CN114672540A - 一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种二代测序文库构建的试剂盒及文库构建方法，所述试剂盒包括：末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系，本发明还包括二代测序文库的构建方法，本发明将商用建库试剂盒中的各组分试剂进行合理的组合预混，简化了试剂盒中单一组分的数量，缩短了操作时间；将小体积组分预混成较大体积的混合组分，保证了反应加入量的准确性；加入保护剂或稳定剂，保证了混合组分的稳定性，可以室温下长期保存。本发明的试剂盒简化了文库构建操作，易于保存，且提高了文库的均一性。

Description

一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤指一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput Sequencing)又称下一代测序技术(Next-Generation Sequencing)、二代测序技术，是一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，其使得可对一个物种的基因组和转录组进行细致全貌的分析，所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。
高通量测序前首先要进行测序文库的构建，目前常见的建库试剂盒厂家包括IDT、Roche、NEB等。IDT公司xGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒因其独特的接头连接方式，可以有效减少接头二聚体的产生，能够检测低至1％的突变位点，对于低质量及降解的样本也能够有效进行文库构建。
但是该试剂盒试剂组分繁多，导致操作非常的繁琐，耗时长且经常容易出错；当有些组分体积较小(低至0.5ul)时，导致取量时体积误差较大，实验结果波动较大，对实验人员的要求较高；另外市售的文库构建试剂盒往往需要低温保存，使用时现配现用，在试剂的配制、使用上存在一些不方便。本领域迫切需要能够解决上述问题的文库制备试剂盒及建库方法。
发明内容
本发明提供一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法，将解决现有的二代测序文库试剂盒中个组分体系繁多，保存、使用不便的问题，并能提高文库均一性。
本发明着眼于简化IDT公司建库试剂盒(xGen Prism DNA library prep Kit)建库流程，采用了将试剂盒组分预先混合的方法，既减少了组分数量，方便操作；同时又增大了各组分体积，方便减小取样误差；提高文库的均一性。另外为了保证试剂组分稳定性，某些混合组分中加入了相应的稳定剂或保护剂。
本发明提供的技术方案如下：
一种二代测序文库试剂盒，包括：末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系。
优选的，所述末端修复混合体系包括末端修复酶、末端修复缓冲液和甘油，其中末端修复酶和末端修复缓冲液的体积比为1：2，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％；
所述第一接头混合体系A包括第一接头缓冲液、第一接头和吐温，其中第一接头缓冲液和第一接头的体积比为13：2，吐温在混合体系中的体积百分比为0.5％-10％；
所述第一接头混合体系B包括第一接头连接酶、第一接头缓冲液和甘油，其中第一接头连接酶和第一接头缓冲液的体积比为1：4，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％；
所述第二接头混合体系包括第二接头连接酶A、第二接头连接酶B、第二接头缓冲液、第二接头、甘油和吐温，其中第二接头连接酶A、第二接头连接酶B、第二接头缓冲液、第二接头的体积比为1：2：9：8，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％，吐温在混合体系中的体积百分比为0.5％-10％；
所述PCR引物混合体系包括IDTE和UDI引物，其中IDTE和UDI引物的体积比为4：1。
优选地，所述末端修复混合体系包括末端修复酶3uL、末端修复缓冲液6uL和甘油1uL。
优选地，所述第一接头混合体系A包括第一接头缓冲液13uL、第一接头2uL和吐温1.5uL；
所述第一接头混合体系B包括第一接头连接酶3uL、第一接头缓冲液12uL和甘油1.5uL。
优选地，所述第二接头混合体系包括第二接头连接酶A 0.5uL、第二接头连接酶B1uL、第二接头缓冲液4.5uL、第二接头4uL、甘油1uL和吐温1uL。
优选地，所述PCR引物混合体系包括IDTE 20uL，UDI引物对为5uL。
一种二代测序文库构建方法，包括如下步骤：
步骤1，样本打断：将DNA样本打断为150-300bp的小片段DNA，打断的小片段DNA经纯化后，备用；
步骤2，末端修复：步骤1纯化后的小片段DNA与末端修复混合体系混匀后置于PCR仪上进行反应；
步骤3，接头1连接：使用2.5X AMpure Beads对末端修复产物进行纯化，直接用第一接头混合体系对磁珠进行洗脱，洗脱液作为反应液进行第一接头连接反应，其中第一接头混合体系包括第一接头混合体系A和第一接头混合体系B；
步骤4，接头2连接：向步骤3的第一接头连接反应产物加入第二接头混合体系，进行第二接头连接反应；
步骤5，PCR扩增：将步骤4中的第二接头连接反应产物使用2.5X PEG/Nacl进行纯化，用PCR引物混合体系进行洗脱，并与KAPA HiFi HotStart ReadyMix混合均匀后置于PCR仪上进行PCR反应；
步骤6，Qubit定量：PCR结束后，使用1.3X AMpure Beads对产物进行纯化，并对文库进行Qubit定量。
优选地，所述步骤2中的总体积为60uL，其中片段化的DNA 50uL；
所述步骤3中的反应体积为50μL，热盖温度为70℃；
所述步骤4中的反应体积为40μL，热盖温度为70℃；
所述步骤5中的反应总体积为50μL，热盖温度为105℃。
与现有技术相比，本发明提供的一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法具有以下有益效果：
1，本发明将试剂盒中的各组分试剂进行合理的组合预混，减少了实际使用时试剂盒中组分的数量，便于操作；将小体积组分预混成较大体积的混合组分，提高了各组分加入量的准确性；加入甘油、吐温等稳定剂或保护剂，保证了混合组分的性能及稳定性，使得混合组分可在低温(如4℃)或室温下(25℃)长期保存。
2，本发明的试剂盒提高了测序均一性：建库过程中影响文库均一性的因素包括片段化、接头连接和文库扩增，而接头连接是其中最关键的。本发明主要是通过控制接头连接步骤中组分准确性来提高文库测序均一性。
3，本发明通过尝试各种不同的混合方式，发现将第一接头的各组分分成混合体系A和混合体系B进行保存，在第一接头连接反应时再将混合体系A和B进行混合，才能够成功实现文库构建的目的。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明实施例2与正常对照试剂的测序均一性的结果对比图；
图2是本发明第一接头混合体系A、B混合保存和分开保存30天(25℃条件下)后用来构建文库的片段大小分析图；
图3是本发明H1975-gDNA-正常对照、4℃保存30天、25℃保存30天片段大小分析图；
图4是本发明60977S01-FFPE-正常对照、4℃保存30天、25℃保存30天片段大小分析图；
图5是本发明H1975-gDNA-正常对照、4℃保存60天、25℃保存60天片段大小分析图；
图6是本发明60977S01-FFPE-正常对照、4℃保存60天、25℃保存60天片段大小分析图；
图7是本发明FFPE和gDNA分别在4℃和25℃保存30天和60天后的测序结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
现有市场销售的二代测序文库试剂盒存在试剂盒试剂组分繁多，导致操作非常的繁琐，耗时长且经常容易出错；再加上有些组分体积较小(低至0.5ul)，导致取量时体积误差较大，实验结果波动较大，对实验人员的要求较高；且试剂盒不易保存。本发明通过对试剂进行预混，形成混合体系，试剂盒的具体混合体系如实施1试剂盒所述。
实施例1
试剂盒的制备
本发明基于IDT公司的xGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒(即IDTPrism建库试剂盒)，该试剂盒主要包括：末端修复缓冲液(End Repair Buffer)、末端修复酶(End Repair Enzyme)、第一接头缓冲液(Ligation 1buffer)、第一接头(Ligation1adapter)、第一接头连接酶(Ligation 1Enzyme)、第二接头连接酶A(Ligation2EnzymeA)、第二接头连接酶B(Ligation 2Enzyme B)、第二接头缓冲液(Ligation2buffer)、第二接头(Ligation 2Adapter)、UDI引物(xGenUDI PrimerPairs)。另外购买IDTE(pH 8.0，1xTE solution，IDT公司)、KAPA HiFi HotStart ReadyMix(Roche公司)、Ampure XP磁珠(Beckman公司)。
将该试剂盒中的多种组分进行预混，并加入甘油和/或吐温，分别得到末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系，各个体系的示例性的具体组分如下表1：
表1
Figure BDA0002856220930000061
Figure BDA0002856220930000071
在具体制备时，可以按照表1中的各组分对应的体积比进行预混合分别形成末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系，预混后减少了试剂盒中的组分数量，简化了在构建文库过程中的实验操作，而且预混后的各个混合体系的体积变大，提高了取样的准确性，增加了建库结果的稳定性。
表1中给出的体积是单个反应所需的对应组分的体积。本发明方案是扩大体积预混合后，再量取各个反应所需的各混合体系。例如，预混合的具体操作过程是：将整个试剂盒(96反应)或更多反应所需要的组分，按照表1中各组分对应的体积比预混到一起，实验操作时直接取用相应体积的各混合体系即可。
实施例2
二代测序文库的构建，具体如下步骤(采用实施例1中的各混合体系)：
步骤1：将打断后的DNA片段经过磁珠纯化后，将片段化的DNA与末端修复混合体系混匀后置于PCR仪上进行反应；
在具体处理时，步骤1中所使用的样本采用Covaris进行物理打断，打断后的DNA为200bp左右的小片段DNA。取100-200ng的DNA样本进行片段化处理，然后对片段化的DNA进行1.8X Ampure XP磁珠纯化，纯化后进行Qubit定量。取20ng纯化后的片段化DNA进行文库构建，建库的起始量为20ng，根据相应的DNA浓度，计算DNA取样量，进行末端修复时，向PCR反应管中加入10uL的末端修复混合体系，并加入50uL的片段化DNA(根据定量结果计算20ng所需纯化后的DNA体积，并用IDTE补足至50ul)，反应的总体积为60uL，并在20℃循环1次，时间为30min，然后再在4℃循环1次，并在4℃下继续保持，步骤1中具体的样本如下表2所示。
表2
样本名称 样本类型 建库起始量(ng)
HCT15-gDNA gDNA 20
54229S01-FFPE FFPE 20
步骤2：使用2.5X AMpure Beads对末端修复产物进行纯化，用33μL第一接头混合体系进行洗脱，混合均匀后进行第一接头连接反应，其中第一接头混合体系由16.5μL的第一接头混合体系A和16.5μL第一接头混合体系B混合而得，在PCR仪上运行时，先在20℃情况下，循环1次15min；然后再在65℃情况下，循环1次15min，最后在4℃情况下循环1次，并在4℃下继续保持。
步骤3：取步骤2中的第一接头连接反应产物，并加入12μL第二接头混合体系进行第二接头连接反应，在PCR仪上运行时，先在65℃情况下，循环1次30min；最后在4℃情况下循环1次，并在4℃下继续保持。
步骤4：将步骤3中的产物使用2.5X PEG/Nacl进行纯化，用25μL PCR引物混合体系进行洗脱，洗脱液与25μL KAPA HiFi HotStart ReadyMix混合均匀后置于PCR仪上进行PCR反应；在PCR仪上运行时，按照如下表3设计的温度、时间和循环次数进行运行：
表3
Figure BDA0002856220930000091
步骤5：PCR结束后，使用使用1.3X AMpure Beads对产物进行纯化，并对文库进行Qubit定量。
对照实施例1
使用正常对照试剂(即xGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒，该试剂盒的组分如实施例1所述)进行文库构建并测序：
步骤1：DNA片段化与末端修复反应；
在具体处理时，步骤1中所使用的样本采用Covaris进行物理打断，打断后的DNA为200bp左右的小片段DNA。打断后的DNA片段经Ampure XP磁珠纯化，取20ng进行文库构建，建库的起始量为20ng，根据相应的DNA浓度，计算DNA取样量，进行末端修复时，向PCR反应管中加入6uL的末端修复缓冲液、3uL的末端修复酶，并加入50uL的片段化DNA，反应的总体积为59uL，并在20℃循环1次，时间为30min，然后再在4℃循环1次，并在4℃下继续保持，
步骤2：使用2.5X AMpure Beads对末端修复产物进行纯化，然后使用25μL的第一接头缓冲液、2μL第一接头、3μL第一接头连接酶对磁珠进行洗脱，洗脱液作为反应液进行第一接头连接反应：在PCR仪上运行时，先在20℃情况下，循环1次15min；然后再在65℃情况下，循环1次15min，最后在4℃情况下循环1次，并在4℃下继续保持。
步骤3：第一接头反应完成后，向第一接头连接反应产物中加入4.5μL第二接头缓冲液、0.5μL第二接头连接酶A、1μL第二接头连接酶B、4μL第二接头，混匀后在PCR仪上运行第二接头连接反应：先在65℃情况下，循环1次30min；最后在4℃情况下循环1次，并在4℃下继续保持。
步骤4：将步骤3中的产物使用2.5X PEG/Nacl进行纯化，并取20μL纯化产物(20μL的IDTE洗脱后得到)、5μL UDI引物以及25μL KAPA HiFi HotStart ReadyMix混合均匀后置于PCR仪上进行反应，在PCR仪上运行时，按照表3设计的温度、时间和循环次数进行。
步骤5：PCR结束后，使用1.3X AMpure Beads对产物进行纯化，并对文库进行Qubit定量后即用于二代测序，Qubit定量如表4。
表4
Figure BDA0002856220930000101
由表4中的文库浓度可以看出，混合试剂构建的文库浓度更稳定，CV值更小，制备的文库间差异更小，对构建的文库进行上机测序，并对不同条件构建文库的均一性进行分析，测序的均一性如图1所示(本发明图、表中“混合试剂”指采用实施例1和实施例2的方法将试剂组分预混后进行文库构建并检测，“正常对照”指采用对照实施例1的方法直接利用商业化购买的试剂盒进行文库构建并检测)。
文库均一性是指覆盖均一性，指的是读取数据在基因组或目标区域内的分布均一程度。二代测序要求位点有足够高的绝对深度才可以判断检测的准确性，如果均一性好的话，不同区域的测序深度就越均匀，那么获得预期测序深度的数据量就会越小，会减少测序费用；反之，如果均一性优化不好，会极大的加大测序费用，所以均一性非常重要。
本发明提高均一性的主要是在两步接头连接过程中，原试剂盒第一接头连接的组分和第二连接头的连接组分众多，而且体积很小(低至0.5ul)，导致在取液时有较大的波动误差，这种误差就会导致制备的文库均一性有差异。本发明通过将各接头组分的试剂提前预混合，混合后的试剂就能减少这种误差的产生，从而使得文库均一性更好，图1可以看出混合试剂构建的文库均一性更好。
对照实施例2
本发明实施例1和实施例2中，在进行第一接头连接反应时，将第一接头连接反应组分分成两个混合体系(即第一接头混合体系A和第一接头混合体系B)。若直接将第一接头混合体系A、B混合在一起进行保存，则会影响试剂盒文库构建的性能。例如，第一接头混合体系A、B混合保存和分开保存30天(25℃条件下)后用来进行文库构建的浓度如表5所示。
表5
Figure BDA0002856220930000111
Figure BDA0002856220930000121
如图2所示，是本发明第一接头混合体系A、B混合保存和分开保存30天(25℃条件下)后用来进行构建文库的片段大小分析图。从表5及图2的建库结果可以看出：第一接头混合体系A、B混合后保存不稳定，影响试剂盒性能；25℃保存30天后，构建的文库不仅浓度低，而且文库片段大小不符合要求，导致建库失败。故本发明选择将第一接头连接反应组分分为A、B两个混合体系。
对照实施例3
为了考察混合试剂的性能和稳定性，将基于IDT Prism建库试剂盒依据表1预混得到的各个混合体系(末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系)分别置于4℃和25℃放置30天和60天后，按照实施例2的文库构建方法构建文库并进行分析。正常的对照试剂盒(IDT Prism建库试剂盒)按照正常流程建库，正常的对照试剂盒正常保存的温度为-20℃，本申请文件中所有正常对照均是正常保存的。gilent 4150TapeStation片段大小分析如图2-5所示，实验后的Qubit定量如下表5所示，测序的结果如图6所示。
表5
Figure BDA0002856220930000122
Figure BDA0002856220930000131
由表5和图3-6所示，各个混合体系在4℃和25℃保存30天和60天后与正常对照建库相比，文库浓度和片段大小都无明显差异，说明文库构建性能与正常试剂盒无差异，同时说明各个混合体系稳定性好，可以长期存放。
对构建的文库进行上机测序分析，并比较同一样本不同加速条件构建文库的均一性。由图7可以看出各个混合体系在4℃和25℃保存30天和60天后，构建文库均一性都很好，长期存放后不影响试剂盒的建库性能，并再次证明了利用各个混合体系建库的均一性优于正常对照试剂盒。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种二代测序文库试剂盒，其特征在于，包括：末端修复混合体系、第一接头混合体系A、第一接头混合体系B、第二接头混合体系以及PCR引物混合体系。
2.根据权利要求1所述的一种二代测序文库试剂盒，其特征在于：
所述末端修复混合体系包括末端修复酶、末端修复缓冲液和甘油，其中末端修复酶和末端修复缓冲液的体积比为1：2，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％；
所述第一接头混合体系A包括第一接头缓冲液、第一接头和吐温，其中第一接头缓冲液和第一接头的体积比为13：2，吐温在混合体系中的体积百分比为0.5％-10％；
所述第一接头混合体系B包括第一接头连接酶、第一接头缓冲液和甘油，其中第一接头连接酶和第一接头缓冲液的体积比为1：4，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％；
所述第二接头混合体系包括第二接头连接酶A、第二接头连接酶B、第二接头缓冲液、第二接头、甘油和吐温，其中第二接头连接酶A、第二接头连接酶B、第二接头缓冲液、第二接头的体积比为1：2：9：8，甘油在混合体系中的体积百分比为5％-30％，吐温在混合体系中的体积百分比为0.5％-10％；和/或
所述PCR引物混合体系包括IDTE和UDI引物，其中IDTE和UDI引物的体积比为4：1。
3.根据权利要求1或2所述的一种二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述末端修复混合体系包括末端修复酶3uL、末端修复缓冲液6uL和甘油1uL。
4.根据权利要求1或2所述的一种二代测序文库试剂盒，其特征在于：
所述第一接头混合体系A包括第一接头缓冲液13uL、第一接头2uL和吐温1.5uL；
所述第一接头混合体系B包括第一接头连接酶3uL、第一接头缓冲液12uL和甘油1.5uL。
5.根据权利要求1或2所述的一种二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述第二接头混合体系包括第二接头连接酶A 0.5uL、第二接头连接酶B1uL、第二接头缓冲液4.5uL、第二接头4uL、甘油1uL和吐温1uL。
6.根据权利要求1或2所述的一种二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述PCR引物混合体系包括IDTE 20uL，UDI引物对为5uL。
7.一种二代测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，样本打断：将DNA样本打断为150-300bp的小片段DNA，打断的小片段DNA经纯化后，备用；
步骤2，末端修复：步骤1纯化后的小片段DNA与末端修复混合体系混匀后置于PCR仪上进行反应；
步骤3，接头1连接：使用2.5X AMpure Beads对末端修复产物进行纯化，直接用第一接头混合体系对磁珠进行洗脱，洗脱液作为反应液进行第一接头连接反应，其中第一接头混合体系包括第一接头混合体系A和第一接头混合体系B；
步骤4，接头2连接：向步骤3的第一接头连接反应产物加入第二接头混合体系，进行第二接头连接反应；
步骤5，PCR扩增：将步骤4中的第二接头连接反应产物使用2.5X PEG/Nacl进行纯化，用PCR引物混合体系进行洗脱，并与KAPA HiFi HotStart ReadyMix混合均匀后置于PCR仪上进行PCR反应；
步骤6，Qubit定量：PCR结束后，使用1.3X AMpure Beads对产物进行纯化，并对文库进行Qubit定量。
8.根据权利要求7所述的一种二代测序文库构建方法，其特征在于：
所述步骤2中的总体积为60uL，其中片段化的DNA 50uL；
所述步骤3中的反应体积为50μL；
所述步骤4中的反应体积为40μL；
所述步骤5中的反应总体积为50μL。
9.根据权利要求7所述的一种二代测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤3和步骤4中PCR仪的热盖温度为70℃，步骤5中PCR仪的热盖温度为105℃。
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