KR102144673B1 - 참외의 품종 구별 및 f1 종자 순도검정을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 23개 SNP 마커는 참외의 12개 염색체 전체에 분포하며, 신속·정확하게 참외 품종을 구별할 수 있으므로, 참외의 품종 육성에 활용될 수 있을 것이다.

Description

참외의 품종 구별 및 F1 종자 순도검정을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도{KASP primer set based on SNP for discriminating Korean melon cultivar and F1 hybrid purity checking and uses thereof}

본 발명은 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것입니다.

참외(Cucumis melo var. makuwa)는 박과에 속하는 덩굴식물로 분류학적으로 멜론(Cucumis melo)의 한 변종이다. 박과 작물의 국내 종자 시장은 320억 정도로 전체 채소 종자시장의 약 20%를 차지하고 있으며, 그 중 참외는 박과 작물 중 수박에 이어 2번째로 종자시장 규모가 크고 매년 시장 규모와 재배 면적이 다소 증가하는 추세에 있다.

현재 유통 중인 참외는 거의 모두 양친의 교배를 통하여 생산된 일대 잡종 품종들이다. 일대 잡종(F₁) 품종에서는 생산된 종자에 대하여 순도검정을 실시하게 되는데, 이는 의도하는 양친간 교배의 성립여부, 즉 이형성(heterozygosity)을 검정하고 그 정도를 순도(%)로서 표시하는 품질관리 행위를 말한다. 이와 관련하여 순도가 떨어지는 원인으로는 수정시 타화분의 오염과 모본의 자식, 다른 종자의 단순 혼입 등이 있을 수 있다. 이 중에서 모본의 자식 개체 발생의 경우 빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 모든 종자회사는 F₁ 종자의 순도검정을 위한 자체 검정 시스템을 기본적으로 유지하고 있다. 이는 해당 교배종 품종의 기본 유전적 특성을 유지시키는 품질관리 차원으로서 뿐만 아니라, 고품질 농산물의 재배 생산을 위하여 필수적인 고순도 종자를 확보하기 위한 기술적 수단이며, 종자의 품질 저하에서 초래되는 재배농민의 소득저하와 민원발생 요인을 원천적으로 방지하는 효과 등 매우 중요한 의미를 갖는 과정이다.

참외는 국내에서는 경제적, 상업적으로 중요한 작물이며, 수출 품종 육성의 중요성도 눈에 띄게 대두되고 있다. 참외는 세대가 짧고 타 작물에 비해 고정이 잘되어 계통 개발에 걸리는 시간이 매우 짧기 때문에, 개발된 품종 및 계통의 보호를 위해서는 품종 보호를 위한 분자표지 개발이 필수적이다.

한편, 한국등록특허 제1516190호에는 '참외 계통 또는 품종의 구별을 위한 SSR 프라이머 세트 및 이들의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1447112호에는 '재배종 참외 품종으로부터 한국 재래종 계통인 곶감참외 품종을 선별하기 위한 바이오 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한국 재래종 계통인 곶감참외를 참조 유전체로 하여 다양한 참외(Cucumis melo var. makuwa) 품종의 유전체 분석을 통해 참외 12개 염색체에서 참외 품종을 구별할 수 있는 23개의 참외 특이적 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 선별한 후 상기 마커를 증폭시키기 위한 KASP용 프라이머 세트를 제작하고 유전형 분석을 수행하여 17개 참외 품종을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 69로 표시된 올리고뉴클레오티드에서 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 23개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 참외(Cucumis melo var. makuwa) 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 참외 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정 방법을 제공한다.

본 발명의 KASP용 프라이머 세트는 다양한 참외 품종을 구별할 수 있고 참외의 전체 유전체 수준에서 F₁ 종자 순도검정이 가능하므로, 참외의 품종 개발, 품종 보호 및 종자 생산에 효율적인 바이오 마커로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 참외의 12개 염색체상에 존재하는 SNP를 나타낸 것으로, 최종 선발된 23개의 SNP 부분은 파란색으로 표시하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 69로 표시된 올리고뉴클레오티드에서 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 23개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 참외(Cucumis melo var. makuwa) 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 참외 품종은 오복꿀 참외, 오복꿀플러스 참외, 참미소꿀 참외, 꿀사랑 참외, 토종꿀 참외, 부자꿀 참외, 제왕꿀 참외, 신금싸라기 참외, 대박꿀 참외, 금제 참외, 마나따벌꿀 참외, 대장금플러스 참외, 팔복꿀 참외, 황깔꿀 참외, 황금도끼 참외, 참깔 참외 또는 슈퍼금덩어리 참외일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 참외 유전자좌에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 연속되는 서열번호 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 구체적으로는 정방향 프라이머의 5' 말단에는 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP를 나타내는 염기가 결합되어 있으며, 역방향 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 SNP 부분의 대립유전자에 동일한 염기쌍으로 이루어져 있다(표 3).

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 23개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 상기 23개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 참외 품종을 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(28개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 69의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 및 67의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 형광물질 FAM이 부착된 정방향 프라이머이고, 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65 및 68의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 HEX가 부착된 정방향 프라이머이며, 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66 및 69의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 69로 표시된 23개의 프라이머 세트를 조합하여 전술한 17개의 참외 품종을 구별할 수 있다. 예를 들어, 하기 표 5의 오복꿀 참외(1)는 서열번호 13, 14 및 15; 서열번호 16, 17 및 18; 서열번호 19, 20 및 21; 서열번호 22, 23 및 24; 서열번호 25, 26 및 27; 서열번호 28, 29 및 30; 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 49, 50 및 51; 서열번호 52, 53 및 54; 서열번호 55, 56 및 57; 서열번호 58, 59 및 60; 서열번호 61, 62 및 63; 및 서열번호 64, 65 및 66의 프라이머 세트를 이용하여 구별할 수 있다. 또한, 오복꿀 참외 이외에, 오복꿀플러스 참외, 참미소꿀 참외, 꿀사랑 참외, 토종꿀 참외, 부자꿀 참외, 제왕꿀 참외, 신금싸라기 참외, 대박꿀 참외, 금제 참외, 마나따벌꿀 참외, 대장금플러스 참외, 팔복꿀 참외, 황깔꿀 참외, 황금도끼 참외, 참깔 참외 또는 슈퍼금덩어리 참외도 23개의 프라이머 세트를 조합하여 구별할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP용 키트를 제공한다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

참외 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 KASP용 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및

상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 참외 품종 구별 및 F₁ 종자 순도검정 방법을 제공한다.

본 발명의 참외 품종 구별 방법에 있어서, KASP용 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 참외 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 하기 표 3에 기재된 바와 같다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계는 유전형 분석을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 정방향 프라이머의 5' 말단에 부착되어 있는 형광물질 FAM 또는 HEX와, 3' 말단에 결합된 SNP를 통해 유전형을 구별하여 참외 품종을 구별할 수 있다. 유전형이 동형접합체(homozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 중 한 개의 형광만 검출된 것으로, FAM이 검출되면 유전형 'A', HEX가 검출되면 유전형 'B'로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. SNP 마커 정보

참조 유전체를 작성하기 위해 곶감참외를 대상으로 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS) 및 Hi-C 방법으로 유전체 정보를 얻었고 다양한 생물정보 분석 방법을 통해 12개의 염색체로 구성된 참외 게놈 정보를 구축하였다(실험실 보유). 열골참외, 은천참외, 안종참외, 강서참외, 조선참외, 먹참외, 노랑참외, 간치참외, 개루리 참외 및 야생종 참외를 포함한 36개의 다양한 재래종 참외 및 참외 계통의 유전체 분석을 위한 NGS 리드(read)를 생산하였고, 생산된 리드는 퀄리티가 낮은 서열을 제거한 후 BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)를 이용하여 곶감참외 참조서열에 맵핑하였다. 맵핑된 리드들은 SNP 콜링(calling)의 정확도를 높이기 위해 게놈 분석 툴인 GATK(http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/The_Genome_Analysis_Toolkit)를 이용하여 이중 마스킹(duplicate masking), 국소적 재정렬(local realignment) 과정을 수행한 후 UnifiedGenotyper를 이용해 SNP(single nucleotide polymorphism)를 예측하고 필터링 과정을 거쳐 526,271개의 SNP를 확보하였으며(표 1), 그 중 분석 가능한 SNP 519개를 선별하여 염색체별로 정리하였다(표 2 및 도 1), 또한, 12개 염색체별로 SNP가 고르게 분포할 있도록 염색체 당 4개의 SNP를 대상으로 분석하였고, 이 중에서 34개의 SNP가 제대로 반응됨을 확인하였다.

염색체별 SNP의 수

염색체	SNP 수
chr01	30,722
chr02	56,304
chr03	46,341
chr04	39,895
chr05	62,051
chr06	101,010
chr07	67,189
chr08	66,693
chr09	17,183
chr10	11,224
chr11	16,472
chr12	11,187
합계	526,271

염색체별로 선별된 SNP 마커

염색체	길이 (Kb)	SNP 수	500 Kb당 평균 SNP 수
chr01	30,382.071	49	0.81
chr02	22,746.494	39	0.86
chr03	21,121.645	36	0.85
chr04	29,198.730	50	0.86
chr05	27,871.970	39	0.70
chr06	34,894.544	55	0.79
chr07	23,387.212	42	0.90
chr08	32,358.245	55	0.85
chr09	19,018.732	34	0.89
chr10	19,826.103	36	0.91
chr11	26,513.796	48	0.91
chr12	20,136.143	36	0.89
합계	307,455.685	519	0.84

3. SNP 마커 선정 및 상기 SNP 기반 KASP 프라이머 제작

상기 선별된 34개의 SNP를 기반으로 제작된 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트는 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 정방향 프라이머는 5' 말단에 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP와 같은 염기서열의 차이가 구분되도록 디자인하였다. 그리고 역방향 프라이머는 상기 2개의 정방향 프라이머와 작동하여 PCR 반응이 진행될 수 있도록 디자인하였다(표 3). PCR을 수행하면 2개의 정방향 프라이머의 5' 말단에 각기 다른 형광물질이 붙은 채로 증폭되므로, 형광물질의 파장 차이에 따라 유전형을 분석하였다. 유전형이 동형접합체(homozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 중 한 개의 형광만 검출된 것으로, FAM이 검출되면 유전형 'A', HEX가 검출되면 유전형 'B'로 판단할 수 있다. 참조 유전체(곶감 참외)에 존재하는 SNP는 FAM이 부착된 정방향 프라이머에 의해 검출될 수 있도록 디자인하였다.

4. SNP 마커 검출을 위한 KASP 반응 조건

LGC genomics(Laboratory of the Government Chemist Genomics)에서 권고한 방법으로 실시하였고, 실험에 사용한 시약은 KASP 2X master mix 및 KASP Assay mix(LGC genomics)이다. KASP 반응 조건은 하기 표 4와 같다.

KASP 조건

단계	온도(℃)		시간	반복 횟수
Hot-start activation	94		15초	1
Denature	94		20초	10
Annealing/Elongation	61~55 (사이클 당 0.6℃씩 감소)		1분
Denature	94		20초	26
Annealing/Elongation	57		1분

실시예 1. KASP 용 프라이머 세트를 이용한 참외 품종 구별

17개 참외 품종을 대상으로 상기 34개의 KASP용 프라이머 세트를 이용하여 유전형 분석을 수행하였다. 17개 참외 품종은 다음과 같다; 1. 오복꿀 참외(농우바이오); 2. 오복꿀플러스 참외(농우바이오); 3. 참미소꿀 참외(농우바이오); 4. 꿀사랑 참외(농우바이오); 5. 토종꿀 참외(팜한농); 6. 부자꿀 참외(팜한농); 7. 제왕꿀 참외(팜한농); 8. 신금싸라기 참외(팜한농); 9. 대박꿀 참외(팜한농); 10. 금제 참외(아시아종묘); 11. 마나따벌꿀 참외(아시아종묘); 12. 대장금플러스 참외(아시아종묘); 13. 팔복꿀 참외(현대종묘); 14. 황깔꿀 참외(현대종묘); 15. 황금도끼 참외(현대종묘); 16. 참깔 참외(코레곤); 및 17. 슈퍼금덩어리 참외(제일종묘). 참조 유전체에 존재하는 SNP는 FAM 형광물질이 부착된 정방향 프라이머에 의해 검출될 수 있고, 유전형 A로 나타내었다.

그 결과, 예를 들어, '오복꿀 참외'는 C01-sp010886, bgs00289, C09-sp000673, C08-sp000276, C03-sp004954 및 bgs01444 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 유전형 분석 결과에서 유전형 A를, bgs00659, bgs04958, C09-sp007875, bgs04175, bgs04286, bgs05223, bgs00068, bgs52645 및 bgs02242 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 유전형 분석 결과에서는 유전형 B를 나타내어 이와 같은 유전형 분석 결과의 조합을 통해 다른 참외 품종으로부터 구별될 수 있었고; '오복꿀플러스 참외'는 C01-sp010886, bgs00289, C09-sp000673, C08-sp000276 및 bgs01444 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 유전형 분석 결과에서 유전형 A를, bgs00659, bgs04958, C09-sp007875, bgs04286, bgs05223, bgs00068, bgs52645 및 bgs02242 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 유전형 분석 결과에서는 유전형 B를 나타내어, 이와 같은 유전현 분석 결과의 조합을 통해 다른 참외 품종으로부터 구별될 수 있었다. 다만, 34개의 프라이머 세트 중에서 11개의 프라이머 세트는 유전형 결과가 동형(A 또는 B) 또는 이형(H)으로 명확하게 확인되지 않고, A/H, B/H 유전형, 또는 '-'로 표시되는 결과가 확인되어, 최종적인 참외 품종 구별을 위한 프라이머 세트에는 제외하였다(하기 표 5에서 파란색으로 표시된 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트).

3-F; 참미소꿀 참외의 부본.

3-M; 참미소꿀 참외의 모본.

4-F; 꿀사랑 참외의 부본.

4-M; 꿀사랑 참외의 모본.

실시예 2. KASP 용 프라이머 세트를 이용한 참외 F ₁ 종자 순도검정

상기 KASP용 프라이머 세트를 이용하여 참미소꿀 참외 또는 꿀사랑 참외의 부본 및 모본을 대상으로 유전형 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 참미소꿀 참외 또는 꿀사랑 참외의 모본 및 부본에서 모두 동형접합(homozygous)하게 검출되었다. 이는 개발된 마커의 유전자위가 품종개발에 쓰이는 고정종(원종 또는 양친)에서 잘 고정되어 있는 위치여서 F₁에서 순도검정에 유용한 위치임을 의미한다. 또한, bgs01227, bgs14324, bgs03305, bgs21920, C01-sp011515, bgs00074, bgs00659, bgs04958, bgs05223, bgs05705, bgs07516, bgs08106, bgs02460 또는 bgs02242의 프라이머 세트는 모본 및 부본 간에 다형성을 나타내어 F₁ 순도검정에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 KASP용 프라이머 세트는 참외의 각 염색체별로 존재하는 SNP를 기반으로 개발된 것으로, 전체 유전체 수준으로 유전형을 분석할 수 있어 보다 정확하고 효율적으로 순도검정을 할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> KASP primer set based on SNP for discriminating Korean melon cultivar and F1 hybrid purity checking and uses thereof <130> PN18449 <160> 102 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cctttcattt tctatggtct ttgacttc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atcctttcat tttctatggt ctttgacttt 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taatgtgatg tcgacacaca cattccaat 29 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aataagaaat gggagtgaga gtaagg 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caataagaaa tgggagtgag agtaaga 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cttcctccat ggtttatttt cgtcacatt 29 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgcacagatt caaaactcga cact 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcacagattc aaaactcgac acc 23 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgaaaatat ctagtagcga ccgaacaaaa 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggacggtca tgtggaatcc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctcggacggt catgtggaat ca 22 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcctcgagat tacacttttg tgttcaat 28 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agtattatat gtagataata ttctactcat tgg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agtattatat gtagataata ttctactcat tgt 33 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 attgatatca gtaagataac gtacgacatt 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 actgcacata aactgttatg ggtatag 27 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ataactgcac ataaactgtt atgggtatat 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aatagggaag tagggtggtc ttaacattt 29 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gttattgctg atcgtaagca tcaaac 26 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atgttattgc tgatcgtaag catcaaat 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ttaaagacat gagtccaaca tcccatgaa 29 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gaaatctaaa caagaaagat tcatatcctc 30 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ctgaaatcta aacaagaaag attcatatcc tt 32 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccaccttcat ctatggtgct tgcta 25 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gaatcaactt gttcaaaacc gacacg 26 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gaatcaactt gttcaaaacc gacaca 26 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gggaaagttc agctcaaaag catcataa 28 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 atggccatga taaaagacca tcagg 25 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gatggccatg ataaaagacc atcaga 26 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtcatgattg tccagataac cacgtttt 28 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gaatcaagct aagcatggtc tgaac 25 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aagaatcaag ctaagcatgg tctgaaa 27 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cggctcctat ttgacacttt atacatgta 29 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gccacgcttg ttggagatga c 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ggccacgctt gttggagatg at 22 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tctccacttc ctccgaaaat aactagttt 29 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ctcgatgtgt tattccactt gc 22 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cctctcgatg tgttattcca cttgt 25 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tggtatgaca gggcagccag ca 22 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cagcacaatt aggattttga tggcc 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cagcacaatt aggattttga tggct 25 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 cgacttggca aactaagtcg ccatt 25 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 aagaacctca aaacttttgt atactcaaac 30 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gaaagaacct caaaactttt gtatactcaa at 32 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cgcttatcaa agcttgcctc gacta 25 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cttatgattg ccaacaatat tcctgt 26 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cttatgattg ccaacaatat tcctgc 26 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 caaaagctta aattagtggg tgaaggcaa 29 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gttagttaat cttaaatcgt tggagctca 29 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 agttaatctt aaatcgttgg agctcg 26 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 tagtgtggga acctaatgga ccaataaat 29 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 aatgggttat cttcaacaac tattaaaagc 30 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 aaaatgggtt atcttcaaca actattaaaa gt 32 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gagtacatgc caaacactac aggaaataa 29 <210> 55 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 tccaactcac tcaattgtga cttaca 26 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ccaactcact caattgtgac ttacc 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gcctccaagt gttgagacgt acaaa 25 <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 aattgatgaa acttataagt gcaagtgg 28 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gtaattgatg aaacttataa gtgcaagtga 30 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 cgttgctcta atctccattc acaaatcat 29 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 aattggttta aggtccaagt tataaactg 29 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 caattggttt aaggtccaag ttataaacta 30 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 caccgtctca ttagctcgag agaaa 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gtccaggtta tttgtaagcc tttgg 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gtccaggtta tttgtaagcc tttgc 25 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 tgggtattca taaaacttca cgaaaaccta 30 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 acattcaaat agcaaatgac taacagattc 30 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 aatacattca aatagcaaat gactaacaga ttt 33 <210> 69 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 cctgtcattg ttgatgatgt ctttggtaa 29 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 gttcaaattc ggttcctaca acttattaaa 30 <210> 71 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 caaattcggt tcctacaact tattaag 27 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ggatgtcgtt aaggtaattg gtcatgttt 29 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gagcacatgt caaagcagta gtatct 26 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 agcacatgtc aaagcagtag tatcc 25 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 cgtttaagag tctttgttgg cttagagat 29 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ccccgattat aacaggttgc acc 23 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 accccgatta taacaggttg caca 24 <210> 78 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 gtcggtggtt attatagttt gtcaggtat 29 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 gatgtctcgt aggaagactc gg 22 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 agatgtctcg taggaagact cga 23 <210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 tgtgggattt catacagatg cctaatgat 29 <210> 82 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 gatgtgtatg ttcatatagg aattgtcg 28 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 atgatgtgta tgttcatata ggaattgtca 30 <210> 84 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 tttccataaa gttgctcgat tgcaaggat 29 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 cacacgcgtc atcatcacgt tg 22 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 aatcacacgc gtcatcatca cgttt 25 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 cacatgcaag aaataagtga attccatgta 30 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 cataccatct agttggtgca tctg 24 <210> 89 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 gcataccatc tagttggtgc atcta 25 <210> 90 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 cagaaaacaa aggcctacag ctattgaaa 29 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 aataattttg aaaacggaaa aagcctactg 30 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 aaaataattt tgaaaacgga aaaagcctac ta 32 <210> 93 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 cgcgtattga ttgggacagt ttttgtatt 29 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 acacgattgt ttagatttgg ttaccc 26 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 acacgattgt ttagatttgg ttacct 26 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 tggggtaacg atcatttagt caaatctaaa 30 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 aatcttcata tgtaggctaa acgatcc 27 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 ataaatcttc atatgtaggc taaacgatct 30 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 gtcgaagaac ctgcatgagt tgagat 26 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gcatattaat ttgtatcttg aatttgctcg 30 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 gcatattaat ttgtatcttg aatttgctcc 30 <210> 102 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 tacaaattac agcacgcttg gaggaattt 29

Claims (5)

1. 서열번호 1 내지 69로 표시된 올리고뉴클레오티드에서, n이 동일한 값을 갖는 서열번호 3n, 서열번호 3n-1, 및 서열번호 3n-2의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트(n은 1 내지 23의 자연수)인 것을 특징으로 하는 23개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 참외(Cucumis melo var. makuwa) 품종 구별 또는 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 참외 품종은 오복꿀 참외, 오복꿀플러스 참외, 참미소꿀 참외, 꿀사랑 참외, 토종꿀 참외, 부자꿀 참외, 제왕꿀 참외, 신금싸라기 참외, 대박꿀 참외, 금제 참외, 마나따벌꿀 참외, 대장금플러스 참외, 팔복꿀 참외, 황깔꿀 참외, 황금도끼 참외, 참깔 참외 또는 슈퍼금덩어리 참외인 것을 특징으로 하는 참외 품종 구별 또는 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP용 프라이머 세트.
3. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 참외 품종 구별 또는 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP용 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 참외 품종 구별 또는 F₁ 종자 순도검정을 위한 KASP용 키트.
5. 참외 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및
   상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 참외 품종 구별 또는 F₁ 종자 순도검정 방법.

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