CN104995295A - 多分化潜能细胞的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种产生表现多分化潜能细胞的方法以及其衍生的细胞。特别是，本发明为一种活体外从CD14⁺单核细胞产生哺乳动物干细胞的方法以及其所衍生的细胞。该发现目前已促使发明确实及有效地产生多分化潜能细胞的方法，例如用于各种临床上研究用途的干细胞，其中包含活体外或活体内的多分化潜能细胞的分化，某些病症经由给予本发明的多分化潜能细胞或源自该些细胞更充分分化的细胞群体的治疗性或预防性治疗。亦促使以活体外为基础的筛选***的设计，该***可用于测试细胞暴露于具潜力的疗程或培养策略时，该疗程或培养策略的治疗性影响及/或其毒性。

Description

多分化潜能细胞的制造方法

技术领域

本发明广义地关于一种产生表现多分化潜能(multilineage potential)细胞的方法以及其所衍生的细胞，特别是，本发明为一种活体外(in vitro)从CD14⁺单核细胞产生哺乳动物干细胞的方法以及其所衍生的细胞。该发现目前已促使发明确实及有效地产生多分化潜能细胞的方法，例如应用于各种临床上研究用途的干细胞，其中包含活体外或活体内(in vivo)的多分化潜能细胞的分化，某些病症经由给予本发明的多分化潜能细胞或源自该些细胞更充分分化的细胞群体的治疗性或预防性治疗。亦促使以活体外为基础的筛选***的设计，该***可用于测试细胞暴露于具潜力的疗程或培养策略时，该疗程或培养策略的治疗性影响及/或其毒性。

背景技术

在本说明书作者提及的公开详细书目细节在本文文末会依字母排列陈述。

本说明参考的任何先前公开文献(或衍生的资讯)，或任何已知的事项，非为及不应视为承认或认可或任何形式的建议，其为该先前公开文献(或衍生的资讯)或已知的事项构成在此领域中与本说明书有关的一般通常知识。

本发明的相关目的在于鉴定、分离或产生哺乳动物干细胞及前驱细胞。“干细胞”及“前驱细胞”通常应理解包含以各种含有能产生任何细胞型态(包含生殖细胞)的全能分化性细胞(totipotent cell)以及能产生更受限制的各种成熟细胞体系的多功能(pluripotent)前驱细胞两种。一些前驱细胞型态分化更完全且相当于能产生特定细胞体系细胞的前驱细胞。这些能力是所有细胞分化及特化的基础，而细胞分化与特化(specialization)的能力更是器官及组织完整发育所必要的能力。

再现性(reproducing)一词，在体外发展路径的选择方面，更着重于干细胞的分离及培养。例如胚胎干细胞可经由培养源自囊胚内细胞团(blastocyst innercell mass)的细胞及重复分离及继代培养而建立。在适当的条件下，活体外培养可维持该干细胞的正常核型及全能分化性此两特性，此对于促进特定细胞体系的干细胞的分化已有重要的进展。虽然胚胎干细胞(ES)已能从人类身上分离取得，但它们在研究及治疗的用途因伦理上的考量而受到阻碍。

成体组织亦含有能自我复制的干细胞群体，其子细胞能更进一步进行不可逆的最终分化成为体细胞(Science,287,1442-1446,2000)。最具特征性的为造血干细胞及其子代，但在大部分组织中都能辨识到干细胞，包含间质、神经元及造血细胞(Science,284,143-147,1999；Science,287,1433-1438,2000；J.Hepatol.,29,676-682,1998)。间质干细胞为骨髓中具分化为间质组织潜力的贴附型的类纤维母细胞的细胞，包含硬骨、软骨、脂肪、肌肉及骨髓基质(Science，284，143-147，1999)。间质前驱细胞(mesenchymal progenitors)在形态上及表型特征及分化潜力上与间质干细胞相似，且该间质前驱细胞被报导极少出现在脐带血(Br.J.Haematol.，109,235-242,2000)、胎儿(Blood,98,2396-2402,2001)及成人周边血液(Arthritis Res.,2,477-488,2000)中。

据此，分化总是被假设为经由很多基因的调节，干细胞采取线性发展的形式最后达到最终分化的体细胞的表型，其功能清楚地被定义且其寿命是有限的。此种细胞的例子包含红血球、破骨细胞、胰岛细胞及血小板。该干细胞被认为以***、自我更新及产生子细胞来确保特定的细胞体系(不对称的***)，其亦被认为在适当的环境条件下，干细胞能对称地***以产生双倍的干细胞群。

然而，实际上有效且确实的分离方法、细胞维持方法，还有特别是干细胞的增殖方法仍然是难以捉摸的。因此，需要持续开发新的有效地且有再现性的分离、维持及分化干细胞的方法。

本发明已确认干细胞增殖不一定需要经由非对称干细胞***的发生，即可提供其相关子细胞自特定细胞体系分化至最终成体细胞时的干细胞更新及体系分化等特性。相反地，增殖可经由成熟细胞转变回具有多分化性潜能(multilineage potential)的细胞的特性而达成。该发现目前已促使确实及有效地产生表现多分化潜能细胞的方法的发展，而经此宝贵机制转化而得的干细胞群体及/或体细胞分化而来的细胞将可用于临床及实验的用途上。

发明内容

本说明书全文及其后的权利要求，除非内容另有需要，该用词“包含(comprise)”，以及例如是“包含(comprises)”及“包含(comprising)”的其他变化形，将理解意指包含所述整体或步骤或群体的整体或步骤，但不排除任何其他整体或步骤或群体的整体或步骤。

本文所使用的，“源自(derived from)”用语应代表以经由特定物种指定特定整体或整体中的群体，但不一定直接从特定来源获得。再者，如本文中使用的单数形式的“一”、“及”以及“该”包含多个指定对象，除非内容另有明确说明。

除非有其他定义，本文使用的所有技术或科学用语与本发明所属技术领域中的通常知识通常可理解具有相同意义。

本发明一方面为一种产生哺乳动物多分化潜能细胞(multilineage potentialcells)的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

又另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的源自周边血液的CD14⁺单核球悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

此本发明尚有另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，该多分化潜能细胞表现造血(haematopoietic)及/或间质(mesenchymal)的潜能。

还有另一方面提供一种产生人类多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的人类周边血液CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

仍有另一方面提供一种促使源自哺乳动物多分化潜能细胞(mammalianMLPC-derived cell)产生的方法，包含：

(i)活体外建立细胞培养的比例包含：

(a)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(b)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(c)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，且选择性地

(ii)将步骤(i)该表现多分化潜能细胞(MLPC)接触一刺激物以导向该多分化潜能细胞分化为源自多分化潜能细胞(MLPC-derived cell)的表现型。

更有一方面提供一种促使源自哺乳动物多分化潜能细胞(MammalianMLPC-derived cell)产生的方法，包含：

(i)活体外建立细胞培养的比例包含：

(a)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(b)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(c)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，且选择性地

(ii)将步骤(i)该表现多分化潜能细胞(MLPC)接触一刺激物以导向该多分化潜能细胞分化为造血或间质的表型。

本发明另有进一步方面为一种治疗性及/或预防性治疗一哺乳动物病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物一有效数量的多分化潜能细胞(MLPC)或者部分或充分分化的源自多分化潜能细胞的细胞(MLPC-derived cell)，而这些细胞是依据本发明的方法产生的。

本发明进一步为一种治疗性及/或预防性治疗哺乳动物中造血或间质功能异常为特征的病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物：

(i)一有效数量的依据本发明的方法产生的造血干细胞或部分或充分分化的源自造血干细胞的细胞；或

(ii)一有效数量的依据本发明的方法产生的间质干细胞或部分或充分分化的源自间质干细胞的细胞。

本发明的另一方面为MLPCs或源自MLPC的细胞的群体，该细胞依据本发明的方法产生，用于制备治疗哺乳动物某病症的药物。

本发明尚有另一方面为依据本发明的方法产生的MLPCs或源自MLPC的细胞。

本发明再有另一方面提供一评估MLPC或源自MLPC的细胞在表型或功能状态上的治疗或培养策略的效果的方法，该方法包含于该治疗策略中给予依据上述定义的方法产生的MLPC或源自MLPC的细胞，并筛选出具有改变的功能或表型的状态。

附图说明

图1为依据本发明的方法将细胞培养于37℃、CO₂培养箱1天的细胞样本的流式细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第1天收集贴附的细胞。M2区域是表面标记群体(surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照(isotype-matched control antibody-FITC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示萤光信号强度。

图2为依据本发明的方法将细胞培养于37℃、CO₂培养箱3天的细胞样本的流式细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第3天收集贴附的细胞。M2区域是表面标记群体(surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照(isotype-matched control antibody-FITC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示萤光信号强度。

图3为依据本发明的方法将细胞培养于37℃、CO₂培养箱6天的细胞样本的流式细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第6天收集贴附的细胞。M2区域是表面标记群体(surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照(isotype-matched control antibody-FITC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示萤光信号强度。

图4为依据本发明的方法将细胞培养于37℃、CO₂培养箱7天的细胞样本的流式细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第7天收集贴附的细胞。M2区域是表面标记群体(surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照(isotype-matched control antibody-FITC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示萤光信号强度。

图5为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养1天后的细胞照片。细胞开始贴附及显示出椭圆形的型态。

图6为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养2天后的细胞照片。细胞开始显示出类似纺锤状及类似纤维母细胞的型态。

图7为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养3天后的细胞照片。细胞显示出椭圆形及类似纺锤状的型态。

图8为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养4天后的细胞照片。

图9为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养4天后的细胞照片。

图10为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养5天后的细胞照片。

图11为利用显微镜观察依据本发明的方法于37℃、CO₂培养箱培养6天后的细胞照片。

图12为CD14⁺PBMC流式细胞仪分析。

图13为CD14⁺PBMC流式细胞仪分析的表格结果。

具体实施方式

本发明推测为达到延自于特定体细胞体系干细胞自我更新(renewal)及分化两者的目的，部分成体干细胞扩增是不一定基于不对称干细胞***的发生。特别是，多能干细胞(multipotent stem cells)可源自于诱导较成熟的CD14⁺单核细胞转变为多分化潜能(multilineage potential)的阶段，经由适当的刺激下进行对称的***及分化。对本发明技术领域而言这个发现是特别困难且有显着的重要性，因为在活体外(in vitro)有效地诱导干细胞自我更新或扩增的方法尚未实现。因此，本发现提供一种产生哺乳动物干细胞的方法，此法是基于活体外诱导成熟哺乳动物细胞去分化(de-differentiation)成为表现有多分化潜能的干细胞表型。据此，该发现在活体外及活体内(in vivo)的应用潜能极为广泛，包含但不限于活体外产生干细胞群体、在活体外或活体内对干细胞进行有目的的分化及上述细胞于治疗性或预防性治疗策略上的应用，以及活体外评估本发明的细胞暴露于具潜力的疗程或培养策略时，该疗程或培养策略的效果及/或毒性。

有鉴于此，本发明的一方面为提供一产生哺乳动物多分化潜能细胞(multilineage potential cells)的方法，该在方法包含活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

当提及CD14⁺单核细胞时应理解其所指为表现细胞表面分子CD14的单核细胞。本发明未限制于任何一种理论或作用方式，CD14作为共受体(co-receptor)用于细菌脂多醣的检测中(与Toll-like受体TLR4及MD-2一起)，CD14仅在脂多醣结合蛋白存在时与脂多醣结合。虽然脂多醣被认为是主要的配体，但CD14亦辨认其他病原体相关的分子型态。CD14主要经由巨噬细胞及单核球及少部分的嗜中性粒细胞表现，其亦由树突细胞表达。CD14的可溶性形式(sCD14)可由肝脏和单核球分泌，且只需低浓度的sCD14就足够使原本不表现CD14的细胞进行脂多醣反应(LPS-responsiveness)。为此，当提及“CD14”时应理解其所指为所有CD14的形式及功能性突变及该分子的多型态，包含可由其他CD14mRNA剪接造成的异构体。当提及“CD14”时应理解其所指为包含在细胞表面表现的所有前驱物、原蛋白或中间物形式的该分子所有形式。当提及“CD14”时亦应理解其所指为扩展到任何CD14细胞表面分子，无论是作为二聚体、多聚体或融合蛋白。

在一实例中，该CD14单核细胞为一单核球(monocyte)。

根据该实例，其提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

本发明未限制于任何一种理论或作用方式，单核球为一种形式的白血球细胞以及为脊椎动物先天免疫***的一部分，该脊椎动物包含哺乳动物、鸟类、爬行动物及鱼类。单核球细胞在免疫功能中扮演多重角色，在正常情况下，该角色扮演补充驻留型巨噬细胞(resident macrophages)及树突细胞。对发炎信号的反应，单核球可快速移动至组织中感染处并分化为巨噬细胞及树突细胞以诱发免疫反应。单核球由骨髓从已知为原单核球(monoblast)的造血干细胞前驱细胞产生，其在血液中循环一至三天，然后通常会进入整个身体的组织。在血液中单核球占白血球的百分之三至八，约有一半的单核球以集群的型态储存在脾脏的红髓索的红髓中(red pulp’s Cords of Billroth)。在组织中，在不同的组织构造位置(anatomical site)单核球会成熟为不同型态的巨噬细胞。在人类的血液中单核球至少有三种型态：

(a)典型的单核球以CD14细胞表面受体(CD14⁺⁺CD16^-单核球)的高表现量为特征。

(b)非典型的单核球其CD14的表现量低并与CD16受体有其他共表现(CD14⁺CD16⁺⁺单核球)。

(c)中间体单核球其CD14的表现量高以及CD16的表现量低(CD14⁺⁺CD16⁺单核球)。

单核球发育显然存在着从典型单核球发育为中间体单核球后，再变成非典型CD14⁺CD16⁺⁺单核球的发展关系。因此，非典型的单核球可代表一个较成熟的形式。因此当提及“单核球”时应理解其所指为任何CD14⁺单核球细胞型态，无论其分化的发展阶段或CD14的表现量。该单核球可源自于任何适合的组织，包含周边血液及脾脏。

在一实例中，该单核球源自周边血液。

依据该实例，其提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞(mammalianmultilineage potential cells)的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的源自周边血液的CD14⁺单核球悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球转变为一表现多分化性潜能(multilineage differentiation potential)的细胞。

详如上述，已确定成熟体细胞，特别是单核球可诱导成为多分化潜能的状态。因此，当提及表现“多分化性潜能(multilineage differentiation potential)”或“多分化潜能(multilineage potential)”的细胞时应理解其所指为该细胞表现超过一个成体细胞分化路径的潜能。例如，该细胞有产生一系列不同类型体细胞的能力，例如该细胞通常为万能(pluripotent)或多功能(multipotent)。该细胞比全能细胞(totipotent cell)在更有限的细胞体系范围内表现特定功能，而全能细胞是本身能在任何分化方向发育为包含体细胞体系及配子的细胞。本发明未限制于任何一种理论或作用方式，扩产至源自产后组织(post-natal tissue)的干细胞，其亦常称之为“成体干细胞”。很多通常被称作“祖(progenitor)”细胞或“前驱(precursor)”细胞的细胞亦会落入“多分化性潜能(multilineagedifferentiation potential)”的定义中，基于在适当的刺激条件下，其可增加超过一个以上体细胞体系的细胞。本文使用的“干细胞”为就本发明的方法产生的细胞而言，其应理解为能以表现如本文所定义的多分化性潜能的细胞。

本发明一实例中，已确定CD14⁺单核球可被诱导转变为多分化性潜能的表型，该表型表现分化成造血细胞体系(haematopoietic lineage)或***体系(mesenchymal lineage)的潜能。例如，在适当的刺激下，多潜能细胞可导向向下分化为造血细胞体系或***体系，造血细胞体系包含单核造血细胞(例如淋巴细胞或单核球)、多形核(polymorphonuclear)造血细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞)、红血球细胞或血小板；延自于***体系例如是硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮以及脂肪。

本发明的一较佳实例，其提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外(in vitro)建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，该多分化潜能细胞表现造血及/或间质潜能。

在另一实例中，多分化潜能细胞为CD14⁺、CD34⁺、CD105⁺、CD44⁺、CD45⁺以及CD24⁺。

在又一实例中，多分化潜能细胞为CD14⁺、CD34⁺、CD105⁺、CD44⁺、CD45⁺、CD38⁺、CD31⁺以及CD59⁺。

较佳的是，造血潜能为分化为淋巴球、单核球、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红血球或血小板的潜能；以及该间质潜能系为分化为硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮或脂肪的潜能。

本文使用“哺乳动物(mammal)”及“哺乳类(mammalian)”用语包含人类、灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、驴)，实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、陪伴动物(例如狗、猫)以及捕获的野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。较佳地，该哺乳动物为人类或实验室测试动物。甚至更佳地，该哺乳动物为人类。

当提及诱导如单核球的CD14⁺单核细胞的“转化(transition)”为多分化潜能的表型时，应理解其所指为诱导体细胞表型在遗传上、型态上及/或功能上的改变，使其变成本文所定义的多分化潜能表型的细胞。

就活体外诱导CD14⁺单核细胞使其去分化(de-differentiation)为多分化潜能细胞而言，其可在活体外小规模的组织培养或大规模的生物反应器生产的任一个条件下完成。

详如上述，已确定CD14⁺单核细胞转变为多分化潜能细胞可经由活体外将该细胞以特殊的细胞培养条件培养。特别是，单核细胞的起始样本培养在特定比例下的白蛋白(albumin)及细胞培养基中，此为本发明方法的优点。有别于大多数的细胞培养***，本发明非以需要测定细胞数量及适当调整细胞浓度成特定浓度进行培养为基础，而是以成份体积的比例为基础来设计培养的条件，因此无论在该体积中实际的细胞数为何皆可进行培养。这使得本发明的方法很简单且可例行性地进行，因为此方法只要CD14⁺单核细胞的起始体积易于取得或方便操作即可进行。

因此，本发明的活体外细胞培养***是以CD14⁺单核细胞悬浮液的起始体积为基础建立的。当提及“悬浮液(suspension)”应理解其所指为一非贴附性细胞的样本。该些细胞可在任何适合的介质中，例如是等张溶液(如PBS、食盐水、Hank’s平衡盐溶液或其他不同成分的平衡盐溶液)、细胞培养基、体液(如血清)或可维持细胞在存活状态下的类似物。如本文实验例，以标准密度梯度离心方式分离周边血液的单核细胞样本，并将所获得的细胞群体依本发明的方法培养。然而，该细胞可能经过其他方法浓缩或处理，例如正或负磁珠分离，最后CD14⁺单核细胞会悬浮在一等张溶液中，而该等张溶液会依据所使用的分离方法而有所不同。无论所获得的细胞的实际浓度为何，任何适当体积的细胞悬浮液皆可使用来建立本发明的培养。其体积是基于所欲使用的培养***的形式选择的。例如，如果是培养在以烧瓶为基础的***、以袋状容器为基础的***或滚瓶为基础的***，其很可能以不超过一公升的较小体积就足以形成细胞培养所需的体积。然而，在生物反应器的条件下，可容纳相当大的细胞培养体积，因而可使用较大的起始体积。在本技术领域的技术人员可确定在特定细胞培养***的条件下使用适当的最终细胞培养体积。

就初步建立本发明的细胞培养而言，细胞培养的最后体积将经过含有15％v/v的CD14⁺单核细胞悬浮液与15％v/v的5％至85％白蛋白溶液及约70％v/v的细胞培养基一起培养。如本文详述，该百分比值接近上述特定的百分比，在某延伸范围内的一些误差是可以接受的且提供功能上同等的比例。基于非常简单以及例行性的实例培养***，在本技术领域的技术人员可确定上述百分比值的一些误差可至何种范围。例如，可预期从约10％至20％v/v单核细胞悬浮液及5％至85％白蛋白溶液是有效的，特别是11％至19％、12％至18％、13％至17％或14％至16％。相对于白蛋白溶液，从约4％至90％或5％至86％或较佳是5％至7％的溶液可以具有相同效果。

本发明未限制任何方式，已确认本发明的方法在一广泛范围中的白蛋白浓度是有效的。因此，可使用浓度范围为5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％。在一实例中，该浓度为5％至20％。

据此，本发明的一实例为一种产生哺乳动物的多分化潜能细胞(multilineage potential cell)的方法，该方法包含在活体外建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至20％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核球细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，

在另一实例中，该白蛋白浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

本发明不应限制于要严格遵循如本文所示作为参考的15％v/v细胞、15％至20％v/v白蛋白或70％细胞培养基的举例，但其百分比的变化应落于能保留本发明的功能的范围内，且其百分比变化引发的功能可例行性地且容易地为本技术领域中的技术人员所评估。

详如上述，在起始悬浮液中CD14⁺单核细胞的浓度可为任何细胞数目。无论该细胞数目是较低的或较高的，本发明的重要观点为只要起始细胞悬浮液体积为起始细胞培养的全部体积的15％v/v，与在该悬浮液中的细胞浓度无关。然而，在一较佳实例中，虽然起始细胞浓度没有上限或下限，但建议细胞数不应过高以至于在培养期间该培养容器没有足够的表面积让单核细胞附着。尽管该方法将产生表现多分化性潜能的细胞(multilineage differentiationpotential cell)，但在某种程度上起始细胞浓度过高以至于该些细胞没有足够的表面积附着，可以观察到该些细胞无法附着不能去分化(de-differentiate)为干细胞，因而该方法是有效的但不具最佳效果。因此，就产生最大效率的观点而言，会期望确保在形成起始细胞培养的细胞悬浮液的细胞浓度下，当中所有的细胞能贴附于为此培养所挑选的特定组织培养容器上。例如，使用袋状培养容器，适当的细胞浓度为不超过每毫升10⁶个细胞。

就所使用的白蛋白溶液而言，6％白蛋白溶液为通常市面上可获得的，但也可以其他任何适合的等张溶液进行白蛋白溶液的配制，如生理食盐水。当提及“白蛋白(Albumin)”时应理解其所指为可溶于蒸馏水和半饱和硫酸铵溶液，但不溶于饱和硫酸铵溶液的白蛋白的球蛋白群体，例如血清白蛋白，其为血清的主要蛋白质可使用作为本发明的方法的内容。然而，应理解可使用任何白蛋白分子，例如乳清蛋白或卵白蛋白。亦应理解任何合成的重组或衍生形式的白蛋白也可使用在本发明的方法中。本发明技术领域中技术人员可理解经由使用6％白蛋白溶液，例如，本发明的起始培养体积的15％v/v的比例下，可得到0.9％白蛋白的有效浓度。

起始培养体积的其余部分由细胞培养基所组成，此体积占起始培养体积的70％v/v。当提及“细胞培养基(cell culture medium)”时应理解其所指为设计用以维持哺乳动物细胞生长的液体或凝胶，特别是支持干细胞培养的培养基。为此目的，可使用任何适合的细胞培养基包含提供最少细胞生长营养素的基本培养基，或包含其他营养素以促进维持哺乳动物细胞存活及生长的丰富培养基。合适的培养基举例包含DMEM培养基及RPMI培养基。亦可使用额外添加特定胺基酸或糖等添加物的基本培养基，以利于维持细胞存活及生长。该培养基也可进一步添加任何适合的试剂，例如抗生素。在另一范例中细胞培养基添加胰岛素以进一步维持细胞存活和生长。当提及70％v/v细胞培养基时，应理解其所指为不受溶剂性质影响的独立需求，且CD14⁺单核细胞或白蛋白可悬浮其中，故无论其为如生理食盐水的等张溶液或基本培养基皆可。事实上，本发明的优势在于不顾进行细胞培养前单核细胞悬浮液的溶液性质为何或其溶液是否溶有白蛋白，只要以70％v/v细胞培养基作为起始细胞培养群体的总体积的百分比的要求维持不变即可。

在一实施例中，该细胞培养额外包含10mg/L胰岛素。

详如上文，本发明的方法预期把一CD14⁺单核细胞族群培养于含特定比例的细胞培养基和5％-85％白蛋白的溶液中，将可诱发该单核细胞去分化(de-differentiation)为间质/造血干细胞表型。在活体外培养该CD14⁺单核细胞一段时间，直到细胞形成干细胞表型。在一实例中，培养3至8天的一段时间，特别是4至7天，已确认适合产生干细胞。由本发明技术领域中的技术人员采集活体外培养的细胞样本，并确认细胞是否已表现必要程度的去分化(de-differentiation)现象。在本发明技术领域中技术人员可确认在何种温度及CO₂百分比条件下，最适合进行本发明的细胞培养。本发明未限制任何理论或作用方式，当培养人类CD14⁺单核细胞时，已知4至5天的培养是最适合的。在另一较佳实例，已确认本发明的方法将人类CD14⁺单核细胞培养至一定程度是特别有效的，细胞培养悬浮液最初培养在5％CO₂、37℃的条件下60至120分钟以促进单核细胞贴附于细胞培养容器。之后，在容易维持的好的细胞活性及生长的适当条件下培养数天的时间。因此，可理解建立适当的细胞培养条件是本技术领域中技术人员例行程序。

据此，在一实施例中提供产生人类多分化潜能细胞(human multilineagepotential cell)的方法，该方法包含在活体外建立细胞培养的比例包含：

(i)15％v/v，或其功能上等同比例的人类周边血液CD14⁺单核球细胞悬浮液；

(ii)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

在一实施例中，白蛋白溶液为5％至20％，较佳为5％至15％。

在一实施例中，该细胞培养额外包含10mg/L人类胰岛素或功能片段或其等同物。

在另一实施例中，该细胞培养4至7天，特别是4至5天。

详如上述，本发明是以活体外进行一群经分离所得的CD14⁺单核细胞培养的培养方法。因此，已理解该细胞可由个体(例如将接受治疗的个体本人)立即分离的细胞或来自于非立即分离的来源，例如来自培养物(例如，其中增殖的细胞数目及/或培养的细胞以至于使给予其接受分化的信号)或从个人或其他来源任一个较早时间点分离出的冷冻储存细胞(例如，建立单核球细胞株)。应理解该细胞可进行一些其他处理或操作形式，例如但不限于浓缩(enrichment)或纯化、细胞周期状态的修饰或细胞株的形成。因此，该细胞可为初级细胞(primary cell)可为由个人分离的细胞，次级细胞(secondary cell)为完成初级细胞分离后并在应用于本发明的培养方法前，于活体外进行某种操作所得的细胞，该操作如细胞株的制备。应理解的是起始CD14⁺单核细胞群体可为较纯的或异质细胞群体的一部分，例如周边血液细胞的群体，之后会更进一步讨论。

在一相关的方面中，应理解本发明的方法已可适用于诱导多分化潜能细胞(MLPCs)的分化，其可经由本发明的方法产生为更成熟的表型。例如，在本发明的一较佳实例的内容中，造血干细胞产生所有的血液细胞(如红血球、血小板、淋巴球、单核球及颗粒性球)，而间质干细胞产生各种的***，其包含硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮或脂肪，以至于本发明的方法产生具有间质及造血潜能的MLPCs。本发明的方法适合于活体外或活体内，更进一步给予MLPC群体特定的刺激以造成其部分或充分分化为目标细胞。

应理解的是，虽然额外导向分化的步骤方便在活体外进行，其亦能在活体内进行，之后会更详细进行讨论。然而，在特定的原位(in situ)环境中亦可方便提供能将MLPC导向分化为特定细胞体系需要的信号。

当提及“源自多分化潜能细胞的细胞(MLPC-derived cell)”时，应理解其所指为比MLPC分化程度更完全，且是由MLPC所分化产生的细胞。该些细胞将对应于已知MLPC会产生的细胞体系的细胞，例如在造血干细胞中的血液细胞以及在间质干细胞的***。该源自的细胞应理解其可为分化程度更完全的前驱细胞，其不可逆地分化为特定细胞体系的亚群，例如造血干细胞或间质干细胞，或其可对应于特定的细胞体系部分或最终分化形式，例如是红血球、淋巴球或其类似物。因而理解到本发明的观点的范围内所界定的细胞可为任何发育的后-MLPC(post-MLPC)分化阶段。详如上述，该进一步分化可本质地发生或需要一个或多个进一步的信号。该信号可为无论是活体外，例如是在活体外小规模组织培养或大规模的生物反应器生产的条件，或在活体内微环境，例如是一前驱细胞移植至合适组织微环境使其能更进一步的分化。

据此，在本发明的相关的观点中，提供一种促使产生哺乳动物的源自MLPC细胞的细胞的方法，该方法包含：

(i)活体外建立细胞培养的比例包含：

(a)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(b)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(c)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，或选择

(ii)将步骤(i)该表现多分化潜能细胞(MLPC)接触一刺激物以导向该多分化潜能细胞分化为源自多分化潜能细胞的表型。

在一实施例中，该CD14⁺单核细胞为一单核球，较佳为一源自周边血液的单核球。

在另一实施例中，该白蛋白为5％至20％。

在又一实施例中，该MLPC表现造血及间质两种潜能。

根据该实施例，因此较佳地提供一种促进产生哺乳动物的源自多分化潜能细胞的细胞(mammalian MLPC-derived cell)的方法，该方法包含：

(i)活体外建立细胞培养的比例包含：

(a)15％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(b)15％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(c)70％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞，或选择

(ii)将步骤(i)该表现多分化潜能细胞(MLPC)接触一刺激物以导向该多分化潜能细胞分化为造血或间质的表型。

更较佳地，该源自造血干细胞的细胞为红血球细胞、血小板、淋巴球、单核球、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

在另一较佳地实例，该源自间质干细胞的细胞为一***细胞，例如硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮或脂肪。

在本发明的观点中，应可理解此方法可能产生如组织(例如，肌肉或真皮组织)，或细胞悬浮液(例如，造血细胞悬浮液)。

详如上述，本发明预期干细胞确实可由CD14⁺单核细胞产生。因此，应可理解在此干细胞的产生可由起始细胞群中的所有CD14⁺细胞转化而成，或由起始细胞群的成体细胞中的某亚群体(subpopulation)转化而成。这很可能取决于，例如，起始细胞群体的纯度及/或异质性(heterogeneity)。再者，本发明的培养***可导致细胞的异质性群体产生。其可能发生例如，如果非所有起始群体细胞转变为MLPC表型或非所有MLPC细胞之后诱导分化为更成熟及同质性(homogeneous)的表型。既然如此，由于非所有起始群体细胞一定可分化为MLPC表型或源自MLPC表型，及获得的源自MLPC产物本身可为异质性的，本发明的方法可利用筛选或选择步骤以确认及分离出能表现所需表型的细胞。辨别方法为本发明技术领域的技术人员所熟知的方法，其中包含，但不限于：

(i)细胞体系特性结构的检测

进行细胞体系特性结构的检测，例如，可经由光学显微镜、萤光亲和性标记(fluorescence affinity labelling)、萤光显微镜或电子显微镜检测，取决于所要识别结构的类型。光学显微镜可用于检测例如是淋巴球细胞相对于(vs)多型核的相对于(vs)红血球核的特性或多核的骨肌肉细胞的形态特征。在另一范例中，直径约有10-30μm的单核细胞，可辨别出具有圆形或杆状型态特征为未成熟的心肌细胞。电子显微镜可用于结构检测，例如是肌原纤维节(sarcomere)、X-带(X-bands)、Z-线(Z-bodied)、心肌间盘(intercalated discs)、间隙结合(gap junction)或包桥体(desmosomes)。萤光亲和性标记及萤光显微镜可用于藉由萤光标记分子检测细胞体系特定结构，通常为能特定结合至所欲观察的特定结构的抗体，且该抗体直接或间接地与萤光团结合。使用适当的检测及计算***进行该结构的自动定量。

(ii)细胞体系特定蛋白质的检测

细胞体系特定蛋白质的检测，例如是细胞表面蛋白或胞内蛋白质的检测，可经由萤光亲合标记及萤光显微镜方便地完成。特定的蛋白质可在完整的细胞和组织中侦测到。简单来说，萤光标记抗体和经固定处理后的细胞一同培养，使其辨识特定的心脏细胞的标记(specific cardiac markers)。或者，可采用例如是西方免疫墨点法(Western immunoblotting)或蛋白质的杂交微阵列(“蛋白质晶片”)。经由该方法可检测的蛋白质可为特定细胞族群的特征的任何蛋白质。例如，前驱/祖细胞的细胞类型可经由一个或多个细胞表面分子的表现与否来做区分。在这方面，可藉透过对任何一个或多个细胞表面分子进行阳性或阴性筛选，以此方法分辨不同细胞类型。更成熟的细胞通常可以文献中完整定义的一系列特定的细胞表面或细胞内蛋白质的表现为其辨识特征。例如，根据细胞表面分子表现的型态定义所有分化阶段的造血细胞的类型。相同地，肌肉细胞及其他源自***的细胞类型亦有其不同分化阶段的蛋白质表现形态的详细文献。为此，本发明的MLPCs通常表现CD14、CD34、CD105、CD44、CD45、CD38、CD31及CD59，其为一般的单核干细胞、间质干细胞及造血干细胞的细胞表面标记。

(iii)细胞体系特定的RNA或DNA

该方法较佳利用RT-PCR或即时(qRT-PCR)完成。或者，其他可使用包含核糖核酸的杂交微阵列(“RNA晶片”)或北方点墨法或南方点墨法。使用RT-PCR以检测基本上任何蛋白质的特定RNAs编码，例如在上述(ii)的蛋白质、或分泌的蛋白质或其他不方便经由上述(ii)检测的蛋白质。例如，早期B细胞分化的情况下，可在细胞表面表现重组后的免疫球蛋白分子前先检测到免疫球蛋白在DNA层次上的基因重组现象。

(iv)细胞体系特定功能活性的检测

虽然以分析细胞的功能性来检测一细胞群体的方法通常被认为较上述(i)至(iii)的筛选方法还不便，但在一些情况下可能并非如此。例如，在寻找产生心肌细胞的情况下，只是简单地在光学显微镜下筛选心脏特定机械性的收缩。

应理解的是可利用上述一个或多个技术来检测以本发明的方法所产生的细胞群体的特性。

无论是在以本发明的方法培养前浓缩一群成熟体细胞以得到CD14⁺单核细胞，或是以浓缩或分离的方法取得经本发明的方法培养后的MLPC细胞，同样的有许多已知的技术可用于检测这些细胞的特性。详如上述，抗体及其他细胞表面结合分子，例如凝集素(lectins)，特别是与鉴定特定的细胞体系及/或分化阶段有关的标记，该抗体可附着于固体支持物以进行分离。然而，其他细胞分离技术包含以不同物理特性(密度梯度离心和对流离心洗脱法)(counter-flow centrifugal elutriation)及活体染色特性(粒线体结合染剂rhodamine123及DNA结合染剂Hoechst33342)为基础的技术。

分离的步骤可包含磁珠分离、使用抗体或凝集素包覆的磁珠(lectin-coatedmagnetic beads)、亲和层析法、以附着于固体基质的抗体进行“挑选(panning)”或任何其他方便的技术。能提供极为精确的其他分离技术包含以萤光活化的细胞分选(fluorescence activated cell sorting)，而此技术也可以正向和侧向的散色光辨别细胞的形态特征，进而以此为基础来分离细胞。这些技术可应用于无论是阳性或阴性的选择，其他阴性的选择技术包含，但不限于定点(site-directed)给予细胞溶解的、细胞雕亡的或其他有毒的试剂。透过将特定试剂和单株抗体结合的方式将更便于促使将特定试剂传送至特定位置。在其他的范例中，先以抗体进行调理作用(opsonisation)后再给予相关试剂也可达到相同结果。

该些技术可以无论是单一步骤或多个步骤进行以达到所需的纯化或浓缩的程度。

因为本发明的细胞及组织的增殖能力为必要的用途，例如修复受损的组织、测试治疗性或治疗策略的效果，其可望筛选出表现相当程度增殖能力的细胞。细胞的增殖能力可经由多种标准技术进行确认。较佳地方式为经由³[H]-胸腺嘧啶(thymidine)或¹²³I-碘脱氧尿苷(123I-iododeoxyuridine)摄取分析以确定增殖。或者，使用例如XTT的代谢染料进行比色测定(colorimetric assay)，或使用直接细胞计数确定细胞增殖能力。增殖能力亦可经由例如Ki-67的细胞周期标记的表现来评估。

详如上述，本发明方法是于活体外进行。在活体外技术的方面，无论是小规模或大规模皆提供有例行性地且确实地生产MLPC细胞或源自MLPC细胞的细胞的方法。在小规模的生产方面，例如在组织培养瓶或袋完成培养，特别适合在特定条件下生产特定细胞群体给特定个体使用。在大规模的生产方面，本发明的方法提供符合大规模需求的一个可行的方法。依据本发明的方法完成大规模生产的一个方法是经由使用生物反应器。

生物反应器是被设计成可控制培养基及氧气的提供的浓度和速率，藉此可模仿活体内养分提供的浓度和速率。生物反应器已在商业上贩售多年并采用各种培养技术。用于哺乳动物细胞培养的不同生物反应器中，大部分设计为允许单一细胞型态的高密度培养的生产，并可应用于本发明。该些高密度***的典型应用为产生最终产物，即由该细胞产生的条件培养基。在此情况下，例如，以融合瘤(hybridoma)生产的单株抗体及用于病毒载体生产的包装细胞株(packaging cell lines)。然而这些应用方法所得的产物不同于本发明方法所得的产物，本发明方法所得的具疗效性的产物即为收集的细胞本身。

一旦进行操作，生物反应器提供自动调整培养基流量、氧输送、温度及pH控制的功能，且通常可生产大量的细胞。因此生物反应器提供较经济的劳动力，并将中间操作造成污染的可能性降至最小。最先进的生物反应器使建立、生长、选择及收成过程允许最少的人工劳动需求和最少的开放性处理步骤。该生物反应器最佳地设计为利于本发明所欲的同质性的细胞混合物或聚集的细胞群体的使用。适合用于本发明的生物反应器包含，但不限于在美国专利第5,763,194号、美国专利第5,985,653号以及美国专利第6,238,908号、美国专利第5,512,480号、美国专利第5,459,069号、第5,763,266号、第5,888,807号以及第5,688,687号。

关于任何大体积、长期间的细胞培养，例如在活体外所需MLPCs的分化，须控制几个基本参数。培养过程必须提供允许细胞维持存活、增殖、分化(也许包含多个不同的分化培养及条件)以及最终细胞培养保存的培养基。通常，在生物反应器中各种介质由帮浦机制运送至细胞，定期进行培养基的给予及交换。交换过程允许副产物从培养物中移出。生长的细胞或组织亦需要氧的来源。不同的细胞型态有不同氧气的需求。因此，以弹性及可调整方式提供氧气至细胞为所需要件。

根据特定的培养，在培养腔室中均匀分配细胞群体和培养基的供给为一重要的控制过程。该控制通常经由使用悬浮培养的设计来完成，之所以能有效达成是因其细胞与细胞间的相互作用并不强。悬浮培养***的范例包含各种反应槽设计及可透气的塑料培养袋。细胞培养时不需要形成三维结构或培养于基质或滋养层(feeder layer)上(例如大多数血液细胞的前驱细胞或成熟血液细胞)的细胞，可使用悬浮设计。

有效的细胞培养***，其重要的特征为在培养程序结束时能有效地收集细胞。以细胞为产品的生产方式之一是将细胞培养于一明确的空间中，而此空间内没有物理性的障碍物(physical barriers)可影响细胞的回收。如此一来，简单冲洗细胞产品可导致一可控制的、浓缩体积的细胞悬浮液。而此大小体积的细胞悬浮液可再依商业的、密闭***的细胞清洗器中清洗。最佳地，该***允许含有或不含有防腐剂的药学上可接受的载体、或细胞储存化合物的添加，藉此提高收集至无菌包装中的细胞的收成率。最佳收成及包装细胞的过程是可在不破坏培养室流体路径的无菌屏障下完成。

对于任何细胞培养过程，主要注意的是无菌。当产物细胞要回输到患者时(通常当患者在患病或免疫功能低下的时间点)，微生物的存在是不被允许的。

本发明的进展目前已促使治疗性或预防性治疗受试者的方法的发展。特别是，本发明的较佳实例中，治疗在造血或***功能表现不充分、不足或异常的患者，其方式是给予依据本发明的方法所产生的该些主要MLPCs或部分或充分分化源自MLPC细胞的细胞(例如源自造血或间质的细胞)为基础。

该方法可应用于广泛的条件，但不仅限，包含造血障碍、循环障碍、中风、心肌梗塞、高血压引起的骨异常、第II型糖尿病、***、损伤或形态上异常的软骨或其他组织、疝气修复、使用支持网和生物支架的骨盆底脱垂手术、其他肌肉骨胳异常的细胞治疗，或因衰老、手术或外伤情况下更换有缺陷的支持组织。

当提及“造血或***功能异常”为特征的症状时，应理解其所指为任何因部分缺陷或不希望或不期望的结果造成造血或***体系的细胞功能或发展异常的症状，其对应于任一种同质性或异质性的细胞群体。当提及“造血干细胞”、“源自造血干细胞的细胞”、“间质干细胞”或“源自间质干细胞的细胞”时应理解其所指的意义与上文所定义的意义相同。细胞缺陷应理解为泛指细胞任何结构的或功能的特征不正常或其他不期望的部分，包含该些细胞的数目生产不足。

因此，本发明的另一方面为一种治疗性及/或预防性治疗一哺乳动物的病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物一有效数目的依据本发明的方法产生的MLPC多分化潜能细胞(MLPC)或部分或充分分化的源自MLPC的细胞。

更特别是，本发明提供一种治疗性及/或预防性治疗在哺乳动物以造血或间质功能异常为特征的病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物；

(i)有效细胞数目的依据本发明的方法产生的造血干细胞，或部分或充分分化的源自造血干细胞的细胞；或

(ii)有效细胞数目的依据本发明的方法产生的间质干细胞或部分或充分分化的源自间质干细胞的细胞。

当提及“给予”一个体有效数目的本发明的细胞时，应理解其所指为将依本发明的方法于生物体外(ex vivo)产生的细胞群体引入一哺乳动物体内。当提及“给予”时，“试剂”应理解为引入一个或多个有效的刺激物至哺乳动物体内，以此作用于哺乳动物体内的MLPC上，使产生源自MLPC的细胞。依据本发明，MLPCs或源自MLPC的细胞较佳为自体的细胞，这些细胞在体外经过辨识、分离、和/或分化的过程而成为所需求的表型，然后在回输原本的个体中。然而，应理解到本发明可延伸应用至任何其他适合的来源，该适合来源所取得的细胞为表现与受治疗个体相同主要的组织相容性(histocompatability)的细胞。因此，该细胞为自体细胞时最有效，因其不会导致组织相容性的问体，而此问题多发生在回输细胞时细胞具外来的MHC型态。应理解该为“自体”定义范围内的细胞。例如，在某些情况下，因期望、有需要或实际可行的原因，细胞是分离自遗传上完全相同的双胞胎身上。该细胞亦可经工程化以表现所需主要的组织相容性。该细胞的使用克服了在组织及器官移植长期会遇到的困难。然而，若分离或产生自体细胞是不可能或不容易，则可能有必要利用异体干细胞(allogeneic stem cell)。“异体移植的(allogeneic)”细胞是指分离自同物种但具不同MHC型态的个体的细胞。虽然是在治疗的前题下使用该异体细胞，但有需要同步使用免疫抑制疗法，但此问题可藉由使用表现类似MHC型态的从兄弟、父母或小孩身上分离/产生的细胞群而降低其排斥反应。本发明亦应理解能扩展到异种移植。也就是说，依据本发明的方法产生并引入病患体内的细胞，该细胞可分离自某种哺乳动物而非受治疗个体的物种。

本发明未限制于任何一种理论或作用方式，即使恢复部分非经由异常细胞群体所提供的功能，也可改善很多病症的征状。因此，“有效数目”表示至少部分达到接受治疗特定病症的预期效果、或延迟发作、抑制其发展、或完全停止发作或延迟所需要的细胞数目。当然，该数目取决于受治疗的特定病症、病症的严重性以及每个患者的参数，包含年龄、身体状况、身材、体重、生理状况、同时进行的治疗、医疗史及与病症有关的参数。本发明技术领域中技术人员应能确认建构有效剂量所需的细胞或组织的数量，以及不需过度的实验就能得知给予该细胞或组织的最佳模式。这之后的问题将在下文进一步讨论。本发明技术领域中技术人员皆熟知此条件而能以不超过例行实验的实验量来解决。通常较佳是使用最大的细胞数目，也就是依据合理的医学判断最高的安全数目。然而，本发明技术领域中技术人员已知可以医疗理由、生理理由或任何其他理由给予较低细胞数目。

依据以上所讨论的。应理解的是，尽管如本文所定义的本发明的方法在其范围内包含引入转化的，或全部或部分的分化细胞至患有病症的个体，并非所有引入个体体内的细胞都需要获得所感兴趣的MLPC或源自MLPC细胞的细胞的表型。例如，CD14⁺单核球群体经过转化为MLPC后并且完全引入病患体内，当中可能还是有部分群体的细胞并未转化成具有所需表型的细胞。相同的问题可能发生在给予源自MLPC细胞的群体，例如特定造血或间质群体。因此本发明实现提供引入相关的部分细胞时，构成上述的“有效数目”。然而，细胞群体特性较佳的实例中，分化的细胞群体是经过辨识确认为成功分化的细胞群，这群细胞经过分离后再引入特定个体体内。此提供选择无论是源自MLPC细胞的异质性群体，如刺激源自间质干细胞的细胞分化成***时；或选出细胞的特定亚群体用于特定的给予(administration)，例如红血球。依据要治疗病症的性质选择所要应用的方法类型。然而，通常会期望给予单纯的细胞群体以避免潜在的副作用，例如形成畸胎瘤。或者，在一些举例中，较可行的方式是将一MLPC群体先进行分化使其表现所需求的功能活性，然后在未去除不相关的细胞种类下将所有细胞引入个体体类。据此，在该情况下应理解到“有效数目”为所引入的全部细胞数目中必需具有足够的已分化细胞数，而此已分化的细胞的活性能达到本发明的目标程度进而应用于治疗个体的病症。

详如上述，在活体外进行MLPC变化。在该情况下，该细胞之后将需要引入至个体体内。例如悬浮细胞可藉由直接注射或包埋于血凝块中引入，因细胞固定在凝血块中较易于移植。该细胞亦可在移植之前包埋。该包埋技术可用于防止可持续增殖的细胞于体内到处四散(如表现出永久生存的特性)，或可用于将组织不相容性所引起的排斥问题减至最少。然而，包埋技术的实用性取决于所移植的细胞所要达成的功能为何。例如，如果移植细胞主要需要用于分泌可溶性因子的目的，包埋细胞的群体可能达到该目的。然而，如果移植细胞需要其收缩的特性，例如，该细胞可能需要以整合现有的肌肉组织支架。包埋细胞无法有效地达到这个效果。

细胞可以经由任何适合的途径以单一剂量或多剂量的方式给予患者。在可能的情况下，利用单一给予是较佳的。依据需要修复的类型，针对组织或器官所在的不同区域以注射的方式将细胞引入该部位。

根据本发明的多个方面可理解，细胞可以任何适合的形式给予需治疗的病患，例如以细胞悬浮液的形式(如血液细胞)或以组织移植的形式(如***)。就产生单一细胞悬浮液而言，该分化过程可设计为有利于维持细胞悬浮的。或者，如果细胞聚集或组织形成，可将聚集或组织打散成单一细胞状态成为细胞悬浮液。就利用细胞悬浮液而言，其亦可以选出特定的细胞亚群体用于给予的患者，例如特定单核造血细胞。在期望将组织移植至病患体内时，通常需要进行手术移植(而不是经由针筒或导管给予)。或者，只有该组织的一部分可移植。在另一范例中，可经由标准组织工程技术产生工程组织，例如将由本发明产生的细胞及组织接种于一经设计的组织工程支架上，并将接种细胞及组织的支架培养于适当的条件下，使接种于其上的细胞与组织能够长成聚落，进而长成期望中的组织。之后该形成的组织给予至一接受者，例如使用标准的外科移植技术。产生合适的支架可使用，例如生物可相容性的、生物可分解性的聚合纤维或泡沫材料，其包含细胞外基质成分，例如基质蛋白(laminin)、胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin)等等。详细的产生或获得合适的支架、培养该支架或治疗性的移植该支架的实施方针可在文献中获得(例如，参见Kim S.S.and Vacanti J.P.,1999.Semin Pediatr Surg.8:119,U.S.Pat.No.6,387,369to Osiris,Therapeutics,Inc.；U.S.Pat.App.No.US20020094573A1to Bell E.)。

依据本发明的方法，其他类似蛋白质的或非类似蛋白质的分子可与细胞一起或先于细胞或依序共同给予(co-administered)。“共同给予(co-administered)”意旨同时或依序经由相同或不同的途径给予相同或不同配方。“依序”意旨引入该些细胞与给予类似蛋白质或非类似蛋白质或该些引入的细胞开始功能性活动与给予类似蛋白质的或非类似蛋白质之间的秒、分、小时或天的时间差异。该共同给予的情况的范例包含，但不限于：

(i)当给予个体非同源的(syngeneic)细胞或组织时，通常该个体会对该细胞或组织发生免疫排斥反应。在这种情况下有必要也以免疫抑制疗法的方式治疗该患者，较佳地是在给予非同源细胞前开始进行免疫抑制疗法以减少排斥反应。抑制同种异体移植的排斥反应的免疫抑制程序有例如经由环孢菌素A(cyclosporine A)、免疫抑制抗体及类似物的给予，皆为普遍及标准的程序。

(ii)依据治疗病症的性质，有必要维持患者原本的药物疗程以减轻病症的征状，直到移植的细胞整合至病灶部位并发挥其功能为止。或者，治疗病症之后，有必要开始长时间使用药物以避免该损伤再发生。例如，个体会经由自身免疫病症(例如发生类风湿性关节炎)引起损伤发生，可能需要长期使用免疫抑制药物，即使已使用同源的干细胞来取代或修复软骨。

应理解本发明的方法可单独进行治疗病症或与一个或多个其他的技术一起进行以促进或增强个体的治疗。该些其他的技术可采用如上述的其他类似蛋白质的或非类似蛋白质的分子共同给予的形式。

本发明的另一方面为将依本发明的方法产生的MLPCs或源自MLPC细胞的群体用于制成药物，进而用于哺乳动物的病症治疗。

本发明尚有一方面为MLPCs或源自MLPC的细胞及依本发明的方法产生的该些细胞。

较佳地，该MLPCs为造血或间质干细胞。

在与本发明相关的观点中，进行治疗或预防的个体可为任何需要治疗性或预防性的治疗的人类或动物。在这方面，所指的“治疗”及“预防”应以最广泛的范围加以解读。该“治疗”用语不一定表示哺乳动物接受治疗直到完全康复。同样地，“预防”不一定表示个体最终不会患有该病症。因此，治疗及预防包含特定病症的症状改善或预防或其他减少特定病症发展的风险。该用语“预防”可认为是减少特定病症发作的严重性。“治疗”以可减少存在病症的严重性。

发展在活体外产生MLPCs或源自MLPC细胞的方法已促使以活体外为基础的筛选***的发展，这些筛选***可测试有潜力的治疗方式或新的培养策略的有效性及毒性。

因此，依据本发明尚有的另一方面，有一以MLPC或源自MLPC的细胞为主的评估方法。该方法可透过以本发明所生产的前述细胞的表型状态与功能性状态来评估治疗方式或培养策略的效果。藉由将细胞以欲评估的治疗策略进行处理，并筛检细胞在表型状态与功能性状态上的改变。

该MLPC较佳为造血或间质的干细胞。

“改变”表示分析个体的一个或多个功能及表型参数相对于未处理的细胞是改变的。这可能为在设计以改善细胞功能的处理方式中所期望的结果。然而，该处理方式与有害的结果有关的情况下，表示有毒性且因此该处理方式的使用是不适合的。已知对单一药物观察到的个体的反应是不同的，其通常与个体独特的基因组成有关。因此，本发明的方法提供一有价值的测试方法，能测试现有的治疗策略或新的治疗策略对细胞的影响，而在此所指的治疗策略是利用受试个体身上的细胞核材料衍生而来。此发明提供了独特的评估方法，在将药物注入个体体内前能测试该药物对于该个体在细胞***层次上的影响。透过此评估方法，一个极为严重的患者，能避免或至少将因治疗方式所引起的非预期生理负担结果减少到最小。

因此，本发明在此方面提供一个将治疗方法最优化，进而使细胞功能正常化的方法。然而，该方法亦可用于评估治疗的毒性，尤其是使用化合物的治疗。因此，例如以某化合物处理以本发明所生产的细胞或组织，结果导致该细胞或组织无法产生与造血或***有关的表型特性，可以此评估该化合物对细胞的毒性。

因此本发明的方法能使用于筛选及/或测试药物、其他治疗策略或培养条件。在评估表型的改变方面，本发明可利用以监控该细胞及组织的基因表达谱(gene expression profiles)。因此，依据本发明的方法可用以确认某治疗对基因表达模式(gene expression pattern)的改变。

对于本发明的细胞或组织的处理较佳是暴露于化合物，且该化合物较佳是药物或生理离子，或者该化合物可为成长因子或分化因子。据此，其为一令人满意的方法，可在给予某药物的前预测该药物对细胞族群会造成何种副作用。

本发明进一步经由以下非局限的范例作为参考进行描述。

范例1

MLPC的制造

采用标准技术，抽取健康成人的静脉血液并使用密度梯度离心，分离出周边血液单核细胞(PBMC)。

将CD14⁺PBMC样本放置在FEP培养袋中。加入体积等同于CD14⁺PBMC样本的6％人类血清白蛋白溶液。

加入适合培养干细胞的细胞培养基，最终混合液约由15％CD14⁺PBMC、15％的6％人类血清白蛋白溶液以及70％细胞培养基。

可加入适当体积的10mg/L胰岛素以促进细胞生长。

将细胞培养在37℃、5％CO₂的培养箱90分钟以使PBMC贴附至培养袋内部。待细胞贴附后，藉由1至7天培养，使细胞转变为MLPC。在第7天时，将细胞从培养袋中移出，以0.9％无菌生理食盐水冲洗。将MLPC进行检测，在回输(reintroduction)至自体捐赠者。

范例2

MLPC的特性

1.MLPC的形态观察

于载玻片上制备经37℃、CO₂培养箱第1、2、3、4、5、6及7天培养后的细胞样本。经由倒置显微镜观察培养期间贴附细胞的表型，以了解MLPC的生物特性(图1至图8)。

2.流式细胞仪分析

藉由流式细胞仪分析细胞表面抗原，以检测MLPC干细胞表现情形。从封闭式袋状***收集MLPCs并以PBS冲洗，在4℃下以1500rpm离心5分钟，保留细胞沈淀物。调整细胞密度至每管1x10⁶个细胞数，以100μlPBS将细胞悬浮并转移至1.5mL离心管。MLPCs分别加入5至20μl的CD14-FITC、CD29-PE、C31-PE、CD34-PE、IgG-PE同型对照(isotypecontrol)(MACS，德国)、CD38-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD105-PE(BD生物科学事业，加州)的萤光抗体，在4℃下，处理20至30分钟，接着在4℃下以2000rpm离心5分钟。以PBS冲洗并离心后，保留细胞沈淀物，并加入100μl的固定液(eBioscience)，在4℃下，处理30分钟。最后，将固定的MLPC样本，在4℃下以2000rpm离心5分钟，丢弃上清液并以PBS缓冲液再悬浮储存在4℃。经由CellQuest软体鉴别活的细胞，以及日期以对数分布图(logarithmic histograms)表示。

3.结果分析

关于显微镜观察的结果，由图1可知，经90分钟后CD14+PBMC即会贴附于细胞培养袋，且大部分为圆形。在第一至第二天，细胞变为椭圆形(图2至图3)。在第三至第五天，贴附细胞呈现明显具有显着尾部的纺锤状及纤维状形态(图4至图6)。在第六至第七天，该细胞转变为椭圆状表型但仍保留尾部(图7至图8)。

关于流式细胞仪分析的结果，分析培养一天后的MLPC样本发现有以下表现：CD14⁺、CD34低表现、CD45⁺、CD29⁺、CD44⁺(图1)。

分析培养三天后的MLPC样本发现有以下表现：CD31⁺、CD38⁺、CD90^-、CD105⁺(图2)。

分析培养六天后的MLPC样本发现有以下表现：CD14⁺、CD29⁺、CD34低、CD44⁺、CD45⁺(图3)。

分析培养七天后的MLPC样本发现有以下表现：CD14⁺、CD34低、CD44⁺、CD45⁺(图4)。

范例3

多分化潜能细胞CD14⁺的蛋白质表现

以二维蛋白质电泳及质谱仪(MALDI-TOF/MS/MS)分析蛋白质表现

细胞萃取物的制备

从4位健康的志愿者收集培养4至7天的CD14阳性周边血单核细胞的细胞蛋白质。简单而言，经由尿素分解细胞及丙酮(accetone)纯化以获得细胞的蛋白质萃取物。

依蛋白质的量将个样品平均地混和后，用IPG胶条(18公分、pH3-11线性胶条；GE Healthcare,Amersham,USA)和12.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)利用IPGphor IEF及Ettan DALTSix***(安玛西亚生物科学公司、美国)进行一维及二维电泳分析，此实验重复三次。

将电泳胶以CyproRuby(GIBCO)染色后用影像扫描仪扫描(安玛西亚生物科学公司、美国)，并进一步作蛋白质鉴定。经由胶内分解胜肽片段(In-Geldigestion)获得蛋白质，蛋白质胶点以50％乙腈(Acetonitrile，ACN)及25％50mM NH₄HCO₃脱色，然后以100％ACN脱水及在氮气中干燥。将干燥的凝胶片段保存在含有25mM NH₄HCO₃及胰蛋白酶((Promega公司、美国))的分解液中，37℃隔夜。该胰蛋白酶胜肽混合液以Zip tip C18(密里博，美国)微管柱脱盐及纯化。纯化的胜肽混合液以α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)为基质进行质谱仪分析。Bruker-Daltonic飞行时间式雷射诱导质谱仪(Autoflex TOF LIFT mass spectrometer)以下列参数获得质谱结果：反射头(perflectometer)模式、正离子、飞行管长度2.7m、加速离子源20,000V、及反射电压23,000V。使用美国国家生物技术资讯中心(NCBI)资料库及MASCOT资料库搜寻胰蛋白酶片段大小的资料鉴别质量指纹(fingerprinting)。

经由二维蛋白质电泳及质谱仪(MALDI-TOF/MS/MS)分析CD14⁺-PBMCs的蛋白质表现

1.MYL9                9.APOA1

2.RASF6               10.TPA4A

3.SYMPK          11.SODM

4.ATPB

5.CALR

6.UBFL6

7.ACTB

8.TPM4

经由西方墨点法分析蛋白质表现

细胞萃取物的制备

从4位健康的志愿者收集培养4至7天的CD14阳性周边血单核细胞的细胞蛋白质。简单而言，经由RIPA细胞溶解缓冲液(密理博，特曼库拉，CA92590)获得细胞萃取物。该萃取的悬浮液存放在冰上20分钟，然后以13000g离心5分钟，收集上清液(可溶性的部分)并用于各种蛋白质表现的侦测。

西方墨点法分析

由市面上购买针对各种抗原的初级抗体，包含从Abcam Inc.公司(波士顿，美国)购买第I型胶原蛋白、第1类HLA、TAZ、类胰岛素生长因子(Insulin-likegrowth factor-binding protein 3，IGFBP3)、碱性磷酸脢(alkaline phosphatase)及穿孔素(Perforin)；从Epitomic Inc.公司购买CDX2、纤连蛋白(Fibronectin)、干扰素gamma诱导蛋白(Interferon gamma-induced protein 10IP-10)、巨噬细胞-1抗原(MAC-1)、M钙粘蛋白(M Cadherin)、MyoD(MYOD1)、核转录因数Y亚基alpha(alpha Nuclear transcription factor Y subunit alpha，NF-YA)、Notch1、配对盒基因-5(Paired box-5，PAX-5)、P-糖蛋白、Wiskott–Aldrich症候群蛋白(WASP)；从默克密理博事业体(Billerica,MA,USA)购买-辅肌动蛋白(-Actinin)、钙钙调蛋白依赖性蛋白质激酶(Ca2+calmodulindependent proteinkinase/CaM kinase IV)、细胞视黄酸结合蛋(Cellular retinoic acid bindingprotein，CRABP II)、GATA结合因子-4(GATA4)、低氧诱导因子-1a(HIF-1a)、无刚毛-盾同源物1(Achaetescute homolog 1，MASH1)、肌原蛋白(Myogenin)以及成骨特异性转录因数(Runt-related transcription factor 3，Runx3)；从圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology(圣克鲁斯，加州，美国)购买膜联蛋白VI(Annexin VI，G10)、神经原质蛋白-3(Neurogenin 3，E-8)、颗粒溶解酶B(Granzyme B)、谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD2，D5G2)以及颗粒溶素(Granulysin，F-9)。

以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide)凝胶电泳分析细胞分解后的上清液，每个细胞样本取100μg至Pierce品牌4-20％Tris-甘胺酸(glycine)胶体中(Thermo SCIENTIFIC公司，罗克福德，美国)进行电泳。电泳之后，将胶体转渍至PVDF膜上(密理博，特曼库拉，CA92590)，该膜浸泡于5％脱脂奶粉(skim milk)的Tris缓冲的食盐水Tween-20缓冲液(10mM Tris pH 8.0，150mM NaCl)进行阻断(blocking)，然后该膜与各种初级抗体(primary antibodies)置于含有5％脱脂奶粉的Tris缓冲的食盐水Tween-20缓冲液，4℃至隔夜。清洗该膜，接着放入接合有辣根过氧化氢酶(horseradish peroxidase-conjugated)的二级抗体。以Amersham-加强型化学发光***(Amersham-enhanced chemiluminescence system)进行分析，以CCD影像感应器及Multi-Gauge软体确认反应条带(bands)。

经由西方墨点分析PBMC-CD14+的蛋白质表现

1.第I型胶原蛋白(Collage Type I)

2.第1类HLA(HLA Class-1)

3.TAZ

4.类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP3)

5.碱性磷酸脢(Alkaline Phosphatase)

6.穿孔素(Perforin)

7.CDX2

8.纤连蛋白(Fibronectin)

9.干扰素gamma诱导蛋白(Interferon gamma-induced protein 10，IP-10，CXCL-1)

10.巨噬细胞-1抗原(Macrophage-1antigen，MAC-1)

11.M钙粘蛋白(M Cadherin)

12.MyoD(MYOD1)

13.核转录因数Y亚基alpha(Nuclear transcription factor Y subunit alpha，NF-YA)

14.Notch 1

15.配对盒基因-5(Paired box-5，PAX-5)

16.P-糖蛋白(P-glycoprotein)

17.Wiskott–Aldrich症候群蛋白(Wiskott-Aldrich Syndrome Protein，WASP)

18.辅肌动蛋白(-Actinin)

19.钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶(Ca2+/calmodulin-dependent proteinkinase，CaM kinase IV)

20.细胞视黄酸结合蛋(Cellular retinoic acid binding protein，CRABP II)

21.GATA结合因子-4(GATA binding factor-4，GATA4)

22.低氧诱导因子-1alpha(Hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1alpha)

23.无刚毛-盾同源物1(Achaete-scute homolog 1，MASH1)

24.肌原蛋白(Myogenin)

25.成骨特异性转录因数(Runt-related transcription factor 3，Runx3)

26.膜联蛋白VI(Annexin VI，G-10)

27.神经原质蛋白-3(Neurogenin 3，E-8)

28.颗粒溶解酶B(Granzyme B)

29.颗粒溶素(Granulysin，F-9)

30.GAD2

经由流式细胞仪分析蛋白质表现

从封闭式培养袋收集CD14⁺-PBMC并以PBS(含有2％FBS)清洗，在4°C下以1500rpm离心5分钟，保留细胞沉淀物。调整细胞密度至每管2.5至3x10⁶个细胞数以利于流式细胞仪分析。遵循实验室标准步骤进行，加入萤光抗体于CD14⁺-PBMC中。最后，加入100μl固定缓冲液(BD)，于4℃下放置20分钟。若无立即分析，需将细胞避光保存于4℃下，直到进行流式细胞仪分析(Bacton Dickinson公司)。经由CellQuest软体分析细胞，以及日期以对数分布图(logarithmic histograms)表示。

范例4

个案研究-癌症

个案研究：经由收集周边血液自体干细胞治疗35岁胸腺癌末期患者

本个案研究为一35岁男性第4期转移性胸腺癌末期患者，该患者注射三次依据范例1制备的自体干细胞。

患者到达时乘坐轮椅，有严重贫血及中性白细胞减少症。该患者先前已接受切除肿瘤手术、化疗(及放射治疗？)。该患者左肺完全塌陷(collapsed)，依据心脏超音波显示该患者心脏有肿瘤转移出现。

自2013年4月8日，以16号针进行静脉穿刺，取得250ml患者血液，然后送至自体干细胞技术实验室(Autologous Stem Cell Technology，ASCT)进行自体干细胞的转变。

于2013年4月13日回输2.3x10⁸个自体干细胞。该治疗的目标是恢复该患者骨髓及强化该患者经几次化疗耗尽到几乎不存在的免疫***。治疗后无不良反应。

当骨髓细胞量恢复至足够时，患者第二次于2013年4月23日抽取250ml血液并在2013年4月29日进行回输。该自体干细胞治疗的目的是提高该患者白血球细胞数目，使其可收集足够的单核球，以用于自体干细胞的转变。治疗后，该患者能在不需帮助下行走，且食欲及活动力皆增加。

患者第三次于2013年5月27日抽取250ml血液并在2013年5月31日回输3.6x10⁸个干细胞。该治疗目标是针对癌症治疗。

在3次干细胞治疗之后，该患者的血红蛋白已改善，不需要例行输入红血球。患者整体的体力及活力改善，能在不需帮助下行走。并干细胞治疗后，该患者血氧饱和度也获得改善。患者持续在所有病理参数中有改善，且经由台湾医师的影像报告中可知心脏周围的肿瘤减小及血管增大。该患者由恶性腹水引起的腹胀在治疗后有改善，他的周围神经病变也因为肾脏及肝脏功能改善而减少。该患者持续越来越好。

范例5

个案研究：收集周边血以制成自体干细胞，欲使70岁女性的脸部年轻化以及身体机能再生。

本个案研究为一70岁女性于2013年5月23日进行自体干细胞周边液回输。

依据范例1的方法，以16号针进行静脉穿刺，取得250ml该患者周边血液。

该患者于2013年5月27日将1.5x10⁸个具有以下CD标记(markers)的转变后的干细胞在2小时过程中于患者前臂以静脉注射方式回输。

CD标记(markers)

CD 38、CD 90(造血/淋巴干细胞)

·CD11b、CD31、CD44、CD105(间质干细胞)

·CD7、CD59、CD84(造血干细胞)

·CD49d(神经干细胞)

·CD45(造血前驱细胞)

·CD9、CD30

·CD7(多功能干细胞)

该患者由静脉回输干细胞，同时进行脸部回春(rejuvenation)，干细胞经由以线性逆行性技术(linear retro-grade technique)皮内注射至该患者脸部所有的区域。进行干细胞填入至法令纹、口周、眼周、额头眉间区域。总共约20ml至40ml的干细胞用于全脸回春疗程。

患者出院后状况良好。疗程后24小时内，患者有轻微的瘀青及肿胀。

患者在间隔6周后进行访查，有以下效果：

·改善皮肤松弛

·改善皮肤纹理

·减少色素沉淀

·减少鼻唇皱褶

·减少眉间纹路

·改善眼周线条

·新的胶原蛋白形成

·减少毛孔

·减少皱纹

范例6

个案研究：收集周边血以制成自体干细胞，欲使68岁男性身体机能再生。

此个案为一68岁男性，依据范例1的方法收集周边血并培养细胞，于2013年4月25日回输自体干细胞，以达成目的。

患者目前的疾病史中包含缺血性心脏病、高血压、第二型糖尿病、以及骨质疏松，且在最近切除了第3-4节的椎间盘。该患者先前的疾病史包含在2004年脑中风(CVA)以及具有很强的血管疾病家族史。患者治疗目的为藉由再生医学增强健康及活力，并且降低为了治疗多年骨质疏松及近年的颈椎和腰椎而使用的特定类固醇。

根据回输疗程获得的血液基础值且非显著的，于2013年4月25日将体积为104.3ml或每毫升1.5x10⁵个细胞，总量为1.56x10⁷的干细胞，进行回输。

干细胞表现以下CD标记(markers)

·CD 38、CD 90(造血/淋巴干细胞)

·CD11b、CD31、CD44、CD105(间质干细胞)

·CD7、CD59、CD84(造血干细胞)

·CD49d(神经干细胞)

·CD45(造血前驱细胞)

·CD9、CD30

·CD7(多功能干细胞)

回输过程中，患者的生命征象稳定且无不良反应，故可让患者出院。患者因先前颈椎影响而导致行动范围受限，需要规律服用endone药物。

回输后患者描述有以下改善：

增加身体舒适感

减少疲劳

增加活动的范围

减少疼痛感

改善睡眠品质

患者逐渐从10mg的***(prednisone)剂量降到6mg，截至目前止他从未达到该剂量。患者的麻醉镇痛剂量也减少，并持续在临床上有改善。

范例7

个案研究

患者因过去脑中风(CVA)导致右侧忽略症(hemineglect)及严重发音困难。在回输前该患者在坐立时需要支撑身躯且右脚的伸展受到限制。干细胞回输前及后患者的生命征象稳定。

患者回输依据范例1制备的自体干细胞。没有其他的不良反应发生，当天在护士的伴随下回到住所。虽患者验血报告霉浆菌(mycoplasma)培养为阳性，但该患者临床症状良好，且根据检查报告显示两个肺部清晰没有发烧或发热出现，氧饱和度正常。

该患者出院时，预防性的给予150mg罗力得(Rulide)的药单以预防霉浆菌的可能影响，以持续目前的健康状况。

自干细胞治疗后观察该患者的改善：

1.在没有支撑身躯的椅子上，患者可以维持4分钟坐姿平衡。这是治疗前没有观察到的。

2.该患者右肩周围的肌肉张力已改善。目前该患者能主动间歇性地向上耸右肩且维持在较水平的位置。

3.右膝盖：亦注意到在该患者坐在轮椅时，膝盖可伸直摇晃。这个动作以前在没有物理治疗的外力协助是不可能的。

4.患者从轮椅上可藉由扶手拉起身体保持站立，此动作在轻微协助下可多达三次。

5.患者说话亦有明显的改善，在英文及希腊文发音上有改善。

6.语言治疗师注意到该患者情绪改善及影响。单字及图片名称过程中有些微变化。

本发明技术领域中技术人员可理解本文描述的发明易于变化及修饰而非为特定的描述。可理解到本发明包含所有该些变化及修饰。本发明亦包含所有本说明书单独或共同地所指或表示的步骤、特征、组合物及化合物，以及任二个或更多个该步骤或特征的任何及所有组合。

范例8

个案研究

一名45岁男性患有因缺乏***的***症，于2013年6月进行干细胞治疗。

患者童年时期没有疾病或发生意外可解释该患者的***症，直至2012年才被确诊。

患者先前的健康状态良好并进行几次的试管婴儿(IVF)。

患者在萤光染色体杂交检查(FISH)报告中，显示有33％机率为非正常数染色体。

从2012年患者***数目为零。

自从接受干细胞治疗后有0.01百万个***/ml，最显著时的***数依报告显示为0.02百万个***/ml。

从2013年七月，患者的染色体异常率从33％降至21.9％。

干细胞治疗后，患者可成功产生***，并进行试管婴儿。

该患者亦注意到从干细胞治疗后毛发生长及体力有显著的提升。

Claims (25)

1.一种产生哺乳动物多分化潜能细胞(MLPC)的方法，该方法包含在体外建立细胞培养的比例包含：

(i)10％至20％v/v，或其功能上等同比例的CD14⁺单核细胞悬浮液；

(ii)10％至20％v/v，或其功能上等同比例的约5％至85％白蛋白溶液；以及

(iii)60％至80％v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，

其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足以诱导该单核细胞转变为一表现多分化潜能的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该10％至20％v/v为15％v/v以及该60％至80％v/v为70％v/v。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该CD14⁺单核细胞悬浮液为CD14⁺单核球细胞悬浮液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该CD14⁺单核球细胞悬浮液来自周边血液。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，该多分化潜能细胞表现造血及/或间质的潜能。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，该多分化潜能细胞表现CD14⁺、CD34⁺、CD105⁺、CD44⁺以及CD45⁺。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该多分化潜能细胞亦表现CD14⁺、CD31⁺以及CD59⁺。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该造血潜能为分化为淋巴球、单核球、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红血球或血小板的潜力。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该间质潜能为分化为一硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮或脂肪细胞的潜能力。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，该白蛋白溶液为一浓度为5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％。

11.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，该白蛋白浓度为5％至20％。

12.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，该白蛋白浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于，该细胞培养另包含10mg/L的胰岛素或其功能性片段或其等价物。

14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于，该细胞培养4至7天。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于，该细胞为人类细胞。

16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，该方法包含一额外步骤，表现多分化潜能细胞(MLPC)接触一刺激物以导向该多分化潜能细胞分化为源自多分化潜能细胞的表型。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，该源自多分化潜能细胞的表型为一造血或间质表型。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，该源自造血干细胞的细胞为一红血球、血小板、淋巴球、单核球、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，源自间质干细胞的细胞为例如是硬骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、间质、骨髓、真皮或脂肪的***细胞。

20.一种在治疗性及/或预防性治疗一病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物一有效数目的根据权利要求1至19任一项所述的方法产生的多分化潜能细胞或部分或充分分化的源自多分化潜能细胞的细胞。

21.一种根据权利要求1至19任一项所述的方法所生产的多分化潜能细胞(MLPC)或源自多分化潜能细胞的细胞的群体用于制备治疗一哺乳动物的一病症的药物的用途。

22.根据权利要求20或21所述的方法或用途，其特征在于，该病症以造血或间质功能异常为特征。

23.根据权利要求22所述的方法或用途，其特征在于，该病症为造血障碍、循环障碍、中风、心肌梗塞、高血压引起的骨异常、第II型糖尿病损伤或形态上异常的软骨或其他组织、疝气、骨盆底脱垂手术、肌肉骨胳异常或因衰老、手术或外伤情况下更换有缺陷的支持组织。

24.一种根据权利要求1至19任一项所述的方法所生产的多分化潜能细胞(MLPC)或源自多分化潜能细胞的细胞的群体。

25.一种评估多分化潜能细胞(MLPC)或源自多分化潜能细胞的细胞在表型或功能状态上的治疗或培养策略的效果的方法，该方法包含于该治疗策略中给予一根据权利要求1至19任一项所述的方法产生的多分化潜能细胞或源自多分化潜能细胞的细胞，并筛选出改变功能或表型的细胞。