KR20160019419A - 암 관련 물질의 라만 정량 방법 - Google Patents

Abstract

[과제]
암 세포 유래의 유리DNA를 측정하기 위한 라만 정량 분석방법의 제공
[해결수단]
과산화은을 포함하는 은산화물의 메소결정 영역을 갖는 바이오칩을 준비하여, 상기 바이오칩의 메소결정 영역에 혈청 또는 생체시료액을 적하하여, 시료 중의 정전하를 갖는 암 관련물질을 선택적으로 흡착하여, 흡착한 암 관련물질에 대하여 레이저 조사하여 그로부터의 라만 산란광을 검지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만산란(SERS)의 강도에 의해 암 질병을 판단한다. 라만산란 스펙트럼에 탄소 특유의 D밴드 및 G밴드에, 메틸기 특유의 2900cm^-1 부근에 암 관련 물질의 특성 피크 스펙트럼으로서 검출하는 것이 가능하다.

Description

암 관련 물질의 라만 정량 방법 {RAMAN QUANTIFICATION METHOD OF CANCER-RELATED SUBSTANCE}

본 발명은, 암의 진행에 따라 증가하는 혈중 암 관련 물질, 주로 유리(遊離)DNA를 대상으로 하는 암 관련 물질의 라만 정량 방법에 관한 것이다.

종래부터, 암의 진단방법의 하나로써, 암의 진행에 따라 혈액 중에 나타나, 증가하는 암 관련 물질을 검출하는 방법이 이용된다. 여기에서, 암 관련 물질이란, 암 환자의 체액에서 추출되는 암 특유물질로, 일반적으로 암화한 세포가 파괴되거나 했을 경우에 혈액 중에 유리되는, 그 파괴된 암세포에서 유래된 단백질 등을 가리킨다. 그리고, 종래의 암 진단방법에서는, 혈액중의 암 관련 물질의 정량값이 어느 일정값 이상인 경우에, 피험자가 암에 이환되어 있을 가능성이 있다고 판정된다.

이와 같이 암화한 세포의 파괴 등에 의해 혈액 중에 유리되는 암 관련 물질로서는, 단백질뿐만 아니라, DNA도 마찬가지로 유리되는 것이 알려져 있다. 그리고, 정상인과 암환자를 비교하면, 혈액 중 암세포에서 유래된 유리DNA(ctDNA)의 양은, 암환자 쪽이 정상인보다 유의하게 많다는 것이 보고되어 있다. 따라서, 혈액 등 체액중의 암세포에서 유래된 유리DNA를 정량함으로써, 피험자가 암에 이환되어 있는지 여부를 진단하는 것이 가능해 진다고 생각되어, 이러한 암의 진단방법으로서, 예를 들면, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)법 등으로 증폭되는 200bp 이상의 DNA가 체액이나 체외에 배출된 분편중 등에서 검출된 경우, 피험자가 암에 이환되어 있을 가능성이 있다고 진단하고, 추가로 그 DNA의 변이를 해석하는 방법(특허문헌 1), 체액 등에 포함되는 세포잔사에서 유래된 게놈DNA를 정량하여, 그 값이 어느 일정값 이상인 경우에, 추가로 DNA검사를 실시하는 방법(특허문헌 2)이 제안되어 있다.

그런데, 진단에 의해 암에 이환되어 있는 것이 판명되어도, 체액중의 DNA를 정량하는 것 만으로는, 암이 발생하고 있는 장기를 특정하는데 까지는 이르지 않는다. 그리고, 암이 발생하고 있는 경우에는, 그 발생하고 있는 장기에 의해, 특이적인 DNA의 변이가 생기고 있는 것이 알려져 있다. 따라서, DNA의 변이의 종류를 분명하게 함으로써, 암이 발생하고 있는 장기를 특정할 수 있을 가능성이 있다. 여기에서 DNA의 변이로서는, DNA의 점돌연변이, 염색체의 결실이나 증폭 등의 구조이상을 들 수 있다. 예를 들면, 췌장암의 약 7할은, K-ras 유전자에 점돌연변이가 생기고 있는 것이 알려져 있다. 또한, 이형접합의 결실(Loss　of　heterozygous, 이하, LOH로 약기한다)의 해석에서도, 각 암종에 특이적인 염색체팔의 결손이 보고되어 있고, 예를 들면, 폐암에서는 3번 염색체의 짧은팔에 LOH가 집중되어 있는 것이 알려져 있다. 또한, 유방암에서는 8번 염색체의 긴팔의 증폭이나, RB2의 증폭이 알려져 있다. 그래서, 암세포에서 유래된 DNA를 정량하여 암의 진단을 정확하게 실시하는 방법을 제공하기 위하여, 피험자로부터 채취한 혈장보다 유리DNA를 추출하는 공정과, 추출한 유리DNA를 정량하여 혈장단위체적당 유리DNA를 산출하는 공정과, 산출한 유리DNA의 산출값을 제1 임계값 이상의 제2 임계값과 비교하는 공정과, 산출값이 제1 임계값 미만의 경우는 피험자의 암이환 가능성이 높다고 판정하고, 반면 제2 임계값 이상인 경우는 정상세포에서 유래된 DNA가 혈장 중에 혼입되어 있다는 암의 진단방법이 제안되고 있다(특허문헌 3).

미국특허 제6143529호 명세서 미국특허 2004/0259101 A1호 명세서 국제공개 2008/090930호 특개 2011-81001호 공보

없음

그렇지만, 예를 들면, 전혈중의 암세포에서 유래된 유리DNA를 정량하려고 해도, 그 양은 미량인 것에 대해, 전혈 중에는 정상세포인 림프구에서 유래된 DNA가 대량으로 포함되어 있다. 따라서, 전혈로부터 그대로 DNA를 추출해도, 암세포에서 유래된 유리DNA를 정량하는 것은 곤란하다. 그래서, 예를 들면, 전혈로부터 분리한 혈장을 이용하고, 혈장중의 암세포에서 유래된 유리DNA를 추출하여 정량하는 방법을 생각할 수 있으나, DNA의 추출방법에 따라서는, 림프구 등의 정상세포에서 유래된 DNA가 혼입하는 경우가 있고, 암세포에서 유래된 유리DNA가 아닌, 정상세포에서 유래된 DNA를 정량해 버리는 경우가 있어, 암을 잘못 진단할 가능성이 있다. 그래서, 암의 정확한 진단에는, 암세포에서 유래된 유리DNA(본 발명에서는 히스톤에 감긴 DNA를 말한다)를 정확하게 정량하는 것이 중요하기는 하나, 미량의 유리DNA를 어떻게 간이, 신속히 추출하는지, 정상세포에서 유래된 DNA를 어떻게 제거하여 유리DNA의 검출 정밀도를 향상시키는지, 어떻게 미량의 DNA를 정밀하게 검출할 지가 암의 적절한 진단에는 필요하다.

그런데, 혈중의 미량 DNA를 분석하는 수법으로써 라만 분광분석기법을 사용하여, 정성적 및 정량적으로 검출하는 수단의 제공을 필요로 하지만, SERS현상은, 1) 메커니즘이 완벽하게 이해되지 않을 뿐만 아니라, 2) 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노물질합성 및 제어가 곤란한 것과, 3) 스펙트럼을 측정할 때 사용되는 광의 파장, 편광방향에 의한 증강효율의 변화 등에 의해, 재현성 및 신뢰성 측면에서 해결해야 할 문제가 많고, 나노-바이오센서의 개발 및 상용화를 시작으로 한 SERS현상의 응용에 큰 과제로써 남아 있어, 나노와이어와 나노파티클의 하이브리드 구조를 이용하여, 생체추출물 및 단백질, DNA와 같은 바이오분자의 SERS신호의 증강과 측정의 재현성, 민감도 및 신뢰도향상을 도모하는 기술이 제안되고 있지만(특허문헌 4), 나노와이어와 나노파티클의 하이브리드 구조가 수용체를 통해 피측정대상을 흡착시키는 것에서, 미량인 암세포에서 유래된 DNA를 검출하는 방법으로서는 적절한 것이 아니다.

그래서, 본 발명자들은, 검출대상으로 해야 할 것은, 암이 발병하기 쉬운, 또는 발병하고 있을 때 혈액 중에서 증가하는 암 관련 물질, 예를 들면 암세포에서 유래된 유리DNA를, 수용체를 통하는 일 없이, 직접 검출하는 것이 최선이라고 생각하여, 예의 연구를 실시했다.

여기에서, 검출해야 할 대상의 유리DNA는 실감개에 상당하는 히스톤이라고 하는 단백질에 감겨 있고, 한번 감긴 단위구조(1세트)는 뉴클레오솜이라고 하며, 뉴클레오솜이 모여 끈형상이 된 구조를 크로마틴(섬유)이라고 한다. 그리고, 세포가 암화하여 분열을 반복할 때, 암이 증가하는데 조건이 나쁜 유전자(암억제 유전자)가 나오지 않도록 확실히 히스톤에 감아 뚜껑을 덮고, 히스톤에 감는 방법을 더 강하게 하여, DNA가 간단하게는 풀리지 않도록 해서, 메틸화라고 하는 수식이 일어나고 있지만, 통상 히스톤은 (+), DNA는 (-)로 충전되어 있고, 2개는 자석과 같이 맞붙고, 게다가 메틸화해서 풀리지 않도록 되어 있어, 히스톤에 감긴 DNA는 (+)로 대전되어 있다(도 11(a) 참조). 한편, 아세틸화는 (-)로 충전하기 위해, 통상은 (+)의 히스톤이 아세틸화 되면, (-)끼리가 되어 DNA와 반발한다. 그러면, DNA라고 하는 '실'이 히스톤으로부터 풀려서 유전자가 발현하는 메커니즘이 되어 있다(도 11(b) 참조). 따라서, 암세포에서 유래된 유리DNA를 선택적으로 흡착시키기 위해서는, 히스톤에 감긴 DNA는 (+)로 대전되어 있으므로, 흡착시키는 기판은 (-)에 대전하고 있는 것이 바람직하다고 사료된다.

그런데, 본 발명자들은 금속착체수용액을 착체를 형성하는 금속보다 낮은 전극전위(이온화경향이 큰) 금속기판상에서 전극전위의 차에 의해 화학 환원해서 양자결정(나노사이즈의 금속착체결정)을 응집시키고 있다. 은착체의 경우, 티오황산은수용액을 은보다 낮은 전극전위(이온화경향이 큰)의 동 또는 동합금상에서 응집시킴으로써 은착체의 양자결정을 화학 환원법을 채용하여 형성하고 있다.

자세하게는, 금속착체의 수용액중의 농도는 주로 형성하는 양자결정의 사이즈를 고려해서 결정해야 하고, 분산제를 사용할 때는 그 농도도 고려하는 것이 좋고, 통상, 100ppm에서 5000ppm의 범위에서 사용할 수 있지만, 리간드의 기능에도 의존해서 나노클러스터라고 할 만한 나노사이즈를 조제하려면 500에서 2000ppm의 농도가 바람직하다. 양자결정을 형성하는 금속착체는 담지금속의 전극전위E와 상관하는 식(I)에서 나타낸 착체 안정도 정수(logβ) 이상을 가지도록 선택된다.

식(I): E°=(RT/｜Z｜F)ln(β_i)

(여기에서 E°는 표준전극전위, R은 기체정수, T는 절대온도, Z는 이온값, F는 패러데이정수를 나타낸다. )

여기에서, 금속착체가, Au, Ag, Pt 또는 Pd로부터 선택되는 플라스몬 금속의 착체인 경우는, 라만광에 대해서 국재(局在) 표면 플라스몬 공명증강효과를 가진다. 특히, 금속착체가 은착체일 때는, 안정도 정수(생성 정수)(logβ_i)가 8 이상의 은착화제와 할로겐화은의 반응에 의해 형성되는 것이 좋고, 할로겐화은으로는 염화은이 바람직하고, 착화제로써는 티오황산염, 티오시안산염, 아황산염, 티오요소, 요오드화칼륨, 티오살리실산염, 티오시아누르산염으로부터 선택되는 1종인 것이 바람직하다. 은착체는 평균직경이 5~20nm인 나노클러스터로 이루어진 양자도트를 가지며, 양자결정의 사이즈가 100~200nm가 된다.

해당 은착체를 할로겐이온의 존재하에 알칼리처리(하이포염소산으로 처리)하면, 이하의 반응에 의해 은할로겐화물을 핵으로써 과산화은을 포함하고, 은산화물의 복합물의 침상 나노결정군이 형성되고(도 9), 게다가 수중에서 (-)하전을 띠는 한편, 히스톤에 감겨 DNA가 (+)하전을 띠므로(도 11(a)), 이 유리DNA로 대표되는 정전하를 띤 암 관련 물질을 선택적으로 흡착하는 것을 발견했다. 게다가 과산화은을 포함하는 은산화물의 침상 나노결정군은 레이저광의 조사에 의해 환원되어, 금속은을 석출하므로, 레이저광 조사에 의해 표면 플라스몬 증강 효과를 나타내어, 흡착된 유리DNA로 대표되는 암 관련 물질을 검출하는 표면증강 라만 산란(SERS)을 얻을 수 있는 것을 발견했다.

Na₂S₂O₃ + 4NaClO + H₂O → Na₂SO₄ + H₂SO₄ + 4NaCl

Ag+ + NaCl → AgCl + Na+

Ag+ + 3NaOCl → 2AgCl + NaClO₃ + 2Na+

Ag+ + OH- → AgOH

2Ag+ + 2OH → Ag₂O + H₂O (미국특허 제4478943호 참조)

본 발명은 상기 지견을 근거로 이루어진 것으로, 은할로겐화물 또는 할로겐을 포함하는 은산화물의 복합 침상 나노결정군을 포함하고, 수중에서 음전하를 나타내고, 정전하의 암 관련 물질을 흡착해서 전하이동착체의 형성이 가능함과 동시에 광조사에 의해 은입자가 석출 가능하고, 레이저 조사에 의해 표면 플라스몬 증강 효과를 얻을 수 있는 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 암 관련 물질 측정용 바이오칩을 요지로 하는 것이다.

본 발명의 은산화물의 복합 침상 나노결정군은, 과산화은을 포함하는 은산화물이 자기조직화해서 뉴런형상의 3차원초구조체(메소결정이라고 한다)를 형성하는 것으로(도 12 및 13), 은이온 수용액을 Ag/AgCl 전극을 이용해서 정전위전착을 실시하여 형성할 수 있지만, 은착체 양자결정, 예를 들면 티오황산은 양자결정을 할로겐이온의 존재하에서 알칼리처리(하이포염소산 나트륨 수용액으로 처리)함으로써 용이하게 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오칩을 이용함으로써, 라만 분석에 의해, 혈중에 포함된 생체시료 중 암 관련 물질, 예를 들면 암세포에서 유래된 유리DNA를 이하의 방법으로 정량할 수 있다. 즉, 은할로겐화물 또는 할로겐을 포함하는 은산화물의 복합 침상 나노결정군, 즉 과산화은을 포함하는 은산화물의 메소결정영역(도 12 및 13)을 가지는 바이오칩을 준비하고, 그 바이오칩의 침상 나노결정군 영역에 혈청 또는 생체시료액을 적하하고, 시료중의 정전하를 가지는 암 관련 물질을 선택적으로 흡착하고, 흡착한 암 관련 물질에 대해 레이저 조사하여 그로부터의 라만 산란광을 검지하는 공정에 의해, 표면증강 라만 산란(SERS)의 강도에 의해 암 질병을 판단할 수 있다.

혈청중의 암 관련 물질로써는, 암세포에서 유래된 히스톤에 DNA가 감겨 이루어진 DNA(여기에서 유리DNA라고 한다), 그 한번 감겨진 단위구조(1세트)의 뉴클레오솜이 모여 끈형상이 된 구조의 크로마틴(섬유)을 포함한다. 또한, 정전하를 띠는 글로불린을 포함하지만, 그 증가는 다른 암 관련 물질에 비해 최대 2배 이하이므로, 본 발명에서 검지되는 물질의 암 진행에 따른 증가가 100배 이상에 달하기 때문에, 글로불린 이외의 증가(암세포 유래 유리DNA)가 검지되고 있는 것을 이야기하고 있다. 또한, 정상세포로부터 나오는 DNA, 아세틸화해서 히스톤이 해리된 DNA, 그리고 알부민은 혈청중의 약 60%를 차지하지만, 음하전을 띠기 때문에, 본 발명에서는 흡착되지 않는다. 따라서, 암 관련 물질의 정량 검사에는 안성맞춤이다.

또한, 본 발명의 침상 나노결정(과산화은을 포함하는 은산화물의 메소결정)은, 과산화은을 포함하는 은산화물이 수용액 중에서 음전하를 띠기 쉽고, 시료(타겟분자)와 접촉해서 전하이동착체를 형성하는 것으로 사료된다. 게다가, 은산화물은 광에너지를 받아 환원되고, 금속은을 석출하기 때문에, 규칙적으로 배열하는 금속 나노입자가 가지는 표면 플라스몬 공명증강효과를 가지게 된다. 따라서, 본 발명의 침상 나노결정(메소결정)은 비금속이지만 금속성질과 이온화성질을 겸비하기 때문에, 표면증강 라만 산란(SERS) 측정용에 적합한 바이오칩을 제공할 수 있다.

양자결정을 형성하는 금속착체는 담지금속의 전극전위E와 상관하는 식 (I)에서 나타낸 착체안정도 정수(logβ) 이상을 가지도록 선택된다.

식(I): E°=(RT/｜Z｜F)ln(β_i)

(여기에서 E°는 표준전극전위, R은 기체정수, T는 절대온도, Z는 이온값, F는 패러데이 정수를 나타낸다.)

본 발명에 있어서, 금속착체가, Au, Ag, Pt 또는 Pd로부터 선택되는 플라스몬 금속의 착체인 경우는, 라만광에 대해서 표면 플라스몬 공명증강효과를 가진다.

금속착체가 은착체일 때는, 안정도 정수(생성 정수)(logβ_i)가 8 이상의 은착화제와 할로겐화은의 반응에 의해 형성되는 것이 좋다.

할로겐화은으로써는 염화은이 바람직하고, 착화제로써는 티오황산염, 티오시안산염, 아황산염, 티오요소, 요오드화칼륨, 티오살리실산염, 티오시아누르산염으로부터 선택되는 1종인 것이 바람직하다.

은착체는 평균직경이 5~20nm인 나노클러스터로 이루어진 양자도트을 가지며, 양자결정의 사이즈가 100~200nm가 된다.

금속착체의 수용액중의 농도는 주로 형성되는 양자결정의 사이즈를 고려해서 결정해야 하고, 분산제를 사용할 때는 그 농도도 고려하는 것이 좋다. 통상, 100ppm에서 5000ppm의 범위에서 사용할 수 있지만, 리간드의 기능에도 의존하여 나노클러스터라고 할 만한 나노사이즈를 조제하려면 500에서 2000ppm의 농도가 바람직하다.

금속기판 또는 금속입자상에 형성된 양자결정은 금속착체결정으로써 수용액 중에서는 정극성을 가지기 쉬운 것이라고 사료되며, 생체시료중의 단백질을 흡착고정하기 위해서는, 할로겐이온의 존재하에서 알칼리처리, 예를 들면 pH11 이상의 하이포염소산소다수용액을 적하하여 극성을 조정하는 것이 바람직하다. 양자결정은 재결정해서 수용액 중에서 음극성이 될 뿐만 아니라, 은산화물의 복합 침상 나노결정은 과산화물을 형성하기 때문에, 시료 중 암 관련 물질이 정전하를 가지는 암세포에서 유래된 유리DNA의 고정화를 촉진할 수 있다.

생체시료중의 총 단백농도의 정량은, 특정 파장의 레이저광을 조사해서 라만 스펙트럼을 얻음으로써 알 수 있다. 도 3은 대장암환자의 혈청 시료이며, 그것을 10배, 100배, 500배, 1000배 및 1만배에 순수한 물로 희석해서 633nm의 레이저(30mW)로 측정한 라만 스펙트럼이며, 농도와 함께 피크 상승값(PSV) 및 피크 적분값이 변화한다. 따라서, 혈청중의 총 단백질의 정량분석을 실시할 수 있는 것을 알 수 있다. 특히 탄소 특유의 G(1300~1400cm^-1 부근) 및 D밴드(1550~1600cm^-1 부근)에 피크를 볼 수 있고, 메틸기에 특유의 2900cm^-1 부근에도 피크를 관측할 수 있는 것을 알았다. 이것은 암 관련 물질로써 히스톤에 DNA가 감긴 메틸화 상태에서 검출되고 있는 것을 이야기하는 것이라고 추측된다.

따라서, 얻어진 라만 스펙트럼의 피크 높이, 피크 적분값, 피크 발현 시간 등의 정보로부터 암의 분류 및 진행상태를 해석할 수 있다. 도 1은 라만 파형의 피크 산출법을 나타내며, 사람 혈청 샘플의 633nm레이저에 의한 라만 산란의 스펙트럼은 1350cm^-1 부근과 1550cm^-1 부근에 산란 강도의 피크를 형성하는 것이 확인된다. 따라서, 800cm^{- 1}(a)와 2000cm^-1(b)의 산란 강도의 평균값(m)을 기준으로 한 최대상승값(p-m)을 피크상승값(Shifting　Peak　Value:PSV)로서 정의했다. 또한, 피크 전체의 면적을 피크 적분값으로써 정의했다. 이러한 피크 상승값 및 피크 적분값은 사람 혈청 중의 암 관련 물질을 보는데 있어서 중요하고, 피크 발현 시간과 함께, 암의 분류 및 진행도를 나타내는 지표로 할 수 있다.

[도 1] 라만 파형의 피크 산출법을 나타내며, 사람 혈청 샘플의 633nm레이저에 의한 라만 산란의 스펙트럼은 1350cm^-1 부근과 1550cm^-1 부근에 산란 강도의 피크를 형성하는 것을 나타낸다.
[도 2a] 위암환자 12예로부터 얻어진 혈청을 조정한 시료의 라만 스펙트럼도이다.
[도 2b] 대장암환자 12예로부터 얻어진 혈청을 조정한 시료의 라만 스펙트럼도이다.
[도 2c] 양성(良性)질환환자 12예로부터 얻어진 혈청을 조정한 시료의 라만 스펙트럼도이다.
[도 2d] 위암, 대장암, 양성질환시료의 라만 산란 피크 상승값의 비교를 나타내는 그래프이다.
[도 3] 대장암환자 12예로부터 얻어진 혈청을 조정한 희석 시료와 라만 산란 강도의 관계를 나타내는 라만 스펙트럼으로, 시료 농도와 산란 강도 피크 상승값이 상관관계에 있는 것을 나타낸다.
[도 4] 실시예 1에서 가리키는 신규 SERS 기판 작성법의 순서를 나타내는 설명도로, 왼쪽 위의 유한회사 마이텍제 기판은 오른쪽 옆의 SEM상을 나타내는 사진이다.
[도 5] 실시예 1에서 제조한 나노입자 응집체(양자결정)의 각종 SEM상을 나타내는 사진이다.
[도 6] 나노입자의 확대 SEM상을 나타낸다.
[도 7] 인청동판상에에 적하 후의 방치 시간과 양자결정형상의 관계를 나타내는 사진이다.
[도 8] 양자결정의 EDS스펙트럼(원소분석)의 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 9] 양자결정을 할로겐이온의 존재하에 알칼리처리(하이포염소산 처리)한 경우의 SEM상이다.
[도 10a] 알칼리처리한 양자결정중의 침상결정을 나타내는 도면이다.
[도 10b] 럭비공형상의 덩어리를 나타내는 도면이다.
[도 10c] 큰 덩어리의 EDS스펙트럼(원소분석)의 결과를 나타내는 그래프도이다.
[도 11] 메틸화한 유리DNA(a)와 아세틸화한 DNA(b)의 기능설명도이다.
[도 12] 도 1의 양자결정기판을 할로겐이온의 존재하에 알칼리처리(하이포염소산 처리)한 경우의 재결정기판의 SEM상(위쪽 도면)과 재결정기판의 EDS스펙트럼(원소분석)의 결과를 나타내는 그래프(아래쪽 도면)이다.
[도 13] 알칼리 처리한 재결정기판의 XPS 측정결과를 나타낸다.
[도 14] 재결정기판의 표면을 에칭한 후의 XPS 측정결과를 나타낸다.

이하, 도면을 참조하여, 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다.

(실시예 1)

도 4에 도시한 바와 같이, 티오황산은 1000ppm 수용액을 조제하고, 그 한 방울을 인청동판상에 적하하고, 약 3분간 방치하여, 용액을 증발시키자, 오른쪽 옆의 SEM상을 나타내는 양자결정이 작성되어 있었다.

도 5는 실시예 1로 제조한 나노입자 응집체(양자결정)의 각종 SEM상을 나타내는 사진이며, 도 6은 나노입자의 확대 SEM상을 나타낸다. 100nm 전후의 얇은 육각기둥형상결정으로, 표면에 수 nm오더의 요철이 발현되어 있다. 금속 나노결정에 특유의 패싯(facet)은 확인할 수 없었다.

도 7은 인청동판상에 적하 후의 방치 시간과 양자결정형상의 관계를 나타내는 사진이다. 우선, 육각형의 양자결정이 생성되고, 형상을 유지하면서 성장하는 것이 인정된다.

도 8은 양자결정의 EDS스펙트럼(원소분석)의 결과를 나타내는 그래프이다. 인청동판상에 형성된 결정은 은 및 착체 리간드에서 유래된 원소를 검출했지만, 동판상에 티오황산은 1000ppm 수용액을 조제하고, 그 한 방울을 적하하고, 약 3분간 방치하여, 용액을 증발시킨 경우는, 은만을 검출한 것에 지나지 않았다.

(양자결정의 작성의 고찰)

양자결정은 1000ppm 티오황산은착체 수용액의 경우, 인청동판상에 적하해서 3분간 방치하면, 100nm 전후의 육각기둥형상으로 형성되고, 각 육각기둥형상의 양자결정은 수 nm오더의 요철을 가지는 것이 SEM상으로부터 확인되었지만(도 4, 도 5 및 도 6), 금속 나노결정에 특유의 패싯은 확인되지 않고, EDS 원소분석으로 은 및 착체 리간드에서 유래된 원소가 검출되었기 때문에, 전체는 은착체의 나노결정이며, 그 표면에 나타나는 요철은 착체 중의 은이 클러스터로써 양자도트를 형성해서 퍼져 있다고 추측된다. 본 발명의 은착체 양자결정이 인청동판상에 형성되는 한편, 동기판상에는 은만의 나노입자가 석출되는 현상을 보면, 티오황산 은착체의 평형전위가 0.33으로 동의 전극전위(0.34)와 동등하기 때문에, 동기판상에는 은(0.80)만이 석출되고, 인청동의 경우는 0.22로 전극전위가 조금 낮기 때문에, 은착체의 결정이 석출된 것이라고 사료된다. 따라서, 양자결정을 작성하기 위해서는 1) 착체 수용액이 500~2000ppm라고 하는 희박한 영역인 것, 2) 금속착체 수용액의 평형전위에 대해 담지금속의 전극전위가 조금 낮다는 것, 3) 전극전위차로 금속착체를 응집시키는 것이 중요하다고 사료된다. 또한, 1000ppm 티오요소 은착체 수용액을 사용한 경우도 마찬가지다.

(실시예 2)

실시예 1로 조정한 인청동판상의 티오황산은 양자결정기판에 pH11의 하이포염소산나트륨 수용액을 적하하고, 3분 후 수용액을 증발시키고, 그 직후, 위암환자 12예로부터 얻어진 혈청을 순수한 물로 10배 희석해서 조정한 시료, 대장암환자 12예로부터 얻어진 혈청을 순수한 물로 10배 희석해서 조정한 시료 및 양성질환환자 12예로부터 얻어진 혈청을 순수한 물로 10배 조정한 시료의 각각을 633nm의 레이저광을 조사해서 라만 스펙트럼을 측정했다. 위암 및 대장암의 진행도와 피크 상승값 및 피크 적분값 사이에는 상관관계가 인정된다고 할 수 있다. 또한, 위암의 경우, 라만 스펙트럼은 레이저 조사 후 1분 후에, 대장암의 경우는 레이저 조사 후 2~3분 후에 라만 스펙트럼에 피크가 발현했다. 또한, D는 위암, 대장암, 양성질환시료의 라만 산란 피크 상승값의 비교를 나타내는 그래프이다. 양성질환환자에 대해, 위암 시료 및 대장암 시료의 피크는 유의하게 높다는 것이 인정된다. 위암 시료와 대장암 시료는 피크 상승값에서는 차이를 찾아내는 것이 곤란하다고 할 수 있지만, 피크 발현 시간 및 피크 적분값을 고려하면, 양자의 암 분류는 가능하다고 할 수 있다.

(은산화물의 메소결정에 대한 고찰: 그 1)

상기 양자결정기판에 5% 하이포염소산나트륨수용액을 적하해서 2분간 처리하여 제거하였더니 도 12에 나타낸 결정 구조가 보이고, 침상의 결정과 럭비공형상의 덩어리와 큰 덩어리가 보였으므로, 각각의 조성을 EDS 스펙트럼(원소분석)으로 분석하면, 이하의 반응식으로부터 침상의 결정은 모두 염화은과 산화은의 복합결정으로 이루어진 것이라고 사료되지만, 도 12의 결과는 염소는 확인할 수 없고, 은과 산소가 지배적인 것을 알 수 있다..

Na₂S₂O₃ + 4NaClO + H₂O → Na₂SO₄ + H₂SO₄ + 4NaCl (1)

Ag+ + NaCl → AgCl + Na+ (2)

Ag+ + 3NaOCl → 2AgCl+ + NaClO₃ + 2Na+ (3)

Ag+ + OH- → AgOH (4)

2Ag+ + 2OH → Ag₂O + H₂O (5)

따라서, 본 발명의 메소결정의 형성에는 은이온과 티오황산이온이 염소이온의 존재하에 알칼리 산화반응에 의해 발생하는 것이라고 사료되지만, 통상의 수용액중에서는 산화은이 형성되는 것에 지나지 않으나, 이하의 XPS 측정으로부터 과산화은이 지배적으로 형성되어 있다고 추측된다.

(은산화물의 메소결정에 대한 고찰: 그 2)

XPS 측정:

상기 양자결정기판에 하이포염소산나트륨수용액 25μl를 2분간 적하하고, 재결정기판을 만들어, 에칭하지 않고 그대로(사용기종: ULVAC-PHI(주)/PHI5000 Versa　Probe (주사형 X선 광전자 분광 분석 장치)) Ag와 O를 XPS 측정했다. 또한, 비교대상을 위해, 산화은의 가루와 염화은의 가루의 Ag를 측정했다. 한편, 재결정기판을 아르곤가스 클러스터 이온빔으로 5분간 에칭하여 Ag와 O를 XPS 측정했다. 도 13 및 도 14의 XPS 측정 결과를 도 12에 근거한 EDS의 결과로부터 추측하면, 529eV 부근의 피크는 과산화은(AgO)에 유래하는 O피크로, 530eV 부근의 피크는 산화은(Ag2O)에 유래하는 O피크라고 인정된다. 에칭했을 경우에, 산소량은 감소하지만, 529eV 부근의 피크의 과산화은(AgO)에 유래하는 O피크가, 530eV 부근의 피크는 산화은(Ag2O)에 유래하는 O피크보다 큰 것은 기판 근방에 과산화은이 형성되어 있는 것을 이야기하는 것이라고 할 수 있다. 이것은, 메소결정 형성 시 촉매작용과 기판의 전극전위가 영향을 주고 있는 것이라고 추측된다.

덧붙여, EDS 측정은 상기 재결정기판을 사용기종: 일본전자주식회사/JSM-7001F(전계 방출형 분석 주사전자현미경)을 이용하여 실시했다.

또한, 티오황산은의 양자결정을 하이포염소산 수용액, 0.01규정 가성소다 수용액, 0.01규정 염산 수용액, 0.1몰 탄산나트륨 수용액으로 처리해도 같은 결과는 얻을 수 없었다. 따라서, 이 침상 결정의 형성에는 은이온과 티오황산이온의 존재하에 상기 반응에 의해 발생하는 것이라고 사료된다. 산화은은 수용액중에서 음전하를 띠고, 광에 의해 환원되어 금속은을 석출시킨다. 과산화은은 그 경향이 현저하기 때문에, 정전하의 암 관련 물질을 흡착하고, 게다가 흡착한 암 관련 물질과 은입자의 사이의 표면 플라스몬 증강 효과를 얻을 수 있는 것이라고 사료된다.

따라서, 본 발명을 이용함으로써, 피 및 생체시료중의 암 관련 물질을 선택적으로 검출할 수 있기 때문에, 라만 스펙트럼보다 암의 조기 발견, 암의 진행도에 관한 판정을 실시할 수 있다.

Claims (3)

1. 과산화은을 포함하는 은산화물의 메소결정영역을 가지는 바이오칩을 준비하고, 상기 바이오칩의 메소결정영역에 혈청 또는 생체시료액을 적하하여, 시료중의 정전하를 가지는 암 관련 물질을 선택적으로 흡착하고, 흡착한 암 관련 물질에 대해 레이저 조사하여 그로부터의 라만 산란광을 검지하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만 산란(SERS)의 강도에 의해 암 질병을 판단하는 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서, 라만 산란 스펙트럼에 탄소 특유의 D밴드 및 G밴드에, 메틸기 특유의 2900cm^-1 부근에 암 관련 물질의 특성 피크 스펙트럼으로서 검출하는 방법.
   
3. 청구항 2에 있어서, 암 관련 물질이 유리DNA(히스톤에 감겨 이루어진 DNA), 및 이의 관련 크로마틴(염색체)을 포함하는 암 질병을 판단하는 방법.
   

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