KR20160057470A

KR20160057470A - Dna 단부 수복, 아데닐화, 인산화를 위한 효소 조성물

Info

Publication number: KR20160057470A
Application number: KR1020167010150A
Authority: KR
Inventors: 주디타 루비엔; 아르투라스 베레즈니아코바스; 아르비다스 루비스
Original assignee: 써모 피셔 사이언티픽 발틱스 유에이비
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2016-05-23
Also published as: EP3049518A1; WO2015044262A1; US20150087557A1; CN105722978A; CN105722978B; US20190010482A1; JP2016535979A; EP3049518B1; US10023856B2

Abstract

즉석 이용 마스터 혼합물을 제공하는 효소 조성물 및 이들의 이용 방법. 이들 조성물은 T4 DNA 중합효소, 클레노브 단편 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 예혼합된, 5'-3'와 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하는 변형된 고온성 DNA 중합효소, 그리고 1개 튜브에서 및 2 단계에서 DNAx 평활화, 인산화와 단일 뉴클레오티드 연장 반응을 수행하는데 필요한, 반응 완충액과 뉴클레오시드 삼인산염을 비롯한 모든 다른 필요한 성분을 포함한다. 다른 이익 중에서, 상이한 효소, 완충액과 뉴클레오시드 삼인산염의 혼합물은 연장된 보관 동안 안정된다.

Description

DNA 단부 수복, 아데닐화, 인산화를 위한 효소 조성물{ENZYME COMPOSITION FOR DNA END REPAIR, ADENYLATION, PHOSPHORYLATION}

본 출원은 2013년 9월 25일자에 제출된 U.S. 특허 출원 일련 번호 61/882,480, 그리고 2013년 11월 15일자 제출된 61/904,543에 우선권을 주장하고, 이들은 각각 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

고처리량 DNA 염기서열결정을 위한 여러 방법 (Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309 (2005) 728-1732)는 DNA 표본이 무작위로 단편화되는 보편적인 증폭 반응에 의존하고, 이후 상이한 단편의 단부 모두가 동일한 DNA 서열을 내포하도록 처리된다. 보편적인 단부를 갖는 단편은 증폭 프라이머의 단일 쌍으로 단일 반응에서 증폭될 수 있다. 증폭에 앞서 단일 분자 수준까지 단편의 라이브러리의 분리는 증폭된 분자가 별개의 개체군을 형성하도록 담보한다. 이들 별개의 개체군은 이후, 더욱 분석될 수 있다. 이런 분리는 유제 내에서 (Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)), 또는 표면 상에서 (Nucleic Acids Research 27, e34 (1999); Nucleic Acids Research 28, e87 (2000)) 수행될 수 있다.

중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되는 표적의 단부 위에 보편적인 기폭 서열을 부가하는 것은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 5' 단부에서 보편적인 서열 및 3' 단부에서 축중성 서열을 내포하는 보편적인 프라이머가 복합체 표적 서열 또는 표적 서열의 복합체 혼합물로부터 무작위로 단편을 증폭하기 위해 PCR (DOP-PCR, 가령, PNAS 93 (1996) 14676-14679)에서 이용될 수 있다. 프라이머의 축중성 3' 부분은 무작위 DNA 위치에서 어닐링하고, 그리고 5' 단부에서 보편적인 서열을 갖는 표적의 사본을 산출하기 위해 확장될 수 있다.

대안으로, 보편적인 기폭 서열을 내포하는 어댑터가 표적 서열의 단부 위에 결찰될 수 있다. 어댑터는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 어댑터는 돌출부 단부를 가질 수 있거나 또는 평활 말단을 가질 수 있다. 돌출부 단부를 갖는 어댑터는 제한 엔도뉴클레아제로 소화에 의해 산출되거나, 또는 DNA 중합효소 또는 말단 전달효소가 첨가될 수 있었던 표적 서열 상에서 돌출부 단부에 상보적이다. 평활 말단을 갖는 어댑터는 또한 평활 말단이고, DNA를 단편으로 전단하는 과정 동안 형성되거나, 또는 당업자에게 공지된 바와 같은 단부 수복 반응에 의해 형성된 표적과 함께 이용된다.

단일 어댑터 또는 2개의 상이한 어댑터가 표적 서열과의 결찰 반응에서 이용될 수 있다. 표적이 이의 단부가 동일하거나, 다시 말하면, 둘 모두 평활이거나 또는 둘 모두 동일한 오버행을 갖도록 조작되었다면, 단일 양립성 어댑터의 결찰은 양쪽 단부 상에 상기 어댑터를 갖는 주형을 산출할 것이다. 하지만, 2개의 양립성 어댑터, 어댑터 A 및 어댑터 B가 이용되면, 결찰된 산물의 3가지 순열이 형성된다: 양쪽 단부에서 어댑터 A를 갖는 주형, 양쪽 단부에서 어댑터 B를 갖는 주형, 그리고 한쪽 단부에서 어댑터 A 및 다른 단부에서 어댑터 B를 갖는 주형. 이러한 최종 산물은 단지 일부 상황 하에서만 결찰 반응으로부터 원하는 산물이고, 그리고 결과적으로, 이것을 양쪽 단부에서 동일한 어댑터를 갖는 결찰 산물로부터 정제하기 위해 결찰 반응 이후에 추가 정제 단계가 필요하다.

많은 분자생물학 연구 기술과 적용, 예를 들면, 차세대 염기서열결정 (NGS)을 위한 DNA 라이브러리를 제조하는 것은 관심되는 DNA 단편의 양쪽 단부에 합성 DNA 어댑터를 부가하는 것을 필요로 한다. 합성 어댑터는 통상적으로 다음의 단계에 의해 부가된다: (1) 관심되는 DNA 표본이 물리적으로 또는 효소적으로 전단되고, (2) 결과의 DNA 단편이 평활화되고 인산화되고, (3) 평활화된 DNA 단편의 3' 단부가 1개의 뉴클레오티드, 선호적으로는 dATP에 의해 연장되고, (4) 결과의 DNA 단편이 그들의 3' 단부에서 dTTP 연장을 갖는 어댑터에 결찰된다. 표적 DNA 단편의 dA-테일링은 이들이 다른 DNA 단편과 분자내 또는 분자간 결찰을 형성하는 것을 예방하고, 따라서 예상된 구조의 단편의 수율을 증가시킨다.

DNA 단편의 양쪽 단부 수복/평활화와 dA-테일링 반응은 먼저 DNA 평활화와 인산화 반응을 더욱 낮은 온도에서 수행하고, 그리고 이후, 평활화된 DNA 단편의 테일링을 더욱 높은 온도에서 수행함으로써 하나의 튜브에서 행위될 수 있는 것으로 최근에 인식되었다. 유사한 방식으로 작동하는 상업적인 NGS 표본 제조 키트가 가용하다 (NxSeq DNA 표본 준비 키트, Lucigen; NEBNext Ultra DNA 라이브러리 준비 키트, NEB로부터 Illumina; PureGenome HE NGS 라이브러리 준비 시약, EMD Milipore). 하지만, 단지 EMD Millipore만 DNA 3'단부 말단 연장에 이용된 효소를 개시한다: 고온성 NovaTaq DNA 중합효소. 다른 두 공급업체는 당업자가 고온성 DNA 중합효소가 dA 테일링 단계에도 이용된다고 생각하게 만드는, 산물 이용 권고 (65-72℃에서 항온처리)를 제공한다. 표 1은 New England Biolabs, EMD Milipore, 그리고 Lucigen으로부터 DNA 단부 수복과 dA-테일링 반응의 상업적인 시약과 프로토콜을 보여준다.

NEB와 Lucigen 산물은 시약 세트를 대표하는데, 여기서 DNA 단부 수복 (평활화와 인산화)과 dA-테일링 반응에 필요한 모든 효소는 사용자에 의해 단일 혼합물 (효소 칵테일)로 합동된다. 하지만, 반응 완충액은 별도로 공급되고, 그리고 효소와 즉석 이용 마스터 믹스로 예혼합되지 않는다. EMD Milipore 키트는 별개의 바이알에서 제공된 DNA 단부 수복과 dA-테일링 반응물의 모든 성분을 포함한다. 다른 공급업체는 2-성분 작업 흐름을 제안하는데, 여기서 관심되는 DNA 단편은 먼저 평활화되고 인산화되고, 그리고 이후, 첫 번째 단계 효소의 비활성화 또는 제거 후, dA-테일링 효소가 첨가된다.

2가지 충분히 특징화된 중합효소가 일반적으로, 많은 클로닝 프로토콜에서 이용된 dA-테일링 반응에 대한 바람직한 효소로서 권장된다: 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성에서 결함되는 중온성 클레노브 단편 돌연변이체, 또는 고온성 Taq DNA 중합효소. 비-주형 지향된 합성을 수행하는 이들 효소의 능력, 예를 들면, DNA 단편의 DNA 3' 단부에서 추가 뉴클레오티드를 부가하는 것은 당업자에게 공지되어 있다.

하지만, 양쪽 효소는 일정한 선호를 전시하는 것으로 알려져 있는데, 이들 중에서 가장 중요한 것은 이들이 3' 단부에서 피리미딘 (dT 또는 dC)을 소유하는 DNA 단편의 3'-말단 연장 및 3'-말단 퓨린 (dA 또는 dG)을 갖는 DNA 단편의 단지 부분적인 연장을 선호한다는 것이다. 결과적으로, 비효율적 dA-테일링 반응 후 남아있는 평활 DNA 단편은 분자간 결찰 반응에 참여할 수 있고, 따라서 선천적 상태에서 유전체 내에 존재하지 않는 하이브리드 DNA 분자를 형성할 수 있다. 이런 하이브리드 분자가 그들의 3' 단부에서 dA 연장을 내포하는 경우에, 어댑터 서열이 이들에 부가될 수 있고, 그리고 이런 분자는 이후, 염기서열결정 반응으로 진행할 수 있다. 라이브러리 제조물이 많은 이런 키메라 분자를 내포하면, 이들은 추후, 유전체 서열 어셈블리를 복잡하게 만들거나 또는 훼손할 수 있다. NGS 적용에서 키메라 DNA 분자는 염기서열결정된 유전체의 어셈블리를 훼손할 수 있다. 따라서, NGS 라이브러리 제조 적용에 대한 선입견 없는 DNA 단편 단부 수복/테일링을 위한 향상된 효소 조성물이 필요하다.

개시된 효소 조성물은 연장된 보관 동안 안정되었고, 그리고 또한, dA-테일링 단계에서 전통적으로 이용되는 고온성 Taq DNA 중합효소 및 중온성 클레노브 단편 엑소^- 돌연변이체와 비교할 때, 더욱 우수한 효율 및 더욱 적은 바이어스를 전시하였다. 개시된 조성물에서 dA 테일링 반응을 위해 이용된 효소는 키메라 DNA 중합효소인데, 이것은 5'-3', 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 소유하지 않고, 테르무스 (Thermus) 종 DNA 중합효소 및 비특이적 DNA 결합 도메인 사이에 융합에 의해 산출된다. 본 발명에서 이용된 이런 키메라 DNA 중합효소를 산출하는데 적합한 DNA 결합 도메인은 제한 없이, 초고온성 원시세균 술폴로부스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus)로부터 Sso7d 기본 염색체 단백질 및 술폴로부스 아시도칼다리우스 (S. acidocaldarius)로부터 Sac7d 단백질을 포함하는 Sso 패밀리 DNA 결합 단백질로부터 DNA 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 효소는 5'-3'과 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 비특이적 DNA 결합 도메인 (mod-Tbr, Thermo Scientific DyNAmo^TM 산물에서 이용된 효소에 의해 구현됨, Microbial Strain Collection of Latvia에 기탁 (MSCL, 수탁 번호 P1397, 확인 참조 BL21(DE3)(pRAT5-DIVOpt))와 융합된 테르무스 브록키아누스 (Thermus brockianus) DNA 중합효소이다. 다른 구체예에서, 효소는 5'-3'또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 소유하지 않는 비특이적 DNA-결합 도메인 (mod-Taq), MSCL에 기탁 (수탁 번호 P1396, 확인 참조 ER2566(pLATE51-융합9))과 융합된 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 중합효소이다.

한 구체예는 즉석 이용 마스터 혼합물 ("마스터 믹스")에서 제공되는 개시된 효소 조성물이다. 마스터 믹스는 T4 DNA 중합효소, 클레노브 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 그리고 반응 완충액 및 뉴클레오시드 삼인산염을 포함하는 모든 다른 성분과 예혼합된 mod-Tbr 또는 mod-Taq를 내포하는데, 여기서 dATP 농도는 1개 튜브에서, 2-단계 반응에서 DNA 평활화, 인산화 및 dA 테일링 반응을 수행하기 위해 필요한 dGTP의 농도보다 10x 높고 dTTP와 dCTP의 농도보다 5x 높다. 상이한 효소, 완충액과 뉴클레오시드 삼인산염의 이런 혼합물은 -20℃ 온도에서 연장된 보관 동안 안정된다.

도면의 간단한 설명
도면 1은 실시예 2에서 각각 이용된 G, C, T와 A에서 종결하는 이중 가닥 올리고를 보여준다.
도면 2는 dA-테일링 효율을 보여주는 다양한 반응 완충액에서 클레노브 단편 엑소^-로 처리된 도면 1의 분리된 이중나선 올리고를 보여준다.
도면 3은 dA 테일링 효율을 보여주는 다양한 pH에서 다양한 반응 완충액에서 Taq DNA 중합효소로 처리된 도면 1의 분리된 이중나선 올리고를 보여준다.
도면 4는 dA-테일링 효율을 보여주는 다양한 기질 농도를 갖는 변형된 테르무스 브록키아누스 (Thermus brockianus) DNA 중합효소로 처리된 도면 1의 분리된 이중나선 올리고를 보여준다.
도면 5는 한 구체예에 따라, 한 반응 혼합물에서 DNA 단부 수복과 3' 말단 연장을 개략적으로 도해한다.
도면 6은 상이한 중합효소를 이용하여 한 반응 혼합물에서 DNA 단부 수복과 3' 말단 연장을 보여준다.
도면 7은 한 구체예에 따라, 설명된 조성물의 안정성을 보여준다.

한 구체예에서, 개시된 조성물은 다음의 성분을 포함한다:

효소:

1 u/μl T4 폴리뉴클레오티드 키나아제

0.32 u/μl T4 DNA 중합효소

0.12 u/μl 클레노브 단편

0.2 u/μl mod-Tbr DNA 중합효소

반응 보조인자와 뉴클레오티드:

20 mM MgCl₂

2 mM dATP

0.4 mM dCTP

0.4 mM dTTP

0.2 mM dGTP

2 mM ATP

조성물 이온 강도와 pH는 100 mM - 105 mM Tris-HCl, pH 8.3 및 20 mM 내지 50 mM 범위에서 변하는 농도에서 일가 금속 염화수소산 염, 예를 들면, NaCl, KCl, LiCl을 이용하여 공식화될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 다음의 안정제와 냉동보호제를 내포한다: 20 mM DTT, 0.2% Triton X-100, 12% (v/v) 글리세롤, 0.07% NP 40, 0.07% Tween 20, 그리고 0.024 mM EDTA.

한 구체예는 단일 용기, 예를 들면, 에펜도르프 유형 튜브, 96 웰 평판 또는 효소적 반응을 설정하는데 이용된 임의의 다른 맥관에서 DNA 단부 수복과 말단 뉴클레오티드 부가를 위한 방법이다. 한 구체예에서, DNA 단부 수복은 평활 말단이고 인산화된 DNA 단편을 산출하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, DNA 단편은 단일 용기에서 설명된 조성물과 혼합되고, 그리고 DNA 단편의 DNA 단부 수복과 뉴클레오티드 테일링은 단일 용기에서 수행된다. 한 구체예에서, 말단 뉴클레오티드는 아데노신이고, 이것은 DNA 단편의 3' 말단 단부에 부가되고, 그리고 dA 테일링으로서 지칭된다. 한 구체예에서, 단일 용기의 내용물은 DNA 단부 수복 반응을 증진하는 첫 번째 반응 조건에 종속되고, 그리고 이후, 용기의 내용물은 dA-테일링 반응을 증진하고 DNA 단부 수복 반응을 비활성화시키는 두 번째 반응 조건에 종속되고, 여기서 DNA 단부 수복 반응은 DNA 단편을 평활화하고 인산화하는 것을 포함하고, 그리고 dA-테일링 반응은 단일 dA를 단부 수복 DNA 단편의 3' 단부에 부가함으로써 DNA 단편의 아데닐화를 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 반응 조건은 단일 용기의 내용물을 5 내지 10 분의 포괄적 기간 동안, 18℃ 내지 22℃ 범위에서 변하는 포괄적 온도에 종속시키는 것을 포함하고, 그리고 두 번째 반응 조건은 용기 내용물을 10 내지 20 분의 포괄적 기간 동안 72℃ 내지 75℃의 포괄적 온도에 종속시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 반응 조건은 용기 내용물을 약 5 분 동안, 약 20℃의 온도에 종속시키는 것을 포함하고, 그리고 두 번째 반응 조건은 용기 내용물을 약 10 분 동안 약 72℃의 온도에 종속시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, dA-테일링된 DNA 단편의 수율은 75%를 초과한다.

한 구체예에서, 상기 방법은 DNA 단부 수복에 앞서, DNA 단편을 산출하는 것을 더욱 포함한다. DNA 단편은 물리적 DNA 전단 방법, 예를 들면, 초음파 분무, 그리고 수력학적 전단에 의해, 또는DNA분해효소I 또는 다른 엔도뉴클레아제를 이용한 효소적 소화에 의해 산출될 수 있다. 한 구체예에서, DNA 표본은 유전체 DNA를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 합성 DNA 어댑터를 뉴클레오티드 테일링된 DNA 단편의 한쪽 또는 양쪽 단부에 연결함으로써, DNA 라이브러리를 산출하는 것을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 단부 수복되고 dA-테일링된 DNA 단편을 dT 연장을 3' 단부에서 소유하는 합성 DNA 어댑터에 결찰하는 것을 더욱 포함한다.

한 구체예는 1-튜브 DNA 평활화와 dA 테일링에 대한 개시된 방법을 수행하기 위한, 개시된 조성물 및 사용설명서를 내포하는 키트이다. 한 구체예에서, 개시된 조성물은 0.5 u/μl -1.5 u/μl T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 0.2 u/μl -0.5 u/μl T4 DNA 중합효소, 0.1 u/μl -0.2 u/μl 클레노브 단편, 그리고 0.1 u/μl - 0.5 u/μl mod-Tbr DNA 중합효소; 반응 보조인자와 뉴클레오티드: 20 mM MgCl₂ 0.4 mM - 3 mM dATP, 0.2 mM - 0.6 mM dCTP, 0.2 mM -0.6 mM dTTP, 0.1 mM - 0.4 mM dGTP, 1.5 mM - 2.5 mM ATP; 이온 강도와 pH 조절제: 100 mM -105 mM Tris-HCl, pH 8.0 - 8.8; 20 mM 내지 50 mM 범위에서 변하는 일가 금속 염화수소산 염, 예를 들면, NaCl, KCl, LiCl; 그리고 안정제와 냉동보호제: 15 mM - 30 mM DTT; 0.1% - 0.4% Triton X-100; 10% - 20% (v/v) 글리세롤; 0.05% - 0.15% NP 40; 0.05% - 0.15% Tween 20; 그리고 0.02 mM - 0.1 mM EDTA를 포함한다.

한 구체예에서, 개시된 조성물은 효소: 1 u/μl T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 0.32 u/μl T4 DNA 중합효소, 0.12 u/μl 클레노브 단편, 그리고 0.2 u/μl mod-Tbr DNA 중합효소; 반응 보조인자와 뉴클레오티드: 20 mM MgCl_2,2 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4 mM dTTP, 0.2 mM dGTP, 2 mM ATP; 이온 강도와 pH 조절제: 100-105 mM Tris-HCl, pH 8.3; 20 mM 내지 50 mM 범위에서 변하는 일가 금속 염화수소산 염, 예를 들면, NaCl, KCl, LiCl; 그리고 안정제와 냉동보호제: 20 mM DTT; 0.2% Triton X-100; 12% (v/v) 글리세롤; 0.07% NP 40; 0.07% Tween 20; 그리고 0.024 mM EDTA를 포함한다.

본 발명은 이제, 다음의 실시예에 관하여 단지 예시로서 더욱 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1

상이한 효소가 상이한 완충액을 필요로 한다는 것의 입증

각 효소에 대한 최적 보관과 반응 조건은 상이한 것으로 당분야에서 알려져 있다. 효소 보관 조건은 종종, 다음의 상업적인 공급업체: Thermo Fisher Scientific, New England Biolabs 및 Life Technologies에 의해 판매되는 DNA 평활화, 인산화와 dA-테일링 효소의 보관과 반응 완충액의 성분을 보여주는 표 2에서 보여지는 바와 같이 권장된 반응 조건과 상이하다.

본 발명 조성물에 도달하기 위해, 모든 상기 지시된 효소 T4 DNA 중합효소, 클레노브 단편, T4 DNA 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 단부-테일링 활성을 갖는 변형된 고온성 중합효소, 예를 들면, 변형된 테르무스 브록키아누스 (Thermus brockianus) 또는 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 중합효소는 단일 단계에서 및 1개의 용기에서 DNA 단편의 효율적인 평활화, 인산화와 dA-테일링을 할 수 있는 안정된 블렌드로 예혼합되어야 한다. 이것은 결코 사소하지 않고, 그리고 심지어 당업자는 보관될 때 안정되고 효소적 반응에서 이용될 때 효율적일 혼합물을 획득하기 위해 다수의 보관과 반응 조건을 시험하는 것을 필요로 할 것이고, 그리고 최적 보관과 반응 조건을 결정할 것이라는 보장이 없다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 이런 혼합물에서 효소는 상이한 최적 요건을 가질 수 있는데, 이것은 이들을 단일 블렌드에서 양립할 수 없게 만든다. 게다가, 즉석 이용 1X-2X 효소 혼합물의 제조에서, 고도로 농축된 냉동보호제, 예를 들면, 글리세롤의 이용은 효소적 반응에 대한 그들의 부정적인 충격으로 인해 종종 부적절한데, 그 이유는 이들이 물리적 환경과 화학적 환경에 영향을 주어 변화된 반응 조건을 유발하기 때문이다. 또한, 높은 농도의 냉동보호제는 효소 활성에 대한 저해 효과를 가질 수 있다. 결과적으로, 단지 낮은 농도의 냉동보호제만 이용될 수 있는데, 이들은 종종, 효소 블렌드의 동결을 예방하는데 불충분하다. 이런 이유로, 복수 동결-해동 주기에서 효소 활성 상실의 매우 높은 위험이 존재한다. 한 효소에 필요한 첨가제는 성분 블렌드의 다른 효소의 보관 및/또는 촉매 활성에 유해할 수 있다. 완충 시스템에 이용된 염뿐만 아니라 그들의 농도, 그리고 즉석 이용 혼합물에서 pH에 대해서도 마찬가지다. 일반적으로, 즉석 이용 혼합물의 안정성은 일가 염 관용 및 충분한 이온 강도의 존재에 의해 결정된다. 일가 염은 금속, 예를 들면, Na, K, 또는 Li가 용해 상태에서 순 1⁺ 전하를 갖는 임의의 염일 수 있다.

DNA 단편 단부 수복/dA 테일링을 위한 안정된 효소 마스터 믹스를 제조하는데 있어서, 본 실시예에서 앞서 개시된 정보와 대조적으로, 효소 T4 DNA 중합효소, 클레노브 단편, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 그리고 mod-Tbr 또는 mod-Taq DNA 중합효소, 그리고 앞서 설명된 모든 다른 필요한 반응 성분을 포함하는 개시된 즉석 이용 조성물은 DNA 단편의 효율적인 1개 튜브 평활화, 인산화와 dA-테일링을 할 수 있게 하고, 이것은 75%를 초과하는 dATP-연장된 DNA 단편의 수율을 유발한다. 개시된 조성물은 다른 상업적인 NGS 표본 제조 키트와 비교할 때, DNA 단편의 제조, 예를 들면, NGS 라이브러리 제조에 필요한 피펫팅 단계의 숫자를 감소시키는 마스터 혼합물을 제공한다. 피펫팅 단계를 감소시키는 것은 NGS 라이브러리 제조 작업 흐름을 단순화시키는데, 그 이유는 이것이 더욱 적은 조작과 실무 시간을 수반하고, 오차를 최소화하고, 그리고 따라서, 표본 세트에 걸쳐 더욱 일관된 결과를 제공하기 때문이다. 개시된 조성 혼합물은 DNA 단편을 훨씬 짧은 반응 시간 내에 변형하는데, 그 이유는 이것이 DNA 단편을 20℃에서 5 분 내에 평활화하고 인산화하고, 그리고 72℃에서 10 분 이내에 그들의 3' 단부에서 dATP를 부가함으로써 이들 단편을 변형하기 때문이다. 따라서, 개시된 조성 혼합물을 이용하면, 양쪽 반응은 집합적으로 단지 15 분만 소요된다.

단부 전환 마스터 믹스로서 지칭되는, 개시된 조성물의 한 구체예가 시험되었다. 단부 전환 마스터 믹스는 다음의 2X 농도와 비율에서 효소, 완충액 및 다른 필요한 반응/보관 성분을 포함하였다: 1 u/μl T4 폴리뉴클레오티드 키나아제; 0.32 u/μl T4 DNA 중합효소; 0.12 u/μl 클레노브 단편, 그리고 0.2 u/μl mod-Tbr DNA 중합효소. 반응 보조인자와 뉴클레오티드는 다음과 같았다: 20 mM MgCl_2,2 mM dATP; 0.4 mM dCTP; 0.4 mM dTTP; 0.2 mM dGTP; 2 mM ATP. 단부 전환 마스터 믹스의 이온 강도와 pH는 100 mM - 105 mM Tris-HCl, pH 8.3 및 20 mM 내지 50 mM에서 일가 금속 염화수소산 염, 예를 들면, NaCl, KCl, LiCl을 이용하여 공식화될 수 있다. 안정제와 냉동보호제는 다음과 같았다: 20 mM DTT; 0.2% Triton X-100; 12% (v/v) 글리세롤; 0.07% NP 40; 0.07% Tween 20; 그리고 0.024 mM EDTA.

효소 블렌드에서 이용에 적합한 다른 염과 안정제는 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 평활화 및/또는 dA-테일링 반응에서 이용된 상이한 DNA 중합효소에 대해 상이할 수 있다.

실시예 2

평활화, 테일링, 그리고 인산화에 대한 완충액과 중합효소 조성물의 효과

DNA 단편 3' 단부 테일링 효율을 시험하고, 그리고 3' 말단 뉴클레오티드에 따라 잠재적 바이어스를 분석하기 위해, 길이와 3' 말단 뉴클레오티드 둘 모두에서 상이하고 그들의 5' 단부에서 Cy5로 표지화된 4개의 올리고이중나선의 모형 시스템이 개발되고 이용되었다 (도면 1).

클레노브 단편 엑소^- 돌연변이체의 dA-테일링 능력이 조사되고 도면 2에서 도시되었는데, 여기서 레인 (A)는 0.2 mM dATP로 보충된 최적 클레노브 단편 완충액 (10x 반응 완충액, EP0421)이고; 레인 (B)는 1 mM DTT 및 0.2 mM dATP를 포함하는 상업적인 완충액 G이고; 그리고 레인 (C)는 최적화된 DNA 단부 수복 완충액 (Fast DNA 단부 수복 키트 K0771)이고, dA-테일링 반응은 도면 1에서 도시된 Cy-5 표지화된 올리고이중나선의 7.5 pmol 등몰 혼합물을 내포하는 50 μl 반응 혼합물에서 5 단위의 효소를 이용하여 37℃에서 수행되었다. 밴드 쌍은 단일 추가 dA가 있는, 그리고 없는 올리고이중나선을 나타낸다.

도면 2는 레인 A - 1x 클레노브 완충액 + 0.2 mM dATP; 레인 B - 1 mM DTT + 0.2 mM dATP를 포함하는 1x G 완충액; 그리고 레인 C - 1x 단부 수복 완충액을 보여준다.

도면 2에서 제공된 결과는 클레노브 단편 엑소^-가 30 분의 항온처리 이후에도, 3가지 시험된 반응 혼합물 모두에서 올리고뉴클레오티드를 균일하게 연장할 수 없고, 3'-말단 퓨린 (A/G)을 특징으로 하는 것들과 비교하여 3'-말단 피리미딘 (C/T)을 더욱 효율적으로 연장한다는 것을 제안하였다. 이에 더하여, 클레노브 단편 엑소^-에 의한 dA-테일링은 (C) 완충액에서 최소 효율적이었는데, 이것은 DNA 단편의 평활화와 인산화를 수행하는 효소에 대해 최적이지만, 클레노브 단편에 대해 준최적이었다.

Taq DNA 중합효소의 dA-테일링 능력이 도면 3에서 조사되고 도시되었는데, 여기서 레인 (A)는 최적화된 DNA 단부 수복 완충액 pH 7.5이고; 레인 (B)는 pH 8.0을 제외하고 A에서와 동일하고; 그리고 레인 (C)는 pH 8.3을 제외하고 A에서와 동일하다. 최적화된 완충액은 Fast DNA 단부 수복 키트 K0771로부터 10X 단부 수복 반응이다. 반응은 도면 1에서 도시된 Cy-5 표지화된 올리고이중나선의 7.5 pmol 등몰 혼합물을 내포하는 50 μl 반응 혼합물에서 7.5 단위 효소를 이용하여 60℃에서 수행되었다.

도면 3 A - 1x 단부 수복 완충액, pH 7.5; B - 1x 단부 수복 완충액, pH 8.0; C - 1x 단부 수복 완충액, pH 8.3.

도면 3에서 제공된 결과는 Taq DNA 중합효소가 pH 7.5에서 3'-말단 피리미딘의 연장을 선호하였고, 이것이 평활화와 인산화 반응을 위해 최적이라는 것을 제안하였다. pH 7.5로부터 pH 8.3으로 증가된 pH는 Taq DNA 중합효소 dA-테일링 효율과 균일성에 대한 긍정적인 효과를 가졌다. 하지만, 20 분의 항온처리 이후에도, 3' 말단 G를 갖는 올리고뉴클레오티드는 이러한 실험에서 이용된 다른 기질과 비교하여 덜 효율적으로 연장되었다.

mod-Tbr DNA 중합효소 (엑소-)로 반응 조건 실험의 최적화는 상기 효소가 Taq 중합효소와 유사하게 dA-테일링에 대해 증가된 pH를 선호하지만, 3' 말단 C 또는 T를 소유하는 DNA 단편에 대한 더욱 적은 선호를 보여준다는 것을 드러냈다 (도면 4 참조). 더욱 우수한 dA-테일링 효율을 담보하기 위해, 반응 혼합물은 1 mM까지 증가하는 농도의 dATP로 농축되었다. 다양한 양의 DNA 단편이 평활화되고 dA-테일링되어야 하는 환경을 모의하기 위해, 실험이 증가된 dATP 농도 (1 mM) 및 도면 1에서 도시된 변하는 양의 올리고이중나선을 이용하여 pH 8.3에서 최적화된 완충액 (Fast DNA 단부 수복 키트 K0771로부터 10X 단부 수복 반응 믹스)에서 일정한 양 (5 단위)의 mod-Tbr DNA 중합효소로 수행되었다.

도면 4는 레인 A 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 1.5 pmol 혼합물; 레인 B 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 7.5 pmol 혼합물; 레인 C 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 15 pmol 혼합물; 레인 D 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 22.5 pmol 혼합물; 그리고 레인 E 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 30 pmol 혼합물을 보여준다. 반응은 50 μl의 반응 혼합물에서 60℃에서 10 분 동안 수행되었다.

도면 4에서 제공된 결과는 mod-Tbr DNA 중합효소가 시험된 광범위한 범위의 농도의 기질에서 모든 유형의 DNA 단부를 효율적으로 및 균일하게 연장하고, 따라서 클레노브 단편 엑소^-와 Taq DNA 중합효소 효소를 능가한다는 것을 보여준다.

대조 DNA 단편이 하나의 반응 혼합물에서 DNA 단부 수복 및 DNA 3' 단부 테일링 효율 둘 모두를 시험하는데 이용되었다. DNA 단편은 3'과 5' 말단 돌출되는 단부를 갖고 이의 5' 단부에서 인산염을 결여하는 265 bp이었고, 그리고 PsuI과 PstI 개열 및 차후, 알칼리 인산분해효소로 처리에 의해 산출되었다. 이러한 DNA 기질은 개별 DNA 단편이 3' 및/또는 5' 돌출되는 단부를 내포하고 5' 말단 인산염을 결여할 수 있을 때 DNA의 물리적 전단 후 환경을 모의한다.

1 μg의 DNA 단편이 상업적인 단부 수복 효소 믹스 (Thermo Scientific, K0771) 및 5 단위의 고온성 DNA 중합효소: mod-Tbr DNA 중합효소 또는 Taq DNA 중합효소와 함께 50 μl의 반응 혼합물에서 항온처리되었다. 반응 혼합물은 20℃에서 5 분 동안 항온처리되어, 단부 수복 효소가 DNA 단편 단부를 평활화하고 인산화하는 것을 허용하고, 그 이후에 중온성 단부 수복 효소의 동시적 비활성화 및 고온성 DNA 중합효소에 의한 DNA 3' 단부 테일링에 우호적인 조건인 72℃에서 10 분 동안 항온처리되었다. 이러한 단계 후, 길이가 60 bp이고 3' 말단 dT 연장을 운반하는 DNA 어댑터가 1 μM의 최종 농도로 반응 혼합물에 부가되었다. DNA 단편에 DNA 어댑터의 결찰이 22℃에서 5 분 동안 T4 DNA 연결효소를 이용하여 달성되었고, 그리고 결과의 반응 산물이 1% 아가로오스 겔에서 분석되었다. 실험적 계획은 도면 5에서 도시된다. 결과는 도면 6에서 도시되는데, 여기서 D1과 D2는 mod-Tbr DNA 중합효소를 이용하여 제조된 표본이고; T1과 T2는 Taq DNA 중합효소를 이용하여 제조된 표본이고; F는 대조 DNA 단편을 나타내고; L은 O'RangeRuler 50 bp DNA 사다리 (Thermo Scientific, SM0613)이고; A는 어댑터가 양쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 381 bp 반응 산물 (60+261+60 bp)이고; 그리고 B는 어댑터가 한쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 321 bp 반응 산물 (261+60 bp)이다.

도면 6은 레인 D1, D2 - DyNAmoIV DNA 중합효소를 이용하여 제조된 표본; 레인 T1, T2 - Taq DNA 중합효소를 이용하여 제조된 표본; F - 대조 DNA 단편; A 어댑터가 양쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 381 bp 반응 산물 (60+261+60 bp); B 어댑터가 한쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 321 bp 반응 산물 (261+60 bp); L - O'RangeRuler 50 bp DNA 사다리 (Thermo Scientific, SM0613)를 보여준다.

도면 6에서 제공된 결과는 mod-Tbr DNA 중합효소가 정확한 구조 (단편 A)의 더욱 많은 산물을 산출하였다는 것을 보여주는데, 이것은 이러한 효소가 Taq DNA 중합효소를 능가하고, 그리고 하나의 반응 혼합물에서 DNA 단부 수복 효소와 함께 이용에 더욱 적절하다는 것을 지시한다. 단지 평활화되고 그리고 이후, dA-테일링된 대조 DNA 단편만 dT-내포 어댑터에 결찰될 수 있다. 우세한 가장 큰 밴드 A는 어댑터가 양쪽 단부에 결찰된 DNA 단편을 나타내고, 반면 대조 DNA 단편 F의 극히 작은 분획물은 처리되지 않은 상태로 남겨졌다.

이들 데이터는 DNA 단부 수복과 DNA 3' 단부 dA-테일링 반응의 효율이 상이한 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 단일 반응 혼합물에서 수행될 때 상이하고, 그리고 게다가, mod-Tbr을 포함하는 본 발명의 반응 혼합물이 상기 반응을 위해 이전에 이용된 다른 조성물을 효율에서 능가한다는 것을 증명하였다. 또한, 본 발명의 조성물이 이용되었을 때, 이후 함께 결찰되는 평활화된 DNA 단편의 불완전 dA-테일링과 함께 나타날 수 있었던 더욱 큰 DNA 단편의 흔적이 없었다는 것은 주목할 만하다.

실시예 3

2x 농축된 단부 전환 마스터 믹스의 안정성

안정성 시험을 위해, 개시된 바와 같은 2x 단부 전환 마스터 믹스가 상이한 기간 동안 가속된 안정성 시험을 나타내기 위해, -20℃와 +25℃에서 보관되었다. 안정성 시험은 도면 5에서 도시된 동일한 실험적 계획을 이용하여 수행되었다. 1 μg의 대조 DNA 단편이 -20℃에서 보관된 1x 단부 전환 마스터 믹스의 50 μl 반응 혼합물에서 5 분 동안 항온처리되어, DNA 단부 수복 효소가 DNA 단부를 평활화하고 인산화하는 것을 허용하고, 그 이후에 중온성 DNA 단부 수복 효소의 동시적 비활성화 및 mod-Tbr DNA 중합효소에 의한 DNA 3' 단부 테일링에 우호적인 조건인 72℃에서 10 분 동안 항온처리되었다. 이러한 단계 후, 길이가 60 bp이고 3' 말단 dT 연장을 운반하는 DNA 어댑터가 최종 1 μM 농도로 반응 혼합물에 첨가되었고, 그리고 22℃에서 5 분 동안 T4 DNA 연결효소를 이용한 결찰이 수행되었다. 결과의 반응 산물은 1% 아가로오스 겔에서 분석되었다. 결과는 도면 7에서 도시되는데, 여기서 A1과 A2는 -20℃에서 2 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본이고; B1과 B2는 +25℃에서 1 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본이고; C1과 C2는 +25 ℃에서 2 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본이고; F는 대조 DNA 단편이고; L은 O'RangeRuler 50 bp DNA 사다리 (Thermo Scientific, SM0613)이고; A는 어댑터가 양쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 381 bp 반응 산물 (60+261+60 bp)이고; 그리고 B는 어댑터가 한쪽 DNA 단편 단부에 결찰된 321 bp 반응 산물 (261+60 bp)이다.

도면 7은 A1, A2 - -20℃에서 2 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본; B1, B2 - +25℃에서 1 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본; C1, C2 - +25℃에서 2 주 보관된 단부 전환 마스터 믹스를 이용하여 제조된 표본; F - 대조 DNA 단편; A - 어댑터가 양쪽 DNA 단부에 결찰된 381 bp 반응 산물 (60+261+60 bp); B - 어댑터가 한쪽 DNA 단부에 결찰된 321 bp 반응 산물 (261+60 bp); L- O'RangeRuler 50 bp DNA 사다리 (Thermo Scientific, SM0613)를 보여준다.

도면 7에서 제공된 결과는 단부 전환 마스터 믹스가 +25℃에서 2 주 동안 기능적 활성을 유지한다는 것을 지시하였고, 따라서 연장된 보관 기간 동안 안정된 것으로 고려된다. 조성물은 4℃에서 최소한 1 주 동안 안정되었다. 이에 더하여, 도면 7에서 제공된 결과는 단부 전환 마스터 믹스가 단일 혼합물에서 효율적인 평활화, 인산화와 dA 테일링을 제공한다는 것을 지시하였다.

출원인은 2013년 9월 24, 오후 12:29의 파일 작성 일자 및 2.06 킬로바이트의 파일 크기를 갖는, Thermo_Fisher_Scientific_Baltics_UAB_33_ST25.txt로서 확인된 첨부 컴퓨터 판독가능한 서열 목록에서 내포된 자료를 참조로서 편입한다.

본 명세서에서 도시되고 설명된 구체예는 당분야에서 숙련된 발명자의 단지 특정한 구체예에 불과하고 어떤 방식으로도 제한하지 않는다. 이런 이유로, 이들 구체예에 대한 다양한 변화, 변형, 또는 변경이 다음 청구항의 범위에서 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다. 인용된 참고문헌은 전체적으로 본원에 명시적으로 참조로서 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> Thermo Fisher Scientific Baltics, UAB Lubiene, Judita Berezniakovas, Arturas Lubys, Arvydas <120> ENZYME COMPOSITION FOR DNA END REPAIR, ADENYLATION, PHOSPHORYLATION <130> 077792.33 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Cy5 label <400> 1 tgcagacatg ggtaggcatc cttggcgtag ttaccaag 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 acgtctgtac ccatccgtag gaaccgcatc aatggttc 38 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Cy5 label <400> 3 tgcagacatg ggtaggcatc cttggcgtag ttacc 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 acgtctgtac ccatccgtag gaaccgcatc aatgg 35 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Cy5 label <400> 5 tgcagacatg ggtaggcatc cttggcgtag tt 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 acgtctgtac ccatccgtag gaaccgcatc aa 32 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Cy5 label <400> 7 tgcagacatg ggtaggcatc cttggcgta 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 acgtctgtac ccatccgtag gaaccgcat 29

Claims

단일 용기에서 뉴클레오시드 삼인산염을 포함하는 완충액 및 DNA 단편을 별도로 평활화하고, 인산화하고, 아데닐화시킬 수 있는 복수의 효소를 포함하는 효소 조성물에 있어서, DNA를 아데닐화시킬 수 있는 효소는 고온성 변형된 DNA 중합효소이고, 그리고 상기 조성물은 4℃에서 최소한 1 주 동안 안정된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서, DNA 단편을 평활화하고 인산화할 수 있는 효소는 T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 클레노브 단편, 그리고 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서, 고온성 변형된 DNA 중합효소는 5'-3'와 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 실제적으로 결여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 3에 있어서, 고온성 변형된 DNA 중합효소는 비특이적 DNA-결합 도메인에 융합된 테르무스 (Thermus) 종 고온성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 4에 있어서, 고온성 변형된 DNA 중합효소는 Sso 패밀리로부터 비특이적 DNA-결합 도메인에 융합된 테르무스 (Thermus) 종으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서, 뉴클레오시드 삼인산염은 dATP, dCTP, dTTP, 그리고 dGTP이고, 여기서 dATP의 농도는 0.4 내지 3 mM 범위에서 변하고, dCTP의 농도는 0.2 내지 0.6 mM 범위에서 변하고, dTTP의 농도는0.2 내지 0.6 mM 범위에서 변하고, 그리고 dGTP의 농도는 0.1 내지 0.4 mM 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항1에 있어서, dATP의 농도는 약 2 mM이고, dCTP의 농도는 약 0.4 mM이고, dTTP의 농도는 약 0.4 mM이고, 그리고 dGTP의 농도는 약 0.2 mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서, 완충액은 Tris-HCl, MgCl₂, DTT, NaCl, KCl과 LiCl에서 선택되는 일가 금속 염화수소산 염, ATP, Triton X-100, 글리세롤, NP 40, EDTA, 그리고 Tween 20으로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 성분을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 7에 있어서, 존재할 때, Tris-HCl의 농도는 8.0 내지 8.8의 pH에서 100 mM 내지 105 mM의 포괄적 범위에서 변하고; MgCl₂의 농도는 15 내지 25 mM의 포괄적 범위에서 변하고, DTT의 농도는 15 내지 30 mM의 포괄적 범위에서 변하고, 일가 금속 염화수소산 염의 농도는 20 mM 내지 50 mM의 포괄적 범위에서 변하고, ATP의 농도는 1.5 내지 2.5 mM의 포괄적 범위에서 변하고, Triton X-100의 농도는 0.1 내지 0.4%의 포괄적 범위에서 변하고, 글리세롤의 농도는 10 내지 20%의 포괄적 범위에서 변하고, NP 40의 농도는 0.05 내지 0.15%의 포괄적 범위에서 변하고, EDTA의 농도는 0.02 내지 0.1 mM의 포괄적 범위에서 변하고, 그리고 Tween 20의 농도는 0.05 내지 0.15%의 포괄적 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 2에 있어서, T4 DNA 중합효소의 농도는 0.2 내지 0.5 u/μl의 포괄적 범위에서 변하고, 클레노브 단편의 농도는 0.1 내지 0.2 u/μl의 포괄적 범위에서 변하고, 그리고 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 농도는 0.5 U/μl 내지 1.5 U/μl의 포괄적 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 10에 있어서, T4 DNA 중합효소의 농도는 약 0.32 U/μl이고, 클레노브 단편의 농도는 약 0.12 U/μl이고, 그리고 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제의 농도는 약 1 U/μl인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 3에 있어서, 고온성 변형된 DNA 중합효소의 농도는 0.1 내지 0.5 u/μl의 포괄적 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 3에 있어서, 고온성 변형된 DNA 중합효소의 농도는 약 0.2 U/μl인 것을 특징으로 하는 조성물.
단일 용기에서 Tris-HCl, MgCl₂, DTT, KCl, dATP, dCTP, dTTP, dGTP, ATP, Triton X-100, 글리세롤, NP 40, EDTA, Tween 20, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, T4 DNA 중합효소, 클레노브 단편, 그리고 Sso 패밀리로부터 DNA-결합 도메인에 융합된 테르무스 브록키아누스 (Thermus brockianus) 또는 테르무스 (Thermus) 종으로부터 고온성 변형된 DNA 중합효소를 포함하는 효소 조성물에 있어서, 상기 조성물은 단일 용기에서 내포되고 안정 보관된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 14에 있어서, dATP의 농도는 dCTP, dTTP, 그리고 dGTP 각각의 농도의 최소한 5배인 것을 특징으로 하는 조성물.
DNA 라이브러리를 산출하기 위한 방법에 있어서, DNA 라이브러리는 각각 3' 단부와 5' 단부를 갖는 DNA 단편을 포함하고, 이들 DNA 단편은 DNA 단편의 3'와 5' 각각에 결합된 합성 DNA 어댑터를 갖고, 상기 방법은
DNA 표본을 전단하여 DNA 단편을 산출하고,
단일 용기에서 DNA 단편을 청구항 1의 조성물과 혼합하고,
단일 용기에서 DNA 단편의 DNA 단부 수복과 dA-테일링을 다음에 의해, 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
단일 용기의 내용물을 DNA 단부 수복 반응을 증진하는 첫 번째 반응 조건에 종속시키고, 그리고 이후,
단일 용기의 내용물을 dA-테일링 반응을 증진하고 DNA 단부 수복 반응을 비활성화시키는 두 번째 반응 조건에 종속시키고,
여기서 DNA 단부 수복 반응은 DNA 단편을 평활화하고 인산화하는 것을 포함하고, 그리고 dA-테일링 반응은 단일 dA를 단부 수복된 DNA 단편의 3' 단부에 부가함으로써 DNA 단편을 아데닐화시키는 것을 포함하고, 그리고
단부 수복되고 dA-테일링된 DNA 단편을 dT 연장을 3' 단부에서 갖는 합성 DNA 어댑터에 결찰함.
청구항 16에 있어서, 첫 번째 반응 조건은 용기 내용물을 5 내지 10 분의 포괄적 기간 동안, 18℃ 내지 22℃의 포괄적 온도에 종속시키는 것을 포함하고, 그리고 두 번째 반응 조건은 용기 내용물을 10 내지 20 분의 포괄적 기간 동안 72℃ 내지 75℃의 포괄적 온도에 종속시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 17에 있어서, 첫 번째 반응 조건은 용기 내용물을 약 5 분 동안, 약 20℃의 온도에 종속시키는 것을 포함하고, 그리고 두 번째 반응 조건은 용기 내용물을 약 10 분 동안 72℃의 온도에 종속시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 16에 있어서, dA-테일링된 DNA 단편의 수율은 75%를 초과하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1의 조성물 및 청구항 16의 방법을 수행하기 위한 사용설명서를 포함하는 키트.