KR20150139531A - 이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자 - Google Patents

이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20150139531A
KR20150139531A KR1020157028764A KR20157028764A KR20150139531A KR 20150139531 A KR20150139531 A KR 20150139531A KR 1020157028764 A KR1020157028764 A KR 1020157028764A KR 20157028764 A KR20157028764 A KR 20157028764A KR 20150139531 A KR20150139531 A KR 20150139531A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
ser
amino acid
acid sequence
gly
Prior art date
Application number
KR1020157028764A
Other languages
English (en)
Inventor
루이스 지. 보르헤스
패트릭 에이. 비어르
웨이 얀
마크 엘. 마이클스
Original Assignee
암젠 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 암젠 인크 filed Critical 암젠 인크
Publication of KR20150139531A publication Critical patent/KR20150139531A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본원에는 Fc 폴리펩티드 쇄 및 면역글로불린 가변 영역을 함유하는 이중특이적 분자가 기재되어 있다. 또한, 이러한 분자를 포함하는 약제학적 제형, 이러한 분자를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포, 이러한 분자를 제조하는 방법 및 이러한 분자를 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자 {BISPECIFIC BIVALENT SCFV-FC MOLECULES}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가출원 제61/791,424호의 이익을 청구하고, 이의 내용은 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다.
분야
본 발명은 단백질 조작 분야에 있다.
이중특이적 항체는 다양한 적응증에서 치료제로서 유망하다. 표준 IgG 포맷을 갖는 이중특이적 항체는, 이들이 4개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함하기 때문에, 생산하기 위해 도전받을 수 있다. 보다 작은, 보다 용이하게 생산된 이중특이적 분자의 효능은 비-호지킨 림프종에서 임상적으로 입증되었다[참조: Bargou et al. (2008), Science 321(5891): 974-977]. 연속 정맥내 주입에 의한 장기 투여는 이러한 작은 단일쇄 분자의 짧은 생체내 반감기 때문에 이들 결과를 달성하기 위해 사용되었다(id). 따라서, 유사한 치료학적 효능을 갖고, 생산하는데 간단한 포맷을 갖고, 장기간 반감기를 포함하는 양호한 약물동태 특성을 갖는 이중특이적 치료제가 당해 기술분야에 요구되고 있다.
본원에 기재된 이중특이적-Fc(Bi-Fc)는 2개의 상이한 단백질에 결합할 수 있고, 항체의 Fc 영역 또는 이의 부분에 결합한다. Bi-Fc는 Fc 영역을 결여하는 이중특이적 단일쇄 분자와 비교하여 양호한 약물동태 특성을 가질 수 있다. Bi-Fc에 의해 결합된 하나의 단백질은 T 세포, NK 세포, 호중구 또는 마크로파지 등의 면역 효과기 세포 상에서 발현될 수 있고, 다른 단백질은 표적 세포, 예를 들면, 암 세포, 병원체에 의해 감염된 세포, 또는 질환을 매개하는 세포, 예를들면, 섬유증을 유발한 섬유아세포 상에서 발현될 수 있다. 본원에 기재된 Bi-Fc 분자는 표적 세포의 존재하에 면역 효과기 세포의 활성화를 유발할 수 있고/있거나 면역 효과기 세포의 존재하에 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.
한 가지 양상에서, 본원에는 (a) (i) 하기 식 V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc을 갖는 아미노산 서열(여기서, Fc는 Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.)을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄; 및 (ii) Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄; 또는 (b) (i) 하기 식 Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4를 갖는 제1 폴리펩티드 쇄(여기서, Fc는 Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.); 및 (ii) Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, 이중특이적(Bi)-Fc로서, 상기 Bi-Fc는 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포 단백질을 표시하는 표적 세포의 세포용해를 매개하고 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포 단백질을 표시하지 않는 세포의 세포용해를 매개하지 않고/않거나, 상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있는, 이중특이적-Fc가 제공된다. 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 중의 Fc 폴리펩티드 쇄는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. V1은 중쇄 가변(VH) 영역일 수 있고, V2는 경쇄 가변(VL) 영역일 수 있다. 대체 실시형태에서, V1은 VL 영역일 수 있고, V2는 VH 영역일 수 있다. V3 및 V4는 각각 VH 및 VL 영역일 수 있거나, V3 및 V4는 각각 VL 및 VH 영역일 수 있다. L1 및 L3은 적어도 15개 아미노산 길이일 수 있고, L2는, 존재하는 경우, 12개 미만의 아미노산 길이일 수 있다. V1 및 V2는, 이들이 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부인 경우, 표적 세포 또는 면역 효과기 세포에 결합할 수 있고, V3 및 V4는, 이들이 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부인 경우, 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄 중의 Fc 폴리펩티드 쇄는 헤테로이량체화 변이를 포함할 수 있고, 제2 폴리펩티드 쇄 중의 Fc 폴리펩티드 쇄는 또 다른 헤테로이량체화 변이를 포함할 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄 중의 헤테로이량체화 변이는 전하 쌍 치환일 수 있고, 제2 폴리펩티드 쇄 중의 헤테로이량체화 변이는 전하 쌍 치환일 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 R409D, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392D, N392E, K392D 또는 K392E를 포함할 수 있고, 제2 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356R, D356K 또는 D356R을 포함할 수 있거나; 제2 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 R409D, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392D, N392E, K392D 또는 K392E를 포함할 수 있고, 제1 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356R, D356K 또는 D356R을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄는 Fc 감마 수용체(FcγR) 결합을 억제하거나 ADCC를 증강시키는 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄는, 예를 들면, L234A, L235A 및 N297에서의 임의의 치환을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에는 (ⅰ) 하기 식 V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc을 갖는 제1 폴리펩티드 쇄(여기서, Fc는 Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.); 및 (ii) Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있는 Bi-Fc로서, L1 및 L3은 적어도 15개 아미노산 길이이고, L2는 12개 미만의 아미노산 길이이고; 어느 하나의 V1은 VH 영역이고 V2는 VL 영역이거나, V1은 VL 영역이고 V2는 VH 영역이고, 어느 하나의 V3은 VH 영역이고 V4는 VL 영역이거나, V3은 VL 영역이고 V4는 VH 영역이고; 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 각각의 Fc 폴리펩티드 쇄는 각각 헤테로이량체화 변이를 함유하고, Bi-Fc는 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포 단백질을 표시하는 표적 세포의 세포용해를 매개하고 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포를 표시하지 않는 세포의 세포용해를 매개하지 않고/않거나 상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있는, Bi-Fc가 기재되어 있다. Fc 폴리펩티드 쇄는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄는 FcγR 결합을 억제하는 하나 이상의 변이, 예를 들면, 하나 이상의 L234A, L235A 및 N297에서의 임의의 치환을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, Bi-Fc는 (a) 식 V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc를 갖는 제1 폴리펩티드 쇄(여기서, Fc는 Fc 폴리펩티드 쇄이고, V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고, L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.); 또는 (b) 하기 식 Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4를 갖는 제1 폴리펩티드 쇄(여기서, Fc는 Fc 폴리펩티드 쇄이고, V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고, L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.)를 포함하고; 여기서, 상기 Bi-Fc는 단량체이고; 상기 Bi-Fc는 면역 효과기 세포에 의해 표적 세포 단백질을 표시하는 표적 세포의 세포용해를 매개하고 면역 효과기 세포에 의해 표적 세포 단백질을 표시하지 않는 세포의 세포용해를 매개하지 않고/않거나 상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있다. Fc 폴리펩티드 쇄는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 하기 변이: K392D, K392E, N392D, N392E, R409E, R409E, K409D, K409E, Y349T, L351T, L368T, L398T, F405T, Y407T, Y407R, D399K, D399R, D356K 및/또는 D356R을 포함할 수 있다. 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩티드 쇄는 FcγR 결합을 억제하는 하나 이상의 변이, 예를 들면, L234A, L235A 및 N297에서의 임의의 치환 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 Bi-Fc의 면역 효과기 세포는 인간 세포 및/또는 시노몰구스 원숭이 T 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc의 효과기 세포 단백질은 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 TCR-CD3 복합체의 일부일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc의 효과 세포 단백질은 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3β 쇄, CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, CD3ε 쇄 또는 CD3ζ 쇄일 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포 단백질은 CD3ε이다. 이러한 실시형태에서, Bi-Fc의 하나의 VH 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가질 수 있고, Bi-Fc의 하나의 VL 영역은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가질 수 있다. 또 다른 이러한 실시형태에서, Bi-Fc의 하나의 VH 영역은 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가질 수 있고, Bi-Fc의 하나의 VL 영역은 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 가질 수 있다.
효과기 세포 단백질이 CD3ε 쇄인 경우, Bi-Fc는 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열을 각각 포함하거나 서열번호 29 및 31의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 영역 및 VL을 포함할 수 있다. 또는, 이러한 Bi-Fc는 서열번호 7 또는 서열번호 29와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 8 또는 서열번호 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있고, 상기 동일성 영역은 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 아미노산 길이이다.
임의의 Bi-Fc의 표적 세포는 암 세포, 병원체에 의해 감염된 세포, 또는 질환을 매개하는 세포일 수 있다. 표적 세포가 암 세포인 경우, 암은 혈액 악성종양 또는 고체 종양의 악성종양일 수 있다. 표적 세포가 암 세포인 경우, Bi-Fc는 그 중에서도 암 세포 항원, 예를 들면, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII(EGFR의 돌연변이체 형태), 흑색종-연관 콘드리이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소텔린(MSLN), 엽산 수용체 1(FOLR1), CD133, CDH19 및 인간 상피 성장 인자 2(HER2)에 결합할 수 있다. 표적 세포가 병원체에 의해 감염된 세포인 경우, 병원체는 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스를 포함하는 바이러스, 또는 리스테리아 속, 마이코박테리움 속, 스타필로콕쿠스 속 또는 스트렙토콕쿠스 속의 세균일 수 있다. 표적 세포가 질환을 매개하는 세포인 경우, 표적 세포는 섬유성 질환 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 매개하는 세포일 수 있다.
본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc 분자 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형이 제공된다.
추가로, 본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 벡터 뿐만 아니라 이러한 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 또 다른 양상에서, 본원에는 핵산 또는 벡터를 당해 핵산이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계 및 Bi-Fc를 세포 괴(mass) 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는 Bi-Fc의 제조 방법이 기재되어 있다.
또 다른 양상에서, 본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc 분자의 치료학적 유효량을 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 환자의 치료 방법이 제공되고, 여기서 Bi-Fc의 표적 세포는 암 세포이다. 이 방법은 Bi-Fc의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 방사선, 화학요법제 또는 비-화학요법제, 항-신생물제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 환자는 혈액 악성종양 또는 고체 종양의 악성종양을 가질 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc 분자의 치료학적 유효량을 섬유성 질환을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유성 질환을 갖는 환자의 치료 방법이 기재되어 있고, 여기서 Bi-Fc의 표적 세포는 섬유성 세포이다. Bi-Fc는 질환을 치료하기 위해 사용된 기타 치료제의 투여와 동시에 투여 전에 또는 투여 후에 투여할 수 있다. 섬유성 질환은 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 간경변, 강피증, 신장 이식 섬유증, 신장 동종이식 신병, 또는 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc 분자의 치료학적 유효량을 병원체에 의해 매개된 질환을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체에 의해 매개된 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법이 기재되어 있다. Bi-Fc는 병원체-매개된 질환을 치료하기 위해 사용된 기타 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 기재된 임의의 Bi-Fc 분자 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되어 있다. 이러한 조성물은 암, 감염성 질환, 자가면역 또는 염증성 질환 또는 섬유성 질환의 치료를 위한 것일 수 있다.
도 1: 예시적 헤테로이량체성 및 단량체성 Bi-Fc 분자의 다이아그램. 4개의 면역글로불린 가변 영역은 타원 및 표지된 V1, V2, V3 및 V4로 제시된다. CH2 및 CH3 영역은 자체로 표지되고, 신장된 육각형으로 도해되어 있다. 이들 영역 사이의 라인은 링커 또는 힌지 영역을 나타낸다. 예시적 디설파이드 브릿지는 수평선으로 제시된다. 패널 A 및 C는 헤테로이량체성 Bi-Fc를 나타내고, 패널 B 및 D는 단량체성 Be-Fc를 나타낸다.
도 2: 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 대한 헤테로이량체성 Bi-Fc의 결합. 방법은 실시예 2에 기재되어 있다. 평균 형광 강도(MFI)는 x 축에 제시되고, 세포 수는 y 축 상에 제시된다. 충전되지 않은 프로파일은 이중특이적 분자 중의 하나의 부재하에 세포로부터의 데이터를 나타내고, 견고하게 충전된 프로파일은 이중특이적 분자 중의 하나의 존재하에 세포로부터의 데이터를 나타낸다. 도면에 제시된 바와 같이, 좌측 패널은 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 우측 패널은 단일쇄 항-HER2/CD3ε을 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 상부 2개 패널은 JIMT-1 세포(이는 표적 세포 단백질 HER2를 발현한다.)를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 하부 2개 패널은 T 세포(이는 효과기 세포 단백질 CD3ε을 발현한다.)를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타낸다.
도 3: 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 및 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε분자의 세포용해 활성. 방법은 실시예 3에 기재되어 있다. 각 패널 중의 x 축은 각 샘플 중의 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자(pM)의 농도를 나타낸다. 각 패널 중의 y 축은 실시예 3에 기재된 바와 같이 계산된 퍼센트 특이적 용해를 나타낸다. 점선에 의해 접속된 개방 원은 단일쇄 분자를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 실선에 의해 접속된 충전된 원은 Bi-Fc 분자로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 상부, 중간 및 하부 패널은 각각 Cal-51 세포(이는 FOLR1을 발현한다.), T47D 세포(이는 FOLR1을 발현한다.) 및 BT474 세포(FOLR1을 발현하지 않는다.)로부터의 데이터를 나타낸다.
도 4: 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 및 단일쇄 항-HER2/CD3ε 분자의 세포용해 활성. 방법은 실시예 3에 기재되어 있다. 각 패널 중의 x 축은 각 샘플에서 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자(pM)의 농도를 나타낸다. 각 패널 중의 y 축은 실시예 3에 기재된 바와 같이 계산된 퍼센트 특이적 용해를 나타낸다. 점선에 의해 접속된 개방 원은 단일쇄 분자를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 실선에 의해 접속된 충전된 원은 Bi-Fc 분자로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 상부, 중간 및 하부 패널은 각각 JIMT-1 세포(이는 HER2를 발현한다.), T47D 세포(이는 HER2를 발현한다.) 및 SHP77 세포(이는 HER2를 발현하지 않는다.)로부터의 데이터를 나타낸다.
도 5: 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 분자의 존재하에 T 세포에 의한 사이토킨 생산. 방법은 실시예 4에 기재되어 있다. 점선에 의해 접속된 개방 원은 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 검정으로부터의 데이터를 나타내고, 실선에 의해 접속된 견고하게 충전된 원은 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε 분자로부터의 데이터를 나타낸다. 각 패널 중의 x 축은 각 검정에서 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자(pM)의 농도를 나타낸다. y 축은 검출된 사이토킨의 농도(pg/mL) 및 속성을 나타낸다. 지시된 바와 같이, 도 5a는 인터페론 감마(IFNγ, 상부), 종양 괴사 인자 알파(TNFα, 중간) 및 인터류킨-10(IL-10, 하부)으로부터의 데이터를 나타내고, 도 5b는 인터류킨-2(IL-2, 상부) 및 인터류킨-13(IL-13, 하부)으로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 좌측 패널은 T47D 세포(이는 FOLR1을 발현한다.)을 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 우측 패널은 BT474 세포(이는 FOLR1을 발현하지 않는다.)를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타낸다.
도 6: 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자의 존재하에 T 세포에 의한 사이토킨 생산. 방법은 실시예 4에 기재되어 있다. 점선에 의해 접속된 개방 원은 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 검정으로부터의 데이터를 나타내고, 실선에 의해 접속된 견고하게 충전된 원은 단일쇄 항-FOLR2/CD3ε 분자로부터의 데이터를 나타낸다. 각 패널 중의 x 축은 각 검정에서 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자(pM)의 농도를 나타낸다. y 축은 검출된 사이토킨의 농도 및 속성(pg/mL)을 나타낸다. 지시된 바와 같이, 도 6a는 IFNγ(상부), TNFα(중간) 및 IL-10(하부)으로부터의 데이터를 나타내고, 도 6b는 IL-2(상부) 및 IL-13(하부)으로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 좌측 패널은 JIMT-1 세포(이는 HER2를 발현한다.)을 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타내고, 우측 패널은 SHP77 세포(이는 HER2를 발현하지 않는다.)를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타낸다.
도 7: 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자의 존재하에 CD25+ 및 CD69+ 세포의 비율. 방법은 실시예 5에 기재되어 있다. x 축은 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자의 농도(pM)를 나타낸다. y 축은 또한 CD25+(좌측 패널) 또는 CD69+(우측 패널) 세포인 CD3+ T 세포의 비율을 나타낸다. 심볼은 다음과 같이 나타낸다: 점선에 의해 접속된 개방 사각형, 단일쇄 분자 + JIMT-1 표적 세포; 실선에 의해 접속된 하방 삼각형, Bi-Fc 분자 + JIMT-1 표적 세포; 점선에 의해 접속된 개방 원, JIMT-1 표적 세포 부재하의 단일쇄 분자; 및 실선에 의해 접속된 상방 삼각형, JIMT-1 표적 세포 부재하의 Bi-Fc.
도 8: 마우스에서 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 이중특이적 분자의 약물동태 특성. 방법은 실시예 6에 기재되어 있다. 상부 패널에서, 정맥내 주사 후의 약물동태 프로파일이 제시되고 있고, 하부 패널에는 피하 주사 후의 프로파일이 제시되어 있다. 실선에 의해 접속된 견고하게 충전된 원은 항-HER2/CD3ε 단일쇄 분자로부터의 데이터를 나타내고, 실선에 의해 접속된 별표는 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 분자로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9: 다양한 세포 유형에 대한 항-CD33/CD3ε 분자의 결합. 실험 절차는 실시예 8에 기재되어 있다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 패널 A, B, C, D 및 E는 각각 몰름-13 세포, 나말와 세포, 인간 팬 T 세포, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 시노몰구스 원숭이 PBMC에 대한 결합의 데이터를 나타낸다.
도 10: 시노몰구스 원숭이 및 이중특이적 항-CD33/CD3ε 분자의 존재하에, 나말와 세포의 용해가 아닌, 몰름-13 세포의 용해. 실험 절차는 실시예 9에 기재되어 있다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 배양물은 PBMC, 이중특이적 항-CD33/CD3ε 분자, 및 몰름-13 세포(패널 A) 또는 나말와 세포(패널 B)를 함유했다.
도 11: 팬 T 세포 및 이중특이적 항-CD33/CD3ε 분자의 존재하에, 나말와 세포의 용해가 아닌, 몰름-13 세포의 용해. 실험 절차는 실시예 9에 기재되어 있다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 배양물은 팬 T 세포, 이중특이적 항-CD33/CD3ε 분자, 및 몰름-13 세포(패널 A) 또는 나말와 세포(패널 B)를 함유했다.
도 12: PBMC 및 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 항-CD33/CD3ε의 존재하에 CD33-발현 종양 세포의 용해. 실험 절차는 실시예 10에 기재되어 있다. 그래프는 항-CD33/CD3ε 분자 및 CD33-발현 몰름-13 세포, + 인간 PBMC(패널 A) 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC(패널 B) 중의 어느 하나를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다.
도 13: 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 CD33-발현 종양 세포의 존재하에 PBMC에 의한 인터페론 감마(IFN-γ)의 방출. 실험 절차는 실시예 10에 기재되어 있다. 그래프는 항-CD33/CD3ε 분자 + CD33-발현 몰름-13 세포 + 인간 PBMC(패널 A) 또는 시노몰구스 원숭이 PBMC(패널 B) 중의 어느 하나를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다.
도 14: T 세포에 의한 증식 및 CD25 발현. 실험 절차는 실시예 11에 기재되어 있다. 지시된 바와 같이, 좌측 컬럼 중의 그래프는 몰름-13 세포(이는 CD33을 발현한다.) 및 팬 T 세포를 함유하는 세포 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 우측 컬럼 중의 그래프는 나말와 세포(이는 CD33을 발현하지 않는다.) 및 팬 T 세포를 함유하는 세포 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 패널 A는 배양물에서 T 세포의 증식의 비율을 나타내고, 패널 B는 배양물에서 CD25 양성 T 세포의 비율을 나타낸다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전된 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다.
도 15: 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 CD33-발현 종양 세포의 존재하에 T 세포에 의한 사이토킨 방출. 실험 절차는 실시예 11에 기재되어 있다. 지시된 바와 같이, 좌측 컬럼 중의 그래프는 몰름-13 세포(이는 CD33을 발현한다.) 및 팬 T 세포를 함유하는 세포 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 우측 컬럼 중의 그래프는 나발와 세포(이는 CD33을 발현하지 않는다.) 및 팬 T 세포를 함유하는 세포 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 점선을 갖는 개방 원은 단일쇄 항-CD33/CD3ε을 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타내고, 실선을 갖는 충전 원은 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 함유하는 배양물로부터의 데이터를 나타낸다. 검정된 사이토킨은 각 패널의 좌측에 제시되어 있다.
도 16: 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc에 의한 종양 성장의 생체내 억제. 방법은 실시예 13에 기재되어 있다. x 축은 300만개의 FOLR1-발현 NCI-N87-luc 종양 세포가 마우스 내로 이식된 이래로 경과된 시간(일)을 나타낸다. y 축은 종양 용적(mm3)을 나타낸다. 심볼은 다음과 같이 마우스의 각 그룹에 대해 사용된 처리를 나타낸다: 비히클(25mM 리신 하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0), 견고하게 충전된 삼각형; 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε 이중특이적, 견고하게 충전된 원; 및 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc, 개방 원.
도 17: 헤테로이량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc에 의한 종양 성장의 생체내 억제. 방법은 실시예 14에 기재되어 있다. x 축은 100만개 종양 세포가 각 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식된 이래로 경과된 시간(일)을 나타낸다. y 축은 존재하는 종양 세포의 수를 반영하는 생물발광을 나타낸다. 종축 점선은 20×106 인간 T 세포가 마우스 내로 주사된 시점을 나타낸다. 심볼은 다음과 같이 마우스의 각 그룹에 대해 사용된 처리를 나타낸다: 비히클(25mM 리신-하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0), 견고하게 충전된 삼각형; 단일쇄 항-MEC/CD3ε 이중특이적, 개방 사각형; 헤테로이량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc, 개방 원; 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc, 견고하게 충전된 사각형; 및 순수한 동물, 견고하게 충전된 원.
도 18: 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc에 의한 종양 성장의 생체내 억제. 방법은 실시예 15에 기재되어 있다. x 축은 100만개 종양 세포가 각 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식된 이래로 경과된 시간(일)을 나타낸다. y 축은 종양 생물발광을 나타낸다. 종축 점선은 20×106 인간 T 세포가 마우스 내로 주사된 시점을 나타낸다. 심볼은 다음과 같이 마우스의 각 그룹에 대해 사용된 처리를 나타낸다: 비히클(25mM 리신-하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0), 견고하게 충전된 삼각형; 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc(N297G), 견고하게 충전된 사각형; 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc(N297 야생형), 개방 사각형; 및 순수한 동물, 견고하게 충전된 원.
서열의 간단한 기재
Figure pct00001

Figure pct00002
하나의 폴리펩티드 쇄 또는 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 함유하는, 본원에서 Bi-Fc로 불리우는 신규 형태의 이중특이적 항체가 기재되어 있다. 하나의 쇄는 2개의 중쇄 가변(VH) 영역, 2개의 경쇄 가변(VL) 영역 및 Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 임의의 제2 폴리펩티드 쇄를 Fc 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, Bi-Fc가 결합하는 단백질 중의 하나는 면역 효과기 세포, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 마크로파지 또는 호중구의 표면 상에서 발현되고, Bi-Fc가 결합하는 른 단백질은 표적 세포, 예를 들면, 암 세포, 병원체에 의해 감염된 세포, 또는 질환(예: 섬유성 질환)을 매개하는 세포의 표면 상에서 발현된다. Bi-Fc는 이들 단백질 각각에 대해 하나의 결합 부위만을 갖기 때문에(즉, 이는 본원에서 의미하는 바와 같이 각 단백질을 "1가"로 결합한다), 이의 결합은, 자체로, 이것이 결합하는 단백질을 세포 표면 상에서 올리고머화하지 않을 것이다. 예를 들면, T 세포의 표면 상에서 CD3에 결합하는 경우, CD3은 표적 세포의 부재하에 T 세포 표면 상에서 올리고머화하지 않을 것이다. CD3의 올리고머화는 바람직하지 않은 T 세포의 일반화된 활성화 또는 T 세포 상에서 CD3의 하향 조절을 유발할 수 있다. Bi-Fc는 면역 효과기 세포를 표적 세포에 계류하여, 일반화된 염증 반응이 아니라 표적 세포에 대한 특이적 세포용해 활성을 유도한다. 추가로, Bi-Fc 분자는 양호한 약물동태 특성을 갖고, 이들이 단지 하나 또는 단지 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 함유하기 때문에, 제조가 과도하게 복잡하지 않다.
정의
본원에 의미하는 바와 같이, "항체"는 적어도 하나의 VH 또는 VL 영역, 다수의 경우에 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 함유하는 단백질이다. 따라서, 용어 "항체"는 단일쇄 Fv 항체(링커에 의해 연결된 VH 및 VL 영역을 함유하는 svFv), Fab, F(ab)2', Fab', scFv:Fc 항체(문헌[참조: Carayannopoulos and Capra, Ch. 9 in Fundamental Immunology, 3rd ed., Paul, ed., Raven Press, New York, 1993, pp. 284-286]에 기재된 바와 같음), 또는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 함유하는 전장 항체, 예를 들면, 포유동물에서 발견되는 천연-발생 IgG 항체를 포함하는 다양한 포맷을 갖는 분자를 포함한다(Id). 이러한 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것일 수 있고, 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항체의 구조를 기재하는 카라야노폴로스(Carayannopoulos) 및 카프라(Capra)의 부분은 참조로서 본원에 도입된다. 추가로, 용어 "항체"는 2개의 중쇄를 함유하고 경쇄를 함유하지 않는 이량체성 항체, 예를 들면, 단봉 및 다른 단봉낙타 종 및 상어에서 발견되는 천연-발생 항체를 포함한다[참조: Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90; Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909]. 항체는 "단일특이적"(즉, 한 종류의 항원에만 결합), "이중특이적"(즉, 2개의 상이한 항원에 결합 또는 "다중특이적"(즉, 하나 이상의 상이한 항원에 결합)일 수 있다. 추가로, 항체는 일가, 이가 또는 다가일 수 있고, 이는 각각 한번에 1개, 2개 또는 복수개 항원 분자에 결합할 수 있음을 의미한다. 항체는, 당해 항체가 상이한 단백질에 또한 결합할 수도 있지만, 항체의 하나의 분자가 단백질의 단지 하나의 분자에 결합하는 경우, 특정 단백질에 대해 "일가"로 결합한다. 즉, 항체는, 본원에서 의미하는 바와 같이, 각 단백질의 하나의 분자에만 결합하는 경우, 2개의 상이한 단백질에 "일가"로 결합한다. 이러한 항체는 "이중특이적"이고, 2개의 상이한 단백질 각각에 "일가"로 결합한다. 항체는 "단량체성", 즉, 단일 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 다중 폴리펩티드 쇄("다량체성")를 포함하거나, 2개("이량체성"), 3개("삼량체성") 또는 4개("사량체성") 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단량체성일 수 있다. 다량체성인 경우, 항체는 호모다량체, 즉 호모이량체, 호모삼량체 또는 호모사량체를 포함하여, 1종의 폴리펩티드 쇄의 하나 이상의 분자를 함유하는 호모다량체일 수 있다. 또는, 다량체성 항체는 헤테로다량체, 즉 헤테로이량체, 헤테로삼량체 또는 헤테로사량체를 포함하여, 폴리펩티드 쇄의 하나 이상의 상이한 종을 함유하는 헤테로다량체일 수 있다. 항체는, 다수의 기타 가능한 항체 포맷 중에서, 예를 들면, 이들이 결합하는 분자를 억제 또는 활성화시킬 수 있는 단일특이적 일가 항체(국제 공개공보 제WO2009/089004호 및 미국 공개공보 제2007/0105199호에 기재된 바와 같음, 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.), 이가 단일특이적 또는 이중특이적 이량체성 Fv-Fc, scFc-Fc 또는 디아바디 Fc, 단일특이적 일가 scFv-Fc/Fc', 미국 공개공보 제2009/0311253호(관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.)에 기재된 다중특이적 결합 단백질 및 이중 가변 도메인 면역글로불린, 본원에 기재된 헤테로이량체성 이중특이적 항체, 및 문헌[참조: Chapters 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 of Bispecific Antibodies, Kontermann, ed., Springer, 2011(챕터는 본원에서 참조로서 도입된다.)에 기재된 이중특이적 항체의 다수의 포맷을 포함하는 다양한 가능한 포맷을 가질 수 있다.
본원에서 의미하는 "Bi - Fc"는 제1 폴리펩티드 쇄 및 임의로 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 다수의 실시형태에서, Bi-Fc는 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, Bi-Fc는 제1 폴리펩티드 쇄만을 포함하는 단량체이다. 제1 폴리펩티드 쇄는 링커 및 Fc 폴리펩티드 쇄에 의해 분리될 수 있는 2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역을 포함한다. Fc 폴리펩티드 쇄는 4개의 면역글로불린 가변 영역에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있고, 링커를 통해 가변 영역에 연결될 수 있다. 이 링커는 존재하거나 부재할 수 있다. 제2 폴리펩티드 쇄는, 존재하는 경우, Fc 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 따라서, Bi-Fc는 단량체 또는 헤테로이량체일 수 있다. Bi-Fc는 효과기 세포 단백질에 의해 면역 효과기 세포에 결합하고 표적 세포 단백질에 의해 표적 세포에 결합할 수 있으며, 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개할 수 있다.
단량체성 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 공개공보 제2012/244578호에 상세히 기재되어 있고, 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 단량체성 Bi-Fc는 천연-발생 Fc 폴리펩티드 쇄보다 단량체로서 보다 안정한 변경된 Fc 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 요약하면, 이러한 단량체는 하기 변이를 포함하는 변경된 인간 IgG Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다: (1) K409D, K409E, R409D 또는 R409E; (2) K392D, K392E, N392D 또는 N392E; 및 (3) F405T 또는 Y349T. 대체 실시형태에서, 위치 409 및 392는 변경되지 않고, 예를 들면, D399K, D399R, E356K, E356R, D356K 및/또는 D356R을 포함하여, 하기 "헤테로이량체화 변이"의 정의에 기재된 하나 이상의 변이를 포함할 수 있는 다른 변이가 존재할 수 있다. 이러한 "헤테로이량체화 변이"는 하기 및 미국 특허 제8,592,562호에 기재되어 있고, 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. Fc 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산의 변이는 다음과 같이 제시된다. 소정 위치에 통상 존재하는 아미노산은 1문자 코드로 명명되고, 이어서 EU 넘버링에 따라 넘버링된 위치(하기 표 2에 제시된 바와 같음), 이어서 당해 위치에 통상 존재하는 아미노산을 대체하는 아미노산을 나타낸다. 예를 들면, 명칭 "N297G"는 위치 297에 통상 존재하는 아스파라긴이 글리신으로 변화된 것을 의미한다. 추가로, 단량체성 Bi-Fc의 Fc 폴리펩티드 쇄 부분은 힌지 영역(하기 표 2와 관련하여 정의된 바와 같음)을 결여할 수 있거나, 이의 힌지 영역에서 결실된 또는 변화된 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "암 세포 항원"은 암 세포의 표면 상에서 발현된 단백질이다. 일부 암 세포 항원은 또한 일부 정상 세포 상에서 발현되고, 일부는 암 세포에 특이적이다. 암 세포 항원은 암 세포의 표면 상에서 고도로 발현될 수 있다. 다양한 암 세포 항원이 있다. 암 세포 항원의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 그 중에서도 하기 인간 단백질을 포함한다: 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII(EGFR의 돌연변이 형태), 흑색종-연관된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소텔린(MSLN), 엽산 수용체 1(FOLR1), CD33, CDH19 및 인간 상피 성장 인자 2(HER2).
본원에 사용된 바와 같이, "화학요법"은 암 세포에 대한 세포독성 또는 세포 증식억제 효과를 갖는 "화학요법제"를 사용한 암 환자의 치료를 의미한다. "화학요법제"는 구체적으로 세포 분화에 관여하는 세포를 표적화하고, 세포 분화에 관여하지 않는 세포를 표적화하지 않는다. 화학요법제는 세포 분화에 밀접하게 연관되는 프로세스, 예를 들면, DNA 복제, RNA 합성, 단백질 합성, 조립, 분해 또는 방추체의 기능, 및/또는 이들 프로세스에 중요한 역할을 담당하는 분자(예: 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 합성 또는 안정성을 직접 간섭한다. 따라서, 화학요법제는 암 세포 및 세포 분화에 관여하는 기타 세포 둘 다에 대해 세포독성 또는 세포 증식억제 효과를 갖는다. 화학요법제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 다수 중에서 알킬화제(예: 부설판, 테모졸로미드, 사이클로포스파미드, 로무스틴(CCNU), 메틸로무스틴, 스트렙토조토신, 시스-디아민디-클로로플라티눔, 아지리디닐벤조-퀴논 및 티오테파); 무기 이온(예: 시스플라틴 및 카보플라틴); 질소 머스타드(예: 멜팔란 하이드로클로라이드, 이포스파미드, 클로르암부실 및 메클로르에타민 HCl); 니트로소우레아(예: 카부스틴(BCNU)); 항-신생물 항생물질(예: 아드리아마이신(독소루비신), 다우노마이신, 미토마이신 C, 다우노루비신, 이다루비신, 미트라마이신 및 블레오마이신); 식물 유도체(예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈데신, VP-16 및 VM-26); 항대사산물(예: 유코보린 존재 또는 부재하의 메토트렉세이트, 류코보린 존재 또는 부재하의 5-플루오로우라실, 5-플루오로데옥시우리딘, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르마이신, 겜시타빈 및 플루다라빈); 포도필로톡신(예: 에토포사이드, 이리노테칸 및 토포테칸); 또한 액티노마이신 D, 다카르바진(DTIC), mAMSA, 프로카바진, 헥산메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, L-아스파기나제 및 미톡산트론을 포함한다[참조: Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1993), 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.]. 알킬화제 및 질소 머스타드는 가닥의 풀림 및 복제를 제한하는 DNA를 알킬화함으로써 작용한다. 메토트렉세이트, 시타라빈, 6-머캅토푸린, 5-플루오로우라실 및 겜시타빈은 뉴클레오티드 합성을 간섭한다. 식물 유도체, 예를 들면, 파클리탁셀 및 빈블라스틴은 방추체 독소이다. 포도필로독신은 토포이소머라제를 억제하여 DNA 복제를 간섭한다. 항생물질 독소루비신, 블레오마이신 및 미토마이신은 DNA의 염기 사이에 개재하여, 각각 가닥 절단을 유발하고 DNA 알킬화함으로써 DNA 합성을 간섭한다. 기타 작용 메카니즘은 아미노산(로무스틴, 카무스틴)의 카바모일화 및 아스파라긴 풀(아스파라기나제)의 고갈을 포함한다[참조: Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Edition, Section 11, Hematology and Oncology, 144. Principles of Cancer Therapy, Table 144-2 (1999)]. 구체적으로, 화학요법제들 중에는 상기 수록된 화학요법에 의해 직접 영향을 받는 동일한 세포 프로세스에 직접 영향을 미치는 것들이 포함된다.
약물 또는 치료는, 이것이 임의로, 계속적으로 Bi-Fc와 동일한 일반 시간 프레임으로 투여되는 경우에 "동시" 투여된다. 예를 들면, 환자가 약물 A를 계속적으로 1주 1회 및 Bi-Fc를 계속적으로 6개월간 1회 섭취하는 경우, 약물 A 및 Bi-Fc는, 이들이 동일한 날에 투여되든지 간에, 동시에 투여된다. 유사하게는, Bi-Fc가 계속적으로 1주 1회 투여되고 약물 A가 1일 기준으로 1회 또는 수회 투여되는 경우, 약물 A 및 Bi-Fc는 본원에서 의미하는 바와 같이 동시에 투여된다. 유사하게는 약물 A 및 Bi-Fc가 1개월 이내에 1회 또는 복수회의 짧은 기간 동안 투여되는 경우, 이들이 동일한 달에 투여되는 한, 이들은 본원에서 의미하는 바와 같이 동시에 투여된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 고려되는 특성은 전하 및 소수성 등의 화학적 특성을 포함한다. 하기 표 1은 본원에서 의미하는 보존적 아미노산 치환으로 고려되는 각각의 아미노산에 대한 치환을 수록한다.
보존적 아미노산 치환
본래 잔기 보존적 아미노산 치환
Ala Val, Leu, Ile
Arg Lys , Gln , Asn
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser , Ala
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro, Ala
His Asn , Gln , Lys , Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe , Norleucine
Leu Norleucine , Ile , Val, Met, Ala, Phe
Lys Arg , Gln , Asn
Met Leu, Phe , Ile
Phe Leu, Val, Ile , Ala, Tyr
Pro Ala
Ser Thr , Ala, Cys
Thr Ser
Trp Tyr , Phe
Tyr Trp, Phe , Thr , Ser
Val Ile , Met, Leu, Phe , Ala, Norleucine
본원에서 의미하는 바와 같이, "Fc 영역"은 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 이량체이고, 각각의 쇄는 힌지 도메인 + CH2 및 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 각각의 폴리펩티드 쇄는 "Fc 폴리펩티드 쇄"로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, "Fc 폴리펩티드 쇄"는, 특히 Fc 폴리펩티드가 단량체성 Bi-Fc에서와 같이 단량체성인 것으로 의도되는 경우, 힌지 영역을 결여할 수있다. Fc 영역에서 2개의 Fc 폴리펩티드 쇄를 구별하기 위해, 일부 예에서 하나는 "A 쇄"로서 본원에 지칭하고 다른 하나는 "B 쇄"로서 지칭한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 Fc 영역(또는 단량체성 Bi-Fc 중의 Fc 폴리펩티드 쇄)는 포유동물, 예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역일 수 있는 IgG Fc 영역(또는 Fc 폴리펩티드 쇄)이다. 인간 IgG1 Fc 영역 중에서, 적어도 2개의 대립유전자형이 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 2개의 Fc 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은, 포유동물 Fc 폴리펩티드 아미노산 서열에 대하여 100개 아미노산당 단일 아미노산의 10개 이하의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 포유동물 Fc 폴리펩티드의 것과 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이는 호모이량체에 비해 헤테로이량체의 형성을 촉진시키고/시키거나 호모이량체의 형성을 억제하는 "헤테로이량체화 변이", 반감기를 연장하는 Fc 변이, Fc 감마 수용체(FcγR) 결합을 억제하는 변이 및/또는 ADCC를 증강시키는 변이일 수 있다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "반감기를 연장시키는 Fc 변이"는, 변이를 함유하지 않는 것을 제외하고, 동일한 Fc 폴리펩티드를 함유하는 유사한 단백질과 비교하여 변경된 Fc 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질의 생체내 반감기를 연장시키는 Fc 폴리펩티드 쇄 중의 변이이다. 이러한 변이는 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. 변이 M252Y, S254T 및 T256E(위치 252에서 메티오닌이 티로신으로 변화되고; 위치 254에서 세린이 트레오닌으로 변화되고; 위치 256에서 트레오닌이 글루탐산으로 변화됨; 표 2에 제시된 바와 같이 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)는 반감기를 연장시키는 Fc 변이이고, 함께, 별도로 또는 임의의 조합으로 함께 사용될 수 있다. 이들 변이 및 기타 번호는 미국 특허 제7,083,784호에 상세히 기재되어 있다. 이러한 변이를 기재하는 미국 특허 제7,083,784호의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 유사하게는 M428L 및 N434S는 반감기를 연장하는 Fc 변이이고, 함께, 별도로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 이들 변이 및 기타 번호는 미국 특허 공개공보 제2010/0234575호 및 미국 특허 제7,670,600호에 상세히 기재되어 있다. 이러한 변이를 기재하는 미국 특허 공개공보 제2010/0234575호 및 미국 특허 제7,670,600호의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 또한, 하기 부위 중의 하나에서 임의의 치환은 본원에서 의미하는 바와 같이 반감기를 연장시키는 Fc 변이로서 간주될 수 있다: 250, 251, 252, 259, 307, 308, 332, 378, 380, 428, 430, 434, 436. 이들 변이 각각 또는 이들 변이의 조합은 본원에 기재된 바와 같이 헤테로이량체성 또는 단량체성 Bi-Fc 항체의 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있는 기타 변이는 2012년 12월 17일자로 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2012/070146호(WO 2013/096221로 공개됨)에 상세히 기재되어 있다. 이러한 변이를 기재하는 이 출원의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 본원에 기재된 일부 구체적 실시형태는, 그 중에서도 하기 아미노산 서열: GGCVFNMFNCGG(서열번호 36), GGCHLPFAVCGG(서열번호 37), GGCGHEYMWCGG(서열번호 38), GGCWPLQDYCGG(서열번호 39), GGCMQMNKWCGG(서열번호 40), GGCDGRTKYCGG(서열번호 41), GGCALYPTNCGG(서열번호 42), GGCGKHWHQCGG(서열번호 43), GGCHSFKHFCGG(서열번호 44), GGCQGMWTWCGG(서열번호 45), GGCAQQWHHEYCGG(서열번호 46) 및 GGCERFHHACGG(서열번호 47)를 포함하는, 반감기를 연장시키는 위치 384 및 385(표 2에 제시된 EU 넘버링) 사이에 삽입체를 포함한다. 이러한 삽입체를 함유하는 헤테로이량체성 또는 단량체성 Bi-Fc 항체가 고려된다.
"호모이량체 형성에 바람직하지 않은 Fc 변이"는, Fc 폴리펩티드 쇄가 야생형 Fc 폴리펩티드 쇄와 비교하여 호모이량체를 형성하는 감소된 능력을 갖도록 Fc 폴리펩티드 쇄에 임의의 변이를 포함한다. 이러한 변이는 미국 특허 공개공보 제US2012/0244578호에 상세히 기재되어 있다. 이러한 변이를 기재하는 이 공보의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 이러한 변이의 예는, 이로써 제한되지 않지만, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있는 하기를 포함한다: R409D, R409E, D399K, D399R, N392D, N392E, K392D, K392E, K439D, K439E, D356K, D356R, E356K, E356R, K370D, K370E, E357K 및 E357R. 이러한 변이는 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄, 특히 Bi-Fc가 단량체인 실시형태에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이는 Fc 폴리펩티드 쇄의 CH3 영역에서 발생하고, 야생형 아미노산 서열 중의 하나 이상의 하전된 아미노산이 CH3 호모이량체 형성에 정전기적으로 불리한 아미노산으로 대체되고/되거나 하나 이상의 소수성 계면 잔기가 작은 극성 아미노산, 예를 들면, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 세린 또는 트레오닌으로 대체되도록 하는 변이를 포함한다. 보다 구체적으로, 예를 들면, 하전된 아미노산, 예를 들면, 위치 392 및/또는 위치 409에서의 리신은 중성 또는 역으로 하전된 아미노산, 예를 들면, 아스파르테이트 또는 글루타메이트로 대체될 수 있다. 이는 또한 Fc 폴리펩티드 쇄 중의 임의의 기타 하전된 아미노산에서 발생할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Y349, L351, L368, V397, L398, F405 및 Y407로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 소수성 계면 잔기는 작은 극성 아미노산으로 대체될 수 있다. 추가로, Fc 폴리펩티드 쇄는 디-설파이드 결합 형성을 방지하기 위해 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 이와 관련하여 특히 유용한 시스테인 돌연변이는 Fc 폴리펩티드 쇄의 힌지 영역 중의 것들이다. 이러한 시스테인은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단량체성 Bi-Fc의 경우, 힌지 영역은 완전히 부재할 수 있다.
"헤테로이량체화 변이"는 일반적으로 헤테로이량체성 Fc 영역, 즉 Fc 영역의 A 쇄 및 B 쇄가 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 Fc 영역의 형성을 촉진하는 Fc 영역의 A 및 B 쇄 중의 변이를 지칭한다. 이러한 변이는 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. 헤테로이량체화 변이는 비대칭일 수 있고, 즉 특정 변이를 갖는 A 쇄는 상이한 변이를 갖는 B 쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 이들 변이는 헤테로이량체화를 촉진하고, 호모이량체화를 배척한다. 헤테로-이량체 또는 호모-이량체가 형성되는지의 여부는 일부 상황에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같은 크기 차이에 의해, 또는 크기가 구별되는 특징이 아닌 상황에서 기타 적절한 수단(예를 들면, 분자 태그, 또는 헤테로이량체의 특정 부분을 인식하는 항체에 의한 결합)에 의해 평가할 수 있다. 이러한 쌍을 이룬 헤테로이량체화 변이의 한 가지 예는 소위 "놉 및 홀(knobs and holes" 치환이다[참조: 미국 특허 제7,695,936호 및 미국 특허 공개공보 제2003/0078385호, 이러한 돌연변이를 기재하는 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.]. 본원에서 의미하는 바와 같이, 한 쌍의 놉 및 홀 치환을 함유하는 Fc 영역은 A 쇄에 하나의 치환 및 B 쇄에 또 다른 치환을 함유한다. 예를 들면, IgG1 Fc 영역의 A 및 B 쇄에서 하기 놉 및 홀 치환은 변형되지 않은 A 및 B 쇄로 밝혀진 것과 비교하여 헤테로이량체 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다: 1) 하나의 쇄에서 Y407T 및 다른 쇄에서 T366Y; 2) 하나의 쇄에서 Y407A 및 다른 쇄에서 T366W; 3) 하나의 쇄에서 F405A 및 다른 쇄에서 T394W; 4) 하나의 쇄에서 F405W 및 다른 쇄에서 T394S; 5) 하나의 쇄에서 Y407T 및 다른 쇄에서 T366Y; 6) 하나의 쇄에서 T366Y 및 F405A 및 다른 쇄에서 T394W 및 Y407T; 7) 하나의 쇄에서 T366W 및 F405W 및 다른 쇄에서 T394S 및 Y407A; 8) 하나의 쇄에서 F405W 및 Y407A 및 다른 쇄에서 T366W 및 T394S, 및 9) Fc의 하나의 폴리펩티드에서 T366W 및 다른 폴리펩티드에서 T366S, L368A 및 Y407V. 상기 설명된 바와 같이, 이러한 방식의 기록되는 돌연변이는 다음과 같이 설명될 수 있다. EU 넘버링 시스템(이는 문헌[참조: Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85]에 제시되어 있고; 또한 하기 표 2 참조)을 사용하여 CH3 영역 중의 소정 위치에 통상 존재하는 아미노산(1문자 코드 사용)은 EU 위치가 계속하고, 이는 당해 위치에 존재하는 또 다른 아미노산이 계속한다. 예를 들면, Y407은 EU 위치 407에 통상 존재하는 티로신이 트레오닌으로 대체되어 있는 것을 의미한다. 대안적으로 또는 이러한 변이에 추가하여, 신규 디설파이드 브릿지를 생성하는 치환은 헤테로이량체 형성을 촉진시킬 수 있다[참조: 미국 특허 공개공보 제2003/0078385호, 이의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.]. IgG1 Fc 영역에서 이러한 변이는, 예를 들면, 하기 치환을 포함한다: 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 E356C; 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 Y349C 및 다른 쇄에서 E357C; 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 L351C 및 다른 쇄에서 S354C; 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 T394C 및 다른 쇄에서 E397C; 또는 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 D399C 및 다른 쇄에서 K392C. 유사하게는, 예를 들면, CH3-CH3 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 전하를 변화시키는 치환은 국제 공개공보 제WO2009/089004호에 설명된 바와 같이 헤테로이량체 형성을 증강시킬 수 있고, 이러한 치환을 기재하는 상기 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 이러한 치환은 본원에서 "전하 쌍 치환"으로 지칭되며, 한 쌍의 전하 쌍 치환을 함유하는 Fc 영역은 A 쇄에서 하나의 치환 및 B 쇄에서 상이한 치환을 함유한다. 전하 쌍 치환의 일반적 예는 하기를 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 K409D 또는 K409E + 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 2) 하나의 쇄에서 K392D 또는 K392E + 다른 쇄에서 D399K 또는 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K439D 또는 K439E + 다른 쇄에서 E356K 또는 E356R; 및 4) 하나의 쇄에서 K370D 또는 K370E + 다른 쇄에서 E357K 또는 E357R. 또한, 양 쇄에서 치환체 R355D, R355E, K360D 또는 K360R은, 다른 헤테로이량체화 변이와 함께 사용되는 경우, 헤테로이량체를 안정화시킬 수 있다. 특정의 전하 쌍 치환은 단독으로 또는 다른 전하 쌍 치환과 함께 사용될 수 있다. 단일 쌍의 전하 쌍 치환 및 이의 조합의 구체적 예는 하기를 포함한다: 1) 하나의 쇄에서 K409E + 다른 쇄에서 D399K; 2) 하나의 쇄에서 K409E + 다른 쇄에서 D399R; 3) 하나의 쇄에서 K409D + 다른 쇄에서 D399K; 4) 하나의 쇄에서 K409D + 다른 쇄에서 D399R; 5) 하나의 쇄에서 K392E + 다른 쇄에서 D399R; 6) 하나의 쇄에서 K392E + 다른 쇄에서 D399K; 7) 하나의 쇄에서 K392D + 다른 쇄에서 D399R; 8) 하나의 쇄에서 K392D + 다른 쇄에서 D399K; 9) 하나의 쇄에서 K409D 및 K360D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 10) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 다른 쇄에서 D399K 및 E357K; 11) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K, E356K 및 E357K; 12) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D 및 다른 쇄에서 D399K; 13) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K; 14) 하나의 쇄에서 K409D 및 K392D + 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 15) 하나의 쇄에서 K409D 및 K370D + 다른 쇄에서 D399K 및 D357K; 16) 하나의 쇄에서 D399K + 다른 쇄에서 K409D 및 K360D; 및 17) 하나의 쇄에서 K409D 및 K439D + 다른 쇄에서 D399K 및 E356K. 임의의 이들 헤테로이량체화 변이는 본원에 기재된 헤테로이량체성 이중특이적 항체의 Fc 영역에서 사용될 수 있다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "FcγR 결합을 억제하는 변이"는, 예를 들면, ALIPHALISAR-기반 경쟁 결합 검정(PerkinElmer, Waltham, MA)에 의해 측정된 바와 같이 FcγRIIA, FcγRIIB 및/또는 RcγRIIIA의 결합을 억제하는 Fc 폴리펩티드 쇄 중의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환이다. 이러한 변이는 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, Fc 감마 수용체(FcγR) 결합을 억제하는 변이는 L234A, L235A, 또는 N297에서의 임의의 치환을 포함하여 N297에서의 글리코실화를 억제하는 임의의 변이를 포함한다. 또한, N297에서 글리코실화를 억제하는 변이와 함께, 추가의 디설파이드 브릿지를 생성함으로써 이량체성 Fc 영역을 안정화시키는 추가의 변이가 또 고려된다. FcγR 결합을 억제하는 변이의 추가의 예는 하나의 Fc 폴리펩티드 쇄에서 D265A 변이 및 다른 Fc 폴리펩티드 쇄에서 A327Q 변이를 포함한다. 일부 이러한 변이는 문헌[참조: Xu et al. (2000), Cellular Immunol. 200: 16-26]에 기재되어 있고, 이러한 변이를 기재하고 이들의 활성을 평가하는 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "ADCC를 증강시키는 변이"는 항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 증강시키는 Fc 폴리펩티드 쇄에서 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환이다. 이러한 변이는 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. 다수의 이러한 변이는 국제 공개공보 제WO 2012/125850호에 기재되어 있다. 이러한 변이를 기재하는 이 출원의 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 이러한 변이는 본원에 기재된 바와 같은 헤테로이량체성 이중특이적 항체의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄에 포함될 수 있다. ADCC 검정은 다음과 같이 수행할 수 있다. 세포 표면 상에서 다량 및 소량의 암 세포 항원을 발현하는 세포주는 표적 세포로서 사용될 수 있다. 이들 표적 세포는 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지할 수 있고, 이어서 V-형상의 웰을 갖는 96-웰 미세역가 플레이트에 침착시키기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)로 1회 세척한다. 정제된 면역 효과기 세포, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 마크로파지, 호중구를 각 웰에 첨가할 수 있다. 암 항원에 결합하고 시험되는 변이(들) 및 이소형-정합 대조군 항체를 함유하는 단일특이적 항체를 1:3 비율로 희석하고, 웰에 첨가할 수 있다. 세포는 3.5시간 동안 5% CO2로 37℃에서 배양할 수 있다. 세포는 확장(spun down)시키고, 사멸 세포를 염색하는 TO-RPOR-3 요오다이드(Molecular Probes, Inc. Corporation, Oregon, USA)를 갖는 1×FACS 완충제(0.5% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 1×인산염 완충 식염수(PBS))에 재현탁시킨 다음, 형광 활성화된 세포 선별(FACS)에 의해 분석한다. 세포 사멸 비율은 하기 식을 사용하여 계산할 수 있다:
( 이중특이성을 갖는 종양 세포 용해율( % )- 이중특이성이 없는 종양 세포 용해율(%))/(전체 세포 용해율(%)-이중특이성이 없는 종양 세포 용해율(%))
전체 세포 용해율은 이중특이적 분자 부재하에 효과기 세포 및 표지된 표적 세포를 함유하는 샘플을 냉각 80% 메탄올로 용해시킴으로써 결정된다. ADCC를 증강시키는 예시적 변이는 Fc 영역의 A 및 B 쇄에서 하기 변이를 포함한다: (a) A 쇄는 Q311M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, E294L 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (b) A 쇄는 E233L, Q311M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, E294L 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (c) A 쇄는 L234I, Q311M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, E294L 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (d) A 쇄는 S298T 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (e) A 쇄는 A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (f) A 쇄는 A330F 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (g) A 쇄는 Q311M, A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, E294L 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (h) A 쇄는 Q311M, A330F 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, E294L 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (i) A 쇄는 S298T, A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (j) A 쇄는 S298T, A330F 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (k) A 쇄는 S239D, A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (l) A 쇄는 S239D, S298T 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (m) A 쇄는 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (n) A 쇄는 K334V 치환체를 포함하고, B 쇄는 L234Y, Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (o) A 쇄는 L235S, S239D 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (p) A 쇄는 L235S, S239D 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (q) A 쇄는 Q311M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, F243V 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (r) A 쇄는 Q311M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (s) A 쇄는 S239D 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (t) A 쇄는 S239D 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (u) A 쇄는 F243V 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (v) A 쇄는 F243V 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (w) A 쇄는 E294L 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (x) A 쇄는 E294L 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y, Y296W 및 S298C 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; (y) A 쇄는 A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 L234Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이고; 또는 (z) A 쇄는 A330M 및 K334V 치환체를 포함하고 B 쇄는 K290Y 및 Y296W 치환체를 포함하거나, 또는 그 반대이이다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "IgG 항체"는, 2개의 면역글로불린 IgG 중쇄 및 카파 또는 람다 경쇄일 수 있는 2개의 면역글로불린 경쇄로 본질적으로 이루어진 항체이다. 보다 구체적으로, 중쇄는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 그 순서로 함유하는 반면, 경쇄는 VL 영역, 이어서 CL 영역을 함유한다. 이러한 면역글로불린 영역의 다수의 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Kabat et al. in Sequences of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]. 카뱃 등에 개시된 IgG 항체로부터의 영역의 서열은 본원에서 참조로서 도입된다. 면역글로불린 IgG 중쇄 및/또는 경쇄의 공지되거나 천연 발생 서열에 대해 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 아미노산 치환체, 삽입체 및/또는 결실체를 포함하는 공지된 및/또는 천연-발생 IgG 항체의 가까운 변이체는 IgG 항체가 의미하는 것 내에 포함된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "면역 효과기 세포"는, 예를 들면, T 세포, NK 세포, 마크로파지 또는 호중구를 포함하여 세포용해 면역 반응의 매개에 관여하는 세포이다. 본원에 기재된 헤테로이량체성 또는 단량체성 Bi-Fc 항체는, 면역 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 단백질의 일부인 항원에 결합한다. 이러한 단백질은 "효과기 세포 단백질"로서 본원에서 지칭된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "면역글로불린 중쇄"는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, CH3 영역을 당해 순서로 본질적으로 포함하고, 임의로 일부 이소형에서 CH3 영역의 하류 영역을 포함한다. 공지된 또는 천연 발생 면역글로불린 중쇄 아미노산 서열에 대하여 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 아미노산 치환체, 삽입체 및/또는 결실체를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 가까운 변이체는 면역글로불린 중쇄가 의미하는 것 내에 포함된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "면역글로불린 경쇄"는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)로 본질적으로 이루어져 있다. 공지되거나 천연 발생 면역글로불린 경쇄 아미노산 서열에 대하여 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 아미노산 치환체, 삽입체 및/또는 결실체를 함유하는 면역글로불린 경쇄의 가까운 변이체는 면역글로불린 경쇄가 의미하는 것 내에 포함된다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "면역글로불린 가변 영역"은 VH 영역, VL 영역 또는 이의 변이체이다. 공지되거나 천연 발생 면역글로불린 가변 영역 아미노산 서열에 대하여 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 아미노산 치환체, 삽입체 및/또는 결실체를 함유하는 면역글로불린 가변 영역의 가까운 변이체는 면역글로불린 가변 영역이 의미하는 것 내에 포함된다. VH 및 VL 영역의 다수의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Kabat et al. in Sequences of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]에 개시된 것들이다. VH 및 VL 영역의 덜 가변 부분 중의 광범위한 서열 공통성, 보다 많은 가변 영역의 서열 내의 위치 및 예상된 3차 구조에 기반하여, 당해 기술분야의 숙련가는 이의 서열에 의해 면역글로불린 가변 영역을 인지한다[참조: Honegger and Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 309: 657-670].
면역글로불린 가변 영역은, 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)으로 공지된 3개의 초가변 영역을 함유한다. 이들 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. CDR은 덜 가변 프레임워크 영역(FR1-FR4) 내에 매립된다. 면역글로불린 가변 영역 내의 이들 부분영역(subregion)의 순서는 다음과 같다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 면역글로불린 가변 영역의 다수의 서열은 문헌에 공지되어 있다[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991].
CDR은 다음 방식으로 VH 영역 서열 내에 위치할 수 있다. CDR1은 성숙 VH 영역의 대략 잔기 31에서 개시하고, 통상적으로 약 5 내지 7개 아미노산 길이이며, 거의 항상 Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx(서열번호 1)(여기서, "Xxx"는 임의의 아미노산이다.)가 선행된다. 중쇄 CDR1 이후의 잔기는 거의 항상 트립토판, 종종 Trp-Val, Trp-Ile 또는 Trp-Ala이다. CDR1 중의 최후 잔기와 CDR2 중의 최초 잔기 사이에는 14개 아미노산이 거의 항상 존재하고, CDR2는 통상적으로 16 내지 19개 아미노산을 함유한다. CDR2는 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(서열번호 2)이 직접 선행할 수 있고, 이어서 바로 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala이 후속할 수 있다. 다른 아미노산은 CDR2를 선행하거나 후속할 수 있다. CDR2 중의 최후 잔기 및 CDR3의 최초 잔기 사이에는 32개 아미노산이 거의 항상 위치하고, CDR3은 약 3 내지 25개 잔기 길이일 수 있다. Cys-Xxx-Xxx는 거의 항상 CDR3을 바로 선행하고, Trp-Gly-Xxx-Gly(서열번호 3)은 거의 항상 CDR3을 후속한다.
경쇄 CDR은 다음 방식으로 VL 영역에 위치할 수 있다. CDR1은 성숙 항체의 대략 잔기 24에서 개시하고, 통상 약 10 내지 17개 잔기 길이이다. 이는 거의 항상 Cys가 선행한다. CDR1의 최후 잔기 및 CDR2의 최초 잔기 사이에는 거의 항상 15개 아미노산이 있고, CDR2는 거의 항상 7개 잔기 길이이다. CDR2는 통상 Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys 또는 Ile-Phe가 선행한다. CDR2 및 CDR3 사이에는 거의 항상 32개 잔기가 있고, CDR3은 통상 약 7 내지 10개 아미노산 길이이다. CDR3은 거의 항상 Cys가 선행하고, 통상 Phe-Gly-Xxx-Gly(서열번호 4)가 후속한다.
본원에서 의미하는 바와 같이, "링커"는 2개의 폴리펩티드를 연결하는 펩티드이고, 이는 Bi-Fc 항체의 문맥에서 2개의 면역글로불린 가변 영역들 또는 가변 영역 및 Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 링커는 길이가 2 내지 30개 또는 2 내지 40개 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 2 내지 25개, 2 내지 20개 또는 3 내지 18개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 단지 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 5 내지 25, 5 내지 15, 4 내지 11, 10 내지 20, 20 내지 30 또는 30 내지 40 아미노산 길이일 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 예시적 링커는, 예를 들면, 그 중에서도 아미노산 서열 TVAAP(서열번호 17), ASTKGP(서열번호 18), GGGGSGGGGS(서열번호 19), GGGGSAAA(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 21) 및 AAA을 포함한다.
본원에서 의미하는 바와 같이, Bi-Fc는 "면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고", Bi-Fc의 0.001pM 내지 20000pM 양을 세포에 첨가할 때, "표적 세포용해 검정"이란 주제로 하기 부분 및 실시예 3에 기재된 세포용해 검정은 표적 세포의 세포용해를 효과적으로 유발한다.
"비-화학요법 항- 신생물제"는 화학치료제 이외에 암 세포에 대해 세포독성 또는 세포 증식억제 효과를 갖는 화학제, 화합물 또는 분자이다. 그러나, 비-화학요법 항신생물제는, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체를 포함하여 세포 표면 수용체 등의 세포 분화에 간접적으로 영향을 미치는 분자와 직접 상호작용하도록 표적화될 수 있다. 그러나, 비-화학요법 항신생물제는, 예를 들면, DNA 복제, RNA 합성, 단백질 합성 또는 방추체 기능, 조립 또는 분해 등과 같이 세포 분화에 친밀하게 관련되는 프로세스를 직접 간섭하지 않는다. 비-화학요법 항-신생물제의 예는, 다수의 가능한 비-화학요법 항-신생물제 중에서 Bcl2의 억제제, 파르네실트랜스페라제의 억제제, 항-에스트로겐제, 예를 들면, 타목시펜, 항-안드로겐성 화합물, 인터페론, 비소, 레티노산, 레티노산 유도체, 종양-특이적 항원에 대해 표적화된 항체, 및 Bcr-Abl 티로신 키나제의 억제제(예: 상표명 GLEEVECTM하에 시판되는 소분자 STI-571, Novartis, New York and New Jersey, USA 및 Basel, Switzerland)를 포함한다.
하나의 아미노산 또는 핵산 서열과 또 다른 아미노산 또는 핵산 서열과의 "퍼센트 동일성"은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 예시적 컴퓨터 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG; Madison, WI) 위스콘신 팩키지 버젼 10.0 프로그램, GAP(Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95)이다. GAP 프로그램을 위한 바람직한 디펄트 파라미터는 (1) 뉴클레오티드에 대한 단항 비교 매트릭스의 GCG 실행(동일성에 대해 1의 값 및 비-동일성에 대해 0의 값을 함유), 문헌[참조: Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, Schwartz and Dayhoff, eds., National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)]에 기재된 바와 같은 그리브스코브 및 부르게스의 중량 아미노산 비교 매트릭스[(1986) Nucleic Acids Res. 14: 6745] 또는 기타 비교가능한 비교 매트릭스; (2) 아미노산 서열에 있어서 각각의 갭에 대해 8의 패널티 및 각 갭 중의 각각의 심볼에 대해 2의 추가 패널티, 또는 뉴클레오티드 서열에 있어서 각각의 갭에 대해 50의 패널티 및 각 갭 중의 각각의 심볼에 대해 3의 추가 패널티; (3) 말단 갭에 대해 패널티 없음; 및 (4) 긴 갭에 대해 최대 패널티 없음을 포함한다. 서열 비교에 대해 당해 기술분야의 숙련가가 사용하는 기타 프로그램도 또한 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 동일성을 결정하기 위한 비교와 관련하여, "동일성 영역"은 하기 언급된 파라미터를 사용하여 컴퓨터 프로그램 GAP(Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95)에 의해 또 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 부분적으로 또는 정확하게 정합되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분이다. 예를 들면, 20개 아미노산의 폴리펩티드가 상당히 긴 단백질로 정렬되는 경우, 최초 10개 아미노산은 보다 긴 단백질과 정확하게 정합하고, 최후 10개 아미노산은 보다 긴 단백질과 전혀 정합하지 않고, 동일성 영역은 10개 아미노산이다. 한편, 20개 아미노산 폴리펩티드의 최초 및 최후 아미노산이 보다 긴 단백질과 정합하고 8개 다른 아미노산이 이들 사이에 산란하는 경우, 동일성 영역은 20개 아미노산 길이이다. 그러나, 동일한 또는 보존적으로 치환된 아미노산 또는 적어도, 예를 들면, 20개 아미노산 또는 60개 뉴클레오티드의 동일한 뉴클레오티드의 부재하에 정렬된 가닥 중의 긴 스트레치는 본원에서 의미하는 바와 같이 동일성 영역의 종점을 구성한다.
"표적 세포"는 Bi-Fc가 결합하고 질환의 매개에 관여하는 세포이다. 일부 경우에, 표적 세포는 면역 반응의 매개에 통상 관여하고 또한 질환의 매개에 관여하는 세포일 수 있다. 예를 들면, B 세포 림프종에서, 면역 반응의 매개에 통상 관여하는 B 세포는 표적 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포, 병원체로 감염된 세포, 또는 자가면역 또는 염증 질환, 예를 들면, 섬유성 질환의 매개에 관여하는 세포이다. Bi-Fc는, 표적 세포의 표면 상에서 표시되는 단백질, 가능하게는 고도로 발현된 단백질인 "표적 세포 단백질" 상에서 항원에 대한 결합을 통해 표적 세포에 결합할 수 있다.
"종양 부하"는 생존 암 세포의 수, 종양 부위의 수 및/또는 암을 앓고 있는 환자에서 종양(들)의 크기를 지칭한다. 종양 부하의 감소는, 예를 들면, 환자의 혈액 또는 뇨에서 종양-연관 항원 또는 단백질 양의 감소, 종양 세포 수 또는 종양 부위의 감소 및/또는 하나 이상의 종양의 크기 감소로서 관찰될 수 있다.
Bi-Fc 또는 임의의 기타 약물의 "치료학적 유효량"은, 예를 들면, 암 환자의 종양 부하를 감소 또는 제거하거나 당해 단백질이 치료에 사용되는 임의의 질환 병태의 증상을 감소 또는 제거하는 효과를 갖는 양이다. 치료학적 유효량은 병태의 모든 증상을 완전히 제거할 필요는 없고, 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킬 수 있거나 치료된 병태 후에 일부 빈도로 발생할 수 있는 보다 심각한 증상 또는 보다 심각한 질환의 개시를 지연시킬 수 있다.
본원에서 언급된 임의의 질환의 "치료"는 질환의 적어도 하나의 증상의 경감, 질환의 중증도의 감소 또는, 일부 경우에, 질환을 수반하거나 적어도 하나의 다른 질환을 유도할 수 있는 보다 심각한 증상으로 질환 진행의 지연 또는 예방을 포함한다. 치료는 당해 질환이 완전히 치유되는 것을 의미할 필요는 없다. 유용한 치료제는 질환의 중증도의 감소, 질환 또는 이의 치료와 연관된 하나 이상의 증상의 중증도의 감소, 또는 치료된 병태 후에 일부 빈도로 발생할 수 있는 보다 심각한 증상 또는 보다 심각한 질환의 개시의 지연만을 필요로 한다.
면역글로불린 가변 영역의 명명된 VH/VL 쌍이 "이들이 IgG 및/또는 scFv 항의 일부인 경우" 표적 세포 또는/및 면역 효과기 세포에 결합할 수 있는 것으로 언급될 때, 이는 양 중쇄 중의 명명된 VH 영역 및 양 경쇄 중의 명명된 VL 영역을 함유하는 IgG 항체 및/또는 이들 VH 및 VL 영역을 함유하는 scFv 항체가 표적 세포 및/또는 면역 효과기 세포에 결합할 수 있음을 의미한다. 실시예 2에 기재된 결합 검정은 결함을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
Bi - Fc 분자
가장 일반적 의미에서, Bi-Fc는 2개의 상이한 항원에 일가 결합할 수 있고, 하나의 폴리펩티드 쇄 또는, 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 또한, 이는 이의 Fc 영역을 통해 약간 산성 pH(약 pH 5.5 내지 6.0)에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있다. FcRn과의 이러한 상호작용은 생체내에서 분자의 반감기를 연장시킬 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄(일부 경우에, 이는 유일한 폴리펩티드 쇄이다)는 Fc 폴리펩티드 쇄, 및 링커에 의해 분리될 수 있는 2개의 VH 영역 + 2개의 VL 영역을 포함한다. Fc 폴리펩티드 쇄는 4개 면역글로불린 가변 영역에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있고, 이는 링커를 통해 가변 영역에 연결될 수 있다. 제2 폴리펩티드 쇄는, 존재하는 경우, Fc 폴리펩티드 쇄를 포함한다. Bi-Fc는 면역 효과기 세포 및 표적 세포에 결합할 수 있고/있거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개할 수 있다. Bi-Fc의 일반 구조는 도 1에 도해되어 있고, 이는 Fc 폴리펩티드 쇄가 C-말단인 실시형태(패널 A 및 B) 및 Fc 폴리펩티드 쇄가 N-말단에 존재하는 실시형태(패널 C 및 D)를 나타낸다.
보다 특정 실시형태는 면역글로불린 가변 영역의 순서 및 링커의 길이를 특정하고, 면역글로불린 가변 영역이 효과기 세포 단백질 또는 표적 세포 단백질에 대한 결합 부위를 형성하기 위해 연관할 수 있음을 특정한다. 일반적으로, 항체의 항원-결합 부분은, 일부 경우 VH 또는 VL 영역이 파트너 부재하에 항원에 결합할 수 있지만, 본원에서 "VH / VL 쌍"으로 지칭되는 VH 및 VL 영역 둘 다를 포함한다[참조: 미국 특허 공개공보 제2003/0114659호].
한 가지 그룹의 실시형태에서, 4개 가변 영역은 하기 순서로 정렬될 수 있다: VH1-링커1-VL1-링커2-VH2-링커3-VL2, 여기서 VH1/VL1은 항원-결합 쌍이고, VH2/VL2는 또 다른 항원-결합 쌍이다. 이러한 그룹의 실시형태에서, 링커 1 및 링커 3은 적어도 15개 아미노산 길이일 수 있고, 링커 2는 12개 미만의 아미노산 길이일 수 있거나, 일부 경우에 부재할 수 있다. 일부 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH1/VL1 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다.
또 다른 그룹의 실시형태에서, 4개 가변 영역은 하기 순서로 정렬될 수 있다: VL1-링커1-VH1-링커2-VL2-링커3-VH2, 여기서 VH1/VL1은 항원-결합 쌍이고, VH2/VL2는 항원-결합 쌍이다. 이들 실시형태에서, 링커 2는 12개 미만의 아미노산 길이이거나 부재할 수 있고, 링커 1 및 링커 3은 적어도 15개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, VH1/VL1 상은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다.
또 다른 그룹의 실시형태에서, 4개 가변 영역은 다음 순서로 정렬될 수 있다: VH1-링커1-VL1-링커2-VL2-링커3-VH2, 여기서 VH1/VL1은 항원-결합 쌍이고, VH2/VL2는 항원-결합 쌍이다. 이들 실시형태에서, 링커 2는 12개 미만의 아미노산 길이이거나 부재할 수 있고, 링커 1 및 링커 3은 적어도 15개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다.
추가 그룹의 실시형태에서, 4개 가변 영역은 다음 순서로 정렬될 수 있다: VL1-링커1-VH1-링커2-VH2-링커3-VL2, 여기서 VH1/VL1은 항원-결합 쌍이고, VH2/VL2는 항원-결합 쌍이다. 이들 실시형태에서, 링커 2는 12개 미만의 아미노산 길이이거나 부재할 수 있고, 링커 1 및 링커 3은 적어도 15개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, VH1/VL1 쌍은 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있고, VH2/VL2 쌍은 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다.
Bi-Fc는 항체의 Fc 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. Fc 폴리펩티드 쇄는 포유동물(예: 인간, 마우스, 랫트, 래빗, 단봉낙타, 또는 새로운 또는 오래된 세계 원숭이), 유인원 또는 상어 기원의 것일 수 있다. 예를 들면, Fc 폴리펩티드 쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 또한, 상기 설명된 바와 같이, Fc 폴리펩티드 쇄는 제한된 수의 변이를 포함할 수 있다. 보다 특히, Fc 폴리펩티드 쇄는 공지되거나 천연-발생 서열에 대하여 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 삽입체, 결실체 및/또는 치환체를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 헤테로이량체성 Bi-Fc의 2개의 Fc 폴리펩티드 쇄는 헤테로이량체화 변이를 함유하고, 이는, 예를 들면, 전하 쌍 치환체일 수 있다. 예를 들면, Bi-Fc의 제1 폴리펩티드 쇄는 치환체 R409D, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392D, N392E, K392D 또는 K392E를 포함할 수 있고, Bi-Fc의 제2 폴리펩티드 쇄는 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356R, D356K 또는 D356R을 포함할 수 있다. 또는, Bi-Fc의 제1 폴리펩티드 쇄는 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356R, D356K 또는 D356R을 포함할 수 있고, Bi-Fc의 제2 폴리펩티드 쇄는 R409E, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392E, N392D, K392D 또는 K392E를 포함할 수 있다. Fc 폴리펩티드 쇄는 또한 본원에서 의미하는 바와 같이 하나 이상의 "호모이량체 형성에 불리한 Fc 변이" 및/또는 하나 이상의 "반감기를 연장시키는 Fc 변이"를 포함할 수 있다.
Bi-Fc의 단량체성 실시형태에서, Bi-Fc는 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 "호모이량체 형성에 불리한 Fc 변이"를 포함할 수 있다.
다른 종류의 변이는 또한 Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드 쇄의 일부일 수 있다. 한 가지 양상에서, Bi-Fc에 포함된 Fc 영역은 상기 정의된 바와 같은 Fc 영역에 대한 "Fc 감마 수용체(FcγR)의 결합을 억제하는 변이"를 하나 이상 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, Bi-Fc에 포함된 Fc 영역은 상기 정의된 바와 같이 "반감기를 연장시키는 Fc 변이"를 하나 이상 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 하나 이상의 "ADCC를 증강시키는 변이"가 Bi-Fc의 일부인 Fc 영역에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포유동물, 예를 들면, 인간의 아미노산 서열, 또는 인간 아미노산 서열에 대해 서열의 100개 아미노산당 단일 아미노산의 단지 10개 결실체, 삽입체 또는 치환체를 포함하는 이의 변이체일 수 있다. 또는, Bi-Fc의 일부인 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄와 90% 또는 95% 동일할 수 있고, 동일성 영역은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 아미노산 길이일 수 있다. Fc 폴리펩티드의 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgM 또는 IgG, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 하기 표 2는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄 서열의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
Figure pct00003
인간 IgG Fc 영역의 아미노산 서열
표 2에 제시된 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른 것이고, 이는 인간 IgG1 항체의 불변 영역의 연속 넘버링에 기반한다[참조: Edelman et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. 63: 78-85]. 따라서, 이는 추가 길이의 IgG3 힌지를 수용하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이는 Fc 영역 중의 위치를 지칭하기 위해 당해 기술분야에서 여전히 통상 사용되기 때문에, Fc 영역 중의 위치를 지정하기 위해 본원에서 사용된다. IgG1, IgG2 및 IgG4 Fc 폴리펩티드의 힌지 영역은 약 위치 216으로부터 약 230까지 연장한다. 이는 IgG2 및 IgG4 힌지 영역이 IgG1 힌지보다 각각 짧은 3개 아미노산인 정렬로부터 명백하다. IgG3은 훨씬 더 길고, 상류로 추가 47개 아미노산을 연장한다. CH2 영역은 약 위치 231로부터 340까지 연장하고, CH3 영역은 약 위치 341로부터 447까지 연장한다.
Fc 폴리펩티드의 천연 발생 아미노산 서열은 약간 상이할 수 있다. 이러한 변화는 Fc 폴리펩티드의 공지되거나 천연-발생 아미노산 서열에서 서열의 100개 아미노산당 소정 아미노산의 단지 10개 삽입체, 결실체 및/또는 치환체를 포함할 수 있다. 치환체가 존재하는 경우, 이들은 상기 정의된 바와 같이 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 헤테로이량체성 Bi-Fc의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 상의 Fc 폴리펩티드는 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 "헤테로이량체화 변이", "ADCC를 증강시키는 변이", "FcγR 결합을 억제하는 변이", "호모이량체 형성에 불리한 Fc 변이" 및/또는 "반감기를 연장시키는 Fc 변이"를 포함할 수 있다.
Bi-Fc는 효과기 세포 단백질의 일부인 항원을 통해 면역 효과기 세포에 결합할 수 있고, 표적 세포 단백질의 일부인 항원을 통해 표적 세포에 결합할 수 있다. 가능한 효과기 세포 단백질의 수는 하기 상세히 기재되어 있다. 유사하게는, 가능한 표적 세포 단백질의 수도 하기에 기재되어 있다. Bi-Fc는 효과기 세포 단백질 및 표적 세포 단백질의 임의의 조합에 결합할 수 있다.
Bi-Fc의 예시적 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 10 및 12(헤테로이량체성 Bi-Fc); 서열번호 15 및 12(헤테로이량체성 Bi-Fc); 및 서열번호 34(이의 Fc 폴리펩티드 쇄 부분에 변이 Y349T, K392D 및 K409D(EU 넘버링)을 포함하는 단량체성 Bi-Fc).
Bi - Fc 분자를 코딩하는 핵산
Bi-Fc를 코딩하는 핵산이 제공된다. VH, VL, hinge, CH1, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함하여 면역글로불린 영역을 코딩하는 다수의 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Kabat et al. in Sequences of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991]. 본원에 제공된 지침을 사용하여, 당해 기술분야의 숙련가는 Bi-Fc를 코딩하는 핵산 서열을 생성하기 위해 당해 기술분야에 공지된 이러한 핵산 서열 및/또는 기타 핵산 서열을 조합할 수 있다. Bi-Fc를 코딩하는 예시적 핵산은 (1) 서열번호 11 및 13, (2) 서열번호 16 및 13 및 (3) 서열번호 35를 포함한다.
또한, Bi-Fc를 코딩하는 핵산 서열은 본원 및 다른 부분에 제공된 아미노산 서열 및 당해 기술분야의 지식에 기반하여 당해 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 특정 아미노산 서열을 코딩하는 클로닝된 DNA 세그먼트를 생산하는 보다 전통적 방법에 더하여, DNA 2.0(Menlo Park, CA, USA) 및 블루헤론(BlueHeron)(Bothell, WA, USA) 등의 회사는 그 중에서 임의의 목적하는 서열의 화학적으로 합성된, 유전자-크기의 DNA를 주문에 따라 통상 생산하여, 이러한 DNA를 생산하는 프로세스를 간소화한다.
Bi - Fc 분자의 제조 방법
Bi-Fc는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, Bi-Fc의 1개 또는 2개의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산은 다양한 공지된 방법, 예를 들면, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 핵산-코팅된 미세투사를 사용한 충격 등에 의해 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, Bi-Fc를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 도입되기 전에 숙주 세포에서의 발현에 적절한 벡터 내로 도입될 수 있다. 전형적으로, 이러한 벡터는 RNA 및 단백질 수준에서 삽입된 핵산의 발현을 가능하게 하는 서열 요소를 함유할 수 있다. 이러한 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수는 상업적으로 입수가능하다. 핵산을 함유하는 숙주 세포는 세포가 핵산을 발현할 수 있도록 하는 조건하에 배양될 수 있고, 수득되는 Bi-Fc는 세포 괴(mass) 또는 배양 배지로부터 수집할 수 있다. 또는, Bi-Fc는 생체내, 예를 들면, 식물 잎[참조: Scheller et al. (2001), Nature Biotechnol. 19: 573-577 및 그 안에 인용된 참조문헌], 조류 난[참조: Zhu et al. (2005), Nature Biotechnol. 23: 1159-1169 및 그 안에 인용된 참조문헌] 또는 포유동물 우유[참조: Laible et al. (2012), Reprod. Fertil. Dev. 25(1): 315]에서 생산될 수 있다.
그 중에서도, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실리스 스테아로테르모필루스(Bacilis stearothermophilus), 진균 세포, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 포함하는 레피도프테란 곤충 세포, 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포, 헬라 세포, 인간 간세포 암종 세포 또는 293 세포 등을 포함하는 다양한 배양된 숙주 세포가 사용될 수 있다.
면역 효과기 세포 및 효과기 세포 단백질
Bi-Fc는 면역 효과기 세포의 표면 상에서 발현된 분자(본원에서 "효과기 세포 단백질"이라 함) 및 표적 세포의 표면 상에서 발현된 또 다른 분자(본원에서 "표적 세포 단백질"이라 함)에 결합할 수 있다. 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 마크로파지 또는 호중구일 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포 단백질은 T 세포 수용체(TCR)-CD3 복합체에 포함된다. TCR-CD3 복합체는, TCRα 및 TCRβ 또는 TCRγ 및 TCRδ + CD3 제타(CDRζ) 쇄, CD3 엡실론(CD3ε) 쇄, CD3 감마(CD3γ) 쇄 및 CD3 델타(CD3δ) 쇄로부터의 다양한 CD3 쇄를 포함하는 헤테로이량체를 포함하는 헤테로다량체이다. 일부 실시형태에서, 효과기 세포 단백질은 인간 CD3 엡실론(CD3ε) 쇄(서열번호 22에 개시되어 있는 성숙 아미노산 서열)일 수 있고, 이는 다량체성 단백질의 일부일 수 있다. 또는, 효과기 세포 단백질은 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 TCRα, TCRβ, TCRδ, TCRγ, CD3β, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ζ일 수 있다.
더욱이, 일부 실시형태에서, Bi-Fc는 비-인간 종, 예를 들면, 마우스, 랫트, 래빗, 새로운 세계 원숭이 및/또는 오래된 세계 원숭이 종으로부터의 CD3ε 쇄에 또한 결합할 수 있다. 이러한 종은, 이로서 제한되지 않지만, 하기 포유동물 종을 포함한다: 무스 무스쿨루스(Mus musculus); 라투스 라투스(Rattus rattus); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); 시노몰구스 원숭이, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis); 하마드리아스 바분, 파피오 하마드리아스(Papio hamadryas); 기니아 바분, 파픽 파피오(Papio papio); 올리브 바분, 파픽 아누비스(Papio anubis); 황색 바분, 파픽 시노세팔루스(Papio cynocephalus); 카크마 바분, 파픽 우르시누스(Papio ursinus); 칼리트릭스 야쿠스(Callithrix jacchus); 사구이누스 오에디푸스(Saguinus Oedipus); 및 사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus). 시노몰구스 원숭이의 CD3ε 쇄의 성숙 아미노산 서열은 서열번호 23에 제공되어 있다. 단백질 치료제의 개발 분야에 공지된 바와 같이, 인간에서 비교가능한 활성을 가질 수 있는 치료제 및 마우스 및 원숭이 등과 같이 임상전 시험에 통상 사용되는 종은 약물 개발 속도를 단수화 및 가속시킬 수 있다. 약물을 시장에 가져오는 장기간 및 고가의 프로세스에서, 이러한 잇점을 중요할 수 있다.
보다 특정 실시형태에서, 헤테로이량체성 이중특이적 항체는 CD3ε 쇄의 최초 27개 아미노산 내에서 에피토프와 결합할 수 있고, 이는 인간 CD3ε 쇄 또는 상이한 종으로부터의 CD3ε 쇄, 특히 상기 수록된 포유동물 종의 것일 수 있다. 에피토프는 아미노산 서열 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(서열번호 24)를 함유할 수 있다.　이러한 에피토프에 결합하는 항체의 잇점은 미국 특허 공개공보 제2010/183615호에 상세히 설명되어 있고, 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다. 항체가 결합하는 에피토프는, 예를 들면, 미국 특허 공개공보 제2010/183615호에 기재되어 있는 알라닌 스캐닝에 의해 결정할 수 있고, 관련 부분은 본원에서 참조로서 도입된다.
요약하면, 알라닌 스캐닝은 다음과 같이 수행할 수 있다. 조절하에, 야생형 CD3ε을 코딩하는 DNA를 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포주에 적절한 발현 벡터에 삽입하고, TCR-CD3 복합체의 일부로서 발현될 수 있는 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 시험 샘플에서, DNA는 CD3ε의 아미노산의 단지 하나가 알라닌으로 변경되어 있는 CD3ε을 코딩한다. DNA 작제물은 전체 시리즈의 분자를 생성하기 위해 제조하고, 소정 시간에서 하나의 아미노산을 알라닌으로 변경한다. 단지 하나의 아미노산은 Bi-Fc에 대한 결합에 관여하는 CD3ε의 세포외 도메인에서 모든 가능한 아미노산 위치를 스캐닝하기 위해 작제물마다 상이하다. 시험되는 Bi-Fc는 포유동물 숙주 세포를 Bi-Fc를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고 세포 배양물로부터 항체를 회수함으로써 제조한다. 야생형 또는 알라닌 대체를 갖는, CD3ε을 발현하는 세포에 대한 Bi-Fc의 결합은 표준 형광-활성화된 세포 선별(FACS) 방법에 의해 평가할 수 있다. CD3ε이 특정 위치에서 알라닌 대체를 갖고 검출된 결합이 야생형 CD3ε으로 검출된 것과 비교하여 감소되거나 제거되는 샘플은 변경된 위치에서의 아미노산이 CD3ε에 대한 Bi-Fc의 결합에 통상 관여하는 것을 나타낸다.
T 세포가 성숙 효과기 세포인 경우, Bi-Fc가 결합할 수 있는 효과기 세포 단백질은, 이로써 제한되지 않지만, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ를 포함한다. NK 세포 또는 세포독성 T 세포가 면역 효과기 세포인 경우, 예를 들면, NKG2D, CD352, NKp46 또는 CD16a가 효과기 세포 단백질일 수 있다. CD8+ T 세포가 면역 효과기 세포인 경우, 예를 들면, 4-1BB 또는 NKG2D가 효과기 세포 단백질일 수 있다. 또는, Bi-Fc는 T 세포, NK 세포, 마크로파지 또는 호중구 상에서 발현된 다른 효과기 세포 단백질에 결합할 수 있다.
표적 세포 및, 표적 세포 상에서 발현된 표적 세포 단백질
상기 설명된 바와 같이, Bi-Fc는 효과기 세포 단백질 및 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다. 표적 세포 단백질은, 예를 들면, 암 세포, 병원체로 감염된 세포, 또는 질환, 예를 들면, 염증, 자가면역 및/또는 섬유성 병태를 매개하는 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포 단백질은, 고도의 발현이 반드시 요구되는 것은 아니지만, 표적 세포 상에서 고도로 발현될 수 있다.
표적 세포는 암 세포인 경우, 본원에 기재된 바와 같은 헤테로이량체성 이중특이적 항체는 상기 기재된 바와 같은 암 세포 항원에 결합할 수 있다. 암 세포 항원은 인간 단백질 또는 또 다른 종으로부터의 단백질일 수 있다. 예를 들면, 헤테로이량체성 이중특이적 항체는 그 중에서 마우스, 랫트, 래빗, 새로운 세계 원숭이 및/또는 오래된 세계 원숭이 종으로부터의 표적 세포 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 종은, 이로서 제한되지 않지만, 하기 종을 포함한다: 무스 무스쿨루스(Mus musculus); 라투스 라투스(Rattus rattus); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); 시노몰구스 원숭이, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis); 하마드리아스 바분, 파피오 하마드리아스(Papio hamadryas); 기니아 바분, 파픽 파피오(Papio papio); 올리브 바분, 파픽 아누비스(Papio anubis); 황색 바분, 파픽 시노세팔루스(Papio cynocephalus); 카크마 바분, 파픽 우르시누스(Papio ursinus); 칼리트릭스 야쿠스(Callithrix jacchus); 사구이누스 오에디푸스(Saguinus Oedipus); 및 사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus).
일부 예에서, 표적 세포 단백질은 감염된 세포 상에서 선택적으로 발현된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 간염 B 바이러스(HBV) 또는 간염 C 바이러스(HCV) 감염의 경우에, 표적 세포 단백질은 감염된 세포의 표면 상에서 발현되는 HBV 또는 HCV의 외피 단백질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 세포 단백질은 HIV-감염된 세포 상에서 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의해 코딩된 gp120일 수 있다.
다른 양상에서, 표적 세포는 자가면역 또는 염증 질환을 매개하는 세포일 수 있다. 예를 들면, 천식에서 인간 호산구는 표적 세포일 수 있고, 이 경우, 예를 들면, EGF-유사 모듈-함유 무신-유사 호르몬 수용체(EMR1)은 표적 세포 단백질일 수 있다. 또는, 전신성 홍반성 낭창 환자에서 과다한 인간 B 세포는 표적 세포일 수 있고, 이 경우, 예를 들면, CD19 또는 CD20은 표적 세포 단백질일 수 있다. 다른 자가면역 병태에서, 과다한 인간 Th2 T 세포는 표적 세포일 수 있고, 이 경우, 예를 들면, CCR4는 표적 세포 단백질일 수 있다. 유사하게는, 표적 세포는 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 간경변, 강피증, 신장 이식의 섬유증, 신장 동종이식 신병, 또는 특발성 폐 섬유증 및/또는 특발성 폐 고혈압을 포함하는 폐 섬유증을 매개하는 섬유성 세포일 수 있다. 이러한 섬유성 병태의 경우, 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP 알파)는, 예를 들면, 표적 세포 단백질일 수 있다.
표적 세포 세포용해 검정
하기 실시예에서, 본원에 기재된 Bi-Fc 항체가 시험관내에서 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 유도할 수 있는지를 결정하는 검정이 기재되어 있다. 이러한 검정에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 하기 매우 유사한 검정은 면역 효과기 세포가 NK 세포인 경우에 사용될 수 있다.
목적하는 표적 세포 단백질을 발현하는 표적 세포주는 37℃에서 15분 동안 2μM 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지하고, 이어서 세척할 수 있다. 이어서, 적절한 수의 표지된 표적 세포를 이중특이적 단백질의 존재 또는 부재하에, 대조군 단백질 또는 상이한 농도의 단백질 첨가 없이 하나 이상의 96 웰 평저 배양 플레이트에서 40분 동안 4℃에서 배양할 수 있다. 건강한 인간 공여체로부터 단리된 NK 세포는 밀테니아(Miltenyi) NK 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 단리한 다음, 10:1의 효과기:표적 비로 표적 세포에 첨가할 수 있다. 이 검정에서 면역 효과기 세포인 NK 세포는 분리 직후 또는 37℃에서 밤새 배양 후에 사용할 수 있다. 종양 표적 세포, 이중특이적 단백질 및 면역 효과기 세포를 함유하는 플레이트는 5% CO2와 함께 37℃에서 18 내지 24시간 동안 배양할 수 있다. 적절한 대조군 웰을 또한 설정할 수 있다. 18 내지 24시간 검정 기간 후, 모든 세포를 웰로부터 제거할 수 있다. 웰의 내용물 용적과 동등한 7-AAD 용액의 용적을 각 샘플에 첨가할 수 있다. 이어서, 샘플은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 유동 세포분석법을 통해 살아있는 대 사멸 표적 세포의 비율을 결정하기 위해 검정할 수 있다.
치료 방법 및 조성물
Bi-Fc는, 예를 들면, 다양한 형태의 암, 감염증, 자가면역 또는 염증성 병태 및/또는 섬유성 병태를 포함하는 광범위한 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에는 Bi-Fc를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 Bi-Fc + 하나 이상의 추가 성분, 예를 들면, 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 이러한 추가 성분은 그 중에서 완충제, 탄수화물, 폴리올, 아미노산, 킬레이트제, 안정화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Bi-Fc는, 인접한 조직 및 새로운 혈관의 성장의 파괴를 종종 동반하는 세포의 비조절된 및/또는 부적절한 증식을 수반하고, 새로운 부분으로 암 세포의 침입, 즉 전이를 가능하게 할 수 있는, 암을 포함하는 세포 증식성 질환의 치료에 사용될 수 있다. Bi-Fc로 치료가능한 병태에는, 결직장 폴립, 뇌허혈, 육안적 낭포증, 다발성 신장 질환, 전립선 비대증 및 자궁내막증을 포함하는 부적절한 세포 성장을 수반하는 비-악성 병태이다. Bi-Fc는 혈액 또는 고형 종양의 악성종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, Bi-Fc를 사용하여 치료될 수 있는 세포 증식성 질환은, 예를 들면, 중피종, 편평상피 세포 암, 골수종, 골육종, 신경교아종, 신경교종, 암종, 선암, 흑색종, 육종, 급성 및 만성 백혈병, 림프종 및 수막종, 호지킨 질환, 세자리 증후군, 다발성 골수종 및 폐암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 인두암, 유방암, 두경부암, 방광암, 난소암, 피부암, 전립선암, 자궁경부암, 질암, 위암, 신장 세포암, 신장암, 췌장암, 결직장암, 자궁내막암, 식도암, 간담도암, 골암, 피부암 및 혈액암을 포함하는 암종, 및 비강 및 부비강, 비인두, 구강, 인두, 후두, 하후두, 타액선, 종격, 위, 소장, 결장, 직장 및 항문 영역, 요관, 요도, 음경, 정소, 외음부, 내분비계, 중추신경계 및 형질 세포의 암이다.
암 치료를 위한 지침을 제공하는 문헌 중에는 문헌[참조: Cancer, Principles and Practice of Oncology, 4th Edition, DeVita et al., Eds. J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1993)]이 있다. 적절한 치료 방법은, 관련 분야에서 인식되는 바와 같이, 특정 종류의 암, 및 환자의 일반 상태 등의 기타 요인에 따라 선택된다. Bi-Fc는 자체로 사용될 수 있거나, 암 환자를 치료하는데 있어서 기타 항-신생물제를 사용한 치료 섭생에 부가할 수 있다.
일부 실시형태에서, Bi-Fc는 암 치료에 광범위하게 사용되는 다양한 약물 및 치료, 예를 들면, 화학요법제, 비-화학요법, 항-신생물제 및/또는 방사선과 함께 , 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 예를 들면, 화학요법 및/또는 방사선은 본원에 기재된 임의의 치료 전에, 치료 동안 및/또는 치료 후에 발생할 수 있다. 화학요법제의 예는 상기 언급되어 있고, 이로써 한정되지 않지만, 시스플라틴, 탁솔, 에토포사이드, 미토산트론(NovantroneR), 액티노마이신 D, 사이클로헥시미드, 캄프토테신(또는 이의 수용성 유도체), 메토트렉세이트, 미토마이신(예: 미토마이신 C), 다카르바진(DTIC), 항-신생물 항생물질, 예를 들면, 아드리아마이신(독소루비신) 및 다우노마이신, 및 상기 언급된 모든 화학요법제를 포함한다.
Bi-Fc는 또한 감염성 질환, 예를 들면, 그 중에서도 만성 HBV 감염, HCV 감염, HIV 감염, 엡스타인-비르 바이러스(EBV) 감염 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. Bi-Fc는 자체로 투여할 수 있거나, 이러한 감염성 질환을 치료하기 위해 사용된 기타 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
Bi-Fc는 특정 암 종류를 고갈시키는데 유리한 다른 종류의 병태에서 추가로 사용할 수 있다. 예를 들면, 천식에서 인간 호산구, 전신성 홍반성 낭창에서 과다한 인간 B 세포, 자가면역 병태에서 과다한 Th2 T 세포, 또는 감염성 질환에서 병원체-감염된 세포의 고갈이 유리할 수 있다. 섬유성 병태에서, 이는 섬유성 조직을 형성하는 세포를 고갈시키는데 유용할 수 있다. Bi-Fc는 자체로 투여할 수 있거나, 이러한 질환의 치료에 사용된 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
Bi-Fc의 치료학적 유효량이 투여될 수 있다. 치료학적 용량을 구성하는 Bi-Fc의 양은 치료되는 징후, 환자의 체중, 환자의 계산된 피부 표면적에 따라 상이할 수 있다. Bi-Fc의 투여는 목적하는 효과를 달성하기 위해 조절할 수 있다. 다수의 경우에, 반복된 투여가 요구될 수 있다. 예를 들면, Bi-Fc는 1주 2회, 1주 1회, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주에 1회, 또는 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월에 1회 투여할 수 있다. 각 일에 투여된 Bi-Fc의 양은 약 0.0036mg 내지 약 450mg일 수 있다. 또는, 용량은 환자의 평가된 피부 표면에 따라 보정할 수 있고, 각 용량은 약 0.002mg/m2 내지 약 250mg/m2일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 용량은 환자의 체중에 따라 보정할 수 있고, 각 용량은 약 0.000051mg/kg 내지 약 6.4mg/kg일 수 있다.
Bi-Fc, 또는 이러한 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 임의의 실행가능한 방법에 의해 투여할 수 있다. 단백질 치료제는 통상 비경구 경로, 예를 들면, 주사로 투여되는데, 이는 일부 특별한 제형 또는 상황의 부재시 경구 투여가 위의 산성 환경에서 단백질의 단편화 및/또는 가수분해를 유도할 것이기 때문이다. 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 병변내 또는 복강내 볼러스 주사가 가능한 투여 경로이다. Bi-Fc는 또한 주입, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주입을 통해 투여될 수 있다. 국소 투여는 특히 피부 관련 질환에 또한 가능하다. 또는, Bi-Fc는 점막과의 접촉을 통해, 예를 들면, 비강내, 설하, 질 또는 직장 투여 또는 흡입제로서의 투여로 투여될 수 있다. 또는, Bi-Fc를 포함하는 특정의 적절한 약제학적 조성물은 경구 투여될 수 있다.
상기 일반적인 용어로 본 발명을 설명하지만, 이하 실시예는 예시로써 제한 없이 제공된다.
실시예
실시예 1: 항- HER2 CD3ε 및 항- FOLR1 / CD3ε Bi - Fc 분자 및 단일쇄 이중특이적 분자의 작제
Bi-Fc 분자는 본질적으로 이전에 기재된 방법을 사용하여 생성시켰다[참조: Lofler et al. (2000), Blood 95(6): 2098-2103]. 보다 상세하게는, 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc를 코딩하는 작제물은 다음과 같이 제조했다. 항-HER2 IgG 항체의 VH 영역(서열번호 5) 및 VL 영역(서열번호 6) 및 항-인간 CD3ε IgG 항체의 VH 영역(서열번호 7) 및 VL 영역(서열번호 8)을 코딩하는 DNA 단편은 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시키고, 가요성 링커와 함께 스플라이싱시켰다. 링커에 의해 연결된 두 개의 scFv를 코딩하는 선형 융합 DNA를 코딩하는 수득된 DNA 단편은 본원에서 단일쇄 항-HER2/CD3ε(서열번호 9)로서 지칭된다. 이 작제물은 항체 생산을 위한 포유동물 발현 벡터에서 서브클로닝시켰다.
헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc(서열번호 10)는 단일쇄 항-HER2/CD3ε 을 코딩하는 DNA를 조작된 인간 IgG1 Fc 영역의 두 쇄 중의 하나를 코딩하는 DNA에 융합시켜 작제했다. 구체적으로, 두 개의 양으로 하전된 돌연변이(D356K/D399K, EU 넘버링) + FcγR 결합을 억제하는 변형(L234A 및 L235A)을 함유하는 Fc 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA를 3' 말단에서 단일쇄 항-HER2/CD3ε을 코딩하는 DNA에 융합시켰다. 이 항-HER/CD3ε Bi-Fc의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열 은 각각 서열번호 10 및 11에 나타낸다. 항-HER2/CD3ε Bi-Fc의 일부였던 제2의 폴리펩티드 쇄는 서열번호 12에 제시된 바와 같이, 두 개의 음으로 하전된 돌연변이(K392D/K409D, EU 넘버링) + L234A 및 L235A를 함유하는 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드 쇄였다. 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(서열번호 13)를 증폭시키고, 발현을 위한 적합한 벡터에 삽입했다. 유사한 방법을 사용하여, 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε(서열번호 14) 및 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc(서열번호 15)는 항-HER2 scFv 단편을 코딩하는 DNA를 항-인간 FOLR1 IgG 항체로부터 유래된 scFv 단편을 코딩하는 DNA로 치환시켜 작제했다.
상기한 모든 단일쇄 및 헤테로이량체성 Bi-Fc 분자는 인간 HEK 293-6E 세포 중에서 일시적 형질감염에 의해 생성했다. 배양 배지는 6일 후에 수거했다. 단일쇄 항-HER2/CD3ε 및 항-FOLR1/CD3ε 분자는 니켈 HISTRAP? (GE Healthcare Bio-Sciences, L.L.C., Uppsala, Sweden) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 25 내지 300mM 이미다졸 구배로 용출시켰다. 용출 풀은 예비 SUPERDEX? 200(GE Healthcare Bio-Sciences, L.L.C., Uppsala, Sweden) 컬럼을 사용하는 크기 이온 크로마토그래피(SEC)로 추가로 정제하고, > 1mg/mL로 농축시키고, -70℃에서 저장했다. 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 및 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 분자는 50mM 시트레이트, 1M L-아르기닌, pH 3.5로 용출시키는 MABSELECT SURETM(GE Healthcare Bio-Sciences, L.L.C., Uppsala, Sweden) 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 용출액은 10mM 인산칼륨, 161mM L-아르기닌, pH 7.6 또는 150mM NaCl, 161mM L-아르기닌, pH 5.2와 함께 아세테이트 및 수크로스를 함유하는 용액을 갖는 예비 SEC에 의해 제형화 완충제 중에서 완충제 교환시켰다.
실시예 2: 표적 세포 및 면역 효과기 세포에의 결합에 대한 BiTE:Fc 분자의 시험
CD3를 발현시키는 T 세포 및 HER2를 발현시키는 JIMT-1 세포에 대한 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 및 단일쇄 항-HER2/CD3ε의 결합은 다음과 같이 평가했다. 인간 팬-T 세포(팬 T 세포 단리 키트 II, 인간을 사용하여 정제됨, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 또는 정제된 JIMT-1 세포를 10㎍/mL의 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 항-HER2/CD3ε의 부재 또는 존재하에 4℃에서 16시간 동안 배양했다. 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc의 세포 결합은 알로피코시아닌(APC)-표지된 항-인간 Fc 제2 항체를 사용하여 검출시켰다. FLAG? 태그를 포함하는 단일쇄 항-HER2/CD3ε은 마우스항-FLAG? 항체에 이어, APC-표지된 마우스 Ig-특이적 항체를 사용하여 검출시켰다.
도 2에 도시된 형광 활성화 세포 선별(FACS) 히스토그램에서, 미충전 프로파일은 이중특이적 분자 중의 하나의 부재하의 세포로부터의 데이터를 나타내고, 단단하게 충전된 프로파일은 도 2 및 이의 설명에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 중의 하나의 존재하의 세포로부터의 데이터를 나타낸다. 이러한 결과는, 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc, 뿐만 아니라 단일쇄 항-HER2/CD3ε이 T 세포(CD3ε 발현) 및 HER2를 발현시키는 JIMT-1 세포 둘 다에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: Bi-Fc 및 T 세포의 존재하의 종양 세포주의 용해
상기한 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε 및 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 및 단일쇄 항-HER2/CD3ε 및 항-FOLR1/CD3ε 분자는 표적 세포로서 HER2 또는 FOLR1을 발현시키는 종양 세포를 사용하여 T 세포 의존 세포 세포용해(TDCC) 검정에서 이들의 활성을 측정하기 위해 검정했다. 간단히 말하면, 팬 T 세포는 팬 T 세포 단리 키트 II, 인간(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 사용하여 건강한 인간 공여자로부터 단리시켰다. T 세포는 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 각종 농도로 실시예 1에 기재된 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε 또는 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 항-HER2/CD3ε 또는 항-FOR1/CD3ε의 존재 또는 부재하에 10:1의 비로 CFSE-표지된 종양 표적 세포로 배양했다. 대조군으로서, 일부 샘플은 T 세포와 종양 표적 세포를 함유하지만, Bi-Fc 또는 단일쇄 분자는 함유하지 않았다.
항-FOLR1/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자를 위한 표적 세포는 Cal-51 세포(세포당 약 148,000개 분자의 FOLR1을 발현), T47D 세포(세포당 약 101,000개 분자의 FOLR1을 발현), 또는 대조군 세포주 BT474(검출가능한 수준의 FOLR1을 발현시키지 않음)였다.
항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자를 위한 표적 세포는 JIMT-1 세포(세포당 약 181,000개 분자의 HER2를 발현), T47D 세포(세포당 약 61,000개 분자의 HER2를 발현), 또는 대조군 세포주 SHP77(검출가능한 양의 HER2를 발현시키지 않음)이었다.
39 내지 48시간 배양 후, 세포를 수거하고, 종양 세포 용해의 퍼센트는 이중 가닥 핵산을 염색하는 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD)의 흡수로 모니터링했다. 무손상 세포는 7-AAD를 제외하는 반면, 7-AAD는 죽거나 죽어가는 세포의 막을 관통하고, 이러한 세포 내부의 이중 가닥 핵산을 염색할 수 있다. 퍼센트 특이적 용해는 다음 식에 따라서 계산했다:
퍼센트 특이적 용해 = [Bi-Fc에 의한 % 종양 용해 - 이중특이적 없는 % 종양 세포 용해/총 세포 용해 % - 이중특이적 없는 % 종양 세포 용해] x 100
퍼센트 총 세포 용해를 측정하기 위해, 면역 효과기 및 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자가 없는 표지된 표적 세포를 함유하는 샘플을 차거운 80% 메탄올로 용해시켰다.
항-FOLR1/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자에 대한 결과는 도 3에 나타낸다. 항-FOLR1/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자는 모두 Cal-51 및 T47D 표적 세포 둘 다의 용량 의존적 용해를 나타냈다. 이러한 세포주 각각에서 이들 분자 각각에 대한 EC50은 이하 표 3에 나타낸다.
Bi-Fc 및 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε 분자의 EC50
EC 50 (pM)
분자 세포주
Cal-51 T47D B7474
항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc 1.27 1.35 NA*
항-FOLR1/CD3ε 단일쇄 0.087 0.19 NA*
*NA는 세포 용해가 거의 또는 전혀 검출되지 않았음을 의미한다.
이러한 데이터는, 항-FOLR1/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자 모두가 T 세포의 존재하에 FOLR1을 발현시키는 세포의 용해를 매개할 수 있지만, FOLR1을 발현시키지 않는 세포의 용해는 매개하지 않는다는 것을 나타낸다. Bi-Fc의 EC50은 단일쇄 분자보다 약 7 내지 15배 더 크지만, 그들은 여전히 pM 범위내에 존재한다. 따라서, Bi-Fc 및 단일쇄 분자는 둘 다 이 검정에서 매우 강력하다.
항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자에 대한 결과는 도 4에 나타낸다. 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자는 모두 JIMT-1 및 T47D 표적 세포 둘 다의 용량 의존적 용해를 나타내지만, 대조군 SHP77 세포주(HER2를 발현시키지 않음)의 용해는 나타내지 않았다. 이러한 세포주 각각에서 이들 분자 각각에 대한 EC50은 이하 표 4에 나타낸다.
Bi-Fc 및 단일쇄 항-HER2/CD3ε 분자의 EC50
EC 50 (pM)
분자 세포주
JIMT-1 T47D SHP77
항-HER2/CD3ε Bi-Fc 11.52 1.03 NA*
항-HER2/CD3ε 단일쇄 1.12 0.12 NA*
*NA는 세포 용해가 거의 또는 전혀 검출되지 않았음을 의미한다.
이러한 데이터는, 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자는 모두 T 세포의 존재하에 HER2를 발현시키는 세포의 용해를 매개할 수 있지만, HER2를 발현시키지 않는 세포의 용해는 매개하지 않는다는 것을 나타낸다. Bi-Fc의 EC50은 단일쇄 분자보다 약 8.6 내지 10.3배 더 크다.
실시예 4: Bi-Fc 및 표적 세포의 존재하에 T 세포에 의한 사이토킨의 방출
상기한 항-HER2/CD3ε 단일쇄 및 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 항-FOLR1/CD3ε 단일쇄 및 헤테로이량체성 Bi-Fc는 그들이 T 세포에 의한 염증성 사이토킨이 생성을 자극할 수 있는지를 측정하기 위해 검정했다. 간단히 말하면, 실시예 3에 기재된 것들과 같은 TDCC 검정으로부터의 24시간 세포 배양 상청액은 메소 스케일 디아그노스틱스, 엘.엘.씨.(Meso Scale Diagnostics, L.L.C.)로부터의 인간 TH1/TH2 7-Plex 및 인간 전염증성 1 4-Plex 초고감도 키트를 사용하여 사이토킨 농도에 대해 평가했다. 검정은 제조업자의 지침에 따라서 수행했다.
이러한 결과는 도 5a, 5b, 6a 및 6b에 나타낸다. 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, T 세포는 FOLR1을 발현시키지 않는 세포의 존재하에서(BT474, 우측 패널)가 아니라 FOLR1을 발현시키는 세포의 존재하에서(T47D, 좌측 패널) 항-FOLR1/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄의 존재하에 사이토킨을 분비시켰다. 유사하게, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, T 세포는 HER2를 발현시키지 않는 세포(SHP77)의 존재하에서가 아니라, HER2를 발현시키는 세포(JIMT-1, 좌측 패널)의 존재하에서 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄의 존재하에 사이토킨을 분비시켰다. 따라서, 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자의 존재하에 T 세포에 의한 인터페론 감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-13(IL-13)의 분비는 표적 세포 단백질을 발현시키는 세포의 존재에 의존적이었다. 따라서, Bi-Fc's 및 단일쇄 분자에 의한 T 세포의 활성화는, 그것이 표적 세포 단백질을 발현시키는 표적 세포의 존재하에서만 발생했다는 의미에서, 특이적이었다.
또한, Bi-Fc's는 검정에서 매우 강력을 활성을 가져 이하 표에 제시된 바와 같이 pM 범위 내의 EC50을 나타낸다.
사이토킨 분비를 도출하기 위한 EC 50
사이토킨

EC 50 (pM)
JIMT-1 세포
T47D 세포
항-HER2/CD3ε
Bi-Fc		 항-HER2/CD3ε
단일쇄		 항-FOLR1/CD3ε
Bi-Fc 		항-FOLR1/CD3ε
단일쇄
INF-γ 32.9 2.1 48.6 7.5
TNF-α 19.5 1.8 41.2 8.8
IL-10 9.6 0.9 110.1 18.4
IL-2 22.3 1.2 67.3 12.9
IL-13 16.4 1.8 126.9 28.1
따라서, 헤테로이량체성 Bi-Fc가 단일쇄 분자의 크기의 거의 두 배이지만, 이는 표적 세포의 부재하에서가 아니라 존재하에서 T 세포에 의한 사이토킨 분비의 매우 강력한 활성제로 잔류한다. 또한, 헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자는 매우 유사한 사이토킨 프로파일을 나타낸다. 항-HER2/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc에 의해 유도된 사이토킨 분비에 대한 EC50은 항-HER2/CD3ε 단일쇄에 의해 유도된 것들보다 약 9 내지 19배 더 높았다. 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc에 의해 유도된 사이토킨 분비에 대한 EC50은 항-FOLR1/CD3ε 단일쇄에 의해 유도된 것들보다 약 4.5 내지 6.5배 더 높았다.
실시예 5: Bi-Fc 및 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화 마커의 상향조절
다음 실험은 헤테로이량체성 Bi-Fc가 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 존재하에 및 표적 세포의 존재 또는 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있는지를 결정하기 위해 수행했다. 건강한 공여자로부터의 PBMC는 펜실베니주아 콜마 소재의 바이올로지컬 스페셜티 코포레이션(Biological Specialty Corporation)으로부터 구입된 인간 백혈구로부터 FICOLLTM 구배 상에서 정제시켰다. 이러한 PBMC는 JIMT-1 세포의 존재 또는 부재하에 상기한 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 항-HER2/CD3ε 이중특이적 분자로 10:1 비로 배양했다. 48시간 배양 후, 비부착성 세포를 웰로부터 제거하고, 두 개의 동일 샘플로 나누었다. 모든 샘플을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 항-인간 CD3 항체 + 알로피코시아닌(APC)-접합된 항-CD25 또는 항-CD69 항체로 염색했다. CD25 및 CD69는 T 세포의 활성화의 마커이다.
CD3+ 말초 T 세포에 의한 CD25 및 CD69(도 7) 활성화 마커의 상향 조절은 HER2-발현 JIMT-1 종양 표적 세포의 부재하에서가 아니라 존재하에서 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc 및 항-HER2/CD3ε 단일쇄로 관찰했다. 이러한 관찰은, Bi-Fc에 의한 T 세포 활성화가 표적 세포 단백질을 발현시키는 종양 표적 세포의 존재에 의존적이다는 것을 시사한다. T 세포 활성화로의 다른 잠재적인 경로, 즉 항-HER2/CD3ε Bi-Fc와 같은 Bi-Fc의 존재하에 FcγR's에 의한 가교결합은 항-HER2/CD3ε Bi-Fc의 Fc 영역이 FcgRs에의 결합을 억제하는 변경을 함유하기 때문에 그리고 T 세포의 활성화가 HER2를 발현시키는 표적 세포의 부재하에 관찰되지 않기 때문에, 아마 관찰된 효과의 원인이 아닐 것이다.
실시예 6: Bi-Fc's의 약물동태학적 특성
다음 실험에서, 헤테로이량체성 항-HER2/CD3ε Bi-Fc(서열번호 10 및 12의 아미노산 서열 포함) 및 항-HER2/CD3ε 단일쇄(서열번호 9의 아미노산 서열 포함)의 단일 투여 약물동태학적 프로파일은 수컷 NOD.SCID 마우스(Harlan, Livermore, CA)에서 정맥내 및 피하 볼러스 투여에 의해 평가했다. 이러한 시험 분자는 볼러스로서 1mg/kg을 일부 마우스에서 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 또는 나머지에서 어께의 피부하에 피하 주입했다. 전혈의 약 0.1mL의 연속 채혈을 안와동 천공을 통해 각 시점에서 수집했다. 전혈의 응고시, 샘플을 처리하여 혈청(샘플당 약 0.040mL)을 수득했다. 혈청 샘플은 항-HER2/CD3ε단일쇄 및 Bi-Fc의 혈청 농도를 결정하기 위해 기술 자이로스(Gyros) AB(Warren, NJ)를 사용하여 면역검정에 의해 분석했다. 혈청 샘플은 0, 0.5, 2, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 312, 384 및 480시간에 수집했다. 혈청 샘플은 분석 전에 -70℃(±10℃)에서 유지시켰다. 약물동태학적 파라미터는 피닉스(PhoenixR) 6.3 소프트웨어(Pharsight, Sunnyvale, CA)를 사용하는 비-구획화 분석을 사용하여 혈청 농도로부터 추정했다.
헤테로이량체성 Bi-Fc 및 단일쇄 분자의 단일 투여 약물동태학적 프로파일은 도 8에 나타낸다. Bi-Fc는 신속하게 제거되고 단지 5시간의 반감기를 갖는 단일쇄 분자와 비교하여 연장된 혈청 반감기(219시간)를 나타냈다. Bi-Fc의 노출은 단일쇄 분자에 대한 19hr*㎍/mL와 비교하여 524hr*㎍/mL의 곡선하 면적(AUC)을 특징으로 하였다. Bi-Fc의 피하 생체이용성은 83%인 반면, 단일쇄 분자의 생체이용성은 29%였다. 따라서, 헤테로이량체성 Bi-Fc는 단일쇄 분자와 비교하여 양호한 단일 투여 약물동태학적 특성을 나타냈다.
실시예 7: 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc의 작제
단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 작제하였고, 이의 전체적인 구조는 도 1에서 좌측으로부터 제2의 다이아그램에 의해 나타낸다. 천연 발생 Fc 폴리펩티드 쇄에 비해 특이적 변경을 함유하는 단량체성 Fc 폴리펩티드 쇄는 관련 부분이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공보 제2012/0244578호에 기재되어 있다. (힌지 영역이 부족한, 즉, EU 넘버링 시스템에서 위치 231에서 출발하고, 카복시말단 헥사-히스티딘 태그 + 변경 Y349T, K392D 및 K409D를 갖는) 인간 단량체성 IgG1 Fc 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 벡터로 출발하여, 추가의 돌연변이가 변경 N297G를 구체화한 Agilent's Quikchange 부위-지시된 돌연변이발생 키트(카탈로그 변호 200518-5)를 사용하여 도입했다. 따라서, 최종 Fc 폴리펩티드 쇄는 위치 231의 알라닌으로 시작했고, 헥사-히스티딘 태그(서열번호 92)가 이어지는 위치 447의 리신까지 계속되었다. 이는 다음 변경: N297G, Y349T, K392D 및 K409D를 함유한다.
항-CD33/CD3ε 단일쇄 분자를 코딩하는 DNA는 CD33에 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 이어, CD3ε에 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 단일쇄 분자를 코딩하는 제2의 벡터로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 아미노산 서열은 서열번호 33에 제시되고, 이는 관련 부분이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 제2012/244162호에 상세히 기재되어 있다. 이 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR에 의한 SOE)에 의해 스플라이스 오버행(overhang) 확장을 사용하여 상기한 변경된 Fc 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA에 부착시켰다[참조: Warrens et al. (1997), Gene 186: 29-35, 본 방법을 기재하는 부분은 본원에 참조로 인용된다].
수득된 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제공되고, 이를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 35에 제공된다. 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 코딩하는 DNA는 포유동물 세포내로 도입하고, 이를 발현에 적합한 조건하에서 배양시켰다. 단백질은 세포 상청액으로부터 회수했다.
실시예 8: CD3ε 또는 CD33을 발현시키는 세포에 대한 항-CD33/ CD3ε Bi -Fc의 결합
CD3ε, CD33을 발현시키거나, 둘 다를 발현시키지 않는 세포에 대한 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 결합을 평가했다. 몰름-13 세포(CD33 발현), 나말와(Namalwa) 세포(CD33도 CD3ε도 발현시키지 않음), 정제된 인간 팬-T 세포(CD3ε 발현), 인간 PBMC(CD3ε 발현), 및 시노몰로구스 PBMC(CD3ε 발현)를 시험했다. 세포를 이중특이적 분자의 부재 또는 존재하에 4℃에서 2시간 동안 배양했다. 이어서, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 세포 결합은 세포를 이중특이적 분자의 CD3-결합 영역에 결합하는 마우스 항체 10㎍/mL로 4℃에서 밤새, 이어서 APC-표지된 항-마우스 Fc 제2의 항체(잭슨(Jackson) 115-136-071) 5㎍/mL로 4℃에서 2시간 동안 배양하여 검출했다. 세포를 FACS로 분석하고, 신호의 평균 형광 강도(MFI)를 측정했다.
도 9는 다음과 같은 이중특이적 분자의 다양한 농도의 존재하에 다양한 세포 형태에 대해 검출된 MFI를 도시한다: 패널 A, 몰름-13 세포(CD33 발현); 페널 B, 나말와 세포(CD33도 CD33ε도 발현시키지 않음); 패널 C, 인간 팬-T 세포(CD3ε 발현); 패놀 D, 인간 PBMC(CD3ε 발현); 및 패널 E, 시노몰로구스 PBMC(CD3ε 발현). 결과는, 이러한 두 개의 이중특이적 분자가 유사한 방식으로 이러한 세포 형태에 결합하여, 항-CD33/CD3ε 단일쇄에 Fc 폴리펩티드 쇄의 첨가가 이 검정에 의해 측정된 바와 같이 CD33 및 CD3ε에 결합하는 이의 능력에 검출가능하게 영향을 미치지 않았음을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 9: 단량체성 항-CD33/ CD3ε Bi - Fc의 존재하에 CD33-발현 종양 세포의 용해
다음 실험은, 상기한 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 존재하에 CD33-발현 종양 세포의 용해를 유도하는지를 결정하기 위해 수행했다. 시노몰로구스 원숭이로부터의 PBMC 효과기 세포는 SNBL USA(신 닛뽄 바이오메디칼 라보라토리즈(Shin Nippon Biomedical Laboratories)의 자회사)로부터 수득했다. PBMC의 이러한 제제에서, 61%는 CD3+ T 세포였다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 PBMC는 도 10에 지시된 농도에서 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 존재 및 부재하에 10:1의 비로 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)-표지된 종양 표적 세포로 배양했다. 37℃에서 40 내지 48시간 배양 후, 세포를 수거하고, 살아 있는 종양 세포 및 죽은 종양 세포를 유동 세포분석법을 사용하여 7AAD 흡수로 모니터링했다. 퍼센트 특이적 용해는 다음 식에 따라 계산했다:
% 특이적 용해 = 1 - ((이중특이성을 갖는) 살아 있는 세포수/(이중특이성을 갖지 않는) 살아 있는 세포수) X 100
이러한 결과는 도 10에 나타낸다. 도 10, 패널 A에 나타낸 데이터는, 세포당 약 33,000개 분자의 CD33을 발현시키는 몰름-13 세포가 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄 둘 다로 용해시켰다. 1/2 최고 용해를 위한 농도(EC50)는 pM 범위내였고, 즉, 각각 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄에 대해 1.45pM and 0.96pM이었다. 따라서, 단량체성 Bi-Fc의 EC50은 단일쇄 분자보다 2배 미만으로 더 컷다. 도 10, 패널 B에 제시된 데이터는 CD33의 검출가능한 수준을 발현시키지 않는 나말와 세포의 용해가 전혀 존재하지 않음을 나타낸다. 이러한 관찰은, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가 시노몰로구스 원숭이 PBMC에 의한 종양 세포 용해를 유도할 수 있는 매우 특이적이고 강력한 시약임을 시사한다.
제2의 실험에서, 건강한 인간 공여자로부터 단리된 팬 T 효과기 세포를 도 11에 지시된 농도에서 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 존재 및 부재하에 10:1의 비로 CFSE-표지된 몰름-13 또는 나말와 세포로 배양했다. 37℃에서 40 내지 48시간 배양 후, 세포를 수거하고, 살아 있는 종양 세포 및 죽은 종양 세포를 유동 세포분석법을 사용하여 7AAD 흡수로 모니터링했다. 퍼센트 특이적 용해는 이 실시예에서 상기 제공된 식에 따라 계산했다. 결과는 도 11에 나타낸다.
몰름-13 세포의 특이적 용해는 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄 둘 다로 관찰되었다(도 11, 패널 A). EC50은 pM 범위내였고, 즉, 각각 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄에 대해 0.65pM 및 0.12pM이었다. 따라서, Bi-Fc에 대한 EC50은 단일쇄 분자보다 5 내지 6배 더 컷다. 시험된 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc의 최고 농도에서 검출된 소량의 용해를 제외하고 어느 하나의 이중특이적 분자로 검출된 나말와 세포의 용해는 존재하지 않았다(도 11, 패널 B). T 세포의 부재하에 몰름-13 세포의 어떤 용해도 일어나지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 관찰은, 상기한 헤테로이량체성 Bi-Fc와 같이, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가 T 세포에 의한 종양 세포 용해를 유도할 수 있는 매우 특이적이고 강력한 시약임을 시사한다.
실시예 10: 단량체성 항-CD33/ CD3ε Bi - Fc의 존재하에 CD33-발현 종양 세포의 용해 및 PBMC로부터 인터페론 감마의 방출
다른 실험에서, 건강한 인간 공여자 또는 시노몰로구스 원숭이(SNBL USA로부터 수득됨)로부터 단리된 PBMC를 CD33을 발현시키는 종양 표적 세포를 용해시키는 이들의 능력에 대해 시험했다. 이러한 제제에서, PBMC는 42% CD3+ T 세포(인간) 및 30% CD3+ T 세포(시노몰로구스 원숭이)였다. PBMC는 37℃에서 도 12에 지시된 농도에서 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 존재 및 부재하에 5:1의 비로 CFSE-표지된 종양 표적 세포로 배양했다. 37℃에서 67시간 배양 후, 세포를 수거하고, 살아 있는 종양 세포 및 죽은 종양 세포를 유동 세포분석법을 사용하여 7AAD 흡수로 모니터링했다. 퍼센트 특이적 용해는 상기한 식에 따라 계산했다. 결과는 도 12에 나타낸다.
몰름-13 세포의 특이적 용해는 인간 PBMC(도 12, 패널 A) 또는 시노몰로구스 PBMC(도 12, 패널 B)를 사용하여 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 및 항-CD33/CD3ε 단일쇄 둘 다로 관찰되었다. 1/2 최고 용해 농도(EC50)는 이하 표 6에 제시된 바와 같이 pM 범위내였다.
항-CD33/CD3ε 이중특이적 분자의 존재하에 PBMC에 의한 몰름-13 세포이 용해에 대한 EC50
몰름-13 세포의 용해에 대한 EC 50 (pM)
항-CD33/CD3ε 이중특이적 인간 PBMCs 시노몰로구스 원숭이 PBMC
단량체성 Bi-Fc 0.68 3.55
단일쇄 0.14 1.39
몰름-13 세포는 T 세포의 부재하에 이중특이성 중의 어느 하나의 존재하에 용해되지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 데이터는, 단량체성 Bi-Fc에 대한 EC50이 서브-피코몰 내지 낮은 피코몰 범위내이고, 효과기 세포로서 인간 및 시노몰로구스 원숭이 PBMC 둘 다를 사용하는 단일쇄 분자의 EC50에 매우 근접한다는 것을 보여준다.
바로 위에서 기재된 세포 용해 검정으로부터의 24시간 세포 배양 상청액은 시판되는 BD OptEIATM 인간 IFN-γ ELISA 키트 II(BD Biosciences) 및 원숭이 인터페런 감마 ELISA 키트(Cell Sciences)를 사용하여 사이토킨 농도에 대해 평가했다. 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행했다. 몰름-13 ?W의 존재하에, IFN-γ를 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄로 처리된 인간(도 13, 패널 A) 및 시노몰로구스 원숭이(도 13, 패널 B) PBMC로부터 방출시켰다. 이러한 결과는, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가, 항-CD33/CD3ε 단일쇄와 같이, PBMC로부터 인터페론 감마의 방출을 매개할 수 있는 매우 특이적이고 강력한 시약임을 시사한다.
실시예 11: 단량체성 항-CD33/ CD3ε Bi - Fc에 의한 T 세포 증식, CD25 발현 및 사이토킨 방출
건강한 인간 공여자로부터 단리된 팬 T 효과기 세포를 CFSE로 표지화하고, 도 14 및 15에 지시된 농도에서 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 존재 및 부재하에 10:1의 비로 종양 표적 세포, 몰름-13 또는 나말와 세포로 배양했다. 37℃에서 72시간 배양 후, 세포를 수거하고, T 세포 증식 및 CD25, 활성화 마커의 발현을 유동 세포분석법에 의해 분석했다.
증식은 CFSE 염료로부터 감소된 형광 신호를 갖는 세포의 수를 모니터링하여 평가했다. CFSE에 의한 T 세포의 표지화 후 각 세포 분열로, 각각의 개별적 분할 세포에 대한 CFSE로부터의 형광 신호의 강도는 감소한다. T 세포의 퍼센트 증식율은 CFSE-표지된 T 세포 상에 게이팅하고, 유사분열 T 세포, 즉 감소된 형광 신호를 갖는 세포의 수를 총 T 세포의 수와 비교하여 결정했다. 퍼센트 CD25 양성 T 세포는 공배양물 중에서 세포를 알로피코시아닌(APC)-표지된 항-인간 CD25 항체로 염색하고, 이색 유동 세포분석법을 사용하여 CFSE-표지된 세포의 APC 수준을 측정하여 결정했다.
T 세포의 증식은 CD33-발현 종양 세포주, 몰름-13 + 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄 중의 하나의 존재하에 관찰했다(도 14, 패널 A). EC50은 한자리 pM 범위내였고, 즉, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc의 존재하에 4.27pM, 항-CD33/CD3ε 단일쇄의 존재하에 1.09pM이었다. CD33의 검출가능한 수준을 발현시키지 않는 나말와 세포의 존재하에서 T 세포의 어떤 증식도 관찰되지 않았다(도 14, 패널 A).
몰름-13 세포 및 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄 중의 어느 하나의 존재하의 T 세포는 활성화 마커, CD25를 발현시켰다(도 14, 패널 B). (CD33의 검출가능한 수준을 발현시키지 않는) 나말와 세포 및 이중특이성 중의 어느 하나의 존재하의 T 세포는 CD25를 발현시키지 않았다(도 14, 패널 B). 이러한 관찰은, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가 T 활성화 및 증식을 특이적으로 유도할 수 있음을 시사한다.
바로 위에 기재된 검정으로부터의 24시간 세포 배양 상청액을 메소 스케일 디아그노스틱스, 엘엘씨(Meso Scale Diagnostics, LLC)로부터 시판되는 인간 TH1/TH2 7-Plex 및 인간 전염증성 1 4-Plex 초고감도 키트를 사용하여 사이토킨 농도에 대해 평가했다. 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행했다. 결과는 도 15에 제시된다.
CD33-발현 몰름-13 종양 세포주의 존재하에, 인터페론 감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-13(IL-13)을 각각 도 15, 패널 A, B, C, D 및 E에 나타낸 바와 같이 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 항-CD33/CD3ε 단일쇄로 처리된 T 세포로부터 방출시켰다. 최고 사이토킨 농도는 IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 IL-10(400pg/mL 초과)로 관찰되었다. IL-13의 중간 정도의 수준도 또한 관찰되었다. CD33-음성 세포주, 나말와의 존재하에서 사이토킨 분비는 관찰되지 않았다. 이하 표 7에서, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 또는 단일쇄 항-CD33/CD3ε 중의 어느 하나의 존재하에 몰름-13 세포에 의해 다양한 사이토킨의 생성을 위한 EC50이 제시된다.
사이토킨 생성을 위한 EC50
EC 50 (pM)
몰름-13 종양 세포주
단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc 단일쇄 항-CD33/CD3ε
IFN-γ 9.5 2.6
TNF-α 6.1 1.7
IL-10 6.4 1.1
IL-2 10.3 5.2
IL-13 8.4 1.3
이러한 결과는, 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc가 T 세포에 의한 사이토킨 방출을 매개할 수 있는 매우 특이적이고 강력한 스캐폴드임을 시사한다.
실시예 12: 항- HER2 / CD3ε 단일쇄 이중특이적 또는 항- HER2 / CD3ε Bi - Fc의 존재하에 세포용해성 시냅스 형성
실시예 1에 기재된 항-HER2/CD3ε 단일쇄 이중특이적 및 HER2/CD3ε Bi-Fc은 T 세포와 HER2-발현 JIMT-1 종양 세포 사이에 세포용해성 시냅스 형성을 유도하는 이들의 능력을 결정하기 위해 검정했다. JIMT-1 세포는 24-웰 폴리-L-리신-코팅된 유리 기저부 배양 플레이트(1% FCS 및 2g/L 글루코스를 갖는 RPMI 배지 중 0.5 x 106 세포/웰)에 분배했다. 37℃에서 1시간 배양 후, 유리 웰에 부착하는 JIMT-1 세포를 따뜻한 DPBS로 완만하게 세척했다. 1nM 항-HER2/CD3ε 단일쇄 이중특이적 또는 항-HER2/CD3ε Bi-Fc를 갖거나 갖지 않는 새로 단리된 CD8+ T 세포(건강한 공여자로부터 1 x 106 세포/웰)를 종양 세포에 첨가하고, 37℃에서 추가의 20분 동안 배양하여 세포용해성 시냅스를 생성했다. 플레이트에 부착된 세포를 예비가온된 DPBS로 세척하고, 직후에 3.7% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 DPBS로 세척하고, 실온에서 5분 동안 0.1% 티트론 X-100으로 투과처리했다. 1차 항체의 혼합물(5㎍/mL 항-PKCθ 및 0.4㎍/mL 항-CD45)을 4℃에서 밤새 세포로 배양한 다음 3회 세척했다. 8㎍/mL의 2차 항체의 혼합물(항-CD45의 경우, 그린 및 항-PKCθ의 경우 레드)을 3시간 동안 실온에서 첨가한 다음, 플레이트를 DPBS로 2회 세척했다. PCKθ는 면역 시냅스로 국소화되는 것으로 공지되어 있는 반면, CD45는 T 세포의 표면에서 발현된다. DAPI(핵 염색)(Life Technologies #536939)를 갖는 SLOWFADER 골드 퇴색방지 시약을 유리 웰에 직접 첨가하고, 플레이트를 빛으로부터 보호하여 -70℃에서 저장했다.
면역형광 공초점 현미경은, CD45(그린 염색)는 T 세포(그린 CD45 염색을 갖는 보다 작은 세포 형태로서 동정됨)의 표면 상에 존재하고, 반면 PKCθ(레드 염색)는 종양 세포(보다 큰 세포 형태로서 동정됨) 및 T 세포 사이의 시냅스 형성 부위에서 초점을 맞춘 신호를 제공했다. T 세포와 종양 표적 사이의 세포용해성 시냅스는 항-HER2/CD3ε 단일쇄 이중특이적 및 항-HER2/CD3ε을 사용하여 관찰되었지만, 이중특이성의 부재하에서는 관찰되지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 관찰은, 세포용해성 시냅스 형성이 이중특이적 분자의 존재에 의존적이고, Bi-Fc가 단일쇄 이중특이적 분자로 관찰된 것들과 유사한 시냅스를 형성할 수 있음을 시시한다.
실시예 13: 종양 성장에 대한 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc의 생체내 효과
이하 기재된 실험은 FOLR1-발현 NCI-N87-luc, 인간 위암 세포를 사용하여 생체내 암 모델 시스템에서 헤테로이량체성 Bi-Fc 이중특이적 항체의 활성을 입증한다. 이러한 세포들이 발광에 의해 종양 검출을 가능하게 할 수 있는 루시퍼라제를 발현시키지 않지만, 종양 성장은 이 실험에서 종양의 물리적 측정에 의해 모니터링했다. 50% 마트리겔 중 NCI-N87-luc 세포(3　x 106)를 8주령 암컷 NOD scid 감마(NSG) 마우스(0일째)에게 피하 이식했다. 10일째에, 20 x 106개의 활성화된 인간 팬-T 세포를 각 마우스에게 복강내 주사로 투여했다. 마우스에 접목된 인간 팬-T 세포는 예비활성화시키고, 제조업자의 지침에 따라 밀텐위(Miltenyi) T 세포 활성화/확장 키트를 사용하여 18일 배양 중 0일 및 14일째에 항-CD3/CD28/CD2 항체를 사용하여 확장시켰다. 11일 및 18일째에, 10mg/마우스 GAMMAGARD[면역 글로불린 주입(인간)] 10%(Baxter) + 0.2mg/마우스 항-mu FcγII/III(클론 2.4G2)로 이루어진 FcγR 블록을 IP 투여했다. 제1 FcγR 블록 후 1시간에 동물(N=10/그룹)은 (1) 0.05mg/kg의 항-FOLR1/항-CD3ε 단일쇄 분자(서열번호 90의 아미노산 서열을 포함)의 매일 복강내 주사 또는 (2) 1mg/kg의 헤테로이량체성 항-FOLR1/항-CD3ε Bi-Fc(서열번호 86 및 88의 아미노산 서열 포함), 또는 25mM 리신-하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0(비히클 대조군)의 5일 간격으로의 2회 복강내 주사를 수용했다. 종양 용적을 측정하고, 동물을 이들의 종양이 2000mm3에 달할 때 또는 연구 말기(27일째)에 안락사시켰다.
비히클 처리된 마우스에서, 종양은 시험된 모든 동물에서 성장했다(참조: 도 16). 대조적으로, 종양 성장은 단일쇄 항-FOLR1/CD3ε 이중특이적 또는 헤테로이량체성 항-FOLR1/CD3ε Bi-Fc로 처리된 마우스에서 상당히 억제되었다(비히클 처리된 마우스와 비교할 때 p<0.0001). 실험 전반에 걸쳐, 처리되거나 비처리된 마우스의 체중에는 유의한 변화가 없었다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 데이터는, 항-FOLR1/항-CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc가 생체내에서 표적 세포의 T 세포 매개된 사멸을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 14: 종양 성장에 대한 단량체성 및 헤테로이량체성 항-CD33/CD3 Bi -Fc의 생체내 효과의 비교
다음 실험은, 단량체성 Bi-Fc가 생체내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있는지를 결정하는 것을 목적으로 했다. 인간 팬-T 세포를 예비활성화했고, 제조업자의 지침에 따라서 밀테니 T 세포 활성화/확장 키트를 사용하여 18일 배양 기간의 0일째 및 14일째에 항-CD3/CD28/CD2 항체를 첨가하여 이 실험에서 사용하기 위한 배양액 중에서 확장시켰다. D-루시페린의 존재하에 발광하는 CD33-발현 종양 세포인 몰름-13-luc 세포(1　x 106)를 10주령 암컷 NSG 마우스의 우측 옆구리에 피하(SC) 주사했다(0일째). 종양 세포 접종 후 3일째에, 20 x 106개의 활성화된 인간 팬-T 세포를 각 마우스에게 IP 주사로 투여했다. 4일 및 11일째에 실시예 13에 기재된 바와 같은 FcγR 블록을 IP 주사로 투여했다. 4일째의 FcγR 블록 후 1시간에, 마우스(N=8/그룹)는 다음 중 하나를 수용했다: (1) 10일 동안 0.05mg/kg의 항-CD33/CD3ε 단일쇄 이중특이적(서열번호 33의 아미노산 서열을 가짐), 0.05mg/kg의 항-MEC/CD3ε 단일쇄 이중특이적(서열번호 78의 아미노산 서열을 가짐; 음성 대조군), 0.05mg/kg의 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc(서열번호 34의 아미노산 서열을 가짐), 또는 25mM 리신-하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0(비히클 대조군) 중의 어느 하나의 매일 복강내 주사; 또는 (2) 1mg/kg 항-CD33/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc(서열번호 80 및 82의 아미노산 서열 포함)의 5일 간격으로의 2회 IP 주사.
투여를 IVISR-200 생체내 영상화 시스템(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 시작한 후 2주 동안 월요일, 수요일 및 금요일에 생체발광 영상화를 수행했다. 영상화 9분 전에, 마우스에게 150mg/kg D-루시페린을 IP 주사로 제공했다. 영상을 수집하고, LIVING IMAGER 소프트웨어 2.5(캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences))를 사용하여 분석했다. 순수한 동물(몰름-13-luc 또는 인간 팬-T 세포로 접종되지 않은 동물)은 기준선 생체발광을 측정하기 위해 사용되었다.
비히클 또는 항-MEC/CD3ε 단일쇄를 수용한 마우스는 연구 전반에 걸쳐 종양 성장을 경함하고, 종양 세포를 수용하지 않은 순수한 대조군 마우스는 인지가능한 종양 성장을 나타내지 않았다(도 17). 순수한 마우스에서 관찰된 수준과 거의 동일한 종양 세포 발광이 연구 말기에 이러한 그룹에서 관찰되었지만, 항-CD33/CD3ε 헤테로이량체성 Bi-Fc 또는 단일쇄 분자를 수용한 마우스는 초기에 종양 성장을 경험했다. 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc를 수용한 마우스도 또한 초기 종양 성장에 이어, 비히클 처리된 마우스에서 관찰된 것과 연구 말기에 순수한 마우스에서 관찰된 것 사이의 중간이었던 종양 세포 발광을 경험했다(도 17). 비히클로 처리된 마우스에서의 종양 성장 대 단량체성 Bi-Fc로 처리된 마우스에서의 종량 성장의 차이는 통계학적으로 유의했다(p<-.0001). 따라서, 단량체성 Bi-Fc는 생체내에서 종양 세포 사멸을 도출했다.
실시예 15: 단량체성 항-CD33/CD3 Bi - Fc의 생체내 항종양 효능에 대한 Fc 변경 N297G의 효과
다음 실험은 Bi-Fc의 Fc 폴리펩티드 쇄 부분에서 N297G 변이(alteration)를 가졌던 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc의 생체내 활성을 야생형 N297을 가졌던 것의 활성을 비교했다. 방법은 본질적으로 실시예 14에 기재된 것과 동일하다. 몰름-13-luc 세포(1　x 106)를 10주령 암컷 NSG 마우스의 우측 옆구리에 피하(SC) 주사했고(0일째), 20 x 106개의 예비활성화된 인간 팬-T 세포를 3일째에 각각의 마우스에게 IP 주사로 투여했다. 4일 및 11일째에 실시예 13에 기재된 FcγR 블록을 투여했다. 4일째 FcγR 블록 후 1시간에, 마우스(N=10/그룹)는 다음 중의 하나를 매일 IP 주사로 수용했다: 비히클(25mM 리신-하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중의 0.002% 트윈 80, pH 7.0); (N297G 변경을 갖는) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc; 또는 (야생형 N297을 갖는) 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc. 순수한 대조군 마우스는 종양 세포의 주사를 수용하지 않았고 주사 치료를 받지 않았다. 결과는 도 18에 제시된다.
비히클 처리된 마우스는 종양 성장을 나타냈다. 종양 성장에서 작지만, 유의한(p<0.0005) 차이가 비히클 처리된 마우스와 N297G 변경을 갖는 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc로 처리된 마우스 사이에 존재했다. (도 18)야생형 N297을 갖는 단량체성 항-CD33/CD3ε Bi-Fc로 처리된 마우스는 비히클 처리된 마우스보다 연구 말기까지 상당히(p<0.0001) 낮은 수준의 생체발광을 가졌다. 순수한 마우스는, 예상된 바와 같이, 낮은 수준의 생체발광을 가졌다(도 18). 최소한, 이러한 결과는, 야생형 N297을 갖는 단량체성 Bi-Fc가 생체내 종양 세포 사멸 검정에서 N297G를 갖는 것보다 더 활성적이지는 않지만, 활성적이다는 것을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> BISPECIFIC BIVALENT SCFV-FC MOLECULES <130> IPA150942-DE <140> PCT/US2014/029253 <141> 2014-03-14 <150> 61/791,424 <151> 2013-03-15 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence immediately preceding HC CDR1" <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(9) <223> Any amino acid <400> 1 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence preceding HC CDR2" <400> 2 Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence following HC CDR3" <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 3 Trp Gly Xaa Gly 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence following LC CDR3" <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 4 Phe Gly Xaa Gly 1 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of anti-HER2 VH region" <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Lys Ile Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asn Ser Leu Tyr Gly Pro Asn 50 55 60 Phe Gln Asp Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of anti-HER2 VL region" <400> 6 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of anti-CD3 VH region" <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of anti-CD3 VL region" <400> 8 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 9 <211> 518 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a single chain anti-HER2/CD3 (P136629.3) P136629.3 aHer2(D3)scFv-aCD3(F12Q)scFv" <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Lys Ile Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asn Ser Leu Tyr Gly Pro Asn 50 55 60 Phe Gln Asp Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser 500 505 510 His His His His His His 515 <210> 10 <211> 742 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-HER2/CD3 Bi-Fc (P136632.3) D356K, D399K, L234A, L235A P136632.3 (aHer2(D3)scFv-aCD3 (F12Q)scFv-FcAAKK)" <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Lys Ile Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asn Ser Leu Tyr Gly Pro Asn 50 55 60 Phe Gln Asp Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 500 505 510 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 515 520 525 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 530 535 540 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 545 550 555 560 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 565 570 575 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 580 585 590 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 595 600 605 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 610 615 620 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 625 630 635 640 Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 645 650 655 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 660 665 670 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly 675 680 685 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 690 695 700 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 705 710 715 720 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala 725 730 735 His His His His His His 740 <210> 11 <211> 2226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:10 aHer2(D3) scFv-aCD3(F12Q)scFv-FcAAKK)" <400> 11 gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagcttgtga ggccaggggc cttagtcaag 60 ttgtcctgca aagcttctgg cttcaaaatt aaagactact ttgtgaactg ggtgaagcag 120 aggcctgaac agggcctgga gtggattgga tggattgatc ctgagaatga taatagttta 180 tatggcccga acttccagga caaggccagt atcacagcag acacatcctc caacacaggc 240 tacctgcagc tcagcggcct gacatctgag gacactgccg tctattactg tgctctttat 300 tacggaagta ggggggatgc tatggactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctga gctcgtgatg 420 acccagactc catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg 480 gcaagtcagg acattagcaa ttatttaaac tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt 540 aaactcctga tctactacac atcaagatta cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc 600 agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc tggagcaaga agatattgcc 660 acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg aggaggattg 780 gtgcagcctg gagggtcatt gaaactctca tgtgcagcct ctggattcac cttcaatagc 840 tacgccatga actgggtccg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata 900 agaagtaaat ataataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaagg caggttcacc 960 atctccagag atgattcaaa aaacactgcc tatctacaaa tgaacaactt gaaaactgag 1020 gacactgccg tgtactactg tgtgagacat gggaacttcg gtaatagcta cgtttcctgg 1080 tgggcttact ggggccaagg gactctggtc accgtctcct caggtggtgg tggttctggc 1140 ggcggcggct ccggtggtgg tggttctcag actgttgtga ctcaggaacc ttcactcacc 1200 gtatcacctg gtggaacagt cacactcact tgtggctcct cgactggggc tgttacatct 1260 ggcaactacc caaactgggt ccaacaaaaa ccaggtcagg caccccgtgg tctaataggt 1320 gggactaagt tcctcgcccc cggtactcct gccagattct caggctccct gcttggaggc 1380 aaggctgccc tcaccctctc aggggtacag ccagaggatg aggcagaata ttactgtgtt 1440 ctatggtaca gcaaccgctg ggtgttcggt ggaggaacca aactgactgt cctagcggcc 1500 gcagagccca aatcttctga caaaactcac acatgccccc cgtgcccagc acctgaagca 1560 gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1620 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1680 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgagaggag 1740 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1800 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1860 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1920 cggaaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1980 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2040 cctcccgtgc tgaagtccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 2100 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2160 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag ctgcagcgca tcaccaccac 2220 catcac 2226 <210> 12 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence encoding a human IgG1 Fc polypeptide containing alterations K392D and K409D, plus L234A and L235A" <400> 12 His Met Ser Ser Val Ser Ala Gln Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 35 40 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 50 55 60 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 65 70 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 100 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 130 135 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 165 170 175 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val 195 200 205 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 210 215 220 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 225 230 235 240 Pro Gly Lys <210> 13 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:12" <400> 13 cacatgtctt cggtaagtgc acaggcggcc gcagagccca aatcttctga caaaactcac 60 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagca gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc 120 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 180 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 240 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 300 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 360 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 420 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 480 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 540 gggcagccgg agaacaacta cgacaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 600 ttcctctata gcgacctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 660 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 720 ccgggtaaa 729 <210> 14 <211> 518 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a single chain anti-FOLR1/CD3 molecule P136637.3 aFOLR1(5G1)scFv-aCD3(F12Q)scFv" <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ser Ser Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 130 135 140 Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Met Leu Ser Ser Gly Val 180 185 190 Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala 210 215 220 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser 500 505 510 His His His His His His 515 <210> 15 <211> 742 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-FOLR1/CD3 Bi-Fc P136635.4 (aFOLR1(5G1)scFv-aCD3(F12Q)scFv-FcAAKK)" <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ser Ser Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 130 135 140 Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Met Leu Ser Ser Gly Val 180 185 190 Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala 210 215 220 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 500 505 510 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 515 520 525 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 530 535 540 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 545 550 555 560 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 565 570 575 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 580 585 590 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 595 600 605 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 610 615 620 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 625 630 635 640 Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 645 650 655 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 660 665 670 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly 675 680 685 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 690 695 700 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 705 710 715 720 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala 725 730 735 His His His His His His 740 <210> 16 <211> 2226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:15 (aFOLR1(5G1) scFv-aCD3(F12Q)scFv-FcAAKK)" <400> 16 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctt actactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttagc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgcgaggc 300 agcagcagct ggttcgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggaggc 360 ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtc agtctgtgct gactcagcca 420 ccctcggtgt ctgaagcccc caggcagagg gtcaccatct cctgttctgg aagcagctcc 480 aacatcggaa ataatgctgt aaactggtac cagcagctcc caggaaaggc tcccaaactc 540 ctcatctatt atgatgatat gttgtcttca ggggtctcgg accgattttc tggctccaag 600 tctggcacct cagcctccct ggccatcagt gggctccagt ctgaggatga ggctgattat 660 tactgtgcag catgggatga cagcctgaat ggtgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 720 accgtcctat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg aggaggattg 780 gtgcagcctg gagggtcatt gaaactctca tgtgcagcct ctggattcac cttcaatagc 840 tacgccatga actgggtccg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata 900 agaagtaaat ataataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaagg caggttcacc 960 atctccagag atgattcaaa aaacactgcc tatctacaaa tgaacaactt gaaaactgag 1020 gacactgccg tgtactactg tgtgagacat gggaacttcg gtaatagcta cgtttcctgg 1080 tgggcttact ggggccaagg gactctggtc accgtctcct caggtggtgg tggttctggc 1140 ggcggcggct ccggtggtgg tggttctcag actgttgtga ctcaggaacc ttcactcacc 1200 gtatcacctg gtggaacagt cacactcact tgtggctcct cgactggggc tgttacatct 1260 ggcaactacc caaactgggt ccaacaaaaa ccaggtcagg caccccgtgg tctaataggt 1320 gggactaagt tcctcgcccc cggtactcct gccagattct caggctccct gcttggaggc 1380 aaggctgccc tcaccctctc aggggtacag ccagaggatg aggcagaata ttactgtgtt 1440 ctatggtaca gcaaccgctg ggtgttcggt ggaggaacca aactgactgt cctagcggcc 1500 gcagagccca aatcttctga caaaactcac acatgccccc cgtgcccagc acctgaagca 1560 gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1620 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1680 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgagaggag 1740 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1800 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1860 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1920 cggaaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1980 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2040 cctcccgtgc tgaagtccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 2100 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2160 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag ctgcagcgca tcaccaccac 2220 catcac 2226 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide" <400> 17 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide" <400> 18 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide" <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide" <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala 1 5 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide" <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="Mature amino acid sequence of CD3 epsilon chain of Homo sapiens" <400> 22 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 20 25 30 Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 50 55 60 Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile 100 105 110 Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr 115 120 125 Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly 130 135 140 Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro 145 150 155 160 Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp 165 170 175 Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 180 185 <210> 23 <211> 177 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> source <223> /note="Mature amino acid sequence of CD3 epsilon chain of Macaca fascicularis" <400> 23 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu 20 25 30 Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Gly Asp Ser 35 40 45 Gly Asp Gln Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly 50 55 60 Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His 65 70 75 80 His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 85 90 95 Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu 100 105 110 Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys 115 120 125 Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly 130 135 140 Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro 145 150 155 160 Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg 165 170 175 Ile <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide which is a portion of an epitope of CD3 epsilon" <400> 24 Gln Asp Gly Asn Glu 1 5 <210> 25 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="amino acid sequence of human IgG1 Fc region" <400> 25 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 26 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="amino acid sequence of human IgG2 Fc region" <400> 26 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 27 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="amino acid sequence of human IgG3 Fc region" <400> 27 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 180 185 190 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 245 250 255 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 <210> 28 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="amino acid sequence of human IgG4 Fc region" <400> 28 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 29 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-CD3-epsilon VH region (12C)" <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 30 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:29" <400> 30 gaggtgcagc tggtcgagtc tggaggagga ttggtgcagc ctggagggtc attgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aagtacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aatataataa ttatgcaaca 180 tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc aaaaaacact 240 gcctatctac aaatgaacaa cttgaaaact gaggacactg ccgtgtacta ctgtgtgaga 300 catgggaact tcggtaatag ctacatatcc tactgggctt actggggcca agggactctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 31 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-CD3-epsilon VL region (12C)" <400> 31 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 32 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:31" <400> 32 cagactgttg tgactcagga accttcactc accgtatcac ctggtggaac agtcacactc 60 acttgtggct cctcgactgg ggctgttaca tctggcaact acccaaactg ggtccaacaa 120 aaaccaggtc aggcaccccg tggtctaata ggtgggacta agttcctcgc ccccggtact 180 cctgccagat tctcaggctc cctgcttgga ggcaaggctg ccctcaccct ctcaggggta 240 cagccagagg atgaggcaga atattactgt gttctatggt acagcaaccg ctgggtgttc 300 ggtggaggaa ccaaactgac tgtccta 327 <210> 33 <211> 511 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-CD33/CD3 bispecific single chain molecule" <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu 165 170 175 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser 180 185 190 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu 210 215 220 Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr 225 230 235 240 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 275 280 285 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 290 295 300 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 355 360 365 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 385 390 395 400 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu 405 410 415 Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 420 425 430 Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly 435 440 445 Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 450 455 460 Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe 485 490 495 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His 500 505 510 <210> 34 <211> 728 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of monomeric anti-CD33/CD3 Bi-Fc" <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu 165 170 175 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser 180 185 190 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu 210 215 220 Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr 225 230 235 240 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 275 280 285 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 290 295 300 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 355 360 365 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 385 390 395 400 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu 405 410 415 Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 420 425 430 Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly 435 440 445 Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 450 455 460 Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe 485 490 495 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 500 505 510 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 515 520 525 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 530 535 540 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 545 550 555 560 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg 565 570 575 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 580 585 590 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 595 600 605 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Thr 610 615 620 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 625 630 635 640 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 645 650 655 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val 660 665 670 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp 675 680 685 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 690 695 700 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 705 710 715 720 Gly Lys His His His His His His 725 <210> 35 <211> 1643 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:34" <400> 35 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagagtc tgtcaaagtc 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaaacaggct 120 ccaggacagg gactcgagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcctacctac 180 gccgacaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca catctaccag cacagcttac 240 atggaaatcc ggaacctggg cggcgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggtggtct 300 tggtccgacg gctactacgt gtacttcgac tactggggcc agggcacctc cgtgacagtg 360 tccagcggag ggggaggaag tggcggaggg ggctctggag gtggcggctc cgacatcgtg 420 atgacccagt cccccgactc cctgaccgtg tccctgggcg agcggaccac catcaactgc 480 aagtcctccc agtccgtgct ggactcctcc accaacaaga actccctggc ctggtatcag 540 cagaagcctg gccagcctcc taagctgctg ctctcttggg cttccaccag agagagcggg 600 attcccgata ggttctccgg ctctggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcgactcc 660 cctcagcctg aggactccgc cacctactac tgccagcagt ccgcccactt ccctatcacc 720 ttcggccagg gaacccggct ggaaatcaag tctggcggcg gtggctctga agtgcagctc 780 gtggagagtg gcggaggact ggtgcagcca ggcggctccc tgaagctgtc ttgcgccgcc 840 agcggcttca ccttcaataa gtacgctatg aattgggtcc ggcaggcacc tggaaaaggg 900 ctcgaatggg tcgcaaggat taggtctaag tacaacaact acgccaccta ttacgccgac 960 tctgtgaagg accggttcac catctcccgg gacgactcta agaacaccgc ttacctgcag 1020 atgaacaacc tgaaaaccga ggataccgct gtgtactatt gtgtgcggca cggcaacttc 1080 ggcaactcct acatctccta ctgggcctat tggggacagg gcacactggt caccgtgtcc 1140 tctggcggtg gaggatctgg tggcggcgga tctggcggcg gaggttccca gaccgtggtc 1200 acccaggaac cttctctgac cgtcagtccc ggcggaaccg tgaccctgac ctgtggctcc 1260 tctaccggcg ctgtgacctc cggcaactac cctaactggg tgcagcagaa acccggccag 1320 gctcccagag gactcatcgg cggcaccaag tttctggccc ctggcacccc tgccagattc 1380 tctggctccc tgctgggcgg caaggctgct ctgaccctga gcggagtcca gccagaggac 1440 gaggccgagt actactgtgt gctgtggtac tccaacagat gggtgttcgg cggtggcacc 1500 aagctgaccg tgctggcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1560 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1620 gtgagccacg aagaccctga ggt 1643 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 36 Gly Gly Cys Val Phe Asn Met Phe Asn Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 37 Gly Gly Cys His Leu Pro Phe Ala Val Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 38 Gly Gly Cys Gly His Glu Tyr Met Trp Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 39 Gly Gly Cys Trp Pro Leu Gln Asp Tyr Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 40 Gly Gly Cys Met Gln Met Asn Lys Trp Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 41 Gly Gly Cys Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 42 Gly Gly Cys Ala Leu Tyr Pro Thr Asn Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 43 Gly Gly Cys Gly Lys His Trp His Gln Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 44 Gly Gly Cys His Ser Phe Lys His Phe Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 45 Gly Gly Cys Gln Gly Met Trp Thr Trp Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 46 Gly Gly Cys Ala Gln Gln Trp His His Glu Tyr Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an insertion that prolongs half life" <400> 47 Gly Gly Cys Glu Arg Phe His His Ala Cys Gly Gly 1 5 10 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR1 which is part of SEQ ID NO:7" <400> 48 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR2 which is part of SEQ ID NO:7" <400> 49 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR3 which is part of SEQ ID NO:7" <400> 50 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR1 which is part of SEQ ID NO:8" <400> 51 Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR2 which is part of SEQ ID NO:8" <400> 52 Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR3 which is part of SEQ ID NO:8" <400> 53 Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR1 which is part of SEQ ID NO:29" <400> 54 Lys Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR2 which is part of SEQ ID NO:29" <400> 55 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR3 which is part of SEQ ID NO:29" <400> 56 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR1 which is part of SEQ ID NO:31" <400> 57 Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR2 which is part of SEQ ID NO:31" <400> 58 Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR3 which is part of SEQ ID NO:31" <400> 59 Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH CDR1 of SEQ ID NO:5" <400> 60 Asp Tyr Phe Val Asn 1 5 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH CDR2 of SEQ ID NO:5" <400> 61 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asn Ser Leu Tyr Gly Pro Asn Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH CDR3 of SEQ ID NO:5" <400> 62 Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL CDR1 of SEQ ID NO:6" <400> 63 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL CDR2 of SEQ ID NO:6" <400> 64 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL CDR3 of SEQ ID NO:6" <400> 65 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR1 of SEQ ID NO:15" <400> 66 Ser Gly Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR2 of SEQ ID NO:15" <400> 67 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR2 of SEQ ID NO:15" <400> 68 Gly Ser Ser Ser Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR1 of SEQ ID NO:15" <400> 69 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR2 of SEQ ID NO:15" <400> 70 Tyr Asp Asp Met Leu Ser Ser 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR3 of SEQ ID NO:15" <400> 71 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR1 of SEQ ID NO:34" <400> 72 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR2 of SEQ ID NO:34" <400> 73 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VH region CDR3 of SEQ ID NO:34" <400> 74 Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR1 of SEQ ID NO:34" <400> 75 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ala <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR2 of SEQ ID NO:34" <400> 76 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a VL region CDR3 of SEQ ID NO:34" <400> 77 Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr 1 5 <210> 78 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an anti-Mec/CD3-epsilon single chain bispecific (P137424.7)" <400> 78 Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr 1 5 10 15 Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Leu Ile Tyr Asp Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ser 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Thr Asn Pro Gly 85 90 95 Ser Ser Thr Tyr Gly Ala Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly 130 135 140 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Ser 145 150 155 160 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Ile 165 170 175 Ala Gly Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 180 185 190 Asn Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Ser Thr Ser Leu Asn Thr Val Thr 195 200 205 Leu Gln Met Thr Arg Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 210 215 220 Ala Arg Trp Ile Arg Ile His Tyr Ser Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys 260 265 270 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn 275 280 285 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 290 295 300 Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 325 330 335 Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 340 345 350 Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp 355 360 365 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu 385 390 395 400 Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly 405 410 415 Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln 420 425 430 Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe 435 440 445 Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly 450 455 460 Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu 465 470 475 480 Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly 485 490 495 Thr Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His 500 505 <210> 79 <211> 1527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the anti-Mec/CD3-epsilon single chain bispecific (P137424.7)" <400> 79 gtcctcactc agaccccttc tccggtctcc gcggccgtcg gcggaactgt cactatcaat 60 tgccagagtt ccccaagtct gatctatgac agtagattag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggcaaccac ctaagctcct gatctataaa gcatccactt tggccagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca caatcagcga cgtccagtct 240 gacgatgccg caacttatta ctgtcaaagt catgacacta atcctgggtc tagtacttat 300 ggcgccccat tcggaggagg cactgaagtc gtagtccagg gtggtggtgg ttctggcggc 360 ggcggctcca gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgatgg agtctggggg aggcttggta 420 aagcccgagg ggtccctgac cctcacctgc aaggtctctg gattctcctt ttcaacgagt 480 gccattagct gggtccgcca ggctccaggg aagagaccag agtggatcgc cgggatttat 540 aacggaggtg gtagcacata ctacgcatcc tgggtgaacg gccggttcag catctccaga 600 tccacgtcct tgaacacggt gacgctgcaa atgaccagac tgacggccgc tgacacggcc 660 acatatttct gtgcgagatg gattcggatc cattattcct tcgacctgtg gggacctggc 720 acgttggtca ccgtctcctc atccggaggt ggtggctccg aggtgcagct ggtcgagtct 780 ggaggaggat tggtgcagcc tggagggtca ttgaaactct catgtgcagc ctctggattc 840 accttcaata agtacgccat gaactgggtc cgccaggctc caggaaaggg tttggaatgg 900 gttgctcgca taagaagtaa atataataat tatgcaacat attatgccga ttcagtgaaa 960 gacaggttca ccatctccag agatgattca aaaaacactg cctatctaca aatgaacaac 1020 ttgaaaactg aggacactgc cgtgtactac tgtgtgagac atgggaactt cggtaatagc 1080 tacatatcct actgggctta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctcaggtggt 1140 ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctc agactgttgt gactcaggaa 1200 ccttcactca ccgtatcacc tggtggaaca gtcacactca cttgtggctc ctcgactggg 1260 gctgttacat ctggcaacta cccaaactgg gtccaacaaa aaccaggtca ggcaccccgt 1320 ggtctaatag gtgggactaa gttcctcgcc cccggtactc ctgccagatt ctcaggctcc 1380 ctgcttggag gcaaggctgc cctcaccctc tcaggggtac agccagagga tgaggcagaa 1440 tattactgtg ttctatggta cagcaaccgc tgggtgttcg gtggaggaac caaactgact 1500 gtcctacatc atcaccatca tcattag 1527 <210> 80 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of the first polypeptide chain of a heterodimeric anti-CD33/CD3-epsilon Bi-Fc aCD33(AMG330) -scFv-aCD3(I2C)-scFv-Fc(L234A, L235A, E356K, D399K (PL-31769)" <400> 80 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu 165 170 175 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser 180 185 190 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu 210 215 220 Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr 225 230 235 240 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 275 280 285 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 290 295 300 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 355 360 365 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 385 390 395 400 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu 405 410 415 Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 420 425 430 Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly 435 440 445 Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 450 455 460 Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe 485 490 495 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys 500 505 510 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 515 520 525 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 530 535 540 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 545 550 555 560 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 565 570 575 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 580 585 590 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 595 600 605 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 610 615 620 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 625 630 635 640 Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 645 650 655 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 660 665 670 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 675 680 685 Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 690 695 700 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 705 710 715 720 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 725 730 735 Lys His His His His His His 740 <210> 81 <211> 2232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:80" <400> 81 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagagtc tgtcaaagtc 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaaacaggct 120 ccaggacagg gactcgagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcctacctac 180 gccgacaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca catctaccag cacagcttac 240 atggaaatcc ggaacctggg cggcgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggtggtct 300 tggtccgacg gctactacgt gtacttcgac tactggggcc agggcacctc cgtgacagtg 360 tccagcggag ggggaggaag tggcggaggg ggctctggag gtggcggctc cgacatcgtg 420 atgacccagt cccccgactc cctgaccgtg tccctgggcg agcggaccac catcaactgc 480 aagtcctccc agtccgtgct ggactcctcc accaacaaga actccctggc ctggtatcag 540 cagaagcctg gccagcctcc taagctgctg ctctcttggg cttccaccag agagagcggg 600 attcccgata ggttctccgg ctctggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcgactcc 660 cctcagcctg aggactccgc cacctactac tgccagcagt ccgcccactt ccctatcacc 720 ttcggccagg gaacccggct ggaaatcaag tctggcggcg gtggctctga agtgcagctc 780 gtggagagtg gcggaggact ggtgcagcca ggcggctccc tgaagctgtc ttgcgccgcc 840 agcggcttca ccttcaataa gtacgctatg aattgggtcc ggcaggcacc tggaaaaggg 900 ctcgaatggg tcgcaaggat taggtctaag tacaacaact acgccaccta ttacgccgac 960 tctgtgaagg accggttcac catctcccgg gacgactcta agaacaccgc ttacctgcag 1020 atgaacaacc tgaaaaccga ggataccgct gtgtactatt gtgtgcggca cggcaacttc 1080 ggcaactcct acatctccta ctgggcctat tggggacagg gcacactggt caccgtgtcc 1140 tctggcggtg gaggatctgg tggcggcgga tctggcggcg gaggttccca gaccgtggtc 1200 acccaggaac cttctctgac cgtcagtccc ggcggaaccg tgaccctgac ctgtggctcc 1260 tctaccggcg ctgtgacctc cggcaactac cctaactggg tgcagcagaa acccggccag 1320 gctcccagag gactcatcgg cggcaccaag tttctggccc ctggcacccc tgccagattc 1380 tctggctccc tgctgggcgg caaggctgct ctgaccctga gcggagtcca gccagaggac 1440 gaggccgagt actactgtgt gctgtggtac tccaacagat gggtgttcgg cggtggcacc 1500 aagctgaccg tgctggagcc caaatcttct gacaaaactc acacatgccc cccgtgccca 1560 gcacctgaag cagctggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1620 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1680 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1740 ccgcgagagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1800 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1860 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1920 ctgcccccat cccggaagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1980 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 2040 tacaagacca cgcctcccgt gctgaagtcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 2100 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 2160 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa acatcatcat 2220 catcatcatt aa 2232 <210> 82 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of an Fc polypeptide chain dummyFc-AADD" <400> 82 His Met Ser Ser Val Ser Ala Gln Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 35 40 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 50 55 60 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 65 70 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 100 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 130 135 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 165 170 175 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val 195 200 205 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 210 215 220 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 225 230 235 240 Pro Gly Lys <210> 83 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:82" <400> 83 cacatgtctt cggtaagtgc acaggcggcc gcagagccca aatcttctga caaaactcac 60 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagca gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc 120 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 180 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 240 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 300 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 360 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 420 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 480 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 540 gggcagccgg agaacaacta cgacaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 600 ttcctctata gcgacctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 660 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 720 ccgggtaaa 729 <210> 84 <211> 728 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of a monomeric anti-CD33/CD3 Bi-Fc having the wild type sequence at residue N297 in the Fc portion of the molecule aCD33(AMF330)scFv-aCD3(I2C)scFv-Fc-mono" <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Thr Asn Lys Asn Ser Leu 165 170 175 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser 180 185 190 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Pro Gln Pro Glu 210 215 220 Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala His Phe Pro Ile Thr 225 230 235 240 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 275 280 285 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 290 295 300 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp 355 360 365 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 385 390 395 400 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu 405 410 415 Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn 420 425 430 Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly 435 440 445 Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 450 455 460 Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe 485 490 495 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 500 505 510 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 515 520 525 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 530 535 540 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 545 550 555 560 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 565 570 575 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 580 585 590 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 595 600 605 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Thr 610 615 620 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 625 630 635 640 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 645 650 655 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val 660 665 670 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp 675 680 685 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 690 695 700 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 705 710 715 720 Gly Lys His His His His His His 725 <210> 85 <211> 2187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:84" <400> 85 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggagagtc tgtcaaagtc 60 agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaaacaggct 120 ccaggacagg gactcgagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gcctacctac 180 gccgacaagt tccagggcag agtgaccatg accaccgaca catctaccag cacagcttac 240 atggaaatcc ggaacctggg cggcgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggtggtct 300 tggtccgacg gctactacgt gtacttcgac tactggggcc agggcacctc cgtgacagtg 360 tccagcggag ggggaggaag tggcggaggg ggctctggag gtggcggctc cgacatcgtg 420 atgacccagt cccccgactc cctgaccgtg tccctgggcg agcggaccac catcaactgc 480 aagtcctccc agtccgtgct ggactcctcc accaacaaga actccctggc ctggtatcag 540 cagaagcctg gccagcctcc taagctgctg ctctcttggg cttccaccag agagagcggg 600 attcccgata ggttctccgg ctctggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcgactcc 660 cctcagcctg aggactccgc cacctactac tgccagcagt ccgcccactt ccctatcacc 720 ttcggccagg gaacccggct ggaaatcaag tctggcggcg gtggctctga agtgcagctc 780 gtggagagtg gcggaggact ggtgcagcca ggcggctccc tgaagctgtc ttgcgccgcc 840 agcggcttca ccttcaataa gtacgctatg aattgggtcc ggcaggcacc tggaaaaggg 900 ctcgaatggg tcgcaaggat taggtctaag tacaacaact acgccaccta ttacgccgac 960 tctgtgaagg accggttcac catctcccgg gacgactcta agaacaccgc ttacctgcag 1020 atgaacaacc tgaaaaccga ggataccgct gtgtactatt gtgtgcggca cggcaacttc 1080 ggcaactcct acatctccta ctgggcctat tggggacagg gcacactggt caccgtgtcc 1140 tctggcggtg gaggatctgg tggcggcgga tctggcggcg gaggttccca gaccgtggtc 1200 acccaggaac cttctctgac cgtcagtccc ggcggaaccg tgaccctgac ctgtggctcc 1260 tctaccggcg ctgtgacctc cggcaactac cctaactggg tgcagcagaa acccggccag 1320 gctcccagag gactcatcgg cggcaccaag tttctggccc ctggcacccc tgccagattc 1380 tctggctccc tgctgggcgg caaggctgct ctgaccctga gcggagtcca gccagaggac 1440 gaggccgagt actactgtgt gctgtggtac tccaacagat gggtgttcgg cggtggcacc 1500 aagctgaccg tgctggcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1560 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1620 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1680 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1740 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1800 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1860 ccacaggtga ctaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1920 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1980 cagccggaga acaactacga caccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 2040 ctctatagcg acctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 2100 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2160 ggtaaacatc atcatcatca tcattga 2187 <210> 86 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence of anti-FOLR1/CD3-epsilon Bi-Fc (PL-30058) ahuFolateR-1(5G1)-scFv-ahuCD3(I2C)scFv-FcAAKK" <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ser Ser Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 130 135 140 Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Met Leu Ser Ser Gly Val 180 185 190 Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala 210 215 220 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 500 505 510 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 515 520 525 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 530 535 540 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 545 550 555 560 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 565 570 575 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 580 585 590 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 595 600 605 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 610 615 620 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu 625 630 635 640 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 645 650 655 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 660 665 670 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe 675 680 685 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 690 695 700 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 705 710 715 720 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His 725 730 735 <210> 87 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:86" <400> 87 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctt actactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttagc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgcgaggc 300 agcagcagct ggttcgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggaggc 360 ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtc agtctgtgct gactcagcca 420 ccctcggtgt ctgaagcccc caggcagagg gtcaccatct cctgttctgg aagcagctcc 480 aacatcggaa ataatgctgt aaactggtac cagcagctcc caggaaaggc tcccaaactc 540 ctcatctatt atgatgatat gttgtcttca ggggtctcgg accgattttc tggctccaag 600 tctggcacct cagcctccct ggccatcagt gggctccagt ctgaggatga ggctgattat 660 tactgtgcag catgggatga cagcctgaat ggtgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 720 accgtcctat ccggaggtgg tggatccgaa gtgcagctcg tggagagtgg cggaggactg 780 gtgcagccag gcggctccct gaagctgtct tgcgccgcca gcggcttcac cttcaataag 840 tacgctatga attgggtccg gcaggcacct ggaaaagggc tcgaatgggt cgcaaggatt 900 aggtctaagt acaacaacta cgccacctat tacgccgact ctgtgaagga ccggttcacc 960 atctcccggg acgactctaa gaacaccgct tacctgcaga tgaacaacct gaaaaccgag 1020 gataccgctg tgtactattg tgtgcggcac ggcaacttcg gcaactccta catctcctac 1080 tgggcctatt ggggacaggg cacactggtc accgtgtcct ctggcggtgg aggatctggt 1140 ggcggcggat ctggcggcgg aggttcccag accgtggtca cccaggaacc ttctctgacc 1200 gtcagtcccg gcggaaccgt gaccctgacc tgtggctcct ctaccggcgc tgtgacctcc 1260 ggcaactacc ctaactgggt gcagcagaaa cccggccagg ctcccagagg actcatcggc 1320 ggcaccaagt ttctggcccc tggcacccct gccagattct ctggctccct gctgggcggc 1380 aaggctgctc tgaccctgag cggagtccag ccagaggacg aggccgagta ctactgtgtg 1440 ctgtggtact ccaacagatg ggtgttcggc ggtggcacca agctgaccgt gctggagccc 1500 aaatcttctg acaaaactca cacatgcccc ccgtgcccag cacctgaagc agctggggga 1560 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 1620 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1680 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgagagga gcagtacaac 1740 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1800 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1860 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccggaaggag 1920 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1980 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 2040 ctgaagtccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 2100 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2160 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa catcaccacc accatcactg a 2211 <210> 88 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic amino acid sequence encoding an Fc polypeptide chain" <400> 88 His Met Ser Ser Val Ser Ala Gln Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 35 40 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 50 55 60 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 65 70 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 100 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 130 135 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 165 170 175 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val 195 200 205 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 210 215 220 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 225 230 235 240 Pro Gly Lys <210> 89 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:88" <400> 89 cacatgtctt cggtaagtgc acaggcggcc gcagagccca aatcttctga caaaactcac 60 acatgcccac cgtgcccagc acctgaagca gctgggggac cgtcagtctt cctcttcccc 120 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 180 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 240 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 300 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 360 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 420 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 480 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 540 gggcagccgg agaacaacta cgacaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 600 ttcctctata gcgacctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 660 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 720 ccgggtaaa 729 <210> 90 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Amino acid sequence of a single chain anti-FOLR1/CD3-epsilon Bispecific PL-30055 aFOLR1(5G1)scFv-aCD3(I2C)scFv" <400> 90 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ser Ser Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 130 135 140 Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Met Leu Ser Ser Gly Val 180 185 190 Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala 210 215 220 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu His His His His His His 500 <210> 91 <211> 1515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO:90" <400> 91 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctt actactggac ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttagc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgcgaggc 300 agcagcagct ggttcgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggaggc 360 ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggaagtc agtctgtgct gactcagcca 420 ccctcggtgt ctgaagcccc caggcagagg gtcaccatct cctgttctgg aagcagctcc 480 aacatcggaa ataatgctgt aaactggtac cagcagctcc caggaaaggc tcccaaactc 540 ctcatctatt atgatgatat gttgtcttca ggggtctcgg accgattttc tggctccaag 600 tctggcacct cagcctccct ggccatcagt gggctccagt ctgaggatga ggctgattat 660 tactgtgcag catgggatga cagcctgaat ggtgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 720 accgtcctat ccggaggtgg tggatccgaa gtgcagctcg tggagagtgg cggaggactg 780 gtgcagccag gcggctccct gaagctgtct tgcgccgcca gcggcttcac cttcaataag 840 tacgctatga attgggtccg gcaggcacct ggaaaagggc tcgaatgggt cgcaaggatt 900 aggtctaagt acaacaacta cgccacctat tacgccgact ctgtgaagga ccggttcacc 960 atctcccggg acgactctaa gaacaccgct tacctgcaga tgaacaacct gaaaaccgag 1020 gataccgctg tgtactattg tgtgcggcac ggcaacttcg gcaactccta catctcctac 1080 tgggcctatt ggggacaggg cacactggtc accgtgtcct ctggcggtgg aggatctggt 1140 ggcggcggat ctggcggcgg aggttcccag accgtggtca cccaggaacc ttctctgacc 1200 gtcagtcccg gcggaaccgt gaccctgacc tgtggctcct ctaccggcgc tgtgacctcc 1260 ggcaactacc ctaactgggt gcagcagaaa cccggccagg ctcccagagg actcatcggc 1320 ggcaccaagt ttctggcccc tggcacccct gccagattct ctggctccct gctgggcggc 1380 aaggctgctc tgaccctgag cggagtccag ccagaggacg aggccgagta ctactgtgtg 1440 ctgtggtact ccaacagatg ggtgttcggc ggtggcacca agctgaccgt gctgcatcac 1500 caccaccatc actga 1515 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 92 His His His His His His 1 5

Claims (79)

  1. (a) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 쇄 :
    : V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4 중의 2개는 면역글로불린 중쇄 가변(VH) 영역이고, 다른 2개는 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 영역이며; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다.; 또는
    (b) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 쇄 :
    : Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4 중의 2개는 VH 영역이고, 다른 2개는 VL 영역이며; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다;을 포함하는 이중특이적(Bi)-Fc로서,
    상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포(immune effector cell)에 결합하고/하거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고,
    상기 Bi-Fc는 단량체인, 이중특이적-Fc.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩티드 쇄가 하기 변이체: K392D, K392E, N392D, N392E, R409D, R409E, K409D, K409E, D399K, D399R, E356R, E356K, D356R, D356K, Y349T, L351T, L368T, L398T, F405T, Y407T 및 Y407R를 하나 이상 포함하는, 이중특이적-Fc.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (a) 또는 (b)의 Fc 폴리펩티드 쇄가 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄이고, 변이체 K392D, K409D 및 Y349T를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄가 변이체(들) L234A 및/또는 L235A를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 (a)의 Bi-Fc인, 이중특이적-Fc.
  6. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 (b)의 Bi-Fc인, 이중특이적-Fc.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포가 인간 T 세포 및/또는 시노몰구스 원숭이 T 세포인, 이중특이적-Fc.
  8. 제7항에 있어서, 상기 효과기 세포 단백질이 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 T 세포 수용체(TCR)-CD3 복합체의 일부인, 이중특이적-Fc.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 효과기 세포 단백질이 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3β, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ인, 이중특이적-Fc.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효과기 세포 단백질이 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD3ε인, 이중특이적-Fc.
  11. 제10항에 있어서, 이중특이적-Fc가 알라닌 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD3ε의 최초 27개 아미노산 내의 아미노산 서열에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  12. 제11항에 있어서, 이중특이적-Fc가 결합하는 아미노산 서열이 알라닌 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(서열번호 24)를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  13. 제13항에 있어서,
    서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  14. 제10항에 있어서,
    서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  15. 제10항 또는 제13항에 있어서, 서열번호 7과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  17. 제10항 또는 제14항에 있어서, 서열번호 29와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  18. 제17항에 있어서, 서열번호 29 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 HER2를 발현하는 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  20. 제19항에 있어서,
    서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  22. 제21항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  23. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FOLR1을 발현하는 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  24. 제 23항에 있어서,
    서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 1 내지 118과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 15의 아미노산 134 내지 244와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호 15의 아미노산 1 내지 118 및 134 내지 244의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  27. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 CD33을 발현하는 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  28. 제 27항에 있어서,
    서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열번호 34의 아미노산 1 내지 121 또는 1 내지 122와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 34의 아미노산 138 내지 251과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  30. 제29항에 있어서, 서열번호 34의 아미노산 1 내지 121 및 138 내지 251의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  31. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 이중특이적-Fc의 Fc 폴리펩티드 쇄가 위치 384 및 385 사이에 서열번호 36 내지 47 중의 어느 하나의 아미노산 서열의 삽입을 포함하고, 이들 위치 번호가 EU 넘버링 도식에 따라 할당되는, 이중특이적-Fc.
  32. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, L2가 존재하고, L2가 약 12개 이하의 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  33. 제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, L1 및 L3가 각각 적어도 약 14개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  34. 제33항에 있어서, L1 및 L3가 각각 적어도 약 15개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  35. 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 어느 하나의 V1이 VH 영역이고 V2가 VL 영역이거나, 또는 그 반대이고,
    어느 하나의 V3이 VH 영역이고 V4가 VL 영역이거나, 또는 그 반대인, 이중특이적-Fc.
  36. (a) (i) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1폴리펩티드 쇄 :
    : V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다; 및
    (ii) 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄; 또는
    (b) (i) 하기 식을 갖는 제 1폴리펩티드 쇄:
    : Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 각각 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다; 및
    (ii) 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄;를 포함하는, 이중특이적(Bi)-Fc로서,
    상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합하고/하거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고,
    L1 및 L3은 적어도 15개 아미노산 길이이고,
    L2는, 존재하는 경우, 12개 미만의 아미노산 길이이고,
    어느 하나의 V1은 VH 영역이고 V2는 VL 영역이거나, 또는 그 반대이고,
    어느 하나의 V3은 VH 영역이고 V4는 VL 영역이거나, 또는 그 반대이고,
    상기 Bi-Fc는 인간 CD3ε에 결합하고, 및
    상기 Bi-Fc는 (1) 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL 영역, 또는 (2) 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 57, 서열번호 58 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  37. 제36항에 있어서, 서열번호 7 또는 서열번호 29와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 8 또는 서열번호 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  38. 제37항에 있어서, 서열번호 7 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 8 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  39. 제36항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 CD33, 인간 FOLR1 또는 인간 HER2를 발현하는 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  40. 제39항에 있어서,
    (a) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    (c) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 15의 아미노산 1 내지 118, 또는 서열번호 34의 아미노산 1 내지 121과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 6, 서열번호 15의 아미노산 134 내지 244, 또는 서열번호 34의 아미노산 138 내지 251과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 상기 동일성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이인, 이중특이적-Fc.
  42. 제41항에 있어서, 아미노산 서열의 하기 쌍: 서열번호 5 및 6; 서열번호 15의 아미노산 1 내지 118 및 134 내지 244; 또는 서열번호 34의 아미노산 1 내지 121 및 138 내지 251 중의 하나를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  43. 제36항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 중의 Fc 폴리펩티드 쇄가 헤테로이량체화 변이를 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄 중의 Fc 폴리펩티드 쇄가 또 다른 헤테로이량체화 변이를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  44. 제43항에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 중의 헤테로이량체화 변이가 전하 쌍 치환이고, 제2 폴리펩티드 쇄 중의 헤테로이량체화 변이가 전하 쌍 치환인, 이중특이적-Fc.
  45. 제44항에 있어서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 전하 쌍 치환체 R409D, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392D, N392E, K392D 또는 K392E를 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄가 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356E, D356K 또는 D356R을 포함하거나;
    제2 폴리펩티드 쇄가 전하 쌍 치환체 R409D, R409E, K409D 또는 K409E 및 N392D, N392E, K392D 또는 K392E를 포함하고, 제1 폴리펩티드 쇄가 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 E356K, E356E, D356K 또는 D356R을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  46. 제36항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 Fc 폴리펩티드 쇄가 L234A, L235A 및 N297에서의 임의의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 FcγR 결합을 억제하는 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중특이적-Fc.
  47. 제36항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩티드 쇄(들)가 각각의 Fc 폴리펩티드 쇄의 위치 384 및 385 사이에 서열번호 36 내지 47 중의 어느 하나의 아미노산 서열의 삽입을 포함하고, 위치 384 및 385는 EU 넘버링 도식에 따라 할당되는, 이중특이적-Fc.
  48. 제36항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 제31항 (a)쇄의 이중특이적-Fc인, 이중특이적-Fc.
  49. 제36항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 제31항 (b)쇄의 이중특이적-Fc인, 이중특이적-Fc.
  50. 제1항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, V1 및 V2가, 이들이 IgG 및/또는 scFc 항체의 일부인 경우, 표적 세포에 결합하고, V3 및 V4가, 이들이 IgG 및/또는 scFc 항체의 일부인 경우, 면역 효과기 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  51. 제1항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, V1 및 V2가, 이들이 IgG 및/또는 scFc 항체의 일부인 경우, 면역 효과기 세포에 결합하고, V3 및 V4가, 이들이 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부인 경우, 표적 세포에 결합하는, 이중특이적-Fc.
  52. 제1항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩티드 쇄(들)가 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드 쇄(들)인, 이중특이적-Fc.
  53. 제1항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩티드 쇄(들)가 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드 쇄(들)인, 이중특이적-Fc.
  54. 제1항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩티드 쇄(들)가 인간 IgG4 Fc 폴리펩티드 쇄(들)인, 이중특이적-Fc.
  55. (i) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제 1폴리펩티드 쇄:
    : V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1, V2, V3 및 V4는 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 가변 영역이고, L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다; 및
    (ii) 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, 이중특이적-Fc로서,
    상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합하고/하거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고,
    L1 및 L3은 적어도 15개 아미노산 길이이고, L2는, 존재하는 경우, 12개 미만의 아미노산 길이이고,
    V1 및 V3은 VH 영역이고, V2 및 V4는 VL 영역이고,
    제1 및 제2 폴리펩티드 쇄 각각의 Fc 폴리펩티드 쇄는 헤테로이량체화 변이를 함유하고,
    상기 Bi-Fc는 (1) 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 VL 영역, 또는 (2) 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 VH 영역 및 서열번호 57, 서열번호 58 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 VL 영역을 포함하고,
    상기 제1 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 K409D, K409E, R409D 또는 R409E 및 K392D, K392E, N392D 또는 N392E를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 D356K, D356R, E356K 또는 E356R을 포함하거나; 상기 제2 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 K409D, K409E, R409D 또는 R409E 및 K392D, K392E, N392D 또는 N392E를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드 쇄는 전하 쌍 치환체 D399K 또는 D399R 및 D356K, D356R, E356K 또는 E356R을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  56. (a) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 쇄:
    : V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc,
    여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1 및 V3은 VH 영역이고, V2 및 V4는 VL 영역이며; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다; 또는
    (b) 하기 식을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 쇄:
    : Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4를 갖는 아미노산 서열(여기서, Fc는 인간 IgG Fc 폴리펩티드 쇄이고; V1 및 V3은 VH 영역이고, V2 및 V4는 VL 영역이며; L1, L2, L3 및 L4는 링커이고; L2 및/또는 L4는 존재하거나 부재할 수 있다; 이중특이적(Bi)-Fc로서,
    상기 Bi-Fc는 표적 세포 및 면역 효과기 세포에 결합하고/하거나 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 매개하고,
    상기 V1 및 V2는, 이들이 IgG 및/또는 scFv 항체의 일부인 경우, 암 세포 항원에 결합하고,
    상기 V3 및 V4는, 이들이 IgG 및/또는 scFc 항체의 일부인 경우, 인간 CD3ε에 결합할 수 있고,
    V3은 서열번호 7 또는 29와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상동성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이이며,
    V4는 서열번호 8 또는 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상동성 영역은 적어도 80개 아미노산 길이이며,
    상기 Bi-Fc는 단량체(monomer)인, 이중특이적-Fc.
  57. 제55항 또는 56항에 있어서, V3은 서열번호 7 또는 29의 아미노산 서열을 포함하고, V4는 서열번호 8 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적-Fc.
  58. 제1항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 암 세포인, 이중특이적-Fc.
  59. 제58항에 있어서, 상기 암 세포가 혈액 악성종양 또는 고형 종양의 악성종양인, 이중특이적-Fc.
  60. 제1항 내지 제18항, 제36항 내지 제38항 및 제55항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 병원체에 의해 감염된 세포인, 이중특이적-Fc.
  61. 제60항에 있어서, 병원체가 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스를 포함하는 바이러스, 또는 리스테리아 속, 마이코박테리움 속, 스타필로콕쿠스 속 또는 스트렙토콕쿠스 속의 세균인, 이중특이적-Fc.
  62. 제1항 내지 제18항, 제36항 내지 제38항 및 제55항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 질환을 매개하는 세포인, 이중특이적-Fc.
  63. 제62항에 있어서, 상기 표적 세포가 섬유성 질환을 매개하는 섬유 세포인, 이중특이적-Fc.
  64. 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항의 이중특이적-Fc 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형.
  65. 제1항 내지 제63항 중의 어느 한 항의 이중특이적-Fc를 코딩하는 하나 이상의 핵산(들).
  66. 제65항의 핵산(들)을 포함하는 하나 이상의 벡터(들).
  67. 제65항의 핵산(들) 및/또는 제66항의 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포.
  68. 제67항의 숙주 세포를 핵산이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계 및
    이중특이적-Fc를 세포 괴(mass) 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 이중특이적-Fc의 제조 방법.
  69. 제1항 내지 제59항 중의 어느 한 항의 이중특이적-Fc의 치료학적 유효량을 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 방법이 이중특이적-Fc의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 방사선, 화학요법제 또는 비화학요법제, 항신생물제(anti-neoplastic agent)를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 환자가 혈액 악성종양 또는 고형 종양의 악성종양을 갖는, 방법.
  72. 제63항의 이중특이적-Fc의 치료학적 유효량을 섬유성 질환을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유성 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 섬유성 질환이 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐색성 폐질환(CDPD), 간경변, 강피증, 신장 이식 섬유증, 신장 동종이식 신병, 또는 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증인, 방법.
  74. 제60항의 이중특이적-Fc의 치료학적 유효량을 병원체에 의해 매개된 질환을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체에 의해 매개된 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스, 세균 또는 원생동물인, 방법.
  76. 제1항 내지 제59항 중의 어느 한 항의 이중특이적-Fc를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
  77. 제60항의 이중특이적-Fc를 포함하는, 감염성 질환 치료용 약제학적 조성물.
  78. 제1항 내지 제18항, 제36항 내지 제38항 및 제55항 내지 제57항 중의 어느 한 항의 이중특이적-Fc를 포함하는, 자가면역 또는 염증 질환 치료용 약제학적 조성물.
  79. 제63항의 이중특이적-Fc를 포함하는, 섬유성 질환 치료용 약제학적 조성물.
KR1020157028764A 2013-03-15 2014-03-14 이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자 KR20150139531A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361791424P 2013-03-15 2013-03-15
US61/791,424 2013-03-15
PCT/US2014/029253 WO2014144722A2 (en) 2013-03-15 2014-03-14 BISPECIFIC-Fc MOLECULES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150139531A true KR20150139531A (ko) 2015-12-11

Family

ID=50489434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157028764A KR20150139531A (ko) 2013-03-15 2014-03-14 이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자

Country Status (21)

Country Link
US (5) US20140302037A1 (ko)
EP (1) EP2970477B1 (ko)
JP (2) JP6535654B2 (ko)
KR (1) KR20150139531A (ko)
CN (1) CN105229031A (ko)
AP (1) AP2015008773A0 (ko)
AU (1) AU2014228829B2 (ko)
BR (1) BR112015023431A2 (ko)
CA (1) CA2902961C (ko)
CL (1) CL2015002756A1 (ko)
CR (1) CR20150573A (ko)
EA (1) EA201591814A1 (ko)
HK (1) HK1214275A1 (ko)
IL (1) IL241354A0 (ko)
MA (1) MA38400A1 (ko)
MX (2) MX2015012187A (ko)
PE (1) PE20151998A1 (ko)
PH (1) PH12015502083A1 (ko)
SG (1) SG11201506647SA (ko)
TN (1) TN2015000379A1 (ko)
WO (1) WO2014144722A2 (ko)

Families Citing this family (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012355435A1 (en) * 2011-12-21 2014-07-17 Amgen Inc. Variant Fc-polypeptides with enhanced binding to the neonatal Fc receptor
CN104640562A (zh) * 2012-07-13 2015-05-20 酵活有限公司 包含抗-cd3构建体的双特异性不对称异二聚体
AU2014236769B2 (en) * 2013-03-15 2018-09-27 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
ES2777940T3 (es) 2013-05-03 2020-08-06 Ohio State Innovation Foundation Células efectoras inmunitarias genomanipuladas con un receptor de antígeno químico específico de CS1
MX2016006572A (es) 2013-11-27 2016-12-09 Zymeworks Inc Construcciones de union a antigenos biespecificas dirigidas a her2.
UA120753C2 (uk) 2013-12-17 2020-02-10 Дженентек, Інк. Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
KR102568808B1 (ko) 2014-04-07 2023-08-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역활성화 항원 결합 분자
JP6894702B2 (ja) * 2014-05-13 2021-06-30 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
AU2015294834B2 (en) 2014-07-31 2021-04-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
AU2015323313B2 (en) * 2014-09-25 2021-04-01 Amgen Inc. Protease-activatable bispecific proteins
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
JP2018510623A (ja) * 2015-02-20 2018-04-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション Ｎｋｇ２ｄ及び腫瘍関連抗原に対する二価抗体
EP3280437A4 (en) 2015-04-06 2018-09-12 Jianhua Yu Egfr-directed car therapy for glioblastoma
LT3283524T (lt) 2015-04-17 2023-05-25 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecifiniai antikūnų konstruktai, skirti cdh3 ir cd3
JP2018520642A (ja) * 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
WO2016182064A1 (ja) * 2015-05-13 2016-11-17 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
WO2017011414A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2017011413A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
CN107921130A (zh) * 2015-08-17 2018-04-17 宏观基因有限公司 能够结合b7‑h3和cd3的双特异性单价双抗体及其用途
MA43025A (fr) * 2015-10-02 2021-05-26 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant les lymphocytes t anti-ceaxcd3
WO2017055388A2 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
AU2016347058B2 (en) 2015-10-25 2023-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of HIV infection
CN107207608B (zh) * 2015-10-30 2021-05-11 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 双特异性抗体、其制备方法和用途
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
BR112018003984A2 (pt) 2015-12-09 2018-09-25 Hoffmann La Roche anticorpos
PL3400246T3 (pl) 2016-01-08 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworów z dodatnim markerem cea z wykorzystaniem antagonistów wiążących oś pd-1 oraz przeciwciał dwuswoistych anty-cea/anty-cd3
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
KR20180101623A (ko) 2016-02-03 2018-09-12 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Psma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EP3411402B1 (en) 2016-02-03 2021-12-22 Amgen Research (Munich) GmbH Bcma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
US11291721B2 (en) 2016-03-21 2022-04-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
WO2017162587A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
DK3433280T3 (da) 2016-03-22 2023-06-19 Hoffmann La Roche Protease-aktiverede T-celle-bispecifikke molekyler
DK3443006T5 (da) 2016-04-13 2023-11-06 Sanofi Sa Trispecifikke og/eller trivalente bindingsproteiner
SG11201808911SA (en) * 2016-04-13 2018-11-29 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
WO2017194597A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation matrix
EP3455241B1 (en) 2016-05-11 2022-02-23 Cytiva BioProcess R&D AB Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
KR102365977B1 (ko) 2016-05-20 2022-02-22 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 쇄 가변 단편 cd3 결합 단백질
AU2017297603A1 (en) 2016-07-14 2019-02-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
AU2017298984B2 (en) 2016-07-22 2023-08-31 Amgen Inc. Methods of purifying Fc-containing proteins
EP3541843A1 (en) 2016-11-15 2019-09-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
MX2019006045A (es) 2016-11-23 2019-11-11 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso.
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
KR20190141243A (ko) 2017-05-05 2019-12-23 암젠 인크 개선된 저장 및 투여를 위한 이중특이적 항체 구축물을 포함하는 약제학적 조성물
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
AU2018347582A1 (en) 2017-10-13 2020-05-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
KR20200064096A (ko) 2017-10-14 2020-06-05 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항체, 활성화 가능한 항체, 이중특이적 항체 및 이중특이적 활성화 가능한 항체 및 이들의 사용 방법
TWI827570B (zh) 2017-12-11 2024-01-01 美商安進公司 雙特異性抗體產品之連續製造製程
TW201940518A (zh) 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
JP7433236B2 (ja) 2018-03-13 2024-02-19 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗葉酸受容体１抗体及びその使用
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
EP3773657A4 (en) * 2018-03-26 2021-12-08 Altor Bioscience LLC ANTI-PDL1, IL-15 AND TGF BETA RECEPTOR COMBINATION MOLECULES
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP3830121A1 (en) 2018-07-30 2021-06-09 Amgen Research (Munich) GmbH Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
WO2020025596A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Research (Munich) Gmbh Dosing regimen for bcma-cd3 bispecific antibodies
BR112021002032A2 (pt) 2018-08-03 2021-07-20 Amgen Research (Munich) Gmbh construtos de anticorpos para cldn18.2 e cd3
KR20210086623A (ko) 2018-09-25 2021-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법
EP3856764A4 (en) * 2018-09-27 2022-11-02 Xilio Development, Inc. MASKED CYTOKINE POLYPEPTIDES
UY38393A (es) 2018-09-28 2020-03-31 Amgen Inc Anticuerpos contra bcma soluble
JP2022512636A (ja) 2018-10-11 2022-02-07 アムジエン・インコーポレーテツド 二重特異性抗体コンストラクトの下流プロセシング
US20220119533A1 (en) * 2018-10-23 2022-04-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric fc-fused proteins
US20220128474A1 (en) 2018-10-23 2022-04-28 Amgen Inc. Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions
US11965030B2 (en) 2018-12-24 2024-04-23 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
TW202043253A (zh) 2019-01-28 2020-12-01 美商安進公司 藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程
CA3130508A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to nkp30 and uses thereof
CN114127113A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与钙网蛋白结合的多功能分子及其用途
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
SG11202109033XA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
SG11202109122SA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
EP3983520A1 (en) 2019-06-13 2022-04-20 Amgen, Inc Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics
JP2022547135A (ja) 2019-09-10 2022-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 増強されたプロテインｌ捕捉動的結合容量を有する二重特異性抗原結合ポリペプチドの精製方法
WO2021091906A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Amgen Inc. Methods for treating leukemia
EP3819007A1 (en) 2019-11-11 2021-05-12 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for anti-bcma agents
WO2021097344A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Amgen Inc. Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
UY38995A (es) 2019-12-20 2021-06-30 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecíficos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores sólidos
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
EP4093771A1 (en) 2020-01-22 2022-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
WO2021158469A1 (en) 2020-02-03 2021-08-12 Amgen Inc. Multivariate bracketing approach for sterile filter validation
WO2021168303A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
TW202200615A (zh) 2020-03-12 2022-01-01 美商安進公司 用於治療和預防患者的crs之方法
IL296601A (en) 2020-03-19 2022-11-01 Amgen Inc Antibodies against mucin 17 and their uses
AU2021261420A1 (en) 2020-04-24 2022-12-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
US20220017636A1 (en) 2020-05-19 2022-01-20 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
TW202210101A (zh) 2020-05-29 2022-03-16 美商安進公司 與ｃｄ３３和ｃｄ３結合的雙特異性構建體的減輕不良反應投與
CA3190755A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
AU2021333779A1 (en) 2020-08-26 2023-04-13 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting TRBC1 or TRBC2
WO2022060878A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for treating prostate cancer
EP4214233A1 (en) 2020-09-16 2023-07-26 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
BR112023008629A2 (pt) 2020-11-06 2023-10-03 Amgen Inc Construtos de polipeptídeos que se ligam seletivamente a cldn6 e cd3
EP4240768A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Amgen Inc. Multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
US20230406887A1 (en) 2020-11-06 2023-12-21 Amegen Inc. Antigen binding domain with reduced clipping rate
CN116635421A (zh) 2020-11-06 2023-08-22 安进公司 与cd3结合的多肽构建体
WO2022103781A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 Amgen Inc. Methods for administering a bcma x cd3 binding molecule
TW202233684A (zh) * 2020-11-18 2022-09-01 美商泰尼歐生物公司 結合於葉酸受體α之重鏈抗體
EP4263600A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
HUP2100038A1 (hu) * 2021-02-03 2022-08-28 Richter Gedeon Nyrt Mutáltatott rekombináns ACE2-Fc fúziós fehérjék COVID-19 fertõzések kezelésére
JP2024509878A (ja) 2021-03-10 2024-03-05 アムジエン・インコーポレーテツド パラレルクロマトグラフィーシステム及び方法
KR20230154908A (ko) 2021-03-10 2023-11-09 암젠 인크 재조합 단백질의 정제 방법
AR125290A1 (es) 2021-04-02 2023-07-05 Amgen Inc Construcciones de unión a mageb2
GB2623199A (en) 2021-04-08 2024-04-10 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules binding to TCR and uses thereof
WO2022234102A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
TW202317625A (zh) 2021-06-17 2023-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 新穎三特異性結合分子
CN113337514B (zh) * 2021-08-05 2021-10-29 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Tcr表达构建体以及其制备方法和用途
US20230183382A1 (en) * 2021-10-15 2023-06-15 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
WO2023076318A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Amgen Inc. Deep learning-based prediction for monitoring of pharmaceuticals using spectroscopy
TW202334221A (zh) 2021-11-03 2023-09-01 德商安富美德有限公司 雙特異性cd16a結合劑
CA3237018A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
WO2023164288A2 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Xilio Development, Inc. Targeted cytokines and methods of use thereof
WO2023164286A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Xilio Development, Inc. Engineered cd122 compositions and methods thereof
WO2023218027A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Amgen Research (Munich) Gmbh Multichain multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
WO2024015960A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Xilio Development, Inc. Engineered cleavable fc domain as carriers and methods of use thereof
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
WO2024077044A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Amgen Inc. Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
KR100508289B1 (ko) * 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2357187A1 (en) 2000-12-12 2011-08-17 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CN1195779C (zh) * 2001-05-24 2005-04-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗人卵巢癌抗人cd3双特异性抗体
JP4966497B2 (ja) * 2002-11-15 2012-07-04 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ２５に対するヒトモノクローナル抗体
JP2008501621A (ja) * 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
EP2006379B1 (en) * 2006-03-23 2016-08-31 Tohoku University High functional bispecific antibody
KR101626988B1 (ko) * 2007-04-03 2016-06-02 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 이중특이적인 결합제들
WO2008119567A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
HUE040467T2 (hu) * 2007-04-03 2019-03-28 Amgen Res Munich Gmbh Keresztfaj-specifikus kötõdomén
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
ES2445755T3 (es) * 2007-11-07 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a células dendríticas y epiteliales humanas 205 (DEC-205)
BRPI0821906B1 (pt) * 2008-01-03 2022-06-07 The Scripps Research Institute Anticorpo isolado de comprimento total, seu uso, polinucleotideo, vetor, e célula hospedeira
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2352763B2 (en) * 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
EP2504360B1 (en) * 2009-11-23 2018-08-15 Amgen Inc. Monomeric antibody fc
EP2516458A1 (en) * 2009-12-22 2012-10-31 Novartis AG Tetravalent cd47-antibody constant region fusion protein for use in therapy
MY171234A (en) * 2010-02-24 2019-10-04 Immunogen Inc Folate receptor 1 antibodies and immunoconjugates and uses thereof
US20140112926A1 (en) 2011-03-16 2014-04-24 Amgen Inc. Fc VARIANTS
TWI803876B (zh) * 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
IL303208A (en) * 2011-04-01 2023-07-01 Immunogen Inc Methods for increasing the effectiveness of FOLR1 cancer therapy
WO2012143524A2 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
US20130078250A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
DK2766392T3 (da) * 2011-10-10 2019-10-07 Xencor Inc Fremgangsmåde til oprensning af antistoffer
CA2854806A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
AU2012355435A1 (en) 2011-12-21 2014-07-17 Amgen Inc. Variant Fc-polypeptides with enhanced binding to the neonatal Fc receptor
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES

Also Published As

Publication number Publication date
EP2970477A2 (en) 2016-01-20
MX2015012187A (es) 2016-04-15
CR20150573A (es) 2015-11-19
US20190002568A1 (en) 2019-01-03
WO2014144722A2 (en) 2014-09-18
CA2902961A1 (en) 2014-09-18
MA38400A1 (fr) 2017-09-29
AP2015008773A0 (en) 2015-09-30
US20230212297A1 (en) 2023-07-06
MX2021010416A (es) 2021-09-14
PH12015502083A1 (en) 2016-01-18
EP2970477B1 (en) 2023-10-04
US11753475B2 (en) 2023-09-12
CL2015002756A1 (es) 2016-04-15
BR112015023431A2 (pt) 2017-11-28
WO2014144722A3 (en) 2014-11-06
TN2015000379A1 (en) 2017-01-03
US20160145340A1 (en) 2016-05-26
AU2014228829A1 (en) 2015-09-10
SG11201506647SA (en) 2015-09-29
EA201591814A1 (ru) 2016-03-31
JP6535654B2 (ja) 2019-06-26
AU2014228829B2 (en) 2019-01-17
IL241354A0 (en) 2015-11-30
JP2016516056A (ja) 2016-06-02
US20180230220A1 (en) 2018-08-16
CN105229031A (zh) 2016-01-06
PE20151998A1 (es) 2016-02-03
HK1214275A1 (zh) 2016-07-22
CA2902961C (en) 2023-08-01
US20140302037A1 (en) 2014-10-09
JP6732988B2 (ja) 2020-07-29
JP2019151634A (ja) 2019-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150139531A (ko) 이중특이적 이가 scFv-Ｆｃ 분자
WO2020088164A1 (zh) 双特异性抗体及其用途
US20200071425A1 (en) Heterodimeric Bispecific Antibodies
KR101900953B1 (ko) Ｃｄ86 길항제 다중-표적 결합 단백질
KR101901458B1 (ko) Ｔｃｒ 복합체 면역치료제
US11634502B2 (en) Heterodimeric bispecific antibodies
TW202342501A (zh) 介白素-21突變蛋白及治療方法
TWI688572B (zh) 包含dr5-結合結構域的多價分子
CN109641037B (zh) 抗psma抗体及其用途
KR102649757B1 (ko) 5t4 및 4-1bb에 결합하는 항원 결합 단백질 및 관련 조성물 및 방법
KR20170063755A (ko) Cd19 및 cd3에 결합할 수 있는 이중-특이적 1가 디아바디, 및 그것의 사용
US20220010011A1 (en) Antibodies specific for immunoglobulin-like transcript 3 (ilt3) and uses thereof
JP2022514702A (ja) 二機能性抗ｐｄ－１／ｉｌ－７分子
CN114728065A (zh) 针对cd3和bcma的抗体和自其制备的双特异性结合蛋白
US20170157251A1 (en) Bi-Specific Monovalent Diabodies That are Capable of Binding CD19 and CD3, and Uses Thereof
US20220056141A1 (en) Improved Anti-FLT3 Antigen Binding Proteins
KR102218723B1 (ko) Baff 및 b7rp1에 특이적인 단백질 및 이의 용도
JP2022540620A (ja) 胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｓｌｐ）受容体シグナル伝達に干渉する薬剤
US20240043566A1 (en) Bi-functional molecules
KR20220127843A (ko) 단백질 치료제용 제형
RU2804458C2 (ru) Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с 5t4 и 4-1bb, и относящиеся к ним композиции и способы

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid