KR20150137577A - 당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 하기 화학식 1로 표시되는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이들 화합물의 효소적 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00009

상기 식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 X-Y의 정의는 명세서에서 정의한 바와 같다.

Description

당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물{Glucose-attached aminoglycoside compounds, manufacturing method thereof and pharmaceutical compositions containing them as active ingredients}
본 발명은 유전 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이들 화합물의 효소적 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
다수의 인간 유전병의 경우 기존 아미노산 암호화 코돈이 3종의 정지코돈들(UAA, UAG 또는 UGA)으로 치환되어 무의미 돌연변이(non-sense mutation)가 됨으로써 유전 질환이 나타난다. 상기 무의미 돌연변이에 따라 번역의 조기종결(premature termination)이 나타나고, 이에 따른 단편화된 불활성 단백질 생합성이 야기된다. 현재까지, 수백 종의 상기 무의미 돌연변이가 알려져 있고, 그 중 여러 가지는 하기와 같은 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증(duchenne muscular dystrophy, DMD), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군(ataxia telangiectasia), 헐러 증후군(hurler syndrome), A형 혈우병(hemophilia A), B형 혈우병(hemophilia B), 및 테이-삭스 병(tay-sachs) 등의 불치 유전 질환들의 원인으로 보여지고 있다(비특허문헌 1, 2 참조). 현재까지 이들 불치병에 대한 효과적인 처치법은 없는 상황이며, 최근 그 잠재적 해결책으로 유전자 치료(gene therapy)가 부각되고 있으나, 아직까지 인체 적용 및 처치 전에 풀어야 할 다수의 문제점은 남아 있는 실정이다.
한편, 아미노글리코사이드가 생체 내 라이보솜(ribosome)이 무의미 돌연변이를 통독(read-through)하도록 유도시키는 활성이 있고, 그에 따라 단편화되지 않고 완전길이(full-length)의 단백질이 만들어질 수 있다는 점 때문에, 지난 수년간 아미노글리코사이드의 유전 질환에 대한 치료제로서의 잠재성이 보고된 바 있다(비특허문헌 3-6 참조).
아미노글리코사이드는 감염증 처치를 위해 일반적으로 사용되는, 광범위하게 적용 가능한 항세균제로 알려져 있다. 도 1에 나타나 있는 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine) 함유 아미노글리코사이드 계열 항균제들은 원핵세포의 라이보솜에 선택적으로 작용하는 항균제로서, 구체적으로, 16S 라이보솜 RNA의 디코딩(decoding) A-부위에 결합하여 단백질 번역을 억제하고, 번역 충실도(translational fidelity)를 방해한다(비특허문헌 7-12 참조). 이들 아미노글리코사이드 계열 화합물들 중 대표적으로 카나마이신(kanamycin), 토브라마이신(tobramycin), 겐타마이신(gentamicin) 및 관련 생합성 중간체인 시소마이신(sisomicin) 등의 천연 항세균제와 이들 천연 항세균제에 화학적 반합성법(semi-synthetic process)을 적용한 2세대 아미노글리코사이드 계열인 아미카신(amikacin), 이세파마이신(isepamicin), 및 네틸마이신(netilmicin) 등이 현재 항세균제로 임상 사용 중에 있다.
한편, 단백질 생합성의 종료는 mRNA 내 종료코돈의 존재로부터 시작되며, 방출인자 (release factor) 단백질이 이 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 번역 종료의 효율은 일반적으로 매우 높으며, 종료 코돈에 대응하는 아미노산이 잘못 삽입될 가능성은 10,000의 1 정도의 낮은 빈도로 나타난다. 진핵세포 내 아미노글리코사이드에 의한 단백질 생합성 종료의 억제 활성 향상은 단백질 생합성 중 번역 충실도를 방해하는 아미노글리코사이드의 활성과 동일한 기전으로 발생하는 것으로 추정되고 있다. 즉, 아미노글리코사이드의 라이보솜 내 A 부위로의 결합은 그 결합의 구조적 변화를 유도하여, 방출인자의 삽입 대신에 mRNA-tRNA 복합체를 안정화시키는 것으로 예측되고 있다(비특허문헌 13 참조).
아미노글리코사이드가 포유동물 세포 내 무의미 돌연변이에 기인한 번역 조기 종결을 억제한다는 사실은 1985년 처음으로 보고되었으며, 유전 질환 치료제로의 이용 잠재성 역시 처음으로 언급된 바 있다(비특허문헌 3 참조). 처음으로 수행된 유전병은 낭성 섬유증으로, 낭성 섬유증은 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 유전자의 점 돌연변이로부터 발생한다. 이 질환은 코카시인 인종에 가장 빈번히 발생하는 퇴행성 유전 질환으로 신생아의 2,500분의 1의 빈도로 발생하고 있다. 현재까지 CFTR 유전자 내 1000종 이상의 다양한 돌연변이가 확인되고 있다(비특허문헌 5 참조).
아미노글리코사이드에 의한 CFTR 무의미 돌연변이 억제에 대한 첫 연구에서 겐타마이신과 그 생합성 중간체로 알려진 게네티신(geneticin 또는 G-418)이 활성을 나타내었으며, 기관지 상피 세포주를 이용한 실험에서 완전길이 기능의 CFTR이 복귀됨을 확인하였다(비특허문헌 14, 15 참조). 인간 유래 CFTR-G542X 유전자가 이입된 CFTR (-) 유전자 이입 생쥐로부터 적출한 장 조직 내 연구를 통하여, 겐타마이신 처치 실험 동물의 경우 인간유래 CFTR이 발현됨을 확인하였고, 그에 비하여 다른 구조를 가진 아미노글리코사이드인 토브라마이신(tobramycin)의 경우엔 무의미 통독 유도(non-sense read-through induction) 활성이 약하게 나타나는 것으로 보고되었다(비특허문헌 16 참조). 무엇보다도, 위약과의 비교를 통한 이중 암맹 임상 시험 결과 겐타마이신은 질환자 내 무의미 돌연변이를 억제하는 것으로 나타났으며, 또한, 겐타마이신 처치를 통하여 CFTR 종료 돌연변이를 앓고 있는 19명의 환자 그룹에서 코 점막을 통한 막횡단 전도효율이 향상되는 것이 확인되었다(비특허문헌 17 참조). 이 밖에 6종의 유전 질환 세포주 및 실험 동물 모델이 실시되어 아미노글리코사이드의 유전 질환 치료제로서의 잠재성이 보고된 바 있다(비특허문헌 18 - 23 참조).
하지만, 아미노글리코사이드의 유전 질환 치료제로의 응용에 있어서, 주된 한계점 중 하나는 포유류 세포에 대한 높은 독성 특히, 신장 독성(nephrotoxicity) 및 내이독성(ototoxicity)이다. 이 같은 독성의 원인은 인지질(phospholipids)과의 상호작용, 포스포라이파아제(phospholipase)의 저해, 자유 라디칼류(free radicals)의 형성과 같은 여러 요인들의 복합적 원인에 기인한 것으로 추측되고 있다(비특허문헌 24, 25 참조). 세균과 같은 원핵세포의 라이보솜에 대한 충분한 선택성에도 불구하고, 대부분의 아미노글리코사이드는 여전히 진핵세포의 라이보솜 내 A 부위에 결합한다. 포유동물 세포 내 번역 억제 효과 또한 아미노글리코사이드의 높은 독성의 주요 원인 중 하나이다. 이러한 독성과 연관된 또 다른 가능성은 미토콘드리아 내 12S rRNA A-부위와의 결합인 것으로 알려져 있다(비특허문헌 26 참조).
이와 같은 아미노글리코사이드 처치와 연관된 독성을 완화할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구들이 수행되었으며, 자유 라디칼류 제거를 위한 항산화제의 사용, 아미노글리코사이드와 인지질 간의 상호작용을 줄이기 위한 뎁토마이신(daptomycin)과 폴리-L-아스파르테이트(poly-L-aspartate)의 동시 사용 등이 보고된 바 있다(비특허문헌 27 참조). 또한, 아미노글리코사이드 처치시 처방 스케쥴이나 제형 처치의 변화를 통한 독성 감소 방안이 모색된 바도 있다(비특허문헌 28, 29 참조).
아미노글리코사이드 독성을 감소하기 위한 다양한 연구 노력에도 불구하고, 처방 스케쥴의 변화 방법을 제외한 어떤 결과도 유전 질환 치료를 위한 표준화된 임상 실습법으로 개선되지 않고 있다. 가령, 임상 시험시 독성 용량 이하의 겐타마이신 처치는 아미노글리코사이드에 기인한 무의미 통독 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(비특허문헌 30 참조). 한편, 게네티신의 경우 시험관 시험(in-vitro)시 가장 좋은 무의미 통독 활성이 나타났으나, 매우 낮은 농도 하에서도 나타나는 치명적 독성은 의약품으로서의 사용을 불가능하게 하였다(비특허문헌 6 참조). 즉, 인간 섬유아세포에 대한 게네티신의 반수치사량(LD50)은 0.04 mg/ml로서, 겐타마이신이나 네오마이신 혹은 카나마이신 등의 LD50인 2.5 ~ 5.0 mg/ml 범위와는 현저한 차이가 나타나고 있다(비특허문헌 31 참조). 따라서, 현재까지 다양한 실험 동물 모델 및 임상 시험 단계에서 연구된 아미노글리코사이드는 유일하게 겐타마이신 밖에 없다. 즉, 일부 세포주를 통한 연구 보고에 따르면 아미카신과 파로모마이신(paromomycin)이 겐타마이신의 무의미 통독 유도(nonsense read-through inducer) 활성의 대체 화합물로 보고된 바는 있으나, 이들 아미노글리코사이드에 대한 임상 시험 자료는 현재까지 보고된 바가 없다(비특허문헌 32, 33 참조).
근래까지 유전 질환 치료 잠재성으로 인식되고 있는 대부분의 무의미 통독 유도 활성의 경우, 임상 사용 중인 아미노글리코사이드 상용품만을 대상으로 연구가 이루어졌으며, 그 화합물의 구조를 변형시킴으로서 무의미 통독 활성을 최적화하려는 노력은 거의 전무하였다(비특허문헌 6 참조).
이스라엘의 테크니온 리서치 앤 디벨로퍼먼트 파운데이션(Technion Research & Development Foundation)의 바소브(Baasov) 연구팀은 의사삼당체(pseudo-trosaccharides) 아미노글리코사이드를 기본 구조로 가진 다양한 신규 아미노글리코사이드 화합물을 화학적 유기합성 제조법을 통하여 합성하여, 이들 화합물의 무의미 통독 유도 활성을 확인하는 한편, 낮은 세포 독성 및 포유동물 세포에 대한 선택성이 있는 신규한 아미노글리코사이드를 발명하여 유전 질환 치료에 이용가능한 화합물로 특허화한 바 있다(특허문헌 1 참조).
일본의 도쿄대와 마이크로비얼 케미스티리 리서치 파운데이션(Microbial Chemistry Research Foundation)은 공동으로 카나마이신 천연 아미노글리코사이드의 반합성 제제로 개발된 아베카신(arbekacin)의 무의미 통독 유도 활성을 실험관 수준에서 확인하여 특허화하였다(특허문헌 2 참조).
전술한 2건의 특허를 제외하고는, 최근까지 보고된 유기합성이나 생합성 제조방법을 통하여 아미노글리코사이드 구조를 변형한 화합물에 대한 보고는 모두 감염질환 치료와 관련된 신규한 항세균제의 발명 및 항생제 이점만을 제시하고 있다(특허문헌 3, 4 참조).
효과적인 무의미 통독 유도제에 요구되는 특성은 경구 투여 및 그에 따른 장내 세균에 대한 영향을 최소화하는 부분이다. 즉, 무의미 통독 유도 의약품의 항세균 활성, 특히, 장내 상재 세균인 가스트로인테스티널 비오타(gastrointestinal biota)에 대하여 어떠한 영향을 미치는 것은 바람직하지 않다. 그런 관점에서, 상술한 아미노글리코사이드의 문제점 외에, 대다수의 임상 사용 중인 상용 아미노글리코사이드는 무의미 통독 유도 활성이 있음에도 임상 적용시 다른 문제점이 있다.
최근 미국 바이오 제약회사인 피티시 세라퓨틱스(PTC Therapeutics)는 상술한 무의미 통독 유도 활성을 가진 아미노글리코사이드의 임상 적용시 문제점을 극복할 방안으로, 다수의 화합물 라이브러리로부터 신규한 무의미 통독 유도 화합물을 스크리닝하였고, 비 아미노글리코사이드 화합물인 아탈루렌(ataluren, PTC124)을 발견하였다(특허문헌 5 참조). 이 화합물은 아미노글리코사이드와는 구조적으로 독립적이고, 항세균 활성을 가지지 않으며, 독성이 나타나지 않았다. 미국 FDA는 PTC124를 희귀 질환인 낭성 섬유증과 듀시엔형 근이영양증에 대한 신약 후보물질로 규정하여 패스트트랙(fast-track)으로 임상 진입시켰고, 2014년 현재 임상 3상 단계에 있다(비특허문헌 34 참조).
이상과 같이, 상술한 모든 문헌들은 무의미 통독 유도 활성을 지닌 동시에, 포유동물 세포에 대한 낮은 활성 및 항세균 활성을 최소화시킨 신규 아미노글리코사이드 화합물에 대한 다양한 연구 및 발명에 대한 접근법을 제시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 신규한 아미노글리코사이드 화합물을 개발하여, 기존 아미노글리코사이드의 임상 적용시 문제점으로 지적된 사항을 극복하고, 유전 질환 치료제로의 이용을 도모하고자 한다.
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본 발명의 목적은 낮은 세포 독성 및 낮은 항세균 활성을 나타내면서 무의미 통독 유도 활성을 나타내는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서,
R1은 NH2 또는 OH이고,
R2는 H 또는 OH이고,
R3은 H 또는 OH이고,
R4는 NH2 또는 OH이고,
R5는 H 또는 CH3이고,
R6은 H, CH2CH3 또는
Figure pat00002
이고,
X-Y는 CH-CH 또는 C=C이다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증(duchenne muscular dystrophy, DMD), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군(ataxia telangiectasia), 헐러 증후군(hurler syndrome), A형 혈우병(hemophilia A), B형 혈우병(hemophilia B), 및 테이-삭스 병(tay-sachs)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 무의미 돌연변이형 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 또는 디스트로핀(dystrophin)에 대하여 무의미 통독 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine)을 포함하는 아미노글리코사이드 계열 항생제를 산 가수분해하여 의사이당체(pseudodisaccharides)를 얻는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 얻어진 의사이당체를 당전이 효소와 반응시켜 효소반응 산물을 얻는 단계를 포함하는, 본 발명의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 낮은 세포 독성 및 낮은 항세균 활성을 나타내면서, 겐타마이신에 비하여 무의미 통독 유도 활성이 향상된 효과를 나타내어, 낭성 섬유증 등의 유전 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기존 아미노글리코사이드 계열 항생제를 산 가수분해하고, 가수분해 산물로부터 분리 및 정제된 의사이당체(pseudodisaccharides)들을 기질로 하여 재조합 당전이 효소 KanM2의 반응을 통하여, 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine)을 포함하는, 당 부가 아미노글리코사이드 화합물을 제조하는 생합성 제조방법을 나타낸 도식도이다.
도 2는 카나마이신 생합성 관련 당전이 효소를 암호화하고 있는 kanM2 유전자의 대장균 내 발현을 통해 제작된 KanM2 재조합 당전이 효소의 분리 및 정제에 대한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel) 결과를 나타낸 이미지이다((A): 대장균에서 발현된 조효소 KanM2의 SDS-PAGE 결과; (B): 조효소를 타론 레진(Talon resin)으로 분리 및 정제한 후 분석한, 정제된 재조합 당전이 효소 KanM2(약 47 kDa)의 SDS-PAGE 결과).
도 3은 당전이 효소 반응을 통해 제조된 본 발명의 당 부가 아미노글리코사이드 화합물 각각의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 당 부가 아미노글리코사이드 화합물과 기존의 아미노글리코사이드 계열 항생제의 사람 세포주를 대상으로 한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 당 부가 아미노글리코사이드 화합물과 겐타마이신의 무의미 통독 유도 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 식에서,
R1은 NH2 또는 OH이고,
R2는 H 또는 OH이고,
R3은 H 또는 OH이고,
R4는 NH2 또는 OH이고,
R5는 H 또는 CH3이고,
R6은 H, CH2CH3 또는
Figure pat00004
이고,
X-Y는 CH-CH 또는 C=C이다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 대표적인 예는 다음과 같다:
1) 3′-디옥시-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C,
2) 1-N-3-아미노-2(S)-하이드록시프로피오닐-카나마이신 D,
3) 6′-메틸-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C,
4) 3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B, 및
5) 1-N-에틸-3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 황산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 화학식 1의 화합물이 결정 형태로 제조될 경우, 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전 질환은 인간의 퇴행성 유전 질환, 더욱 바람직하게는, 낭성 섬유증, 듀시엔형 근이영양증, 모세혈관 확장성 운동 실조증후군, 헐러 증후군, A형 혈우병, B형 혈우병, 및 테이-삭스 병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 그람 음성 세균인 대장균과 녹농균에 대하여 낮은 항세균 활성을 나타내고(실험예 1), 사람 세포주에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내며(실험예 2), 유효한 무의미 통독 유도 활성을 나타내어(실험예 3), 낭성 섬유증, 듀시엔형 근이영양증, 모세혈관 확장성 운동 실조증후군, 헐러 증후군, A형 혈우병, B형 혈우병, 및 테이-삭스 병 등의 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 무의미 돌연변이형 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절 및 디스트로핀에 대하여 무의미 통독 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 표준 약학적 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석액 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 적어도 하나 이상 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 캄셀제, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등의 제형일 수 있는데, 이들 제형은 유효성분 외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산의 마그네슘염, 스테아르산의 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제형으로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 적어도 하나 이상 포함하고, 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하며, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 1) 2-데옥시스트렙타민을 포함하는 아미노글리코사이드 계열 항생제를 산 가수분해하여 의사이당체를 얻는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 얻어진 의사이당체를 당전이 효소와 반응시켜 효소반응 산물을 얻는 단계를 포함하는 본 발명의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 제조 방법은 3) 상기 2) 단계에서 얻어진 효소반응 산물을 MPLC 방법으로 분리, 정제, 또는 분리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 2-데옥시스트렙타민을 포함하는 아미노글리코사이드 계열 항생제는 리비도마이신(lividomycin), 이세파마이신(isepamicin), 게네티신(geneticin 또는 G-418), 시소마이신(sisomicin) 및 네틸마이신(netilmicin)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 1) 단계의 의사이당체는 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC) 방법으로 분리, 정제, 또는 분리 및 정제될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에서, 바람직하게는, 상기 2) 단계의 당전이 효소는 KanM2 또는 KanE이고, 더욱 바람직하게는, 상기 KanM2 또는 KanE는 대장균에서 발현된 것이다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 3) 단계에서 MPLC 방법에 사용되는 고정상은 실리카일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 3) 단계에서 MPLC 방법에 사용되는 이동상은 클로로포름:메탄올:수산화암모늄 1:1:1(v/v/v) 혼합액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에서, 상기 3) 단계에서 MPLC 유지 시간(Retention time)은 8 ~ 14 분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 실시예를 제시한다.
그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 화합물 1) 3′- 디옥시 -3″- 디아미노 -3″- 하이드록시카나마이신 C의 제조
(1) 산 가수분해를 통한 의사이당체의 생성
당전이 효소의 반응을 통한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성 제조를 위하여 우선, 효소의 기질인 의사이당체를 산 가수분해하여 얻은 후 분리하였다. 즉, 현재 임상 및 실험적으로 상용화되고 있는 2-데옥시스트렙타민 포함 아미노글리코사이드 계열 항생제인 리비도마이신을 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 아미노글리코사이드 항생제인 리비도마이신 100 mg을 차광 유리 캡튜브에 넣고, 1 N 염산 메탄올 용액(진한 염산 0.86 ml + 메탄올 9.14 ml) 8 ml를 첨가하였다. 핫 플레이트 위에 놓고 4시간 동안 가수분해를 실시한 후, 모든 용액이 건조됨을 확인한 후, 다시 1 N 염산용액 8 ml를 한번 더 첨가하였다. 1시간 동안 가열 없이 반응하는 동안, 반응물이 모두 용해되었음을 확인한 후, 1 N 수산화나트륨 메탄올 용액(0.6 g NaOH + 메탄올 15 ml)을 2방울씩 점적하여 반응물의 최종 pH를 7로 조정하였다. 반응액을 2000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 에펜도르프 튜브에 분주하고 스피드백(SpeedVac, EYELA, Tokyo, Japan)으로 감압 건조하였다.
산 가수분해 반응물 내 의사이당체의 분리 및 정제에는 콤비플래시 Rf MPLC 시스템(CombiFlash Rf MPLC Cystem, Teledyne ISCO, Lincoln, NE, USA)을 사용하였다. 즉, 정상(normal-phase) 실리카 카트리지에 클로로포름:메탄올:수산화암모늄 1:1:1(v/v/v) 혼합액을 이동상으로 분당 8 ml의 속도로 흘러가는 MPLC 시스템에, 동일한 이동상 3 ml에 용해시킨 반응액을 주입한 후, 크로마토그램 상 검출된 피크를 자동 분취하였다. 개별 분획을 다시 감압하여 농축한 후, 이온트랩 질량 분석기(LCQ ion-trap mass spectrometer, ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)로 질량 스펙트럼을 분석함으로써 목적하는 의사이당체를 분리하였다. 도 1에 나타난 화합물 6은 가수분해된 의사이당체로서 MPLC 시스템 상 8.2분의 유지 시간으로 분취되었다. 또한, 최종 정제된 의사다당체 화합물 6은 62 mg으로 정제되어 산 가수분해 반응의 효율은 62% 임을 알 수 있었으며, 하기 당전이 효소 반응의 기질로 이용되었다(도 1 참조).
(2) 대장균에서 KanM2 재조합 효소의 발현
상기 (1)에서 얻어진 의사이당체 즉, 화합물 6을 기질로 사용하기에 앞서 카나마이신 생합성 관련 이차 당전이 효소를 암호화하고 있는 kanM2 (또는 kanE) 유전자를 다음과 같이 대장균에서 발현시켰다. 카나마이신 생합성 유전자 집단을 포함하고 있는 pSKC2 코스미드(cosmid)를 템플레이트로 하고 목적 유전자인 kanM2에 선택적인 프라이머(primer)를 제작하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. N-터미널 프라이머는 하기 서열번호 1의 서열이고, C-터미널 프라이머는 하기 서열번호 2의 서열이다.
서열번호 1: 5' - GG CATATG ACCGAGCCTGCCAAGGGTG - 3' (NdeI 제한위치)
서열번호 2: 5' - CGGGGTGGGGGGA CTCGAG GAGGACCC - 3' (XhoI 제한위치)
중합효소 연쇄반응 증폭은 전체 32 사이클로 수행하였다(초기 불활성 98℃에서 5분, 52.8 에서 69.3℃로 기울기 반응 후, 72℃에서 5분 동안 반응 후 종결). PCR 산물을 정제한 후, pGEMR-T 이지 벡터(pGEMR-T easy vector, Promega, Madison, WI, USA)에 접합한 후, 대장균 XL1 블루(XL1 blue, Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 42℃에서 45초간 열처리한 후, 형질전환을 수행하였다. 선발된 형질전환 대장균으로부터 T-이지 벡터를 분리, 정제한 후 그 서열을 확인하였다. T-이지 벡터를 NdeI과 XhoI 제한효소로 처리한 kanM2 절편을 동일한 제한효소들로 처리한 단백질 발현 벡터인 pET-28(a+)(Novagen, Madison, WI, USA)에 삽입한 후, 대장균 BL21(DE3)(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 형질전환시켰다. 이때, 형질전환체의 선발을 위하여 카나마이신 항생제 50 ppm을 사용하였다.
상기 재조합 대장균을 전술한 항생제와 최종 농도 1 M의 소르비톨(sorbitol) 및 2.5 mM 베타인(betaine)이 첨가된 LB 배지(Luria Bertani)에 1% 부피비로 접종한 후, 37℃에서 배양하였고, 광학농도 0.6 ~ 0.8 사이로 성장이 확인될 때, 단백질 발현을 유도시키고자, 최종농도 0.5 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-D-thiogalactopyranoside, IPTG, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 재조합 대장균주를 20℃에서 24시간 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50 mM 인산나트륨 용균(lysis) 완충용액(300 nM NaCl, 10 mM imidazole, 10% glycerol, 1% Triton X-100)에 균체를 용해시키고, 초음파 분해(sonication)를 실시하였다. 이 후, 12000 rpm에서 30분간 냉장 원심분리하고, 상등액을 따로 모아 일부 시료를 12% SDS-PAGE로 분석하여 재조합 당전이 효소 KanM2의 발현 정도를 확인하였다. 발현이 확인된 재조합 단백질 KanM2를 정제하기 위하여, 전술한 상등액을 50 mM 인산 완충용액(0.3 M NaCl, 20 mM imidazole)에 평형화된 탈론-금속 친화성 수지(Talon-metal affinity resin, Clontech, Mountain View, CA, USA)와 섞은 후 4℃에서 한시간 동안 배양하였다. 2000 rmp에서 5분간 냉장 원심분리한 후, 수지를 일회용 컬럼에 도입한 후, 수지 10배 용량의 20 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충용액으로 세척하였다. 최종적으로 250 mM 이미다졸을 포함한 인산 완충용액 3 ml로 수지에 결합된 재조합 당전이 효소 KanM2를 정제하였다(도 2 참조).
(3) 의사이당체를 기질로 하여 KanM2 재조합 효소 반응에 의한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
분리 정제된 의사이당체 즉, 화합물 6을 반응 완충용액(50 mM 인산 완충용액, 10 mM 염화마그네슘, 1 mg/ml 소 혈청 알부민)으로 용해하여 1 mM의 농도가 되게 한 후, KanM2 당전이 효소 30 uM와 핵산당 UDP-포도당(UDP-glucose) 2 mM을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 당전이 효소 반응을 실시하였다. 반응 후, 동량의 클로로포름을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 상층액만을 모아서 동결건조를 실시하였다. 효소 반응액으로부터 목적하는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 분리 및 정제에는 상기 콤비플래시 Rf MPLC 시스템을 사용하였다. 즉, 정상(normal-phase) 실리카 카트리지에 클로로포름:메탄올:수산화암모늄 1:1:1(v/v/v) 혼합액을 이동상으로 분당 8 ml의 속도로 흘러가는 MPLC 시스템에, 동일한 이동상 3 ml에 용해시킨 전술한 효소 반응물을 주입한 후, 크로마토그램 상 검출된 피크를 자동 분취하였다. 개별 분획을 다시 감압하여 농축한 후, 이온트랩 질량 분석기(LCQ ion-trap mass spectrometer, ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)로 질량 스펙트럼을 분석함으로써 목적하는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물을 분리하였다. 기질로 사용된 화합물 6은 MPLC 시스템 상 8.2분의 유지 시간으로 분취되었고, 목적하는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물 즉, 화합물 1은 기질보다 늦은 유지 시간인 9.2분으로 검출되었다. 정제된 당 부가 아미노글리코사이드 화합물은 3′-디옥시-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C이며, 도 1에 화합물 1로서 나타나 있다. 5 mg으로 최종 정제되었다.
NMR 시료들은 200 ul의 D2O에 화합물 1)을 일부 용해시킨 후, 5 mm 시게미 어드밴스드 NMR 마이크로튜브(Shigemi advanced NMR microtube, Sigma, St. Louis, MO)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. 13C NMR 스펙트럼은 배리언(Varian) INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298 K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS를 이용하여 ppm으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였고, 하기 표 1에 생합성된 화합물의 13C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.
[표 1] 화합물 1 내지 화합물 5의 13C-NMR 스펙트럼
Figure pat00005

제조된 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 질량 스펙트럼을 도 3에 나타내었다.
< 실시예 2> 화합물 2) 1-N-3-아미노-2(S)- 하이드록시프로피오닐 - 카나마이신 D의 제조
(1) 산 가수분해를 통한 의사이당체의 생성
아미노글리코사이드 항생제로서 리비도마이신 대신에 이세파마이신을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여, 가수분해된 의사이당체인 화합물 7을 얻었고, MPLC 시스템 상 분취되는 유지 시간은 7.6분이었으며, 78 mg으로 정제되어 산 가수분해 반응의 효율은 78 %임을 알 수 있었다.
(2) 대장균에서 KanM2 재조합 효소의 발현
<실시예 1>과 동일하게 실험하였다.
(3) 의사이당체를 기질로하여 KanM2 재조합 효소 반응에 의한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
의사이당체로서 화합물 6 대신에 화합물 7(MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 7.6분)을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여 화합물 2인 1-N-3-아미노-2(S)-하이드록시프로피오닐-카나마이신 D를 얻었고, 화합물 2의 유지시간은 8.2분이었으며, 6.1mg으로 최종 정제되었다.
< 실시예 3> 화합물 3) 6′- 메틸 -3″- 디아미노 -3″- 하이드록시카나마이신 C의 제조
(1) 산 가수분해를 통한 의사이당체의 생성
아미노글리코사이드 항생제로서 리비도마이신 대신에 게네티신을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여, 가수분해된 의사이당체인 화합물 8을 얻었고, MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 8분이었으며, 65 mg으로 정제되어 산 가수분해 반응의 효율은 65 %임을 알 수 있었다.
(2) 대장균에서 KanM2 재조합 효소의 발현
<실시예 1>과 동일하게 실험하였다.
(3) 의사이당체를 기질로하여 KanM2 재조합 효소 반응에 의한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
의사이당체로서 화합물 6 대신에 화합물 8(MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 8분)을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여 화합물 3인 6′-메틸-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C를 얻었고, 화합물 3의 유지 시간은 8.6분이었으며, 5.8mg으로 최종 정제되었다.
< 실시예 4> 화합물 4) 3′,4′- 디디옥시 -4′,5′- 디하이드로 -3″- 디아미노 -3″- 하이드록시카나마이신 B의 제조
(1) 산 가수분해를 통한 의사이당체의 생성
아미노글리코사이드 항생제로서 리비도마이신 대신에 시소마이신을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여, 가수분해된 의사이당체인 화합물 9를 얻었고, MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 13분이었으며, 72 mg으로 정제되어 산 가수분해 반응의 효율은 72 %임을 알 수 있었다.
(2) 대장균에서 KanM2 재조합 효소의 발현
<실시예 1>과 동일하게 실험하였다.
(3) 의사이당체를 기질로하여 KanM2 재조합 효소 반응에 의한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
의사이당체로서 화합물 6 대신에 화합물 9(MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 13분)을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여 화합물 4인 3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B를 얻었고, 화합물 4의 유지 시간은 13.8분이었으며, 4.2mg으로 최종 정제되었다.
< 실시예 5> 화합물 5) 1-N-에틸-3′,4′- 디디옥시 -4′,5′- 디하이드로 -3″-디아미노-3″- 하이드록시카나마이신 B의 제조
(1) 산 가수분해를 통한 의사이당체의 생성
아미노글리코사이드 항생제로서 리비도마이신 대신에 네틸마이신을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여, 가수분해된 의사이당체인 화합물 10을 얻었고, MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 7.9분이었으며, 66 mg으로 정제되어 산 가수분해 반응의 효율은 66 %임을 알 수 있었다.
(2) 대장균에서 KanM2 재조합 효소의 발현
<실시예 1>과 동일하게 실험하였다.
(3) 의사이당체를 기질로하여 KanM2 재조합 효소 반응에 의한 당 부가 아미노글리코사이드 화합물의 생합성, 분리 및 정제
의사이당체로서 화합물 6 대신에 화합물 10(MPLC 시스템 상 분취되는 유지시간은 7.9분)을 사용한 것을 제외하고는 <실시예 1>에 기재된 것과 동일하게 실험하여 화합물 5인 1-N-에틸-3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B를 얻었고, 화합물 5의 유지 시간은 9분이었으며, 5.8 mg으로 최종 정제되었다.
< 실험예 1> 실시예 화합물과 기존 항생제의 항세균 활성 비교
실시예 1 내지 실시예 5에서 얻은 화합물 1 내지 화합물 5의 항세균 활성을 알아보기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)와 항생제 내성 균주 은행(CCARM, 서울, 대한민국)으로부터 그람 음성 세균류에 속하는 대장균과 녹농균 각각의 기준주(type strain) 2종과 임상분리주(clinical isolate) 2종을 확보하여 항세균 활성을 실험하였다.
구체적으로, 4종의 검사 세균주를 28℃에서 뮐러-힌턴 브로스(Mueller-Hinton broth, Difco, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 배양 및 유지시켰다. 이 후, 산 가수분해 전의 상용 아미노글리코사이드 항생제들과 실시예에서 얻어진 화합물 5종을 배지에 처리하였다. 임상 및 실험 표준화 기관(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)에 의해 권장되는 미량 희석법(microdilution method)을 이용하여, 검사 균주들에 대한 항세균 활성을 측정하였다. 각 처리구의 연속 2배 희석으로 최종 농도가 0.25 ~ 128 ㎍/ml이 되도록 증류수를 이용하여 수행하였고, 증류수 첨가구를 음성 대조군으로 사용하였다. 세균들의 성장은 랩시스템(Labsystem) 사의 바이오스크린 C(Bioscreen C) 리더기를 이용하여 600 nm에서 모니터하였으며, 시험 미생물의 성장을 억제하는 브로스(broth) 배지에서 희석된 기존 항생제들 및 실시예 화합물의 최저 농도로서 항생제 최소 억제농도(MIC)를 결정하였다. 모든 분석은 적어도 세 번 이상 수행하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 실시예 화합물과 상용 아미노글리코사이드 항생제의 그람 음성 세균들에 대한 항세균 활성 결과
Figure pat00006

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 카나마이신 민감성인 대장균 2종과 카나마이신 내성인 녹농균 2종을 대상으로 한 항세균 활성 결과로부터 실시예 화합물 5종은 모두 기존의 상용 항생제들에 비하여 낮은 항세균 활성을 보여, 아미노글리코사이드의 유전 질환 치료제로의 임상 적용시 문제점 중 하나인 장내 상재 세균인 가스트로인테스티널 비오타에 대한 영향성을 극복할 수 있는 가능성을 보여주는 것으로 나타났다.
< 실험예 2> 실시예 화합물과 기존 항생제의 사람 세포주에 대한 세포 독성 비교
실시예 화합물 5종을 유전 질환 치료제로서 임상 적용시 또 다른 문제점인 신장 세포 독성에 대한 독성을 검정하기 위하여, 정상 신장세포주인 HEK293, 신장 근위세뇨관 세포주인 LLC-PK1 및 신장 상피세포주 A498을 대상으로 하여 MTT 방법으로 그 세포 독성을 확인하였다. 대조군으로는 현재 다수의 연구가 수행된 바 있는 아미노글리코사이드 항생제인 겐타마이신과 관련 반합성 항생제인 아미카신을 동일 농도로 사용하여 비교하였다. 우선, 검정용 3종의 사람 신장세포주, 즉 정상 신장세포주인 HEK293, 신장 근위세뇨관 세포주인 LLC-PK1 및 신장 상피세포주 A498을 활성화시켰다. 각각의 세포주를 DE 배지(DE medium)에 전 배양시킨 후, 원심 분리하고 T-플라스크에 분주하여 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 3일째에 실시예 화합물 각각을 최종 0.1 ~ 2.5 ppm 수준이 되도록 처리한 후, 2일간 추가 배양을 실시하였고, 필요할 경우 하루 간격으로 처리 세포주들을 분리하여 샘플링을 실시하였다. 각 처리구와 함께 대조구로서 그 독성이 보고된 바 있는 동일 농도의 겐타마이신 또한 동일하게 처리한 후, 최종 MTT로 정색 반응을 실시하여 각 세포주에 대한 개별 LD50를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 신장세포주인 HEK293의 경우 겐타마이신과 유사한 화학 구조를 지닌 화합물 4와 화합물 5는 겐타마이신 처리구의 LD50 수치와 유사한 세포 독성을 보이는데 비하여, 화합물 1, 화합물 2, 및 화합물 3은 낮은 세포 독성을 나타냈다. 또한, 신장 근위세뇨관 세포주인 LLC-PK1에 있어서도 유사한 결과가 도출되었다. 특히, 화합물 1과 3의 처리구는 대조구인 겐타마이신 처리구에 비하여 각각 2배 정도로 낮은 세포 독성을 나타내었다. 마지막으로, 신장 상피세포주를 대상으로 한 세포 독성 실험 결과에서, 화합물 2 처리구는 대조구에 비하여 높은 세포 독성을 보이는데 비하여 화합물 1과 화합물 3 처리구에서는 역시 2배 이상의 감소된 세포 독성을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 아미노글리코사이드의 유전 질환 치료제로의 임상 적용시 또 다른 문제점인 신장 독성을 극복할 수 있는 화합물로서 이용 가능성을 보여주는 것으로 나타났다.
< 실험예 3> 실시예 화합물과 기존 항생제의 무의미 통독 유도 활성 비교
실시예 화합물 5종에 대하여 시험관 내 및 생체 외 NRI 검정방법들을 실시함으로써 무의미 통독 유도 활성을 확인하였다. 우선, 무의미 돌연변이 코돈을 포함하고 있는 디스트로핀과 CFTR을 암호화하고 있는 유전자를 대장균에 각각 발현한 후, 발현된 단백질을 함유하는 대장균을 초음파 분해하여 무세포 추출물(cell-free extract)을 확보하였다. 여기에 화합물 5종을 최종 2.4, 3.6 및 4.8 ppm의 세 가지 구간으로 각각 30℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.1% 트리클로로아세트산(trichrolo acetic acid, TCA)으로 단백질을 침전시켰다. 이후, 침전된 단백질을 다시 트리스(tris) 완충액(pH 7.4)에 용해한 후, HPLC/ESI-MS 상에서 분리하여 크로마토그램 상에 나타난 피크를 알고리듬화 프로그램으로 디콘볼루션(deconvolution)시켜 그 단백질 크기를 확인하였다. 절단된 단백질과 완전길이 단백질의 피크 강도(intensity)를 계측하여 각 화합물의 무의미 통독 유도 활성을 검정하였다.
한편, 퇴행성 유전 질환자, 즉, 낭포성 섬유증 질환자로부터 적출한 세포주를 대상으로 하여 전 임상 초기 단계라 할 수 있는 생체 외 NRI 검정방법을 실시하였다. 이는 전술한 시험관 내 NRI 검정방법에 비하여 보다 구체적이고 임상에 근접한 데이터를 제공할 수 있는 방법이다. 우선, 낭포성 섬유증 유전 질환자 적출 세포주를 활성화시켰다. 즉 DE 배지에 전 배양시킨 후, 원심 분리하여 T-플라스크에서 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 3일째에 5종 각각의 화합물을 최종 2.4, 3.6 및 4.8 ppm의 세 가지 구간이 되도록 처리한 후, 2일간 추가 배양하였다. 각 처리구와 함께 대조구로서 그 활성이 보고된 바 있는 겐타마이신을 동일하게 처리하여 비교하였다. 처리구 및 대조구 시료들을 초음파 분해시킨 후, 원심 분리하여 그 상등액을 확보하였다. 각 처리구의 상등액에 0.1% 트리클로로아세트산을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 고속 냉장 원심 분리하여 침전된 단백질을 수거한 후, 이를 한번 더 트리스 완충액(pH 7.4)에 용해하였다. 상기 용해시킨 단백질을 HPLC/ESI-MS 상에서 분리하여 크로마토그램 상에 나타난 피크를 알고리듬화 프로그램으로 디콘볼루션시켜 그 단백질 크기를 확인하였다. 절단된 단백질과 완전길이 단백질의 피크 강도를 계측하여 각 화합물들의 무의미 통독 유도 활성을 검정하여 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타난 바와 같이, 동일한 농도(4.8 ug/ml) 수준으로 겐타마이신 대조군과 비교하여 무의미 통독 유도 활성이 비교 가능하거나 향상된 시험관 내 무의미 통독 유도 활성을 일부 화합물에서 확인할 수 있었다. 즉, 화합물 4와 화합물 5 처리구는 대조군인 겐타마이신 처리구에 비하여 낮은 무의미 통독 유도 활성을 보였고, 화합물 1과 2는 대조구와 유사한 무의미 통독 유도 활성을, 그리고 화합물 3은 대조군과 비교시 향상된 무의미 통독 유도 활성을 보여주었다. 한편, 생체 외 무의미 통독 유도 활성 비교시, 시험관 내 활성 검정 결과와 유사한 결과를 도출하였다. 즉, 2.4, 3.6 및 4.8 ug/ml 수준으로 처리시 화합물 4와 화합물 5 처리구는 대조군인 겐타마이신 처리구에 비하여 낮은 무의미 통독 유도 활성을 보였고, 화합물 2는 대조구와 유사한 무의미 통독 유도 활성을, 그리고 화합물 1과 화합물 3은 대조군과 비교시 향상된 무의미 통독 유도 활성 강도를 보여주었다. 이상의 결과에 의해, 실시예 화합물의 유전 질환 치료제로의 임상 적용 잠재성을 확인할 수 있었다.
실시예 화합물 5종(화합물 1 내지 화합물 5)에 대하여 하기와 같이 제제화하였다.
< 제제예 1> 정제(직접 가압)
화합물 1, 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈(USNF) 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.
< 제제예 2> 정제(습식 조립)
화합물 1, 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 800.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후, 이 용액의 적당량을 첨가하여 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후, 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.
< 제제예 3> 분말과 캡슐제
화합물 1, 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 캡슐제조기를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.
< 제제예 4> 주사제
활성 성분 100 mg에 만니톨 180 mg, Na2HPO412H2O 26 mg 및 증류수 2974 mg을 함유시켜 주사제를 제조하였다.
본 발명의 무의미 통독 유도 활성을 나타내는 당 부가 아미노글리코사이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 의해, 기존의 아미노글리코사이드 유전 질환 치료제 개발시의 문제점들을 극복하고, 신규 유전 질환 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> Glucose-attached aminoglycoside compounds, manufacturing method thereof and pharmaceutical compositions containing them as active ingredients <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 ggcatatgac cgagcctgcc aagggtg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 cggggtgggg ggactcgagg aggaccc 27

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    상기 식에서,
    R1은 NH2 또는 OH이고,
    R2는 H 또는 OH이고,
    R3은 H 또는 OH이고,
    R4는 NH2 또는 OH이고,
    R5는 H 또는 CH3이고,
    R6은 H, CH2CH3 또는
    Figure pat00008
    이고,
    X-Y는 CH-CH 또는 C=C이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은
    1) 3′-디옥시-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C,
    2) 1-N-3-아미노-2(S)-하이드록시프로피오닐-카나마이신 D,
    3) 6′-메틸-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 C,
    4) 3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B, 및
    5) 1-N-에틸-3′,4′-디디옥시-4′,5′-디하이드로-3″-디아미노-3″-하이드록시카나마이신 B로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항의 화합물을 포함하는, 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증(duchenne muscular dystrophy, DMD), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군(ataxia telangiectasia), 헐러 증후군(hurler syndrome), A형 혈우병(hemophilia A), B형 혈우병(hemophilia B), 및 테이-삭스 병(tay-sachs)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항의 화합물을 포함하는, 무의미 돌연변이형 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 또는 디스트로핀(dystrophin)에 대하여 무의미 통독 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항의 화합물 및 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  6. 1) 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine)을 포함하는 아미노글리코사이드 계열 항생제를 산 가수분해하여 의사이당체(pseudodisaccharides)를 얻는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 얻어진 의사이당체를 당전이 효소와 반응시켜 효소반응 산물을 얻는 단계
    를 포함하는 제1항 또는 제2항의 화합물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    3) 상기 2) 단계에서 얻어진 효소반응 산물을 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC) 방법으로 분리, 정제, 또는 분리 및 정제하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 2) 단계의 당전이 효소는 KanM2 또는 KanE인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 KanM2 또는 KanE는 대장균에서 발현된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 3) 단계에서 MPLC 유지 시간(Retention time)은 8 ~ 14 분인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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