에 있어서 역할을 하고 있다(Kobayashi Y. et al., J Leukoc Biol., 88, pp1157-62, 2010). 염증반응의 유도 물질들 중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 백혈구와 같은 면역세포와 상호작용을 하며, 단핵세포의 대식세포들에 있어서 iNOS 이소 형태의 활성화에 의한 산화질소 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있다(Korhonen R. et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy., 4, pp471-79, 2005). LPS는 그람음성 세균의 외막(outer membrane)에 존재하는 엔도톡신(endotoxin)이며, TLR4(toll-like receptor 4)와의 결합은 IL-6(interleukin-6) 및 케모카인(chemokines) 등 많은 사이토카인 유전자의 활성화를 이끄는 신호전달을 개시하고, 이는 그 부분의 염증을 유도한다(Dobrovolskaia MA, et al., J Immunol., 170, pp508-19, 2003; Ji Y, et al., Cell Physiol Biochem., 25, pp631-640, 2010). 특히 인터페론γ, TNF-α와 같은 사이토카인 자극에 의해 발현되는 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS)는 장시간 동안 다량의 질소산화물(NO)을 생산한다. 이러한 산화적 스트레스는 IκB에 의하여 억제되어 있는 염증 반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 NFκB는 핵으로 이동하여 iNOS, IL-1β나 TNF-α와 같은 여러 종류의 사이토카인 등 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 이들 인자들을 저해하면 염증 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Karin M. et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, pp1-14, 2009). 질소산화물(NO)은 세 가지 주요한 질소산화물 합성효소(NOS) 이성질체인 nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS), iNOS(inducible NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된다. nNOS와 eNOS는 Ca^{2 +}/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 산화질소는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생화학적 과정에 관여하며, 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NFκB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236: 658-671, 2011; Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94, 1999; Stamleret al., Science, 258: 1898-1902, 1992).

또한, 다양한 연구를 통하여 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-1β(IL-1β) 등이 염증반응을 하도록 촉진하는 사이토카인의 한 종류로 알려져 있으며(Punzi L. et al., Crit Rev Clin Lab Sci., 2002, 39(1): 63-88), 이는 류마티스 관절염(Jang C. H, et al., Rheumatology, 2006, 45(6): 703-710), 섬유근통(Hernandez M. E. et al., BMC Res. Notes., 2010, 3(1): 156), 쇼그렌 증후군(Baturone R. et al., Scand J Rheumatol., 2009, 38(5): 386-389) 등 많은 염증성 질환과 관련하는 것으로 알려져 있다.

상기와 같은 연구결과는 산화질소(NO) 생성을 억제하거나, TNF-α, IL-6, IL-1β 등의 사이토카인 생성을 억제하는 물질을 탐색하면, 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 물질로 판명할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 염증성 질환과 관련하여, 식물 유래 화합물의 필요성이 대두되고 있다. 즉, 천연물로부터 생리활성 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 질병에 대한 치료 및 예방제 등으로 식물 자원이 널리 이용되고 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 산화질소 생성을 억제하여 염증질환을 치료할 수 있는 식물 유래 화합물을 찾기 위해 노력한 결과, 초과 추출물의 분획물로부터 항염활성을 가진 화합물을 분리하여, 상기 화합물을 분석 및 동정하고, 상기 화합물의 산화질소 및 염증성 사이토카인의 분비 억제를 확인함으로써, 염증성 질환의 예방, 치료 및 개선 용도를 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 초과 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 염증성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 2,8-데카디엔-1,10-디올(2,8-decadiene-1,10-diol)로 명명된다. 본 발명의 화합물은 일반적인 화학 합성에 의해서도 수득할 수 있으나, 바람직하게는 상기 화합물은 초과(Amomum tsao - ko)와 같은 천연물로부터 분리한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 초과 에탄올 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 초과는 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관에서 유래될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 초과로부터 상기 화합물을 분리해냈으며, 상기 화합물의 분자량 측정, 분자식 추정 및 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR) 분석법에 의한 구조 확인 결과, 2,8-데카디엔-1,10-디올 화합물임을 확인하였다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는 동일한 효능을 나타내는 용매화물, 수화물 및 입체이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.

본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화학식 1의 화합물을 0.0001 내지 99.9 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 산화질소(NO), TNF-α, IL-6 또는 IL-10의 분비를 억제함으로써 항염활성을 가짐을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 화학식 1의 화합물의 세포 독성을 측정한 결과, 세포 독성이 없음을 확인하여 약학적 조성물로의 사용 가능성을 확인하였으며, 염증 유발 인자인 산화질소(NO), TNF-α, IL-6, IL-1β, NOS2 및 COX-2의 생산 및 분비를 억제하는 효과가 우수함을 확인함으로써, 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 2 내지 도 5).

본 발명에서 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 또는 다발성 경화증일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로, 일일 투여량은 바람직하게는 화학식 1의 화합물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 초과 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화합물, 염증성 질환, 약학적 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 분획물은, (a) 초과를 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 초과 추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 (a)의 초과 추출물을 유기용매로 분획하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 (a) 단계는 초과를 추출용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 초과 추출물을 수득하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "초과(Amomi Tsao - ko)"는 생강과에 속하는 초과의 열매를 말린것을 의미하며, 초과자, 노구 또는 초과인 등으로 불리며, 비위를 덥게 하고 습을 제거하며 복통, 복부창만, 메스꺼움, 구토 및 설사 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 초과는 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "초과 추출물"은 초과를 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 초과 추출물은 초과 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C₁) 내지 4(C₄)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 더욱 바람직하게는 에탄올을 사용한다. 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과 추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 초과 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 상기 초과 추출물은 천연, 잡종, 변종식물 등으로부터 추출 가능하다.

본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 (a)의 초과 추출물을 유기용매로 분획하여 분획물을 수득하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 상기 유기용매는 고체, 기체, 액체를 녹일 수 있는 액체 유기 화합물로서, 당업계에서 통상적으로 사용하는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 부탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 아세톤, 아세토니트릴, 벤젠 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄, 메탄올, 에틸아세테이트 또는 부탄을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 디클로로메탄 또는 메탄올을 사용할 수 있다.

상기 분획물은 (1) 초과 에탄올 추출물을 물에 용해시키고, 상기 용해물에 디클로로메탄을 혼합하여 물층과 디클로로메탄층을 분리하는 단계; (2) 상기 디클로로메탄 분획부를 분리하고, 이를 여과, 감압농축 및 회전증발하여 디클로로메탄 분획물을 수득하는 단계; (3) 상기 디클로로메탄 분획물을 n-헥산에 용해시키고, 상기 용해물에 메탄올을 혼합하여 n-헥산층과 메탄올 층을 분리하는 단계; 및 (4) 상기 메탄올 분획부를 분리하고, 이를 여과, 감압농축 및 회전증발하여 메탄올 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.

상기 분획물은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 더욱 세분화시킬 수 있는데, 컬럼 크로마토그래피는 고정상 알갱이를 크로마토관에 기둥 모양으로 채워서 넣고 진행하는 크로마토그래피법으로서, 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으며, 바람직하게는 상기 충진제는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(toyopearl) 또는 XAD 수지를 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 염증성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 젤제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선크림 로션, 모발손질 제품, 에어프레쉬너 젤 또는 세정 젤일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 화합물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증성 질환 의심 개체는 염증성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 염증성 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환 의심 개체에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 공수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물은 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용할 수 있으며, 본 발명의 유효성분인 2,8-데카디엔-1,10-디올(2,8-decadiene-1,10-diol) 화합물은 초과 에탄올 추출물의 분획물로부터 분리한 천연물 유래의 화합물로서, 합성 의약품에 비하여 부작용의 염려가 없는 안전한 치료제를 제공할 수 있다.

도 1은 초과(Amomum tsao - ko)로부터 화학식 1의 화합물을 분리하는 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포에서 화학식 1의 화합물의 NO 생성 억제 효과를 확인한 것이다. 1㎍/㎖의 LPS(lipopolysacharide)를 처리하여 RAW 264.7 세포를 자극시켰다. 각 웰의 배지를 무혈청 배지로 교체하고 다양한 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200μM)의 2,8-데카디엔-1,10-디올을 24시간 동안 처리하였다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D. 값을 나타낸다. 데이터의 통계적 유의성은 *P<0.01 이다.
도 3은 RAW 264.7 대식세포의 세포 생존률을 나타낸 것이다. RAW 264.7 세포에 화학식 1의 화합물을 다양한 농도(6.25-200μM)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존률은 MTT 분석을 통해 측정한 것이며, 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D. 값으로 나타내었다.
도 4는 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물의 염증 관련 유전자 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 RT-PCR 데이터이다.
도 5는 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물의 COX-2 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다. 화학식 1의 화합물 처리는 COX-2 및 iNOS 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제시켰다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± S.D. 값을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 초과 추출물 및 분획물의 제조

경동시장에서 구입한 건조 초과 9.5kg에 80%의 에탄올을 가하고 실온에서 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기(EYEKA사, N-100, 일본)를 이용하여 에탄올을 제거하고, 추출된 잔사로서 초과 조추출물 538.5g을 얻었다.

상기 조추출물에서 활성 분획물을 분획하기 위하여, 초과 조추출물을 증류수로 현탁시켰다. 동량의 디클로로메탄을 가하여 혼합하여 디클로로메탄 가용성 분획부와 수가용성 분획부를 분리하였고, 이를 여과, 감압농축 및 회전증발하여 디클로로메탄 분획물 146g을 수득하였다. 그런 다음, 상기의 디클로로메탄 분획물을 제거하고 남은 물층에 에틸아세테이트를 동량 가하여 같은 방법으로 에틸아세테에트 분획물 40g을 수득하였으며, 또 다시 남은 물층에 부탄올을 동량 가하여 동일한 방법으로 부탄올 분획물 85g을 수득하였다. 그리고 상기 디클로로메탄 분획물을 n-헥산에 현탁시켰다. 동량의 50% 메탄올을 가하여 같은 방법으로 n-헥산 분획물 65g과 50% 메탄올 분획물 81g을 수득하였다.

실시예 2. 분획물로부터 활성성분의 분리

상기 실시예 1에서 수득한 50% 메탄올 분획물을 n-헥산과 아세톤을 혼합용매 (1:0, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 v/v), 디클로로메탄과 메탄올 혼합용매 (5:1, 2:1, 1:1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다(도 1). 순차적 용리법에 의해 13개의 소분획으로 나누었고 (G47-4-1 내지 G47-4-13), 이 중 소분획 G47-4-9에 대하여, 1:1 비율의 클로로포름과 메탄올 혼합 용매를 전개용매로 하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성 성분인 하기 화학식 1의 2,8-데카디엔-1,10-디올 (2,8-decadiene-1,10-diol)을 분리하였다.

[화학식 1]

실시예 3. 화합물의 항염 활성 평가

실험에 사용한 RAW264.7 마우스 대식세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고, 이를 10% FBS(Fetal bovine serum)/DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 넣고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다.

상기 화학식 1의 화합물에 대한 세포 내 항염 활성을 평가하기 위해, RAW264.7 마우스 대식세포를 96-웰 플레이트에 5×10⁴ 세포/웰의 세포 수로 분주하고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 96웰-플레이트에 시료를 농도별로 1시간 동안 처리한 뒤, 내독소로 작용하여 산화질소(NO) 합성의 유도자(mitogen)로 쓰이는 LPS(lipopolysacharide) 1㎍/㎖와 함께 24시간 동안 배양하여 항염 활성 평가에 활용하였다. NO 분석을 통한 항염 활성 평가는 그리스(griess) A, B 시약을 이용한 방법으로, 1% 설프아닐아마이드(sulfanilamide), 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride) 시약을 1:1 비율로 혼합하여 사용하였다. 상기 화학식 1의 화합물은 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200μM의 농도로 각 배양액에 처리하였고, 96-웰 플레이트에서 상기 화합물 처리 후 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양된 배지의 상등액을 그리스 (A+B) 시약과 1:1 비율로 각각 50㎕씩 혼합하여 10분간 상온에서 보관한 후 540nm에서 ELISA 측정을 통해 대조군 대비 NO 생성 억제능을 측정하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이 상기 화학식 1의 화합물의 농도가 높을수록 NO의 분비량이 감소함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 화합물의 세포 독성 평가

96웰-플레이트 내에 남아있는 배지를 제거하고 5mg/㎖ MTT 시약(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)이 10% 포함된 무혈청 배지를 각 웰에 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하고 난 뒤, 100% DMSO 시약(Dimethyl sulfoxide)을 100㎕/웰씩 처리하고 플레이트 로테이터에서 15분간 보관한 후 ELlSA 리더를 이용해 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 및 시료의 독성 유무를 확인하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 식에 대입하여 세포 생존률을 계산하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

세포 생존률(%) = [(대조군 O.D.-시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100

그 결과, 도 3에 나타나듯이, 상기 화학식 1의 화합물이 세포에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 화합물 처리에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 확인

RAW264.7 마우스 대식세포주를 10% FBS, 100 unit/㎖의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지와 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 처리하였다. 이후 상기 화학식 1의 화합물을 농도별(50, 100, 200μM)로 1시간 동안 우선 처리하고 내독소로 작용하여 NO(Nitric oxide) 합성의 유도자(mitogen)로 쓰이는 LPS(lipopolysacharide)를 1㎍/ml의 농도로 처리하였다. 시료 처리 24시간 후, PBS (Phosphate buffered saline)로 세척한 뒤, Trizol (Invitrogen)과 클로로포름(chloroform, Sigma)을 넣고 반응 시켜 RNA를 분리하였다.

분리된 RNA를 이용하여 정량 후 역전사 효소인 Superscript (Invitrogen)를사용하여 역전사 연쇄중합반응을 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 열변성과정 (Denaturation) 95℃ 1분, 결합반응 (annealing) 55℃ 30초, 중합반응 (extension) 72℃ 1분의 25 사이클 조건의 중합효소 연쇄반응을 통해 각각의 사이토카인을 합성하였다.

정량 분석을 위하여 사이토카인과 대조군 유전자인 GAPDH 프라이머를 이용하여 유전자의 발현 억제 효과를 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 비교하였다.

상기 화학식 1의 화합물에 대해 작용 메커니즘 탐색을 위한 염증성 사이토카인의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과, 염증 관련 유도 인자로 알려진 COX-2와 NOS2 및 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-1β, IL-6, TNF의 발현이 상기 화학식 1의 화합물의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것이 확인되었다(도 4).

실시예 6. 화합물 처리에 의한 염증관련 유도 인자의 발현 확인

상기 실시예 5와 동일한 방법에 의해 상기 화학식 1의 화합물이 농도별로 처리된 RAW264.7 세포를 PBS로 세척 후 용해 완충액(RIPA 완충액, protease inhibitor)에 용해시켰다. 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심 분리하여 단백질을 추출하였다. 정량된 단백질을 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eletrophoresis)를 이용하여 전기영동 후 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 0.1% Tween 20과 4% BSA를 포함하고 있는 Tris-buffered saline으로 블록킹하여 1차 항체와 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체에 반응시킨 후, ECL 웨스턴 검출 시약으로 단백질 (COX-2, NOS2)의 발현을 확인하였다.

염증 관련 유도 인자인 COX-2와 NOS2의 단백질 발현을 확인해본 결과, RT-PCR 결과와 마찬가지로 상기 화학식 1의 화합물의 처리에 따라 염증 관련 유도 인자들의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 5).

이와 같은 결과들로부터 화학식 1의 화합물이 염증성 질환의 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루프스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrom) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
   
3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 초과(Amomi Tsao - ko) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
4. 제3항에 있어서, 상기 분획물은
   (1) 초과 에탄올 추출물을 물에 용해시키고, 상기 용해물에 디클로로메탄을 혼합하여 물층과 디클로로메탄층을 분리하는 단계;
   (2) 상기 디클로로메탄 분획부를 분리하고, 이를 여과, 감압농축 및 회전증발하여 디클로로메탄 분획물을 수득하는 단계;
   (3) 상기 디클로로메탄 분획물을 n-헥산에 용해시키고, 상기 용해물에 메탄올을 혼합하여 n-헥산층과 메탄올층을 분리하는 단계; 및
   (4) 상기 메탄올 분획부를 분리하고, 이를 여과, 감압농축 및 회전증발하여 메탄올 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조한 것인 조성물.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루프스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrom) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
   
6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 염증성 질환 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환 치료 방법.

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