KR20160056518A - 양배추의 계통 순도 검정과 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도 - Google Patents

양배추의 계통 순도 검정과 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP 조성물 및 상기 SNP 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트에 관한 것으로, 본 발명의 SNP를 이용하면 양배추 계통 순도검정 및 조기 고정 계통의 선별을 전체 유전체 수준에서 검정할 수 있어 보다 정확하고 효율적인 결과를 얻어낼 수 있다.

Description

양배추의 계통 순도 검정과 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker set for line purity checking and early fixed line selecting in Cabbage and uses thereof}
본 발명은 양배추의 계통 순도 검정과 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP 조성물, 상기 SNP 또는 이의 cDNA를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 마이크로어레이, 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하고 상기 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법, 상기 SNP 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 키트에 관한 것이다.
양배추류는 약 76백만톤의 생산량, 150억 달러의 경제적 가치(2010년 기준)를 가진 채소류 작물로서 세계 최대 재배 최소 작물군에 속한다. 양배추류는 양배추, 케일, 브로콜리, 콜라비, 콜리플라워(꽃양배추) 등과 같이 형태학적으로 다양한 아종을 가지고 있어 형태학 연구의 모델 작물이기도 하다. 특히, 영양학적 관점에서, 양배추류는 단백질, 카로테노이드 뿐만 아니라 항암 효과가 있는 글루코시놀레이트를 다량 함유하고 있다. 이러한 양배추류의 경제적 부가가치를 더 높이기 위하여, 육종가(breeder)는 높은 생산량, 병충 및 환경 스트레스에 저항성을 가진, 또는 유용물질을 많이 함유한 양배추류를 만들기 위해 끊임없이 노력해 왔다.
양배추의 새로운 품종을 개발하기 위해서는 우수한 계통의 개발이 중요하며, F1 품종의 양친이 되는 계통은 원종이라하며, 이 원종들의 순도는 개발되는 F1 품종의 순도로 이어져 F1품종의 품질에 그대로 연계된다. 원종계통 육성을 위해 교배를 통해 좋은 형질을 도입하고 지속적인 자배(selfing)를 통해 고정을 시키며, 이 고정 과정은 보통 8-10년 이상 소요되고, 육종가들은 양배추의 표현형에 의존하여 고정여부를 판별한다. 표현형에 의존한 고정여부 판별방법은 많은 시간 및 노동이 필요할 뿐만 아니라 재현성이 떨어지는 단점이 있었다. 또한 형태학적 판별은 명확한 유전적 특성(genetic attribute)을 반영하지 못한다.
본 발명에서는 이러한 단점을 극복하기 위하여, 계통의 순도 및 고정 정도를 판별하고 고정된 계통을 조기 선발하기 위한 양배추의 분자표지 마커를 개발코자 하였다.
한편, 한국등록특허 제0652501호에는 '금싸라기 계통 참외의 에프1 종자 순도검정방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1014238호에는 '수박 F1 종자 순도 검정 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 양배추의 계통 순도 검정과 조기 고정 계통 선발을 위한 단일염기다형성 마커 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 23 계통의 양배추류의 기 서열들을 사용하여 전체 유전체 수준의 단일염기다형성(SNP) 마커를 발굴하고, 다형성이 많이 나타나는 구간을 분석하여, 이 구간에서 23 계통 중 6 계통 이상에서 다형성을 보이는 SNP 분자 마커로 필터링하였다. 그 후, 잘 고정되지 않는 유전자좌를 중심으로 각 염색체별로 SNP를 선별하고 각각의 프라이머 세트를 제작한 뒤, 고정이 완벽하게 되지 않은 6 계통에서 개체를 무작위로 선발하여 유전형 분석을 실시하고, 유전형 분석 결과 고정이 잘 안 되는 부위로 나타난 SNP를 염색체별로 선발하여 총 24개의 마커 세트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 또는 이의 cDNA를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하여 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 SNP 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 단일염기다형성(SNP) 마커 세트는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 전체 유전체 수준에서 검정할 수 있어 보다 정확하고 효율적인 결과를 얻어낼 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 고정 계통 검정용 SNP 마커 세트 구축 모식도이다.
도 2는 6계통의 양배추 계통에 대해 본 발명의 마커 세트를 이용한 유전형 분석 결과이다.
도 3은 소포자배양체 유래 계통(9949) 30 개체에 대한 본 발명의 마커 세트를 이용한 유전형분석 결과이다.
도 4는 소포자배양체 유래 계통(9951) 27 개체에 대한 본 발명의 마커 세트를 이용한 유전형분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 24는 상기 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 서열번호 1 내지 24는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1 부터 서열번호 24까지 모두 61번째로, 다형성 염기 정보는 표 3의 SNP 염기서열 정보에 [/]로 표시하였다.
본 발명에 따른 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 10개 이상의 연속 염기이며, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 연속 염기이며, 더더욱 바람직하게는 20개 이상의 연속 염기이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 24의 각 서열이다.
본 발명은 또한, 상기 SNP의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 마이크로어레이를 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한,
양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
본 발명의 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으며, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법은 바람직하게는, 상기 양배추 시료로부터 분리한 핵산 시료를 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화시킨 후 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 25 내지 120의 총 24개 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 상기 각 프라이머 세트는 ASP1, ASP2, LSP 및 STA의 4개의 프라이머가 하나의 세트를 이루며, 예를 들면, 순서대로 서열번호 25부터 28까지는 서열번호 1의 SNP 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머 세트이며, 서열번호 29부터 32까지는 서열번호 2의 SNP 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머 세트이며, 서열번호 113부터 116까지는 서열번호 23의 SNP 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머 세트이며, 서열번호 117부터 120까지는 서열번호 24의 SNP 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머 세트이다. 본 발명의 STA(SNPtype assay specific target amplification primer)와 LSP(SNPtype assay locus specific primer)는 목표 염기서열(표 3) 증폭을 위해 사용되는 프라이머 세트이며, LSP와 ASP(SNPtype assay allele specific primer)는 SNP 위치 염기를 확인하기 위해 사용되는 프라이머 세트이다. ASP 프라이머의 3' 말단 최종 염기가 SNP 위치 염기를 나타내는데, 본 발명의 ASP1은 TO1000 참조서열에 대한 프라이머이며, ASP2는 타 품종의 유전체 서열에 대한 프라이머이다(표 4).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 본 발명의 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 전술한 바와 같다. 상기 분리된 양배추 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
실험재료
국내외에서 수집한 23 계통의 양배추류의 계통명 및 출처는 하기 표 1과 같다.
시료 번호 계통명 제공기업/출처
K0001 #107-HO-154 아시아종묘
K0002 #5-KK-146 아시아종묘
K0003 #105-RK-P6-1 아시아종묘
K0004 #106-HY-164 아시아종묘
K0005 #108-EB-858-7 아시아종묘
K0006 #10-JK-JK-2 아시아종묘
K0007 #14-KR,518 아시아종묘
K0008 #15-OK,517 아시아종묘
K0009 #17-JK,JK-2 아시아종묘
K0010 #103-MT-621 아시아종묘
K0011 LN-748-4 누넴 종묘
K0012 100587 삼성종묘
K0013 FA-747-1 누넴 종묘
K0014 #701, CT-12 female 아시아종묘
K0015 107140 삼성종묘
K0016 #7, HRIGRU009386 HRI, 영국
K0017 102119 삼성종묘
K0018 #111-DS-2437-51 아시아종묘
K0019 #112-QT-DWB-25 아시아종묘
K0020 #116-PH-347-51 아시아종묘
K0021 Badger Inbred 16 HRI, 영국
K0022 HRIGRU007826 HRI, 영국
K0023 HRIGRU009617 HRI, 영국
SNP 마커 선별 및 유전형분석
국내외에서 수집한 23 계통의 양배추류를 기반으로 10X 이상의 NGS 리드를 생산하였다. 생산된 리드는 퀄리티가 낮은 서열을 제거한 후 446Mb의 양배추류 참조서열(TO1000)에 BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)를 이용해 맵핑하였다. 맵핑된 리드들은 SNP 콜링(calling)의 정확도를 높이기 위해 게놈 분석 툴인 GATK(http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/The_Genome_Analysis_Toolkit)를 이용하여 이중 마스킹(duplicate masking), 국소적 재정렬(local realignment) 과정을 수행한 후 UnifiedGenotyper를 이용해 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 InDel(Insertion-Deletion)을 예측하였다. 23계통에서 만들어진 SNP/InDel을 염색체의 좌(loci)를 기반으로 병합한 후 SNP/InDel 매트릭스(matrix)를 생성한 후, 각 SNP 위치좌(locus)를 대상으로 인접 60bp에서 SNP 또는 InDel이 나타나는지 유무를 조사하였다. 그 결과 인접 60bp에서 SNP 또는 InDel이 없는 부분을 SNP 마커 개발의 타겟으로 선정하고 Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm)를 이용하여 특유의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머를 생산하였다. 그 후 mesohexaploid 지놈의 특성을 고려하여, 생산된 프라이머를 TO1000 영역에 다시 맵핑하여 프라이머가 단일 위치좌만 증폭하는지를 평가한 후 단일 염기좌 맵핑 영역만 이용하여 HVR(hyper-variable region)을 발굴하였고, 이로부터 2-5Mb 단위로 96개의 SNP 마커를 선정하였다.
각 SNP를 유전형분석(genotyping) 할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여, 고정이 완벽하게 되지 않는 6 계통에서 각 30개체씩 무작위로 선발하여 유전자형 분석을 하였다. 각 SNP의 유전자형 분석 방법은 Fluidigm 플랫폼을 이용하였다. 이 유전형분석 결과 중 고정이 잘 안되는 부위로 나타난 SNP를 각 염색체별 1-5개씩 선별하여 총 24개의 SNP 마커를 양배추류의 계통 고정 및 계통 순도를 검정할 수 있는 마커 세트로 개발하였고 이 마커 세트로 검정할 수 있는 SNP 유전자위를 양배추의 계통 고정 및 계통 순도 검정을 위한 유전자위로 개발하였다.
실시예 1. SNP 통계치
양배추류의 23 계통의 고품질의 리드(high quality read)를 맵핑한 결과 82%이상이 TO1000 참조서열에 맵핑되었다. 맵핑된 리드를 기반으로 분석한 SNP 결과는 표 2와 같으며, 평균 4,216,350개의 SNP와 437,484개의 InDel이 예측 되었다. 예측된 SNP/InDel을 기반으로 염색체 위치를 기반으로 SNP/InDel 매트릭스를 만든 결과, 총 21,587,643개의 좌(loci)에서 SNP 또는 InDel 변이가 나타나는 것을 알 수 있었다. 인접 60bp 서열에서 서열 변이가 없는 SNP를 조사하여 프라이머를 만든 결과, 121,909개의 SNP 마커 후보군이 만들어졌고, 그 중 101,639개의 SNP 마커가 단일 위치 증폭이 될 것으로 예측되었다.
Figure pat00001
실시예 2. SNP 마커 선정
양배추류 지놈에서 서열 변이가 많이 일어나는 영역을 선정하기 위하여 각 계통의 SNP 정보를 기반으로 100K 범위에 나타나는 SNP의 빈도수(frequency)를 이용하여 two-sided hypergeometric test를 수행하였다. 그 결과, 각 계통에서 유의확률(p-value)이 0.001이하인 영역을 HVR(hyper-variable region)으로 정하고, 23계통 중 HVR이 7계통 이상에서 나타나는 영역이 cHVR(common HVR region)으로 정의하였다. 그래서, cHVR 영역의 SNP 마커를 파싱한 후 23개의 양배추류에서 4계통 이상에서 SNP 다형성을 보이는 SNP 마커만을 2-5Mb 간격으로 선정하였다. 그 후 Fluidigm으로 96개의 SNP 마커의 유전자형을 확인하여 24개의 고정 검정을 위한 SNP 마커 세트를 만들었다(표 3).
고정 계통 검정을 위한 24개의 SNP 염기서열 정보
SNP 이름 서열정보(5'→3') (서열번호)
H1 TTTCTCTCATTCCTCTCCTCAACCTATCAACACTCGTCCATTTCTGTTCCTCAGCATACA[C/T]ATTCGAGAGCAAAACCTGATATCCTGAAAAGTTCTTCCCTTTATCCACTTTAGCTAACTT (1)
H2 AGTATACCGGTGTTGCTAATTTGTATTTTAAGATGCTCTTTCTTCAAACCTATACAAACA[C/T]AGTTCCGTTTTTTATTGATAGAAAATTGTAAGCGGTGGCCTAAAGTTTTGTTAGTAGATT (2)
H3 TGGTTGATTGCATGAGCGACTTCGGCTATTAGTAATAACCACCGCAACTTTATTCTCCTC[G/A]TCAGCGAAGCAAATATCAGCATGCAAGCCAAACATAATACCTCTGAGTCGATTCATCATC (3)
H4 AGGAGGAGAGATGCATTAAGATCGACTGGTGGACGACTAATGTATTTGTAATTGTGAGAA[G/C]TATAACGGATGGCTTATACGCTTTGAACATCGTGCTTCAGGTGTGTTACCTTTTGCTTTC (4)
H5 GAAAGCCCTTCTCCGTGGACTCACGACGCAGCTCTTGAAGCACGGGAGAATCAAGACGAC[C/T]CGAGCTAGAGCAAGTGCGATGAGGAAGTTTGTGGATAAGATGATTACTCTCGCTAAAGAT (5)
H6 ATCCTTGCGTCCTCATCTTTGCTGGAAGTTACAAACCGACGGCACGGGTAGGTAAGGTGG[A/G]CAGGCTCCCACGAGATGCTAGTAATCCATTTCTTGTGGCCTCTAAGGGGGCTGCCATCTA (6)
H7 AGATTGTTGCTGCAGTTCACACCTATCCAGTTACACGGCGTCTCGTCAATGCCGTTCCAG[C/T]TGTGCAGACGGTTGAATGAATCTTGAAATCCTCTGTTCTTCAGCTCCAATAGAAACTGAC (7)
H8 AGCTGGTGTCCAGGCTGATCCTCTTGGAGATCTAAATACCGAAACAGAGAGAAAACTTGG[A/C]GAGCTAGTTCGGGAAAAGTATGACACCGAGTTCTACATCCTGCATCGCTATCCTTCGGCT (8)
H9 ACAATCAGTCTGAAAGTAATGTCTATGTGGTTGGCCTTTTACATATGATTTCCAGTAGTA[G/C]TCAGCTTCCTCAGAGGTTCTGTCAATATAACTGCAAAGCAAGGAAATAGTTAATTTATTT (9)
H10 ATAACCACACTCATCTCGTGTGTTTCTTTCTTTTGAGAATGCGCCTCCCACAACATCTCG[A/G]TCCTTTGAGAATGTCATTACATGTTCCGTGATCTTGACTTATTTTTGCTACAGACCTTGT (10)
H11 GATAACGGTGACATGAGCTGATTGTGTTTTGTTGGATACTAAATCGCCGAGGCTAAGAGA[T/C]TGGAGATTATTGACTTGGTGAATTTCCAGAGCCTCATTGATAATTACACTGACTTATCAT (11)
H12 AACATAAGTGGAAACAGAGATTAGCACAACAGAACCGTTCAAATACAAGATAATGAATCA[A/G]CTAAGTTAATGCAAAACAAAAGATTCATGTCACAAAGAAACCAATCAAATATCAGCTAAG (12)
H13 AGCTTTGCAATCAAGTTATCCCTACTCTTACCTGTAATCACGGCACCAGTTACGCGAGCA[C/T]AAACGGCTCGTATCAGCCCACTTGGATAAGATACAGTCTTTGTTAAATTTAGATGATGAG (13)
H14 TACATGCAACCGCAGACGAGAAAGAGTTACAAGTCTGAACCTCGGAGGATTCAAACTGGC[A/C]GGTGTGATCTCTCCCTCCATTGGTAATCTCTCCTTTCTCATATCACTTAATCTTGGAGAC (14)
H15 AGATTCAACAAGAAGAAACTCTCCAGGAGACGATGTAAGGCTCTCACATCAAGACAGCTT[T/C]TTATGATGCTCTATAAGATTTGAATGTTTGTCTTTTCAATGTAAGGTGGCTCTTTGAGGG (15)
H16 CAGTTCACTGGCTGCGTGATATATGGAATGTAAAAACAATCCCCAAGTTGAAAGACTTCT[A/T]TGGAGAGTAATAAAAGGAGCTATACCGGTCAGCTCAAACTTGGAAAGGAGAGGGCTCCCG (16)
H17 ACGTACGGGCTCAGACAAATTGTCACGTGTTGCAATATAGGAGGTTCAAAATATAGATGC[T/C]GAGTCAGGTCCATGCAACAATGTTTCCTCAAATTCTGTAGCATTATCAGCTCTTAGTTTT (17)
H18 TAGGTTGGAGAAGGAGTCTGGCTTTTTCTTCAACATGAGGTACTTTGAAGACTGTATAAC[C/A]GCTGGTGAATGGGACGATGTGGAGAAGTACCTTTCTGGATTCACTAAAGCTGATGACAAT (18)
H19 AGATCTCAGTATCGGATTCGATGCTTTTGTTTCTGCTGTTCAACTATATAAAAGCTTGTG[T/G]AGGGTGTTCTAAGTTTCAAGACTCTTGCATAATCGTTCTTGAGCCATACTAATCAATTTC (19)
H20 TTAAAAACTATATATTTATTATCATTGTTAGCTTGATGAAACCACAAATTAAAGAAATAC[C/A]TATCAGCTGGTCTCGATGTTAACTTAAATGTTAAAGCCACACTAATCCCATAGGTTGTAG (20)
H21 AATTATAATGTATATGGCCAATACAAGAAGGAGGAACTGAAAAACTTGAAACATCTACTT[A/G]TTCGTCGAAAATATGACGTGATAAGGTATCTGCTCCATATTTCTTTCACGATTGACCGAG (21)
H22 TCTGCGGAGTTCAATACACAGATCAACATACGCACATAGAAGAAAATGTAGTGATTAAAG[A/G]GGAAGACGTATCAAATAAAGACCTGGATCTGGATTTTTATCAGGATGGTATTGAATGGAC (22)
H23 TCAACGGAAAAAGGAAGATTTAAAATAATTAAAACCGAAAAAGATACGAGGAGGAAGAGC[A/T]GAGTTTTAGTTCATTAGTGGTGGGGACTTACGGAGTAATAAGGTGCGGCGGCGACGACAC (23)
H24 GGTATGTTGCCTTTGGCAGTGGTGAATTCTGTATTTTAGATGTCGAGTAGCTCGGGAAGT[C/T]TCTCAGGACGCAGTAGCTCGGCTTGTAGTTCCACAAGTGATTGCCAAAACAACTCCTTTG (24)
*[TO1000 서열/타 품종 서열]
SNP 확인을 위한 프라이머 서열 정보
증폭대상 ASP1 (서열번호) ASP2 (서열번호) LSP (서열번호) STA (서열번호)
H1 CCATTTCTGTTCCTCAGCATACAC (25) TCCATTTCTGTTCCTCAGCATACAT (26) TTTCAGGATATCAGGTTTTGCTCTCGA (27) TCAACCTATCAACACTCGTCCA (28)
H2 ATGCTCTTTCTTCAAACCTATACAAACAC (29) GATGCTCTTTCTTCAAACCTATACAAACAT (30) GGCCACCGCTTACAATTTTCTATCA (31) TGTTGCTAATTTGTATTTTAAGATGCTCTTT (32)
H3 CACCGCAACTTTATTCTCCTCG (33) CCACCGCAACTTTATTCTCCTCA (34) TTGGCTTGCATGCTGATATTTGCT (35) CGACTTCGGCTATTAGTAATAACCA (36)
H4 CAAAGCGTATAAGCCATCCGTTATAC (37) TCAAAGCGTATAAGCCATCCGTTATAG (38) GATCGACTGGTGGACGACTAATGT (39) ACCTGAAGCACGATGTTCAAAG (40)
H5 CGCACTTGCTCTAGCTCGG (41) CGCACTTGCTCTAGCTCGA (42) ACGACGCAGCTCTTGAAGCA (43) TTATCCACAAACTTCCTCATCGC (44)
H6 CATCTCGTGGGAGCCTGT (45) ATCTCGTGGGAGCCTGC (46) AACCGACGGCACGGGTA (47) GAGGCCACAAGAAATGGATTACTAG (48)
H7 GATTCATTCAACCGTCTGCACAG (49) GATTCATTCAACCGTCTGCACAA (50) AGTTACACGGCGTCTCGTCA (51) GCTGAAGAACAGAGGATTTCAAGA (52)
H8 ACCGAAACAGAGAGAAAACTTGGA (53) CCGAAACAGAGAGAAAACTTGGC (54) AACTCGGTGTCATACTTTTCCCGA (55) CTGATCCTCTTGGAGATCTAAATACC (56)
H9 CAGAACCTCTGAGGAAGCTGAC (57) CAGAACCTCTGAGGAAGCTGAG (58) GTGGTTGGCCTTTTACATATGATTTCCA (59) TCCTTGCTTTGCAGTTATATTGACA (60)
H10 GGAACATGTAATGACATTCTCAAAGGAT (61) GGAACATGTAATGACATTCTCAAAGGAC (62) CTTTTGAGAATGCGCCTCCCA (63) CAAAAATAAGTCAAGATCACGGAACAT (64)
H11 CTAAATCGCCGAGGCTAAGAGAT (65) AAATCGCCGAGGCTAAGAGAC (66) AGGCTCTGGAAATTCACCAAGTCA (67) AGCTGATTGTGTTTTGTTGGATACT (68)
H12 CAGAACCGTTCAAATACAAGATAATGAATCAA (69) AGAACCGTTCAAATACAAGATAATGAATCAG (70) CTTTGTGACATGAATCTTTTGTTTTGCATTAACT (71) GATTAGCACAACAGAACCGTTCA (72)
H13 GGCTGATACGAGCCGTTTG (73) GGGCTGATACGAGCCGTTTA (74) ACCTGTAATCACGGCACCAGT (75) CAAAGACTGTATCTTATCCAAGTGGG (76)
H14 TCGGAGGATTCAAACTGGCA (77) TCGGAGGATTCAAACTGGCC (78) ATTACCAATGGAGGGAGAGATCACAC (79) CGAGAAAGAGTTACAAGTCTGAACC (80)
H15 GGCTCTCACATCAAGACAGCTTT (81) GCTCTCACATCAAGACAGCTTC (82) CCACCTTACATTGAAAAGACAAACATTCAAAT (83) TCCAGGAGACGATGTAAGGC (84)
H16 ACAATCCCCAAGTTGAAAGACTTCTA (85) CAATCCCCAAGTTGAAAGACTTCTT (86) GAGCTGACCGGTATAGCTCCTT (87) CTGCGTGATATATGGAATGTAAAAACAAT (88)
H17 TGTTGCATGGACCTGACTCA (89) TGTTGCATGGACCTGACTCG (90) TCACGTGTTGCAATATAGGAGGTTCA (91) TGCTACAGAATTTGAGGAAACATTGT (92)
H18 TCGTCCCATTCACCAGCG (93) CATCGTCCCATTCACCAGCT (94) GTCTGGCTTTTTCTTCAACATGAGGT (95) TCCAGAAAGGTACTTCTCCACAT (96)
H19 CAAGAGTCTTGAAACTTAGAACACCCTA (97) AGAGTCTTGAAACTTAGAACACCCTC (98) CGATGCTTTTGTTTCTGCTGTTCAAC (99) GCTCAAGAACGATTATGCAAGAGT (100)
H20 AAGTTAACATCGAGACCAGCTGATAG (101) TTTAAGTTAACATCGAGACCAGCTGATAT (102) TCATTGTTAGCTTGATGAAACCACAAATTAAAGAA (103) GGATTAGTGTGGCTTTAACATTTAAGTT (104)
H21 ACCTTATCACGTCATATTTTCGACGAAT (105) CCTTATCACGTCATATTTTCGACGAAC (106) GCCAATACAAGAAGGAGGAACTGAAAA (107) GGAGCAGATACCTTATCACGTCA (108)
H22 CCAGGTCTTTATTTGATACGTCTTCCT (109) CCAGGTCTTTATTTGATACGTCTTCCC (110) CAACATACGCACATAGAAGAAAATGTAGTGATT (111) TCCTGATAAAAATCCAGATCCAGGT (112)
H23 CCCCACCACTAATGAACTAAAACTCT (113) CCCCACCACTAATGAACTAAAACTCA (114) AAAACCGAAAAAGATACGAGGAGGAAGA (115) CCTTATTACTCCGTAAGTCCCCA (116)
H24 GTCGAGTAGCTCGGGAAGTC (117) GTCGAGTAGCTCGGGAAGTT (118) ACAAGCCGAGCTACTGCGT (119) GGCAGTGGTGAATTCTGTATTTTAGA (120)
실시예 3. 고정 검정 결과
고정 검정을 위한 24개의 마커 세트를 기반으로 고정여부 판별이 가능한지를 검정하기 위하여 6계통의 양배추 계통을 각각 29-30 개체씩 선정하여 유전형분석을 하였다. 계통 9913과 9914 계통은 육종가의 판단에 의해 표현형 분리가 더 이상 일어나지 않아 육종가가 고정되었다고 판단하는 계통이며, 나머지 4계통은 표현형 분리가 일어나는 아직 고정이 되는 않는 계통이다. 유전형 분석 결과 9913과 9914 계통에서는 이형접합적인 유전자위(loci, 노란색 표기)가 존재하나(도 2A 및 B), 그정도가 크기 않아 24개의 마커중 각 개체별 다른 유전자형을 보이는 개체는 각각 9개체, 2개체씩 검출되었다. 반면 나머지 4 계통에서는 24개의 마커 중 절반 이상의 마커에서 각 개체별로 다른 유전자형을 보여 고정 정도가 매우 떨어짐을 알 수 있었다(도 2C-F). 또한 육종가가 표현형 분리가 일어나지 않는 기준하에 정의한 고정은 실제 유전자형의 완전한 고정과는 다름을 알 수 있었다. 또한, 개체간의 변이가 없이 완벽하게 고정되었을 것으로 사료되는 소포자 배양체 유래 두 계통의 27-30개체의 유전자형을 개발된 마커 세트를 이용하여 검정한 결과 모든 개체들의 유전자형이 일치하는 것을 알 수가 있었다(도 3 및 4).
상기의 결과를 통해, 고정이 되지 않는 계통의 고정과 F1 품종 개발을 위한 원종의 증식시 본 발명의 마커 세트를 이용하면 원종의 순도를 완벽하게 높일 수 있으며, 고정에 걸리는 시간을 단축할 수 있을 것으로 사료된다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Single nucleotide polymorphism marker set for line purity checking and early fixed line selecting in Cabbage and uses thereof <130> PN14311 <160> 120 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 1 tttctctcat tcctctcctc aacctatcaa cactcgtcca tttctgttcc tcagcataca 60 tattcgagag caaaacctga tatcctgaaa agttcttccc tttatccact ttagctaact 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 2 agtataccgg tgttgctaat ttgtatttta agatgctctt tcttcaaacc tatacaaaca 60 tagttccgtt ttttattgat agaaaattgt aagcggtggc ctaaagtttt gttagtagat 120 t 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 3 tggttgattg catgagcgac ttcggctatt agtaataacc accgcaactt tattctcctc 60 atcagcgaag caaatatcag catgcaagcc aaacataata cctctgagtc gattcatcat 120 c 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 4 aggaggagag atgcattaag atcgactggt ggacgactaa tgtatttgta attgtgagaa 60 ctataacgga tggcttatac gctttgaaca tcgtgcttca ggtgtgttac cttttgcttt 120 c 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 5 gaaagccctt ctccgtggac tcacgacgca gctcttgaag cacgggagaa tcaagacgac 60 tcgagctaga gcaagtgcga tgaggaagtt tgtggataag atgattactc tcgctaaaga 120 t 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 6 atccttgcgt cctcatcttt gctggaagtt acaaaccgac ggcacgggta ggtaaggtgg 60 gcaggctccc acgagatgct agtaatccat ttcttgtggc ctctaagggg gctgccatct 120 a 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 7 agattgttgc tgcagttcac acctatccag ttacacggcg tctcgtcaat gccgttccag 60 ttgtgcagac ggttgaatga atcttgaaat cctctgttct tcagctccaa tagaaactga 120 c 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 8 agctggtgtc caggctgatc ctcttggaga tctaaatacc gaaacagaga gaaaacttgg 60 cgagctagtt cgggaaaagt atgacaccga gttctacatc ctgcatcgct atccttcggc 120 t 121 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 9 acaatcagtc tgaaagtaat gtctatgtgg ttggcctttt acatatgatt tccagtagta 60 ctcagcttcc tcagaggttc tgtcaatata actgcaaagc aaggaaatag ttaatttatt 120 t 121 <210> 10 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 10 ataaccacac tcatctcgtg tgtttctttc ttttgagaat gcgcctccca caacatctcg 60 gtcctttgag aatgtcatta catgttccgt gatcttgact tatttttgct acagaccttg 120 t 121 <210> 11 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 11 gataacggtg acatgagctg attgtgtttt gttggatact aaatcgccga ggctaagaga 60 ctggagatta ttgacttggt gaatttccag agcctcattg ataattacac tgacttatca 120 t 121 <210> 12 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 12 aacataagtg gaaacagaga ttagcacaac agaaccgttc aaatacaaga taatgaatca 60 gctaagttaa tgcaaaacaa aagattcatg tcacaaagaa accaatcaaa tatcagctaa 120 g 121 <210> 13 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 13 agctttgcaa tcaagttatc cctactctta cctgtaatca cggcaccagt tacgcgagca 60 taaacggctc gtatcagccc acttggataa gatacagtct ttgttaaatt tagatgatga 120 g 121 <210> 14 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 14 tacatgcaac 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Brassica oleracea <400> 19 agatctcagt atcggattcg atgcttttgt ttctgctgtt caactatata aaagcttgtg 60 gagggtgttc taagtttcaa gactcttgca taatcgttct tgagccatac taatcaattt 120 c 121 <210> 20 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 20 ttaaaaacta tatatttatt atcattgtta gcttgatgaa accacaaatt aaagaaatac 60 atatcagctg gtctcgatgt taacttaaat gttaaagcca cactaatccc ataggttgta 120 g 121 <210> 21 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 21 aattataatg tatatggcca atacaagaag gaggaactga aaaacttgaa acatctactt 60 gttcgtcgaa aatatgacgt gataaggtat ctgctccata tttctttcac gattgaccga 120 g 121 <210> 22 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 22 tctgcggagt tcaatacaca gatcaacata cgcacataga agaaaatgta gtgattaaag 60 gggaagacgt atcaaataaa gacctggatc tggattttta tcaggatggt attgaatgga 120 c 121 <210> 23 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 23 tcaacggaaa aaggaagatt taaaataatt aaaaccgaaa aagatacgag gaggaagagc 60 tgagttttag ttcattagtg gtggggactt acggagtaat aaggtgcggc ggcgacgaca 120 c 121 <210> 24 <211> 121 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 24 ggtatgttgc ctttggcagt ggtgaattct gtattttaga tgtcgagtag ctcgggaagt 60 ttctcaggac gcagtagctc ggcttgtagt tccacaagtg attgccaaaa caactccttt 120 g 121 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ccatttctgt tcctcagcat acac 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tccatttctg ttcctcagca tacat 25 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tttcaggata tcaggttttg ctctcga 27 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tcaacctatc aacactcgtc ca 22 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atgctctttc ttcaaaccta tacaaacac 29 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gatgctcttt cttcaaacct atacaaacat 30 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ggccaccgct tacaattttc tatca 25 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tgttgctaat ttgtatttta agatgctctt t 31 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 caccgcaact ttattctcct cg 22 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ccaccgcaac tttattctcc tca 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ttggcttgca tgctgatatt tgct 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 cgacttcggc tattagtaat aacca 25 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 caaagcgtat aagccatccg ttatac 26 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tcaaagcgta taagccatcc gttatag 27 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gatcgactgg tggacgacta atgt 24 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 acctgaagca cgatgttcaa ag 22 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgcacttgct ctagctcgg 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cgcacttgct ctagctcga 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 acgacgcagc tcttgaagca 20 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ttatccacaa acttcctcat cgc 23 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 catctcgtgg gagcctgt 18 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 atctcgtggg agcctgc 17 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 aaccgacggc acgggta 17 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gaggccacaa gaaatggatt actag 25 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gattcattca accgtctgca cag 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gattcattca accgtctgca caa 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 agttacacgg cgtctcgtca 20 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gctgaagaac agaggatttc aaga 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 accgaaacag agagaaaact tgga 24 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 ccgaaacaga gagaaaactt ggc 23 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 aactcggtgt catacttttc ccga 24 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ctgatcctct tggagatcta aatacc 26 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 cagaacctct gaggaagctg ac 22 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 cagaacctct gaggaagctg ag 22 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gtggttggcc ttttacatat gatttcca 28 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 tccttgcttt gcagttatat tgaca 25 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggaacatgta atgacattct caaaggat 28 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ggaacatgta atgacattct caaaggac 28 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 cttttgagaa tgcgcctccc a 21 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 caaaaataag tcaagatcac ggaacat 27 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ctaaatcgcc gaggctaaga gat 23 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aaatcgccga ggctaagaga c 21 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 aggctctgga aattcaccaa gtca 24 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 agctgattgt gttttgttgg atact 25 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 cagaaccgtt caaatacaag ataatgaatc aa 32 <210> 70 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 agaaccgttc aaatacaaga taatgaatca g 31 <210> 71 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ctttgtgaca tgaatctttt gttttgcatt aact 34 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 gattagcaca acagaaccgt tca 23 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggctgatacg agccgtttg 19 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gggctgatac gagccgttta 20 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 acctgtaatc acggcaccag t 21 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 caaagactgt atcttatcca agtggg 26 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tcggaggatt caaactggca 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 tcggaggatt caaactggcc 20 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 attaccaatg gagggagaga tcacac 26 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 cgagaaagag ttacaagtct gaacc 25 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 ggctctcaca tcaagacagc ttt 23 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 gctctcacat caagacagct tc 22 <210> 83 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ccaccttaca ttgaaaagac aaacattcaa at 32 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 tccaggagac gatgtaaggc 20 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 acaatcccca agttgaaaga cttcta 26 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 caatccccaa gttgaaagac ttctt 25 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gagctgaccg gtatagctcc tt 22 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 ctgcgtgata tatggaatgt aaaaacaat 29 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 tgttgcatgg acctgactca 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 tgttgcatgg acctgactcg 20 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 tcacgtgttg caatatagga ggttca 26 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 tgctacagaa tttgaggaaa cattgt 26 <210> 93 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 tcgtcccatt caccagcg 18 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 catcgtccca ttcaccagct 20 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 gtctggcttt ttcttcaaca tgaggt 26 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 tccagaaagg tacttctcca cat 23 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 caagagtctt gaaacttaga acacccta 28 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 agagtcttga aacttagaac accctc 26 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 cgatgctttt gtttctgctg ttcaac 26 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gctcaagaac gattatgcaa gagt 24 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 aagttaacat cgagaccagc tgatag 26 <210> 102 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 tttaagttaa catcgagacc agctgatat 29 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 tcattgttag cttgatgaaa ccacaaatta aagaa 35 <210> 104 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ggattagtgt ggctttaaca tttaagtt 28 <210> 105 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 accttatcac gtcatatttt cgacgaat 28 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 ccttatcacg tcatattttc gacgaac 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 gccaatacaa gaaggaggaa ctgaaaa 27 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 ggagcagata ccttatcacg tca 23 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 ccaggtcttt atttgatacg tcttcct 27 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 ccaggtcttt atttgatacg tcttccc 27 <210> 111 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 caacatacgc acatagaaga aaatgtagtg att 33 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 tcctgataaa aatccagatc caggt 25 <210> 113 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 ccccaccact aatgaactaa aactct 26 <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 ccccaccact aatgaactaa aactca 26 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 aaaaccgaaa aagatacgag gaggaaga 28 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 ccttattact ccgtaagtcc cca 23 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 gtcgagtagc tcgggaagtc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 gtcgagtagc tcgggaagtt 20 <210> 119 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 acaagccgag ctactgcgt 19 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 ggcagtggtg aattctgtat tttaga 26

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 부터 서열번호 24까지 각 61번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 SNP 조성물.
  2. 제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism)의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 마이크로어레이.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정되는 것을 특징으로 하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발용 마이크로어레이.
  4. 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
    제1항에 기재된 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법.
  5. 제1항에 기재된 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 폴리뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 25 내지 120의 24개 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트로서, 상기 각 프라이머 세트는 서열번호 25부터 시작하여 순서대로 인접한 서열번호의 네 개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  7. 제5항 또는 제6항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발을 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제5항 또는 제6항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 제1항에 기재된 서열번호 1 내지 24의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 양배추의 계통 순도검정 및 조기 고정 계통 선발 방법.
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