KR20150122645A

KR20150122645A - 비이온성 유기 폴리머들 및 전기양성 표면들의 존재에서의 단백질 정제

Info

Publication number: KR20150122645A
Application number: KR1020157021409A
Authority: KR
Inventors: 피터 스탠리 가그논
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2015-11-02
Also published as: US20160009759A1; CN105008383A; SG10201610955SA; US10112971B2; EP2961759A1; JP2016507588A; SG11201505203XA; WO2014133458A1; EP2961759A4

Abstract

제제로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법은, (a) 최초 생산 배지 내에 체류하는 약 5% 이하의 크로마틴을 가지는 형태로 상기 제제를 제공하는 단계를 포함하고, (b) 상기 제제를 비이온성 유기 폴리머 및 염과 접촉시키는 단계를 포함하며, 비이온성 유기 폴리머의 농도는 상기 원하는 단백질을 침전시키거나, 친수성 표면상에 부착을 야기하거나, 침전된 상태로 유지시키거나, 상기 친수성 표면상에 부착시키기에 충분하고, 상기 염 농도는 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분하며, (c) 선택적으로 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분한 염 농도의 존재에서, 상기 제제를 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 대한 산성 오염물들의 흡착을 방지하지 않으면서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 실질적으로 흡수되지 않는다.

Description

비이온성 유기 폴리머들 및 전기양성 표면들의 존재에서의 단백질 정제{PROTEIN PURIFICATION IN THE PRESENCE OF NONIONIC ORGANIC POLYMERS AND ELECTROPOSITIVE SURFACES}

여기에 개시되는 실시예들은 단일클론 항체들을 포함하는 항체들을 포함하여 단백질들의 정제를 위한 방법들에 관한 것이다.

본 출원은 2013년 2월 26일에 출원되었고, 여기에 개시 사항이 참조로 포함되는 미국 임시 특허 출원 제61/769,416호를 우선권으로 수반하는 출원이다.

폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온성 유기 폴리머들로의 단백질 정제의 기술은 알려져 있다. 이는 첨가된 염의 부존재에서 낮은 염 농도들에서 가장 흔히 이용되지만, 예외들이 알려져 있다(D. Gervais 등의 미국 특허 출원 공개 제2010/0204455호 A1; K. Ingham의 "Arch. Biochem. Biophys."(186 (1978) 106-113); K. Yamamoto 등의 "Virology"(40(1970) 734-744); S. Branston 등의 "Biotechnol. Progr."(28(2012) 129-136)).

입체 배제 크로마토그래피(steric exclusion chromatography)의 기술은 알려져 있다(J. Lee 등의 "J. Chromatogr. A"(1270(2012) 162-170); 또한 여기에 참조로 포함되고 부록 A에 부가된 PCT/SG2012/000199 참조). 이는 원하는 단백질의 유지가 PEG와 같은 비이온성 유기 폴리머에 의해 그 상부에 유도되는 비이온성의 친수성 표면들을 활용한다. 상승된 NaCl 농도들은 바이러스 결합 효율을 증가시키는 것으로 보고되었다(Lee 등 앞서의 문헌). NaCl의 상승된 농도의 존재에서 유동화된 입자들에 상기 기술을 수행하는 점은 IgG 제제들의 회수 및 순도를 증가시키는 것으로 보고되었다(P. Gagnon 등의 "J. Chromatogr. A"(2014, 1324, 171-180)).

음이온 교환 크로마토그래피가 알려져 있고, 단백질들의 정제를 위해 널리 이용된다. 이는 염들에 대하여 결핍되거나 부족한 수성 용액 내에 적용될 때에 단백질들이 자발적으로 그 상부에 결합되는 양성으로 대전된 표면들을 활용한다. PEG의 존재에서 음이온 교환 크로마토그래피의 수행이 알려져 있으며, 여기서 상기 PEG의 존재는 PEG의 부존재에서의 경우보다 높은 염 농도에서 다공성 입자 음이온 교환체들로 충전된 칼럼들로부터 단백질이 용리되게 하며, 여기서 상기 단백질이 커질수록, 상기 단백질을 용리하도록 요구되는 염 농도가 크게 증가한다(P. Gagnon 등의 "J. Chromatogr. A"(743 (1996) 51-55)).

단일클론 항체들을 함유하는 세포 배양 수확물들로부터 크로마틴의 함량을 감소시키기 위한 방법들은 기재되어 있다(H. Gan 등의 "J. Chromatogr. A"(1291 (2013) 33-40)). 크로마틴(chromatin)은 뉴클레오솜들(nucleosomes)로 알려진 안정한 연관들로 DNA 및 히스톤 단백질들을 포함하는 것으로 알려져 있다. Gan 등은 크로마틴과 이의 분해대사물들(catabolites) 또한 후속되는 분별 방법들의 효율을 제한하는 항체들과 연관들을 형성하는 점을 보고하였다. 이들은 99%의 크로마틴 감소를 구현하였던 방법들을 보고하였고, 이와 같은 감소가 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 얻어지는 정제의 품질을 향상시켰던 점을 더 보고하였다. Gan 등에 의해 보고된 기슬의 변화는 유동화된 친수성 입자들에의 입체 배제 크로마토그래피에 의해 분별되는 IgG의 회수와 순도를 향상시키기 위해 Gagnon 등(2013, 앞서의 문헌)에 의해 보고되었다.

본 발명은 비이온성 유기 폴리머들 및 전기양성 표면들의 존재에서의 단백질 정제를 제공한다.

제제(preparation)로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법은, (a) 최초 생산 배지 내에 체류하는 약 5% 이하의 크로마틴(chromatin)을 가지는 형태로 상기 제제를 제공하는 단계를 포함하고, (b) 상기 제제를 비이온성 유기 폴리머 및 염과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 비이온성 유기 폴리머의 농도는 상기 원하는 단백질을 침전시키거나, 친수성 표면상에 부착을 야기하거나, 침전된 상태를 유지하거나, 상기 친수성 표면상에 부착하기에 충분하고, 상기 염 농도는 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분하며, (c) 선택적으로 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분한 염 농도의 존재에서, 상기 제제를 적어도 하나의 전기양성(electropositive) 표면과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 대한 산성 오염물들의 흡착을 방지하지 않으면서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 실질적으로 흡수되지 않는다.

놀랍게도 PEG-매개 분별 방법들이 적어도 95%의 크로마틴(chromatin)을 제거하도록 조절되었던 불순물이 섞인 제제(impure preparation)에 대해 수행되고, 상기 PEG-매개 방법이 침전 혼합물이 상승된 염의 농도를 포함하는 적어도 하나의 단계, 적어도 하나의 전기양성(electropositive) 표면이 존재하는 적어도 하나의 단계, 그리고 PEG 및 상기 원하는 단백질의 혼합물이 염의 상대적인 부존재에서 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉하는 적어도 하나의 단계를 포함할 때에, 상기 PEG-매개 분별 방법들이 알려진 생물 친화 크로마토그래피(biological affinity chromatography)의 고기능 방법보다 높은 정도의 단백질 정제를 구현할 수 있는 점이 발견되었다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 95%의 크로마틴을 제거하도록 조절된 불순물이 섞인 제제로부터 원하는 단백질의 정제를 위한 다단계 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (i) 정상 생리적 전도도(physiological conductivity)보다 큰 전도도를 생성하기에 충분한 염의 농도의 동시 존재에서, 상기 불순물이 섞인 제제를 원하는 항체가 침전되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 유기 폴리머와 접촉시키는 단계, (ii) 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서, 상기 혼합물로부터 염을 감소시키거나 제거하는 단계, (iii) 상기 비이온성 유기 폴리머를 상기 원하는 단백질을 침전된 상태로 유지시키기에 불충분한 농도까지 감소시키는 단계, 그리고 (iv) 원하는 경우에 추가적인 분별 방법들에 의해 더 정제될 수 있는 고도로 정제된 원하는 단백질을 남기며, 상기 제제로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면을 분리시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgG이다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 95%의 크로마틴을 제거하도록 조절된 불순물이 섞인 제제로부터 원하는 단백질의 정제를 위한 다단계 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (i) 정상 생리적 전도도보다 큰 전도도를 생성하기에 충분한 염의 농도의 동시 존재에서, 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 원하는 단백질이 침전되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 유기 폴리머와 접촉시키는 단계, (ii) 상기 혼합물로부터 염을 감소시키거나 제거하는 단계, (iii) 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서, 상기 비이온성 유기 폴리머를 상기 원하는 단백질이 침전된 상태를 유지하기에 불충분한 농도까지 감소시키는 단계, 그리고 (iv) 원하는 경우에 추가적인 분별 방법들에 의해 더 정제될 수 있는 고도로 정제된 단백질을 남기며, 상기 제제로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면을 분리시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgG이다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 99%의 상기 크로마틴을 제거하도록 조절된 불순물이 섞인 제제로부터 원하는 단백질의 정제를 위한 다단계 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (i) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 원하는 단백질이 침전되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 유기 폴리머와 접촉시키는 단계, (ii) 조절된 수확물(harvest) 및 비이온성 유기 폴리머의 결합에 정상 생리적 전도도보다 큰 전도도를 생성하기에 충분한 농도까지 염을 첨가하는 단계, (iii) 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서 상기 혼합물로부터 염을 감소시키거나 제거하는 단계, (iv) 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서, 상기 비이온성 유기 폴리머를 상기 원하는 단백질이 침전된 상태를 유지하기에 불충분한 농도까지 감소시키는 단계, 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서, 그리고 (v) 원하는 경우에 추가적인 분별 방법들에 의해 더 정제될 수 있는 고도로 정제된 단백질을 남기며, 상기 제제로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면을 분리시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgG이다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 95%의 크로마틴을 제거하도록 조절된 불순물이 섞인 제제로부터 원하는 단백질의 정제를 위한 다단계 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (i) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 원하는 단백질이 침전되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 유기 폴리머와 접촉시키는 단계, (ii) 조절된 수확물 및 비이온성 유기 폴리머의 결합에 정상 생리적 전도도보다 큰 전도도를 생성하기에 충분한 농도까지 염을 첨가하는 단계, (iii) 상기 혼합물로부터 염을 감소시키거나 제거하는 단계, (iv) 적어도 하나의 전기양성 표면의 존재에서, 상기 비이온성 유기 폴리머를 상기 원하는 단백질이 침전된 상태를 유지하기에 불충분한 농도까지 감소시키는 단계, 그리고 (v) 원하는 경우에 추가적인 분별 방법들에 의해 더 정제될 수 있는 고도로 정제된 단백질을 남기며, 상기 제제로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면을 분리시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgG이다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 95%의 크로마틴을 제거하도록 조절된 불순물이 섞인 제제로부터 원하는 단백질의 정제를 위한 다단계 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (i) 정상 생리적 전도도보다 높은 전도도를 생성하기에 충분한 염의 농도의 동시 존재에서, 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 원하는 단백질이 침전되도록 하기에 충분한 양으로 비이온성 유기 폴리머와 접촉시키는 단계, (ii) 상기 혼합물로부터 염을 감소시키거나 제거하는 단계, (iii) 상기 비이온성 유기 폴리머를 상기 원하는 단백질이 침전된 상태를 유지하기에 불충분한 농도까지 감소시키고, 이후에 상기 혼합물을 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉시키는 단계, 그리고 (iv) 원하는 경우에 추가적인 분별 방법들에 의해 더 정제될 수 있는 고도로 정제된 단백질을 남기며, 상기 제제로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면을 분리시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 단백질은 IgG이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 프로세스의 적어도 하나의 단계는 상기 표면에 대한 상기 원하는 단백질의 흡착을 실질적으로 방지하는 조건들 하에서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉되는 것을 수반한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgG 항체이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 단일클론(monoclonal) IgG 항체이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 프로세스의 적어도 하나의 단계는 실질적으로 모든 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 흡착하게 되는 조건들 하에서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉되는 것을 수반한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 IgM 항체이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 단일클론 IgM 항체이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 비항체 단백질이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 응고 인자(clotting factor)이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 피브리노겐(fibrinogen)이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 인자(Factor) VIII이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항혈우병 인자(antihemophiliac factor)라고도 알려진 인자 VIII 및 폰 빌레발트 인자(von Willebrand factor)의 복합체이다.

이전의 실시예들의 임의의 하나에 있어서, 상기 적어도 비이온성의 친수성 표면은 상기 정제된 단백질로부터 상기 적어도 하나의 전기양성 표면의 분리까지 상기 방법의 임의의 단계에 선택적으로 존재할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 비이온성의 친수성 표면은 모놀리스(monolith)이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 비이온성의 친수성 표면은 멤브레인의 형태이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 비이온성의 친수성 표면은 복수의 입자들로 구성된다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성의 친수성 입자들은 10나노미터, 또는 100나노미터, 또는 1미크론, 또는 10미크론, 또는 100미크론, 또는 중간이나 보다 큰 크기의 평균 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 자기장 내에 또는 자성 표면상에 이들을 수집을 가능하게 하도록 자성 또는 상자성(paramagnetic)이 될 수 있다.

이전의 실시예들의 임의의 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 복수의 유동화된(fluidized) 전기양성 입자들의 형태가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 칼럼들 내에서 크로마토그래피를 수행하기 위해 제조되는 입자들일 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 음이온 교환 크로마토그래피 입자들로 언급될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 전기양성으로 되는 점 이외에 상황을 언급하는 혼합 모드(mixed mode) 크로마토그래피 입자들로 언급될 수 있고, 상기 입자들은 또한 소수성 상호작용, 수소 결합 및 배위 결합 또는 금속 친화 상호작용들과 같은 상기 항체 제제의 성분들과의 임의의 형태들의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 구현한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 상기 입자들 상의 순 전하(net charge)가 양성인 한 음성 전하들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기양성 입자들은 10나노미터, 또는 100나노미터, 또는 1미크론, 또는 10미크론, 또는 100미크론, 또는 중간이나 보다 큰 크기의 평균 크기를 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자는 자기장 내에 또는 자성 표면상에 이들을 수집을 가능하게 하도록 자성 또는 상자성이 될 수 있다.

상기 적어도 하나의 전기양성 표면이 복수의 입자들을 포함하는 일부 실시예들에 있어서, 입자들의 부분은 입자 첨가의 시간에서 상기 제제의 부피의 1%, 또는 2%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 그 이하, 또는 그 이상, 또는 중간 부분을 구성할 수 있다. 상기 입자들의 실제 부분이 상기 입자들의 크기, 이들의 표면 특성들, 상기 IgG의 특성들 그리고 상기 제제 내에 여전히 존재하는 오염물들의 양과 특성들과 함께 변화될 수 있는 점이 인식될 것이다. 초기의 실험 목적들을 위하여, 상기 IgG 제제의 부피 부분에 대한 부피로서 2% 내지 5%의 입자들로 개시되는 것이 편리할 것이다.

이전의 실시예들의 임의의 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 다공성 멤브레인의 형태가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인의 평균 공극 크기는 100㎚, 또는 220㎚, 또는 450㎚, 또는 1미크론, 또는 2미크론, 또는 보다 작거나, 중간이거나 보다 큰 크기가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인의 평균 공극 크기는 220㎚가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인의 평균 공극 크기는 450㎚가 될 수 있다. 상기 멤브레인의 기능이 PEG-유도 침전물들 및/또는 친수성 입자들을 유지할 것으로 주어지면, 결과적으로 가장 짧은 처리 시간을 지지할 것인 가장 높은 멤브레인을 통한 유체 운반 속도들을 지지할 것이므로, 이들 종들을 유지하는 가장 큰 공극 크기 분포를 갖는 멤브레인이 바람직할 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인은 음이온 교환 크로마토그래피 멤브레인 또는 음이온 교환 멤브레인 흡착기(adsorber)로 언급될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인은 전기양성이 되는 점 이외의 상황은 언급하는 혼합 모드 크로마토그래피 멤브레인으로 언급될 수 있으며, 상기 멤브레인은 또한 소수성 상호작용들, 수소 결합 및 배위 결합 또는 금속 친화 상호작용들과 같은 상기 불순물이 섞인 제제의 성분들과의 다른 형태들의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 구현한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인은 또한 작동의 정상 조건들 하에서 상기 멤브레인 상의 순 전하가 양성인 한 음성 전하들을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면의 전기양성도(electropositivity)는 질소를 함유하는 화합물에 의해 부여될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 질소를 함유하는 화합물은 1차 아미노기(amino group), 또는 2차 아미노기, 또는 3차 아미노기, 또는 4차 아미노기, 또는 이와 같은 기들의 결합이나 중합체가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 질소를 함유하는 화합물은 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)(TREN)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양으로 대전된 질소를 함유하는 기는 이민(imine), 또는 피리딘(pyridine), 또는 다른 전기양성의 기가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 질소를 함유하는 화합물의 양성 전하는 질소 원자보다는 황 원자와 같은 잔기 상에 머무를 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 개시된 방법들은 원하는 바에 따라 정도들을 변화시키도록 자동화될 수 있는 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 장치 내에 수용되는 전기양성 멤브레인으로 수행될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 전기양성 멤브레인은 또한 상기 IgG 제제가 상기 멤브레인 상의 양성 전하들 및 상기 불순물이 섞인 제제의 성분들 상의 음성 전하들 사이의 정전기적 상호작용들을 부분적으로 또는 크게 또는 전체적으로 방지하는 염의 농도를 함유하는 경우를 포함하여 상기 침전된 IgG를 유지하는 기능을 수행할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면이 침전된 IgG를 유지하는 기능을 수행하지 않을 경우, 이는 멤브레인 장치 또는 모놀리스(mololith), 또는 충전된 입자들의 칼럼으로 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 접선 유동 여과 장치 내의 명목상으로 대전되지 않은 멤브레인으로 수행될 수 있고, 여기서 상기 대전되지 않은 멤브레인은 상기 침전된 IgG를 유지하는 기능을 수행할 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 대전되지 않은 멤브레인은 또한 전기양성 입자들을 유지하는 기능을 수행할 수 있다. 관련된 실시예에 있어서, 상기 대전되지 않은 멤브레인은 선택적으로는 전기양성 입자들을 유지하는 기능을 수행할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 내장 여과(dead-end filtration) 배지들로 수행될 수 있으며, 여기서 상기 침전물이 유지될 수 있는 반면에 침전되지 않은 오염물들은 통과할 수 있고, 이에 따라 제거된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 원심분리로 수행될 수 있으며, 여기서 상기 침전물은 오염물을 함유하는 상청액(supernatant)의 폐기를 가능하게 하도록 침강된다.

일부 실시예들에 있어서, 산성 오염물들이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 결합하는 것으로 이해되는 경우의 낮은 또는 염이 없는 단계에서 상기 IgG 제제 내의 PEG의 농도는 오염물이 상기 멤브레인에 결합되게 하는 PEG의 의도로 상기 IgG가 가용성이 되게 하는 PEG의 가장 높은 농도가 될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 가용화된 IgG 내의 PEG의 농도는 상기 샘플의 점도를 최소화하거나 및/또는 나중에 이의 제거를 용이하게 하는 가장 낮은 가능한 농도일 수 있다. 상기 가용성으로 된 IgG 내의 PEG 농도가 일부 실제적인 값을 가질 수 있는 것을 아는 것으로서, 특정 상황에서 이들의 관심을 가장 잘 수행하는 농도를 확인하도록 간단한 실험들을 수행하는 점은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있을 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 정상 생리적 전도도보다 큰 전도도를 생성하기에 충분한 염의 농도는 정상 생리적 전도도보다 실질적으로 클 수 있다. 정상 전도도가 12mS/㎝로부터 16mS/㎝까지의 범위가 될 수 있을 경우, 실질적으로 보다 큰 것으로 간주되는 값은 20mS/㎝, 또는 30mS/㎝, 또는 40mS/㎝, 또는 50mS/㎝, 또는 60mS/㎝, 또는 70mS/㎝, 또는 80mS/㎝, 또는 90mS/㎝, 또는 100mS/㎝, 또는 150mS/㎝, 또는 200mS/㎝, 또는 예를 들면 NaCl의 포화된 용액의 전도도까지의 중간이나 보다 높은 값을 포함할 수 있다. 실험 데이터는 가장 효과적인 오염물 감소 및 IgG 회수가 약 50mS/㎝부터 150mS/㎝까지 또는 약 0.5M부터 1.5M까지의 범위의 NaCl의 농도에 대응되는 범위 내에서 얻어질 수 있는 점을 나타낸다. 다른 경우들에 있어서, 생리적 전도도보다 큰이라는 용어는 17mS/㎝, 또는 18mS/㎝, 또는 19mS/㎝, 또는 중간 값인 것으로 이해될 수 있다. 모든 IgG가 다르게 행동하고 상기 IgG 가 체류하는 순수하지 않은 제제의 성분들 또한 영향을 미치므로, 특정 IgG 제제를 수용하는 가장 바람직한 전도도를 결정하도록 간단한 실험들을 수행하는 것이 필수적일 수 있는 점이 이해될 것이다. 보다 높은 레벨의 순도를 구현하도록 PEG 침전을 가능하게 하는 이점들 이외에도, 산성 오염물들을 포함하는 오염물들의 감소 또한 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 의해 요구되는 용량을 감소시키며, 이는 보다 효과적이 되고 또한 상기 표면의 치수들이 감소되게 할 수 있는 점을 인식하는 것이 중요하다.

일부 실시예들에 있어서, 전도성을 증가시키기 위해 채용되는 염은 염화나트륨(sodium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 아세트산나트륨(sodium acetate), 아세트산칼륨(potassium acetate)과 같은 중성염이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 다른 것들 중에서 아세트산구아니딘(guanidine acetate), 염산구아니딘(guanidine hydrochloride), 황산구아니딘(guanidine sulfate), 인산염(phosphate), 티오시안산나트륨(sodium thiocyanate), 또는 티오시안산칼륨(potassium thiocyanate)과 같은 카오트로픽 염(chaotropic salt)일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 황산나트륨(sodium sulfate), 황산칼륨(potassium sulfate), 황산암모늄(ammonium sulfate), 시트르산나트륨(sodium citrate), 시트르산칼륨(potassium citrate), 시트르산암모늄(ammonium citrate), 인산칼륨(potassium phosphate)을 포함하여 침전시키는 염들의 사용은 이들이 농축된 염 용액의 상단에 부유하는 농축된 PEG 용액을 생성하는 자발적인 상 분리를 발생시키는 강한 경향을 가지기 때문에 피해질 것이다. 대부분의 목적들을 위해서 및 특히 출발점으로서, NaCl이 일반적으로 선택되는 염일 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 염의 농도는 2.0M 이상, 또는 2.5M 이상, 또는 3M 이상, 또는 포화된 용액까지 4M 이상이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 NaCl이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 KCl이다.

일부 실시예들에 있어서, 특히 실질적으로 생리적 전도도 위의 값들을 포함하여 상기 전도도가 생리적 전도도 위인 프로세스 단계 동안, 작동 pH를 최적화하는 필요성이 감소되거나 유예될 수 있다. 낮은 전도도 값들에서, pH는 단백질들 사이의 전하 상호작용들을 조절한다. 단백질들이 이들의 등전점(isoelectric point)에 있을 때, 이들의 순 전하는 영(zero)이며 이들은 최소한으로 자기 반발하게 된다. pH가 이들의 등전점 위에 있을 때, 이들은 음의 순 전하를 가지며, 증가하는 pH로 점점 더 자기 반발하게 된다. pH가 이들의 등전점 아래에 있을 때, 이들은 양의 순 전하를 가지며, 감소하는 pH로 점점 더 자기 반발하게 된다. 따라서 주어진 IgG가 그 등전점에 또는 가까이에 있을 때, 이는 대체로 PEG에 의한 침전을 지지한다. 염 이온들이 용액 내의 대전체들 사이의 정전기적 상호작용들에 참가하기 때문에, 이들은 이들의 등전점으로부터 떨어진 pH 값들에서 단백질들 사이의 반발성의 정도를 감소시키며, 이는 pH의 효과를 감소시키거나 없앤다. 개시된 방법들의 내용에서 실제적인 중요성은, 일부 실시예들에서, 높은 전도도들을 생성하는 농도들에서 염의 존재가 pH를 조절할 필요성을 소거하는 점이다. 특정한 불순물이 섞인 제제 내의 특정 IgG에 상기 방법을 맞추는 목적들을 위하여, 7.0의 중성의 pH가 우수한 출발점을 생성하며, 이를 조절하는 것이 불필요할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, pH 조절은 상기 IgG 제제가 과잉의 염의 부존재에서 상기 IgG와 접촉하는 단계까지 연기될 수 있다. 이러한 단계에서, 상기 항체가 침전된 상태를 유지하도록 요구되는 PEG의 농도를 최소화하기 위해 상기 pH를 상기 IgG의 등전점에 접근하는 값까지 조절하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시예들에서는 동일한 하나인 이러한 단계에서 및/또는 적어도 하나의 전기양성 표면이 상기 IgG 제제 상에 접촉하는 동안의 단계에서, 산성 오염물들을 결합시키는 상기 적어도 하나의 전기양성 표면의 능력을 최대화하도록 상기 pH를 조절하는 것이 유리할 것이다. 주어진 IgG의 등전점을 아는 것은 도움이 될 수 있지만, 일반적으로 사전에 알 수 없는 표면들에 대한 결합 또한 상기 단백질 상의 전하 분포에 의해 영향을 받으므로, 다른 pH 값들로의 간단한 실험들이 최적의 pH를 확인하는 가장 효과적인 방식이 될 것이다. 8.0의 pH 값이 대부분의 인간 IgG1 단일클론 항체들로 출발하기 위한 편리한 위치이다.

염이 2M보다 큰 농도로 존재하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 용액의 pH는 7, 또는 8, 또는 8.5, 그 보다 높거나, 또는 6, 또는 6.5, 또는 6 내지 8.5 사이의 다른 값, 또는 6 이하이다.

이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 NaCl 또는 KCl 혹은 이들의 결합이다.

일부 실시예들에 있어서, 산성 오염물들이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 결합되는 단계에서 상기 염 농도는 이상적으로는 영(zero)이거나, 상기 항체의 용해도를 유지하도록 요구되는 가장 낮은 농도이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머는 다른 것들 중에서 폴리에틸렌글리콜(PEG), 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), 또는 덱스트린(dextran), 또는 셀룰로오스(cellulose), 또는 녹말(starch), 또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)이 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머는 약 2,000달톤(Dalton)(D), 또는 3,000D, 또는 4,000D, 또는 5,000D, 또는 6,000D, 또는 8,000D, 또는 10,000D, 또는 12,000D의 폴리머 크기, 혹은 중간의 폴리머 크기를 갖는 PEG가 될 것이다. 경험으로 상기 평균 폴리머 크기가 작을수록, 침전을 구현하는 데 요구되는 농도가 높아지는 점이 기록되어 있다. 이는 질량에 대한 조절에서 간단하지 않으며, PEG 폴리머들의 유효성이 질량에 독립적인 이들의 유체역학적 반경에 비례하는 사실에 의해 매개되는 진보적인 효과가 존재하므로, 동일한 질량이지만 다른 분지(branching)의 PEG 폴리머들은 다른 침전을 매개하는 능력들을 가진다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 PEG는 PEG-6000일 수 있고, 생리적 또는 보다 낮은 전도도에서 IgG 침전을 구현하거나, 이들 전도도 값들에서 상기 IgG를 침전된 상태로 유지하기 위해 채용되는 상기 PEG의 농도는 12%부터 18%까지, 또는 14%-16%의 범위가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 1M의 NaCl과 같이 약 80mS/㎝의 전도도를 생성하기에 충분한 염의 농도 내의 상기 PEG-6000의 농도는 IgG 침전을 구현하거나 및/또는 IgG를 침전된 상태로 유지하기 위하여 상승될 필요가 있을 것이다. 생리적 농도에서 침전을 구현하도록 요구되는 상기 PEG-6000의 농도가 15%-16%인 이와 같은 일 실시예에 있어서, 1M의 NaCl의 존재에서 침전을 구현하는 데 요구되는 상기 PEG-6000의 농도는 18%-22%이다. 이는 알려졌지만 일반적으로 간과된 염의 효과를 반영하며, 이에 따라 상기 PEG의 유체역학적 반경을 감소시킨다. 이들 농도들은 각 IgG 클론 및 이가 체류하는 상기 불순물이 섞인 제제의 고유한 개별적인 특성들을 수용하는 것이 최적화를 요구할 것인 점을 이해하는 가이드라인들이나 출발점들로 이용될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 불순물이 섞인 IgG 제제는 포유류의 세포들, 효모들 또는 박테리아로부터와 같은 세포 배양 수확물로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제는 배양된 세포들의 추출물로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 불순물이 섞인 IgG 제제는 혈장, 혈청, 젖 또는 다른 체액들과 같은 체액으로 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제는 세포들을 제거하도록 처리되었던 세포 배양 수확물이 될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 원심분리 및 여과와 같은 물리적 방법들에 의해 미리 조절될 수 있다.

이전의 실시예들의 모두에 있어서, 적어도 95%의 크로마틴 및 관련 분해대사물들(catabolites)을 제거하도록 조절되었던 불순물이 섞인 제제에 대해 개시된 방법들을 수행하는 것은 높은 정제를 구현하는 시스템의 능력을 불균형적으로 증가시킨다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 수확물은 하나 또는 그 이상의 양성으로 대전된 표면들과의 접촉에 의해 조절될 수 있으며, 여기서 상기 양성 전하는 상기 표면상에 고정된 다가 유기 이온들에 의해 부여된다. 이와 같은 다른 실시예에 있어서, 상기 조절하는 방법은 상기 원하는 산물 제제를 가용성의 다가 유기 이온들과 접촉시키는 단계를 수반한다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, 상기 조절하는 방법은 상기 원하는 산물 제제를 가용성 및/또는 불용성의 다가 유기 이온들과 접촉시키는 단계를 수반한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는 상기 샘플을 가용성의 전기양성 유기 첨가제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기양성 유기 첨가제는 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue) 및 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(cetyl trimethylammonium bromide)로 이루어진 그룹으로부터 적어도 하나의 종을 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 이와 같은 종의 농도, 또는 종들의 결합의 응집체(aggregate) 농도는 0.001% 내지 1%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 또는 0.02% 내지 0.05%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 또는 중간 값의 범위 내에 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 상기 원하는 IgG의 회수의 상당한 감소를 야기하지 않는 알칼리성 값까지 조절될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 실험 결과들이 항체 회수가 허용되는 것을 나타내지만 이와 같은 조절들이 일반적으로 필수적이지 않은 경우, 상기 pH는 상기 항체 등위점의 pH 단위의 반 이내의 pH 값 또는 그 이상까지 조절될 수 있다. 임의의 pH 조절이 이루어지는 정도까지, 상기 단백질 등위점의 1pH 단위 내의 또는 1.5pH 단위 내의 값이 충분할 것이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는 상기 샘플을 가용성의 전기음성 유기 첨가제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기음성 유기 첨가제는 헵탄산(heptanoic acid), 옥탄산(octanoic acid), 옥텐산(octenoic acid), 노난산(nonanoic acid), 노넨산(nonenoic acid), 데칸산(decanoic acid) 및 메틸 블루(methyl blue)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 종을 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 이와 같은 종의 농도 또는 종들의 결합의 전체 농도는 0.001% 내지 10%, 또는 0.01% 내지 1%, 또는 0.1% 내지 0.5%의 범위 내에 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 상기 원하는 단백질의 회수의 상당한 감소를 야기하지 않는 산성 값까지 조절될 수 있다. 이러와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 3.5 내지 6.5, 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 5.3, 5.15 내지 5.25, 또는 5.2, 또는 다른 중간 값의 범위로 조절될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는 상기 샘플을 용해되지 않은 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 불순물이 섞인 제제 내에 잔류하는 상기 첨가된 알란토인은 약 0.6% 내지 50%, 또는 0.7% 내지 20%, 또는 0.8% 내지 10%, 또는 0.9% 내지 5%, 또는 1% 내지 2%, 또는 중간 값까지의 양이 될 수 있다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 건조 알란토인의 평균 입자 크기는 과포화된 용액 내의 용해되지 않은 알란토인의 가장 큰 전체 표면 면적을 구현하는 목적으로 사용 가능한 가장 작은 크기까지 선택된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 알란토인은 보다 작은 입자 크기를 생성하도록 과립화된다.

일부 실시예들에 있어서, 고체 표면상에 고정된 다중 모드 유기 이온이 전기양성일 경우, 상기 고정된 다중 모드 유기 이온은 일차 아미노기, 또는 이차 아미노기, 또는 삼차 아미노기, 또는 사차 아미노기, 또는 이와 같은 기들의 결합이나 중합체와 같은 질소를 함유하는 기가 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 질소를 함유하는 화합물은 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)(TREN)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양성으로 대전된 질소를 함유하는 기는 이민(imine), 또는 피리미딘(pyridine), 또는 다른 전기양성 기가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 질소를 함유하는 화합물의 양성 전하는 질소 원자보다는 황 원자와 같은 잔기 상에 머무를 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는 그 임계 미셀 농도(critical micelle concentration)보다 낮은 농도에서 상기 샘플을 비이온성 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 계면활성제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는, (i) 전기음성 표면을 갖는 제1 고체 기재인 제1 성분을 제공하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키는 단계를 구비하며, 여기서 상기 작동 조건들은 상기 제1 성분에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고, (iii) 상기 제1 성분으로부터 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 분리시키는 단계를 구비한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기음성 표면은 제2 전기음성 표면을 수반할 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는, (i) 전기양성 표면을 갖는 제1 고체 기재인 제1 성분을 제공하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키는 단계를 구비하며, 여기서 상기 작동 조건들은 상기 제1 성분에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고, (iii) 상기 원하는 단백질을 감소된 크로마틴 함량으로 상기 제1 성분으로부터 분리하는 단계를 구비한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성 표면은 트리스(2-아미노에틸)아민의 잔류물들을 지닌다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성 표면은 제2 전기양성 표면을 수반할 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는, (i) 전기양성 표면을 갖는 제1 고체 기재인 제1 성분을 제공하는 단계를 구비하고, (ii) 전기음성 표면을 갖는 제2 고체 기재인 제2 성분을 제공하는 단계를 구비하며, (iii) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키는 단계를 구비하고, 여기서 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 불순물이 섞인 제제가 양 성분들에 동시에 접촉될 수 있도록 구성되며, 상기 작동 조건들은 상기 제1 및 제2 성분들에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고, (iv) 감소된 크로마틴 함량으로 상기 원하는 단백질을 상기 제1 및 제2 성분들로부터 분리하는 단계를 구비한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성 표면은 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)의 잔류물들을 지닌다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 제제를 유기 다가 이온들로 조절하는 단계는, (i) 상기 불순물이 섞인 제제를 금속을 결합시킬 수 있는 적어도 하나의 표면-결합 리간드(surface-bound ligand)를 포함하는 적어도 하나의 고체 표면과 접촉시키는 단계를 구비하고, 여기서 상기 금속을 결합시킬 수 있는 표면-결합 리간드는 초기에 실질적으로 금속이 없으며, 작동 조건들은 상기 적어도 하나의 고체 표면에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하도록 선택되고, (ii) 상기 불순물이 섞인 제제를 상기 적어도 하나의 표면-결합 리간드로부터 분리하는 단계를 구비한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 가용성의 전기양성 또는 전기음성 유기 첨가제 및/또는 전기음성, 전기양성 또는 금속 친화 리간드를 지니는 고체 표면으로 미리 처리된 불순물이 섞인 제제는 유체 접촉 표면이 양성 전하들을 포함하는 장치를 통해 후속하여 흐를 수 있다.

크로마틴-유도 정화(chromatin-directed clarification) 방법의 응용을 예시하는 일 실시예에 있어서, 알란토인이 1%(v/v)의 양으로 세포 배양 수확물에 첨가된다. 상기 세포 배양은 세포들을 함유할 수 있거나, 상기 세포들이 미리 제거되었을 수 있다. 메틸렌 블루는 0.025%(w/v)의 농도까지 첨가된다. 선택적으로는, 에타크리딘은 0.025%의 농도까지 첨가될 수 있다. 선택적으로는, 0.025%의 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드는 0.025%의 농도까지 첨가될 수 있다. 선택적으로는, 이들 또는 다른 전기양성 유기 첨가제들의 결합이 0.025%의 결합된 농도로 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 이후에 2시간 동안 교반되면서 배양된다. 상기 전기양성의 금속 친화 리간드인 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)을 지니는 입자들이 2%-5% v:v의 양으로 첨가된다. 상기 혼합물은 4시간 동안 교반되면서 배양되며, 이후에 상기 고체들이 임의의 적절한 수단에 의해 제거된다. 상기 원하는 단백질을 함유하는 남아있는 용액은 선택적으로 그 유체 접촉 표면상에 양성 전하들을 지니는 뎁스 필터(depth filter)를 통해 흐를 수 있다.

크로마틴-유도 정화 방법의 응용을 예시하는 다른 실시예에 있어서, 알란토인은 1%(v/v)의 양으로 세포 배양 수확물에 첨가된다. 상기 세포 배양은 세포들을 함유할 수 있거나, 상기 세포들은 미리 제거되었을 수 있다. 0.7%의 헵탄산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.6%의 헵텐산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.4%의 옥탄산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.4%의 옥텐산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.3%의 펠라곤(pelargonic)(나논) 산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.4%의 노넨산이 첨가된다. 선택적으로는, 0.2%의 카프릭산(capric acid)이 첨가된다. 선택적으로는, 0.5%의 메틸 블루가 첨가된다. 선택적으로는, 이들 또는 다른 전기음성의 유기 첨가제들이 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 이후에 2시간 동안 교반되면서 배양된다. 상기 전기양성의 금속 친화 리간드인 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)을 지니는 입자들은 2-5% v:v의 양으로 첨가된다. 상기 혼합물은 4시간 동안 혼합되면서 배양되며, 이후에 상기 고체들이 임의의 적절한 방법에 의해 제거된다. 상기 원하는 단백질을 함유하는 남아있는 용액은 선택적으로 그 유체 접촉 표면상에 양성 전하들을 지니는 뎁스 필터를 통해 흐를 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 특정한 조절하는 방법의 크로마틴 감소의 정도는 DNA 감소의 정도 및 히스톤 감소의 정도를 측정하고, 두 값들을 평균화하여 추산된다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, DNA는 삽입 색소 분석(intercalating dye assay)에 의해 측정될 수 있는 반면, 히스톤들은 통상적으로 면역분석(immunoassay)에 의해 측정된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 히스톤의 양이 크로마틴의 구조의 직접적인 함수이기 때문에, 전체 히스톤 함량은 히스톤의 1종의 함량을 결정하고, 크로마틴 내의 다른 히스톤들의 상대적인 부분들에 비례하는 양을 조절함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 전체 히스톤은 히스톤 H1을 측정하고, 이후에 온전한 크로마틴 내의 다른 히스톤들에 대한 H1의 질량 비율을 서명하도록 9배를 곱하여 추산될 수 있다. 선택적으로는, 전체 히스톤은 H2a, H2b, H3 또는 H4를 측정하고, 이들의 임의의 하나로부터의 결과에 4.5를 곱하여 추산될 수 있다. 선택적으로는, 분석들은 H1과 H2a 및 H2b 및 H3 및 H4, 그리고 함께 첨가된 결과들에 대해 수행될 수 있다. DNA 분석들은 선택적으로 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 기술에 의해 보조될 수 있다. 그러나, 실험 데이터는 전체 크로마틴을 추정하는 데 DNA를 사용하는 것이 생성 동안에 세포 사멸을 수반하는 DNA의 효소-매개 가수분해로 인하여 전체 크로마틴이 너무 적게 추산되게 할 수 있는 점을 나타낸다. 히스톤 및 DNA 분석들은 모두 정확한 결과들을 얻기 위해 특별한 추출 과정들을 요구할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 IgG 제제는 상기 방법의 하나 또는 그 이상의 단계들 동안 하나 또는 그 이상의 항바이러스 화합물들과 접촉될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 항바이러스 화합물들은 에타크리딘, 메틸렌 블루, 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide), 트리(tri)(n-부틸(butyl))포스페이트(phosphate)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법의 수행 동안에 채용되는 비이온성의 친수성 입자들은 나노입자들 또는 마이크로입자들이다. 이와 같은 특정한 실시예들에 있어서, 상기 비이온성의 친수성 입자들은 다공성이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자 크기는 약 50㎚ 내지 약 500㎛이거나, 약 50㎚ 내지 약 50㎛이거나, 약 50㎚ 내지 약 4㎛이거나, 약 50㎚ 내지 약 3㎛이거나, 약 50㎚ 내지 약 1㎛이거나, 약 100㎚ 내지 약 1㎛이거나, 약 200㎚ and 약 2㎛이거나, 약 200㎚ 내지 약 500㎚이거나, 약 500㎚ 내지 약 1㎛이거나, 약 5㎛ 내지 약 50㎛이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 자성을 가진다.

일부 실시예들에 있어서, 제제로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, (a) 최초 생산 배지 내에 체류하는 약 5% 이하의 크로마틴을 가지는 형태로 상기 제제를 제공하는 단계를 구비하고, (b) 상기 제제를 비이온성 유기 폴리머 및 염과 접촉시키는 단계를 구비하며, 여기서 비이온성 유기 폴리머의 농도는 상기 원하는 단백질을 침전시키거나, 친수성 표면상에 이의 부착을 야기하거나, 이를 침전된 상태로 유지하거나 상기 친수성 표면상에 부착되게 하기에 충분하고, 상기 염 농도는 생리적 전도도보다 큰 전도도를 생성하기에 충분하며, (c) 선택적으로 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분한 염 농도의 존재에서 상기 제제를 적어도 하나의 전기양성 표면과 접촉시키는 단계를 구비하며, 이에 따라 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 대한 산성 오염물들의 흡수를 방지하지 않으면서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 실질적으로 흡수되지 않는다.

일부 실시예들에 있어서, 방법들은 (d) 상기 제제를 적어도 하나의 비이온성의 친수성 표면과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b) 동안의 상기 염 농도는 동일하다.

일부 실시예들에 있어서, 방법들은 가용성 오염물들이 이를 통한 통로에 의해 제거되는 동안에 다공성 멤브레인 상에 상기 침전된 원하는 단백질을 유지시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 방법들은 상기 침전된 원하는 단백질을 상기 염 농도와 독립적으로 가용성 오염물들을 그를 통한 통로에 의해 제거하는 동안에 실질적으로 불활성인 미세다공성 멤브레인 상에 유지시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 방법들은 상기 침전된 원하는 단백질을 상기 전도도가 생리적 전도도 보다 클 때에 가용성 오염물들을 그를 통한 통로에 의해 제거하는 동안에 전기양성인 미세다공성 멤브레인 상에 유지시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 단일의 통합 장치 내에서 수행된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머의 평균 폴리머 크기는, (a) 약 1,500달톤부터 약 15,000달톤까지, (b) 약 2,000달톤부터 약 12,000달톤까지 (c) 약 3,000달톤부터 약 10,000달톤까지, (d) 약 4,000달톤부터 약 8,000달톤까지, 그리고 (e) 약 5,000달톤부터 약 6,000달톤까지로 이루어진 그룹으로부터 하나의 범위 내에 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 생리적 전도도보다 적어도 1mS/㎝ 크다. 일부 실시예들에 있어서, 전도도는 생리적 전도도보다 염 또는 염들의 선택된 용액의 포화된 용액에 대응되는 전도도까지 1mS/㎝ 이상, 5mS/㎝ 이상, 10mS/㎝ 이상, 20mS/㎝ 이상, 40mS/㎝ 이상, 80mS/㎝ 이상, 160mS/㎝ 이상, 또는 중간 증가분만큼 크다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 티오시안산나트륨, 티오시안산칼륨, 구아니디늄 하이드로클로라이드(guanidinium hydrochloride) 및 이들의 결합들로부터 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 염은, (a) 약 0.5M부터 약 1.5M까지, (b) 약 2.0M부터 약 3.0M까지, 그리고 이의 중간 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도에서의 염화나트륨이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은, (a) 약 100㎚, (b) 약 220㎚, (c) 약 450㎚, (d) 약 1미크론, (e) 약 2미크론, 그리고 이의 중간 값으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 평균 크기의 공극들을 갖는 멤브레인이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 고체는 복수의 입자들이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 고체는 모놀리스 기반의 크로마토그래피 장치, 멤브레인 기반의 크로마토그래피 장치, 입자 기반의 크로마토그래피 장치, 거대망상 골격 지지(macroreticulate skeleton supporting) 하이드로겔 기반의(hydrogel-based) 장치 그리고 이들의 결합들을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 크로마토그래피 장치의 일부이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 염 농도는 영(zero)의 양, 1mM, 2mM, 5mM, 10mM, 25mM, 50mM, 100mM, 그리고 그 중간 농도들을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시예들에 있어서, 단계 (a) 동안의 pH는, (a) 약 8부터 약 9까지, (b) 약 8부터 약 8.5까지, (c) 약 7.5부터 약 8.5까지, (d) 약 7.25부터 약 8.25까지, (e) 약 7.0부터 약 8.0까지, (f) 약 6부터 약 7까지, 그리고 그 중간 pH 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내에 있다.

일부 실시예들에 있어서, 단계 (b) 동안의 pH는, (a) 약 5부터 약 9까지, (b) 약 6부터 약 8까지, (c) 약 6.5부터 약 7.5까지, (d) 약 7.5부터 약 8.5까지, 그리고 그 중간 pH 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내에 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 친수성 표면은 멤브레인, 모놀리스 및 복수의 입자들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하며, 여기서 상기 복수의 입자들은 선택적으로 자성을 가진다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 멤브레인, 모놀리스 및 복수의 입자들로 이루어진 그룹으로부터 하나를 포함하며, 여기서 상기 복수의 입자들은 선택적으로 자성을 가진다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 세포 배양 배지, 배양된 유기체들로부터의 추출물 및 체액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나이다.

용어들은 실시예들이 보다 용이하게 이해되도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설정된다.

"크로마틴(chromatin)"은 염색체들(chromosomes)의 기본 조성을 언급한다. 살아있는 세포들 내의 이의 온전한 형태에 있어서, 이는 보다 작은 양의 다른 단백질들 및 펩티드들과 연관되는 DNA 및 히스톤 단백질들을 우세하게 포함한다. 이는 뉴클레오솜들(nucleosomes) 내로 구조화되며, DNA의 1.65회전으로 둘러싸인 2개의 각각의 히스톤들 2a, 2b, 3 및 4를 포함하는 히스톤 단백질들의 옥타머(octamer)를 포함한다. 뉴클레오솜들은 링커(linker) DNA의 구획들에 의해 선형의 영역들로 연결되며, 히스톤 H1과 연관된다. 크로마틴은 begins to break down coincident with 세포 사멸. 재조합 단백질들을 생성하도록 이용되는 바와 같은 세포 배양 프로세스에 있어서, 크로마틴 및 이의 분해 산물들(break-down products)이 상기 세포 배양 배지들 내로 축출됨에 따라, 이들은 상기 원하는 재조합 단백질을 포함하여 상기 세포 배양 배지들의 구성 성분들과 연관들을 형성할 수 있다. "크로마틴 분해대사물들(chromatin catabolites)"이라는 용어는 크로마틴 분해 산물을 언급하는 것으로 사용될 수 있다. 이들 분해 산물들은 2-30 또는 그 이상의 뉴클레오솜들, 개개의 뉴클레오솜들, 뉴클레오솜 조각들, DNA 그리고 히스톤 단백질들을 함유하는 어레이들을 포함한다(Gan 등의 앞서의 문헌, Gagnon 등(2013)의 앞서의 문헌). "히스톤 단백질들(histone proteins)"은 크로마틴 분해대사물들을 나타내는 것으로 이해된다. "DNA"는 그 크기에 관계없이 크로마틴 분해대사물들의 종들을 나타내는 것으로 이해된다. 개개의 "뉴클레오솜들" 및 큐클레오솜 배열들은 크로마틴 분해대사물들을 나타내는 것으로 이해된다.

"입체 배제 크로마토그래피(steric exclusion chromatography)"는 항체 분자(예를 들면, IgG 또는 다른 항체 산물)의 유지가 항체 및 비이온성 입자의 친수성 표면들로부터 PEG와 같은 비이온성 유기 폴리머의 동시 상호 입체 배제에 의해 매개되는 정제 방법을 언급한다. 상기 단백질 표면과 상기 입자들 표면 사이에 직접적인 화학적 상호작용은 일어나지 않는 것으로 여겨진다. 이는 특징적으로 음이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 전통적인 크로마토그래피 방법들로 가능한 경우 보다 넓은 범위의 조건들에 걸친 결합을 유지하는 능력을 갖는 방법을 부여한다.

"수화된 표면(hydrated surface)" 혹은 "고도로 수화된 표면(highly hydrated surface)" 또는 "친수성 표면(hydrophilic surface)"은 잠재적으로 수소 결합, 전왜(electrostriction) 또는 상기 두 메커니즘들의 일부 결합들을 통해 물과 강하게 상호 작용하는 표면을 언급한다. 이와 같은 상호작용들은 히드록실들(hydroxyls), 음성 전하들, 또는 양성 전하들, 혹은 대전되지 않은 극성기들과 같은 화학적 기들에 의해 매개될 수 있다. 수화될 수 있는 화학적 기들의 존재는 입자 또는 대류성 크로마토그래피 물질과 같이 주어진 물질의 천연 조성의 기본적인 특징이 될 수 있거나, 이는 이에 한정되는 것은 아니지만 탄수화물들 및 우레이드들(ureides)을 포함하는 상기 표면상의 이와 같은 기들을 고정화시키는 화학적 변형에 의해 첨가되거나 향상될 수 있다. 이른바 소수성 표면들은 일반적으로 고도로 수화되는 것으로 간주되지는 않지만, 소수성 잔류물들과 결합하여 강하게 수화될 수 있는 기들을 포함하는 표면들은 그럼에도 불구하고 여기에 개시되는 실시예들을 수행하도록 충분하게 수화될 수 있다.

"응집체(들)(aggregate)(s)"는 생리적 조건들에서 안정하고, 넓은 범위의 pH 및 전도도 조건들에 대해 안정하게 남을 수 있는 둘 또는 그 이상의 분자들의 연관을 언급한다. 응집체들은 흔히 단백질, 핵산 또는 지질 및 다른 분자 혹은 금속 이온과 같은 적어도 하나의 생체 분자를 포함한다. 상기 연관은 화학적 상호작용들의 임의의 유형 또는 임의의 결합을 통해 일어날 수 있다. 항체들의 응집체들은 두 카테고리들로 분류될 수 있으며, "동종-응집체들(homo-aggregates)"은 둘 또는 그 이상의 항체 분자들의 안정한 연관을 언급하고, "이종-응집체들(hetero-aggregates)"은 하나 또는 그 이상의 항체 분자들과 하나 또는 그 이상의 비항체 분자들의 안정한 연관을 언급한다. 상기 비항체 성분은 뉴클레오티드, 엔도톡신, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지들 성분으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상의 실체들로 구성될 수 있다.

"항체(antibody)"는 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메라(chimeric), 합성, 재조합, 하이브리드(hybrid), 돌연변이형, 그래프트된(grafted) 및 생체 외에서(in vitro) 생성된 항체들과 같이 천연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간 또는 다른 포유동물 세포 주들로부터 유도되는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 면역글로불린(immunoglobulin)을 언급한다. "항체"는 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역글로불린 모이어티(moiety)를 함유하는 융합 단백질들 또는 다른 항체, 효소, 플루오르포레(fluorphore)나 다른 신호 발생 모이어티, 바이오틴(biotin), 약물 또는 다른 기능성 모이어티를 포함하여 다른 기능성 모이어티에 대한 IgG의 합성 연결에 의해 생성되는 면역접합들(immunoconjugates)을 포함하는 혼성 형태들을 구비할 수 있다.

"항체 산물(antibody product)"은 적어도 일부가 항체 또는 항체의 부분을 포함하는 단백질성 실체를 언급한다. 가장 간단한 예는 항체이다. 화합물 예들은 Fc-융합 단백질들을 포함하며, 이는 항체의 Fc 부위에 대한 재조합 수단에 의해 공유결합으로 결합되는 비항체 기능성 모이어티를 함유한다. 다른 화합물 예는 항체 접합체 또는 면역 접합체이며, 이는 항체의 기능성을 증가시키도록, 예를 들면 형광으로 만들도록 합성 수단에 의해 가장 흔히 다른 모이어티에 연결되는 항체로 구성되므로, 면역분석들, 또는 동일한 목적으로 이를 효소에 결합시키거나, 암세포들을 죽이기 위해 두 세포독소에 결합시키거나, 다른 목적들을 위해 다른 모이어티들에 결합시키는 데 사용된다. 다른 항체 산물들은 두 개의 별도의 타겟들에 대한 결합 특이성들을 구비하는 두 도메인을 가지는 이가의 화합물들(두 항체 조각들 사이의 융합들과 같은)이다.

"엔도톡신(endotoxin)"은 세포 용해(lysis)에 따라 세포로부터 방출되는 그람-음성의(gram-negative) 박테리아의 외막 내에 존재하는 유독성의 열에 안정한 지질다당류(lipopolysaccharide) 물질을 언급한다. 엔도톡신들은 상기 중심 다당류와 연관된 인산염 및 카르복실 잔류물들의 높은 함량으로 인해 일반적으로 산성일 수 있으며. 지질-A 부위의 지방산 함량으로 인해 높은 소수성을 나타낼 수 있다. 엔도톡신들은 수소 결합에 대한 광범위한 기회를 제공할 수 있다.

"비이온성 유기 폴리머(non-ionic organic polymer)"는 대전된 기들이 결핍된 연결되는 반복적인 유기 서브단위들로 구성되는 자연 발생되거나 합성 탄화수소를 언급한다. 이는 선형일 수 있거나, 일부 분지들을 갖는 우세하게 선형일 수 있거나, 우세하게 분지될 수 있다. 상기 실시예들을 수행하기에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH₂-CH₂-O)n-H의 구조식을 가진다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 100달톤 이하로부터 10,000달톤 이상까지의 범위의 평균 중합체 분자량을 가지는 조성물들을 포함한다. 상업적인 PEG 제제들의 평균 분자량은 통상적으로 하이픈으로 연결한 접미사로 나타낸다. 예를 들면, PEG-6000은 약 6,000달톤의 평균 분자량을 가지는 제제를 언급한다. 이와 같은 약제들의 효과적인 농도는 여기에 개시되는 실시예들에 의해 처리되는 폴리머의 실체 및 항체 산물의 특성들과 함께 변화된다.

"음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)"는 산성(전기음성) 오염물들은 양성 전하들에 결합되는 경향이 있고, 알칼리성(전기양성) 오염물들은 상기 양성 전하들로부터 밀려나는 경향이 있으며, 대전되지 않거나 전기중성의 오염물들은 상기 양성 전하들에 결합되지 않는 경향이 있는 바와 같은 다른 전하 특성의 샘플 성분들 중에서 분별을 매개하는 표면을 위해 고체 표면에 공유결합으로 결합되는 상기 양성 전하들을 채용하는 프로세스를 언급한다. 이와 같은 시스템들의 선택성은 통상적으로 pH 및 전도도에 의해 조절되며, 여기서 결합은 통상적으로 증가하는 pH 및/또는 감소하는 염 농도로 강해진다.

"음이온 교환 멤브레인(anion exchange membrane)" 또는 "전기양성 멤브레인(electropositive membrane)"은 그 표면이 양성 전하들이 우세한 다공성 멤브레인을 언급한다. 상기 멤브레인 공극들은 5㎚ 또는 그 이하 혹은 1미크론 또는 그 이상의 범위가 될 수 있다. 200㎚보다 작은 공극들을 갖는 멤브레인들은 흔히 한외여과(ultrafiltration) 멤브레인들로 언급되는 반면, 200㎚보다 큰 공극들을 갖는 멤브레인들은 종종 정밀여과(microfiltration) 멤브레인들로 언급된다. 전기양성도는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노(amino), 에틸렌 디아미노(ethylene diamino), 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl), 폴리알릴아민(polyallylamine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 같은 약한 음이온 교환 기들; 사차 아미노기들과 같은 강한 음이온 교환 기들; 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine) 또는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine), 폴리프로필렌이민 테트라아민(polypropylenimine tetraamine), PAMAM 덴드리머(dendrimer)(에틸렌디아민 코어ethylenediamine core)) 또는 전술한 것들의 임의의 결합들과 같은 결합된 약-강 교환체들을 포함하는 화학적 기들에 의해 부여될 수 있다. 양성으로 대전된 멤브레인 상에 혼합된 화학적 특성을 생성하는 이차 작용기들은 음성으로 또는 양성으로 대전된 기들, 소수성 기들, pi-pi 결합 기들, 수소 결합 기들, 또는 금속-킬레이트화(metal-chelation) 기들로 구성될 수 있다. 상기 이차 작용기들은 상기 입자들이 합성되는 제조 물질들이나 프로세스의 의도하지 않은 부산물로서 상기 멤브레인 표면상에 존재할 수 있거나, 이들은 의도적인 설계에 의해 존재할 수 있다. 상기 이차 작용기들의 농도는 입자들의 mL당 1밀리당량 이하로부터 mL당 10밀리당량 이상까지의 범위가 될 수 있다.

"음이온 교환 입자(anion exchange particle)" 또는 "전기양성 입자(electropositive particle)"는 그 표면에 양성 전하가 우세한 다공성 또는 비다공성 입자를 언급한다. 입자 크기는 50㎚ 이하부터 200미크론 이상까지의 범위가 될 수 있다. 상기 입자들은 여기에 개시되고 청구된 실시예들을 수행하는 이들의 능력을 수반하지 않거나 간섭하는 수단에 의해 이들이 격리되게 하는 특징들도 통합할 수 있지만, 일부 전제적인 향상을 제공할 수 있는 중합체, 결정 또는 세라믹 구조를 포함할 수 있다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 부유를 가능하게 하는 낮은 밀도, 신속한 침강을 가능하게 하는 높은 밀도 및/또는 자기장 내에서 이들의 수집을 가능하게 하는 자성을 부여하는 특징들을 포함한다. 전기양성도는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노, 에틸렌 디아미노, 디에틸아미노에틸, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 약한 음이온 교환 기들; 사차 아미노기들과 같은 강한 음이온 교환 기들; 폴리리신, 폴리아르기닌 또는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜타민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 또는 전술한 것들의 임의의 결합들과 같은 결합된 약-강 교환체들을 포함하는 화학적 기들에 의해 부여될 수 있다. 양성으로 대전된 멤브레인 상에 혼합된 화학적 특성을 생성하는 이차 작용기들은 음성으로 또는 양성으로 대전된 기들, 소수성 기들, pi-pi 결합 기들, 수소 결합 기들, 또는 금속-킬레이트화(metal-chelation) 기들로 구성될 수 있다. 상기 이차 작용기들은 상기 입자들이 합성되는 제조 물질들이나 프로세스의 의도하지 않은 부산물로서 상기 멤브레인 표면상에 존재할 수 있거나, 이들은 의도적인 설계에 의해 존재할 수 있다. 상기 이차 작용기들의 농도는 입자들의 mL당 1밀리당량 이하로부터 mL당 10밀리당량 이상까지의 범위가 될 수 있다.

"유기 다가 이온(organic multivalent ion)"은 유기 분자, 중성의 이온이나 염 또는 적어도 하나의 전하 및 적어도 하나의 추가적인 화학 작용기를 구현하고 이에 따라 다가를 부여하는 합성 원료를 언급한다. 유기 다가 이온의 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 화학 작용기가 추가적인 전하이므로 상기 유기 다가 이온은 둘 또는 그 이상의 동일하거나 상이한 전하들을 지닌다. 상기 유기 다가 이온은 순 양성, 순 음성 또는 순 중성의 전하를 지닐 수 있다. 상기 유기 다가 이온이 순 양성인 경우, 이는 염화물들, 브롬화물들, 황산염들, 유기산들, 젖산들(lactates), 글루콘산들(gluconates) 그리고 상기 방법과 양립할 수 있는 임의의 다른 음이온과 같은 음이온들과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 다가 이온의 특정한 양성 전하들은 아민, 이민 또는 다른 질소 모이어티들에 의해 공급된다. 상기 유기 다가 이온은 추가적으로 혼합된 화학적 특성이 될 수 있고, 소수성 잔기들, 다른 기능적 모이어티들을 포함할 수 있거나 및/또는 이는, 예를 들면, 수소 결합들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 금속 배위 그리고 삽입(intercalation)에 참여하는 능력을 포함하여 다른 유형들의 화학적 상호작용들에 참가하는 능력을 소유할 수 있다. 일부 실시예들에서 양성으로 대전된 유기 다가 이온들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 디아미노산들, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리오르니틴(polyornithine); 폴리에틸렌이민; 폴리알릴아민; 폴리디메트린(polydimethrine), 폴리메틸아크릴아미도프로필트리메틸암모니아(polymethylacrylamidopropyltrimethylammonia); 폴리디알릴디메틸암모니아(polydiallyldimethylammonia); 폴리비닐벤질트리메틸암모니아(polyvinylbenzyltrimethylammonia); 폴리비닐구아니딘(polyvinylguanidine); 폴리(poly)(N-에틸(ethyl)-4-비닐피리딘(vinylpyridine); DEAE-텍스트란(dextran); DEAE-셀룰로오스; 에타크리딘(CAS 번호 442-16-0; 7-에톡시아크리딘(ethoxyacridine)-3,9-디아민(diamine)); 트리스(2-아미노에틸)아민; 구아니딘; 클로르헥시딘(chlorhexidine); 알렉시딘(alexidine); 시트리시달(citricidal), 프로타민(protamine); 스페르민(spermine); 스페르미딘(spermidine); 살민(salmine); 치토산(chitosan); 그리고 전술한 것들의 변이체들 및 유도체들과 같은 디-, 트리 또는 보다 큰 동종- 혹은 이종-펩티드들을 포함한다. 예를 들면, 에타크리딘의 변이체들과 유도체들은 9-아미노아크리딘(aminoacridine)(아민아크린(aminacrine)), 3,6 아크리딘디아민(acridinediamine)(프로플라빈(proflavin)), 아크리소르신(acrisorcin), 아크리잔(acrizane)(페나크리단(phenacridane)), 아크리딘오란지(acridineorange), 퀴나크린(quinacrine), 아크리시드(acricide), 아크리돈(acridone), 아크리딘(acridine)-9-카르복시산(carboxylic acid), 아크라닐(acranil)(1-[(6-클로로(chloro)-2-메톡시(methoxy)-9-아크리디닐(acridinyl))아미노(amino)]-3-(디에틸아미노)(diethylamino)-2-프로파놀디하이드로클로라이드(propanoldihydrochloride)), 페노사프라닌(phenosafranin), 페녹사진(phenoxazine), 페노티아진(phenothiazine), 아크리플라빈(acriflavine)(3,6-디아미노(diamino)-10-메틸아크리디늄(methylacridinium), 클로라이드 및 3,6-아크리디네이디아민(acridineidiamine)), 그리고 이들의 염들(예를 들면, 염화물들, 브롬화물들, 황산염들, 젖산들, 글루콘산들)을 포함하는 것으로 이해된다. 효과적인 전기양성 다가 유기 이온들의 다른 등급은 메틸렌 블루(methylne blue)와 같은 티아진들(thiazines), 그 유도체들, 유사체들 및 이의 염들을 포함한다. 상기 유기 다가 이온이 순 전기음성일 경우, 이는 나트륨이나 칼륨과 같은 양이온들, 또는 상기 방법과 양립할 수 있는 임의의 다른 양이온과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 다가 이온의 특정한 음성 전하들은 카르복실(carboxyl), 포스포(phospho) 또는 술포(sulfo) 모이어티들에 의해 공급된다. 상기 유기 다가 이온은 추가적으로 혼합된 화학적 특성일 수 있고, 소수성 잔기들, 다른 기능성 모이어티들을 포함할 수 있거나 및/또는 이는, 예를 들면, 수소 결합, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 금속 배위 및 삽입에 참가하는 능력을 포함하여 다른 유형들의 화학적 상호작용들에 참여하는 능력을 소유할 수 있다. 일부 실시예들에서 음으로 대전된 유기 다가 이온들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 헵탄산, 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 데칸산(decanoic acid)과 같은 지방산들, 메틸 블루, 이온성 폴리머들 그리고 이의 염들(예를 들면, 염화물들, 브롬화물들, 황산염들, 젖산들, 글루콘산들)을 포함한다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합되는 다중 뉴클레오티드 모노머들로 구성되는 생물 고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)은 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합들의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다.

"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 주로 구성되는 복합 유기 고분자들의 기의 임의의 하나를 언급한다. 상기 단백질은 천연이나 재조합으로 유래된 것일 수 있다. 단백질들은 글리코실화(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 또는 다른 화학 모이어티들(moieties)과의 접합(conjugation)을 통해서와 같이 비아미노산 모이어티들로 변형될 수 있다. 단백질의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자들, 효소들 그리고 펩티드 호르몬들을 포함한다.

"단백질 제제(protein preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포가 없는 세포 배양 상청액(supernatant) 또는 정제의 단계로부터 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같이 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성 또는 대부분의 수성 용액을 언급한다.

"불순물이 섞인 제제(impure preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포가 없는 세포 배양 상청액, 또는 세포 추출물, 또는 체액, 또는 정제의 단계로부터의 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같은 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성 또는 대부분의 수성 용액을 언급한다.

"계면활성제(surfactant)"는 일반적으로 소수성 부분 및 친수성 부분들을 구현하는 등급의 유기 분자들과 같은 "표면 활성제들(surface active agents)"을 포함하며, 이들을 양친매성으로 언급하게 된다. 수성 용액들 내의 충분한 농도들에서, 계면활성제들은 물과의 접촉을 최소화하도록 중심에 집중되는 상기 소수성 부분들 및 물과의 접촉을 최대화하도록 외측으로 발산되는 상기 친수성 부분들을 갖는 클러스터들(clusters)로 자기 연관될 수 있다. 특히 소수성 특성을 가지거나 소수성 특성 영역들을 소유하는 물질들을 함유하는 경우의 생물 제제들의 존재에서, 상기 계면활성제들의 소수성 부분은 상기 소수성 물질의 일부들과 자발적으로 연관되는 경향이 있고, 상기 계면활성제의 친수성 부분의 영향을 통해 그 용해도를 증가시킨다. 이들은 또한 수성 용제 내에 모두 용해되는 다른 소수성 물질들 사이에 일어나는 소수성 상호작용들을 조절하는 데 사용될 수 있다. 여기에 개시되는 일부 실시예들을 수행하기 위해 적합한 계면활성제들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리소르베이트(polysorbate) 계면활성제들(예를 들면, 트윈(Tween) 20, 폴리옥시에틸렌(Polyoxyethylene) (20) 소르비탄 모노로레이트(sorbitan monolaurate) 및 트윈 80, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate)) 및 트리톤(Triton)(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸(tetramethylbutyl))-페닐 에테르(phenyl ether))와 같은 비이온성 계면활성제들, 그리고 차프스(CHAPS)(3-[(3-클로아미도프로필(Cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판술포네이트(propanesulfonate)), 차프소(CHAPSO)(3-[(3-클로아미도프로필) 디메틸암모니오]-2-하이드록시(hydroxy)-1-프로판술포네이트) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)(예를 들면, (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(하이드록시메틸(hydroxymethyl))-6-옥톡시옥산(octoxyoxane)-3,4,5-트리올(triol))과 같은 쌍성이온성 계면활성제들을 포함한다.

"입자들(synthetic particles)"은 크기가 100㎚ 이하로부터 100미크론 이상의 범위가 될 수 있다. 이들은 다공성 또는 비다공성이 될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 폴리메타크릴레이트들(polymethacrylates), 폴리아크릴레이트들(polyacrylates), 아가로오스(agarose), 셀룰로오스, 덱스트란, 또는 다른 폴리머들로 구성되는 중합체일 수 있거나, 이들은 실리카와 같은 무기물일 수 있다. 이들은 전체적으로 균일한 구조가 될 수 있거나, 이들은 금속 합금이나 소수성 폴리머와 같은 하나의 물질의 내측 코어로 구성되고 고도로 수화되거나 고도로 수화된 표면을 생성하도록 화학적 기들의 부착을 허용하는 적용된 표면으로 코팅되는 화합물이 될 수 있다. "합성 입자들(synthetic particles)"은 크로마토그래피 응용들을 위해 설계된 입자들이나, 크로마토그래피 분야와 완전히 구별되는 응용들을 위해 의도된 입자들을 포함할 수 있다.

"우레이드(ureide)"는 하나 또는 그 이상의 요소(urea) 모이어티들 또는 이의 유도체들을 포함하는 천연이나 합성의 순환형 또는 비순환형 유기 분자들을 언급한다. 일부 실시예들에 있어서, 요소, 요산(uric acid), 히단토인(hydantoin), 알란토인(CAS 번호 97-59-6; 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모케인(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리옥실산 디우레이드(glyoxylic acid diureide), 2,5-디옥소(dioxo)-4-이미다졸리디닐 요소(imidazolidinyl urea), 푸린들(purines), 그리고 이들의 유도체들과 같은 우레이드들이 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 화학식 R-CO-NH-CO-NH₂ 또는 R-CO-NH-CO-NH-CO-R' 또는 R'R"NH-CO-NR'"R""의 유기 분자들이 제공되며, 여기서 관련된 "R-기들"은 H 또는 임의의 유기 모이어티가 될 수 있다.

"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되고, RNA 또는 DNA 코어, 단백질 막 및 보다 복잡한 형태들에서는 둘러싸는 외피(envelope)로 구성되는 한외현미경적(ultramicroscopic)(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경)이고, 대사 작용적으로 불활성인 감염원(infectious agent)을 언급한다.

일부 실시예들에 있어서, 입체 배제 크로마토그래피(SXC)는 유동화된 친수성의 비이온성 입자들에 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 10미크론 이하부터 200미크론 이상까지의 범위가 될 수 있는 마이크로입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 크기가 10㎚ 이하부터 1,000㎚까지의 범위가 될 수 있는 나노입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 비다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 미세 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 거대 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 자성 표면상이나 자기장 내에 이들의 포획을 가능하게 하는 방식으로 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC는 유동화된 친수성의 비이온성 입자들에 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, SXC는 유동화된 친수성의 전기양성 입자들에 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, SXC는 유동화된 친수성의 전기음성 입자들에 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 10미크론 이하로부터 200미크론 이상까지의 범위가 될 수 있는 마이크로입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 크기가 10㎚ 이하부터 1,000㎚까지의 범위가 될 수 있는 나노입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 비다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 미세 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 거대 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 SXC 입자들은 자성 표면상이나 자기장 내에 이들의 포획을 가능하게 하는 방식으로 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 복수의 입자들로 구성될 수 있다. 이와 같은 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 10미크론 이하부터 200미크론 이상까지의 범위가 될 수 있는 평균 크기의 마이크로입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이크로입자들은 비다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이크로입자들은 미세 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이크로입자들은 거대 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이크로입자들은 자성 표면상이나 자기장 내에 이들의 포획을 가능하게 하는 방식으로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 10㎚ 이하부터 200㎚ 이상까지의 범위가 될 수 있는 평균 크기의 나노입자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노입자들은 비다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노입자들은 미세 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노입자들은 거대 다공성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노입자들은 자성 표면상이나 자기장 내에 이들의 포획을 가능하게 하는 방식으로 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 하나 또는 그 이상의 다공성 멤브레인들로 구성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 공극들은 0.1미크론부터 5미크론까지의 범위에 있는 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 공극들은 100㎚부터 5㎚까지의 범위에 있는 평균 직경을 가질 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면의 전기양성도는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노, 에틸렌 디아미노, 디에틸아미노에틸, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 약한 음이온 교환 기들; 사차 아미노기들과 같은 강한 음이온 교환 기들; 폴리리신, 폴리아르기닌 또는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜타민, 폴리프로필렌이민테트라아민, PAMAM 덴드라이머(에틸렌디아민 코어), 또는 전술한 것들의 임의의 결합들과 같은 결합된 약-강 교환체들을 포함하는 화학적 기들에 의해 부여될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 전기양성 표면의 전기양성도는 혼합된 화학 특성을 생성하는 하나 또는 그 이상의 이차 작용기들에 의해 수반된 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 전기양성도가 우세한 표면 화학으로 남는 한 상기 표면은 음성 전하들을 지닐 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 표면은 소수성 기들, pi-pi 결합 기들, 수소 결합 기들, 또는 금속-킬레이트화 기들을 포함할 수 있다. 상기 이차 작용기들은 상기 입자들이 합성되는 제조 물질들 또는 프로세스의 의도하지 않은 부산물로서 상기 멤브레인 표면들 상에 존재할 수 있거나, 이들은 의도된 설계에 의해 존재할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, NaCl 보다는 하나 또는 그 이상의 염들이 세척 단계에 사용될 수 있다. 이와 같은 염들은 때때로 나트륨 또는 칼륨 이소티오시아네이트(isothiocyanate)로 예시되는 바와 같은 구조 절단 염들로 언급되는 이른바 카오트로픽 염들(chaotropic salts), 또는 황산암모늄, 시트르산나트륨 또는 인산칼륨으로 예시되는 바와 같은 때때로 구조 형성 염들로 언급되는 이른바 코스모트로픽 염들(kosmotropic salts)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 염들 이외에 세척제들(washing agents)이 요소와 같은 비이온성 카오트로프들(chaotropes), 또는 차프스(CHAPS), 차프소(CHAPSO), 옥타글루코시드(octaglucoside), 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton)과 같은 이온성 혹은 쌍성 이온성 계면활성제들; 또는 에틸렌글리콜이나 프로필렌글리콜과 같은 비이온성 유기 용제들; 또는 수크로오스(sucrose)나 소르비톨(sorbitol)과 같은 당들, 또는 킬레이트화제들(chelating agents)과 같이 염과 결합하여 또는 대신에 사용될 수 있다. 이들의 이온적 성질 및 음이온 교환 프로세스들을 간섭하는 이들의 잠재성으로 인하여, 트렌(TREN)과 같은 전기양성 킬레이트화제들이 에드타(EDTA)와 같은 전기음성 킬레이트화제들보다 바람직할 수 있다. 아르기닌과 같은 아미노산들과 같이 다른 세척제들 또한 동일한 이유로 길레이트화제들로 보다 바람직한 전기양성 우세 종들로 고려될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 단일의 유닛 동작으로 수행된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 입체 배제 크로마토그래피 입자들 상의 상기 IgG의 유지를 증진시키도록 사용되는 상기 PEG는 8kDa, 또는 6kDa, 또는 4kDa, 또는 3kDa, 또는 2kDa, 또는 1kDa의 평균 크기가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입체 배제 크로마토그래피 입자들 상의 상기 IgG의 유지를 증진시키도록 사용되는 물질은 PEG보다는 폴리머, 예를 들면 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 또는 다른 비이온성 유기 폴리머가 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 항체 산물은 약 150kDa의 분자 질량을 갖는 IgG와 같은 완전히 온전한 항체이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 조절된 세포 배양 상청액(cell culture supernatant: CCS)으로 구성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 CCS는 원심분리, 또는 응집(flocculation), 또는 여과, 또는 이들 기술들의 일부 결합에 의해 조절된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 CCS는 상기 제제의 크로마틴 함량 및/또는 응집체 함량을 특히 감소시키는 화학 첨가제들의 사용을 포함하는 보다 포괄적인 수단에 의해 조절된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 CCS는 99% 또는 그 이상의 크로마틴을 제거하고, 90%-99%의 항체 회수를 유지하면서 비-히스톤 숙주 단백질, 엔도톡신 및 바이러스의 실질적인 제거와 1% 또는 그 이하까지의 응집체 함량의 감소를 동시 발생적으로 구현하는 방법으로 분류된다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 청구된 실시예들은 응집체 함량을 감소시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 청구된 실시예들은 항체 조각들의 함량을 감소시킨다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 상기 전기양성 표면에 결합된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 개시되는 프로세스는 IgM 단일클론 항체의 정제를 위해 적용된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 선택적으로 0.5M 내지 1.5M과 같은 NaCl의 상승된 농도의 존재에서, 상기 IgM은 상기 IgM을 침전시키거나, 친수성 표면상에 이의 부착을 야기하기에 충분한 PEG의 농도와 초기에 접촉된다. NaCl은 후속하는 세척 단계에서 제거되는 반면, 충분한 PEG는 상기 IgM이 침전되거나 친수성 입자들과 연관되는 것을 유지하도록 잔류한다. 상기 PEG 농도는 상기 IgM을 가용화시키도록 충분하게 감소된다. 입자들은 존재하는 경우에 제거되고, 상기 IgM은 그가 결합되는 전기양성 표면에 접촉된다. 보다 약하게 결합되는 오염물들은 일반적으로 결합에 실패하며, 이에 따라 제거된다. 상기 IgM은 상기 전기양성 표면으로부터 용리되는 반면, 보다 강하게 결합된 산성 오염물들은 결합되어 남고 이에 따라 제거된다. 많은 비-IgG 단백질들이 유사한 방식으로 행동할 것인 점과 상기 방법의 많은 변형들이 개시된 방법들의 기본적인 원리들로부터 벗어나지 않고 성공적으로 적용될 수 있는 점이 분명해질 것이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 불순물이 섞인 IgG 제제는 전기양성 표면과 접촉되기 전에 전기음성 표면과 접촉됨에 의해 처리된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 상기 전기음성 표면에 결합되는 반면에 PEG는 그렇지 못하며, 후자는 이에 따라 제거된다. 이는 잠재적으로 상기 IgG가 상기 전기양성 표면과 접촉되는 단계가 이른바 통과 모드(flow-through mode)로 수행되는 것을 가능하게 하며, 여기서 상기 항체는 결합되지 않지만, 산성 오염물들은 대부분의 부분에 대해 결합되는 점이 인식될 것이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서. 상기 전기음성 표면은 멤브레인, 모놀리스(monolith) 또는 복수의 입자들로 구성된다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기음성 작용기는 수소 결합, 소수성 상호작용들 및/또는 배위 결합들에 참가하는 상기 표면의 능력을 부여하는 다른 작용기들에 의해 수반된다.

해당 기술 분야의 숙련자라면 전술한 프로세스들의 많은 변형들이 그 기본적인 요소들을 벗어나지 않고 채용될 수 있는 점을 인식할 것이다. 예를 들면, 실시예들이 결합되지 않은 프로세스 단계들을 수반할 수 있으므로 둘 또는 셋 또는 그 이상의 단위 동작들로 수행된다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 청구된 실시예들은 다른 정제 방법들에 선행되거나, 후속되거나, 선행되고 후속되는 모두가 될 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 개시된 방법들은 특히 분별 방법을 수반할 수 있으며, 이에 따라 원하는 IgG가 표면상에 유지되므로, 잔류하는 PEG가 세척될 수 있고 상기 항체가 후속하여 이제 PEG가 없는 이가 유지되는 표면으로부터 용리된다, 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상부에 상기 항체가 유지되는 상기 표면은 양이온 교환 크로마토그래피 배지, 아파타이트(apatite) 배지, 양성 전하들 및 소수성을 결합시키는 혼합 모드 배지로 이루어진 그룹으로부터의 크로마토그래피 배지가 될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 양성 전하들 및 소수성을 결합시키는 혼합 모드 크로마토그래피 배지는 캅토 애드히어(Capto adhere)(GE 헬스케어(Healthcare))라는 상품명으로 시판되는 상업용 크로마토그래피 제품으로 나타낸다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 상기 수확물을 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온들과 접촉시키는 단계를 포함하는 조절하는 방법에 의한 최초의 생물학적 유체보다 적어도 99% 낮은 레벨까지 크로마틴이 감소된다. 일부 이와 같은 실시예들에 있어서, 상기 다가 유기 이온은 전기양성이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온들은 메틸렌 블루, 에타크리딘, 클로르헥시딘, 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드로 이루어진 양이온들의 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상인 가용성의 전기양성 다가 이온을 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온은 표면에 공유결합으로 부착되기 때문에 불용성이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온은 일차 아미노기, 이차 아미노기, 삼차 아미노기, 사차 아미노기, 하나 또는 그 이상의 종류들의 아미노기들에 의해 부여되는 하나 이상의 양성 전하들을 함유하는 복합 양이온으로 구성되는 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상인 전기양성 다가 이온이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 불용성의 전기양성 다가 이온은 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온은 전기음성이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온은 헵탄산, 옥탄산, 옥텐산, 노난산, 노넨산, 데칸산, 메틸 블루로 이루어진 음이온들의 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상인 강요성의 전기음성 다가 이온을 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 불용성의 전기음성 다가 이온은 포스포(phospho) 기, 카르복실 기, 술포(sulfo) 기, 하나 또는 그 이상의 종류들의 음성으로 대전된 기들에 의해 부여되는 하나 이상의 음성 전하를 함유하는 복합 음이온으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 다가 유기 이온은 이미노디아세트산(iminodiacetic acid) 또는 니트릴로아세트산(nitriloacetic acid)이 될 수 있는 불용성의 복합 전기음성 다가 이온이다.

일부 실시예들에 있어서, 불용성 다가 이온은 금속 이온에 대해 1:1의 친화도를 가진다.

일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 0.6% 내지 50%, 0.7% 내지 20%, 0.8% 내지 10%, 0.9% 내지 5%, 1% 내지 2%, 또는 중간 값으로 이루어진 그룹으로부터의 범위 내의 과포화되는(supersaturating) 농도에 선택적으로 존재할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 개시된 방법의 끝에서 상기 IgG 제제가 비이온성 유기 폴리머의 비-IgG를 침전시키는 농도를 함유할 것인 점이 주어지면, 후속되는 정제 방법은 상기 제제로부터 이러한 폴리머를 감소시키거나 제거하도록 특별히 선택될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 IgG는 상기 비이온성 유기 폴리머가 결합되지 않는 적어도 하나의 전기양성 표면에 결합될 수 있으며, 이에 따라 제거된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 IgG 제제들을 포함하는 단백질의 크로마토그래피 분별을 수행하는 목적을 위해 알려지고 시판되는 바와 같은 이른바 양이온 교환체가 될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 양이온 교환체는 멤브레인, 모놀리스, 충전된 입자들의 칼럼, 또는 다른 물리적 포맷의 형태가 될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 적어도 하나의 전기양성 표면은 그 전기음성도를 통한 정전기적 상호작용들 이외에도 이를 소수성 및/또는 수소 결합 상호작용들에 참가하게 하는 표면 조성을 가지는 이른바 다중 모드 크로마토그래피 물질로 구성될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 또한 소수성 상호작용들 및 수소 결합에 이를 참가하게 하는 표면 조성을 갖는 전기양성 크로마토그래피 물질이 채용될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, PEG를 함유하는 IgG 제제가 1M의 NaCl, pH 7.0에서 캅토 애드히어로 충전된 칼럼에 적용되었다. 상기 항체는 결합되었지만, 상기 PEG는 그렇지 않았고 이에 따라 제거되었다. 상기 항체는 상기 NaCl 농도를 0.3M까지 감소시켜 용리되었으며, 그레 따라 IgG가 용리되었다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 상기 입자들에 의해 유지되는 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가된다. 상기 입자들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되며, 이하에서 세척 완충제(wash buffer)로 언급되는 깨끗한 PEG 완충제로 대체된다. 전기양성 입자들은 상기 세척 완충제의 첨가와 함께 또는 이후에 첨가될 수 있다. 상기 PEG의 존재를 제외하면, 상기 완충제 제형은 상기 전기양성 입자들에 대한 잔류하는 오염물들의 결합을 위해 적합한 반면, 항체는 결합되지 않고 남는다. 상기 액체는, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 다시 제거된다. 상기 SXC 및 전기양성 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 현탁된다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 IgG는, 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 전기양성 입자들을 유지하는 멤브레인을 통한 여과에 의해 수집되며, 이는 버려지거나 재활용될 수 있다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분(high-salt) 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 전기양성 입자들은 상기 고염분 세척 완충제의 첨가와 함께 또는 이후에 첨가될 수 있다. 상기 고염분 세척 완충제는 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 제거된다. 상기 SXC 및 전기양성 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 세척 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 현탁된다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 IgG는, 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 전기양성 입자들을 유지하는 멤브레인을 통한 여과에 의해 수집되며, 이는 버려지거나 재활용될 수 있다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 고염분 세척 완충제는 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 제거된다. 상기 SXC 및 전기양성 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 세척 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 전기양성 입자들이 첨가되며, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 현탁된다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 IgG는, 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 전기양성 입자들을 유지하는 멤브레인을 통한 여과에 의해 수집되며, 이는 버려지거나 재활용될 수 있다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 고염분 세척 완충제는 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 상기 전기양성 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거된다. 상기 SXC 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 세척 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 현탁된다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 멤브레인에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 IgG는 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 산성 입자들을 유지하는 상기 전기양성 멤브레인을 통한 여과에 의해 수집된다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 고염분 세척 완충제는, 예를 들면 동일한 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 전기양성 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거된다. 상기 SXC 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 현탁된다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 IgG는, 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 산성 오염물들을 유지하는 상기 전기양성 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거된다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 고염분 세척 완충제는, 예를 들면 동일한 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거된다. 상기 SXC 입자들은 PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 세척 완충제 내에 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되는 결과로 현탁된다. 상기 IgG는, 예를 들면 상기 SXC 입자들 및 산성 오염물들을 유지하는 전기양성 멤브레인을 통한 여과에 의해 수집된다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 표준 정밀여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 고염분 세척 완충제는, 예를 들면 동일한 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제로 대체되며, 이는 상기 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않는다. 상기 세척 완충제는 100kDa 내지 300kDa의 크기의 구형 단백질들에 일반적으로 대응되는 약 7.5㎚ 내지 20㎚의 평균 공극 크기를 갖는 전기양성 멤브레인을 통해 계속적으로 순환된다. PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 완충제가 상기 시스템 내로 스며들며, 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 입자들에 의해 결합되는 결과로 상기 시스템으로부터 상기 PEG를 점진적으로 대체한다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 멤브레인에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 유지된 IgG는 유지물 주(retentate line)로부터 수집되는 반면, 상기 멤브레인은 산성 오염물들을 유지한다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, SXC 입자들은 단일클론 IgG 항체를 함유하는 세포 배양 상청액에 첨가된다. PEG는 0.8M의 NaCl의 존재에서 상기 입자들에 의해 유지되는 상기 IgG를 위해 요구되는 레벨까지 첨가되며, 이는 또한 용액 내에 존재한다. 상기 오염물들에 결합되지 않은 상기 액체를 함유하는 오염물들은, 예를 들면 표준 정밀여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되고, 이하에서 고염분 세척 완충제로 언급되는 깨끗한 PEG-NaCl 완충제로 대체된다. 상기 현탁된 SXC 입자들을 함유하는 고염분 세척 완충제는 100kDa 내지 300kDa의 크기의 구형 단백질들에 일반적으로 대응되는 약 7.5㎚ 내지 20㎚의 평균 공극 크기를 갖는 전기양성 멤브레인을 통해 계속적으로 순환된다. 이하에서는 세척 완충제로 언급되는 NaCl이 결핍되거나 부족한 깨끗한 PEG 완충제는 PEG의 존재를 제외하면 전기양성 표면에 산성 오염물들이 결합하기에 적합한 반면, 상기 항체는 결합되지 않으며, 상기 고염분이 대체될 때까지 상기 시스템 내로 스며든다. 상기 세척 완충제는 상기 전기양성 멤브레인을 통해 계속적으로 순환된다. PEG가 결핍되거나 부족하지만 그 이외에는 상기 세척 완충제와 유사한 완충제가 상기 시스템 내로 스며들며, 상기 IgG가 상기 입자들로부터 가용성의 형태로 분리되고, 오염물들이 상기 전기양성 멤브레인에 의해 결합되는 결과로 상기 시스템으로부터 상기 PEG를 점진적으로 대체한다. 상기 오염물들이 상기 전기양성 멤브레인에 결합되는 충분한 시간의 간격 후, 상기 유지된 IgG는 유지물 주로부터 수집되는 반면, 상기 멤브레인은 산성 오염물들을 유지한다. 밀접하게 관련된 실시예에 있어서, SXC를 위한 입자들은 전체 프로세스에서 생략될 수 있다.

여기에 개시되는 실시예들의 추가적인 목적들과 이점들은 후속하는 설명에서 부분적으로 설시될 것이고, 다음의 설명으로부터 자명해질 것이며, 여기에 개시되는 실시예들의 실행에 의해 학습될 수 있다. 여기에 개시되는 실시예들의 목적들과 이점들은 특허청구범위 내에 특정되는 요소들 및 결합들에 의하여 구현되고 수득될 것이다.

전술한 일반적인 기재와 다음의 상세한 기재 모두가 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구되는 바와 같은 여기에 개시되는 실시예들을 제한하는 것은 아닌 점이 이해되어야 할 것이다.

실험예들

실험예 1: 입체 배제 크로마토그래피 배지들에 결합되는 IgG를 위한 조건들의 정의

실험은 포유류의 세포 배양에 의해 생성된 항-HER2 단일클론 항체로부터의 숙주 세포 단백질들의 가장 효과적인 감소를 지지하는 염 농도를 결정하도록 수행되었다. 상기 실험은 약 30미크론의 평균 직경을 갖는 비이온성의 친수성 녹말 입자들을 사용하여 수행되었다. 상기 입자들은 세포 배양 상청액(cell culture supernatant: CCS)의 다른 부분 표본들과 혼합되었다. 상기 CCS의 숙주 단백질 농도는 약 243,011ppm이었다. 상기 샘플은 알란토인, 에타크리딘, 음이온 교환 입자들 및 양이온 교환 입자들로 처리되었고, 이는 상기 숙주 단백질 농도를 165,213ppm까지 감소시켰다. PEG-6000이 18%의 최종 농도까지 첨가되었다. NaCl이 이후에 0.0M, 0.2M, 0.4M, 0.8M 및 1.0M을 함유하는 시리즈들을 생성하도록 다른 부분 표본들에 첨가되었다. 상기 처리된 샘플들 내의 숙주 세포 오염물 레벨들은 15,558ppm, 1,994ppm, 662ppm, 90ppm 및 266ppm이었다. 0.8M에서의 정제는 이에 따라 99.95%의 향상; 3로그(log) 이상의 감소를 나타낸다.

실험예 2: 음이온 교환 처리를 위한 염 농도의 결정

실험예 1의 항체가 VEAX에 의해 평가되었다. 샘플들은 염이 결핍된 3으로부터 9까지 범위의 다른 pH 값들에서 별도의 실험들로 평형화된 VEAX 칼럼에 적용되었다. 샘플들은 또한 0M부터 1M까지의 다른 염의 레벨들을 포함하는 VEAX 칼럼에 pH 8에서 적용되었다. 가장 효과적인 오염물 감소는 염의 부존재에서 pH 8.0에서 구현되었다. 후속되는 실험들은 pH 8.2에서 타겟을 정제하였다. 성과는 pH 8.15 및 8.25에서 모두 낮았다. 이들 조건들 하에서, VEAX는 99.8%까지의 숙주 단백질들, DNA, 바이러스 및 엔도톡신을 포함하여 숙주 단백질들의 감소를 구현하였다. 이들 조건들은 이러한 항체에 대하여 SXC와 함께 음이온 교환에 의한 오염물 추출을 위한 조건들을 한정하였다.

실험예 3: 음이온 교환 처리를 위한 염 농도의 결정

실험예 1 및 실험예 2의 항체가 평탄한 멤브레인 및 중공형 섬유 포맷들로 적층된 음이온 교환 멤브레인들에 적용되었다. 오염물 감소는 본질적으로 VEAX를 위한 동일한 조건들 하에서와 동일하였다. 이들 실험 결과들은 SXC와 음이온 교환 멤브레인들의 통합이 6로그 이상의 정제(99.9999%)를 구현할 수 있는 점을 보여준다.

실험예 4: SXC와 전기양성 입자들의 결합

세포 배양 상청액으로부터의 HER2 IgG가 1M의 NaCl에서 19%의 PEG-6000의 존재에서 녹말 입자들에 결합되었다. 다우엑스(Dowex) AG1x8 200메시-400메시의 형태로 전기양성 입자들 또한 4%w/v의 양으로 존재하였다. 유체는 0.22미크론의 공극들을 갖는 멤브레인을 통한 여과에 의해 제거되었고, 이후에 19%의 PEG-6000, 1M의 NaCl 및 50mM의 트리스(Tris), pH 8.0을 함유하는 세정 완충제로 대체되었다. 상기 유체는 제거되었고 19%의 PEG-6000 및 50mM의 트리스, pH 8.0을 함유하는 세정 완충제로 대체되었다. 이러한 단계가 반복되었고, 이후에 상기 유체는 여과에 의해 제거되었다. 상기 유체는 50mM의 트리스, pH 8.0으로 대체되었다. 숙주 세포 단백질들은 최초 샘플 내의 142,000ppm으로부터 약 120ppm까지 감소되었다.

실험예 5: SXC와 전기양성 입자들의 결합

녹말 입자들이 19%의 PEG-6000 및 50mM의 트리스, pH 8.0으로 세척되었기 전까지 상기 전기양성 입자들이 첨가되지 않았던 점을 제외하면 실험예 4의 형태가 반복되었다. 상기 유체는 제거되었고, 이후에 IgG를 상기 SXC 입자들과 분리하도록 50mM의 트리스, pH 8.0으로 대체되었다. 숙주 세포 단백질들은 최초 샘플 내의 142,000ppm으로부터 약 1ppm 이하까지 감소되었다.

실험예 6: SXC와 전기양성 입자들의 결합

다우엑스(Dowex) 입자들을 대체하여 우노스피어(UNOsphere) Q 입자들이 사용된 점을 제외하면 실험예 5의 형태가 반복되었다. 숙주 세포 단백질의 감소를 갖는 결과들은 동등하였지만, IgG 회수는 보다 높았다.

실험예 7: SXC와 전기양성 입자들의 결합

가장 우수한 결과들을 구현하는 데 얼마나 많은 시간이 요구되었던 가를 결정하는 증가분들로 상기 SXC 입자들로부터 IgG의 분리가 변화되었던 후에, 입자 노출의 지속과 함께 실험예 6의 형태가 반복되었다. 결과들은 본질적으로 30분 및 60분에서 동일하였지만, 보다 낮은 노출 시간들에서는 더 못하였다.

실험예 8

275,357ppm의 숙주 세포 단백질들, 5,283ppm의 DNA 및 13.96%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인, 이후에 0.025%의 에타크리딘의 첨가에 의해 조절되었고, 이후에 15분 동안 혼합되었다. 마크로프렙 하이(MacroPrep High) Q, 마크로프렙 하이(MacroPrep High) S, 마크로프렙(Macroprep) t부틸(Butyl) 그리고 첼렉스(Chelex)-100(바이로-라드 라보라토리스(Bio-Rad Laboratories))의 균등한 혼합물이 50mM의 헤페스, 100mM의 NaCl, pH 7.0로의 세정에 의해 사전에 평형화되었다. 평형화되고 혼합된 입자들은 2%(v:v)의 양으로 불순물이 섞인 IgG 제제에 첨가되었고, 이후에 4도씨-8도씨에서 하룻밤 동안 혼합되었다. 고체들은 정밀여과에 의해 제거되었다. 1.25㎎의 녹말이 코팅된 200㎚의 자성 입자들이 20mL의 조절된 불순물이 섞인 IgG 제제에 첨가되었다. 1.6M의 NaCl, 50mM의 헤페스, pH 7.0 내의 20mL의 36% PEG-6000이 18%의 PEG-6000 및 0.8M의 NaCl의 최종 농도를 생성하도록 500rpm에서 와류 혼합기(vortex mixer) 상에서 혼합되면서 서서히 첨가되었다. 와류 혼합은 30분 동안 계속되었고, 이후에 상기 IgG-적재된 입자들이 자기적으로 수집되었다. 상기 IgG-적재된 입자들은 신선한 50mM의 헤페스, 0.8M의 NaCl, pH 7.0으로 세척되었고, 상기 세척 용액은 제거되었다. 상기 세척 완충제가 제거되었고, 상기 입자들은 동일한 방식으로 다시 세척되었다. 상기 세척 완충제는 제거되었고, 상기 항체는 50mM의 헤페스, 1M의 NaCl, pH 7 내에서 가용화되었다. 1mL의 칼럼이 전기양성의 소수성 크로마토그래피 배지(캅토 애드히어(Capto adhere), GE 헬스케어(Healthcare))로 충전되었고, 동일한 조건들까지 평형화되었다. 상기 가용화된 IgG가 상기 칼럼에 적용되었고, 여기서 상기 IgG가 결합되었으며 일부 오염물들이 결합을 가지는 것으로 이해되었던 반면, 잔류 PEG가 결합된다. 시스템으로부터 결합하지 않은 성분들을 보다 완전히 제거하도록 평형 완충제를 갖는 5 칼럼 부피 세척이 이후에 적용되었다. 상기 IgG는 50mM의 헤페스 및 300mM의 NaCl, pH 7.0으로 종료되는 10 칼럼 부피 선형 구배(linear gradient)로 용리되었다. 정제 성과는 다음 표에 나타내며, 여기서 'post-con'은 사후-조건들(post-conditions)을 나타내고, 'post-NP'는 사후 나노입자들을 나타내며, 'post-CA'는 사후 캅토 애드히어를 나타낸다. 회수 하에서 좌측의 값은 이러한 단계에 대한 회수를 나타내지만, 우측의 값은 이전의 단계들에 더하여 이러한 단계에 대한 누적 회수를 나타낸다. 'bld'는 검출의 한계 아래를 나타낸다. 보다 상세한 사항들은 Gagnon 등의 2014 앞서의 문헌에 언급된다.

단계 HCP(ppm) DNA(ppm) 응집체들(%) 회수%

수확(harvest) 275,357 5,283 13.96 100/100

Post-con. 91,275 9 4.88 98/98

Post-NP 441 bld 3.59 87/84

Post-C 2 bld <0.05 81/69

실험예 9

176,244ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 19%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인의 첨가에 의해 조절되었고, 4% 전기양성 금속 친화 입자들(트렌(TREN) 40 하이(high), 바이오-웍스(Bio-Works))이 실온에서 4시간 동안 혼합되었다. 분석을 위해 제거되었던 샘플은 90,259ppm까지의 숙주 단백질 및 1.2%까지의 응집체들의 감소를 보여주었다. pH는 5.2로 감소되었고, 0.5%의 카프릴릭산(caprylic acid)이 첨가되었으며, 상기 혼합물은 2시간 동안 배양되었다. 분석을 위해 제거되었던 샘플은 1,758ppm에서의 숙주 단백질 및 약 0.4%에서의 응집체들을 보여주었다. 고체들은 전기양성 뎁스 필터(사르토리우스(Sartorius) PC1)을 통해 제거되었다. 숙주 단백질들은 135ppm까지, 응집체들은 0.05% 이하까지 감소되었다. 항체는 pH 7.0에서 18%의 PEG-6000 내의 침전에 의해 정제되었다. 상기 침전물은 이후에 PEG를 제거하도록 1.8M의 황산암모늄으로 세척되었고, 이후에 상기 항체는 50mM의 헤페스, pH 7.0 내에 가용화되었다. 숙주 단백질은 32ppm까지 감소되었다. 50mM의 트리스, pH 8.0에서의 보이드 배제 모드로 동작하는 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(우노스피어 Q, 바이오-라드)에 대한 적용 후, 숙주 단백질은 1ppm 이하로 감소되었다. 800mM의 NaCl의 존재에서 수행되는 상기 PEG 침전만이 다른 병행 실험은 숙주 단백질을 1ppm 이하까지 감소시켰다. 상기 음이온 교환 단계는 숙주 단백질 및 응집체들을 검출할 수 없는 레벨까지 감소시켰다.

실험예 10

286,010ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 23%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인 및 0.025%의 에타크리딘의 첨가에 의해 조절되었고, 실온에서 1시간 동안 교반되면서 배양되었다. 입자들(첼렉스(Chelex)-100, 마크로프렙 t부틸, 마크로프렙 하이 Q, 바이오-라드)의 1:1:1 혼합물이 혼합되었고, 생리적 조건들까지 평형화되었으며, 정착되고 혼합된 입자들이 5%의 결합된 양으로 수확물에 첨가되었고, 이후에 2시간 동안 실온에서 혼합되었다. 숙주 단백질은 43,058ppm까지 감소되었고, 응집체들은 3.4%까지 감소되었다. pH 8.0에서 수행된 일련의 실험들에 있어서, 상기 샘플은 별도의 실험들에서 PEG-6000으로 침전에 의해 분별되었고, 여기서 농도는 600mM, 800mM, 900mM 및 1000mM(1M)이었다. 상기 침전물들은 이후에 PEG, 50mM의 트리스, pH 8.0 내에서 세척되었고, 이후에 상기 항체는 50mM의 트리스, pH 8.0 내에 가용화되었다. 상기 일련의 실험들에서 숙주 단백질은 각기 51ppm, 55ppm, 45ppm 및 41ppm까지 감소되었다. 다우엑스 AG1X2(바이오-라드)의 형태로 음이온 교환 입자들이 5%v/v의 양으로 각 샘플에 첨가되었고 60분 동안 혼합되었다. 상기 일련의 실험들에 걸쳐 숙주 단백질은 16ppm, 17ppm, 15ppm 및 13ppm까지 감소되었다. 최초의 PEG 침전이 pH 7.0에서 수행되었던 점을 제외하면 모든 세부 사항들이 동일한 다른 일련의 실험들이 행해졌다. 상기 PEG 단계 후의 숙주 단백질은 600mM의 NaCl 트랙(track)에 대해 44ppm, 800mM 트랙에 대해 43ppm, 900mM 트랙에 대해 29ppm 및 1,000mM 트랙에 대해 31ppm이었다. 다우엑스 처리 후, 숙주 단백질은 각기 20ppm, 17ppm, 12ppm 및 16ppm로 감소되었다.

실험예 11

286,010ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 23%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인 및 0.025%의 에타크리딘의 첨가에 의해 조절되었고, 실온에서 1시간 동안 교반되면서 배양되었다. 입자들(바이오-라드로부터의 첼렉스-100, 마크로프렙 t부틸, 마크로프렙 하이 Q)의 1:1:1:1 혼합물 및 전기양성 금속 친화 입자들(바이오-웍스로부터의 트렌 40 하이)이 혼합되었고, 생리적 조건들까지 평형화되었으며, 정착되고 혼합된 입자들은 5%의 결합된 양으로 수확물에 첨가되었고, 이후에 2시간 동안 실온에서 혼합되었다. 숙주 단백질은 38,061ppm로 감소되었고, 응집체들은 1.4%로 감소되었다. pH 8.0에서 수행된 일련의 실험들에서, 샘플은 별도의 실험들에서 PEG-6000으로의 침전에 의해 분별되었고, 여기서 NaCl의 농도는 600mM, 800mM, 900mM 및 1000mM(1M)이었다. 상기 침전물은 이후에 PEG, 50mM의 트리스, pH 8.0 내에 세척되었고, 이후에 상기 항체는 50mM의 트리스, pH 8.0 내에 가용화되었다. 숙주 단백질은 각기 79ppm, 69ppm, 56ppm 및 57ppm까지 감소되었다. 다우엑스 AG1X2(바이오-라드)의 형태로 음이온 교환 입자들이 5%v/v의 양으로 각 샘플에 첨가되었고, 60분 동안 혼합되었다. 상기 일련의 실험들에 걸친 숙주 단백질은 18ppm, 17ppm, 16ppm 및 13ppm까지 감소되었다. 초기 PEG 침전이 pH 7.0에서 수행되었던 점을 제외하면 모든 세부 사항들이 동일한 다른 일련의 실험들이 행해졌다. 상기 PEG 단계 후의 숙주 단백질은 600mM의 NaCl 트랙에 대해 94ppm, 800mM 트랙에 대해 62ppm, 900mM 트랙에 대해 67ppm 및 1,000mM 트랙에 대해 46ppm이었다. 다우엑스 처리 후, 숙주 단백질은 각기 28ppm, 9ppm, 23ppm 및 17ppm까지 감소되었다.

실험예 12

321,483ppm의 숙주 단백질 및 26%의 응집체들을 포함하는 IgM를 함유하는 세포 배양 수확물이 25mS/㎝을 전도도를 생성하도록 1%의 알란토인, 0.025%의 에타크리딘 및 NaCl의 첨가에 의해 조절되었다. 상기 혼합물은 1시간 동안 배양되었고, 고체들이 원심분리에 의해 제거되었으며, 액체는 마크로프렙 t부틸, 마크로프렙 하이 Q, 마크로 프렙 하이 S 그리고 첼렉스 100의 동등한 비율들로 충전된 칼럼을 통해 흘렀고, 여기서 수확물에 대한 상기 칼럼의 부피 비율은 5%였다. 숙주 단백질은 73,663ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.8%까지 감소되었다. 상기 샘플은 동시에 분별되었지만, 모두 pH 7에서 13%의 PEG-6000로의 별도의 실험들에서 하나는 100mM의 NaCl로, 다른 하나는 800mM의 NaCl로 분별되었다. 감기 침전물들은 이후에 과잉의 염을 제거하도록 13%의 PEG, 50mM의 헤페스, pH 7.0로 세척되었고, 이후에 상기 IgM가 50mM의 헤페스, pH 7.0으로 가용화되었다. 100mM의 NaCl에서 숙주 단백질은 7,411ppm까지 감소되었다. 800mM의 NaCl에서 숙주 단백질은 417ppm까지 감소되었다. 응집체 함량은 1.1%까지 증가되었다. 상기 샘플들은 pH 7.0에서 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA Separations)에 적용되었고, 염화나트륨 구배로 용리되었다. 100mM의 NaCl에서 PEG 침전에 대응되는 샘플 내의 숙주 단백질들은 1,424ppm까지 감소되었다. 800mM의 NaCl에서 PEG 침전에 대응되는 샘플 내의 숙주 단백질들은 63ppm까지 감소되었다. 응집체들은 양 제제들에 대해 0.01% 이하였다.

여기에 개시되는 본 발명의 실시예들은 보다 높은 정제의 레벨들을 구현하기 위해 다른 정제 방법들과 결합될 수 있다. 이와 같은 다른 정제 방법들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단백질 A 및 다른 형태들의 친화 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화 크로마토그래피, 그리고 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 IgG의 정제를 위해 통상적으로 이용되는 다른 방법들, 그리고 침전, 결정화 및 액상-액상 추출의 방법들도 포함한다. 다양한 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하고, 특정 항체의 필수적인 정제를 구현하도록 이들을 여기에 개시되는 실시예들과 통합하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있을 것이다.

여기서 언급되는 모든 참조 문헌들은 개개의 공보나 특허 또는 특허 출원이 각기 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함되는 구체적이고 개별적으로 나타내어졌던 바와 같은 동일한 정도로 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공보들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항들과 모순되는 점에 있어서, 본 명세서는 임의의 이와 같은 모순되는 물질을 대체하거나 및/또는 이에 우선하는 것으로 의도된다.

성분들, 크로마토그래피 조건들의 양들을 나타내고 본 명세서와 특허청구범위에 설시되는 모든 수치들이 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어로 변경될 수 있는 점이 이해되어야 한다. 이에 따라, 대조적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설시되는 수치적인 변수들은 본 발명의 방법들에 의해 얻어지는 것으로 여겨지는 원하는 성과에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.

상기 방법들의 많은 변경들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 자명할 것인 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기재되는 특정 실시예들은 예로서만 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 한정하는 것을 의미하지는 않는다. 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주에서 본 명세서와 실험예들은 단지 예시적으로 간주되도록 의도된 것이다.

Claims

제제(preparation)로부터 원하는 단백질을 정제하는 방법에 있어서,
(a) 최초 생산 배지 내에 체류하는 약 5% 이하의 크로마틴(chromatin)을 가지는 형태로 상기 제제를 제공하는 단계를 포함하고;
(b) 상기 제제를 비이온성 유기 폴리머 및 염과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 비이온성 유기 폴리머의 농도는 상기 원하는 단백질을 침전시키거나, 친수성 표면상의 부착을 야기하거나, 침전된 상태로 유지시키거나, 상기 친수성 표면상에 부착시키기에 충분하고, 상기 염 농도는 생리적 전도도(physiological conductivity)보다 크게 생성하기에 충분하며;
(c) 선택적으로 생리적 전도도보다 크게 생성하기에 충분한 염 농도의 존재에서 상기 제제를 적어도 하나의 전기양성(electropositive) 표면과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 따라 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 대한 산성 오염물들의 흡착을 방지하지 않으면서 상기 원하는 단백질이 상기 적어도 하나의 전기양성 표면에 실질적으로 흡수되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (d) 상기 제제를 적어도 하나의 비이온성의 친수성 표면과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b) 동안에 상기 염 농도는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 다공성 멤브레인을 통한 통로에 의해 가용성 오염물들을 제거하는 동안에 침전된 원하는 단백질을 상기 다공성 멤브레인 상에 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 염 농도와 독립적으로, 미세다공성 멤브레인을 통한 통과에 의해 가용성 오염물들을 제거하는 동안에 실질적으로 불활성인 상기 미세다공성 멤브레인 상에 침전된 원하는 단백질을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전도도가 생리적 전도도보다 클 때에 미세다공성 멤브레인을 통한 통과에 의해 가용성 오염물들을 제거하는 동안에 전기양성인 상기 미세다공성 멤브레인 상에 침전된 원하는 단백질을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단일의 통합 장치 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머의 평균 중합체 크기는, (a) 약 1,500달톤(Dalton)부터 약 15,000달톤까지, (b) 약 2,000달톤부터 약 12,000달톤까지, (c) 약 3,000달톤부터 약 10,000달톤까지, (d) 약 4,000달톤부터 약 8,000달톤까지, 그리고 (e) 약 5,000달톤부터 약 6,000달톤까지로 이루어진 그룹으로부터 하나의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전도도는 생리적 전도도보다 적어도 1mS/㎝ 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 염은 염화나트륨(sodium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 아세트산나트륨(sodium acetate), 아세트산칼륨(potassium acetate), 티오시안산나트륨(sodium thiocyanate), 티오시안산칼륨(potassium thiocyanate), 구아니디늄 하이드로클로라이드(guanidinium hydrochloride) 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 염은, (a) 약 0.5M부터 약 1.5M까지, (b) 약 2.0M부터 약 3.0M까지, 그리고 이들의 중간 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도에서의 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은, (a) 약 100㎚, (b) 약 220㎚, (c) 약 450㎚, (d) 약 1미크론, (e) 약 2미크론, 그리고 이들의 중갑 값들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 평균 크기의 공극들을 갖는 멤브레인인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 고체는 복수의 입자들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 고체는, 모놀리스 기반의(monolith-based) 크로마토그래피 장치, 멤브레인 기반의(membrane-based) 크로마토그래피 장치, 입자 기반의(particle-based) 크로마토그래피 장치, 거대망상 골격 지지(macroreticulate skeleton supporting) 하이드로겔 기반의(hydrogel-based) 장치, 그리고 이들의 결합들을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 크로마토그래피 장치의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 염 농도는 영(zero)의 양, 1mM, 2mM, 5mM, 10mM, 25mM, 50mM, 100mM, 그리고 이들의 중간 농도들을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 동안의 pH는, (a) 약 8부터 약 9까지, (b) 약 8부터 약 8.5까지, (c) 약 7.5부터 약 8.5까지, (d) 약 7.25부터 약 8.25까지, (e) 약 7.0부터 약 8.0까지, (f) 약 6부터 약 7까지, 그리고 이들의 중간 pH 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안의 pH는, (a) 약 5부터 약 9까지, (b) 약 6부터 약 8까지, (c) 약 6.5부터 약 7.5까지, (d) 약 7.5부터 약 8.5까지, 그리고 이들의 중간 pH 범위들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 친수성 표면은 멤브레인, 모놀리스(monolith) 및 복수의 입자들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하며, 상기 복수의 입자들은 선택적으로 자성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전기양성 표면은 멤브레인, 모놀리스 및 복수의 입자들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하며, 상기 복수의 입자들은 선택적으로 자성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 제제는 세포 배양 배지, 배양된 유기체들로부터의 추출물 및 체액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.