KR20150122674A - 아데노바이러스의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 아데노바이러스의 제조 방법 및 당해 방법으로부터 수득가능한 바이러스에 관한 것이며, 당해 방법은 상기 세포를 지지하는데 적합한 배지의 존재하에 상기 아데노바이러스로 감염된 포유동물 세포를 배양함으로써 상기 바이러스가 복제하도록 하는 단계(여기서, 상기 세포는 바이러스 복제를 지지할 수 있다), 및 배양 기간의 말기에 배지로부터 아데노바이러스를 여과에 의해 분리하는 단계(여기서, 바이러스의 분리는 세포 용해 단계에 대해 후속적이지 않다)를 포함한다.

Description

아데노바이러스의 생산 방법{A PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ADENOVIRUS}

본 발명은 특정의 아데노바이러스, 예를 들면 키메라 아데노바이러스, 특히 복제 가능한 아데노바이러스, 및 이로부터 수득된 바이러스 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.

현재, 약제 분야는 사람용 치료제로서 바이러스의 잠재능력을 실현하려는 상태에 있다. 지금까지, ONXY-15(제조원: ONYX Pharmaceuticals 및 Shanghai Sunway Biotech에서 획득)는 제한된 수의 국가에서 두경부암에서 사용하도록 승인되어 있다. 그러나, 임상에서 현재 다수의 바이러스가 존재하며, 이는 바라건대 이들 중 일부가 사람에서 사용하기 위해 등록되어 있어야 한다.

다수의 바이러스 치료요법은 아데노바이러스를 기본으로 하는데, 예를 들어, ColoAd1은 결장직장암의 치료를 위한 임상 시험에서 현재 키메라 종양분해성(oncolytic) 아데노바이러스(제WO 2005/118825호)이다.

이들 아데노바이러스계 치료제는 등록 후 및 우수 의약품 제조관리기준(good manufacturing practice: GMP)에 부합하는 조건 하에서 임상 시험 및 요구 둘 다를 뒷받침하는데 적합한 양으로 제조될 필요가 있다.

제조 공정의 일부로서, 바이러스는 시험관내 포유동물 세포내에서, 예를 들면, 세포 현탁 배양물 속에서 증식된다. 바이러스는 이들 세포로부터 세포 용해(cell lysis) 및 후속적인 정제에 의해 회수된다. 도 1은 GMP 등급의 아데노바이러스의 제조에 관여된 공정의 개략도를 나타내는 문헌[참조: Kamen & Henry 2004 (J Gene Med. 6: pages 184-192)]으로부터의 추출물이다. 주목하게도, 바이러스 복제 후, 세포는 용해된다.

용해 후 세포로부터 DNA의 오염은 유의적인 문제이며 치료학적 아데노바이러스 생성물로부터 가능한한 멀리 제거되어야만 한다. 이는 세포를 용해하고, 세포 현탁액 속에서 DNA를 단편화하거나 침전시키고 이를 정화시켜, 접선 유동을 사용함을 기술하고 있는 국제 특허출원 제WO 2011/045381호에 상세히 기술되어 있다. DNAse를 사용한 DNA 분해는 또한 도 1에서 제3 단계로서 나타나 있다.

아데노바이러스의 GMP 제조 분야에서 많은 작업이 Ad5에 대해 수행되어 왔다. 선행 기술은, 배취 과정(batch process)의 경우 최대 바이러스 역가가 감염 후 약 40시간에서 달성되며 이후 세포 사멸이 일어나기 시작함을 나타낸다. 또한, 생산된 바이러스 활성의 척도인, 바이러스 감염성에 있어서의 감소에 대한 관심은 일반적으로 어떠한 GMP 공정에서도 공정 시간을 최소로 유지시킴에 의해 초점이 맞춰져 있다.

간단히 말해서, 성공적인 재조합체 아데노바이러스 과정을 개발하는 것은 기본적인 숙주 세포주 생리학 및 물질대사; 재조합체 바이러스, 및 세포주와 바이러스 사이의 상호작용의 상세한 이해를 필요로 한다. 필수적으로 당해 과정은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 특수한 유형에 따른 조정을 필요로 한다.

놀랍게도 본 발명자들은, 키메라 종양분해성 아데노바이러스가 세포 배지로부터 바이러스를 분리하고 세포를 용해시킬 필요성을 제외시킴으로써 바이러스 생성물에서 DNA 오염의 출발 수준을 유의적으로 감소시키는 공정에 의해 제조될 수 있음을 확립하였다.

발명의 요약

따라서, 본 기재내용은 E2B 영역을 포함하는 게놈을 지닌 키메라 종양분해성 아데노바이러스의 제조 방법을 제공하며, E2B 영역은 제1의 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원한 핵산 서열 및 제2의 명백한 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원한 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2의 혈청형은 아데노바이러스 소그룹 B, C, D, E 또는 F로부터 각각 선택되며, 상기 제조 방법은

a. 포유동물 세포를 지지하는데 적합한 배지의 존재하에서 상기 아데노바이러스로 감염된 상기 포유동물 세포를 배양시켜 상기 바이러스가 복제하도록 하는 단계(여기서, 상기 세포는 바이러스 복제를 지지할 수 있다), 및

b. 배양 기간의 말기에 배지로부터 단계 a)로부터의 바이러스를 여과에 의해 분리하는 단계(여기서, 상기 바이러스의 분리는 세포 용해 단계에 대해 후속적이지 않다)를 포함한다.

또한, 본 기재내용은 소그룹 B의 섬유 및 헥손(예를 들면, Ad11, 특히 슬로비츠키(Slobitski) 균주로 또한 공지된 Adllp)을 지닌 아데노바이러스의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은

a. 포유동물 세포를 지지하는데 적합한 배지의 존재하에 상기 아데노바이러스로 감염된 포유동물 세포를 배양시켜 상기 바이러스가 복제하도록 하는 단계(여기서, 상기 세포는 바이러스 복제를 지지할 수 있다), 및

b. 배양 기간의 말기에 배지로부터 단계 a)로부터의 바이러스를 여과에 의해 분리하는 단계(여기서, 바이러스의 분리는 세포 용해 단계에 대해 후속적이지 않다)를 포함한다.

일 구현예에서, 바이러스는 복제 가능하거나 복제 결핍성이다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 결실된 E3 영역 중의 일부 또는 모두를 갖는다.

놀랍게도, 본 발명자들은 또한 상기 공정이 Ad11p와 같은 야생형 Ad11 바이러스로, 또한 Ad11p를 포함하는, Ad11로부터의 섬유 및 헥손을 갖는 바이러스로 성공적으로 확장될 수 있음을 발견하였다.

도 1은 GMP 등급 아데노바이러스의 제조에 관여된 공정의 개략도를 나타내는 문헌[참조: Kamen and Henry 2004 (J Gene Med. 6: S184-192)으로부터의 추출물이다.
도 2는 MOI 10에서 감염된 현탁액 HEK293의 세포 및 상층액(SN)과 관련된 감염성 ColoAd1 입자의 비율을 나타낸다.
도 3은 MOI 10(다중 감염도 10)에서 감염된 부착성 HEK293의 세포 및 상층액(SN)과 관련된 감염성 ColoAdl 입자의 비율을 나타낸다.
도 4는 감염 조건 시험에서 현탁액 HEK293 배양물의 총 바이러스 입자의 양을 나타낸다.
도 5는 감염 후 40시간, 46시간 및 70시간째에 ColoAd1 감염된 HEK293 세포의 세포 용해물(Lysate) 또는 상층액(SN)에서 세포 및 바이러스 DNA의 가시화를 나타낸다.
도 6 A - 바이러스 분포(CVL 또는 상층액),
B - 총 바이러스 생산(vp/세포) 및
C - ColoAdl에 대한 감염 후 각각의 시점에서 세포 생존능력력.
도 7 A - 바이러스 분포(CVL 또는 상층액),
B - 총 바이러스 생산(vp/세포), 및
C - NG135에 대한 감염 후 각각의 시점에서 세포 생존능력력.
도 8 A - 바이러스 분포(CVL 또는 상층액),
B - 총 바이러스 생산(vp/세포), 및
C - NG76에 대한 감염 후 각각의 시점에서 세포 생존능력력.
도 9 A - 바이러스 분포(CVL 또는 상층액),
B - 총 바이러스 생산(vp/세포) 및
C - 야생형 Ad5의 감염 후 각각의 시점에서 세포 생존능력력.
도 10 A - 바이러스 분포(CVL 또는 상층액),
B - 총 바이러스 생산(vp/세포) 및
C - 야생형 Ad11p의 감염 후 각각의 시점에서 세포 생존능력력.
본원에 사용된 것으로서 NG135는 삽입된 전이유전자를 지닌 ColoAdl 바이러스의 유도체를 말한다. 전이유전자는 완전한 길이의 항체이다. NG135는 첨가된 전이유전자 카세트를 지닌 서열 번호 1이다. 본원에 사용된 것으로서 NG76은 삽입된 전이유전자를 지닌 ColoAdl 바이러스의 유도체를 말한다. 전이유전자는 ScFv 항체 단편이다. NG76은 첨가된 전이유전자 카세트를 지닌 서열번호 1이다.

본 개시내용의 상세한 설명

본원에 사용된 것으로서 키메라 종양분해성 바이러스(oncolytic virus)의 제조 방법은, 바이러스를 복제하여 바이러스 입자의 수를 증가시키는 공정을 말한다. 특히, 제조는 충분한 수의 바이러스 입자를 제공하여, 예를 들면, 1 내지 9 xlO⁸　내지 1 내지 9 xlO¹⁵개의 바이러스 입자, 특히 1 내지 9 x 1O¹⁰　또는 1 내지 9 x 10¹⁵　바이러스 입자의 범위와 같이, 1 내지 9 x 10⁵　내지 1 내지 9 x 10²⁰ 이상의 범위의 입자가 10L의 배취로부터 생산될 수 있는 치료학적 생성물을 제형화하는 것이다.

본원에 사용된 것으로서 'E4 영역의 일부가 결실된'은, E4 영역의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97 또는 98%와 같이, E4의 영역의 1 내지 99%의 범위의 적어도 일부가 결실됨을 의미한다.

본원에 사용된 것으로서 "로부터 기원한"은, 예를 들면, DNA 단편이 아데노바이러스로부터 취해지거나 아데노바이러스에서 원래 발견된 서열에 상응하는 경우를 말한다. 당해 언어는, 당해 서열이 어떻게 수득되는, 예를 들면, 본 개시내용에 따라 바이러스에서 사용된 서열이 합성될 수 있는 방법을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

일 구현예에서, 유도체는 원래의 DNA 서열에 대해 이의 완전한 길이에 걸쳐 100% 서열 동질성을 가진다.

일 구현예에서, 유도체는 원래의 DNA 서열에 대해 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동질성 또는 유사성을 가진다.

일 구현예에서, 유도체는 원래의 DNA 서열에 대해 엄중한 조건(stringent condition) 하에서 하이브리드화된다.

본원에 사용된 것으로서, "엄중함"은 약 -50℃의 Tm(융점 온도)(프로브의 Tm의 5°이하)으로부터 약 20℃ 내지 25℃ 이하 Tm까지 범위에서 전형적으로 발생한다. 당해 분야의 숙련가에게 이해될 바와 같이, 엄중한 하이브리드화를 사용하여 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하거나 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "엄중한 조건"은 서열 사이에 적어도 97% 동질성과 같이 적어도 95%의 동질성이 존재하는 경우 하이브리드화가 일반적으로 발생할 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 본원에 사용된 "하이브리드화"는 "폴리뉴클레오타이드 가닥이 염기 쌍화(base pairing)를 통한 상보성 가닥(complementary strand)과 결합하는 임의의 공정"을 포함할 것이다(참조: Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

본원에 사용된 것으로서 "여기서 분리는 세포 용해 단계에 대해 후속적이지 않다"는, 제조 공정이 특수한 용해 단계를 포함하지 않는다는 사실을 말하기 위해 의도된다. 즉, 다시 말해서 조건이 배양물 속의 세포 모두 또는 대부분을 용해하도록 설계된 단계를 말한다. 예를 들면, 바이러스는 상층액으로부터 분리된다.

본원에 사용된 것으로서 대부분은 많은 부분, 예를 들면, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%를 말한다.

본원에 사용된 것으로서 "배양 기간의 말기에"는, 감염된 세포내 바이러스가 복제하도록 허용되는 기간의 말기를 말한다. 말기는 수거(harvesting)를 위해 선택된 시간에 선택된 지점을 말한다. 본원에 사용된 것으로서 말기는 한정적인 종점이 아니다. 일 구현예에서, 종점은 복제된 바이러스 또는 이의 유의적인 비율이 배지 또는 상층액내로 방출되기에 충분한 배양 기간을 수반하기 위해 선택된다. 일 구현예에서, 수거는 다수의 시점에서 일어나거나 이것이 개시된 후 진행된다.

유리하게도, 본 발명의 공정은, 세포 용해 단계가 회피해지므로 세포로부터 오염시키는 DNA의 보다 낮은 출발 농도로 인하여 바이러스의 하부스트림 공정(downstream processing)을 단순화시킬 수 있다. 이는 하부스트림 공정에 사용된 시약, 장치 및 시간이 감소될 수 있으므로 비용 절약을 초래할 수 있다. 이는 또한 오염시키는 DNA의 보다 낮은 말기 농도 및/또는 오염시키는 DNA의 큰 단편의 보다 낮은 농도와 함께 보다 큰 순도를 초래할 수 있다.

더욱이, 세포 효소에 대한 바이러스 노출은 세포 용해를 피함으로써 최소화되며, 이는 세포로부터 뉴클레아제와 같은 바이러스 잠재적인 분해생성물의 노출을 최소화한다. 이는 예를 들면, 감염성에 의해 측정된 바와 같이 보다 높은 바이러스 안전성 및/또는 효능을 초래할 수 있다.

세포 DNA를 분해하기 위한 벤조나제의 용도는 또한 바람직한 경우 회피해지거나 감소시킬 수 있으며, 이것이 유리할 수 있다. 특히, 벤조나제의 제거 및 잔류 벤조나제의 부재를 보여주기 위한 시험을 피할 수 있다.

흥미롭게도, 세포에서 배출 후 본 개시내용의 바이러스는 세포에 부착하지 않으므로 상층액으로부터 용이하게 회수될 수 있다. 이는 현재의 공정을 촉진시키는 본원에 기술된 종양분해성 바이러스의 특징적인 현상일 수 있다. 대조적으로, 야생형 Ad5는 세포에 부착하는 것으로 고려된다. 실제로, 결과들은, 실질적으로 야생형 Ad5, 바이러스 입자는 상층액에서 존재하지 않음을 나타낸다(참조: 도 9 및 표 6).

이론에 얽메일 필요없이, 일 구현예에서 세포로부터 배출되어 이에 부착하지 않는 능력은 키메라 E2B 영역과 관련될 수 있다.

일 구현예에서, 세포로부터 배출되는 능력은 소(small) 바이러스 게놈 및/또는 E4 및/또는 E3 영역내 부분적인 결실과 관련될 수 있다.

일 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스는 전이유전자를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 세포에 대한 부착성의 결여는 암용해 유전자의 헥손 및 섬유와 관련될 수 있다.

종양분해성 바이러스는, 암 세포를 우선적으로 감염시키고, 예를 들면, 암 세포의 용해에 의해 세포 사멸을 재촉하거나, 암 세포내에서 선택적으로 복제하는 것이다.

암 세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스는 정상의 건강한 세포와 비교하는 경우 암 세포를 감염시키는 보다 높은 비율을 나타내는 바이러스이다.

본 개시내용의 키메라 아데노바이러스는 종양 세포, 예를 들면, HT-29, DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48, 및 Colo320DM을 포함하는 결장 종양 세포주의 패널에서 이의 용해성 잠재능력을 시험함으로써 특수한 종양 유형에 대한 이의 선호도에 대해 평가할 수 있다. 어떠한 이용가능한 결장 종양 세포주로 이러한 평가를 위해 동등하게 유용할 수 있다.

전립샘 세포주는 DU145 및 PC-3 세포를 포함한다. 췌장 세포주는 Panc-1 세포를 포함한다. 유방 종양 세포주는 MDA231 세포주를 포함하고 난소 세포주는 OVCA-3 세포주를 포함한다. 조혈 세포주는 Raji 및 Daudi B-림프구 세포, K562 적아세포종 세포, U937 골수종 세포, 및 HSB2 T-림프구 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 이용가능한 종양 세포주도 동등하게 유용하다.

비-키메라성인 것, 예를 들면, Ad11p와 같은 Ad11을 포함하는 종양분해성 바이러스가 이들 세포주에서 유사하게 평가될 수 있다.

암 세포내에서 선택적으로 복제하는 바이러스는 p53 유전자와 같이 암 세포내에서 복제하기 위해 상향조절된 유전자 또는 단백질을 필요로 하는 것이다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스는 세포자멸사적이며, 이는 프로그램화된 세포 사멸(programmed cell death)을 촉진한다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스는 세포용해성이다. 본 개시내용의 키메라성 종양분해성 아데노바이러스의 세포용해 활성은 대표적인 종양 세포주 및 표준(즉, 1의 효능으로 제공됨)으로서 사용되는 소그룹 C, 바람직하게는 Ad5에 속하는 아데노바이러스를 사용하여, 효능의 척도로 전환시킨 데이타에서 측정될 수 있다. 세포용해 활성을 측정하기 위한 적합한 방법은 MTS 검정이다(참조: 본원에 참조로 포함된 제WO 2005/118825호의 도 2, 실시예 4).

일 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 종양분해성 아데노바이러스는 세포 괴사를 유발한다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스는 암 세포에 대해 향상된 치료학적 지수를 갖는다.

"치료학적 지수" 또는 "치료학적 윈도우(therapeutic window)"는 정상(즉, 비-암성) 세포주에서 동일한 아데노바이러스의 잠재능력에 의해 관련 암 세포주에서 키메라 종양분해성 아데노바이러스의 잠재능력을 나누어 측정될 수 있는 제공된 아데노바이러스의 종양분해성 잠재능력을 나타내는 수를 말한다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스는 결장암 세포, 유방암 세포, 두경부 암, 췌장암 세포, 난소암 세포, 조혈 종양 세포, 백혈병 세포, 신경교종 세포, 전립샘 암세포, 폐암 세포, 흑색종 세포, 육종 세포, 간암 세포, 신장암 세포, 방광암 세포 및 전이성 암 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 암 세포에서 향상된 치료학적 지수를 갖는다.

본원에 사용된 것으로서 키메라 종양분해성 아데노바이러스는 적어도 2개의 병백한 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원한 DNA 서열을 갖는 E2B 영역을 포함하는 아데노바이러스를 말하며, 여기서 바이러스는 종양분해성이다.

현재 약 56개의 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 표 1은 아데노바이러스 혈청형의 구분을 나타낸다:

E2B 영역은 아데노바이러스에서 공지된 영역이며 바이러스 게놈의 약 18%를 나타낸다. 이는 단백질 IVa2, DNA 폴리머라제 및 말단 단백질을 암호화하는 것으로 고려된다. Ad11의 슬로비츠키(Slobitski) 균주(Ad11p로 언급됨)에서 이들 단백질은 게놈 서열내에서 5588 내지 3964번, 8435 내지 5067번 및 10342 내지 8438번 위치에서 각각 암호화되며 E2B 영역은 10342 내지 3950번 위치로부터 진행된다. E2B 영역의 정확한 위치는 다른 혈청형에서 변할 수 있으나 기능은, 이들이 모두 동일한 일반적인 조직을 가지므로 지금까지 시험된 모든 사람 아데노바이러스 게놈에서 보존되어 있다.

일 구현에에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 소그룹 B 헥손을 갖는다.

일 구현에에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 A11p 헥손과 같은 Ad11 헥손을 갖는다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 소그룹 B 섬유를 갖는다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 하나의 바이러스는 Ad11p 섬유와 같은, Ad11 섬유를 갖는다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 동일한 혈청형, 예를 들면 Ad11와 같은 소그룹 B 아데노바이러스, 특히 Ad11p로부터의 섬유 및 헥손 단백질을 갖는다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 동일한 혈청형, 예를 들면, Ad11p의 게놈 서열의 30811 내지 31788번, 18254 내지 21100번 및 13682 내지 15367번 위치에서 발견된, 동일한 혈청형, 예를 들면, Ad11, 특히 Ad11p로부터의 섬유, 헥손 및 펜톤 단백질을 갖는다.

제1 바이러스에 대한 명백한 혈청형의 바이러스는 동일한 소그룹 또는 상이한 소그룹으로부터 존재할 수 있지만 항상 상이한 혈청형으로부터 존재할 것이다. 일 구현예에서, 당해 조합은 다음과 같다(제1의 Ad 혈청형: 제2의 Ad 혈청형): AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, BB, BC, BD, BF, BG, CC, CD, CE, CF, CG, DD, DE, DF, DG, EE, EF, EG, FF, FG 및 GG.

일 구현예에서, 키메라 E2B 영역은 Ad3 및 Ad11(특히 Ad11p)로부터 기원한다.

일 구현예에서, E2B 영역은 본원의 서열 번호 2에 나타낸 서열이다.

포유동물 세포는 포유동물로부터 기원한 세포이다. 일 구현예에서, 포유동물 세포는 HEK, CHO, COS-7, HeLa, Viro, A549, PerC6 및 GMK, 특히 HEK293을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 세포는 부착성 또는 현탁 배양물, 특히 현탁 배양물 속에서 성장한다.

본원에 사용된 것으로서 포유동물 세포를 배양하는 것은, 세포가 생체외에서 조절된 조건하에 성장하는 공정을 말한다. 적합한 조건은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 37℃와 같은 온도를 포함할 수 있다. C0₂　수준은 조절될, 예를 들면, 5% 수준에서 유지되도록 조절될 필요가 있을 수 있다. 이의 세부사항은 문헌[참조: the text Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques and Specialised Applications Edition Six R. Ian Freshney, Basic Cell Culture (Practical Approach) Second Edition Edited by J.M. Davis]에 제공된다.

일반적으로, 세포는 아데노바이러스에 의한 감염 전에 충분한 수를 생성하기 위해 배양될 것이다. 이들 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있거나 발표된 프로토콜 또는 문헌에서 용이하게 이용가능하다.

일반적으로, 세포는 시판 규모, 예를 들면, 5L, 10L, 15L, 20L, 25L, 30L, 35L, 40L, 45L, 50L, 100L, 200L, 300L, 400L, 500L, 600L, 700L, 800L, 900, 1000L 또는 유사한 상업적 규모에서 배양될 것이다.

포유동물 세포를 배양하는데 적합한 배지는 EX-CELL^®배지(제조원: Sigma-Aldrich), 예를 들면, HEK293 세포용의 EX-CELL^® 293 혈청 유리된 배지(free medium), CHO 세포용의 EX-CELL^®　ACF CHO 혈청 유리된 배지, CHO 세포용의 EX-CELL^®　302 혈청 유리된 배지, EX-CELL CD 가수분해물 융합 배지 보충물(제조원: Lonza RMPI)[예를 들면, HEPES 및 L-글루타민이 들어있는 RMPI 1640], L-글루타민이 들어있거나 들어있지 않은 RMPI 1640, 및 울트라글루타민(UltraGlutamine)이 들어있는 RMPI 1640, MEM 및 DMEM, SFMII 배지를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 배지는 혈청 유리된 배지이다. 이는 규제 기관에 의한 제조 공정의 등록을 용이하게 하므로 유리하다.

키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 Ad5와 같은 벡터로서 사용된 아데노바이러스의 특성과는 상이한 특성을 가지며, 이는, 이들이 세포 용해의 필요성 없이 배지로부터 회수될 수 있다는 사실을 포함한다. 따라서, 이론에 얽메일 필요없이, 바이러스는 세포로부터 배출되는 메카니즘을 가지는 것으로 여겨진다.

또한, 키메라 종양분해성 아데노바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 이를 배출한 후 세포와 연합하거나 이에 부착하는 것으로 여겨지지 않으며, 이는 또한, 특히 세포 배양 조건이 최적화되는 경우, 상층액으로부터의 회수를 촉진한다.

또한 배양 공정이 70시간 이상 연장되는 경우에도, 키메라 종양분해성 바이러스는 분해되는 것으로 여겨지지 않는다. 바이러스의 분해는 바이러스의 감염성을 검정함으로써 점검될 수 있다. 바이러스의 감염성은, 바이러스 입자가 분해되면서 감소한다.

일 구현예에서 배양 기간은 30 내지 100시간, 예를 들면, 35 내지 70시간, 예를 들면, 40, 45, 50, 55, 60 또는 65 시간의 범위이다.

일 구현예에서, 배양 시간은 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 시간 이상이다.

일 구현예에서 키메라 종양분해성 바이러스의 90% 이상, 예를 들면, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%, 예를 들면, 95% 이상, 특히 98% 이상이 64시간 시점에서 상층액 속에 존재한다.

일 구현예에서 유의적인 양의 바이러스가 38시간 후 배지 속에 존재한다. 예를 들면, 50% 이상, 특히 70% 이상의 바이러스가 38시간 후 배지 속에 존재한다.

일 구현예에서 최대의 총 바이러스 생산은 감염 후 약 40 내지 60시간째에, 예를 들면, 감염 후 49시간째에 달성된다. 일 구현예에서, 최대 이후 바이러스 생산에 있어서의 감소는 느리다.

일 구현예에서 최대의 총 바이러스 생산은 감염 후 약 70 내지 90시간째에 달성된다.

놀랍게도, 본 발명자는, 당해 과정을 사용하는 경우, 세포가 감염 후 90시간이상 동안 높은 생존능력(예를 들면, 80 내지 90% 생존능력)을 유지함을 발견하였다. 따라서, 일 구현예에서, 수거 및 공정은, 세포가 생존하고 있는 한 지속될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서 최대의 총 바이러스 생산은 세포당 생산된 바이러스 입자의 총 수를 의미하며 상층액 및 세포 속의 바이러스 입자를 포함한다.

일 구현에에서, 감염 후 49시간째에 ColoAd1에 대한 상층액 속의 바이러스 생산은 세포당 약 20000 내지 30000개 바이러스 입자(vp/세포)이다. 예를 들면 26000 vp/세포이다.

일 구현예에서, 감염 후 49시간째에 NG135에 대한 상층액 속의 바이러스 생산은 약 20000 내지 30000vp/세포, 예를 들면 26000 vp/세포이다.

일 구현예에서 감염 후 49시간째에 NG76에 대한 바이러스 생산은 약 6000 내지 10000 vp/세포, 예를 들면 8000 vp/세포이다.

일 구현예에서, 64시간 시점, 즉, 64시간 후 CVL 펠렛 속에 10% 미만의 검출가능한 바이러스, 예를 들면, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1%의 검출가능한 바이러스가 존재한다. 실시예 6은, CVL가 수득되었던 방법을 기술한다.

본원에 사용된 것으로서 CVL은 조(crude) 바이러스 분해물을 의미한다.

세포를 배양하는 것은 관류 배양(perfusion culture), 공급 배취 배양, 배취 배양, 정상상태 배양(steady state culture), 연속 배양 또는 기술적으로 적절한 이들 중의 하나 이상의 조합, 특히 관류 배양을 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 당해 공정은 관류 공정, 예를 들면, 연속식 관류 공정이다.

일 구현예에서, 배양 공정은 하나 이상의 배지 교환을 포함한다. 이는 세포 성장, 수율 또는 유사의 것을 최적화하는데 유리할 수 있다. 배지 변화를 사용하는 경우, 이는 교환되는 배지로부터 바이러스 입자를 회수하는데 필수적일 수 있다. 이들 입자는 주 바이러스 배취와 조합되어 바이러스의 수율이 최적화되는 것을 보장할 수 있다. 유사한 기술을 또한 바이러스 회수를 최적화하기 위한 관류 공정의 배지와 함께 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 배양 공정은 배지 교환 단계를 포함하지 않는다. 이는, 바이러스 입자가 소실되지 않을 것이므로 수율을 최적화시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다.

일 구현예에서, 배양 공정은 하나 이상의 세포 첨가 또는 변화를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 세포 첨가 변화는 세포중의 일부 또는 모두를 보충하고 사멸한 세포를 임의로 제거함을 말한다.

일 구현예에서, 배양 동안 키메라 종양분해성 아데노바이러스는 세포당 20 내지 150개 입자(ppc) 범위, 예를 들면, 40 내지 100ppc, 특히 50ppc의 농도이다.

1OOppc 미만, 특히 50ppc와 같은, 보다 낮은 값의 바이러스 농도가, 특히 세포 생존능력이 수거 전에 측정되는 경우, 보다 높은 바이러스 농도를 사용한 배양물과 비교하여 증가된 세포 생존능력을 초래할 수 있으므로 유리할 수 있다.

낮은 세포 생존능력은 효소에 세포를 노출시킬 수 있는 세포 용해를 초래할 수 있으며, 이 시간을 사용하여 바이러스를 공격할 수 있다. 그러나, 세포 배양과 같은 역학적 공정에서, 세포의 작은 퍼센트와 같은 퍼센트는 의미가 없을 수 있다. 이는 일반적으로 실제 유의적인 문제를 유발하지 않는다.

일 구현예에서, 세포 생존능력은 ColoAd1으로 감염시킨 경우 공정 동안, 예를 들면 96 시간 시점(즉, 감염 후 96시간)에서 약 85 내지 95%, 예를 들면, 90% 생존능력이다.

일 구현예에서, 세포 생존능력은 NG76으로 감염시킨 경우 공정 동안, 예를 들면 96 시간 시점(즉, 감염 후 96시간)에서 약 80 내지 90%, 예를 들면, 83% 생존능력이다.

일 구현예에서, 세포 생존능력은 NG135로 감염시킨 경우 공정 동안, 예를 들면 96 시간 시점(즉, 감염 후 96시간)에서 약 80 내지 90%, 예를 들면, 85% 생존능력이다.

일 구현예에서, 세포 생존능력은 Ad11로 감염시킨 경우 공정 동안, 예를 들면 96 시간 시점(즉, 감염 후 96시간)에서 약 80 내지 90%, 예를 들면, 85% 생존능력이다.

일 구현예에서, 배지 및/또는 세포는 보충물이거나 주기적으로 보충된다.

일 구현예에서, 세포는 공정 동안, 예를 들면, 별개의 시점 또는 시점들 또는 연속적으로 수거된다.

공정의 일 구현예에서, 포유동물 세포는 1 내지 9 x 10⁴　vp/ml 이상, 예를 들면, 1 내지 9 x 10⁵, 1 내지 9 x 10⁶, 1 내지 9 x 10⁷, 1 내지 9 x 10⁸, 1 내지 9 x 10⁹, 특히 1 내지 5 x 10⁶　vp/ml 또는 2.5 내지 5 x 10⁸　vp/ml의 출발 바이러스 농도로 감염된다.

본 공정의 일 구현예에서, 포유동물 세포는 약 1 내지 200ppc, 예를 들면 40 내지 120ppc, 예를 들면, 50ppc에서 1x10⁶개의 세포/ml의 출발 농도에서 감염된다.

본원에 사용된 것으로서 ppc는 세포당 바이러스 입자의 수를 말한다.

일 구현예에서, 상기 공정은 약 35 내지 39℃, 예를 들면 37℃에서 수행한다.

일 구현예에서, 상기 공정은 약 4 내지 6% C0₂, 예를 들면 5% C0₂에서 수행한다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스 입자와 같은, 바이러스를 함유하는 배지는 세포를 제거하기 위해 여과되어 추가의 하부 프로세싱용 조 상층액을 제공한다.

일 구현예에서, 접선 유동 여과기가 사용된다.

일 구현예에서, 배지는 셀룰로즈계 심층 여과기가 장착된 Millipore's Millistak+^®　POD 시스템을 사용하여 여과된다. Millistak+^®　심층 여과기 배지는 규모가 조절가능한, 1회용 양식의 포드 여과기 시스템(Pod Filter System)에서 제공된다. 세포 배양을 포함하는, 광범위한 1차 및 2차 정화 적용이 이상적이다.

Millistak+^®　포드 여과기는 구체적인 적용 요구도를 충족시키기 위하여 3개의 명백한 계열의 배지 등급에서 이용가능하다. Millistak+^®　DE, CE 및 HC 배지는 구배 밀도 매트릭스뿐만 아니라 양성 표면 전하 특성을 통해 최적의 수행능을 전달한다. 일 구현예에서, 여과는 예를 들면, 펠리콘 미니 카세트 막 홀더(Pellicon Mini cassette membrane holder), 압력 센서, 혼합기가 장착된 10리터 들이 재순환 탱크, 보유물 유동 계량기, 저울, 공급물 펌프, 전달 펌프, 파이핑 및 밸브를 포함하는 Cogent™ M 시스템을 사용하는, 접선 유동 기술을 사용하여 수행된다. 시스템의 조절 및 작동은 반-자동 디아필트레이션(diafiltration)/농도를 제외하고는 수동이다. 작동기는 펌프 속도, 모든 밸브 및 작동 과정의 수동 조절을 갖는다. 바이러스는 또한 필요할 경우, 당해 단계에서 최종의 완충액으로 제형화될 수 있다.

따라서, 일 구현예에서 여과 단계에서, 농축되고 조건화된 아데노바이러스 물질은 최종의 또는 거의 근접한 최종의 제형으로 제공된다.

일 구현예에서, 당해 공정은 2개 이상의 여과 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 다운스트림 공정은 일련의 opticap XL 10 익스프레스(express) 0.5/0.2μm 막 여과기를 수반한 밀리스탁(Millistak)+POD 시스템 35 CE 및 50 CE 카세트를 포함한다.

일 구현예에서, 당해 공정은 CsCl 구배, 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 특히 음이온-교환 크로마토그래피, 및 이의 조합과 같은 크로마토그래피 단계로부터 선택된 정제 단계를 추가로 포함한다.

이온 교환 크로마토그래피는 DNA에 매우 강력하게 결합하며 전형적으로 어떠한 잔류 DNA도 제거되는 장소이다. 이온 교환 수지/막은 바이러스와 DNA 둘 다에 결합하며 염 구배 용출 동안에 바이러스는 일반적으로 컬럼에서 우선 용출되며(저 염 구배) DNA는, DNA와 수지의 상호작용이 바이러스보다 더 강력하므로 훨씬 더 높은 염 농도에서 용출된다.

일 구현예에서, 크로마토그래피 단계 또는 단계들은 예를 들면, BIA Separations으로부터 이용가능한 모노리쓰 기술(monolith technology)을 사용한다.

일 구현예에서, Sartobind Q(4급 아민 막 정제 공정)을 정제 단계로서 사용한다.

일 구현예에서, Source Q RESIN가 정제 단계에서 사용된다.

일 구현예에서, Sartobind Q가 사용된 후 분리된 바이러스의 다운스트림 공정에서 Source Q RESIN가 사용된다.

일 구현예에서, Source Q는 정제 단계에서 사용된다.

일 구현예에서, 정제 후, 제조된 바이러스는 오염된 DNA의 80ng/mL 미만, 예를 들면, 60ng/mL 내지 lOng/mL이다.

일 구현예에서, 실질적으로 모든 오염되는 DNA 단편은 700개 이하의 염기쌍, 예를 들면 500bp 이하, 예를 들면, 200bp 이하이다.

일 구현예에서, 정제된 바이러스 생성물 속에서 잔류성 벤조나제 함량은 1ng/mL 이하, 예를 들면, 0.5ng/mL 이하이다.

일 구현예에서, 정제된 바이러스 생성물 속에서 잔류 숙주 세포 단백질 함량은, 특히 ELISA 검정으로 측정하는 경우, 20ng/mL 이하, 예를 들면 15ng/mL 이하이다.

일 구현예에서, 정제된 바이러스 생성물 속에서 잔류 트윈(residual tween)은 O.1mg/mL 이하, 예를 들면, 0.05mg/mL 이하이다.

일 구현예에서, 바이러스는 그룹 B 아데노바이러스, 예를 들면 Ad11로부터의 헥손 및 섬유를 가지며, 특히 여기서 바이러스는 ColoAd1이다.

일 구현예에서, 분리되어 정제된 ColoAd1이 제공되며, 여기서 오염되는 DNA 함량은 80ng/mL 미만이다.

ColoAd1은 제WO 2005/118825호에 기재되어 있으며 당해 바이러스에 대한 완전한 서열이, 본원에서, 즉 서열 번호 1로 제공된다.

대안의 키메라 종양분해성 바이러스는 OvAd1 및 OvAd2를 포함하며, 이는 제WO 2008/080003호에 기재되고 본원에 참조로 포함된 서열 번호 2 및 3 각각이다.

일 구현예에서, 바이러스는 복제 가능하다. 본원에 사용된 것으로서 복제 가능한 바이러스는 E1 영역(또한 패키징 세포주로서 언급됨)에 의해 암호화된 것과 같은, 필수적인 바이러스 단백질을 암호화하는 상보성 세포주의 보조가 없이 복제할 수 있는 바이러스 및 헬퍼 바이러스(helper virus)의 보조없이 복제할 수 있는 바이러스를 말한다.

일 구현예에서, 본 개시내용의 키메라 종양분해성 바이러스와 같은, 본 개시내용의 바이러스는 하나 이상의 전이유전자, 예를 들면, 치료학적 펩타이드(들) 또는 단백질 서열(들)을 암호화하는 하나 이상의 전이유전자를 포함한다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스는 적어도 하나의 전이유전자를 암호화한다. 적합한 전이유전자는 p53과 같은 자살 유전자; IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF 또는 G-CSF와 같은 사이토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 인터페론(예를 들면, IFN-알파 또는 베타와 같은 인터페론 I, IFN-감마와 같은 인터페론 II), TNF(예를 들면, TNF-알파 또는 TNF-베타), TGF-베타, CD22, CD27, CD30, CD40, CD120; 모노클로날 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 트라스투자마브, 세툭시마브, 파니투무마브, 페르투주마브, 에프라투주마브, 항-EGF 항체, 항-VEGF 항체 및 항-PDGF 항체, 항-FGF 항체를 포함한다.

자체가 종양 또는 면역 반응을 조절하기 위해 작용하고 치료학적으로 작용하거나, 이러한 분자의 활성을 직접 또는 간접적으로 억제하거나, 활성화시키거나 향상시키는 다양하고 상이한 유형의 전이유전자, 및 이의 조합이 예상된다. 이러한 분자는 단백질 리간드 또는 리간드의 활성 결합 단편, 항체(완전한 길이 또는 Fv, ScFv, Fab, F(ab)'₂ 또는 보다 작은 특이적인 결합 단편과 같은 단편), 또는 다른 표적-특이적인 결합 단백질 또는 펩타이드(예를 들면, 파아지 디스플레이 등과 같은 기술에 의해 선택될 수 있는 바와 같음), 천연 또는 합성의 결합 수용체, 리간드 또는 단편, 표적(예를 들면, siRNA 또는 shRNA 분자, 전사 인자)를 암호화하는 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 특이 분자를 포함한다. 분자는 이의 활성, 안전성, 특이성 등을 향상시키기 위한 다른 펩타이드 서열과의 융합 단백질 형태일 수 있다(예를 들면, 리간드는 면역글로불린 Fc 영역과 융합하여 이량체를 형성하고 안전성을 향상시키며, 수지 세포와 같은 항원을 제시하는 세포에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편(예를 들면, 항-DEC-205, 항-만노즈 수용체, 항-덱틴)에 융합될 수 있다. 전이유전자는 또한 예를 들면, "삽입체를 지닌 아데노바이러스"로 감염된 세포의 검출, 종양의 영상화 또는 림프구 및 림프절 등의 유출(draining)을 위해 사용될 수 있는 리포터 유전자(reporter gene)를 암호화할 수 있다.

일 구현예에서, 키메라 종양분해성 바이러스로 감염된 암 세포는 용해되어 전이유전자에 의해 암호화된 단백질을 포함할 수 있는 세포의 내용물을 방출한다.

일 구현예에서, 세포내에서 복제된 총 바이러스의 40 내지 93% 이상이 배지로부터 회수될 수 있는데, 예를 들면, 총 바이러스의 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 또는 92%가 회수될 수 있으며, 예를 들면, 총 바이러스의 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%가 회수될 수 있다.

일 구현예에서, 당해 공정은 cGMP 제조 공정과 같은 GMP 제조 공정이다.

일 구현예에서, 당해 공정은 저장에 적합한 완충액 속에서 바이러스를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 본 개시내용은 본 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 바이러스 또는 바이러스 제형으로 확장된다.

세포 용해를 위해 공지된 방법은 MgCl₂　및 세제, 예를 들면, 1% 트윈-20을 함유하는 용해 완충액(pH 8.0)을 사용함을 포함한다. 세포 용해는 pH 또는 p0₂　조절없이 수행된다. 로킹(rocking) 및 가열이 사용된다. 용해는 1.5 내지 2시간 동안 지속된다.

동결-해동의 다수의 횟수는 또한 세포 용해의 통상의 방법이다.

벤조나제(제조원: Merck), 100 U/ml를 사용하여 숙주 세포 DNA를 분해한다. 벤조나제 처리는 +37℃에서 30분 동안 수행된다. 벤조나제는 실온에서 1시간 동안 높은 염 항온처리하여 중지한다.

풀모자임이 또한 세포 용해에 사용될 수 있다.

세포 용해를 위한 대안적인 방법은 세포 현탁액을 1000 x g에서, 10분 동안 4℃에서 원심분리함을 포함한다. 세포 펠렛(cell pellet)을 1ml의 Ex-세포 배지 5% 글리세롤 내로 재현탁시키고 펠렛으로부터 반응한 세포를 함유하는 튜브를 액체 질소 속에서 3 내지 5분 동안 동결시킴으로써 동결-해동에 의해 세포로부터 바이러스를 방출하고 +37℃ 수욕(water bath)에서 해동될 때까지 해동시킨다. 일반적으로, 해동 및 동결 단계는 2회 이상 반복한다. 당해 주기는 세포로부터 바이러스를 방출한다. 마지막 해동 단계 후 +4℃에서 20분 동안 1936 x g로 원심분리하여 세포 부스러기를 제거한다.

본 출원의 내용에서, 배지 및 배지들은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서의 내용에서, "포함하는(comprising)"은 "포괄하는(including)으로서 해석되어야 한다.

특정의 성분을 포함하는 본 발명의 국면은 또한 관련 성분으로 "이루어진" 또는 "필수적으로 이루어진" 대체 성분으로 확장되는 것으로 의도된다.

기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 구현예는 조합될 수 있다.

구현예들은 본원에서 특정의 특징/요소를 포함하는 것으로 기술된다. 본 개시내용은 또한 상기 특징/요소로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 구현예를 분리하기 위해 확장된다.

특허 및 특허출원과 같은 기술적 참조문헌은 본원에 참조로 포함된다.

본원에 구체적으로 그리고 명쾌하게 인용된 어떠한 구현예도 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 구현에와 함께 권리포기의 기준을 형성할 수 있다.

본 발명은 또한 첨부한 도면을 참조로 언급하는, 다음의 실시예에서 단지 예로써 추가로 기술된다.

실시예

실시예 1

현탁액 HEK293(lOOrpm에서 125mL들이 진탕 플라스크중 1 x 10⁶개의 세포/mL)을 MOI10에서 감염시키고 ColoAd1으로 감염 후 2시간 째에 CD293 배지를 공급하였다. 시료를 감염 후 6, 24, 30, 48, 54 및 78 시간째에 취하였다. 상층액을 세포로부터 원심분리에 의해 분리하고 세포 펠렛을 세포 용해 완충액 속에 재현탁시켰다. 세포 및 상층액 속의 감염성 ColoAd1 입자의 양을 면역염색 감염성 검정으로 측정하고 각각의 시점에서 전체의 비로서 나타낸다. N = 1, 오차 바아(SD)는 3회의 감염을 나타낸다. 결과는 도 2에 나타낸다.

실시예 2

부착성 HEK293(1mL의 24-웰 플레이트(well plate) 중 1 x 10⁶개의 세포/mL)를 MOI 10(2% FCS를 함유하는 배지)에서 감염시켰다. ColoAd1으로 감염 후 6, 24, 30, 48, 54, 72 및 78 시간째에 상층액을 제거하고, 세포를 세포 분해 완충액 속에서 재-현탁시키기 전에 표면으로부터 탈착시켰다. 세포 및 상층액과 관련된 감염성 ColoAd1 입자의 양을 면역염색 감염성 검정으로 측정하고 각각의 시점에서 총 비율로 나타낸다. N = 1, 오차 바아(SD)는 3회의 감염을 나타낸다. 결과는 도 3에 나타낸다.

실시예 3 HEK 293 현탁액 배양물 속에서 배양된 ColoAd1

종양분해성 바이러스 ColoAd1의 감염 조건을 소 규모 현탁액 HEK293 배양물 속에서 시험하였다. 세포를 감염 전 96시간 동안 Ex-세포 - 6mM L-글루타민 - 50 g/ml/50 lU/ml의 페니실린/스트렙토마이신을 사용하여 +37℃및 5% C0₂에서 배양하였다.

세포 계수를 부르커 세포 혈구계산기(Burker cell hemacytometer) 및 트립판 블루 염색(제조원: Invitrogen, 15250-061)을 사용하여 수행하였다. 보다 큰 희석(희석 인자 3 이상)을 위해 트립판 블루가 첨가된 세포 배양 배지를 사용하였다. 2개의 바이러스 희석액(세포당 50 및 100개 입자) 및 6개의 수거 시점(40, 43, 36, 49, 64, 및 70h)을 시험하였다. 모든 시험은 2개의 진탕 플라스크 속에서 수행하였다. 시료의 바이러스 입자 농도는 AEX-HPLC로 분석하고 결과는 표 3 및 4에 나타낸다.

[표 3] 감염 조건 시험에서 HEK239 현탁 배양물의 세포 시료의 AEX-HPLC 결과(세포내 바이러스 농도)

[표 4] 감염 조건 시험에서 배지 시료 및 HEK239 현탁 배양물의 총 세포내 및 세포외 바이러스 양의 AEX-HPLC 결과

세포를 70시간 동안 100ppc를 사용하여 감염시키는 경우 최대량의 바이러스 입자가 생산되었다(중복 플라스크의 평균 결과 1.05E+13vp, 표 4). 이 시점에서, 바이러스 입자의 93%는 배지 속에 존재하였다. 도 5로부터, 바이러스의 총량은 70시간까지 증가하였음을 알 수 있으나, 당해 곡선은 64시간 후 최고(plateu)에 도달하기 시작하는 것으로 여겨진다. 이미 43시간째에, 바이러스의 1/2 이상이 배양 배지 속에 존재하나, 현탁 생산 공정에서는 또한 배지 속의 바이러스 입자가 정제 동안에 포획될 수 있다. 70시간째에, 100ppc의 MOI는 50ppc보다 2.6E+12 더 많은 바이러스 입자를 생산하였다(및 64시간째에 2.8E+12 이상). 그러나 50ppc에서도, 세포의 생산 능력은 최대에 근접하는 것으로 여겨졌다: 세포내 바이러스 양은 40 내지 70시간의 시간 범위 동안 양호하게 일정하게 유지되었다.

실시예 4 부착성 HEK 293 세포 속에서 배양된 ColoAd1의 예

부착성 HEK293 세포를 185cm² 들이의 세포 배양 플라스크(24개 조작) 속에서 플라스크당 4.8 x lO⁶개 세포로 감염 72시간 전에 씨딩(seeding)하였다. 세포 배양을 DMEM - 10% FBS - 2mM L-글루타민을 사용하여 +37℃ 및 5% CO₂에서 수행하였다. 세포 수를 감염 당일에 1개의 세포 배양 플라스크로부터 계수하여 40.6 x 10⁶개의 세포/플라스크를 생성하였다. 세포당 시험한 입자(ppc)는 200, 100 및 50이었다. 감염 후 세포를 35 내지 70시간 동안 배양할 수 있다.

실시예 5 감염 후 40시간, 46시간 및 70 시간째에 ColoAd1 감염된 HEK293 세포의 세포 용해물 ( 용해물 ) 또는 상층액 ( SN ) 속에서 세포 및 바이러스 DNA의 가시화

세포 당 50개 입자에서 ColoAd1으로 감염된 HEK293 세포를 감염 후 40, 46 또는 70시간째에 수거하였다. 배양물 상층액 및 세포 용해물을 수집하고 총 DNA를 추출하였다. 동일한 용적의 정제된 용해물 또는 상층액 DNA를 0.7% 아가로즈 겔 위에 2회 로딩(loading)하고 DNA를 전기영동으로 분리하였다. 유의적인 세포 DNA가 겔의 상부에서 그리고 세포 용해물로부터 추출된 DNA를 함유하는 모든 레인(lane) 중 도말표본(smear)으로서 검출될 수 있었으나, 매우 적은 수준의 세포 DNA 만이 상층액(SN)으로부터 추출된 DNA를 함유하는 레인에서 검출될 수 있었다. 대조적으로, 바이러스 DNA는 모든 시료에서 검출될 수 있었으며 전체의 검출가능한 바이러스 DNA는 시간에 따라 상층액 속에서 식별가능하게 증가하였다. 결과는 도 5에 나타낸다.

실시예 6

ColoAd1, NG-135, NG-76, Ad5 및 Adllp(도 및 표에서 Ad11으로서 언급됨)를 세포 펠렛과 관련된 또는 상층액 속에서 바이러스 입자(CVL)의 발현의 상대적인 수준에 대해 비교하였다.

[표 5] 바이러스의 총 아데노바이러스 입자 농도(HPLC 검정에 의함)

HEK293 세포(293f) 현탁액을 4mM L-글루타민 및 50㎍/ml/50IU/ml의 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 SFMII 배지의 40ml의 작업 용적을 함유하는 2개의 진탕 플라스크 속에서 배양하고 세포당 50개의 바이러스 입자(ppc)의 비에서 10⁶개 세포/ml로서 바이러스로 감염시켰다.

세포 확장을 1개 바이알의 세포를 해동시켜 개시하고 당해 연구를 위해 요구된 총 4.8 x 10⁶개의 세포가 달성될 때까지 3주 동안 세포 확장을 지속하였다. 감염 3일 전에, HEK 293 현탁액 세포를 4 x 10⁵개의 세포/ml를 사용하여 플라스크당 428ml의 SFMII 배지(3.4 x 10⁸개의 세포/플라스크) 속에서 단일의 1리터들이 진탕 플라스크 속에 씨딩하고 +37℃, 5% C0₂　& 115rpm에서 진탕 배양기 속에서 항온처리하였다.

감염일에, 세포 계수를 수행하고 세포 밀도를 기준으로 하여, 2.15 x 10⁶개의 세포/ml에서 225 ml의 세포 현탁액을 당해 연구에 사용하였다. 나머지 세포를 버렸다. HEK 293 현탁액 세포를 4개의 상이한 바이러스 중 하나(참조: 표 5)로 50ppc에서 2회 감염시켰다.

1:100 희석의 각각의 바이러스를 세포의 감염 전에 SFMII 성장 배지 속에서 수행하였다(바이러스 농도에 대해서는 표 5를 참조한다).

[표 6] 감염 전 바이러스의 감염 계산 및 희석

다음과 같은 희석된 바이러스를 사용한 현탁액 HEK293 세포의 감염:

2.15 x 10⁶에서 225ml의 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 펠렛을 480ml의 배지 속에 재현탁시켜 세포 농도를 1x10⁶개의 세포/ml로 조절하였다. 이후에, 진탕 플라스크당 40ml의 작업 용적이 들어있는 10개의 진탕 플라스크를 제조하였다. 이중 플라스크를 각각 ColoAd1-AlA2, NG 135-B1B2, NG 76-C1C2, Ad5-D1D2 및 Ad11E1E2로 표지하였다. 모든 표지된 플라스크를 표 6에 따라 50ppc의 바이러스로 감염시켰다. 모든 진탕 플라스크를 진탕 항온처리기 속에 +37℃, 5% C0₂　& 120rpm에서 수거될 때까지 두었다. 감염 후 40, 46, 49, 64, 70, 73 및 89 시간째에, 2.5ml의 시료를 각각의 플라스크로부터 취하고 중복물을 혼주(pooling)시켜 5.0ml의 시료를 제공하였다. 감염 후 96시간 째에, 모든 세포를 수거하였다. 세포 생존능력을 0.5ml를 사용하여 평가하고 나머지 4.5ml 용적을 이후에 원심분리하고 각각의 바이러스에 대해 상층액과 세포 펠렛 사이의 바이러스 분포를 다음 방식으로 측정하였다:

세포를 1000 x g에서, 10분 동안 4℃에서 원심분리하고,

원심분리 후, 상층액을 멸균 용기내로 온화하게 붓고 0.5ml의 50% 글리세롤을 시료에 가하고 1ml의 분취량을 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였으며,

세포 펠렛을 5% 글리세롤을 함유하는 1ml의 SFMII 배지 속에 현탁시키고,세포내 바이러스를 다음과 같이 동결-해동에 의해 세포로부터 방출시켰다:

원심분리 튜브를 액체 질소 속에서 3 내지 5분 동안 동결시킨 후 해동할 때까지 +37℃로 설정된 수 욕조로 이전시켰다.

동결 및 해동 공정을 상기 단계 a에서 기술한 바와 같이 2회 이상 반복하였다.

최종의 해동 단계 후, 세포 부스러기를 조 바이러스 용해물(CVL)로부터 1936 x g에서 20분 동안 +4℃에서 원심분리하여 제거하고 상층액(CVL)을 새로운 용기로 이전하였다.

CVL을 100μl의 시료로서 분취하여 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

조 바이러스 용해물(CVL) 및 상층액(SN) 시료로부터 전체 바이러스 입자 농도(vp)를 AEX-HPLC 검정으로 분석하였다. 이후에, 이들 값을 사용하여 배양물당 바이러스 입자의 총 수 및 각각의 시료 시점에 대해 SN 및 CVL에서의 퍼센트를 계산하였다. 이들은 도 6 내지 10에서 각각 ColoAd1, NG-135, NG-76, Ad5 및 Ad11p에 대해, HEK293 세포의 생존능력과 함께, 막대 그래프로서 나타낸다. ColoAd1, NG-135, NG-76 및 Ad11p의 경우 대부분의 바이러스는 배양 상층액 속에 존재한 반면, Ad5 바이러스의 경우에는 전적으로 세포 용해물(CVL) 속에 존재하여, 상층액 속에서 검출불가능하였다. 모든 배양물의 경우, HEK293 세포의 생존능력은 배양 96시간에 걸쳐 높게 남았다.

ColoAd1(도 6A)의 경우, 84%가 40시간 시점에서 상층액 속에 존재하였으며, 98%는 64시간 시점에 CVL(펠렛) 시료 속에서 검출가능한 바이러스 없이 상층액 속에 존재하였다.

Next Gen135(도 7A) 및 Next Gen 76(도 8A)의 경우 바이러스 분포의 경향은 ColoAd1과 유사하다. NG135의 경우, 77%의 바이러스가 40시간의 시점에서 상층액 속에 존재하였다. 이는 64시간의 시점에서 상층액 속에 존재하는 바이러스가 97%까지 증가하였다. 동일한 시점에 대해, Next Gen 76의 경우 56% 및 98%의 바이러스가 상층액 속에 존재하였다.

Ad11(도 10A)의 경우, 31%의 바이러스가 40시간의 시점에서 상층액 속에 존재하였으며, 88%가 64시간의 시점에 상층액 속에 존재하였고, 98%의 바이러스가 96시간의 시점에 각각 존재하였다.

Ad5(도 9A)의 경우, 100%의 바이러스가 CVL(펠렛) 속에 상층액에서 검출되는 바이러스 없이 검출되었다.

당해 연구에서 평가된 모든 바이러스의 경우, 최대 수준의 바이러스가 감염 후 49시간째에 관찰되었으며 후속적인 시점에서 이후 관찰된 바이러스 수준에 있어서 감소는 느렸다.

ColoAd1(도 6B) 및 NG135(도 7B)의 경우 최대 바이러스 수준(27000 vp/세포)이 49시간 시점에서 관찰된 반면, NG76(도 8B)에서는 최대 바이러스 수준(9200 vp/세포)이 동일한 시점에서 관찰되었다.

Ad5(도 9B)의 경우, 최대 바이러스 수준(11000 vp/세포)이 89시간 시점에서 관찰된 반면, Ad11p(도 10B)에서 최대 바이러스 수준(30000 vp/세포)이 동일한 시점에서 관찰되었다.

AEX-HPLC로 분석한 모든 상층액 및 CVL 시료의 전체 바이러스 입자 농도는 표 7 및 8 및 도 6 내지 10에 나타낸다.

[표 7] ColoAdl, NG135 및 NG76의 AEX-HPLC 검정 결과

[표 8] Ad5 및 Adll의 AEX-HPLC 검정 결과

<110> PsiOxus Therapeutics Limited <120> A Process for the Production of Adenovirus <130> P15-4130 <150> US 61/770513 <151> 2013-02-28 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ColoAd1 adenovirus genome <400> 1 tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60 aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120 ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180 gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240 aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300 tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360 ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420 ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480 tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540 tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600 aatctctgct gagactggaa atgaaatatt 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caccattcca tctataaggt atattatata gataga 32326 <210> 2 <211> 5287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ColoAd1 Chimeric E2B <400> 2 ctatggcatc tcgatccagc agacctcctc gtttcgcggg tttggacggc tcctggaata 60 gggtatgaga cgatgggcgt ccagcgctgc cagggttcgg tccttccagg gtctcagtgt 120 tcgagtcagg gttgtttccg tcacagtgaa ggggtgtgcg cctgcttggg cgcttgccag 180 ggtgcgcttc agactcatcc tgctggtcga aaacttctgt cgcttggcgc cctgtatgtc 240 ggccaagtag cagtttacca tgagttcgta gttgagcgcc tcggctgcgt ggcctttggc 300 gcggagctta cctttggaag ttttcttgca taccgggcag tataggcatt tcagcgcata 360 caacttgggc gcaaggaaaa cggattctgg ggagtatgca tctgcgccgc aggaggcgca 420 aacagtttca cattccacca gccaggttaa atccggttca ttggggtcaa aaacaagttt 480 tccgccatat tttttgatgc gtttcttacc tttggtctcc atgagttcgt gtcctcgttg 540 agtgacaaac aggctgtccg tgtccccgta gactgatttt acaggcctct tctccagtgg 600 agtgcctcgg tcttcttcgt acaggaactc tgaccactct gatacaaagg cgcgcgtcca 660 ggccagcaca aaggaggcta tgtgggaggg gtagcgatcg ttgtcaacca gggggtccac 720 cttttccaaa 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ttggatagca tcgcccccct ctgatacttg ctcgcacata 1620 gtcatatagt tcatgtgatg gcgctagcag ccccggaccc aagttggtgc gattgggttt 1680 ttctgttctg tagacgatct ggcgaaagat ggcgtgagaa ttggaagaga tggtgggtct 1740 ttgaaaaatg ttgaaatggg catgaggtag acctacagag tctctgacaa agtgggcata 1800 agattcttga agcttggtta ccagttcggc ggtgacaagt acgtctaggg cgcagtagtc 1860 aagtgtttct tgaatgatgt cataacctgg ttggtttttc ttttcccaca gttcgcggtt 1920 gagaaggtat tcttcgcgat ccttccagta ctcttctagc ggaaacccgt ctttgtctgc 1980 acggtaagat cctagcatgt agaactgatt aactgccttg taagggcagc agcccttctc 2040 tacgggtaga gagtatgctt gagcagcttt tcgtagcgaa gcgtgagtaa gggcaaaggt 2100 gtctctgacc atgactttga ggaattggta tttgaagtcg atgtcgtcac aggctccctg 2160 ttcccagagt tggaagtcta cccgtttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac 2220 atcattgaag agaatcttgc cggccctggg catgaaattg cgagtgatgc gaaaaggctg 2280 tggtacttcc gctcggttat tgataacctg ggcagctagg acgatctcgt cgaaaccgtt 2340 gatgttgtgt cctacgatgt ataattctat gaaacgcggc gtgcctctga cgtgaggtag 2400 cttactgagc tcatcaaagg ttaggtctgt ggggtcagat aaggcgtagt gttcgagagc 2460 ccattcgtgc aggtgaggat tcgctttaag gaaggaggac cagaggtcca ctgccagtgc 2520 tgtttgtaac tggtcccggt actgacgaaa atgccgtccg actgccattt tttctggggt 2580 gacgcaatag aaggtttggg ggtcctgccg ccagcgatcc cacttgagtt ttatggcgag 2640 gtcataggcg atgttgacga gccgctggtc tccagagagt ttcatgacca gcatgaaggg 2700 gattagctgc ttgccaaagg accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgagaaa 2760 gagcctttct gtgcgaggat gagagccaat cgggaagaac tggatctcct gccaccagtt 2820 ggaggaatgg ctgttgatgt gatggaagta gaactccctg cgacgcgccg agcattcatg 2880 cttgtgcttg tacagacggc cgcagtagtc gcagcgttgc acgggttgta tctcgtgaat 2940 gagttgtacc tggcttccct tgacgagaaa tttcagtggg aagccgaggc ctggcgattg 3000 tatctcgtgc tttactatgt tgtctgcatc ggcctgttca tcttctgtct cgatggtggt 3060 catgctgacg agccctcgcg ggaggcaagt ccagacctcg gcgcggcagg ggcggagctc 3120 gaggacgaga gcgcgcaggc tggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gactcaggtt 3180 agtaggcagt gtcaggagat taacttgcat gatcttttgg agggcgtgcg ggaggttcag 3240 atagtacttg atctcaacgg gtccgttggt ggagatgtcg atggcttgca gggttccgtg 3300 tcccttgggc gctaccaccg tgcccttgtt tttcattttg gacggcggtg gctctgttgc 3360 ttcttgcatg tttagaagcg gtgtcgaggg cgcgcaccgg gcggcagggg cggctcggga 3420 cccggcggca tggctggcag tggtacgtcg gcgccgcgcg cgggtaggtt ctggtactgc 3480 gccctgagaa gactcgcatg cgcgacgacg cggcggttga catcctggat ctgacgcctc 3540 tgggtgaaag ctaccggccc cgtgagcttg aacctgaaag agagttcaac agaatcaatc 3600 tcggtatcgt tgacggcggc ttgcctaagg atttcttgca cgtcaccaga gttgtcctgg 3660 taggcgatct ccgccatgaa ctgctcgatc tcttcctctt gaagatctcc gcggcccgct 3720 ctctcgacgg tggccgcgag gtcgttggag atgcgcccaa tgagttgaga gaatgcattc 3780 atgcccgcct cgttccagac gcggctgtag accacggccc ccacgggatc tctcgcgcgc 3840 atgaccacct gggcgaggtt gagctccacg tggcgggtga agaccgcata gttgcatagg 3900 cgctggaaaa ggtagttgag tgtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa atacatgatc 3960 catcgtctca gcggcatctc gctgacatcg cccagagctt ccaagcgctc catggcctcg 4020 tagaagtcca cggcaaaatt aaaaaactgg gagtttcgcg cggacacggt caactcctct 4080 tccagaagac ggataagttc ggcgatggtg gtgcgcacct cgcgctcgaa agcccctggg 4140 atttcttcct caatctcttc ttcttccact aacatctctt cctcttcagg tggggctgca 4200 ggaggagggg gaacgcggcg acgccggcgg cgcacgggca gacggtcgat gaatctttca 4260 atgacctctc cgcggcggcg gcgcatggtt tcagtgacgg cgcggccgtt ctcgcgcggt 4320 cgcagagtaa aaacaccgcc gcgcatctcc ttaaagtggt gactgggagg ttctccgttt 4380 gggagggaga gggcgctgat tatacatttt attaattggc ccgtagggac tgcacgcaga 4440 gatctgatcg tgtcaagatc cacgggatct gaaaaccttt cgacgaaagc gtctaaccag 4500 tcacagtcac aaggtaggct gagtacggct tcttgtgggc gggggtggtt atgtgttcgg 4560 tctgggtctt ctgtttcttc ttcatctcgg gaaggtgaga cgatgctgct ggtgatgaaa 4620 ttaaagtagg cagttctaag acggcggatg gtggcgagga gcaccaggtc tttgggtccg 4680 gcttgctgga tacgcaggcg attggccatt ccccaagcat tatcctgaca tctagcaaga 4740 tctttgtagt agtcttgcat gagccgttct acgggcactt cttcctcacc cgttctgcca 4800 tgcatacgtg tgagtccaaa tccgcgcatt ggttgtacca gtgccaagtc agctacgact 4860 ctttcggcga ggatggcttg ctgtacttgg gtaagggtgg cttgaaagtc atcaaaatcc 4920 acaaagcggt ggtaagctcc 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Claims (17)

1. E2B 영역을 포함하는 게놈을 지닌 키메라 종양분해성 아데노바이러스의 제조 방법으로서, 상기 E2B 영역은 제1의 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원한 핵산 서열 및 제2의 명백한 아데노바이러스 혈청형으로부터 기원한 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2의 혈청형은 아데노바이러스 소그룹 B, C, D, E 또는 F로부터 각각 선택되며, 상기 제조 방법은
   a. 포유동물 세포를 지지하는데 적합한 배지의 존재하에서 상기 아데노바이러스로 감염된 상기 포유동물 세포를 배양시켜 상기 바이러스가 복제하도록 하는 단계(여기서, 상기 세포는 바이러스 복제를 지지할 수 있다), 및
   b. 배양 기간의 말기에 배지로부터 단계 a)로부터의 바이러스를 여과에 의해 분리하는 단계(여기서, 상기 바이러스의 분리는 세포 용해 단계에 대해 후속적이지 않다)를 포함하는, 제조 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스가 그룹 B 아데노바이러스, 예를 들면, Ad11로부터의 헥손 및 섬유를 가지고, 여기서 상기 바이러스는 그룹 ColoAd1로부터 선택되는, 방법.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 바이러스가 복제 가능한, 방법.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 기간이 30 내지 100시간의 범위, 예를 들면, 35 내지 70시간의 범위인, 방법.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 관류 배양 (perfusion culture)단계, 공급 배취(fed batch), 배취, 특히 관류 배양 단계를 포함하는, 방법.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들이 부착성 또는 현탁 배양물 속에서, 특히 현탁 배양물 속에서 성장하는, 방법.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 HEK, CHO, HeLa, Viro, PerC6 및 GMK, 특히 HEK293을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
8. 청구항 1 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 5L 이상의 규모인, 방법.
9. 청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 동안의 바이러스가 40 내지 150ppc, 예를 들면, 50 내지 100ppc의 범위의 농도인, 방법.
10. 청구항 1 내지 청구항 9 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들이 1 내지 9 x 10⁴　vp/ml 이상의 출발 농도, 예를 들면, 1 내지 9 x 10⁵, 1 내지 9 x 10⁶, 1 내지 9 x 10⁷, 1 내지 9 x 10⁸, 1 내지 9 x 10⁹, 특히 4 내지 5 x 10⁶　vp/ml의 출발 농도로 감염되는, 방법.
11. 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 있어서, 종양분해성 바이러스의 분획을 제공하고, 상기 방법이 동일하거나 상이한 공정에 의해 제조된 종양분해성 바이러스의 제2 분획 또는 분획들이 상기 제1의 분획과 배합되도록 하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
12. 청구항 1 내지 청구항 11 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 GMP 제조 공정인, 방법.
13. 청구항 1 내지 청구항 12 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 여과기가 접선 여과기(tangential filter)인, 방법.
14. 청구항 1 내지 청구항 13 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 CsCl 구배, 이온-교환 크로마토그래피, 특히 음이온-교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계, 및 이의 조합으로부터 선택된 정제 단계를 추가로 포함하는, 방법.
15. 청구항 1 내지 청구항 14 중의 어느 한 항에 있어서, 전체 바이러스의 40 내지 93%가 상기 배지로부터 회수가능한 방법.
16. 청구항 1 내지 청구항 15 중의 어느 한 항에 있어서, 저장에 적합한 완충액 속에서 상기 바이러스를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
17. 청구항 1 내지 청구항 16 중의 어느 한 항에 기술된 상기 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 바이러스 또는 제형.
    

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