KR20150122198A - 약물 내성 akt 돌연변이체의 검출 및 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

약물 내성 akt 돌연변이체의 검출 및 치료를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

AKT 억제제 내성 암의 확인 또는 진단을 위한 방법, 및 치료를 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

약물 내성 AKT 돌연변이체의 검출 및 치료를 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND TREATING DRUG RESISTANT AKT MUTANT}
본 발명은 종양 성장, 종양 유형 및 약물 내성의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 종양에 대한 억제제 및 진단 마커, 및 암, 약물 내성 암 및 종양 성장의 진단 및 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
악성 종양 (암)은 미국에서 심장 질환 다음으로 높은 사망의 주요 원인이다 (예를 들어, 문헌 [Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)] 참조). 암은 증식하여 종양 덩이를 형성하는, 정상 조직으로부터 유래된 비정상적이거나 신생물성인 세포의 수의 증가, 이들 신생물성 종양 세포에 의한 인접 조직의 침습, 및 전이로 지칭되는 과정을 통해 궁극적으로는 국소 림프절 및 원위 부위까지 혈액 또는 림프계를 통해 확산되는 악성 세포의 생성을 특징으로 한다. 암성 상태에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 않는 조건 하에 증식한다. 암은 그 자체가 상이한 정도의 침습성 및 공격성을 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 나타난다.
암 유형에 따라, 환자는 전형적으로 화학요법, 방사선 치료 및 항체-기재 약물을 비롯하여 이들에게 이용가능한 여러 치료 옵션을 갖는다. 상이한 치료 요법으로부터의 임상 결과를 예측하는데 유용한 진단 방법은 이러한 환자들의 임상 관리에 크게 유익할 것이다. 여러 연구에서, 예를 들어 돌연변이-특이적 검정, 마이크로어레이 분석, qPCR 등에 의해, 유전자 발현과 특정 암 유형의 확인과의 상관관계가 조사되었다. 이러한 방법은 환자에서 나타나는 암을 확인하고 분류하는데 유용할 수 있다.
Akt는 급성 형질전환 레트로바이러스 AKT8의 원종양유전자 v-akt의 인간 동족체이다. Akt는 단백질 키나제 A 및 C에 대한 서열 상동성이 높기 때문에 단백질 키나제 B (PKB) 및 A 및 C에 대한 관련물 (RAC)로 지칭되기도 한다. Akt는 3가지 이소형, 즉 Akt1, Akt2 및 Akt3이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 80％의 전체 상동성을 나타낸다 (Staal, S.P. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:5034; Nakatani, K. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:906; Li et al. (2002) Current Topics in Med. Chem. 2:939-971; WO 2005/113762). Akt 이소형은 N-말단의 플렉스트린 상동성 도메인, 키나제 촉매 도메인, 및 C-말단의 짧은 조절 영역으로 구성된 공통 도메인 조직을 공유한다. 또한, Akt2 및 Akt3은 둘 다 스플라이스 변이체를 나타낸다. PtdInd(3,4,5)P3에 의해 세포막으로 동원되면, Akt는 이소형 Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) 및 Akt3 (PKBγ)에 대해 각각 T308, T309 및 T305에서, 이소형 Akt1, Akt2 및 Akt3에 대해 각각 S473, S474 및 S472에서 PDK1에 의해 인산화 (활성화)된다. PDK1 (Balendran, A., (1999) Curr. Biol. 9:393), 자가인산화 (Toker, A. (2000) J. Biol. Chem. 275:8271) 및 인테그린-연결된 키나제 (ILK) (Delcommenne, M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:11211)가 이 과정에 연관되어 있긴 하지만, 이러한 인산화는 아직 알려지지 않은 키나제 (추정적으로, PDK2로 명명됨)에 의해 발생한다. Akt 활성화에는 C-말단 소수성 모티프의 잔기 Ser 473 상에서의 인산화가 요구된다 (Brodbeck et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:9133-9136; Coffer et al. (1991) Eur. J. Biochem. 201:475-481; Alessi et al. (1997) Curr. Biol. 7:261-269). Akt의 단일인산화가 키나제를 활성화시키기는 하지만, 최대 키나제 활성을 위해서는 비스(인산화)가 필요하다.
Akt는 아폽토시스를 저해하고 혈관신생 및 증식을 둘 다 증진시킴으로써 암에 대한 효과를 발휘하는 것으로 여겨진다 (Toker et al. (2006) Cancer Res. 66(8):3963-3966). Akt는 결장 (Zinda et al. (2001) Clin. Cancer Res. 7:2475), 난소 (Cheng et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9267), 뇌 (Haas Kogan et al. (1998) Curr. Biol. 8:1195), 폐 (Brognard et al. (2001) Cancer Res. 61:3986), 췌장 (Bellacosa et al. (1995) Int. J. Cancer 64:280-285; Cheng et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3636-3641), 전립선 (Graff et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:24500) 및 위 암종 (Staal et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5034-5037)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 형태의 인간 암에서 과다발현된다.
따라서, 항-AKT 치료에 대한 내성을 갖는 대상체를 확인하고 치료하는데 사용될 수 있는, 분자-기반 진단 방법 및 조성물을 갖는 것이 매우 유리할 것이다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 AKT 억제제에 대한 내성을 갖는 종양 및 암 세포의 확인, 진단 및 치료를 포함하여, 다양한 목적에 이용될 수 있다.
한 측면은 AKT1 또는 PRAS40 돌연변이를 포함하는 암 세포에서 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 돌연변이의 존재는 암 세포가 AKT 억제제에 대한 내성을 갖거나 또는 갖게 될 것임을 나타내는 것인, 암 세포에서 AKT 억제제의 치료 효과에 대한 내성을 검출하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, AKT 억제제를 사용한 치료 후에 돌연변이의 존재를 검출한다.
특정 실시양태에서, AKT1 돌연변이는 W80을 포함한다.
특정 실시양태에서, W80 돌연변이는 시스테인 잔기 변화를 포함한다.
특정 실시양태는 AKT3의 발현 수준을 검출하는 것을 추가로 포함한다.
제1항 내지 제5항의 방법은 AKT3의 과다발현을 검출하는 것은 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, AKT 억제제는 알로스테릭 억제제이다.
특정 실시양태에서, 알로스테릭 억제제는 MK-2206이다.
특정 실시양태는 PI3k 또는 mTOR 억제제의 유효량을 암 세포에 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, PRAS40 돌연변이는 정지 코돈을 포함한다.
특정 실시양태에서, 돌연변이는 178 정지 코돈을 포함한다.
특정 실시양태에서, AKT 억제제는 ATP 경쟁적 억제제이다.
특정 실시양태에서, AKT 억제제는 GDC-0068 또는 GSK2110183이다.
특정 실시양태에서, AKT3 발현 수준은 mRNA 발현 수준이다.
특정 실시양태에서, mRNA 발현 수준은 마이크로어레이 또는 qRT-PCR을 이용하여 측정된다.
특정 실시양태에서, mRNA 발현 수준의 변화는 증가이다.
특정 실시양태는 GDC-0941 및 GDC-0980으로부터 선택된 PI3k 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태는 라파마이신으로부터 선택된 mTOR 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 중피종, 자궁내막암, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 위암, 결장암, 신장암, 두경부암, 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 암은 PTEN 돌연변이와 연관된다.
특정 실시양태에서, 암은 PTEN가 적거나 또는 존재하지 않는 상태와 연관된다.
특정 실시양태에서, 암은 AKT 돌연변이, 과다발현 또는 증폭과 연관된다.
특정 실시양태에서, 암은 PI3K 돌연변이와 연관된다.
특정 실시양태에서, 암은 Her2/ErbB2 증폭과 연관된다.
특정 실시양태에서, 암 세포는 순환 종양 세포 (CTC)이다.
특정 실시양태에서, 검출은 pCR에 의해 돌연변이를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 그의 임의의 조합은 본원에 기재된 임의의 및 모든 방법 및 조성물에 적용된다.
도 1-2는 부모 (예를 들어, 참조 세포) 및 AKT 억제제 세포 (예를 들어, 샘플 세포) 중에서 전립선암 세포주 (LNCaP 세포)에서의 AKT 억제제 GDC-0068 ((S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온) 및 MK2206 (8-[4-(1-아미노시클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온)에 대한 용량 반응 곡선을 보여준다. 두 억제제에 대한 내성을 갖는 클론이 시간 경과에 따라 증가하는 용량의 AKT 억제제로 처리된 암 세포의 집단으로부터 유래되었다. GDC-0068의 경우, 감수성이 ~10x 낮은 세포가 클로닝되었다. MK2206의 경우, 감수성이 ~40x 낮은 세포가 클로닝되었다.
도 3-4는 암 세포 (LNCaP 세포)에 투여된 AKT 억제제의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. GDC-0068 내성 세포는 여전히 억제제에 결합하였으나, GDC-0068은 하류 pS6을 억제하는데 있어 덜 강력하였다 (즉, 암 세포가 내성을 가짐). 유사하게, MK2206 내성 세포는 MK2206에 의해 유도되는 pS6의 억제를 상실하였으며, 또한 MK2206은 부모 세포주에서는 성공할 수 있었던 Akt 인산화의 억제를 실패하였다. 내성 클론 및 풀을 엑솜-seq에 의해 분석하여, 2개의 돌연변이를 발견하였으며, 그 중 하나는 W80에 있으며 시스테인 잔기로 돌연변이된 것이고, 다른 하나는 Akt 기질 PRAS40에 있으며 위치 178에 정지 코돈을 갖는 것이었다. Akt1 돌연변이는 모든 MK2206 클론에서 발생하였고, PRAS40 돌연변이는 모든 GDC-0068 내성 클론에서 발생하였다.
도 5는 LNCaP MK2206 내성 클론이 또한 RNA seq 데이터에 의해 나타난 바와 같이 Akt3을 발현하게 되었음을 보여준다. 이는 AKT 억제제 (예를 들어, MK2206)에 대한 내성을 갖는 세포가 또한 AKT 단백질, 예를 들어 AKT3의 이상 발현을 나타낼 수 있다는 것을 입증한다.
RNA-seq 실험에 의해 밝혀진 바와 같이, 부모 LNCaP 세포는 Akt3을 발현하지 않았으며, 어느 한가지 억제제로 처리된 GDC-0068 내성 클론 또는 부모 세포 또한 마찬가지였다. MK-2206 내성 세포는 Akt1이 돌연변이되고 Akt3을 발현하게 되어, 알로스테릭 억제제의 억제 작용을 극복하였다.
도 6은 추가의 AKT 억제제로 처리되었을 때, 부모, 및 AKT 억제제에 대한 내성을 갖는 LNCap 세포의 용량 반응 곡선을 보여준다. LNCaP 세포에서의 Akt 억제제 내성은 GDC-0068 및 MK-2206 둘 다에 대한 내성을 갖는 경우에 계속 Akt 경로 활성에 의존한다. MK2206-내성 세포는 여전히 GDC-0068에 대해 감수성이었으며, 이는 GDC-0068가 ATP 부위를 표적화하고 3가지 모든 Akt를 동등한 강도로 억제한다는 것과 일치한다. 다른 한편으로는, GDC-0068-감수성 세포는 GDC-0068과 유사하게 MK2206에 대한 내성을 가졌으며, 이는 돌연변이가 Akt의 하류에 있다는 것과 일치한다.
ATP 경쟁적 억제제, 예를 들어 GDC-0068에 대한 내성을 갖는 암 세포는 Akt 상위의 mTORC1을 활성화시킨다. MK-2206 내성 세포는 Akt 자체의 알로스테릭 억제는 제거하였으나, ATP 경쟁적 AKT 억제제, 예컨대 GDC-0068에 대해서는 여전히 감수성이다.
도 7-8은 AKT 억제제의 처리에 대한, 예를 들어 이들에 대한 내성을 획득한 후의, 난소암 세포의 결과를 보여준다 (IGROV1 (난소, PI3K 돌연변이체 O1069W, PTEN 이형접합 세포). GDC0068 및 MK2206에 대한 내성을 갖는 세포는 알로스테릭 억제 (예를 들어, MK2206)에 대해 동등하게 내성을 갖는 반면, GDC0068에 대한 내성을 갖는 세포는 MK2206보다 GDC-0068에 대해 더 큰 내성을 갖는다.
도 9는 GDC-0941 및 GDC-0980이 둘 다 모든 IGROV1 세포주 (부모 및 내성)에 대해 여전히 강력하다는 것을 보여준다. 이는 세포가 AKT 억제제에 대한 내성을 갖게 된 후에, 환자의 암이 AKT-내성 암을 치료하기 위한 PI3k 또는 mTOR 억제제를 투여하여 치료될 수 있다는 것을 입증한다.
본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고 있으며, 통상의 방법론, 예컨대 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); 연속 간행물 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 기재된 널리 활용되는 방법론을 이용하여 통상의 기술자에 의해 통상적으로 활용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 통상의 기술자에게 본원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
정의
본 명세서를 해석하고자 하는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우에는 언제라도, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형을 또한 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 목적으로만 사용되는 것이며, 이는 제한하기 위한 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 하기 열거된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 상충되는 경우에는 하기 열거된 정의가 우선한다.
본원에서 "시험 샘플" 또는 "샘플"은 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인될 세포 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는, 관심 대상체로부터 수득되거나 유래된 조성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 이 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플 및 조직 샘플, 예컨대 생검 시편 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포를 포괄한다. 조직 샘플의 공급원은 새로운 것이고/거나 냉동되고/거나 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액; 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 정의는 공급 후에 예컨대 시약으로 처리하거나, 가용화하거나, 특정 성분, 예컨대 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 풍부화하거나, 또는 절편화 목적을 위해 반-고체 또는 고체 매트릭스에 포매시키는 것과 같은 임의의 방법으로 조작된 생물학적 샘플을 포함한다. 본원에서의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직의 박편 또는 세포를 의미한다.
샘플은 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 유액, 전혈, 소변, 뇌척수액, 타액, 가래, 누액, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지 뿐만 아니라 조직 추출물, 예컨대 균질화된 조직, 종양 조직 및 세포 추출물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 시험 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 진단 검정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 시험 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 생물학적 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 브러싱(brushing)으로 수득될 수도 있고, 또는 가래, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수도 있다. 한 실시양태에서, 시험 샘플은 순환 종양 세포 (CTC), 예를 들어 환자의 혈청으로부터의 CTC를 포함한다.
한 실시양태에서, 시험 샘플은 AKT 억제제를 사용하는 요법 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 대상체 또는 환자로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 시험 샘플은 암이 전이된 후에 수득된다.
본원에 사용된 "참조 샘플"은 비교 목적을 위해 사용되는 임의의 참조 샘플, 표준물, 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자의 신체의 건강한 및/또는 비이환된 부분으로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 환자의 신체의 비처리된 조직 및/또는 세포로부터 수득된다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플은 AKT 억제제 요법에 반응하는 종양 또는 암 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, AKT 억제제 요법은 GDC-0068, MK2206 또는 GSK2110183을 포함한다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플은 시험 샘플이 수득된 때와 상이한 하나 이상의 시점에서 동일한 대상체 또는 환자로부터 수득된 단일 샘플 또는 조합된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플은 시험 샘플이 수득된 때보다 더 이른 시점에 동일한 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 이러한 참조 샘플은, 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 시험 샘플은 이후에 암이 전이된 시점에 수득된 경우에 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, CTC는 AKT 억제제, 예를 들어 GDC-0068, MK2206 또는 GSK2110183을 사용하는 치료 전에, 그 동안 및 그 후에 다양한 시점에서 환자로부터 수득되고, AKT 및 PRAS40의 돌연변이 상태가 (예를 들어, pCR, 웨스턴, 또는 IHC에 의해) 검출된다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌, 하나 이상의 건강한 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌, 암을 갖는 하나 이상의 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌, 하나 이상의 개체의 정상 조직으로부터 모은 RNA 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌, 암을 갖는 하나 이상의 개체로부터의 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플이다.
유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피 수를 포함하나 이에 제한되지는 않은, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기준에 기초하여 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 유전자 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 증가된다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 유전자 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플에서의 발현/양과 비교하여 감소된다. 특정 실시양태에서, 제2 샘플은 참조 샘플이다.
특정 실시양태에서, 용어 "증가"는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법, 예컨대 본원에 기재된 방법에 의해 검출시에 참조 샘플과 비교하여 단백질 또는 핵산의 수준이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 전체적으로 증가하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 증가는 샘플에서의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 참조 샘플에서의 각각의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.25X, 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X만큼 증가하는 것을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 용어 "감소"는 관련 기술분야에 공지된 표준 방법, 예컨대 본원에 기재된 방법에 의해 검출시에 참조 샘플과 비교하여 단백질 또는 핵산의 수준이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 전체적으로 감소하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 감소는 샘플에서의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 참조 샘플에서의 각각의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, 또는 0.01X만큼 감소하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "표지"는 시약, 예컨대 핵산 프로브 또는 항체와 직접 또는 간접적으로 접합 또는 융합되고, 이와 접합 또는 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
특정 실시양태에서, "상관시키다" 또는 "상관시키는"은 임의의 방식으로 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 요법을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만, 일반적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만으로 짧은, 일반적으로 단일-가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
"단리된" 핵산 분자는 폴리펩티드 핵산의 천연 공급원에서 그와 통상적으로 회합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정이 아닌 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 것과 같은 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 폴리펩티드를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유되고, 예를 들어 천연 세포의 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 있는 핵산 분자를 포함한다.
"프라이머"는 일반적으로 표적 서열에 혼성화함으로써 관심있는 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합한 후, 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하는, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 갖는 짧은 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "하우스키핑 유전자"는 그의 활성이 세포 기능의 유지에 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자 군을 지칭한다. 이러한 유전자는 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 발현된다.
본원에 사용된 용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 기판 상의, 혼성화가능한 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 정렬된 배열을 지칭한다. 기판은 고체 기판, 예컨대 유리 슬라이드, 또는 반-고체 기판, 예컨대 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 그의 임의의 치환물일 수 있다.
"천연 서열" 폴리펩티드는 자연계로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연계로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 구체적으로, 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 발생 말단절단된 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연 발생 변이체 도메인 (예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정시에 폴리펩티드의 95 중량％ 초과, 또는 99 중량％ 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 적어도 15개 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 이용하는 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에서 본래의 환경에서 폴리펩티드를 포함하며, 이는 상기 폴리펩티드의 자연 환경의 성분이 적어도 하나라도 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"폴리펩티드 쇄"는 각각의 도메인이 비-공유 상호작용 또는 디술피드 결합과는 반대로 펩티드 결합(들)에 의해 다른 도메인(들)에 연결된 폴리펩티드이다.
폴리펩티드 "변이체"는 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 (자연 발생 아미노산 및/또는 비-자연 발생 아미노산) 잔기가 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 또한 천연 서열의 폴리펩티드 단편 (예를 들어, 하위서열, 말단절단물 등), 전형적으로는 생물학적 활성 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단백질 변이체"는 상기 기재된 바와 같은 변이체 및/또는 천연 단백질 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 지칭한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다. 단백질 및 그의 변이체는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 단백질의 아미노산 서열 변이체는 단백질 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들어 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 원하는 활성을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 변이체를 코딩하는 DNA에서 생성될 돌연변이는 리딩 프레임 밖의 서열에 위치해서는 안되고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 생성하지 않을 것이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편 (하기 참조)을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 표현 "다가 항체"는 본 명세서 전반에 걸쳐 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내도록 사용된다. 다가 항체는 전형적으로 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되고, 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로, 항원에 결합하는 능력을 보유하고 있는 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 본 발명의 정의에 포괄되는 항체 단편의 예는 하기를 포함한다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편, (ii) CH1 도메인의 C-말단에 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편, (iv) VH 및 CH1 도메인을 갖고 CH1 도메인의 C-말단에 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편, (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), (vii) 단리된 CDR 영역, (viii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (ix) 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일 쇄 Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); 및 Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)), (x) 동일한 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디" (예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조), (xi) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 "선형 항체" (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995); 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대해 지시된다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 전형적으로 표적과 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 것을 포함하는 과정에 의해 수득된 것이다. 예를 들어, 선택 과정은 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 추가로 변경되어, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물 중에서의 그의 생산을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 뿐만 아니라 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 사항은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는, 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에게 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다. 인간 항체는 다양한 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되고, 여기서 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 도입시켜 제조될 수도 있다. 시험접종시에, 인간 항체 생산이 관찰되고, 이것은 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 하기 과학 문헌: [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관내 면역화되었을 수 있음). 예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 번호 5,750,373을 참조한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 차이가 나고, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 베타-시트 배위를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 상기 베타-시트 구조를 연결하며 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 경우, 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 용어 초가변 영역은 서열 내에 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는, 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
다수의 HVR 설명이 사용되고 있으며 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR 및 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 하기 기재된다.
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HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해, 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬하여 결정할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 카바트 넘버링 시스템이 일반적으로 이용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급할 때 일반적으로 사용된다 (예를 들어, 명백하게 본원에 참조로 포함된 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 보고된 EU 인덱스 참조). 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의해 넘버링된 잔기를 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1 (비-A 및 A 동종이형 포함), IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나에 할당될 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 무손상 항체를 파파인 소화시킴으로써 생성될 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 약 위치 Cys226, 또는 약 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 Fc 영역의 카르복실-말단까지의 스트레치로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합적 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다.
본원에서 달리 나타내지 않는 한, 이뮤노글로불린 중쇄 내 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"Fc 영역 쇄"는 본원에서 Fc 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄 중의 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" (또한, "Cg2" 도메인으로 지칭됨)은 통상적으로, 아미노산 잔기 위치 약 231에서부터 아미노산 잔기 위치 약 340까지 연장된다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서 특징적이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추정되었다. 문헌 [Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)]. 본원에서의 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치 (즉, IgG의 아미노산 잔기 위치 약 341에서부터 아미노산 잔기 위치 약 447까지)를 포함한다. 본원에서의 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인 (예를 들어, 그의 1개 쇄 내에 "돌출부"가 도입되고 그의 다른 쇄 내에 "함몰부"가 상응하게 도입된 CH3 도메인)일 수 있다 (명백하게 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,821,333 참조). 이러한 변이체 CH3 도메인을 사용하여 본원에서 기재된 바와 같은 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조할 수 있다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 약 Glu216 또는 약 Cys226에서부터 약 Pro230까지의 스트레치로 정의된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 IgG1 서열과 동일한 위치에 배치하여 정렬될 수 있다. 본원에서 힌지 영역은 천연 서열 힌지 영역 또는 변이체 힌지 영역일 수 있다. 변이체 힌지 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄는 일반적으로 폴리펩티드 쇄 1개 당 1개 이상의 시스테인 잔기를 보유하고, 이에 따라 변이체 힌지 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄는 2개의 쇄 사이에서 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 본원에서 바람직한 힌지 영역은 천연 서열 인간 힌지 영역, 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 힌지 영역이다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형을 통해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 전형적으로, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 예를 들어 적어도 약 80%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 90%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 것이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성의 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가, 상기 세포독성 이펙터 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 일반적으로 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은, 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후에 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체를 기재하고 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합되어 있는 (적절한 하위부류의) 항체에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된, 그의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
항체의 "기능적 항원 결합 부위"는 표적 항원과 결합할 수 있는 것이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 항원 결합 부위가 유래된 부모 항체만큼 강할 필요는 없지만, 항원에 결합하는 능력은 항원에 대한 항체 결합의 평가에 대해 공지된 다양한 방법 중 어느 하나를 이용하여 측정가능해야 한다. 또한, 본원에서의 다가 항체의 항원 결합 부위 각각의 항원 결합 친화도가 정량적으로 동일할 필요는 없다. 본원에서의 다량체 항체의 경우, 기능적 항원 결합 부위의 수는 초원심분리 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석 방법에 따라, 다량체 항체에 대한 표적 항원의 상이한 비를 조합하고, 기능적 결합 부위의 상이한 수를 추정하여 복합체의 평균 분자량을 계산한다. 이러한 이론적 값을 기능적 결합 부위의 수를 평가하기 위해 수득된 실제 실험 값과 비교한다.
지정된 항체의 "생물학적 특징"을 갖는 항체는 그를 동일한 항원에 결합하는 다른 항체와 구별하는 항체의 하나 이상의 생물학적 특징을 보유하는 것이다.
관심 항체에 의해 결합된 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝을 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상의 교차-차단 검정을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 경우, 용어 "길항제"는 단백질의 활성, 예를 들어 리간드의 경우에는 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합, 또는 수용체의 경우에는 하나 이상의 리간드에 대한 그의 결합을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 길항제는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 핵산, 생물유기 분자, 펩티드모방체, 약리학적 작용제 및 그의 대사물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다. 또한 길항제는 단백질의 소분자 억제제, 및 단백질에 특이적으로 결합하여 그것이 그의 표적에 결합하는 것을 봉쇄하는 융합 단백질, 수용체 분자 및 유도체, 단백질의 길항제 변이체, 단백질에 대해 지시된 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 단백질에 대한 리보자임을 포함한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
용어 "항혈관신생 요법"은 본원에 정의된 바와 같은 1종 이상의 항혈관신생제의 투여를 포함하는, 혈관신생 억제에 유용한 요법을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.
본원에 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료할 포유동물의 면역계를 억제하거나 차폐시키는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이는 시토카인 생산을 억제하거나 자기-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조), 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 간시클로비르, 타크롤리무스, 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론, 항염증제, 예컨대 시클로옥시게나제 억제제, 5-리폭시게나제 억제제, 또는 류코트리엔 수용체 길항제, 퓨린 길항제, 예컨대 아자티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸 (MMF), 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드, 브로모크립틴, 다나졸, 답손, 글루타르알데히드 (미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차폐시킴), MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체, 시클로스포린 A, 스테로이드, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손, 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하), 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 레플루노미드, 시토카인 또는 시토카인 수용체 항체, 예를 들어 항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항-종양 괴사 인자-알파 항체 (인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-TNF-알파 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-종양 괴사 인자-베타 항체, 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체, 항-LFA-1 항체, 예를 들어 항-CD11a 및 항-CD18 항체, 항-L3T4 항체, 이종 항-림프구 글로불린, 범-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체, LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (1990년 7월 26일에 공개된 WO 1990/08187 참조), 스트렙토키나제, TGF-베타, 스트렙토도르나제, 숙주로부터의 RNA 또는 DNA, FK506, RS-61443, 데옥시스페르구알린, 라파마이신, T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721 (Cohen et al.)), T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 1990/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 및 WO 1991/01133) 및 T-세포-수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 포함한다.
"비스테로이드성 항염증 약물" 또는 "NSAID"의 예는 아세틸살리실산, 이부프로펜, 나프록센, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴 (그의 염 및 유도체 포함) 등이다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함한다.
본원에 사용된는 경우, "성장 억제제"는 시험관내 및/또는 생체내 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에서) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전형적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔(TAXOL)®, 및 토포 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신, 예를 들어 디네미신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔®); 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 이용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나 감소시키거나 차단하거나 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제도 포함된다. 이들은 그 자체가 호르몬일 수 있다. 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄로시펜 (에비스타(EVISTA)®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 류프롤리드 아세테이트 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®), 및 아나스트로졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®)을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사막스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®), 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식과 관련이 있는 신호전달 경로의 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제하는 것들; 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루프토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로도 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠술폰아미드; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인 중에 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체화 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (예를 들어, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E); 태반 유래 성장 인자 (PlGF); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF, 예를 들어 PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD); 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-알파; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20-IL-30; 세크레토글로빈/유테로글로빈; 온코스타틴 M (OSM); 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예를 들어 LIF 및 키트 리간드 (KL)가 포함된다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
"대상체" 또는 "환자"는 인간, 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하나 이에 제한되지 않은 포유동물을 의미한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 암으로 진단된다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 비롯한, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"장애"는 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태 포함)을 포함한다. 본원에서 치료할 장애의 비제한적 예는 임의의 형태의 종양, 양성 및 악성 종양; 혈관화된 종양; 비대증; 백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 장애; 및 염증성, 혈관신생 및 면역 장애, 부적절한, 이상, 과도한 및/또는 병리학적 혈관형성 및/또는 혈관 투과성으로 인한 혈관 장애를 포함한다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 변형)는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키고자 하는 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 및 조성물은 질환 또는 장애의 발생을 지연시키거나 질환 또는 장애의 진행을 늦추는데 사용된다.
용어 "유효량" 또는 "치료상 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 감소시키고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 늦추고, 전형적으로 정지시키는 것); 종양 전이를 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 늦추고, 전형적으로 정지시키는 것); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나 장애에 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물은, 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우에, 생체내 효능은 예를 들어 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률 (RR), 반응의 지속기간 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정될 수 있다.
"감소시키거나 억제한다"는 참조물과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양을 감소시키거나 저하시키는 것이다. 특정 실시양태에서, "감소시키거나 억제한다"는 20％ 이상의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소시키거나 억제한다"는 50％ 이상의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소시키거나 억제한다"는 75％, 85％, 90％, 95％ 또는 그 초과의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관신생 장애에서 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 요법에 대한 내성을 갖는 암 (세포 및/또는 종양)은 요법에 반응하지 않고/거나 요법에 대한 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성하는 능력이 감소된 암을 포함한다. 내성은 치료 방법의 과정 중에 발생하는 후천성 내성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 후천성 약물 내성은 약물 저항성이다. 요법에 대한 약물 저항성은 치료 방법의 중단 후에 요법에 대한 감수성을 다시 획득할 수 있는, 요법에 대한 일시적 및/또는 가역성 내성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후천성 내성은 영구적 내성이다. 요법에 대한 영구적 내성은 약물 내성을 부여하는 유전적 변화를 포함한다.
본원에 사용된 요법에 대한 감수성을 갖는 암은 반응성이고/거나 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 있는 암을 포함한다.
요법에 대한 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지를 평가하는 결정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 약물 저항성과 같은 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는 약물 저항성 존속체의 성장을 검정함으로써 평가할 수 있다. 영구적 내성과 같은 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는 약물 저항성 확장된 존속체의 성장을 검정함으로써 평가할 수 있다. 또한, 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는 요법에 대한 반응, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응을 평가함으로써 평가할 수 있다. 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는 개체 집단에서의 요법에 대한 반응의 변화, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응의 수에 기초할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 신장암 또는 신암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 복막암, 간세포성암, 위암, 예를 들어 위장암, 위장 기질 종양 (GIST), 췌장암, 두경부암, 교모세포종, 망막모세포종, 성상세포종, 난포막종, 남성배세포종, 간세포암, 혈액계 악성종양, 예를 들어 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 및 급성 혈액 악성종양, 자궁내막 또는 자궁 암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 타액선 암종, 외음부암, 갑상선암, 식도 암종, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 비인두 암종, 후두 암종, 카포시 육종, 흑색종, 피부 암종, 슈반세포종, 핍지교종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골형성 육종, 평활근육종, 요로 암종, 갑상선 암종, 빌름스 종양, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (저등급/여포성 비호지킨 림프종 (NHL); 소형 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소형 비-절단 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증과 관련이 있는 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예컨대, 뇌 종양과 관련이 있는 부종), 및 메이그스 증후군을 포함한다.
본원에 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
치료할 신생물성 장애의 예는 용어 "암" 및 "암성" 하에 본원에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 길항제로 치료할 수 있는 비-신생물성 상태는 예를 들어 바람직하지 않은 또는 이상 비대증, 관절염, 류마티스 관절염 (RA), 건선, 판산 건선, 사르코이드증, 아테롬성동맥경화증, 아테롬성동맥경화판, 심근경색증으로 인한 부종, 당뇨병성 및 다른 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙아 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관화, 각막 이식 신생혈관화, 각막 이식편 거부, 망막/맥락막 신생혈관화, 각 신생혈관화 (피부 홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 비대증 (그레이브스병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 졸중/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련이 있음), 활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화성 근염, 비후성 골 형성, 골관절염 (OA), 불응성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액의 제3공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 유섬유종, 조산, 만성 염증, 예컨대 IBD (크론병 및 궤양성 결장염), 신장 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신증후군, 바람직하지 않은 또는 이상 조직 덩어리 성장 (비-암), 비만, 지방 조직 덩어리 성장, 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 수정체후 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 전자간증, 복수, 심막 삼출 (예컨대, 심막염과 관련이 있음), 및 흉막 삼출을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 용어 "항신생물성 조성물"은 하나 이상의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예는 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아폽토시스성 작용제, 항-튜불린제, 독소, 및 암을 치료하기 위한 다른 작용제, 예를 들어 항-VEGF 중화 항체, VEGF 길항제, 항-HER-2, 항-CD20, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)®), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체(들) 중 1종 이상과 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 및/또는 줄기 세포 인자 (SCF)에 대한 수용체 티로신 키나제에 대한 억제제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)®, 노파르티스(Novartis))), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학적 작용제 등, 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서, 용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 확인, 예컨대 암의 확인을 지칭하거나, 또는 특정한 치료 방식으로부터 이익을 얻을 수 있는 암 환자의 확인을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 진단은 특정한 유형의 종양의 확인을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 진단은 대상체에서 AKT 억제제에 대한 내성을 갖는 암 세포의 확인을 지칭한다.
본원에서, 용어 "예후"는 항암 요법으로 인한 임상 이익의 가능성의 예측을 지칭하는데 사용된다.
본원에서, 용어 "예측"은 환자가 특정한 항암 요법에 대하여 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어 특정한 치료제를 사용한 치료 이후에 질환의 재발 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다.
"pAKT 프로파일"은 주어진 샘플에서 비-활성화되거나 비-인산화된 AKT의 수준과 비교한 AKT의 활성화 또는 인산화 ("pAKT")의 수준을 지칭한다. 한 예에서, 샘플은 종양 세포이다. pAKT 프로파일은 비 (예를 들어, 종양 세포에서의 pAKT의 양 / 상기 세포 또는 동일한 유형의 비-종양성 세포에서의 비-인산화된 AKT의 양) 또는 차이 (예를 들어, 종양세포에서의 pAKT의 양 - 상기 세포 또는 동일 유형의 비-종양성 세포에서의 비-인산화된 AKT의 양)에 의해 표현될 수 있다. pAKT 프로파일은 또한 AKT (예를 들어, pGSK 또는 PRAS40)의 인산화된 하류 표적의 양을 측정함으로써 경로의 활성화의 수준에 의해 표현될 수 있다. "높은 pAKT 프로파일"은 기준선 값보다 높은 샘플에서의 전반적인 AKT의 활성화 또는 인산화 수준을 지칭한다. 한 예에서, 기준선 값은 주어진 세포 유형에 대한 pAKT의 기저 수준이다. 또 다른 예에서, 기준선 값은 샘플 세포의 주어진 집단에서의 pAKT의 평균 또는 중간 수준이다. 또 다른 예에서, "높은 pAKT 프로파일"은 동일한 포유동물 또는 환자 집단으로부터의 동일한 유형의 정상인, 건강한 (예컨대 비-종양성) 세포의 평균과 비교하였을 때, 종양 세포 내에서 인산화된 또는 활성화된 AKT가 과다발현되거나 또는 증폭된 종양 세포를 지칭한다. pAKT 프로파일은 또한 AKT 억제제의 효능을 예상하기 위해 다른 마커 (예를 들어, PTEN 손실, PI3K, Kras 또는 Braf 키나제에 대한 돌연변이, 또는 FOXO3 국재화 프로파일)와 함께 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, AKT 또는 PRAS40 돌연변이 상태는 또한 AKT 억제제의 효능 또는 AKT 억제제에 대한 암 세포의 내성을 예측하기 위해 다른 마커 (예를 들어, PTEN 상태 (예를 들어, 손실 또는 존재하지 않음), PI3K, Kras 또는 Braf 키나제에 대한 돌연변이 또는 FOXO3 국재화 프로파일) 또는 HER2 상태와 함께 사용될 수 있다.
AKT 활성화 수준 및 샘플 내 pAKT 양의 측정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 면역침전 검정, 예컨대 AKT 활성 검정 키트 (압캠(abcam)® (캘리포니아주 샌프란시스코)으로부터 입수가능함)가 이용될 수 있다. 또 다른 예에서, 웨스턴 블롯 검정, 예컨대 AKT 웨스턴 블롯 검정 키트 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, 매사추세츠주 댄버스)로부터 입수가능함)이 이용될 수 있다. pAKT 수준 측정을 위해 공지된 다른 검정 포맷은 화학발광-연결된 면역흡착 검정을 포함하며, 문헌 [Cicenas, J, et al., "Increased level of phosphorylated akt measured by chemiluminescence-linked immunosorbent assay is a predictor of poor prognosis in primary breast cancer overexpressing ErbB-2," Breast Can. Res., 7(4), R394, 2005]을 참조한다. 이용될 수 있는 다른 검정, 예를 들어 알파스크린 슈어파이어(AlphaScreen SureFire) Akt1 (p-Thr308) 검정 키트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer, 매사추세츠주 월섬)로부터 입수가능함)가 이용가능하다.
PI3K 돌연변이의 존재를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 실시간 PCR을 이용한 PIK3CA 유전자의 특정한 돌연변이 (엑손 9 및 20 상의, 및 또한 H1047R 또는 H1047L 돌연변이)의 검출을 위한 검정이 공지되어 있다 (퀴아젠 (Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아)으로부터 입수가능).
핵산은 예를 들어 게놈 DNA, 게놈 DNA로부터 전사된 RNA, 또는 RNA로부터 생성된 cDNA일 수 있다. 핵산은 척추동물, 예를 들어 포유동물로부터 유래될 수 있다. 핵산은 특정한 공급원으로부터 직접 얻거나 공급원에서 발견되는 핵산의 카피일 경우에 상기 공급원으로부터 "유래된" 것으로 언급된다.
핵산 및 아미노산 서열에서 변화는 통상의 기술자에게 공지된 특정 방법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법은 DNA 서열 분석; 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 도입 검정 및 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 대립유전자-특이적 라이게이션 연쇄 반응 (LCR), 및 갭(gap)-LCR)을 포함하는 프라이머 연장 검정; 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검정); 핵산 듀플렉스 내의 미스매치된 염기를 검출하기 위해 절단제로부터의 보호가 사용되는 절단 보호 검정; MutS 단백질 결합의 분석; 변이체 및 야생형 핵산 분자의 이동성을 비교하는 전기영동 분석; 변성-구배 겔 전기영동 (DGGE, 예를 들어 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]에서와 같음); 미스매치된 염기쌍에서 RNase 절단의 분석; 헤테로듀플렉스 DNA의 화학적 또는 효소적 절단의 분석; 질량 분광측정법 (예를 들어, MALDI-TOF); 유전자 비트 분석 (GBA); 5' 뉴클레아제 분석 (예를 들어, 택맨(TaqMan)®); 및 분자 비콘을 사용하는 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 특정 방법이 하기에 보다 상세하게 논의된다.
표적 핵산에서 변이의 검출은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 표적 핵산의 분자 클로닝 및 서열 분석에 의해 수행할 수 있다. 대안적으로, 증폭 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 종양 조직의 게놈 DNA 제제로부터 직접 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 이어서, 증폭된 서열의 핵산 서열이 결정되고, 변이가 그로부터 확인될 수 있다. 증폭 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응은 문헌 [Saiki et al., Science 239:487, 1988]; 미국 특허 번호 4,683,203 및 4,683,195에 기재되어 있다.
표적 핵산 서열을 증폭하기 위해 관련 기술분야에 공지된 리가제 연쇄 반응도 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Wu et al., Genomics 4:560-569 (1989)]을 참조한다. 또한, 대립유전자-특이적 PCR로서 공지된 기술도 변이 (예를 들어, 치환)를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ruano and Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17:8392; McClay et al. (2002) Analytical Biochem. 301:200-206]을 참조한다. 상기 기술의 특정 실시양태에서, 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드가 표적 핵산 내의 특정한 변이에 상보적인 (즉, 특이적으로 염기쌍을 형성할 수 있는) 대립유전자-특이적 프라이머가 사용된다. 특정한 변이가 존재하지 않으면, 증폭 생성물은 관찰되지 않는다. 또한, 변이 (예를 들어, 치환)를 검출하기 위해 증폭 불응성 돌연변이 시스템 (ARMS)도 사용될 수 있다. ARMS는 예를 들어 유럽 특허 출원 공개 번호 0332435 및 문헌 [Newton et al., Nucleic Acids Research, 17:7, 1989]에 기재되어 있다.
변이 (예를 들어, 치환)을 검출하는데 유용한 방법은 (1) 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 혼입 검정, 예컨대 단일 염기 연장 검정 (예를 들어, 문헌 [Chen et al. (2000) Genome Res. 10:549-557; Fan et al. (2000) Genome Res. 10:853-860; Pastinen et al. (1997) Genome Res. 7:606-614; 및 Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17:305-316] 참조); (2) 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 문헌 [Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17:305-316; 및 Shen et al. Genetic Engineering News, vol. 23, Mar. 15, 2003] 참조) (대립유전자-특이적 PCR 포함); (3) 5'뉴클레아제 검정 (예를 들어, 문헌 [De La Vega et al. (2002) BioTechniques 32:S48-S54 (택맨® 검정 기재); Ranade et al. (2001) Genome Res. 11:1262-1268; 및 Shi (2001) Clin. Chem. 47:164-172] 참조); (4) 분자 비콘을 사용하는 검정 (예를 들어, 문헌 [Tyagi et al. (1998) Nature Biotech. 16:49-53; 및 Mhlanga et al. (2001) Methods 25:463-71] 참조); 및 (5) 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검정 (예를 들어, 문헌 [Grossman et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22:4527-4534]; 특허 출원 공개 번호 US 2003/0119004 A1; PCT 국제 공개 번호 WO 01/92579 A2; 및 미국 특허 번호 6,027,889 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 변이는 미스매치 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 미스매치는 100％ 상보적이지 않은, 혼성화된 핵산 듀플렉스이다. 전체 상보성의 결여는 결실, 삽입, 역위, 또는 치환 때문일 수 있다. 미스매치 검출 방법의 한가지 예는, 예를 들어 문헌 [Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005) 및 Faham et al., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001)]에 기재된 미스매치 복구 검출 (MRD) 검정이다. 미스매치 절단 기술의 다른 예는 RNase 보호 방법이고, 이는 문헌 [Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575, 1985, 및 Myers et al., Science 230:1242, 1985]에 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 방법은 인간 야생형 표적 핵산에 상보적인 표지된 리보프로브의 사용을 수반할 수 있다. 리보프로브 및 조직 샘플로부터 유래된 표적 핵산은 함께 어닐링 (혼성화)된 후, 듀플렉스 RNA 구조에서 일부 미스매치를 검출할 수 있는 효소 RNase A로 소화된다. 미스매치가 RNase A에 의해 검출되면, 이 효소는 미스매치 부위에서 구조를 절단한다. 따라서, 어닐링된 RNA 표본을 전기영동 겔 매트릭스 상에서 분리시킬 때, 미스매치가 RNase A에 의해 검출되어 절단되면, 리보프로브 및 mRNA 또는 DNA에 대해 전장 듀플렉스 RNA보다 작은 RNA 생성물이 관찰될 것이다. 리보프로브는 전장 표적 핵산일 필요는 없고, 변이가 존재하는 것으로 의심되는 위치를 포함한다면 표적 핵산의 일부일 수 있다.
유사한 방식으로, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단을 통해 미스매치를 검출하기 위해 DNA 프로브가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397, 1988; 및 Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:989, 1975]을 참조한다. 대안적으로, 미스매치는 매치된 듀플렉스와 비교할 때 미스매치된 듀플렉스의 전기영동 이동성의 변화에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cariello, Human Genetics, 42:726, 1988]을 참조한다. 리보프로브 또는 DNA 프로브를 사용할 때, 변이를 포함하는 것으로 의심되는 표적 핵산은 혼성화 전에 증폭될 수 있다. 또한, 표적 핵산 내의 변화는 특히 변화가 전반적인 재배열, 예컨대 결실 및 삽입일 경우에 서던 혼성화를 이용하여 검출될 수 있다.
표적 핵산에 대한 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 프로브 또는 주위 마커 유전자를 사용하여 변이, 예를 들어, 삽입 또는 결실을 검출할 수 있다. 또한, 삽입 및 결실은 표적 핵산의 클로닝, 서열 분석 및 증폭에 의해 검출할 수 있다. 대립유전자의 염기 변화 변이체를 검출하기 위해 단일 가닥 입체형태 다형성 (SSCP) 분석이 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989, 및 Genomics, 5:874-879, 1989]을 참조한다.
또 다른 측면은 이러한 방법에 사용될 수 있는 어레이를 제공한다. 한 실시양태에서, 어레이는 검출 변형에 유용한 개별 핵산 분자 또는 그의 집합을 포함한다. 예를 들어, 어레이는 일련의 독립적으로 배치된 개별 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 또는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함할 수 있다. 핵산을 고체 기판, 예컨대 유리 슬라이드에 부착시키기 위한 몇몇 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한가지 방법은 고체 기판에 부착시킬 수 있는 반응성 모이어티, 예컨대 아민기, 아민기의 유도체, 또는 양전하를 갖는 또 다른 기를 함유하는 변형된 염기 또는 유사체를 합성되는 핵산 분자 내로 도입하는 것이다. 이어서, 합성된 생성물은 알데히드 또는 다른 반응성 기로 코팅된 고체 기판, 예를 들어 유리 슬라이드와 접촉된다. 알데히드 또는 다른 반응성 기는 유리 슬라이드에 공유 부착될 증폭된 생성물 상의 반응성 모이어티와 공유 연결을 형성할 것이다. 아미노 프로필 실리칸 표면 화학을 사용하는 것과 같은 다른 방법도 관련 기술분야에 공지되어 있다.
임의의 상기 방법에 따른 생물학적 샘플은 통상의 기술자에게 공지된 특정 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 생물학적 샘플은 척추동물, 특히 포유동물로부터 수득할 수 있다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 브러싱에 의해, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 표적 핵산 (또는 코딩된 폴리펩티드)에서의 변화는 종양 샘플로부터 또는 다른 신체 샘플, 예컨대 소변, 객담 또는 혈청으로부터 검출될 수 있다. (암 세포가 종양으로부터 떨어져 나와 이러한 신체 샘플 내에서 나타남). 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써, 간단한 조기 진단은 암과 같은 질환에 대해 수행될 수 있다. 또한, 요법의 진행은 표적 핵산 (또는 코딩된 폴리펩티드)에서의 변이에 대해 상기 신체 샘플을 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링할 수 있다. 추가로, 종양 세포에 대해 조직 표본을 풍부화시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직을 파라핀 또는 동결 절편으로부터 단리할 수 있다. 또한, 암 세포는 유동 세포측정법 또는 레이저 포획 미세절제에 의해 정상 세포로부터 분리될 수도 있다.
AKT 키나제 억제제
특정 AKT 키나제 억제제는 AKT의 활성 부위에 대한 결합에 대해 ATP와 경쟁하는 능력과 관련하여, ATP-경쟁적 억제제로 알려져 있다. 알로스테릭 억제제로 알려져 있는 특정 AKT 키나제 억제제는 AKT의 활성 부위에 결합하지 않는다. 또한, AKT 키나제 억제제는 범-AKT 억제제일 수 있으며, 여기서 억제제는 AKT-1, AKT-2 및 AKT-3 중 둘 이상의 활성을 억제할 수 있다. AKT 키나제 억제제는 선택적 AKT 억제제일 수 있으며, 여기서 억제제는 AKT-1, AKT-2 및 AKT-3 중 하나의 활성을 나머지 둘의 활성은 억제하지 않으면서 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, AKT 키나제 억제제는 ATP-경쟁적 억제제이다. 또 다른 실시양태에서, ATP-경쟁적 억제제는 범-AKT 억제제이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, AKT 억제제는 하기 화학식 I의 ATP-경쟁적, 범-AKT 억제제, 및 그의 호변이성질체, 분할된 거울상이성질체, 분할된 부분입체이성질체, 용매화물 및 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00002
상기 식에서,
R1은 H, Me, Et 및 CF3이고;
R2는 H 또는 Me이고; R5는 H 또는 Me이고;
A는
Figure pct00003
이고;
여기서 G는 1 내기 4개의 R9 기에 의해 임의로 치환된 페닐 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴이고;
R6 및 R7은 독립적으로 H; OCH3; (C3-C6 시클로알킬)-(CH2); (C3-C6 시클로알킬)-(CH2CH2); V-(CH2)0-1 (여기서, V는 5-6원 헤테로아릴임); W-(CH2)1-2 (여기서, W는 F, Cl, Br, I, OMe, CF3 또는 Me로 임의로 치환된 페닐임); C1-C3 알킬 또는 O(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 C3-C6-시클로알킬; 히드록시-(C3-C6-시클로알킬); 플루오로-(C3-C6-시클로알킬); CH(CH3)CH(OH)페닐; F, OH, C1-C3 알킬, 시클로프로필메틸 또는 C(=O)(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 4-6원 헤테로사이클; 또는 OH, 옥소, O(C1-C6-알킬), CN, F, NH2, NH(C1-C6-알킬), N(C1-C6-알킬)2, 시클로프로필, 페닐, 이미다졸릴, 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐, 옥세타닐 또는 테트라히드로피라닐로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 C1-C6-알킬이거나, 또는 R6 및 R7은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 OH, 할로겐, 옥소, CF3, CH2CF3, CH2CH2OH, O(C1-C3 알킬), C(=O)CH3, NH2, NHMe, N(Me)2, S(O)2CH3, 시클로프로필메틸 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 4-7원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
Ra 및 Rb는 H이거나, 또는 Ra는 H이고, Rb 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
Rc 및 Rd는 H 또는 Me이거나, 또는 Rc 및 Rd는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성하고;
R8은 H, Me, F 또는 OH이거나, 또는 R8 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
각각의 R9는 독립적으로 할로겐, C1-C6-알킬, C3-C6-시클로알킬, O-(C1-C6-알킬), CF3, OCF3, S(C1-C6-알킬), CN, OCH2-페닐, CH2O-페닐, NH2, NH-(C1-C6-알킬), N-(C1-C6-알킬)2, 피페리딘, 피롤리딘, CH2F, CHF2, OCH2F, OCHF2, OH, SO2(C1-C6-알킬), C(O)NH2, C(O)NH(C1-C6-알킬), 및 C(O)N(C1-C6-알킬)2이고;
R10은 H 또는 Me이고;
m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
또 다른 실시양태는 화학식 I의 AKT 억제제를 포함하며, 여기서 R1은 메틸이고; R2, R5 및 R10은 H이고; G는 1-3개의 R9로 임의로 치환된 페닐이고; R9는 할로겐, C1-C3 알킬, CN, CF3, OCF3 OCH3 또는 OCH2페닐이고; Rc 및 Rd는 H 또는 메틸이고; m, n 및 p는 0 또는 1이고; R8은 H 또는 메틸이다.
또 다른 실시양태는, 하기로부터 선택된 화학식 I의 AKT 억제제를 포함한다:
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온 디히드로클로라이드;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-((S)-4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온 디히드로클로라이드;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-((S)-4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온 디히드로클로라이드;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-((S)-4-((5R,7R)-7-메톡시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온 디히드로클로라이드;
(S)-3-아미노-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온 디히드로클로라이드;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-((S)-4-((S)-7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-((S)-4-((S)-7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(2R)-2-아미노-3-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-((3S)-4-((5R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(2R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-(4-(7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메톡시페닐)프로판-1-온;
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2-(3,4-디플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(피리딘-3-일메틸아미노)프로판-1-온;
2-(2,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(펜탄-3-일아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-((1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((1R,4R)-4-히드록시시클로헥실아미노)프로판-1-온;
((3S,4R)-4-(3,4-디클로로페닐)피롤리딘-3-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논;
((3R,4S)-4-(3,4-디클로로페닐)피롤리딘-3-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논;
2-(4-클로로페닐)-2-히드록시-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
4-아미노-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-메틸펜탄-1-온;
4-아미노-2-(3,4-디플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-메틸펜탄-1-온;
(4-(4-클로로-3-플루오로페닐)피페리딘-4-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논;
(3-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논;
1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-p-톨릴프로판-1-온;
1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-(4-메톡시페닐)프로판-1-온;
3-(에틸아미노)-2-(4-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(메틸아미노)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-((S)-4-((S)-7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-((S)-4-((R)-7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-((S)-4-((R)-7-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R)-7-히드록시-5,7-디메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(4-(3,4-디클로로페닐)피페리딘-4-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논 디히드로클로라이드;
4-(3,4-디클로로페닐)피롤리딘-3-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논 디히드로클로라이드;
1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(4-메톡시페닐)-3-(피롤리딘-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(2,2,2-트리플루오로에틸아미노)프로판-1-온;
3-(tert-부틸아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(메틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로판-1-온;
4-(1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-1-옥소프로판-2-일)벤조니트릴;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
3-(아제티딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-히드록시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(네오펜틸아미노)프로판-1-온;
2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-(4-플루오로피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-((S)-3-플루오로피롤리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-(에틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필(메틸)아미노)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-(3,3-디플루오로피롤리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-브로모-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(4-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-아미노-3-(3,4-디플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-((R)-3-플루오로피롤리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로프로필아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-히드록시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-히드록시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-4-아미노-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-메틸펜탄-1-온;
(S)-4-아미노-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-메틸펜탄-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((R)-피롤리딘-3-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((S)-피롤리딘-3-일아미노)프로판-1-온;
(S)-3-((R)-1-아세틸피롤리딘-3-일아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-((S)-1-아세틸피롤리딘-3-일아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(피페리딘-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-3-(1-아세틸피페리딘-4-일아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(2-메톡시에틸아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-4-(디메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((1r,4S)-4-히드록시시클로헥실아미노)프로판-1-온;
(S)-3-(아제티딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(아제티딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-((S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필아미노)아세트아미드;
2-((S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필아미노)-N,N-디메틸아세트아미드;
2-((S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필아미노)-N-메틸아세트아미드;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(이소프로필아미노)부탄-1-온;
(R)-2-(4-브로모페닐)-4-(디메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(이소부틸아미노)부탄-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)아미노)부탄-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(이소프로필아미노)부탄-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(3-히드록시아제티딘-1-일)부탄-1-온;
2-((R)-3-(4-브로모페닐)-4-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-옥소부틸아미노)-N,N-디메틸아세트아미드;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(2-히드록시에틸아미노)부탄-1-온;
(2R)-2-(4-브로모페닐)-4-(2-히드록시-1-(테트라히드로-2H-피란-4-일)에틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(R)-2-아미노-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-아이오도페닐)프로판-1-온;
4-((R)-2-아미노-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필)벤조니트릴;
(R)-2-아미노-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로판-1-온;
(S)-3-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(메틸아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-메톡시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-4-(시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)부탄-1-온;
(2R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(2-히드록시프로필아미노)부탄-1-온;
(2R)-2-(4-클로로페닐)-4-(2-히드록시-1-(테트라히드로-2H-피란-4-일)에틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(2R)-2-(4-클로로페닐)-4-(2-히드록시-1-페닐에틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(에틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(2-메톡시에틸아미노)부탄-1-온;
(2R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로필아미노)부탄-1-온;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-((1-히드록시시클로프로필)메틸아미노)부탄-1-온;
2-((R)-3-(4-브로모페닐)-4-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-옥소부틸아미노)아세트아미드;
(R)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-4-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)부탄-1-온;
(R)-4-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필아미노)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)부탄-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-모르폴리노프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-모르폴리노프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(3-아미노아제티딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(3-아미노아제티딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-티오모르폴리노프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-티오모르폴리노프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-플루오로피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-플루오로피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-메톡시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(3-메톡시아제티딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(디메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(메톡시아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메톡시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메톡시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-아미노피페리딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(메틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필(메틸)아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(메틸술포닐)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-(메틸아미노)피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-에틸피페라진-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-에틸피페라진-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-이소프로필피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-이소프로필피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-((S)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-((S)-3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((R)-테트라히드로푸란-3-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((R)-테트라히드로푸란-3-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(2-플루오로에틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
4-((R)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필)피페라진-2-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((R)-3-히드록시피롤리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3-클로로-5-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-브로모-4-메톡시페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(피페리딘-4-일아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(1-아세틸피페리딘-4-일아미노)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-((R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-1-옥소프로판-2-일아미노)-N-이소프로필아세트아미드;
(R)-3-(4-클로로페닐)-2-(디메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(2-모르폴리노에틸아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-((S)-4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)-3-메틸피페라진-1-일)-2-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
2-((R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-1-옥소프로판-2-일아미노)-N,N-디메틸아세트아미드;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(1,4-옥사제판-4-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(1,4-옥사제판-4-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로-2-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-2-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메톡시시클로헥실아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((S)-테트라히드로푸란-3-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)에틸아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(3,3,3-트리플루오로프로필아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-((테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸아미노)프로판-1-온;
(R)-3-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(이소프로필(메틸)아미노)프로판-1-온;
(S)-3-(tert-부틸아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(tert-부틸아미노)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-모르폴리노프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-메틸피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(시클로프로필메틸아미노)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(시클로프로필메틸아미노)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
3-((S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필아미노)프로판아미드;
3-((S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-옥소프로필아미노)프로판아미드;
(4-(4-클로로페닐)피페리딘-4-일)(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)메타논;
(S)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-이소프로필피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-히드록시피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-이소프로필피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3,5-디플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-3-((R)-3-아미노피롤리딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-((R)-3-아미노피롤리딘-1-일)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(4-이소프로필피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-모르폴리노프로판-1-온;
(R)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-모르폴리노프로판-1-온;
(S)-3-(4-에틸피페라진-1-일)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-에틸피페라진-1-일)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-3-(4-아세틸피페라진-1-일)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(비스(시클로프로필메틸)아미노)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-3-((시클로프로필메틸)(메틸)아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(시클로프로필메틸아미노)-2-(3,4-디클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-((3S,5R)-3,5-디메틸피페라진-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(R)-2-(4-클로로페닐)-3-((2S,6R)-2,6-디메틸모르폴리노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
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(S)-2-(4-클로로페닐)-3-((3S,5R)-3,5-디메틸피페라진-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
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(S)-2-(4-브로모페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필(메틸)아미노)프로판-1-온;
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(S)-3-아미노-2-(4-클로로-2-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
2-(4-클로로페닐)-3-((3S,4R)-4-(디메틸아미노)-3-플루오로피페리딘-1-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모-2-플루오로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(tert-부틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)프로판-1-온;
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(S)-2-(4-클로로-2-플루오로페닐)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모-2-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-2-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
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(S)-2-(4-브로모페닐)-3-(tert-부틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소부틸아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-3-(시클로펜틸메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로-3-플루오로페닐)-3-(시클로펜틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필(메틸)아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-((2-히드록시에틸)(이소프로필)아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-3-아미노-2-(2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(시클로프로필메틸아미노)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-3-(시클로프로필메틸아미노)-2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-3-(4,4-디메틸시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-브로모페닐)-3-(3,3-디메틸시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(4,4-디메틸시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(4-클로로페닐)-3-(3,3-디메틸시클로헥실아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)-2-(티오펜-2-일)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(R)-2-(5-브로모피리딘-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모피리딘-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-브로모티오펜-2-일)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(테트라히드로-2H-피란-4-일아미노)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온;
(S)-2-(5-클로로티오펜-2-일)-3-(시클로프로필메틸아미노)-1-(4-((5R,7S)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)프로판-1-온; 및
그의 염.
또 다른 실시양태는 하기 화합물을 포함하는, 화학식 I의 AKT 억제제를 포함한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
; 및 그의 염.
화학식 I의 화합물의 제조
화학식 I의 화합물은 미국 특허 공개 번호 2008/0051399 (2007년 7월 5일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 11/773,949, 발명의 명칭 "Hydroxylated and Methoxylated Pyrimidyl Cyclopentanes as AKT Protein Kinase Inhibitors") (모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 단독으로, 또는 2종 이상, 예를 들어 5 내지 1,000종의 화합물, 또는 10 내지 100종의 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리로서 제조될 수 있다. 화학식 I의 화합물의 라이브러리는 조합적인 '분리 및 혼합' 접근법 또는 다중 병행 합성에 의해, 용액상 또는 고체상 화학반응을 이용하여 제조될 수 있다.
예시적 목적을 위해, 반응식 1-4는 화학식 I의 화합물 뿐만 아니라 주요 중간체를 제조하는 일반적 방법을 보여준다. 통상의 기술자는 다른 합성 경로를 이용할 수 있음을 인지할 것이다. 구체적인 출발 물질 및 시약이 하기 반응식에 도시되고 논의되어 있지만, 다른 출발 물질 및 시약으로 용이하게 대체하여 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공할 수 있다. 또한, 하기 기재된 방법에 의해 제조된 다수의 화합물은 통상의 기술자에게 널리 공지된 통상의 화학반응을 이용하여 본 개시내용의 관점에서 추가로 변형될 수 있다.
반응식 1
Figure pct00006
반응식 1은 화학식 I의 화합물 (10) (여기서, R1은 H이고, R2는 OH이고, R5는 H임)의 제조 방법을 보여준다. 피리미딘 (2)의 형성은, 케토 에스테르 (1)을 적절한 용매, 예컨대 에탄올 중에서 염기, 예컨대 KOH의 존재 하에 티오우레아와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 표준 환원 조건 (예를 들어, 라니 Ni 및 NH4OH) 하에 화합물 (2)의 메르캅토 기를 환원시켜 화합물 (3)을 수득한 후, 히드록시피리미딘 (3)을 표준 조건 (예를 들어, DIEA/DCE 중 POCl3) 하에 염소화시켜 화합물 (4)를 수득할 수 있다. 이어서, 화합물 (4)를 표준 조건 (예를 들어, 적절한 용매, 예컨대 CHCl3 중 MCPBA) 하에 산화시켜 피리미딘-옥시드 (5)를 수득한다. 피리미딘-옥시드를 아세트산 무수물로 처리하여 재배열 생성물 (6)을 수득한다. 화합물 (7)은, 화합물 (6)을 표준 SNAr 반응 조건 하에 적절하게 치환된 피페리딘과 반응시켜 화합물 (7)을 수득함으로써 얻어진다. 화합물 (7)을 가수분해하여 화합물 (8)을 수득하고, 이어서 이를 탈보호시켜 중간체 (9)를 수득한다. 피페라지닐 시클로펜타[d]피리미딘 (9)를 커플링 시약, 예컨대 HBTU의 존재 하에 적절한 아미노산으로 아실화시킨 후에, 필요하다면 탈보호시켜, 화학식 I의 화합물 (10)을 수득한다.
반응식 2
Figure pct00007
반응식 2는 화학식 I의 화합물 (22), (25) 및 (27) (여기서, R1, R2 및 R5는 메틸임)의 제조 방법을 보여준다. 반응식 2에 따르면, (+)-풀레곤 (11)을 브로민으로 브로민화시켜 디브로마이드 (12)를 수득한다. 디브로마이드 (12)를 염기, 예컨대 소듐 에톡시드로 처리하여 풀레게네이트 (13)을 수득한다. 풀레게네이트 (13)을 오존첨가분해하여 케토에스테르 (14)를 수득한다. 에탄올 중에서 염기, 예컨대 KOH의 존재 하에 케토 에스테르 (14)를 티오우레아로 처리한 후, 표준 조건 (예를 들어, 암모니아 중 라니 Ni 촉매) 하에 메르캅토 기를 환원시켜 히드록시피리미딘 (16)을 수득한다. 히드록시피리미딘 (16)을 표준 조건 (예를 들어, POCl3) 하에 염소화시켜 4-클로로피리미딘 (17)을 수득한다. 4-클로로피리미딘 (17)을 산화제, 예컨대 MCPBA 또는 과산화수소로 산화시켜 N-옥시드 (18)을 수득한다. N-옥시드 (18)을 아세트산 무수물로 재배열하여 중간체 (19)를 수득한다. 화합물 (19)를 반응식 1에 기재된 절차에 따라 바람직한 피페라진과 반응시켜, 화합물 (20) (여기서, R5는 H임) 및 화합물 (23) (여기서, R5는 Me임)을 수득한다. 화합물 (20) 및 (23)을, 키랄 고정상을 갖는 HPLC를 이용하여 키랄 분리에 적용하고, 이어서 염기, 예컨대 수산화리튬으로 처리하여 가수분해시킴으로써 각각 화합물 (21) 및 (24)를 수득한다. 탈보호한 후에, 화합물 (21) 및 (24)를 이어서 적절한 아미노산과 반응시켜 각각 화합물 (22) 및 (25)를 수득한다.
대안적으로, 화합물 (24)의 7-히드록시 기를 염기, 예컨대 NaH 또는 KOH의 존재 하에 알킬화 시약, 예컨대 알킬 할라이드로 알킬화시켜 화합물 (26) (여기서, R2는 Me임)을 수득할 수 있다. 탈보호한 후에, 화합물 (26)을 이어서 적절한 아미노산과 반응시켜 화합물 (27)을 수득한다.
반응식 3
Figure pct00008
반응식 3은 화합물 (73) 및 (74)의 대안적 제조 방법을 보여준다. 반응식 3에 따르면, 암모니아 합성단위체를 사용하여 (14)를 아민화시켜 (63)을 수득한다. 50℃-250℃ 및/또는 고압에서 포름아미드의 존재 하에, 예를 들어 암모늄 포르메이트를 사용하여 피리미딘을 형성하여 비시클릭 단위 (64)를 수득한다. (64)를 예를 들어 POCl3 또는 SOCl2를 이용하여 활성화시켜 활성화된 피리미딘 (65)를 수득한다. 0℃ 내지 150℃에서 적합한 보호된/치환된 피페리딘을 사용하여 상기 이탈기를 대체하여 피페리딘 (66)을 수득한다. 예를 들어, m-클로로퍼옥시벤조산 ("MCPBA" 또는 "m-CPBA") 또는 옥손(Oxone)®를 이용하여 -20℃ 내지 50℃에서 산화시켜 N-옥시드 (67)을 제공한다. 아실화제 (예를 들어, 아세트산 무수물)로 처리한 후에 가열 (40℃에서 200℃)함으로써 재배열을 유발하여 (68)을 수득한다. 0℃ 내지 50℃에서 예를 들어 LiOH 또는 NaOH를 이용하여 가수분해하여 알콜 (69)를 수득한다. 적절한 온도에서, 예를 들어 스원(Swern) 조건, MnO4 또는 피리딘-SO3 복합체를 이용하여 산화시켜 케톤 (70)을 수득한다. 예를 들어, 촉매성 키랄 촉매 (수소의 존재 하에), CBS 촉매 또는 보로히드라이드 환원제 (키랄 리간드의 존재 하에)를 사용하여 비대칭 환원시켜 (R) 또는 (S) 입체화학의 알콜 (71) 또는 (72)를 수득한다. 대안적으로, 비-키랄 환원제 (예를 들어, H2, Pd/C)를 사용하여, 시클로펜탄 단위 상의 메틸 기가 대면 선택성 및 궁극적으로는 부분입체선택성을 제공하도록 할 수 있다. 환원이 낮은 부분입체선택성을 제공하는 경우, (예를 들어) 크로마토그래피, 결정화 또는 유도체화에 의해 부분입체이성질체를 분리할 수 있다. 최종적으로, 0℃ 내지 50℃에서, 예를 들어 산을 사용하여 Boc-기를 탈보호하고, 적절하게 관능화된 아미노산을 사용하여 아실화하고, 이 아미노산의 아민을 최종적으로 관능화시켜 (예를 들어, 임의의 보호기의 제거, 알킬화, 환원성 아민화 또는 아실화에 의해 새로운 치환기를 도입시킴) 최종 화합물 (73) 및 (74)를 수득한다.
반응식 4
Figure pct00009
표준 아실화 절차에 의해 화합물 (1)에 키랄 보조제 (예를 들어, 에반스 옥사졸리디논 등)를 도입하여 접합체 (2)를 수득할 수 있다. 예를 들어, 아민 염기의 존재 하에 -20℃ 내지 100℃에서, 산을 활성화제 (예를 들어, COCl2)로 처리하거나 또는 혼합 무수물을 형성하고 (예를 들어, 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드), 이어서 적절한 키랄 보조제 (X)로 처리하여 화합물 (2)를 수득한다. 키랄 보조제의 입체화학 및 선택은 새롭게 생성된 키랄 중심 및 부분입체선택성의 입체화학을 결정할 수 있다. 화합물 (2)를 저온 (예를 들어, -20℃ 내지 -100℃)에서 루이스 산 (예를 들어, TiCl4)으로 처리하고 아민 염기 (예를 들어, 휘니그 염기)로 처리하고, 이어서 저온에서 적절하게 치환된 이미늄 이온 전구체 (3)을 이용하여 화합물 (4)를 수득한다. 온도, 루이스 산 및 키랄 보조제가 모두 추가 부가물의 부분입체선택성에 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있다. 최종적으로, 온화한 조건 (예를 들어, -10℃ 내지 30℃에서 LiOH/H2O) 하에 비누화시켜 원하는 산 (5)를 수득한다.
또 다른 실시양태에서, AKT 키나제 억제제는 하기 화학식 II의 ATP-경쟁적, 범-AKT 억제제, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 II>
Figure pct00010
상기 식에서,
G는 1 내지 3개의 Ra 기로 임의로 치환된 페닐 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴이고;
R1 및 R1a는 독립적으로 H, Me, CF3, CHF2 또는 CH2F로부터 선택되고;
R2는 H, F 또는 -OH이고;
R2a는 H이고;
R3은 H이고;
R4는 H이거나, 또는 F, -OH 또는 -O(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 C1-C4 알킬이고;
R5 및 R5a는 독립적으로 H 및 C1-C4 알킬로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R5a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 5-6원 시클로알킬 또는 5-6원 헤테로사이클을 형성하고, 여기서 헤테로사이클은 산소 헤테로원자를 갖고;
각각의 Ra은 독립적으로 수소, C1-C6-알킬, C3-C6-시클로알킬, -O-(C1-C6-알킬), CF3, -OCF3, S(C1-C6-알킬), CN, -OCH2-페닐, NH2, -NO2, -NH-(C1-C6-알킬), -N-(C1-C6-알킬)2, 피페리딘, 피롤리딘, CH2F, CHF2, -OCH2F, -OCHF2, -OH, -SO2(C1-C6-알킬), C(O)NH2, C(O)NH(C1-C6-알킬), 및 C(O)N(C1-C6-알킬)2이고;
j는 1 또는 2이다.
또 다른 실시양태는 하기를 포함하는, AKT 억제제 화합물을 포함한다:
Figure pct00011
.
한 실시양태에서, AKT 억제제는 GDC-0068로부터 선택된 상기 화학식의 화합물 및 그의 염이고, GDC-0068의 화학식은
Figure pct00012
이다.
화학식 II의 화합물은 WO 2009006567 (모든 목적을 위해, 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, AKT 억제제는 하기 화학식 III의 알로스테릭 AKT 억제제이다.
<화학식 III>
Figure pct00013
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-C5 알킬, 히드록실, C1-5 알콕시 또는 아민이고; p는 1 내지 6의 정수이고; A는 5-14개의 탄소 시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 페닐 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환될 수 있고; 한 실시양태에서 A는 하기 구조 중 하나를 갖고;
Figure pct00014
여기서, D 및 E는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
여기서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)이고;
R5는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환된 5 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고; 한 실시양태에서 R5는 페닐이고;
B는 하기 화학식을 갖는 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리이고;
Figure pct00015
여기서, Q, T, X 및 Y는 각각 독립적으로 -CH, -CH2, C=O, N 또는 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 -CH, -CH2, C=O, N, O 또는 -C=C-이고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 카르보닐 및 5 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리 (할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 한 실시양태에서 R6 또는 R7은 피리디닐이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 5-6원 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환될 수 있고; 한 실시양태에서, B는 하기 구조 중 하나를 갖고,
Figure pct00016
여기서, X, Y, Q, R6 및 R7은 상기 기재된 바와 같고, X', Q' 및 T'는 -CH 또는 N이다.
또 다른 실시양태는 하기 화학식을 갖는 알로스테릭 AKT 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00017
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
Q는 --NR7R8,
Figure pct00018
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 각각의 고리에 5-7개 구성원을 갖고 임의로 질소 이외에 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2 NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소, 및 N(Rb)2로부터 선택된 최대 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
또 다른 실시양태는 하기 화학식을 갖는 알로스테릭 AKT 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00019
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1, 2 또는 3이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고; u, v, w 및 x는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, 단 u, v, w 및 x 중 오직 1개는 N일 수 있고;
Q는 --NR5R6,
Figure pct00020
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 각각의 고리에 5-7개 구성원을 갖고 임의로 질소 이외에 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2 NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소, 및 N(Rb)2로부터 선택된 최대 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
또 다른 실시양태는 하기 화학식을 갖는 알로스테릭 AKT 억제제, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00021
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1, 2 또는 3이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고; u, v, 및 x는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고; W는 결합, CH 또는 N이고;
Q는 --NR5R6,
Figure pct00022
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 각각의 고리에 5-7개 구성원을 갖고 임의로 질소 이외에 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2 NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소, 및 N(Rb)2로부터 선택된 최대 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐, 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
또 다른 실시양태는 하기로부터 선택된 알로스테릭 AKT 억제제 및 그의 염을 포함한다:
Figure pct00023
.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 AKT-1 선택적 ATP-경쟁적 억제제이고, 하기 화학식 IV의 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 IV>
Figure pct00024
상기 식에서,
Ar은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
Q는 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로헤테로알킬, 치환된 시클로헤테로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 R1 및 R2가 부착되어 있는 질소와 함께 시클로헤테로알킬, 치환된 시클로헤테로알킬, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택된 고리를 형성하고;
p는 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고;
q는 0 또는 1이다.
화학식 IV의 화합물은
Figure pct00025
,
및 그의 염을 포함한다.
또 다른 실시양태는 AKT 억제제, 예컨대 하기 화학식을 갖는 페리포신을 포함한다:
Figure pct00026
.
또 다른 실시양태는 AKT 억제제, 예컨대 항-AKT 항체 및 항-AKT DNA 또는 RNA를 포함한다.
또 다른 실시양태는 AKT 억제제, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 하기 서열: 5' ccagcccccaccagtccact 3', 5' cgccaaggagatcatgcagc 3', 5' gctgcatgatctccttggcg 3', 5' agatagctggtgacagacag 3', 5' cgtggagagatcatctgagg 3', 5' tcgaaaaggtcaagtgctac 3', 5' tggtgcagcggcagcggcag 3' 및 5' ggcgcgagcgcgggcctagc 3'을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식 III의 화합물이다. 한 예에서, 화학식 III의 화합물은 PI3-k 억제제를 포함한다. 또 다른 예에서, 화학식 III의 화합물은 mTOR 억제제를 포함한다. 화학식 III의 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
<화학식 III>
Figure pct00027
상기 식에서, A, B, D 및 E는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
R8 및 R9는 함께 5 또는 6원 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 임의로 치환될 수 있다. 예를 들어, R8 및 R9는 이들이 부착되어 있는 화학식 III 내의 탄소와 함께 9-10원 비시클릭 고리계를 형성한다. 비시클릭 고리계의 실시양태는 하기 구조를 포함하고, 여기서,
Figure pct00028
는 화학식 III 고리 내의 결합을 나타낸다:
Figure pct00029
상기 식에서, R11 및 R12는 독립적으로 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬, -C(=O)O-(CRyRz)n-W 또는 페닐 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 W는 C5-12 아릴 또는 헤테로아릴이고, Ry 및 Rz는 독립적으로 수소, 할로겐, -OH 또는 C1-6 알킬이거나; 또는 R11 및 R12는 함께 5-14원 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 형성한다. 예를 들어, R11 및 R12는 이들이 부착되어 있는 탄소 및 상기 화학식 III 내의 고리와 함께 12-14원 트리시클릭 고리계를 형성할 수 있고, 한 실시양태에서 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00030
R' 및 R"는 이들이 결합되어 있는 N과 함께 5, 6 또는 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬로 임의로 치환될 수 있으며, 상기-열거된 치환기를 추가로 함유할 수 있는, 하기 구조 중 하나를 갖는다.
Figure pct00031
상기 식에서, G 및 G'는 독립적으로 C, O 또는 N이고;
R10은 하기 구조를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고;
Figure pct00032
여기서, X, Y, Z 및 Z'는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
R13은 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 -N-(C=O)-N-R14이고, 여기서 R14는 C1-C6-알킬이다. R10의 예는
Figure pct00033
이고;
여기서 J는 -N-(C=O)-N-이고, R14는 C1-C6-알킬이다.
화학식 III의 예시적 화합물은 PI3-k 억제제를 포함한다.
<화학식 III-5>
Figure pct00034
또 다른 실시양태는 하기 화학식을 갖는 mTOR 억제제, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염을 포함한다.
Figure pct00035
상기 식에서,
A는 모르폴린-4-일, 3,4-디히드로-2H-피란-4-일, 3,6-디히드로-2H-피란-4-일, 테트라히드로-2H-피란-4-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피페리딘-1-일로 이루어진 군으로부터 선택된 고리이고, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRaRb , -ORa, -SRa, -S(O)2Rc, -S(O)Rc, -Rc, 할로겐, -NO2, -CN 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2개의 치환기로 임의로 치환되고, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐 및 C3-6 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 각각 부착되어 있는 질소 원자와 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고, Rc는 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C3-6 시클로알킬로부터 선택되고;
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의로 치환된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리를 형성하고, 여기서 상기 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리의 질소 원자는 하기 기에 의해 치환되고;
Figure pct00036
여기서 E는 수소, C6-10 아릴, C5-10 헤테로아릴, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, C1-6 알킬 또는 C1-6 헤테로알킬이고; E는 할로겐, C1-6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서 Rd 및 Re는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되거나, 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
F는 C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌, C2-6 알키닐렌 및 C1-6 헤테로알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고; F는 독립적으로 할로겐, -NRgRh, -SRg, -ORg, -C(O)ORg, -C(O)NRgRh, -NRgC(O)Ri, -OC(O)Ri, -NRgC(O)NRgRh, -OC(O)NRgRh, NRgS(O)2NRgRh, -S(O)2Rg, -S(O)2NRgRh, -Ri, -NO2, N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRgRh, -(CH2)1-4-SRg, -(CH2)1-4-ORg, -(CH2)1-4-C(O)ORg, -(CH2)1-4-C(O)NRgRh, -(CH2)1-4-C(O)Rg, -(CH2)1-4-NRgC(O)Rh, -(CH2)1-4-OC(O)Ri, -(CH2)1-4-NRgC(O)NRgRh, -(CH2)1-4-OC(O)NRgRh, -(CH2)1-4-NRgS(O)2NRgRh, -(CH2)1-4-S(O)2Rg, -(CH2)1-4-S(O)2NRgRh, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 및 -(CH2)1-4-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 치환기로 치환되고; 여기서 Rg 및 Rh는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C1-6 헤테로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고, 임의로 Rg 및 Rh는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Ri는 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
G는 -C(O)-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHC(=NOH)-, -S(O)2- 및 -NHS(O)2-로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고;
m 및 p는 각각 독립적으로 0 내지 1의 정수이며, m 및 p 둘 다가 정수 0인 경우에, E는 C1-6 알킬 또는 C1-6 헤테로알킬이 아니고;
여기서 R1 및 R2가 합하여져 형성된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리는 할로겐, -NRjRk, -SRj, -ORj, -C(O)ORj, -C(O)NRjRk, -NHC(O)Rj, -OC(O)Rj, -Rm, -CN 및 =O로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 치환기로 추가로 치환되고, 여기서 Rj 및 Rk는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-5 시클로알킬 및 C3-5 헤테로시클로알킬로부터 선택되고, Rj 및 Rk는, 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에, 임의로 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rm은 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-5 시클로알킬 및 C3-5 헤테로시클로알킬로부터 선택되고;
B는 페닐렌, 피리딜렌, 피리미딜렌, 피리다지닐렌 및 피라지닐린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로겐, -CN, -N3, -NO2, -C(O)ORn, -C(O)NRnRo, -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)NRnRo, -ORn, -NRnRo 및 Rp로부터 선택된 0 내지 4개의 치환기로 치환되고; 여기서 Rn 및 Ro는 독립적으로 수소 및 C1-4 알킬, C1-4 할로알킬, C1-4 헤테로알킬, C3-7 시클로알킬 및 C3-7 헤테로시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에, Rn 및 Ro는 임의로 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rp는 C1-4 알킬, C1-4 할로알킬, C3-7 시클로알킬 및 C3-7 헤테로시클로알킬이고, 여기서 임의의 B의 인접한 원자에 위치한 2개의 치환기 (D 기는 포함하지 않음)는 임의로 함께 5- 내지 6-원 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
D는 -NR3C(O)NR4R5, -NR4R5, -C(O)NR4R5, -OC(O)OR4, -OC(O)NR4R5, -NR3C(=N-CN)NR4R5, -NR3C(=N-OR4)NR4R5, -NR3C(=N-NR4)NR4R5, -NR3C(O)R4, -NR3C(O)OR4, -NR3S(O)2NR4R5 및 -NR3S(O)2R4로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 여기서 R3은 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬 및 C2-6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-10 시클로알킬, C3-10 헤테로시클로알킬, C6-10 아릴 및 C5-10 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4 및 R5는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 임의로 함께 5- 내지 7-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고; 여기서 R3, R4 및 R5는 독립적으로 할로겐, -NO2, -CN, -NRqRr, -ORq, -SRq, -C(O)ORq, -C(O)NRqRr, -NRqC(O)Rr, -NRqC(O)ORs, -(CH2)1-4-NRqRr, -(CH2)1-4-ORq, -(CH2)1-4-SRq, -(CH2)1-4-C(O)ORq, -(CH2)1-4-C(O)NRqRr, -(CH2)1-4-NRqC(O)Rr, -(CH2)1-4-NRqC(O)ORr, -(CH2)1-4-CN, -(CH2)1-4-NO2, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, =O, 및 -Rs로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 치환기로 추가로 치환되고; 여기서 Rq 및 Rr은 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 헤테로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, C6-10 아릴, C5-10 헤테로아릴로부터 선택되고; Rs는 각각의 경우에 독립적으로 C1-6 알킬. C1-6 할로알킬, C1-6 헤테로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, C6-10 아릴 및 C5-10 헤테로아릴로부터 선택되고; 여기서 D 기 및 B 고리의 인접한 원자 상에 위치한 치환기는 임의로 함께 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
특정 실시양태에서,
A는 모르폴린-4-일, 3,4-디히드로-2H-피란-4-일, 3,6-디히드로-2H-피란-4-일, 테트라히드로-2H-피란-4-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피페리딘-1-일 (C1-C6 알킬에 의해 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 고리이고;
B는 페닐렌 및 피리미딜렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
D는 -NR3C(O)NR4R5, -NR4R5, -C(O)NR4R5, -OC(O)OR4, -OC(O)NR4R5, -NR3C(=N-CN)NR4R5, -NR3C(=N-OR4)NR4R5, -NR3C(=N-NR4)NR4R5, -NR3C(O)R4, -NR3C(O)OR4, -NR3S(O)2NR4R5 또는 -NR3S(O)2R4이고, 여기서 R3은 수소 또는 C1-6 알킬이고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬 또는 C3-10 시클로알킬이거나, 또는 R4 및 R5는 함께 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 치환된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리를 형성하고, 여기서 상기 고리의 질소 원자는 하기 기에 의해 치환되고;
Figure pct00037
여기서, E는 수소, C6 아릴, C5-6 헤테로아릴, C1-6 알킬 또는 C5-6 헤테로시클로알킬이고; E는 할로겐, C1-6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서 Rd 및 Re는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되거나, 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
F는 C1-6 알킬렌이고;
G는 -C(O)-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHC(=NOH)-, -S(O)2- 또는 -NHS(O)2-이고;
m 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
또 다른 실시양태는 하기를 포함하는, mTOR 억제제 화합물을 포함한다:
Figure pct00038
.
또 다른 실시양태는 mTOR 억제제, 라파마이신을 포함한다.
Figure pct00039
또 다른 실시양태는 하기 화학식의 PI3-k 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
Figure pct00040
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 선택되고; 여기서 Rd 및 Re는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되거나, 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 함께 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C3-7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되거나; 또는
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 융합된 5- 또는 6-원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고, 이는 옥소, 할로겐, C1-C3 알킬 또는 CF3에 의해 임의로 치환된다.
PI3-k 억제제의 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00041
.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식 V 및 VI의 PI3K 키나제 억제제, 또는 그의 입체이성질체, 기하 이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 V>
Figure pct00042
<화학식 VI>
Figure pct00043
상기 식에서,
R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, -(CR14R15)mNR10R11, -C(R14R15)nNR12C(=Y)R10, -(CR14R15)nNR12S(O)2R10, -(CR14R15)mOR10, -(CR14R15)nS(O)2R10, -(CR14R15)nS(O)2NR10R11, -C(OR10)R11R14, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -C(=Y)NR12OR10, -C(=O)NR12S(O)2R10, -C(=O)NR12(CR14R15)mNR10R11, -NO2, -NR12C(=Y)R11, -NR12C(=Y)OR11, -NR12C(=Y)NR10R11, -NR12S(O)2R10, -NR12SO2NR10R11, -SR10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 선택되고;
R2는 H, F, Cl, Br, I, CN, CF3, -NO2, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)mNR10R11, -(CR14R15)nOR10, -(CR14R15)t-NR12C(=O)(CR14R15)NR10R11, -NR12C(=Y)R10, -NR12C(=Y)OR10, -NR12C(=Y)NR10R11, -NR12SO2R10, OR10, -OC(=Y)R10, -OC(=Y)OR10, -OC(=Y)NR10R11, -OS(O)2(OR10), -OP(=Y)(OR10)(OR11), -OP(OR10)(OR11), SR10, -S(O)R10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -S(O)(OR10), -S(O)2(OR10), -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, -SC(=Y)NR10R11, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 선택되고;
R3은 탄소 연결된 모노시클릭 헤테로아릴, 탄소 연결된 융합된 비시클릭 C3-C20 헤테로시클릴, 또는 탄소 연결된 융합된 비시클릭 C1-C20 헤테로아릴이고, 여기서 모노시클릭 헤테로아릴, 융합된 비시클릭 C3-C20 헤테로시클릴, 및 융합된 비시클릭 C1-C20 헤테로아릴은 F, Cl, Br, I, -CN, -NR10R11, -OR10, -C(O)R10, -NR10C(O)R11, -N(C(O)R11)2, -NR10C(O)NR10R11, -NR12S(O)2R10, -C(=O)OR10, -C(=O)NR10R11, C1-C12 알킬 및 (C1-C12 알킬)-OR10으로부터 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환되고;
R10, R11 및 R12는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 또는 C1-C20 헤테로아릴이거나,
또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 C2-C20 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 옥소, (CH2)mOR12, NR12R12, CF3, F, Cl, Br, I, SO2R12, C(=O)R12, NR12C(=Y)R12, NR12S(O)2R12, C(=Y)NR12R12, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환되고;
R14 및 R15는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 또는 -(CH2)n-아릴로부터 선택되거나,
또는 R14 및 R15는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 포화 또는 부분 불포화 C3-C12 카르보시클릭 고리를 형성하고; 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, Cl, Br, I, CN, CF3, -NO2, 옥소, R10, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)nNR10R11, -(CR14R15)nOR10, -NR10R11, -NR12C(=Y)R10, -NR12C(=Y)OR11, -NR12C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)mNR12SO2R10, =NR12, OR10, -OC(=Y)R10, -OC(=Y)OR10, -OC(=Y)NR10R11, -OS(O)2(OR10), -OP(=Y)(OR10)(OR11), -OP(OR10)(OR11), -SR10, -S(O)R10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -S(O)(OR10), -S(O)2(OR10), -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, -SC(=Y)NR10R11, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴, 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환되고;
Y는 O, S, 또는 NR12이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
PI3-k 억제제의 예는 하기를 포함한다.
<화학식 III-3>
Figure pct00044
, 및
<화학식 III-6>
Figure pct00045
화학식 V 및 VI 화합물의 제조
화학식 V 및 VI의 화합물은 WO 2006/046031 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 비롯하여 화학 업계에 널리 공지된 것들과 유사한 방법을 포함하는 합성 경로에 의해 합성될 수 있다. 출발 물질은 일반적으로 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals; 위스콘신주 밀워키)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수가능하거나, 또는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 용이하게 제조된다 (예를 들어, 문헌 [Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, N.Y. (1967-1999 ed.), 또는 Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin] (부록 포함) (또한 바일스타인(Beilstein) 온라인 데이터베이스를 통해 이용가능함)에 일반적으로 기재된 방법에 의해 제조됨).
화학식 V 및 VI의 화합물은 다른 티오펜, 푸란 및 피리미딘 (US 6608053; US 6492383; US 6232320; US 6187777; US 3763156; US 3661908; US 3475429; US 5075305; US 2003/220365; GB 1393161; WO 93/13664); 및 다른 헤테로사이클 (문헌 [Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Editors Katritzky and Rees, Pergamon Press, 1984]에 기재됨)의 제조 절차를 이용하여 제조될 수 있다.
화학식 V 및 VI의 화합물은 제약상 허용되는 염으로 전환될 수 있고, 염은 통상의 방법에 의해 유리 화합물로 전환될 수 있다. 제약상 허용되는 염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 황산, 질산 및 인산; 및 유기 산, 예컨대 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 에탄술폰산, 아스파르트산 및 글루탐산과의 염을 포함한다. 염은 메실레이트, 히드로클로라이드, 포스페이트, 벤젠술포네이트 또는 술페이트일 수 있다. 염은 모노-염 또는 비스-염일 수 있다. 예를 들어, 메실레이트 염은 모노-메실레이트 또는 비스-메실레이트일 수 있다.
또한, 화학식 V 및 VI의 화합물 및 염은 수화물 또는 용매화물로 존재할 수 있다.
화학식 V 및 VI의 화합물의 제조에서 중간체의 관능기 (예를 들어, 1급 또는 2급 아민)를 보호할 필요가 있을 수 있다. 이러한 보호에 대한 필요성은 원격 관능기의 특성 및 제조 방법의 조건에 따라 달라질 것이다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBz) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함한다. 이러한 보호에 대한 필요성은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 보호기 및 그의 사용의 일반적 설명에 대해, 문헌 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
예시적 목적을 위해, 하기 반응식 5-11은 화합물 뿐만 아니라 주요 중간체를 제조하는 일반적 방법을 보여준다. 개별 반응 단계의 보다 상세한 설명에 대해, 하기 실시예 섹션을 참조한다. 통상의 기술자는 본 발명의 화합물을 합성하기 위해 다른 합성 경로가 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 구체적인 출발 물질 및 시약이 하기 반응식에 도시되고 논의되어 있지만, 다른 출발 물질 및 시약으로 용이하게 대체하여 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공할 수 있다. 또한, 하기 기재된 방법에 의해 제조된 다수의 화합물은 통상의 기술자에게 널리 공지된 통상의 화학반응을 이용하여 본 개시내용의 관점에서 추가로 변형될 수 있다.
반응식 5
Figure pct00046
반응식 5는 2-카르복시에스테르, 3-아미노 티오펜, 및 2-아미노, 3-카르복시 에스테르 티오펜 시약, 각각 중간체 (51) 및 (52)로부터 티에노피리미딘 중간체 (55) 및 (56), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, Hal은 Cl, Br, 또는 I이고; R1, R2, 및 R10은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 제조하기 위한 일반적 방법을 보여준다.
반응식 6
Figure pct00047
반응식 6은 유기 용매 중에서 염기성 조건 하에 비스-할로 티에노피리미딘 중간체 (57) 및 (58)로부터의 4-할라이드를 모르폴린으로 선택적으로 대체하여 각각 2-할로, 4-모르폴리노 티에노피리미딘 화합물 (59) 및 (60), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R1 및 R2는 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 제조하기 위한 일반적 방법을 보여준다.
반응식 7
Figure pct00048
반응식 7은 2-할로, 4-모르폴리노, 6-수소 티에노피리미딘 화합물 (61) 및 (62) (여기서, R1은 H임)의 6-위치를 유도체화하기 위한 일반적 방법을 보여준다. 리튬화 시약으로 (61) 또는 (62)를 처리하여 6 위치 양성자를 제거한 후, 아실화 시약 R10C(O)Z (여기서, Z는 이탈기, 예컨대 할라이드, NHS 에스테르, 카르복실레이트 또는 디알킬아미노임)를 첨가하여, 2-할로, 4-모르폴리노, 6-아실 티에노피리미딘 화합물 (63) 및 (64), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, Hal은 Cl, Br 또는 I이고, R2 및 R10은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득한다. 6-포르밀 화합물 (R10 = H)을 제조하기 위한 R10C(O)Z의 예는 N,N'-디메틸포름아미드 (DMF)이다.
반응식 8
Figure pct00049
반응식 8은 2-할로 피리미딘 중간체 (65) 및 (66)을 모노시클릭 헤테로아릴, 융합된 비시클릭 헤테로시클릴 또는 융합된 비시클릭 헤테로아릴 보로네이트 산 (R15 = H) 또는 에스테르 (R15 = 알킬) 시약 (67)과 스즈키-유형 커플링시켜 화학식 V 및 VI의 2-치환된 (Hy), 4-모르폴리노 티에노피리미딘 화합물 (68) 및 (69), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R1 및 R2는 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 제조하기 위한 일반적 방법을 보여준다. 스즈키 반응에 대한 검토를 위해 문헌 [Miyaura et al. (1995) Chem. Rev. 95:2457-2483; Suzuki, A. (1999) J. Organomet. Chem. 576:147-168; Suzuki, A. in Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions, Diederich, F., Stang, P.J., Eds., VCH, Weinheim, DE (1998), pp 49-97]을 참조한다. 팔라듐 촉매는 스즈키-유형 교차-커플링에 통상적으로 사용되는 임의의 것, 예컨대 PdCl2(PPh3)2, Pd(PPh3)4, Pd(OAc)2, PdCl2(dppf)-DCM, Pd2(dba)3/Pt-Bu)3일 수 있다 (Owens et al. (2003) Bioorganic & Med. Chem. Letters 13:4143-4145; Molander et al. (2002) Organic Letters 4(11):1867-1870; US 6448433).
반응식 9
Figure pct00050
반응식 9는 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체의 제조에 사용될 수 있는 알킨 (71)의 합성을 위한 일반적 방법을 보여준다. 적절한 염기 (Cs2CO3 등)의 존재 하에 프로파르길 아민 (71)은 프로파르길 브로민화물 (70)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 독립적으로 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 알키닐 아민 및 관련 합성의 검토를 위해 문헌 [Booker-Milburn, K.I., Comprehensive Organic Functional Group Transformations (1995), 2:1039-1074; 및 Viehe, H.G., (1967) Angew. Chem., Int. Ed. Eng., 6(9):767-778]을 참조한다. 후속적으로, 알킨 (71)을 중간체 (72) (X2 = 브로모 또는 아이오도) 또는 (73)과 (소노가시라(Sonogashira) 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (74) 및 (75), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
반응식 10
Figure pct00051
반응식 10은 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체를 제조하는데 사용될 수 있는 알킨 (77)의 합성을 위한 일반적 방법을 보여준다. gem-디알킬 프로파르길 아민 (77)은 문헌 [Zaragoza et al. (2004) J. Med. Chem., 47:2833]에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 반응식 6에 따르면, CuCl 및 적절한 염기 (예를 들어, TEA 등)의 존재 하에 gem-디알킬 클로라이드 (76) (R14 및 R15는 독립적으로 메틸, 에틸 또는 다른 알킬 기임)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 독립적으로 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시켜, 알킨 (77)을 수득할 수 있다. 알킨 (77)을 중간체 (72) 또는 (73)과 (소노가시라 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (78) 및 (79), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
반응식 11
Figure pct00052
반응식 11은 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 알킨 (81)의 합성을 위한 일반적 방법을 보여준다. 부트-3-인-1-아민 (81) (여기서, R14 및 R15는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴이거나, 또는 R14 및 R15는 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함)은 문헌 [Olomucki M. et al. (1960) Ann. Chim. 5:845]에 기재된 프로토콜을 이용하여 알킨 (80) (LG = 토실레이트 또는 다른 이탈기)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 후속적으로, 반응식 5 및 6에 제공된 설명에 따라 알킨 (81)을 중간체 (72) 또는 (73)과 (소노가시라 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (82) 및 (83), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
상기에 정의된 바와 같은 과정에서, 아미노화 단계 및 Pd-매개 교차-커플링 단계는 둘 다 통상의 조건 하에 일어난다. 팔라듐 촉매는 스즈키-유형 교차-커플링에 전형적으로 사용되는 임의의 것, 예컨대 PdCl2(PPh3)2일 수 있다. 환원제는 전형적으로 보로히드라이드, 예컨대 NaBH(OAc)3, NaBH4 또는 NaCNBH4이다.
또한, 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암 요법을 받았거나 또는 현재 받고 있다. 본원에 기재된 추가의 치료, 작용제, 또는 조합 요법의 투여는 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시킨다.
RNA 구축물
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 대상은 본원에 기재된 RNAi 구축물에 관한 것이다. RNAi 구축물은 Akt의 유용한 억제제이다.
제약 제제
이러한 벌크 조성물과 각각의 개별 투여 단위는 고정량의 상기 언급된 제약 활성제를 함유할 수 있다. 벌크 조성물은 아직 개별 투여 단위로 형성되지 않은 물질이다. 예시적 투여 단위는 경구 투여 단위, 예컨대 정제, 환제, 캡슐제 등이다. 유사하게, 제약 조성물을 투여함으로써 환자를 치료하는 본원에 기재된 방법은 또한 벌크 조성물 및 개별 투여 단위의 투여를 포괄하도록 의도된다.
제약 조성물은 본원에 기재된 것들과 동일한 동위원소-표지된 화합물을 포함할 뿐만 아니라 1개 이상의 원자가 통상적으로 실측되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된다는 사실을 포함한다. 명시된 임의의 특정한 원자 또는 원소의 모든 동위원소는 화합물 및 그의 용도의 범위 내로 고려된다. 화합물에 도입될 수 있는 예시적인 동위원소는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소 및 아이오딘의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 32P, 33P, 35S, 18F, 36Cl, 123I 및 125I를 포함한다. 특정 동위원소-표지된 개시된 화합물 (예를 들어, 3H 및 14C로 표지된 것)은 화합물 및/또는 기질 조직 분포 검정에 유용하다. 삼중수소 (3H) 및 탄소-14 (14C) 동위원소는 제조의 용이성 및 검출감도의 측면에서 유용하다. 추가로, 보다 무거운 동위원소, 예컨대 중수소 (2H)로의 치환은 더 높은 대사 안정성으로부터 유래된 특정의 치료 이점 (예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여량 요건)을 제공할 수 있고, 이에 따라 일부 상황에서 바람직할 수 있다. 양전자 방출 동위원소, 예컨대 15O, 13N, 11C 및 18F는 기질 수용체 점유성을 조사하는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 연구에 유용하다. 일반적으로, 동위원소 표지된 화합물은 하기 본원의 반응식 및/또는 실시예에 개시된 것들과 유사한 하기 절차에 의해, 비-동위원소 표지된 시약 대신에 동위원소 표지된 시약을 사용하여 제조될 수 있다.
또 다른 측면은 본원에 개시된 화합물을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
적합한 담체, 희석제 및 부형제는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이는 물질, 예컨대 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등을 포함한다. 사용되는 특정한 담체, 희석제 또는 부형제는 화합물이 적용되는 수단 및 목적에 따라 달라질 것이다. 용매는 일반적으로 포유동물에게 투여되기에 안전한 것으로 통상의 기술자에게 인지되는 (GRAS) 용매를 기초로 하여 선택된다. 일반적으로, 안전한 용매는 비-독성 수성 용매, 예컨대 물, 및 물 중에서 가용성 또는 혼화성인 다른 비-독성 용매이다. 적합한 수성 용매는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 400, PEG 300) 등 및 그의 혼합물을 포함한다. 제제는 또한 약물 (즉, 화합물 또는 그의 제약 조성물)의 우아한 외양을 제공하거나 또는 제약 제품 (즉, 의약)의 제조를 보조하기 위해 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 퍼퓸제, 향미제, 및 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.
제제는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 벌크 약물 물질 (즉, 화합물 또는 화합물의 안정화된 형태, 예를 들어 시클로덱스트린 유도체 또는 다른 공지된 복합체화 작용제와의 복합체)은 상기 기재된 하나 이상의 부형제의 존재 하에 적합한 용매에 용해된다. 전형적으로, 화합물은 제약 투여 형태로 제제화되어, 용이하게 제어가능한 투여량의 약물을 제공하고 환자가 처방된 요법에 순응할 수 있게 한다.
적용을 위한 제약 조성물 (또는 제제)은 약물을 투여하기 위해 사용되는 방법에 따라 다양한 방식으로 포장될 수 있다. 일반적으로, 분배를 위한 물품은 그 안에 제약 제제가 적절한 형태로 배치된 용기를 포함한다. 적합한 용기는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 물질, 예컨대 병 (플라스틱 및 유리), 사쉐, 앰플, 플라스틱 백, 금속 실린더 등을 포함한다. 용기는 또한 포장의 내용물에 무분별하게 접근하는 것을 방지하기 위해 부정조작-방지 조립물을 포함할 수 있다. 또한, 용기는 용기의 내용물을 기재한 라벨이 그 위에 배치되어 있다. 라벨은 또한 적절한 경고문을 포함할 수 있다.
화합물의 제약 제제는 다양한 경로 및 유형의 투여를 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 정도의 순도를 갖는 본원에 기재된 화합물은 임의로 동결건조 제제, 밀링된 분말, 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1995) 18th edition, Mack Publ. Co., Easton, PA). 제제화는 주위 온도에서 적절한 pH에서 원하는 정도의 순도로 생리학상 허용되는 담체, 즉 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 제제의 pH는 주로 화합물의 특정한 용도 및 농도에 따라 달라지지만, 약 3 내지 약 8의 범위일 수 있다.
제약 제제는 바람직하게 멸균된다. 특히 생체내 투여를 위해 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이러한 멸균은 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 용이하게 달성된다.
제약 제제는 통상적으로, 고체 조성물, 동결건조 제제 또는 수용액으로서 저장할 수 있다.
제약 제제는 우수한 의료 행위와 일치되는 방식으로, 즉 이러한 양, 농도, 스케줄, 과정, 비히클 및 투여 경로로, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 투여될 화합물의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 이는 응고 인자 매개된 장애를 예방, 회복 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 이러한 양은 바람직하게는, 숙주에게 독성이거나 숙주에게 훨씬 더 용이하게 출혈을 일으키는 양 보다 적다.
일반적 문제로서, 용량당 경구로 또는 비경구로 투여되는 본원에 기재된 화합물의 초기 제약 유효량은 약 0.01-100 mg/kg의 범위, 즉 약 0.1 내지 20 mg/kg (환자 체중)/일일 것이며, 사용되는 화합물의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일일 것이다.
허용되는 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 활성 제약 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, (1995) Mack Publ. Co., Easton, PA]에 개시되어 있다.
본원에 기재된 화합물의 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (US 3773919), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체) 및 폴리-D (-) 3-히드록시부티르산을 포함한다.
제약 제제는 본원에 상세히 기재된 투여 경로에 적합한 것을 포함한다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제제는 일반적으로 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Ed. (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 치밀하게 회합시키고, 이어서 필요한 경우에는 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본원에 기재된 화합물의 제제는 각각 미리 결정된 양의 본원에 기재된 화합물을 함유하는 이산 단위, 예컨대 환제, 경질 또는 연질의 예를 들어 젤라틴 캡슐, 카쉐, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르로서 제조할 수 있다. 이러한 제제는 제약 조성물의 제조에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 이러한 조성물은 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 비롯한 하나 이상의 작용제를 함유하여 미감이 향상된 제제를 제공할 수 있다. 압착된 정제는 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면 활성제 또는 분산제와 임의로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유-유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압착하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화시킨 분말형 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅 또는 스코어링될 수 있고, 이로부터 활성 성분의 지연 또는 제어 방출이 제공되도록 임의로 제제화된다.
제약 제제의 정제 부형제는 하기를 포함할 수 있다: 정제를 구성하는 분말형 약물의 벌크 부피를 증가시키기 위한 충전제 (또는 희석제); 정제를 섭취하였을 때, 이를 작은 단편, 이상적으로는 개별 약물 입자로 분해하는 것을 도와주어, 약물이 신속하게 용해 및 흡수되는 것을 증진시켜 주는 붕해제; 과립 및 정제를 요구되는 기계적 강도로 형성하고, 이를 압착시킨 후에도 함께 정제를 보유하여, 포장, 선적 및 통상적인 취급 동안에 해당 정제가 그의 성분 분말로 분해되는 것을 방지할 수 있는 결합제; 생성 과정 동안에 정제를 구성하는 분말의 유동성을 개선시켜 주는 활택제; 정제 제조 동안에 정제화 분말이 정제를 압착시키기 위해 사용된 장비에 부착되지 않도록 해주는 윤활제. 이들은 압축기를 통한 분말 혼합물의 흐름을 개선시키고, 완성된 정제가 장치로부터 튀어나올 때 마찰 및 파손을 최소화하며; 활택제와 유사한 기능을 갖는 부착방지제는 제조 동안 정제의 형상을 찍어내는 데 사용되는 기계와 정제를 구성하는 분말 사이의 부착을 감소시키고; 정제에 혼입된 향미제는 정제에 보다 우수한 맛을 부여하거나 불쾌한 맛을 차폐하며; 착색제는 식별성 및 환자 순응도에 도움을 제공하였다.
활성 성분을 정제 제조에 적합한 비-독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합하여 함유하는 정제가 허용된다. 이러한 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 또는 마이크로캡슐화를 비롯한 공지된 기술에 의해 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 더 오랜 기간에 걸친 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.
안구 또는 다른 외부 조직, 예를 들어 구강 및 피부를 치료하는 경우, 제제는 바람직하게는 활성 성분(들)을, 예를 들어 0.075 내지 20% w/w의 양으로 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 도포된다. 연고로 제제화되는 경우에, 활성 성분은 파라핀계 또는 수혼화성 연고 베이스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수중유 크림 베이스와 함께 크림으로 제제화될 수 있다.
원하는 경우에, 크림 베이스의 수성 상은 다가 알콜, 즉 2개 이상의 히드록실 기를 갖는 알콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 400 포함) 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 국소 제제는 바람직하게는 피부 또는 다른 이환 부위를 통한 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증진하는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 피부 침투 증진제의 예는 디메틸 술폭시드 및 관련 유사체를 포함한다.
에멀젼의 유성 상은 공지된 성분으로부터 공지된 방식으로 구성될 수 있고, 지방 또는 오일, 또는 지방 및 오일 둘 다와 하나 이상의 유화제의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제는 안정화제로서 작용하는 친지성 유화제와 함께 포함된다. 함께, 안정화제(들)를 수반하거나 수반하지 않는 유화제(들)가 유화 왁스를 구성하고, 오일과 지방을 수반한 왁스는 크림 제제의 유성 분산 상을 형성하는 유화 연고 베이스를 포함한다. 제제에 사용하기에 적합한 유화제 및 에멀젼 안정화제는 트윈® 60, 스팬(Span)® 80, 세토스테아릴 알콜, 벤질 알콜, 미리스틸 알콜, 글리세릴 모노-스테아레이트 및 소듐 라우릴 술페이트를 포함한다.
제약 제제의 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 크로스카르멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 자연 발생 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 멸균 주사가능한 제제, 예컨대 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술분야에 공지된 바에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 비-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-부탄디올 중 용액 또는 동결건조 분말로부터 제조된 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 완화성 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 마찬가지로 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하도록 의도된 지연-방출 제제는, 전체 조성물의 약 5 내지 약 95% (중량:중량)로 달라질 수 있는 적절하고도 편리한 양의 담체 물질과 배합된 활성 물질 대략 1 내지 1000 mg을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 투여를 위해 용이하게 측정가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위해 의도된 수용액은 약 30 mL/시간의 속도에서 적합한 부피로 주입될 수 있도록, 용액의 밀리리터 당 활성 성분 약 3 내지 500 μg을 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제가 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
안구로의 국소 투여에 적합한 제제는 활성 성분이 적합한 담체, 특히 활성 성분용 수성 용매 중에 용해되거나 또는 현탁화된 점안제를 또한 포함한다. 바람직하게는, 활성 성분은 약 0.5 내지 20% w/w, 예를 들어 약 0.5 내지 10% w/w, 예를 들어 약 1.5% w/w의 농도로 이러한 제제에 존재한다.
구강으로의 국소 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 향미 베이스, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중에 포함하는 로젠지; 활성 성분을 불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중에 포함하는 파스틸; 및 활성 성분을 적합한 액체 담체 중에 포함하는 구강세정제를 포함한다.
직장 투여를 위한 제제는, 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 베이스를 사용하여 좌제로서 제공될 수 있다.
폐내 또는 비강 투여에 적합한 제제는 예를 들어 0.1 내지 500 마이크로미터 범위의 입자 크기 (예컨대, 0.5, 1, 30 마이크로미터, 35 마이크로미터 등의 마이크로미터 증분으로 0.1 내지 500 마이크로미터 범위의 입자 크기 포함)를 가지며, 이는 비도를 통한 신속한 흡입에 의해 투여되거나, 또는 구강을 통한 흡입에 의해 투여되어 폐포낭에 도달하게 된다. 적합한 제제는 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 에어로졸 또는 건조 분말 투여에 적합한 제제는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있고, 다른 치료제, 예컨대 하기 기재되는 장애의 치료 또는 예방에서 종전에 사용된 화합물과 함께 전달될 수 있다.
질 투여에 적합한 제제는 활성 성분 이외에도 관련 기술분야에 적절한 것으로 공지된 바와 같은 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체 또는 스프레이 제제로서 제공될 수 있다.
제제는 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 포장될 수 있고, 사용 직전에 주사용 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만이 필요한 냉동-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉시투여용 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조된다. 바람직한 단위 투여 제제는 활성 성분을 본원에서 상기 언급한 바와 같은 1일 용량 또는 단위 1일 하위-용량 또는 그의 적절한 분획으로 함유하는 것이다.
따라서 또 다른 측면은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 수의학적 담체와 함께 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다. 수의학적 담체는 조성물 투여 목적에 유용한 물질이고, 다르게는 불활성이거나 또는 수의학 업계에서 허용되는 고체, 액체 또는 기체 물질일 수 있고, 활성 성분과 상용성이다. 이러한 수의학적 조성물은 비경구로, 경구로, 또는 임의의 다른 목적한 경로로 투여될 수 있다.
조합 요법
조합 요법은 동시 또는 순차 요법으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우에, 조합물은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 여기서 바람직하게는 둘 다의 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 존재한다.
임의의 상기 공투여된 작용제에 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 투여량이며, 새로 확인된 작용제 및 본원에 기재된 다른 치료제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 감량될 수 있다.
화합물은 치료할 상태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 경로는 경구, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 흡입, 피내, 척수강내, 경막외, 및 주입 기술 포함), 경피, 직장, 비내, 국소 (협측 및 설하 포함), 질, 복강내, 폐내 및 비강내 투여를 포함한다. 국소 투여는 또한 경피 패치 또는 이온영동 장치와 같이 경피 투여를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 약물의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 논의되어 있다. 약물 제제의 다른 예는 문헌 [Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 국부 면역억제 치료의 경우, 상기 화합물은 병변내 투여로 투여될 수 있는데, 이는 이식편을 이식 전에 해당 억제제로 관류시키거나 다른 방식으로 이와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 상태에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 화합물을 경구로 투여하는 경우에, 이는 제약상 허용되는 담체, 활택제 또는 부형제와 함께, 환제, 캡슐제, 정제 등으로서 제제화될 수 있다. 화합물을 비경구로 투여하는 경우에, 이는 제약상 허용되는 비경구 비히클 또는 희석제와 함께, 하기 상세히 기재되는 바와 같은 단위 투여량 주사가능한 형태로 제제화될 수 있다.
인간 환자를 치료하기 위한 용량은 화합물 약 10 mg 내지 약 1000 mg 범위일 수 있다. 전형적인 용량은 화합물 약 100 mg 내지 약 300 mg일 수 있다. 용량은 1일 1회 (QID), 1일 2회 (BID), 또는 특정 화합물의 흡수, 분포, 대사 및 배출을 비롯하여 약동학 (PK) 및 약력학 (PD) 특성에 따라 더욱 빈번하게 투여될 수 있다. 또한, 독성 요인이 투여량 및 투여 요법에 영향을 줄 수도 있다. 경구 투여되는 경우에, 환제, 캡슐 또는 정제를 명시된 기간 동안 매일 섭취하거나 덜 빈번하게 섭취할 수 있다. 이러한 요법을 여러 요법 주기 동안 반복할 수 있다.
제조품
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 질환 및 장애의 치료에 유용한 화합물을 함유하는 제조품 또는 "키트"가 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 화합물을 포함하는 용기를 포함한다. 키트는 상기 용기와 연합되거나 그 위에 라벨 또는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "포장 삽입물"은 일반적으로 치료 제조품의 상업적으로 입수가능한 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제조품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 블리스터 팩 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태의 치료에 효과적인 화합물 또는 그의 제제를 보유할 수 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물의 하나 이상의 활성제는 본원에 기재된 화합물이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태, 예컨대 암을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 상기 라벨 또는 포장 삽입물은 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물이 비정상적 세포 성장으로 인한 장애의 치료를 위해 사용될 수 있음을 지시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 또한 조성물이 다른 장애를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낼 수도 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 화합물의 경구용 고체 형태, 예컨대 정제 또는 캡슐의 전달에 적합하다. 바람직하게는, 이러한 키트는 수많은 단위 투여량을 포함한다. 이러한 키트는 의도된 사용 순서로 배열된 투여량을 갖는 카드를 포함할 수 있다. 이러한 키트의 예는 "블리스터 팩"이다. 블리스터 팩은 포장 산업에 널리 공지되어 있으며, 제약 단위 투여 형태를 포장하기 위해 널리 이용된다. 원하는 경우에, 기억 보조물이 예를 들어 숫자, 문자 또는 다른 표기 형태로, 또는 투여량이 투여될 수 있는 치료 스케쥴에서 날짜가 지정되어 있는 달력 삽입물과 함께 제공될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 키트는 (a) 본원에 기재된 화합물이 함유된 제1 용기; 및 임의로 (b) 제2 제약 제제가 함유된 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 제약 제제는 항과다증식 활성을 갖는 제2 화합물을 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 키트는 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 포함된 제3 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
환자의 반응성은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 성장 정지, (2) 병변 크기의 감소, (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (4) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, (6) 치료 후 무질환 상태를 보이는 기간의 증가, 및/또는 (8) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않은, 환자에 대한 이익을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.
임상 이익은 다양한 종점, 예를 들어 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 정지, 질환 에피소드 및/또는 증상의 수 감소, 병변 크기의 감소, 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), 질환 병변을 퇴행시키거나 제거할 수는 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아닌 자가면역 반응의 감소, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, 치료 후 무질환 상태, 예를 들어 무진행 생존을 보이는 기간의 증가, 전체 생존의 증가, 반응률의 증가, 및/또는 치료 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 평가하여 측정할 수 있다.
용어 "이익"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 임의의 바람직한 효과를 지칭하며, 구체적으로는 본원에 정의한 바와 같은 임상 이익을 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
용어 "공동으로"는 2종 이상의 치료제의 투여가 적어도 일부의 투여 시간이 중첩되는 경우를 지칭하도록 본원에 사용된다. 따라서, 공동 투여는 하나 이상의 작용제(들)의 투여를 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 계속하는 경우의 투여 요법을 포함한다.
특정 조합은, AKT 억제제에 대한 내성이 발생한 한 실시양태에서, 특정 암 표현형에 대해 개선된 효과를 제공하는 것으로 결정되었다. 예를 들어, 특정 조합은 PTEN 돌연변이, AKT 돌연변이 (예를 들어, 과다발현 또는 증폭), PI3K 돌연변이, 또는 Her2/ErbB2 증폭과 연관된 암에 대해 개선된 효과를 제공한다. 따라서, 본원에 기재된 특정 조합은 이러한 유형의 암에 대해, 한 실시양태에서는 암이 AKT 억제제에 대한 내성을 갖는 경우에, 특히 유용할 수 있다.
PTEN 상태는 관련 기술분야에 공지된 것과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 측정될 수 있다. 한 예에서, IHC가 이용된다. 대안적으로, 웨스턴 블롯 분석을 이용할 수 있다. PTEN에 대한 항체는 상업적으로 입수가능하다 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 매사추세츠주 비벌리, 캐스케이드 바이오사이언시즈(Cascade Biosciences), 매사추세츠주 윈체스터). PTEN 상태에 대한 IHC 및 웨스턴 블롯 분석에 대한 예시적 절차는 문헌 [Neshat, M. S. et al. Enhanced sensitivity of PTEN-deficient tumors to inhibition of FRAP/mTOR, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10314-10319 (2001) 및 Perren, A., et al. Immunohistochemical Evidence of Loss of PTEN Expression in Primary Ductal Adenocarcinomas of the Breast, American Journal of Pathology, Vol. 155, No. 4, October 1999]에 기재되어 있다. 부가적으로, AKT 돌연변이, PI3K 돌연변이, 및 Her2/ErbB2 증폭 또는 돌연변이와 연관된 암은 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 한 예에서, 환자 또는 조직 샘플의 PTEN 상태는 IHC를 이용하여 결정되고, histo 스코어 또는 HScore가 샘플 또는 환자에 할당된다. Hscore를 계산하는 예시적 방식은 식: HScore = (%1+세포 x 1)+(%2+세포 x 2)+(%3+세포 x 3)을 이용한다 (문헌 [Shoman, N, et al., Mod Path (2005) 18, 250-259] 참조). 동일한 환자 또는 환자의 수집물로부터의 비-암성 조직의 평균 PTEN Hscore를 이용하여 환자 또는 샘플 Hscore가 적거나 또는 존재하지 않는지 여부를 결정할 수 있다. 한 예에서, 약 200 미만의 Hscore는 낮은 것으로 간주되며 PTEN이 적다는 것에 해당하고, 약 0의 Hscore는 존재하지 않는 것으로 간주된다.
표적 유전자 또는 바이오마커를 포함하는 샘플은 관련 기술분야에 공지되어 있고 관심 암의 특정 유형 및 위치에 적절한 방법으로 수득될 수 있다. 정의 부분을 참조한다. 예를 들어, 암성 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 브러싱으로 수득될 수도 있고, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수도 있다. 유전자 또는 유전자 산물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 객담, 혈청 또는 혈장으로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 산물의 검출에 대해 상기 논의된 것과 동일한 기술이 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨져서 이러한 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 산물에 대해 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링될 수 있다.
조직 제제를 암 세포에 대해 풍부하게 하는 수단은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직을 파라핀 또는 동결 절편으로부터 단리할 수 있다. 또한, 암 세포는 유동 세포측정법 또는 레이저 포획 미세절제에 의해 정상 세포로부터 분리될 수도 있다. 이러한 기술 뿐만 아니라 정상 세포로부터 암성 세포를 분리해 내는 다른 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 암 조직이 정상 세포로 고도로 오염되어 있는 경우에는, 오염 및/또는 가양성/가음성 결과를 최소화하는 기술 (이중 일부는 본원에서 하기 기재됨)이 공지되어 있기는 하지만, 표지 유전자 또는 단백질 발현 프로파일의 검출이 더욱 어려울 수 있다. 예를 들어, 샘플은 또한 관심 암 세포와는 관련이 있지만 상응하는 정상 세포와는 관련이 없는 것으로 공지된 바이오마커, 또는 그와 반대되는 경우의 바이오마커의 존재에 대해 평가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플 내 단백질의 발현은 면역조직화학 ("IHC") 및 염색 프로토콜을 이용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 밝혀졌다. 면역조직화학 기술은 프로브에 대한 항체를 사용하고, 일반적으로는 발색 또는 형광 방법을 통해 계내에서 세포 항원을 시각화한다.
조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 통상의 기술자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제를 선택할 수 있음을 알 것이다. 통상의 기술자는 또한 고정시키는 시간의 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 예로서, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 대안적으로, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예로서, 조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 파라핀에 포매되어 처리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 조직 샘플을 포매시킨 후, 샘플은 마이크로톰 등에 의해 절편화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예로서, 절편의 두께는 약 3 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러 표준 방법을 통해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 포매 물질로서 사용된 경우, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러 표준 방법에 의해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점진적으로 하강하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 대안적으로, 상업적으로 입수가능한 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예컨대 Hemo-De7 (CMS, 텍사스주 휴스톤)을 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플 제조에 이어서, 조직 절편은 IHC를 이용하여 분석할 수 있다. IHC는 추가의 기술, 예컨대 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 조합하여 수행될 수 있다. 2가지 일반적 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정이 이용가능하다. 첫번째 검정에 따르면, 표적 항원에 대한 항체의 결합은 직접 결정된다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 일차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서, 미접합 일차 항체가 항원에 결합한 후에, 표지된 이차 항체가 일차 항체에 결합한다. 이차 항체가 효소적 표지에 접합된 경우에, 발색 또는 형광 기질을 첨가하여 항원의 시각화를 제공한다. 여러 이차 항체가 일차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성 동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 이용하여 측정할 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 이러한 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 형광 표지. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 이용하여 정량화될 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에, 측정 (예를 들어, 화학발광계 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 또는 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소적 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)
의 조합.
다수의 다른 효소-기질 조합이 통상의 기술자에게 이용가능하다. 이들의 포괄적 검토를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다. 때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 통상의 기술자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4가지 넓은 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수도 있고, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 표지는 이러한 간접 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 상이한 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 이에 따라, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.
상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, IHC 전에, 그 동안 또는 그 후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 시트레이트 완충제 중에서 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의적 차단 단계 후에, 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 충분한 기간 동안 및 적합한 조건 하에, 조직 절편을 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 통상적인 실험으로 결정될 수 있다. 샘플에 대한 항체의 결합 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색체의 화학적 변경을 촉매하는 효소적 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 한 실시양태에서, 효소적 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체임).
이에 따라 제조된 시편을 탑재하고 이에 커버슬립을 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 관련 기술분야에 통상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 이용할 수 있다. 염색 강도 기준은 다음과 같이 평가될 수 있다:
[표 1]
Figure pct00053
일부 실시양태에서, 약 1+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 특정 실시양태에서, IHC 검정에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 다른 실시양태에서, 약 3 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 한 실시양태에서, 종양 또는 결장 선종으로부터의 세포 및/또는 조직을 IHC를 사용하여 검사하는 경우, 염색은 일반적으로 (샘플 중에 존재할 수 있는 기질 또는 주위 조직에 반대되는 것으로서) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정 또는 평가되는 것으로 이해된다.
대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건 하에 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 다수의 방법, 예컨대 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 종래의 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.
샌드위치 검정은 가장 유용하고 일반적으로 이용되는 검정 중 하나이다. 간략하게, 전형적인 전방향 검정에서, 비표지된 항체를 고체 기질에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체 형성에 충분한 기간 동안의 적합한 인큐베이션 기간 후, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지되고 항원에 특이적인 제2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척하고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 시각적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수도 있고, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량화할 수도 있다.
정방향 검정의 변형은 결합된 항체에 샘플 및 표지된 항체 둘 다를 동시에 첨가하는 동시 검정을 포함한다. 이러한 기술은 용이하게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 전형적인 정방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 제1 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 이어서, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합을 허용하기에 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 32℃ (양끝값 포함)) 하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2-40분 또는 보다 편리하게는 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 제2 항체와 함께 인큐베이션한다. 제2 항체는 분자 마커에 대한 제2 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
대안적 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 상기 고정된 표적을 리포터 분자로 표지될 수도 있고 표지되지 않을 수도 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체를 이용한 직접 표지에 의해 결합된 표적을 검출할 수 있다. 대안적으로, 제1 항체에 특이적인 제2 표지된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜 표적-제1 항체-제2 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원 결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 나타낸다. 이러한 유형의 검정에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사성동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트에 의해 제2 항체에 접합된다. 그러나, 용이하게 인지되는 바와 같이, 통상의 기술자가 용이하게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, -갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기 언급된 발색 기질보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에서, 효소-표지된 항체를 제1 항체-분자 마커 복합체에 첨가하여 결합시킨 후에 잉여량의 시약을 세척한다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량화될 수 있다. 대안적으로, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정한 파장의 광을 사용한 조명으로 활성화될 때, 형광색소-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상의 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 시약을 세척한 후에, 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘 다 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성동위원소, 화학발광 또는 생물발광 분자가 또한 사용될 수 있다.
상기 기재된 기술은 또한 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 검출하는데에도 사용될 수 있다고 고려된다.
방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 하나 이상의 표적 유전자의 mRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내 mRNA를 평가하는 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, S100A9, S100A9, Tie-1, Tie-2, CD31, CD34, VEGFR1, VEGFR2, PDGFC, IL-1β, PlGF, HGF, IL-6, 및 LIF를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 유전자에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯팅 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대, 하나 이상의 상기 유전자에 대하여 특이적인 상보적 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플을 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 검정할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 표적 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용하는 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하는 단계, 표적 폴리뉴클레오티드를 센스 및 안티센스 프라이머로서 사용하여 상기와 같이 생성된 cDNA를 증폭시킴으로써 그안의 표적 cDNA를 증폭시키는 것, 및 증폭된 표적 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플에서 표적 mRNA 수준의 결정 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조 mRNA 서열의 수준을 동시에 조사함으로써 결정됨)을 허용하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 중의 mRNA, 예컨대 표적 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 발현이 AKT 또는 PRAS40의 돌연변이의 검출과 상관되는 유전자를 선택하여 고체 지지체 상에 정렬할 수 있다. 특정한 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다. 질환 조직의 차등 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천 개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일에 공개된 WO 01/75166 참조; (예를 들어, 어레이 제작의 논의에 대해 U.S. 5,700,637, 미국 특허 5,445,934, 및 미국 특허 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조)). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 소형 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터의 형광 표지된 표적의 제조 단계, 2) 표지된 표적의 마이크로어레이로의 혼성화 단계, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝 단계, 4) 스캐닝된 영상의 분석 단계, 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성 단계를 포함한다. 현재, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로, 25 내지 70량체) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
아피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)® 시스템은, 유리 표면 상에서 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하여 제작되는 어레이를 포함하는 상업적으로 입수가능한 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로 25량체)는 반도체-기반 포토리소그래피 및 고체 상 화학적 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 최대 400,000개의 상이한 올리고를 함유하고, 각각의 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이 상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 아피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 동일성 및 상대적인 발현 수준의 면으로 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 어레이에서 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 나타난다. 각각의 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 갖기 때문에 유전자 발현을 결정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 백그라운드 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도 값 또는 특이적 강도 값을 결정한다. 프로브는 진뱅크 및 다른 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보를 기초로 선택한다. 서열은 유전자의 3' 말단의 특유한 영역을 인식하는 것으로 생각된다. 진칩 혼성화 오븐 ("회전식" 오븐)은 한번에 최대 64개의 어레이의 혼성화를 수행하기 위해 사용된다. 플루딕스 스테이션은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 함유하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그램화 플루딕스 프로토콜을 이용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그램화 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 이용하여 최대 8개의 플루딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 수득하고 이것을 적절한 알고리즘을 이용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 소프트웨어는 비교 분석에 의해 실험들 사이의 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과를 .txt 파일 형식으로 구성하며, 이를 다른 소프트웨어 프로그램과 사용하여 추가의 데이터 분석을 수행할 수 있다.
조직 또는 세포 샘플에서 선택된 유전자 또는 바이오마커의 발현은 또한 기능적 또는 활성-기반 검정으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우에, 관련 기술분야에 공지된 검정을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소적 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제안될 것이고, 본원의 취지 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
시험관내 세포 증식 검정
실시예 2의 화합물과 특정 특이적 화학요법제의 조합물의 시험관내 효력을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 (프로메가 코포레이션(Promega Corp., 위스콘신주 메디슨)으로부터 상업적으로 입수가능함)을 이용하여 측정하였다. 이러한 균질 검정 방법은 딱정벌레목(Coleoptera) 루시페라제의 재조합 발현을 기초로 하며 (US 5583024; US 5674713; US 5700670), 대사적으로 활성인 세포의 지표인 ATP 존재의 정량화에 기초하여 배양물 중 생존 세포의 개수를 결정한다 (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). 셀타이터-글로® 검정을 96 또는 384 웰 포맷에서 수행하였으며, 이는 상기 검정을 자동화 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용가능하게 하였다 (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). 균질 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 혈청-보충 배지에서 배양된 세포에 직접적으로 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지 제거, 및 다중 피펫팅 단계는 필요하지 않다. 상기 시스템은 시약을 첨가하고 혼합한 후 10분 내에 384웰 포맷에서 겨우 15개 세포/웰에 불과한 것도 검출한다.
균질 "첨가-혼합-측정" 포맷은 세포 용해물에 존재하는 ATP의 양에 비례하여 발광 신호를 발생시킨다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포의 개수에 직접적으로 비례한다. 셀타이터-글로® 검정은 루시페라제 반응에 의해 생성되는 "성장-유형" 발광 신호를 생성하고, 사용되는 세포 유형 및 배지에 따라 일반적으로 5시간 초과의 반감기를 갖는다. 생존 세포는 상대 발광 단위 (RLU)에 반영된다. 기질인 딱정벌레 루시페린은 ATP를 AMP로 전환시킴과 동시에 광자를 생성하는 재조합 반딧불이 루시페라제에 의해 산화적으로 탈카르복실화된다. 반감기의 연장은 시약 주사기를 사용할 필요성을 없애고, 다중 플레이트의 연속식 또는 배치식 조작에 대한 융통성을 제공한다. 이러한 세포 증식 검정을 각종 다중웰 포맷, 예를 들어 96 또는 384웰 포맷으로 이용할 수 있다. 데이터는 발광측정기 또는 CCD 카메라 영상화 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력량은 시간 경과에 따라 측정된 상대 광 단위 (RLU)로 제시된다.
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Claims (26)

  1. AKT1 또는 PRAS40 돌연변이를 포함하는 암 세포에서 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 돌연변이의 존재는 암 세포가 AKT 억제제에 대한 내성을 갖거나 또는 갖게 될 것임을 나타내는 것인, 암 세포에서 AKT 억제제의 치료 효과에 대한 내성을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, AKT 억제제를 사용한 치료 후에 돌연변이의 존재를 검출하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, AKT1 돌연변이가 W80을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, W80 돌연변이가 시스테인 잔기 변화를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AKT3의 발현 수준을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, AKT3의 과다발현을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제가 알로스테릭 억제제인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알로스테릭 억제제가 MK-2206인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PI3k 또는 mTOR 억제제의 유효량을 암 세포에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, PRAS40 돌연변이가 정지 코돈을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항, 제2항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 178 정지 코돈을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항, 제2항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제가 ATP 경쟁적 억제제인 방법.
  13. 제1항, 제2항, 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 억제제가 GDC-0068 또는 GSK2110183인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, AKT3 발현 수준이 mRNA 발현 수준인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 발현 수준이 마이크로어레이 또는 qRT-PCR을 이용하여 측정되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 발현 수준의 변화가 증가인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, GDC-0941 및 GDC-0980으로부터 선택된 PI3k 억제제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 라파마이신으로부터 선택된 mTOR 억제제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 중피종, 자궁내막암, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 흑색종, 위암, 결장암, 신장암, 두경부암, 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 PTEN 돌연변이와 연관되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 PTEN이 적거나 또는 존재하지 않는 상태와 연관되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 AKT 돌연변이, 과다발현 또는 증폭과 연관되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 PI3K 돌연변이와 연관되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 Her2/ErbB2 증폭과 연관되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 순환 종양 세포 (CTC)인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 pCR에 의해 돌연변이를 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
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