KR20150090081A - 디술피드-함유 단백질로부터 접합체를 제조하는 방법 - Google Patents

디술피드-함유 단백질로부터 접합체를 제조하는 방법 Download PDF

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치-잉 후
히데토모 이마세
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 적어도 2개의 시스테인을 갖는 단백질로부터 단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 디술피드 연결을 갖는 단백질이 환원되어, 2개의 시스테인의 황 원자를 함께 연결하는 1,3-디할로아세톤 또는 유사한 반응물과 반응하기 위한 2개의 유리 시스테인을 제공한다. 이어서, 황 원자 사이에 삽입된 케톤이 사용되어 아민화 페이로드 분자에 대해 쉬프 염기를 형성하고, 따라서 단백질을 페이로드에 접합시킨다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 시스테인 잔기는 1,3-디할로아세톤 또는 유사한 반응물과의 반응에 의해 함께 묶인다. 각각의 경우에 황 원자 사이의 연결은 단백질 또는 펩티드를 제한된 입체형태로 유지시키면서, 또한 우수한 특이성 및 효율로 페이로드를 부착하기 위한 편리한 장소를 제공한다.

Description

디술피드-함유 단백질로부터 접합체를 제조하는 방법 {METHODS FOR MAKING CONJUGATES FROM DISULFIDE-CONTAINING PROTEINS}
매우 다양한 화학적 모이어티 ('페이로드')가 접합체를 형성하기 위해 효소, 항체, 및 다른 큰 폴리펩티드 또는 단백질에 공유 부착되었다. 페이로드는 그가 부착되는 단백질의 위치를 찾기 위해 (예를 들어, 표지), 단백질의 물리화학적 특성 또는 안정성을 변경하기 위해 (예를 들어, PEG화), 단백질이 또 다른 분자 또는 단백질에 부착되도록 하기 위해 (접합체를 또 다른 화합물 또는 또 다른 접합체에 연결하기 위한 커플링 기), 또는 페이로드 또는 단백질의 기능 또는 활성을 변경하기 위해 (예를 들어, 백신 접합체) 사용될 수 있다. 단백질은 또한 예컨대 항체-약물 접합체 (ADC)에서, 부착된 페이로드를 특정 조직 또는 세포 종류에 전달하기 위한 담체로서 작용할 수 있다. 단백질에 유용하게 연결될 수 있는 페이로드의 부류는 검출가능한 모이어티 (표지), 단백질을 표면 또는 또 다른 화합물에 부착시키기 위한 고정 모이어티, 단백질에 접합될 때 면역 반응을 유도하는 항원, 화학적으로 상보적 커플링 파트너와 쉽게 반응하는 (따라서 단백질을 또 다른 엔티티에 연결하는) 커플링 기, 및 치료 모이어티, 예컨대 세포독소 및 다른 생활성제를 포함할 수 있다. 이들 다양한 구조를 제어되고 재현가능한 방식으로 단백질에 부착하는 것은 종종 접합체가 정확하게 기능하기 위해 매우 중요하다. 따라서, 많은 종류의 페이로드를 많은 상이한 단백질 또는 폴리펩티드에 부착하기 위한 다양한 방법에 대한 요구가 존재한다.
페이로드를 단백질에 부착하여 단백질 접합체를 형성하기 위한 많은 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Sletten, E. M. and Bertozzi, C. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974-6998]; [Basle', E.; Joubert, N.; and Pucheault, M. Chemistry & Biology 2010, 17, 213-227]을 참조한다. 몇몇의 단백질 접합체에서, 단백질 및 페이로드가 연결되는 방법은 접합체의 활성 또는 관련 특성에 대해 검출가능한 영향을 갖지 않을 수 있고; 다른 경우에, 단백질과 페이로드 사이의 연결 특성은 접합체의 활성 또는 특성에 유의하게 영향을 줄 수 있다. 때때로, 예를 들어 단백질당 페이로드 모이어티의 수를 제어하기 위해서, 또는 단백질의 기능을 저해하지 않도록 페이로드가 부착되는 정확한 위치를 제어하는 것이 매우 중요하다. ADC는 예를 들어 항체가 인식하여야 하는 표면 구조 (항원)에 대한 항체의 결합을 저해하도록 페이로드가 위치하지 않게 하기 위해 단백질이 표적화된 세포 상의 표면 구조를 인식하고 결합할 것을 필요로 한다. 예를 들어, 문헌 [Expert Opin. Biol. Ther. 2012, 12, 1191-1206]; [Toxins 2011, 3, 848-883]; 및 [Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology: From Basic Research to Cancer Therapy, 1st Edition. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2012, 12, 355-374]을 참조한다.
페이로드를 단백질에 부착하기 위한 대부분의 방법은 단백질과 관심 있는 특정 페이로드 사이에 화학적 연결 구조 (링커)를 부가하는 것을 수반한다. 링커는 각각의 모이어티 상의 이용가능한 기능성 기를 사용하여 관심 있는 페이로드를 단백질에 연결하는 방법을 제공한다. 링커는 종종 페이로드와 단백질 사이의 거리 조정을 허용하고, 또한 단백질로부터 페이로드를 방출하기 위해 생체내에서 용해되거나 분해될 수 있는 절단가능한 부분을 포함할 수 있고, 여기서 방출은 그의 목적을 달성하기 위해 페이로드에 중요하다. 예를 들어, ADC에서, 접합체가 목적하는 효과를 가질 수 있는 위치에서 페이로드를 분해하고 방출하는 것이 매우 중요할 수 있다. 페이로드 및 단백질이 연결되는 방식에 대한 요구가 상이한 단백질-페이로드 접합체의 다양한 종류 때문에, 페이로드를 단백질에 지속적으로 및 효율적으로 연결하기 위한 신규한 방법에 대한 필요성이 계속 존재한다.
단백질 접합체를 형성하기 위한 가장 통상적인 방법은 많은 천연 단백질에서 자연적으로 발생하는 특정 아미노산의 화학적 반응성에 의존하고: 리신 및 시스테인은 페이로드를 단백질에 연결하기 위한 반응성 부위를 제공하기 때문에 종종 사용된다. 리신은 연결기 또는 페이로드 상의 적합한 친전자성 관능기와 반응할 수 있는 유리 아민기를 갖고, 시스테인은 그의 유리 술프히드릴 기를 통해 반응할 수 있다. 그러나, 이들 자연적으로 발생하는 반응성 부위에 대한 의존은 복잡할 수 있고: 관심 있는 단백질에 특정 종류의 아미노산이 너무 많거나 너무 적을 때, 예를 들어, 단백질 상의 페이로드의 정확한 '로딩'을 얻는 것이 어렵게 된다. 단백질 표면 상의 리신의 높은 풍부도는 부위- 및 영역-선택적 접합을 어렵게 만들고, 불균일한 생성물을 생성한다. 이와 대조적으로, 시스테인은 비교적 드물고, 주로 단백질에 디술피드-연결된 쌍으로 존재한다. 시스테인에서의 접합은 종종 디술피드의 환원, 이어서 개개의 시스테인을 별개로 표지하기 위한 접합 시약 (예를 들어 말레이미드)과의 반응을 필요로 한다. 이것은 디술피드 연결을 제거하기 때문에, 단백질 구조 및 안정성은 상기 과정에 의해 저하될 수 있다.
단백질은 또한 종종 부착되는 페이로드의 최적 수보다 많은 리신을 갖고: 지속적인 균일한 생성물을 보장하기 위해 모든 이용가능한 리신을 점유하기에 충분한 페이로드 모이어티를 부가하는 것은 최적 효능을 위해 너무 많은 페이로드 분자를 부가할 수 있다. 이것은 접합을 위해 단지 몇몇의 리신만을 사용하여 피할 수 있지만, 상기 부분적인 또는 불완전한 로딩은 일반적으로 불균일한 생성물을 제공할 수 있고, 이것은 다양한 이유로 문제가 될 수 있다 - 예를 들어, 최초로 시판된 ADC인 밀로타르그(Mylotarg)™의 경우, ADC 생성물의 불균일성은 생성물의 등록 취소 결정을 유도한 문제에 기여한 것으로 보인다 (Fuenmayor, et al., Cancers, vol. 3, 3370-93 (2011)). 또한, 특정 종류 (예를 들어, 리신)의 충분한 아미노산 기가 최적 로딩을 위해 존재할 때, 이 중 몇몇의 또는 모든 기는 단백질이 그의 용액 입체형태 내에 존재할 때 단백질 내에 '매립'될 수 있고, 이것은 이들 기를 접합에 효과적으로 이용가능하지 못하게 만들거나, 또는 '부분적으로' 접근가능하게 만들고, 이 역시 접합체의 불균일성을 유발할 수 있다. 따라서, 리신이 접합을 위한 유용한 부위일 수 있지만, 이것은 많은 상황에서 이상적이지 않다.
천연 단백질 내의 시스테인의 발생 빈도는 리신보다 더 낮고, 시스테인은 적당한 수로 이용가능한 경우에 접합 부위로서 사용하기 적합할 수 있고; 너무 적은 시스테인이 존재할 경우, 하나 이상이 표준 단백질 변형 방법에 의해 삽입될 수 있다. 그러나, 시스테인을 삽입함으로써 천연 단백질의 서열 변경을 방지하는 것이 종종 바람직하고; 뿐만 아니라, 천연 단백질 내의 표면-접근가능한 시스테인은 종종 다른 시스테인 근처에 위치하고, 이것은 단백질의 활성 입체형태의 유지에 중요할 수 있다. 디술피드를 환원시킴으로써 디술피드를 2개의 유리 시스테인으로 전환하는 것은 어렵지 않지만, 이것은 단백질의 2차 또는 3차 구조를 붕괴시킬 수 있다.
단백질 상의 디술피드를 환원시킴으로써 형성된 시스테인 잔기 사이에 테더를 삽입하기 위해 시도하는 몇몇 방법이 보고되었다. 상기 방법 중의 하나는 술폰-치환된 메타크릴레이트 유도체를 수반한다 (US2006/0210526). 상기 방법은 고리화 전에 제거 단계를 필요로 하는 반응성 중간체를 형성하고, 다단계 과정에 대한 조건은 시스테인 사이에 링커 (테더)의 불완전한 형성을 야기할 수 있고, 반응 조건은 심지어 단백질 변성을 야기할 수 있다. 또 다른 방법은 말레이미드 유도체를 이용한다 (WO2011/018613). 그러나, 상기 과정에서 형성된 접합체는 말레이미드 상의 티올의 마이클(Michael) 부가가 가역적이기 때문에 안정성 문제가 발생한다. 따라서, 단백질 접합체를 형성하기 위해 디술피드 연결을 포함하는 단백질에 화학적 모이어티를 접합하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 효율적인 접합, 안정성, 및 일관된 페이로드/단백질 비를 제공하면서도 디술피드의 입체형태 제어 효과를 포기하지 않으면서 디술피드 성분 (술프히드릴)을 사용하는 방법이 필요하다. 또한, 고정된 단백질을 페이로드와 접합하기 위한 수단을 또한 제공하는 특정 입체형태로 단백질을 유지하기 위한 고정(stapling) 방법에 대한 필요성이 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Expert Opin. Drug Discov. (2011) 6(9):937-963]; [Tetrahedron 55 (1999) 11711-11743] 참조). 본 발명은 상기 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 페이로드를 단백질에 연결하여 단백질 접합체를 형성하기 위해 단백질의 표면 상에 디술피드를 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 사용하는 방법을 제공한다. 방법은 디술피드를 환원시켜 2개의 유리 티올기를 제공하고, 2개의 티올기가 디술피드를 형성할 때 이들이 점유한 것과 거의 동일한 위치에 이들을 유지하는 테더로 2개의 티올기를 함께 묶는 것을 수반한다. 시스테인기를 그의 거의 동일한 위치에 유지하는 것은 디술피드의 환원시에 발생할 수 있는 단백질의 입체형태에 대한 임의의 유해한 효과를 최소화한다. 2개의 티올기를 함께 연결하기 위해 도입된 테더는 관심 있는 페이로드를 부착시키기 위해 사용될 수 있는 반응성 기능성 기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 테더는 외부 아민기와 이민 또는 옥심 또는 히드라존 연결을 형성하기에 충분히 반응성인 카르보닐기를 포함하고, 페이로드는 상기 연결을 형성함으로써 활성화 단백질에 접합된다. 예를 들어, 환원 단백질은 1,3-디할로 아세톤, 예컨대 디클로로아세톤 또는 디브로모아세톤과 반응하여, 2개의 황 원자를 함께 연결하는 3-탄소 테더를 삽입할 수 있다. 이것은 디술피드보다 큰 안정성 및 페이로드를 부착하기 위한 장소를 또한 제공하면서, 디술피드가 존재할 때 갖는 것과 매우 유사한 입체형태로 단백질을 유지하는 디술피드의 효과를 적합하게 모방할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용되는 테더는 화학적으로 반응성인 기능성 기를 제공하고, 2개의 시스테인 황 원자 사이에 상기 종류의 테더를 포함하는 단백질은 본원에서 활성화 단백질로 언급된다. 페이로드는 테더 상의 기능성 기를 사용하여 활성화 단백질에 부착될 수 있다. 단백질의 티올을 디할로아세톤과 반응시킴으로써 형성된 테더는 예를 들어 접합을 위한 부위로서 카르보닐을 제공한다. 적합한 아민 (아민화 페이로드), 바람직하게는 아미노옥시 또는 히드라진을 함유하는 페이로드는 페이로드의 아민 관능기와 테더의 카르보닐기 (케톤) 사이에 쉬프 염기를 형성함으로써 상기 활성화 단백질에 쉽게 접합될 수 있다. 과정은 적합하게 반응성인 -NH2 기를 포함할 경우 비변형된 페이로드 분자를 사용할 수 있거나, 또는 반응성 아민, 예컨대 -ONH2는 필요한 경우 통상적인 방법에 의해 페이로드에 부착될 수 있다.
이들 방법은 하나 이상의 접근가능한 디술피드 연결을 갖는 임의의 단백질에 적용될 수 있고, 분자량이 500 Da 초과, 일반적으로 2,000 Da 초과인 천연 단백질에 대해 일반적으로 유용하고, 여기서 디술피드는 단백질의 천연 또는 활성 형태로 존재한다. 이 방법은 하나 초과의 디술피드, 예컨대 2-10개, 또는 일반적으로 6개 이하의 디술피드기를 포함하는 단백질과 함께 사용될 수 있고, 여기서 디술피드기 중 중 적어도 하나는 통상적인 디술피드 환원제에 의해 환원되기에 충분히 표면 접근가능하다. 이들 방법은 이용되는 각각의 디술피드기에 대해 적어도 하나의 페이로드를 포함하는 접합체를 생산하고, 테더는 실질적으로 단백질의 천연 또는 활성 입체형태를 보유한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2개의 시스테인 잔기를 함께 묶고, 단단한 입체형태를 제공함으로써 단백질을 고정하는 방법을 제공하고, 여기서 고정 방법은 고정된 단백질을 페이로드에 접합하기 위해 추후에 사용가능한 케톤-함유 연결을 사용하여 2개의 시스테인을 함께 묶는다. 고정은 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질을 디할로케톤, 예컨대 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤과 반응시켜 [cys1]-S-CH2-C(=O)-CH2-S-[cys2] 연결을 포함하는 고리화된 단백질을 형성시킨 후, 연결을 화학식 H2N-X-L-PL의 아미노옥시 또는 히드라지노 화합물과 반응하도록 하여 추가의 본원에서 설명되는 바와 같은 쉬프 염기 형성 (옥심 및 히드라존 포함)을 통해 접합체를 형성시킴으로써 달성된다. 본 발명은 이들 고정된 접합체 및 대응하는 접합된 펩티드의 제조 방법을 포함한다.
도 1은 디술피드-함유 단백질로 시작하고 단백질-페이로드 접합체를 제공하는 본 발명의 실시양태를 예시하는 모식도이다.
도 2는 상보적 커플링 기를 그의 페이로드로서 갖는 2개의 단백질-페이로드 접합체의 커플링을 보여준다.
도 3은 실시예 1의 출발 단백질, 활성화 단백질 및 단백질 접합체에 대한 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 실시예 1의 아지도 치환된 CRM197 구축물에 대한 SDS Page 겔 분석을 보여준다.
도 5는 실시예 4에 대한 활성화 단백질의 모식도 및 활성화 (케톤-변형된) 단백질에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 6은 실시예 4에서 설명되는 단백질-페이로드 접합체의 모식도 및 생성물에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 7은 실시예 6, 방법 A의 접합체 및 환원된 접합체의 겔, 비교를 위해 수반되는 분자량 래더를 보여준다. 이것은 또한 방법 B의 생성물의 LC-MS를 보여주고, 이것은 몇몇의 상이한 접합체의 형성을 보여준다.
도 8은 실시예 7의 단계 1; 단계 2, 방법 A (PL1); 및 단계 2, 방법 B (PL2)의 생성물에 대한 LC-MS 데이터를 보여준다.
도 9는 실시예 8의 생성물에 대한 SDS PAGE 겔 및 LC-MS 데이터를 보여준다.
본원에서 사용될 때 '단백질' 및 폴리펩티드는 아미드 (펩티드) 결합에 의해 연결된 5개 이상, 일반적으로 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 의미한다. 일반적으로 본원에서 설명되는 단백질은 주로 또는 오직 자연 발생 아미노산을 포함하지만, 방법은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드와 함께 동등하게 유용하다. 통상적으로 (반드시는 아니지만) 아미노산은 대부분 또는 완전히 L 입체형태이고, 통상적인 '필수' 아미노산으로부터 선택된다.
약어
DAR 약물 대 항체 비
DCM 디클로로메탄
DIC 디이소프로필 카르보디이미드
DIPEA 디이소프로필 에틸 아민
EDT 에탄 디티올
HBTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄
헥사플루오로포스페이트
MeCN 아세토니트릴
NMP N-메틸 피롤리디논
PBS 포스페이트-완충 염수
TCEP 트리스(카르보에톡시에틸)포스핀
TFA 트리플루오로아세트산
TIPS 트리이소프로필 실란
본 발명의 한 실시양태의 예를 도 1에 제시한다. 도면은 노출된 디술피드기를 갖는 음영을 넣은 원 또는 구체로서 제시된 단백질을 보여준다. 디술피드는 환원되어, 디술피드로부터 유래된 2개의 유리 티올을 갖는 환원 단백질을 형성한다. 이어서, 환원 단백질은 디할로아세톤 또는 유사한 비스-친전자체 (예를 들어, 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤)과 반응시켜 활성화 단백질을 형성하고, 여기서 2개의 티올은 관능화 테더를 통해 함께 연결되고: 이 예에서 테더는 쉬프 염기 형성을 향하여 비교적 반응성인 유리 카르보닐기를 함유한다. 이어서, 페이로드 분자는 쉬프 염기 형성을 통해 활성화 단백질의 테더에 연결되어 단백질 접합체를 제공한다. 이 예에서 페이로드는 테더에 연결기를 통해 부착된다. PL이 페이로드 화합물인 화학식 H2N-X-L-PL의 화합물은 링커 L에 의해 PL에 연결된 활성화 아민기 (H2N-)를 함유하고, 아민은 케톤 카르보닐과 PL에 부착된 아민 사이의 쉬프 염기 형성을 촉진하는 아미노옥시 또는 유사한 활성화 아민, 즉 -X-NH2 (여기서 X는 O 또는 NH임)을 사용함으로써 특히 반응성으로 된다. 대체 실시양태는 2개의 유리 시스테인기를 갖는 단백질, 예컨대 도 1에서 환원 단백질로 시작하고, 이를, 페이로드가 고정된 단백질 상에 접합되는 부착점을 또한 제공하면서 단백질을 제한된 입체형태로 '고정'하기 위해 사용한다.
본 발명의 방법은 2개의 시스테인 사이에 적어도 하나의 디술피드 연결을 함유하거나 또는 1,3-디할로아세톤 반응물과의 반응에 의해 함께 연결될 수 있는 2개의 유리 시스테인 잔기를 함유하는 대부분의 단백질로부터 접합체를 형성하기 위해 사용하기에 적합하다. 일반적으로, 단백질은 2개의 티올이 본원에서 설명되는 조건 하에서 디클로로아세톤 또는 디브로모아세톤과 반응하여 2개의 티올의 적어도 50% 가교결합을 생성하는 것이고, 흔히 가교결합의 정도는 적어도 약 70%, 80% 또는 90%이다.
함께 연결되는 2개의 시스테인은 단일 폴리펩티드 상에 존재할 수 있거나, 또는 단백질 복합체를 형성하는 별개의 폴리펩티드 상에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 1-6 디술피드 연결, 또는 2-6 유리 시스테인 잔기를 갖는 단백질을 이용하고, 적어도 하나의 이들 디술피드의 환원을 수반한다. 디술피드-함유 단백질은 단일 폴리펩티드 서열 내에 디술피드 연결을 함유하는, 적어도 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산을 갖는 임의의 폴리펩티드, 또는 디술피드가 황 원자 사이에 테더의 삽입을 위해 환원될 때 복합체가 빨리 해리되지 않으면, 디술피드가 하나의 폴리펩티드 서열을 또 다른 아미노산 또는 폴리펩티드에 연결하는 단백질 복합체일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 전형적인 단백질은 기능성 단백질, 예컨대 효소 또는 수용체를 포함하는, 약 5 내지 약 5000개의 아미노산, 일반적으로 적어도 10개의 아미노산 내지 약 1000개 이하의 아미노산을 함유하는 시클릭 펩티드 및 선형 펩티드; 적어도 하나의 디술피드 연결 (종종 2개의 별개의 폴리펩티드 가닥을 연결하는)을 갖는 단백질 복합체; 구조 단백질; 백신 스캐폴드로서 사용되는 단백질, 예컨대 CRM197 또는 아주반트 활성을 갖는 다른 단백질; 및 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 이들 방법에 특히 유용한 단백질은 항체, 특히 조작된 항체, 변형된 항체 및 항체 단편을 포함하는 모노클로날 항체; 백신 담체 단백질, 예컨대 CRM197; 및 적어도 하나의 디술피드 연결 또는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 갖고 분자량이 500 내지 500,000, 일반적으로 1,000 내지 200,000인 단일 가닥 단백질을 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입하기 위해 항체 또는 다른 단백질을 조작하는 방법, 및 항체를 변형하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
방법은 4개 이하의 접근가능한 디술피드 결합을 갖는, IgG를 비롯한 항체 및 항체 단편을 사용할 때 특히 유용하다. 방법은 또한 백신 담체 단백질, 예컨대 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소(197)의 비-독성 교차 반응성 물질 (CRM197), 파상풍 톡소이드, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis) 외막 단백질, 및 비-분류가능 에이치. 인플루엔자-유래 단백질 D를 사용할 때 특히 유용하다. 이들 백신 담체 단백질은 공지의 방법 및/또는 본원에 개시된 방법에 의해 항원으로 기능화될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 향상된 면역 반응을 제공하도록 아주반트 화합물, 예컨대 TLR 효능제 (TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, 또는 TLR9의 리간드), 예를 들어 이미퀴모드, 이미다조퀴놀린, 및 가르디퀴모드, PRR 리간드, RLR 리간드, NOD2 리간드, 시클릭 디-AMP, 시클릭 디-GMP, 플라겔린, 모노포스포릴 지질 A, N-글리콜화 무라물디펩티드, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN), 트리아실화 지단백질, 또는 폴리 (I:C)에 부착하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 디술피드-함유 단백질의 디술피드 연결은 환원되어 2개의 유리 티올기를 형성하고: 상기 환원 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 몇몇 실시양태에서, 환원은 단백질 주위의 용매에 쉽게 접근가능한 디술피드 연결을 선택적으로 환원시키는 환원제를 사용하여 수행하고: 하나의 적합한 환원제는 트리스(2-카르보에톡시)포스핀 (TCEP) 및 그의 염이다 (문헌 [Analytical Biochemistry 273, 73-80 (1999)] 참조). 다른 알려진 디술피드-환원제, 예컨대 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 시스테아민, 및 디티오부틸아민 ([JM Perkel, Chem. Eng'g News, Feb. 29, 2012]; [Lukesh, et al., J. Am. Chem. Soc, 134, 4057-59 (2012)]) 및 트리알킬 포스핀, 예컨대 트리부틸 포스핀 (WO2008/157380)도 사용될 수 있다. 단백질 내의 디술피드를 환원시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
테더링 연결의 카르보닐과 쉬프 염기를 형성하는 질소를 부가된 모이어티 (-L-PL)의 연결기-페이로드 부분에 연결하는 기 'X'는 산소일 수 있거나, 또는 임의로 치환된 질소일 수 있다. X가 산소 (O)일 때, 연결은 일반적으로 생체내에서 안정한 옥심을 포함한다. 연결기 L은 X를 적어도 하나 및 임의로 2개 이상의 페이로드 기에 연결하고; 예를 들어 부분 -L-PL은 단일 변형된 디술피드가 단백질을 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 페이로드 분자에 연결하도록 -CH(CH2O-PL)2일 수 있다. X가 질소일 때, 이것은 -NH일 수 있거나 또는 -NR일 수 있고, 여기서 R은 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸)이고; 별법으로, 질소는 -N-L-PL일 수 있고, 따라서 2개의 링커-페이로드 모이어티를 보유한다. 후자의 실시양태에서, 2개의 링커는 동일하거나 상이할 수 있고, 2개의 페이로드는 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 링커와 페이로드 둘 모두가 동일하고, 따라서 그 결과는 단일 테더링 연결은 2개의 동일한 페이로드를 보유한 접합체이다:
Figure pct00001
다른 실시양태에서, 2개의 링커 및 2개의 페이로드는 상이하고, PL1 및 PL2는 심지어 상이한 페이로드 부류에 속할 수 있다.
연결기 L은 페이로드 화합물을 -X-NH2에 연결하는 임의의 적합한 유기 연결일 수 있다. 적합한 연결의 몇몇 예는 다음을 포함한다: [X]-(CH2)1-6-[PL]; [X]-CH2C(=O)-[PL]; [X]-CH2C(=O)-NH-[PL]; [X]-CH2C(=O)-O-[PL]; [X]-(CH2CH2O)n-[PL]; [X]-페닐-C(O)NH-[PL], [X]-(CH2)1-10-C(=O)-NH-(CH2)2-10-NH-C(=O)-(CH2)0-10-(OCH2CH2)0-10-(AA)0-10-[PL] (AA는 임의의 필수 아미노산, 예를 들어 glu, gly, ala, asp 등일 수 있다) 등 (여기서 n은 일반적으로 1-20이고, [X] 및 [PL]은 각각 링커의 어느 말단부가 X에 및 PL에 부착되는지를 나타낸다). 몇몇 실시양태에서, 링커 L은 접합체에 대한 페이로드 로딩을 증가시키기 위해 부착된 2 또는 3개의 페이로드를 가질 수 있고, 하나 초과의 페이로드가 제시된 링커에 부착될 경우, 페이로드는 동일하거나 상이할 수 있다. 적합한 링커는 또한 이들 기의 성분의 조합을 포함하고: 링커의 특성은 본 발명의 실시에 중요하지 않고, 적어도 하나의 페이로드 PL에 대한 부착을 위한 방법의 편리성 및 이용가능성, 또는 접합체에 요구되는 물리화학적 특성을 기초로 할 수 있다. 적합한 링커의 선택은 통상의 기술 수준 범위 내에서 수행할 수 있고, 페이로드의 구조 및 링커 L에 부착시키기 위해 페이로드를 변경하기 위한 이용가능한 방법에 의해 결정된다. 일반적으로, 링커는 아미드 또는 에스테르기를 통해 하나 또는 둘 모두의 말단부에 부착되고; 자주 링커 L은 프로테아제 또는 에스테라제 활성에 의한 생체내 용해를 허용하는 펩티드 결합 또는 에스테르를 함유하고 (예를 들어, 카텝신 B에 의해 절단되는 val-cit 디펩티드, 또는 카텝신 B에 의해 또한 절단가능한 Gly-phe-leu-gly); 임의로 하나 이상의 에틸렌 옥시드 단위 (-OCH2CH2-)를 함유하고; 많은 실시양태에서 적어도 하나 내지 6개 이하의 아미노산 모이어티를 함유한다. L의 적합한 실시양태는 또한 다음 군으로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다:
(a) 결합, -O-, -S-, -S-S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
(b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 [여기서 Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 산소 원자가 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 탄소 원자에 의해 분리되도록 상기 모이어티 내에 분산된 하나 이상의 산소 원자를 임의로 포함함];
(c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 [여기서 Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH- 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된(C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨];
(d) -[OCH2CH2]v- [여기서 v는 1-2,000, 바람직하게는 1-10임]; 및
(e) 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 1-30 또는 1-6개의 아미노산을 포함하는 펩티드.
또한, L은 절단가능한 링커, 예컨대 Val-Cit (발린-시트룰린, 카텝신 B에 의해 선택적으로 절단된 디펩티드) 또는 val-cit-PABC (발린-시트룰린 p-아미노벤질카르바메이트 (Bioconjugate Chem. 19(10), 1960-63 (2008)), 디술피드, 또는 글루쿠로니다제에 의해 절단되는 링커, 예컨대 하기 화학식에 존재하는 링커이거나 이를 포함할 수 있다:
Figure pct00002
여기서 단백질은 접합을 위한 단백질을 나타내고, X는 상기 설명한 O 또는 NR이고, PL은 본원에서 설명되는 페이로드를 나타내고, 및 L1 및 L2는 독립적으로 선택적인 링커, 예컨대 상기 설명된 기 L이다 (ACS Med. Chem. Letters, vol. 1, 277-280 (2010)).
페이로드 (PL)는 단백질에 부착하기에 유용한 임의의 모이어티일 수 있다. 단백질에 유용하게 부착될 수 있는 화합물의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그 예는 사용자가 단백질의 위치를 찾고 확인할 수 있도록 하는 표지 모이어티, 예를 들어 금속 이온에 결합하여 접합체의 검출가능성을 제공하는 킬레이터; 단백질을 정제하거나 단리하거나 또는 이를 표면에 부착시키는 것을 용이하게 하는 결합 모이어티, 예컨대 비오틴 또는 아비딘, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 그의 단편, 5-15개의 아미노산 잔기 등을 함유하는 폴리-Arg 또는 폴리-lys; 특성-변형기, 예컨대 지방산 기 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 항원성 기, 예컨대 특정 종류의 세포 또는 박테리아에 특징적인 다당류 또는 세포 표면 단백질; 보다 복잡한 접합체, 예컨대 이중특이적 항체를 만들기 위해 변형된 단백질 또는 펩티드가 또 다른 분자에 부착될 수 있도록 하는 커플링 기 (도 2 참조); 및 생활성 화합물, 예를 들어 RNA, DNA, mRNA, siRNA과 같은 핵산 및 이들의 단편; 제약 화합물, 예컨대 다양한 치료 약물; 및 이들이 목적하는 효과를 생산할 수 있는 목적하는 조직 또는 세포에 단백질을 히치하이킹(hitchhiking)할 수 있는 방사선핵종 및 세포독소를 포함한다. 이들 히치하이킹 화합물은 단백질 또는 그의 일부에 접합된 상태로 존재하면서 작용할 수 있거나, 또는 연결기가 생체내에서 쉽게 절단될 수 있는 것일 경우에 단백질로부터 먼저 분리될 수 있다. 이들 방법에 사용하기 적합한 제약 페이로드는 미세관 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, 중격제, 세포내 신호전달 경로의 억제제, 키나제 억제제, 전사 억제제, 예컨대 siRNA, aRNA, 및 miRNA, 및 DNA 소홈 결합제를 포함하고; 이들 페이로드는 화합물 부류, 예컨대 메이탄시노이드, 오리스타틴, 아마니틴, 칼리케아마이신, 심베린, 듀오카르마이신, 안트라사이클린, 캄토테신, 독소루비신, 탁솔, 피롤로벤조디아제핀 등을 포함한다.
치료 또는 진단 용도를 갖는 상기 제약 페이로드의 구체적인 예는 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 미트라마이신, 악티노마이신, 글루코르티코이드, 푸로마이신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 시타라빈, f-플루오로우라실, 플라틴, 스트렙토조토신, 미노마이신 C, 안트라사이클린, 닥티노마이신 또는 악티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신, 듀오카르마이신, 이포스파미드, 미톡산트론, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아니모테린, 멜팔란, 에스페라미신, 렉시트롭신, 오리스타틴 (예를 들어, 오리스타틴 E, 오리스타틴 F, AEB, AEVB, AEFP, MMAE, MMAF), 엘류토로빈, 네트롭신, 포도필로톡신, 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 DM1, 및 콤브레테스타틴을 포함한다.
페이로드로서 사용될 수 있는 적합한 커플링 기 (접합체를 또 다른 모이어티에 커플링하기 위해 사용될 수 있는 기)는 말레이미드, 티올, 알파-할로 케톤 (예를 들어, --C(=O)-CH2-X (여기서 X는 클로로, 브로모 또는 아이오도임)), 카르복실산, 아민, 히드록실, 알켄, 구리-미사용 '클릭' 화학에 사용될 수 있는 시클릭 옥틴을 포함하는 알킨, 아지드 등을 포함한다. 본 발명의 접합체를 상보적 커플링 기를 갖는 다른 화합물에 연결하기 위해 이들 커플링 기를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있고, 티올의 말레이미드에 대한 마이클 부가, 알파-할로케톤을 사용한 티올의 알킬화, 아민과 카르복실산 사이의 아미드 결합 형성, 1,2,3-트리아졸 고리를 형성함으로써 아지드를 알킨에 연결하기 위한 '클릭' 화학 (예를 들어, 문헌 [Meldal, et al., Chem Rev., vol 108, 2952-3015 (2008)] 참조), 및 '구리-미사용 클릭' 화학을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Meeuwissen, et al. Polymer Chemistry, vol. 3, 1783-95 (2012)]을 참조한다. '상보적' 커플링 기는 공유 결합을 형성하기 위해 쉽게 조합되는 2개의 커플링 기, 예컨대 상기 언급된 쌍 (아미드를 형성하는 카르복실레이트 + 아민; 1,2,3-트리아졸을 형성하는 아지드 + 알킨; 티올이 마이클 부가를 통해 이중 결합에 부가되는, 말레이미드 + 티올; 티올의 알킬화에 의해 알파-티오 케톤을 형성하는 알파-할로 케톤 + 티올 등)이다. 상보적 커플링 기를 함유하는 제2 접합체와 커플링되는 페이로드로서 커플링 기를 함유하는 접합체에 대한 예시가 도 2에 제시된다. 특정 예에서, 페이로드 (PL)로서 기능하는 커플링 기는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 할로겐, -C≡CH, -C=CH2, -OH, -SH, -SO2-CH=CH2, -O-NH2, -N3, -O-P(O)(OH)2, -C(O)-H, -C(O)-CH3, -NH-C(O)-CH2-I, 말레이미딜, 3,5-디옥소-1,2,4-트리아졸리딘-4-일, 1H-피롤-2,5-디온-1-일, 피리딘-2-일-디술파닐, 테트라히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-2(3H)-온-4-일, 1-카르보닐옥시-2,5-디옥소피롤리딘, 나트륨 1-카르보닐옥시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술포네이트, -SSR1, -C(O)-OR1-, -N(R1)H, -NH-N(R1)H (여기서 R1은 H 또는 (C1-C6)알킬임), 및 -C(O)-R2 (여기서 R2는 H, (C1-C4)알킬, 할로-치환된 (C1-C4)알킬, -CH=CH2, N(R1)H, 또는 -NH-N(R1)H임). 이들 페이로드가 초기 페이로드 (PLa)로서 사용될 때, 접합체는 제2 페이로드 (PLb)를 포함하는 화합물과 반응할 수 있고, 새로운 접합체를 형성할 때 추가의 링커 L'를 도입할 수 있다:
Figure pct00003
PLa는 커플링 기, 예를 들어 말레이미드, 보호된 티올, N3, 알킨이고,
R은 PLa에 대한 상보적 반응성 기이고,
PLb는 새로운 페이로드, 예컨대 표지 또는 단백질, 항체, si-RNA, 독소를 포함하는 생물학적 물질 등이다.
이들 반응에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 L 및 L'가 새로운 페이로드 PLb를 연결하기 위해 사용되는 반응에 따라 PLa 및/또는 R의 일부를 보유할 수 있음을 이해할 것임에 유의한다.
다음과 같이 열거되는 실시양태는 본 발명의 특정 측면을 예시한다.
1. 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질로부터 단백질-페이로드 접합체를 형성하는 방법이며,
a) 관능화 테더링 화합물이 단백질 상의 2개의 유리 티올기와 반응하여 2개의 티올기가 관능화 테더에 의해 함께 공유 연결된 활성화 단백질을 형성하는 조건 하에 단백질을 관능화 테더링 화합물과 접촉시키고;
b) 관능화 테더가 페이로드에 이미 연결되어 있지 않으면, 페이로드와 관능화 테더의 공유 부착을 형성하기 위해 활성화 단백질을 관능화 페이로드 화합물과 접촉시켜 단백질-페이로드 접합체를 형성시키는 것
을 포함하는 방법.
몇몇 실시양태에서, 단백질은 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인을 갖고, 디술피드는 단백질을 관능화 테더링 화합물과 접촉시키기 전에 환원된다. 다른 실시양태에서, 단백질은 관능화 테더링 화합물에 의해 함께 묶이기 위해 서로 충분히 접근할 수 있는 2개의 유리 시스테인 (즉, 유리 -SH기를 갖는 시스테인)을 갖는다. 각각의 경우에, 관능화 테더링 화합물은 2개의 시스테인 잔기와 반응하여 이들은 함께 묶고, 단백질의 입체형태에 대한 제한을 제시한다. 2개의 시스테인이 디술피드로부터 유래할 때, 황 원자 사이에서 테더에 의해 제시되는 제한은 디술피드의 환원에 의해 상실된 제한을 유용한 정도로 모방하고, 이것은 단백질을 요구되는 또는 생활성 입체형태로 유지할 때 종종 중요하다.
관능화 테더링 화합물은 단백질이 일반적으로 약 0 내지 50℃의 온도에서 수성 완충 매질에서 안정한 및 가용성인 조건 하에서 티올 (시스테인의 -SH)과 쉽게 반응하여 시스테인의 술프히드릴과 테더링 화합물의 프레임워크 사이에 공유 결합을 형성하는 2개의 반응성 기를 갖는 화합물이다. 관능화 테더링 화합물은 또한 페이로드를 포함하는 또 다른 모이어티를 접합하기 위해 사용될 수 있는 카르보닐과 같은 추가의 기능성 기를 갖거나, 또는 페이로드에 이미 부착되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 관능화 테더링 화합물은 1,3-디할로아세톤, 일반적으로 1,3-디클로로- 또는 1,3-디브로모-아세톤이다.
2. 실시양태 1에 있어서, 단백질이 관능화 테더링제와 접촉되기 전에 디술피드 연결에 의해 함께 연결된 2개의 시스테인 잔기를 갖고, 디술피드가 실시양태 1의 단계 a)에 사용하기 위한 2개의 유리 시스테인 잔기를 갖는 단백질을 제공하기 위해 환원되는 것인 방법. 디술피드의 환원 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있고, 본원에서 설명된다. 특정 실시양태에서, 디술피드는 단백질을 특정 입체형태로 유지하는 것을 돕는 매립된 디술피드를 환원시키지 않으면서 용매-노출된 디술피드를 선택적으로 환원시킬 수 있는 TCEP와 같은 선택적 환원제로 환원된다.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 관능화 테더링 화합물이 디할로아세톤 유도체이고, 단백질-페이로드 접합체에서 황 원자를 함께 연결하는 관능화 테더가 -CHR-C(=Z)-CHR-이고, 여기서 Z는 O 또는 NR'이고, 각각의 R은 독립적으로 H, 페닐, C1-C4 알콕시, 또는 C1-C4 알킬이고, R'는 페이로드에 부착된 연결기인 방법. R'는 따라서 화학식 -L-PL의 기일 수 있고: R'에 대해 적합한 연결기 (L) 및 페이로드 (PL)는 본원에서 설명된다. 특정 실시양태에서, 관능화 테더링 화합물은 1,3-디클로로아세톤 또는 1,3-디브로모아세톤이고, Z는 O이다.
4. 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 관능화 페이로드가 화학식 H2N-O-L-PL 또는 H2N-NR'-L-PL의 화합물이고, 여기서 L은 연결기이고; PL은 적어도 하나의 페이로드 분자인 방법.
5. 실시양태 1-3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 관능화 페이로드가 화학식 H2N-O-L-PL의 화합물인 방법.
6. 실시양태 1에 있어서, 활성화 단백질이 하기 화학식의 적어도 하나의 케톤을 포함하는 것인 방법.
Figure pct00004
여기서 원은 단백질이고, 각각의 황 원자는 단백질의 시스테인 잔기의 술프히드릴로부터 유래한다.
7. 실시양태 1-6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질-페이로드 접합체가 하기 화학식의 기를 포함하는 것인 방법.
Figure pct00005
여기서 X는 O 또는 NH이고, L은 링커이고, PL은 적어도 하나의 페이로드 기이다.
8. 실시양태 1-7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질이 항체인 방법. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 단편일 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 PEG화에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이고, 항체와 연관된 생물활성을 보유하면서 하나 이상의 잔기를 변형하도록 조작될 수 있고; 항체 조작 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.
9. 실시양태 1-7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질이 백신 담체인 방법.
10. 실시양태 1-8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 치료제를 포함하는 것인 방법.
11. 실시양태 1-8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 검출가능한 표지 또는 결합기를 포함하는 것인 방법. 적합한 결합기는 접합체가 특정 세포 종류에 결합할 수 있도록 하는 세포 표면 마커 (예를 들어, 다당류 또는 단백질), 및 단백질 또는 접합체를 표면, 세포, 또는 세포내 소기관에 결합시키기에 유용한 것으로 알려진 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 결합기를 포함한다.
12. 실시양태 9에 있어서, 페이로드가 항원을 포함하는 것인 방법. 일반적으로, 항원은 면역 반응을 유발하기 위해 접합체에 부착된 박테리아 또는 바이러스 항원일 것이다.
13. 실시양태 8에 있어서, L이 절단가능한 연결 모이어티를 포함하는 것인 방법. Val-Cit, Val-Cit-PABC, Gly-phe-leu-gly, 및 글루쿠로니다제-절단가능 기, 예컨대 본원에서 설명되는 기가 적합하다.
14. 실시양태 1-13 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 방법. 몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산이 포함될 수 있다.
15. 실시양태 1-14 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 스페이서를 포함하는 것인 방법:
(a) 결합, -O-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
(b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 [여기서 Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 상기 모이어티 내에 분산된 1-10개의 산소 원자를 임의로 함유함];
(c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 [여기서 Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH- 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된(C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨];
(d) -[OCH2CH2]v- [여기서 v는 1-2,000임]; 및
(e) 1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드.
16. 하기 화학식의 단백질-페이로드 접합체.
Figure pct00006
여기서 원은 적어도 5개의 아미노산을 갖는 단백질이고;
X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2, 또는 O이고;
L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고;
PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티이다.
17. 실시양태 16에 있어서, X가 O인 단백질-페이로드 접합체.
18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 단백질이 항체인 단백질-페이로드 접합체.
19. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 단백질이 백신 담체인 단백질-페이로드 접합체.
20. 실시양태 16-18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페이로드가 치료제, 검출가능한 표지, 항원 또는 결합기인 단백질-페이로드 접합체.
21. 실시양태 16-20 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 절단가능한 링커를 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
22. 실시양태 16-21 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
23. 실시양태 16-22 중 어느 한 실시양태에 있어서, L이 화학식 (CH2)1-6 또는 (CH2CH2O)1-4의 적어도 하나의 스페이서를 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
24. 디술피드 결합을 함유하는 단백질을 안정화하거나 또는 단백질을 요구되는 입체형태로 제한하는 방법이며,
(a) 디술피드 결합을 환원시켜 2개의 유리 티올기를 형성하고,
(b) 2개의 티올기를 함께 연결하는 -CH2-C(=N-X-L-PL)-CH2- 연결을 도입하는 것
을 포함하고, 여기서 X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2, 또는 O이고; L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고; PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티인 방법.
25. 실시양태 24에 있어서, 연결 -CH2-C(=O)-CH2-가 2개의 유리 티올을 함께 연결하기 위해 사용된 후, 연결의 카르보닐이 화학식 H2N-X-L-PL의 기와 반응하는 것인 방법.
26. 고리화된 단백질 접합체를 형성하기 위해 2개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 단백질을 고정하는 방법이며,
(a) 단백질의 일부를 고리화하기 위해 2개의 시스테인 잔기의 티올기를 함께 연결하는 -CH2-C(=O)-CH2- 연결을 도입하고,
(b) 고리화된 단백질의 고정된 접합체를 형성하기 위해 고리화된 단백질을 화학식 H2N-X-L-PL의 아민화 페이로드와 접촉시키는 것
을 포함하고, 여기서 X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2, 또는 O이고; L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고; PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티인 방법.
27. 실시양태 26에 있어서, 1,3-디할로아세톤이 2개의 시스테인 티올을 -CH2-C(=O)-CH2- 연결과 함께 연결하기 위해 사용된 후, 연결의 카르보닐이 화학식 H2N-O-L-PL의 아민화 페이로드 화합물과 반응하는 것인 방법.
본 발명의 방법은 도 1에 요약한 바와 같이, 변형되는 단백질의 디술피드를 환원시켜 2개의 유리 티올기를 함유하는 환원 단백질을 형성하는 것을 수반한다. 환원 단백질은 페이로드를 부착시키는데 적합한 테더 상의 적어도 하나의 기능성 기를 또한 보유하면서, 유리 티올을 함께 테더링하기 위해 환원 단백질 상의 유리 티올 둘 모두와 반응할 수 있는 관능화 테더링 화합물과 접촉된다. 몇몇 실시양태에서, 테더 상의 기능성 기는 카르보닐기, 예를 들어 유리 티올이 1,3-디할로케톤과 반응하도록 할 때 얻은 케톤이다. 유리 티올은 강한 친핵성이기 때문에, 이들은 이탈기 대체 및 공유 황-탄소 결합 형성을 수반하는 비가역적인 반응을 통해 쉽게 친전자체, 예컨대 알킬 할라이드 또는 알킬 토실레이트와 반응한다. 관능화된 카르보닐-함유 테더링 화합물의 몇몇의 적합한 예는 1,3-디클로로아세톤 및 1,3-디브로모아세톤을 포함한다. 이들 시약은 술프히드릴을 함께 테더링함으로써 작은 시클릭 펩티드 내의 디술피드 모이어티의 안정화를 제공하기 위해 사용되었다. 예를 들어, WO2008/157380 (디클로로아세톤과 환원된 시클릭 펜타펩티드의 반응, 이어서 카르보닐의 환원)을 참조한다. 1,3-디히드록시아세톤의 술포네이트 (예를 들어, 메실레이트, 트리플레이트, 페닐술포네이트, 토실레이트 등)도 사용될 수 있다. 이들 시약은 함께 테더링되는 2개의 시스테인 잔기를 갖는 활성화 단백질을 형성하기 위해 합리적으로 신속한 반응을 제공하도록 환원 단백질의 유리 티올을 향해 충분히 반응성이고, 여기서 각각의 유리 티올은 관능화 테더링 기에 공유 부착된다.
환원 단백질 및 관능화 테더링 화합물은 테더링 화합물과 환원 단백질의 2개의 유리 티올 사이의 반응을 촉진하기에 적합한 조건 하에, 특히 이전에 디술피드 결합으로 연결된 2개의 유리 티올이 테더링 화합물의 단일 분자와 반응하여 함께 다시 한번 묶이지만 이제는 직접적인 디술피드 결합 대신에 이들을 연결하는 짧은 테더를 갖도록 하기에 유리한 농도 및 온도의 조건 하에 접촉된다. 상기 반응은 도 1에 도시된 바와 같이, 2개의 황 원자 사이에 관능화 테더 [-CH2C(O)-CH2-]를 갖는 활성화 단백질을 형성한다. 도 1에서 테더는 순수하고 효율적인 쉬프 염기 형성 화학을 통해 페이로드를 효율적으로 부착하기 위해 사용될 수 있는 카르보닐을 포함한다.
본 논의 전체에 걸쳐, 단백질은 원 또는 구체로 도시되지만, 10개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드 또는 2개 이상의 서브유닛 또는 별개의 단백질의 큰 효소 또는 복합체일 수 있음이 이해된다. 디술피드의 2개의 황 원자는 다량체 복합체의 하나의 서브유닛 상에 존재할 수 있거나, 또는 상이한 서브유닛 상에 존재할 수 있다. 본원에서 설명되는 변환에 참여하는 디술피드 이외에, 단백질은 또한 환원 및 관능화될 수 있거나, 또는 단백질 내의 그의 위치에 의해 환원되지 않을 수 있는 다른 디술피드 연결을 함유할 수 있다. 단지 단일 디술피드, 테더링기, 또는 접합만이 제시되지만, 하나의 상기 디술피드, 테더링기 또는 접합을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질이 하나 초과를 함유할 수 있음도 이해된다. 본 발명의 방법은 종종 단백질의 전체적인 형태 및 관능기를 유지하기 위해 또는 2개의 서브유닛을 다중-서브유닛 복합체로 함께 연결된 상태로 유지하기 위해 필수적일 수 있는 '매립된' 디술피드를 환원시키지 않으면서 폴딩된 단백질의 표면 근처의 용매-접근가능한 디술피드 연결을 선택적으로 환원시키는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 초과의 관능화 테더링기를 함유할 수 있고, 따라서 일반적으로 명료함을 위해 단지 하나만 도시된 경우에도 하나 초과의 접합 부위를 함유할 수 있다.
일단 활성화 단백질이 형성된 후, 페이로드는 관능화 테더에 부착될 수 있다. 예를 들어, 아민-함유 (또는 아민화) 페이로드는 페이로드의 아민과 테더의 케톤 사이에 쉬프 염기를 형성함으로써 디할로아세톤으로부터 형성된 테더에 부착될 수 있다. 적합한 페이로드 화합물은 접근가능하고 반응성인 -NH2 아민기를 함유하고; 바람직한 실시양태에서, 아민은 쉬프 염기 형성을 향해 활성화된 것이다. 적합한 아민의 예는 예를 들어 옥시아민 (X = O), 티오아민 (X = S), 및 히드라진 (X = NH)을 포함하고: 이들 헤테로원자-치환된 아민은 케톤, 예컨대 도 1에 도시된 디할로아세톤으로부터 형성된 활성화 단백질의 테더 상의 것과 쉽게 축합되는 것으로 알려져 있다.
활성화 단백질은 일반적으로 활성화 단백질의 정제 또는 단리 없이 아미노-함유 페이로드와 접촉된다. 페이로드 (PL) 상의 유리-NH2 기는 이용가능한 경우 사용될 수 있지만, 이용가능하지 않을 경우에는 도 1 및 실시예에 예시된 바와 같은 연결기를 통해 부가될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 일단 활성화 단백질이 생성되면, 아미노-페이로드를 활성화 단백질이 요구되는 쉬프 염기의 형성을 촉진하는 조건 하에 형성된 반응 혼합물에 첨가된다. 이어서, 아미노-페이로드는 도 1에 도시된 바와 같이 그의 아민기를 통해 활성화 단백질의 카르보닐과 반응하여, X가 O, NH 또는 치환된 N이고; L이 연결기이고; PL이 페이로드인 목적하는 단백질-페이로드 접합체를 형성한다.
실시예
다음 HPLC 방법을 아래 실시예에서 사용한다.
방법 A: 용리액 A: 물+0.1% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴+0.08% 포름산
구배: 2 min 내에 3에서 80% B - 유동 1.0 ml/min. 칼럼: 프로스위프트 모노리쓰(Proswift Monolith) 4.6*50 mm 40℃
방법 B: 용리액 A: 물+0.1% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴+0.04% 포름산
구배: 2 min 내에 3에서 80% B - 유동 1.0 ml/min. 칼럼: 프로스위프트 모노리쓰 4.6*50 mm 40℃
방법 C: 용리액 A: 물+3.75 mM 아세트산암모늄+2% 아세토니트릴, 용리액 B: 아세토니트릴
구배: 1.7 min 내에 2에서 98% B - 유동 1.0 ml/min. 칼럼: 액퀴티(Acquity) CSH 2.1*50 mm 50℃
방법 D (HRMS): 용리액 A: 물+0.05% 포름산+3.75 mM 아세트산암모늄, 용리액 B: 아세토니트릴+0.04% 포름산
구배: 4.4 min 내에 2에서 98% - 유동 1.0 ml/min. 칼럼: 액퀴티 CSH 2.1*50 mm 50℃
링커의 합성
Figure pct00007
100 mL 유리용기 내의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (1.55 mmol/g) (0.500 g, 0.775 mmol)를 DCM (20 ml) 내에서 30 min 동안 팽창시키고, 유출시켰다. NMP (7 ml)/DCM (4 ml) 내의 2-(아미노옥시)아세트산 헤미히드로클로라이드 (0.338 g, 3.10 mmol) 및 DIPEA (1.354 ml, 7.75 mmol)의 현탁액을 수지에 첨가하고, 5 h 동안 진탕하였다. 용매를 유출시켰다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1, 40 mL), DCM (50 mL), NMP (50 mL) 및 DCM (50 mL)로 각각 세정하였다. 생성되는 수지를 KOH/NaOH를 사용하여 밤새 건조시켰다.
Figure pct00008
100 mL 유리용기 내의 수지 (0.775 mmol)를 DCM (20 ml) 내에서 30 min 동안 팽창시키고, 유출시켰다. NMP (8 ml) 내의 (9H-플루오렌-9-일)메틸 2-아미노에틸카르바메이트 히드로클로라이드 (0.081 g, 0.775 mmol), HOAt (0.422 g, 3.10 mmol) 및 DIPEA (1.354 ml, 7.75 mmol)의 현탁액 내에 NMP (2.5 ml) 내의 HBTU (1.176 g, 3.10 mmol)을 첨가하고, 이것을 RT에서 2h 동안 진탕하였다. 용매를 유출시키고, 수지를 NMP (10 mL) 및 DCM (10 mL)로 순차적으로 세정하였다. 생성되는 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00009
수지 (0.775 mmol)을 반응 용기에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. 용매를 유출시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)을 첨가하고, 20 min 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 mL) 내의 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol) 및 1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오산 (0.896 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (1 ml) 내의 DIC (0.362 ml, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 h 동안 실온에서 교반하고, 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 세정하였다. 생성되는 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00010
수지 (0.775 mmol)를 반응 용기에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)를 수지에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. 용매를 유출시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (v/v)을 첨가하고, 20 min 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 ml) 내의 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol) 및 Fmoc-Glu-OtBu (0.989 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (2.00 ml) 내의 DIC (0.362 ml, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 h 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 세정하였다. 생성되는 수지를 밤새 건조시켰다.
페이로드를 링커에 부착시킴
Figure pct00011
수지 (2-클로로트리틸 클로라이드 수지, 0.775 mmol)를 반응 용기에 채웠다. 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (0.775 mmol, v/v)를 수지에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. 용매를 유출시킨 후, 추가의 10 mL의 20% 피페리딘/NMP (0.775 mmol)를 첨가하고, 20 min 동안 실온에서 교반하였다. NMP (8 mL) 내의 18-tert-부톡시-18-옥소옥타데칸산 (0.862 g, 2.325 mmol) 및 HOAt (0.316 g, 2.325 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, NMP (2.00 ml) 내의 DIC (0.362 mL, 2.325 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 h 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하고, NMP (10 ml)로 4회 세정하였다. 생성되는 수지를 밤새 건조시켰다.
Figure pct00012
선행 단계로부터의 수지 (0.775 mmol)를 실온에서 1.5 h 동안 20 mL의 절단 칵테일 (TFA/TIPS/물 = 95/2.5/2.5, v/v)로 처리하였다. 수지를 여과하여 제거하고, TFA로 세정하였다. 여과물을 진공에서 농축시켰다. 15-50% MeCN/물 + 0.1% TFA로 용리시키는 C18 칼럼을 사용하는 RP-HPLC로 2,2,2-트리플루오로아세트산을 함유하는 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 (1:1) (207 mg, 0.294 mmol, 37.9% 수율) (PL1)을 제공하였다. HRMS[M+1] (방법 D); 704.4459 (관측치), 704.4486 (예상치).
실시예 1
CRM197 (문헌 [G. Giannini and R. Rappuoli, Nucleic Acids Res., 1984, 25, 4063] 참조)을 TCEP (xx)로 처리하였고, 이것은 C201-C185 디술피드의 환원을 일으켰고, C451-C471 디술피드의 환원은 거의 또는 전혀 없었다 (실시예 3 참조). 환원된 CRM197을 1,3-디클로로아세톤으로 처리하여, 무손상의 C451-C471을 갖고 C201은 -CH2-C(=O)-CH2-연결을 통해 C185에 테더링된 활성화 단백질을 제공하였다. 상기 활성화 단백질을 PL1 (아미노옥시기를 함유하는 아민화 지방산 유도체, 이의 제조는 상기 설명되어 있다)과 접촉시켜, 지방산 유도체를 단백질에 연결하는 옥심을 형성하였다. 부착된 지방산기를 갖는 접합체는 신 청소를 감소시키고, 따라서 CRM197 단백질의 순환 반감기를 연장시키고 접합체 백신에서 담체로서 그의 유용성을 증가시키는 것으로 예상된다. 천연 단백질 (도 3A, 방법 A 이용), 활성화 단백질 (도 3B) 및 단백질 접합체 (도 3C)에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 도 3에 제공한다.
Figure pct00013
CRM197을 보유하는 부위-한정 아지도 화합물의 합성
방법 A -
용리액 A: 물+0.1% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴+0.1% 포름산
구배: 2 min 내에 3에서 80% B - 유동 1.8 ml/min. 칼럼: 액퀴티 BEH300 SEC 4.6x30 mm 50℃
SDS Page 겔 분석 - NuPage 4-12% 비스-트리스 겔; 1.5 mm*10 웰
Figure pct00014
인산나트륨 완충제 pH 7.4 (230 ㎕) 내의 CRM197 (32.5 mg/ml) (185 ㎕, 0.103 μmol)에 TCEP HCl (물 중 3 mg/mL, 58.9 ㎕, 0.616 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16 h 동안 교반한 후에, 1,3-디클로로프로판-2-온 (DMSO 중 20 mg/mL, 13.04 ㎕, 2.054 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 3.5 h 동안 교반한 후, 0.5 mL 제브라(Zeba)™ 스핀 (spin) 크기 배제 칼럼 (7K MWCO, 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 통해 통과시키고, 0.1 M 인산나트륨 완충제 pH 6 내에 완충제 교환하여 케톤-보유 CRM197 (6.78 mg/ml, 1.3 mL, 나노드롭(nanodrop) 방법)을 얻었다.
LCMS [M+1] = 58465
Figure pct00015
케톤-변형된 CRM197 (6.78 mg/ml - 인산나트륨 완충제 pH 6, 1.3 mL, 0.151 μmol)의 용액 내에 O-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)히드록실아민 (300 mg/ml - DMSO) (0.044 mL, 0.045 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 36 h 동안 23℃에서 교반한 후, PBS 7.4로 용리시키는 5 mL 제브라™ 스핀 칼럼을 통해 통과시켜 표제 화합물 (4.41 mg/ml, 1.6 mL, 80% 수율, 나노드롭 방법)을 제공하였다.
LCMS [M+1] = 58682.5
도 4는 변형된 CRM197에 대한 SDS Page를 보여준다.
실시예 2
출발 물질 제조: pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH (디술피드 C6-C12) ( 8)의 합성
Figure pct00016
· 중간체 8a의 제조
(2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 Fmoc-F-OH의 로딩, Fmoc 제거 및 수지의 로딩의 결정)
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (40.0 g, 64.0 mmol)를 DCM (3x)로 세척하였다. DCM (400 mL) 및 DIPEA (44.7 mL, 256 mmol) 내의 Fmoc-F-OH (24.8 g, 64.0 mmol)의 용액을 첨가하고, 현탁액을 22 h 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17:2:1) (3x), DCM (3x), DMA (3x), DCM (3x)로 완전히 세척하였다. 이어서, 수지를 10 min 동안 피페리딘/DMA (1:4)의 혼합물 (400 mL)로 4회 처리한 후, DMA (2 x 180 ml)로 세척하였다. 수지의 로딩의 결정을 위해 피페리딘/DMA 용액 및 DMA 세척 용액을 수집하였다. 1 mL의 합한 용액을 MeOH로 500 mL로 희석하고, 299.8 nm에서 UV 흡광도는 A = 0.368인 것으로 측정되었다. 이것은 46.2 mmol의 Fmoc 양에 상응한다. 수지를 DCM (3x), DMA (3x), DCM (3x)로 완전히 세척하고, 진공 건조시켜 중간체 8a (50.7 g; 로딩 = 0.91 mmol/g)를 제공하였다.
· 중간체 8b의 제조 (선형 펩티드의 조립)
중간체 8a (2.64 g, 2.40 mmol)를 프리루드(Prelude)™ 펩티드 합성기 상에서 고상 펩티드 합성으로 처리하였다. 커플링을 다음과 같이 수행하였다:
Figure pct00017
· 중간체 8c의 제조 (보호기 제거를 이용하여 수지로부터 절단)
중간체 8b (2.40 mmol)를 DCM (4x)으로 조심스럽게 세척하였다. 95% 수성 TFA/EDT/TIPS (95:2.5:2.5)의 혼합물 (50 mL)을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 1 h 동안 진탕하였다. 절단 용액을 여과하고, 신선한 절단 용액 (35 mL)을 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 1 h 동안 진탕시킨 후, 절단 용액을 여과하였다. 신선한 용액 (35 mL)을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 1 h 동안 진탕하였다. 절단 용액을 여과하였다. 합한 절단 용액을 냉 헵탄/디에틸 에테르 (1:1)의 교반시킨 혼합물 (500 mL) 상으로 서서히 부어, 침전물을 제공하였다. 현탁액을 실온에서 2 h 동안 교반한 후, 침전물을 가라앉혔다. 상청액을 프릿을 사용하여 흡입시켰다. 잔류물을 냉 헵탄/디에틸 에테르 (1:1) (2 x 100 mL)로 세척하고, 상청액을 프릿을 사용하여 흡입시켰다. 고체를 고진공에서 건조시켜 중간체 8c를 회백색 고체 (3.75 g, 1.88 mmol)로서 얻었다.
시클릭 펩티드 8의 제조 (고리화 및 정제)
중간체 8c (3.75 g, 1.88 mmol)를 H2O (375 mL)에 용해시켰다. 교반시킨 용액에 AcOH 내의 50 mM I2 (45.1 mL, 2.26 mmol)의 용액을 일부씩 첨가하고, 용액을 10 min 동안 실온에서 교반하였다. H2O 내의 0.5 M 아스코르브산 (5.64 mL, 2.82 mmol)을 첨가하여 과량의 I2를 켄칭하였다. 용액을 거의 건조하도록 농축시켰다. 반응은 실온에서 2개 부분으로 수행하였다: 0.188 mmol 규모 및 1.69 mmol 규모. 정제를 위해 조 물질을 합하였다. 조 물질을 예비적 HPLC에 의해 정제하고, ACN/H2O로부터 동결건조시켜 화합물 8을 백색 고체 (1.53 g, 0.767 mmol)로서 얻었다.
순수한 생성물을 분석적 HPLC (분석 방법 C: tR=3.43 min) 및 UPLC-MS (분석 방법 B; 측정치: [M+3]/3=512.4; 계산치: [M+3]/3=512.6)에 의해 분석하였다.
본 실시예는 시클릭 펩티드 8을 사용하여 출발한 활성화 단백질의 형성을 예시한다.
Figure pct00018
시클릭 펩티드 8 (12 mg, 6.76 μmol)을 50 mM Na 포스페이트 완충제 pH 6.5 (1.5 ml) 내에 용해시키고, 여기에 실온에서 TCEP HCl (2.91 mg, 10.13 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1 h 동안 실온에서 교반하였다. 상기 용액에 실온에서 1,3-디클로로프로판-2-온 (4.29 mg, 0.034 mmol)을 첨가하고, 이것을 30 min 동안 실온에서 교반하였다. 0.1% TFA를 함유하는 15-60% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC로 활성화 단백질 8d (6 mg, 2.93 μmol, 43.4% 수율)를 제공하였다. HRMS[M+1] (방법 D); 1590.7911 (관측치), 1590.7912 (예상치).
위치 6 및 12 [C6-C12]에서 2개의 시스테인 사이에 -S-CH2-C(=Z)-CH2-S- 연결을 갖고 Z는 다음과 같은 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH:
Figure pct00019
Figure pct00020
100 nM Na 포스페이트 완충제 pH 6.0 (1 ml) 내의 화합물 8 ((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-이미다졸-5-일)메틸)-20-(4-아미노부틸)-3-부틸-14-((S)-2-((S)-5-구아니디노-2-((S)-1-((S)-5-구아니디노-2-((S)-5-옥소피롤리딘-2-카르복사미도)펜타노일)피롤리딘-2-카르복사미도)펜탄아미도)-4-메틸펜탄아미도)-1,4,10,15,18,21,24-헵타옥소헥사코사히드로피롤로[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]디티아헥사아자시클로헥사코신-6-카르복사미도)-3-페닐프로판산) (11.5 mg, 5.62 μmol) 및 2,2,2-트리플루오로아세트산 (1:1)을 갖는 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 화합물 (9.19 mg, 0.011 mmol)의 용액에 실온에서 아닐린 (2.051 ㎕, 0.022 mmol)을 첨가하였다. DMSO (50 ㎕)의 첨가로 균일한 용액을 제공하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 2 h 동안 교반하였다. 0.1% TFA를 함유하는 15-60% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC로 예상된 접합체, 즉, (1-((Z)-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-이미다졸-5-일)메틸)-20-(4-아미노부틸)-3-부틸-6-((S)-1-카르복시-2-페닐에틸카르바모일)-14-((S)-2-((S)-5-구아니디노-2-((S)-1-((S)-5-구아니디노-2-((S)-5-옥소피롤리딘-2-카르복사미도)펜타노일)피롤리딘-2-카르복사미도)펜탄아미도)-4-메틸펜탄아미도)-1,4,15,18,21,24-헥사옥소도코사히드로피롤로[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]디티아헥사아자시클로헥사코신-10(1H,9H,11H)-일리덴)아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산) (4.5 mg, 1.646 μmol, 29.3% 수율)을 제공하였다. HRMS (방법 D) [(M+3)/3]; 759.7487 (관측치), 759.7462 (예상치). 체류 시간 4.12 min.
실시예 3
Figure pct00021
50 mM Na 포스페이트 완충제 pH 7.4 (10 ㎕) 내의 CRM197 (200 ㎍, 6.2 ㎕, 0.0034 μmol)의 용액 내에 TCEP HCl (5.89 ㎍, 0.021 μmol)의 수용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 15 h 동안 실온에서 방치하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (4.58 ㎍, 0.034 μmol 10eq)을 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응액을 실온에서 2 h 동안 방치하였다. 조 물질을 제브라™ 크기 배제 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] = 58465. 상기 활성화 단백질은 아민화 페이로드, 예컨대 TLR 효능제와 반응하여, 담체 단백질에 첨가된 임의의 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 화합물과 접합된 담체 단백질을 형성할 수 있다.
Figure pct00022
케톤-변형된 CRM197 (5 mg/ml, Na 포스페이트 완충제, pH 6.0) (50 ㎍, 0.00086 μmol)의 용액에 N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-아미노-8-메틸벤조[f][1,7]나프티리딘-2-일)에틸)-3-메틸페녹시)에틸)피페라진-1-일)프로필)-2-(아미노옥시)아세트아미드 (66.8 ㎍, 0.064 μmol) 및 아닐린 (0.0020 ㎕, 0.021 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응액을 14 h 동안 23℃에서 방치하여, LCMS 분석을 기초로 하여 목적하는 접합체 A를 제공하였다. 반응 혼합물을 PBS pH 7.2 완충제로 용리시키는 0.5 mL 제브라™ 크기 배제 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] = 59032.
PL의 합성:
Figure pct00023
DMF (0.5 ml) 내의 tert-부틸 2-(3-브로모프로필아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (53.3 mg, 0.171 mmol) 및 8-메틸-2-(2-메틸-4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페네틸)벤조[f][1,7]나프티리딘-5-아민 (52 mg, 0.114 mmol)의 용액에 RT에서 탄산칼륨 (39.4 mg, 0.285 mmol)를 첨가하고, 이를 24 h 동안 RT에서 교반하였다. 물 및 EtOAc를 첨가하였다. 유기층을 분리하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켜 조 Boc-보호된 물질을 제공하고, 이것을 DMF (0.5 ml) 내에 용해시키고, 여기에 TFA (0.5 mL, 6.49 mmol)을 첨가하였다. 이것을 30 min 동안 RT에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 0.1% TFA를 함유하는 15-60% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC 정제로 N-(3-(4-(2-(4-(2-(5-아미노-8-메틸벤조[f][1,7]나프티리딘-2-일)에틸)-3-메틸페녹시)에틸)피페라진-1-일)프로필)-2-(아미노옥시)아세트아미드 (25 mg, 0.024 mmol, 21.02% 수율)를 제공하였다. LCMS; [M+1] = 586.
실시예 4
다음 실시예에서는 항-VEGF 항체 단편 (VEGF-Fab), 및 항체 단편의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 첨가되는 지방산 유도체를 이용하였다. 몇몇의 덜 접근가능한 쇄내 디술피드 연결의 존재 하에 쇄내 디술피드의 선택적 환원은 pH 7에서 PBS 내의 TCEP를 사용하여 달성하였다. 환원 단백질을 디할로아세톤 (디브로모아세톤 또는 디클로로아세톤)과 반응시켜, 황 원자들을 함께 연결하는 3-탄소 테더 -CH2-C(=O)-CH2-를 갖는 활성화 단백질을 제공하였다. 활성화 단백질을 반응성 부분으로서 아미노옥시를 갖는 링커-페이로드 모이어티와 접촉시켜, 디할로아세톤으로부터 유래된 케톤과 함께 옥심을 형성하였다. 본 실시예에서 연결기 L은 다음과 같다:
Figure pct00024
여기서 [X] 및 [PL]은 각각 -X-NH2 및 페이로드 PL에 대한 부착 지점을 나타내고, 페이로드는 C18 지방산기이다. 실시예에서, X는 -ONH2이고, 이것은 활성화 단백질의 아세토닐 케톤의 카르보닐과 함께 옥심을 형성한다. 도 5는 본 실시예에 대한 활성화 단백질의 형성을 도시하고, 그의 형성에 대한 질량 스펙트럼 증거를 보여준다.
Figure pct00025
PBS pH 7.4 (8 ㎕) 내의 A (72.72 ㎍, 6.0 ㎕, 0.0015 μmol)의 용액에 TCEP HCl (2.63 ㎍, 0.0092 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3 h 동안 실온에서 방치하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (1.945 ㎍, 0.015 μmol)을 첨가하고, 반응액을 실온에서 1 h 동안 정치시켰다. A는 소비되어 목적하는 생성물 B로 전환되었다. 조 물질을 크기 배제 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] = 47538.
Figure pct00026
PBS pH 7.4 (22.5 ㎕) 내의 B (36.36 ㎍, 0.00076 μmol)의 용액에 2,2,2-트리플루오로아세트산 (1:1)을 함유하는 (S)-1-(아미노옥시)-19-카르복시-2,7,16,21-테트라옥소-9,12-디옥사-3,6,15,20-테트라아자옥타트리아콘탄-38-오산 화합물 (64.33 ㎍, 0.079 μmol) 및 아닐린 (0.00105 ㎕, 0.011 μmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 14 h 동안 23℃에서 교반하였다. B는 소비되어 목적하는 생성물 C로 전환되었다. 조직 물질을 제브라™ 스핀 탈염 칼럼, 7K MWCO (써모 사이언티픽)을 통해 통과시켰다. LCMS; [M+1] (방법 A) = 48222. 도 6은 단백질 접합체의 형성을 도시하고, 접합체 형성에 대한 질량 스펙트럼 증거를 보여준다.
실시예 5
Figure pct00027
펩티드 A (1 mg, 0.519 μmol)를 완충제 (2.5 ml) (50 mM 인산나트륨 완충제 pH 6.5 (1.5 mL), 40% MeCN (0.9 mL), 2.5% DMF (0.1 mL)) 내에 용해시키고, 여기에 TCEP HCl (0.164 mg, 0.571 μmol)을 실온에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 60 min 동안 교반하였다. DMF (0.1 ml) 내의 1,3-디브로모아세톤 (0.164 mg, 0.571 μmol)을 반응 혼합물에 실온에서 첨가하였다. 3 min 동안 교반한 후에, LCMS 분석을 기초로 한 정량적 전환으로 아세톤 부가물 B가 형성되는 것이 관찰되었다. LCMS (방법 C) [M+2]/2 = 991.
실시예 6: 항Her2 항체-약물 접합체의 제조.
방법 A:
단계 1.
Figure pct00028
단계 1: 항- HER2 IgG (0.1 M 트리스/HCl 내의 20.36 mg/ml, 30 ㎕, 610.8 ㎍, 0.0041 μmol) 및 1,3-디클로로프로판-2-온 (66.1 ㎍, 0.495 μmol)의 용액에 TCEP HCl (14.17 ㎍, 0.049 μmol)을 첨가하고, 이를 16 h 동안 4℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 용리시키는 0.5 mL 제브라™ 스핀 칼럼을 통해 통과시켰다. 4 쇄간 디술피드의 변형은 반응 용액으로부터 취한 샘플을 사용하여 수행된 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈(Roche)) 및 비-환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루(colloidal blue) 염색을 이용한 4-12% 비스-트리스 겔)을 이용하는 분석에 의해 확인하였다. LCMS (방법 B); 145394 (PNGase F를 사용한 탈글리코실화 이후).
단계 2:
Figure pct00029
단계 1에서 제조된 변형된 항-HER2 IgG의 용액 (7.14 mg/mL, 100 mM 아닐리늄 아세테이트 완충제 pH 4.8, 600 ㎍, 0.0040 μmol)에 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(아미노옥시)-N-메틸헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (30 mg/ml, 104 ㎍, 0.121 μmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 실온에서 19 h 동안 교반하였다. 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 1회 용리시키는 0.5 ml 제브라™ 스핀 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 변형은 반응 용액으로부터 취한 샘플을 사용하여 수행된 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비-환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 이용한 4-12% 비스-트리스 겔, 아래 제시함)을 이용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR (약물-항체 비)는 3.2이었다. LCMS (방법 B); 148770 (탈글리코실화 이후). 도 7은 접합체 및 환원 이후 접합체에 대한 SDS PAGE를 보여준다 (아래 참조). 시블루 플러스2(SeeBlue Plus2)® 예비-염색된 표준물 (인비트로젠)을 겉보기 분자량 래더로서 사용하였다. 이것은 접합 생성물 내에 비접합된 항체가 거의 또는 전혀 존재하지 않음을 입증하고: 비접합된 항체는 디술피드 결합에 의해서만 함께 유지된 항체의 해리 때문에 환원 시에 보다 저분자량 밴드를 생성할 것이다. -S-CH2-C(=X)-CH2-S- 연결을 통해 공유 연결된 단편을 갖는 접합체는 환원 시에 해리할 수 없다.
방법 B:
단계 1:
Figure pct00030
항-HER2 IgG (0.1 M 트리스/HCl 내의 20.36 mg/ml) (610.8 ㎍, 0.0041 μmol) (30 ㎕) 및 1,3-디클로로프로판-2-온 (66.1 ㎍, 0.495 μmol)의 용액에 TCEP HCl (14.17 ㎍, 0.049 μmol)을 첨가하고, 이를 16 h 동안 4℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 PBS pH 7.2로 용리시키는 0.5 mL 제브라™ 스핀 칼럼을 통해 통과시켰다. 4 아세톤 형성에 의한 쇄간 디술피드에서 성공적인 변형은 반응 용액으로부터 취한 샘플을 사용하여 수행된 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비-환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 이용한 4-12% 비스-트리스 겔)을 이용하는 분석에 의해 확인하였다. LCMS (방법 B); 145394 (탈글리코실화 이후). SDS PAGE를 위한 환원된 샘플을 상기 설명된 절차에 따라 제조하였다.
단계 2:
변형된 항-HER2 IgG의 용액 (7.14 mg/mL, 100 mM 아닐리늄 아세테이트 완충제 pH 4.8) (600 ㎍, 0.0040 μmol)에 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(아미노옥시)-N-메틸헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 (30 mg/ml, 104 ㎍, 0.121 μmol)을 실온에서 첨가하고, 이를 19 h 동안 RT에서 교반하였다. 생성되는 혼합물을 PBS pH 7.2로 1회 용리시키는 0.5 ml 제브라™ 스핀 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 성공적인 변형은 반응 용액으로부터 취한 샘플을 사용하여 수행된 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩), 엔도프로테이나제 Lys-C (로슈) 및 비-환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 이용한 4-12% 비스-트리스 겔)을 이용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR은 3.8이었다. LCMS (방법 B); 148770 (탈글리코실화 이후). 시블루 플러스2™ 예비-염색된 표준물 (인비트로젠)을 겉보기 분자량 래더로서 사용하였다. SDS PAGE를 위한 환원된 샘플을 앞서 설명된 절차에 따라 제조하였다. 단계 2의 생성물에 대한 LC-MS 데이터를 도 7에 제시한다.
실시예 7: 항체 B-DM1 접합체의 제조:
단계 1:
Figure pct00032
트리스 완충제 (4800 ㎕) 내의 디클로로아세톤 (7.35 mg, 0.055 mmol, 368 ㎕)의 용액에 항체 B IgG (항체 B IgG는 Her2와 상이한 항원을 인식한다: 68.2 mg, 0.458 μmol, 400 ㎕)를 첨가하고, 이를 60 min 동안 4℃로 냉각시켰다. 4℃에서 TCEP HCl (1.576 mg, 5.50 μmol, 524 ㎕)을 첨가하고, 이를 16 h 동안 4℃ 실내에서 방치하였다. 혼합물을 10K 아미콘(Amicon)® 막 여과를 통해 농축시키고, PBS로 희석하였다. 상기 사이클을 2회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제브라™ 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 4 아세톤 형성에 의한 쇄간 디술피드에서 성공적인 변형은 반응 용액으로부터 취한 샘플을 사용하여 수행된 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩) 및 비-환원/환원 SDS PAGE (콜로이달 블루 염색을 이용한 4-12% 비스-트리스 겔)을 이용하는 분석에 의해 확인하였다. LCMS (방법 B); 146020 (탈글리코실화 이후). SDS PAGE를 위한 환원된 샘플을 앞서 설명된 절차에 따라 제조하였다.
단계 2:
PL1 (방법 A):
Figure pct00033
변형된 항체 B IgG (48 mg, 0.322 μmol, 1.2 ml)의 용액에 DM-1 유도체 (10.00 mg, 8.05 μmol, 67 ㎕) 및 3,5-디아미노벤조산 (14.70 mg, 0.097 mmol, 30 ㎕)의 DMSO 용액을 첨가하고, 이를 23℃에서 15 h 동안 교반하였다. 혼합물을 10K 아미콘® 막 여과를 통해 농축시키고 PBS로 희석하였다. 상기 사이클을 3회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제브라™ 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 성공적인 변형은 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩)를 사용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 4이었다. LCMS (방법 B); 150915 (탈글리코실화 이후).
PL1 (방법 B):
Figure pct00034
0.1 M Na 포스페이트 pH 6.0 내의 변형된 항체 B IgG (679 ㎍, 0.0046 μmol)의 용액에 DMSO 내의 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드 (563 ㎍, 0.911 μmol, 2.25 ㎕)를 RT에서 첨가하고, 이를 20 h 동안 23℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EDTA를 함유하는 100 mM HEPES로 3회 용리시키는 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 3.8 말레이미드 링커/항체 (DAR = 3.8)의 도입은 LCMS에 의해 확인하였다. LCMS (방법 B); 147968 (PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩)를 사용한 탈글리코실화된 이후).
Figure pct00035
10 mM EDTA를 함유하는 100 mM HEPES 완충제 내의 변형된 항체 B IgG (177 ㎍, 0.0012 μmol)의 용액에 DMSO 내의 DM-1 (8.65 ㎍, 0.012 μmol, 0.288 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 6 h 동안 23℃에서 교반하였다. N-메틸말레이미드 (DMSO 내의 1.3 mg/ml) (2.083 ㎍, 0.019 μmol)을 반응 용액 내에 첨가하고, 이를 10 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 100 mM HEPES 완충제로 용리시키는 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 3.7이었다. LCMS (방법 B); 153967 (DAR4) (글리코실화된 것).
PL2:
Figure pct00036
10 mM EDTA를 함유하는 HEPES 완충제 내의 변형된 항체 B IgG (420 ㎍, 0.0028 μmol)의 용액에 DMSO 내의 DM-1 (10.61 ㎍, 0.014 μmol, 0.55 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 8 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EDTA를 함유하는 100 mM HEPES로 3회 용리시키는 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 반응 혼합물을 100 mM HEPES 완충제로 용리시키는 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 3.6이었다. LCMS (방법 B); 150101 (DAR4) (PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩)를 사용하여 탈글리코실화된 이후).
Figure pct00037
10 mM EDTA를 함유하는 HEPES 완충제 내의 변형된 항체 B IgG (420 ㎍, 0.0028 μmol)의 용액에 DMSO 내의 DM-1 (10.61 ㎍, 0.014 μmol, 0.55 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 8 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EDTA를 함유하는 100 mM HEPES로 3회 용리시키는 0.5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 반응 혼합물을 100 mM HEPES 완충제로 용리시키는 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 3.6이었다. LCMS (방법 B); 150101 (DAR4) (PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩)를 사용하여 탈글리코실화된 이후).
PL3:
Figure pct00038
변형된 항체 B IgG (47.3 mg, 0.317 μmol, 1.1 ml)의 용액에 DM-1 유도체 (6.34 mg, 6.35 μmol, 42.3 ㎕) 및 3,5-디아미노벤조산 (13.52 mg, 0.089 mmol, 27 ㎕)의 DMSO 용액을 첨가하고, 이를 23℃에서 15 h 동안 교반하였다. 혼합물을 10K 아미콘® 막 여과를 통해 농축시키고 PBS로 희석하였다. 상기 사이클을 2회 반복하였다. 여과 후에, 샘플을 5 ml 제브라™ 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 케톤의 성공적인 변형은 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩)을 사용하는 분석에 의해 확인하였다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 4이었다. LCMS (방법 B); 150910 (탈글리코실화 이후).
PL4:
Figure pct00039
PBS 내의 변형된 항체 B IgG (250 ㎍, 0.0017 μmol, 10 ㎕)의 용액에 상기 제시된 요구되는 알콕시아민 (21.66 ㎍, 0.025 μmol, 0.245 ㎕) 및 3,5-디아미노벤조산 (383 ㎍, 2.52 μmol, 0.43 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 24 h 동안 23℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 PBS로 2회 용리시키는 0.5 mL 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. DAR은 LCMS를 기초로 하여 4이었다. LCMS (방법 B); 152446 (글리코실화된 것).
PL1, PL2, PL3의 합성:
PL1 합성:
Figure pct00040
tert-부틸 (2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (245 mg, 0.746 mmol)를 RT에서 디옥산 내의 4N HCl (2 mL, 8.00 mmol)에 용해시키고, 이를 1 h 동안 RT에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 조 물질을 추가로 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00041
DCM (8 mL) 내의 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (185 mg, 0.970 mmol) 및 TEA (0.520 mL, 3.73 mmol)의 용액에 EDC (172 mg, 0.895 mmol) 및 HOBT (114 mg, 0.746 mmol)를 RT에서 첨가하고, 이를 5 min 동안 RT에서 교반하였다. DCM (4 mL) 내의 1-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (197 mg, 0.746 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 1 h 동안 교반한 후에, DCM 및 물을 첨가하였다. 유기층을 분리하였다. 수성층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 0.1% TFA를 함유하는 15-65% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC 정제로 tert-부틸 2-((2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (62 mg, 0.154 mmol, 2 단계에 대해 20.70% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다. ESI-MS (방법 A) m/z: 402[M+1]+, 체류 시간: 1.60 min.
Figure pct00042
Figure pct00043
DCM (400 ㎕) 내의 tert-부틸 2-((2-(2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트 (62 mg, 0.154 mmol)의 용액에 TFA (400 ㎕)를 RT에서 첨가하고, 이를 1 h 동안 RT에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 조 물질을 밤새 진공 내에 두었고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. ESI-MS (방법 A) m/z: 302[M+1]+.
PL2 합성:
Figure pct00044
DCM (8 mL)/DMF (4 mL) 내의 2-Cl Trt 수지 (1.70 mmol/g) (0.086 g, 1.7 mmol) 및 1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-오산 (2 g, 5.19 mmol)의 현탁액에 DIPEA (2.67 mL, 15.30 mmol)을 적가하고, 이를 15 h 동안 RT에서 교반하였다. 용매를 유출시켰다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1, 40 ml), DCM (8 mL*2), DMF (8 mL*2), DCM (8 mL*2)로 세정하고, 진공 건조시켰다.
Figure pct00045
수지 (0.679 g, 1.7 mmol)를 반응 용기에 채웠다. DMF 내의 20% 피페리딘 5 mL을 첨가하고, 이를 1 min 동안 부드럽게 교반하고 제거하였다. 추가의 DMF 내의 20% 피페리딘 10 mL을 첨가하고, 간헐적으로 교반하면서 20 min 동안 기다리고 제거하였다. DMF (10 ml)을 첨가하고, 15 s 동안 교반하고, 진공 여과를 통해 제거하였다. 상기 단계를 4회 반복하였다 (카이저(Kaiser) 검정으로 검토함; 양성, 자색-진청색). DMF (8 mL) 내의 HOAt (0.463 g, 3.40 mmol) 및 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (0.650 g, 3.40 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, DMF (4 mL) 내의 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5 h 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과하고, DMF (10 ml)로 4회 세정하고, 진공 건조시켰다.
Figure pct00046
수지 (0.926 g, 1.7 mmol)를 반응 용기에 채웠다. DMF 내의 20% 피페리딘 5 mL을 첨가하고, 이를 1 min 동안 부드럽게 교반하고 제거하였다. 추가의 DMF 내의 20% 피페리딘 10 mL을 첨가하고, 간헐적으로 교반하면서 20 min 동안 기다리고 제거하였다. DMF (10 ml)을 첨가하고, 15 s 동안 교반하고, 진공 여과를 통해 제거하였다. 상기 단계를 4회 반복하였다 (카이저 검정으로 검토함; 양성, 자색-진청색). DMF (8 mL) 내의 HOAt (0.463 g, 3.40 mmol) 및 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (0.650 g, 3.40 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, DMF (4 mL) 내의 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5 h 동안 RT에서 교반하였다. 수지를 여과하고, DMF (10 ml)로 4회 세정하고, 진공 건조시켰다.
Figure pct00047
수지를 CHCl3 (20 mL, 1.700 mmol) 내의 30% HFIP (헥사플루오로이소프로판올)로 현탁시키고, 이를 2 h 동안 RT에서 교반하였다. 유출된 용매를 농축시켜, 조 2,2-디메틸-4,8,17-트리옥소-3,6,12,15,21,24-헥사옥사-5,9,18-트리아자헥사코산-26-오산 (1.13 g, 2.347 mmol, 138% 수율)을 제공하였다. 이것을 추가로 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다. ESI-MS m/z: 482[M+1]+, 체류 시간: 1.10 min (방법 B).
Figure pct00048
DMF (6 mL) 내의 2,2-디메틸-4,8,17-트리옥소-3,6,12,15,21,24-헥사옥사-5,9,18-트리아자헥사코산-26-오산 (819 mg, 1.7 mmol)의 용액에 HOAt (463 mg, 3.40 mmol) 및 DIC (0.530 mL, 3.40 mmol)을 각각 RT에서 첨가하고, 이를 5 min 동안 RT에서 교반하였다. 상기 혼합물에 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (518 mg, 2.040 mmol) 및 DIPEA (디이소프로필 에틸아민, 0.594 mL, 3.40 mmol)을 RT에서 첨가하고, 이를 1 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물 및 EtOAc (에틸 아세테이트)로 희석하였다. 유기층을 분리하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 목적하는 화합물은 LCMS를 기초로 하여 대부분 수성층에 존재하였다. 수성층의 동결건조 후에, 조 물질을 0.1% TFA를 함유하는 15-70% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC로 정제하여 tert-부틸 (23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,11,20-트리옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21-트리아자트리코실)옥시카르바메이트 (600 mg, 0.994 mmol, 58.5% 수율)를 제공하였다. ESI-MS m/z: 604[M+1]+, 체류 시간: 1.14 min (방법 B).
Figure pct00049
Figure pct00050
DCM (100 ㎕) 내의 tert-부틸 (23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,11,20-트리옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12,21-트리아자트리코실)옥시카르바메이트 (8.4 mg, 0.014 mmol)의 용액에 TFA (100 ㎕)를 RT에서 첨가하고, 이를 1 h 동안 RT에서 교반하였다. 용매를 제거하여 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드를 얻었다. 이것을 추가로 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다. ESI-MS m/z: 504[M+1]+, 체류 시간: 0.69 min (방법 A).
Figure pct00051
PL3 합성:
DMA (0.6 mL) 내의 2-(아미노옥시)-N-(1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,13-디옥소-6,9,15,18-테트라옥사-3,12-디아자이코산-20-일)아세트아미드 (22.79 mg, 0.031 mmol)의 용액에 DM-1 (23 mg, 0.031 mmol) 및 100 mM Na 포스페이트 pH 7.4 (0.600 mL)을 5℃에서 첨가하였다. DIPEA (10.88 ㎕, 0.062 mmol)를 동일한 온도에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 RT로 가온시키고, 1.5 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 포화 중탄산나트륨 수액으로 희석하였다. 유기층을 포화 NH4Cl (aq) 및 염수로 세척하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 0-15% MeOH/DCM로 용리시키는 실리카겔 크로마토그래피로 목적하는 화합물 (21 mg, 0.017 mmol, 54.3% 수율)을 제공하였다. ESI-MS m/z: 1242[M+1]+, 체류 시간: 1.00 min (방법 A).
Figure pct00052
Figure pct00053
DCM (3 mL) 내의 tert-부틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (320 mg, 1.289 mmol)의 용액에 2-브로모아세틸 브로마이드 (0.225 mL, 2.58 mmol) 및 DIPEA (0.563 mL, 3.22 mmol)를 5℃에서 첨가하고, 이를 15 min 동안 교반하고 RT으로 가온시켰다. 용매의 제거 후에, 0-40-100% EtOAc/헵탄으로 용리시키는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 정제로 tert-부틸 (2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (317 mg, 0.858 mmol, 66.6% 수율)를 제공하였다. ESI-MS m/z: 269[M+1-Boc]+, 체류 시간: 1.41 min (방법 A).
Figure pct00054
Figure pct00055
DCM (1 mL) 내의 tert-부틸 (2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (317 mg, 0.858 mmol)의 용액에 TFA (1 mL)를 첨가하고, 이를 30 min 동안 RT에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 생성되는 조 물질을 추가로 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00056
DCM (1.5 mL) 내의 N-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)-2-브로모아세트아미드 (329 mg, 0.858 mmol)의 용액에, 예비-활성화된 에스테르 (DMF (1.5 mL) 내의 2-(((tert-부톡시카르보닐)아미노)옥시)아세트산 (328 mg, 1.716 mmol), HOAt (175 mg, 1.287 mmol) 및 DIC (0.267 mL, 1.716 mmol)로부터 5 min 동안 RT에서 교반하여 제조됨) 및 DIPEA (0.749 mL, 4.29 mmol)를 5℃에서 첨가하고, 이를 20 min 동안 교반하고 RT으로 가온하였다. EtOAc 및 물을 첨가하였다. 유기층을 분리하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 0-5% MeOH/DCM으로 용리시키는 실리카겔 크로마토그래피 정제로 tert-부틸 (14-브로모-2,13-디옥소-6,9-디옥사-3,12-디아자테트라데실)옥시카르바메이트 (150 mg, 0.339 mmol, 39.5% 수율)을 제공하였다. ESI-MS m/z: 343 [M+1-Boc]+, 체류 시간: 1.30 min (방법 A).
Figure pct00057
Figure pct00058
tert-부틸 (14-브로모-2,13-디옥소-6,9-디옥사-3,12-디아자테트라데실)옥시카르바메이트 (150 mg, 0.339 mmol)을 DCM (부피: 1 mL, 비: 1.000)에 용해시키고, 여기에 TFA (부피: 1, 비: 1.000)를 RT에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30 min 동안 RT에서 교반하였다. 용매의 제거 후에, 0.1% TFA를 함유하는 10-25% MeCN/물로 용리시키는 RP-HPLC로 2-(아미노옥시)-N-(2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)아세트아미드 (110 mg, 0.241 mmol, 71.1% 수율)를 제공하였다. ESI-MS m/z: 344[M+2]+, 체류 시간: 0.44 min (방법 A).
Figure pct00059
DMA (1 mL) 내의 2-(아미노옥시)-N-(2-(2-(2-(2-브로모아세트아미도)에톡시)에톡시)에틸)아세트아미드(42.9 mg, 0.075 mmol)의 용액에 DM-1 (37 mg, 0.050 mmol) 및 75 mM Na 포스페이트 pH 8.5 (1 mL)을 5℃에서 첨가하였다. DIPEA (0.026 mL, 0.150 mmol)을 동일한 온도에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 RT로 가온시키고 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 포화 중탄산나트륨 수액으로 희석하고, 유기층을 포화 NH4Cl (aq) 및 염수로 세척하였다. 합한 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 0-15% MeOH/DCM로 용리시키는 실리카겔 크로마토그래피로 목적하는 화합물 (31 mg, 0.031 mmol, 61.9% 수율)을 제공하였다. ESI-MS m/z: 1000[M+1]+, 체류 시간: 1.61 min (방법 A).
Figure pct00060
실시예 8: 항체 C Fab 접합체:
단계 1:
Figure pct00061
EDTA를 함유하는 100 mM Na 포스페이트 (pH 7.4) 내의 항체 C Fab (항체 C는 Her2 및 항체 B와 상이한 표적 항원에 결합한다: 1668 ㎍, 0.035 μmol, 120 ㎕)의 용액에 TCEP HCl (35.2 ㎍, 0.123 μmol, 11.73 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 1.5 h 동안 23℃에서 교반하였다. 1,3-디클로로프로판-2-온 (117 ㎍, 0.878 μmol, 5.85 ㎕)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 40 min 동안 23℃에서 교반하였다. 1 아세톤 가교 (bridge) 변형이 LCMS에 의해 관찰되었다. 반응 혼합물을 100 mM NaOAc 완충제 pH 5.2로 용리시키는 0.5 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. LCMS (방법 B); 47554.
단계 2:
Figure pct00062
100 mM NaOAc 완충제 pH 5.2 내의 변형된 항체 C Fab (1668 ㎍, 0.035 μmol, 148 ㎕), 및 제시된 아미노옥시-치환된 지방산 (1852 ㎍, 2.63 μmol)의 용액에 3,5-디아미노벤조산 (694 ㎍, 4.56 μmol, 5.34 ㎕)을 RT에서 첨가하고, 이를 20 h 동안 23℃에서 교반하였다. 추가의 아미노옥시-지방산 (1852 ㎍, 2.63 μmol)을 혼합물에 첨가하고, 이를 24 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 PBS pH 7.4로 용리시키는 5 ml 탈염 칼럼을 통해 통과시켜, 예상된 항체 C Fab-지방산 접합체 (30% 수율)을 제공하였다. LCMS (방법 B); 48238.
접합체에 대한 SDS PAGE 영상 및 질량 스펙트럼을 도 9에 제공한다.

Claims (27)

  1. 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질로부터 단백질-페이로드 접합체를 형성하는 방법이며,
    a) 관능화 테더링 화합물이 단백질 상의 2개의 유리 티올기와 반응하여 2개의 티올기가 관능화 테더에 의해 함께 공유 연결된 활성화 단백질을 형성하는 조건 하에 단백질을 관능화 테더링 화합물과 접촉시키고;
    b) 관능화 테더가 페이로드에 이미 연결되어 있지 않으면, 페이로드와 관능화 테더의 공유 부착을 형성하기 위해 활성화 단백질을 관능화 페이로드 화합물과 접촉시켜 단백질-페이로드 접합체를 형성시키는 것
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 관능화 테더링제와 접촉되기 전에 디술피드 연결에 의해 함께 연결된 2개의 시스테인 잔기를 갖고, 디술피드가 제1항의 단계 a)에 사용하기 위한 2개의 유리 시스테인 잔기를 갖는 단백질을 제공하기 위해 환원되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관능화 테더링 화합물이 디할로아세톤 유도체이고, 관능화 테더가 -CHR-C(=Z)-CHR-이고, 여기서 Z는 O 또는 NR'이고, 각각의 R은 독립적으로 H, 페닐, C1-C4 알콕시 또는 C1-C4 알킬이고, R'는 페이로드에 부착된 연결기를 나타내는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화 페이로드가 화학식 H2N-O-L-PL 또는 H2N-NR'-L-PL의 화합물이고, 여기서 L은 연결기를 나타내고; PL은 적어도 하나의 페이로드 분자를 나타내는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화 페이로드가 화학식 H2N-O-L-PL의 화합물인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 활성화 단백질이 하기 화학식을 갖는 케톤을 포함하는 것인 방법.
    Figure pct00063

    여기서 원은 단백질을 나타내고, 각각의 황 원자는 단백질의 시스테인 잔기의 술프히드릴이다.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질-페이로드 접합체가 하기 화학식의 기를 포함하는 것인 방법.
    Figure pct00064

    여기서 X는 O 또는 NH이고, L은 링커를 나타내고, PL은 적어도 하나의 페이로드 기를 나타낸다.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 백신 담체인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 치료제를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 검출가능한 표지 또는 결합기를 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 페이로드가 항원을 포함하는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, L이 절단가능한 연결 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, L이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, L이
    (a) 결합, -O-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-;
    (b) (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -Z-(C1-C20)알킬렌-, -Z-(C2-C20)알케닐렌, -Z-(C2-C20)알키닐렌, (C1-C20)알킬렌-Z-(C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌-Z-(C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌-Z-(C2-C20)알키닐렌 [여기서 Z는 -NH-, -N(C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, (C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클렌이고, 상기 (C1-C20)알킬렌, 상기 (C2-C20)알케닐렌 및 상기 (C2-C20)알키닐렌 모이어티는 각각 독립적으로 상기 모이어티 내에 분산된 1-10개의 산소 원자를 임의로 함유함];
    (c) (C3-C7)시클로알킬렌, (C3-C7)시클로알킬렌-Y-(C3-C7)시클로알킬렌, -Y-(C3-C7)시클로알킬렌, 페닐렌, -Y-페닐렌, 페닐렌-Y-페닐렌, 헤테로아릴렌, Y-헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌-Y-헤테로아릴렌, 헤테로시클렌, -Y-헤테로시클렌 또는 헤테로시클렌-Y-헤테로시클렌 [여기서 Y는 (C1-C20)알킬렌, (C2-C20)알케닐렌, (C2-C20)알키닐렌, -O-, -C(O)-, -S-, -NH-, -N((C1-C6)알킬)H-, -NH-C(O)-NH-, -C(O)-NH- 또는 -NH-C(O)-이고, 상기 (C3-C7)시클로알킬렌, 상기 페닐렌, 상기 헤테로아릴렌 및 상기 헤테로시클렌 모이어티는 각각 개별적으로 할로, (C1-C4)알킬 또는 할로-치환된(C1-C4)알킬로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환됨];
    (d) -[OCH2CH2]v- [여기서 v는 1-2,000임]; 및
    (e) 1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 펩티드
    로부터 선택된 적어도 하나의 스페이서를 포함하는 것인 방법.
  16. 하기 화학식의 단백질-페이로드 접합체.
    Figure pct00065

    여기서 원은 적어도 5개의 아미노산을 갖는 단백질을 나타내고;
    X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2 또는 O이고;
    L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고;
    PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티이다.
  17. 제16항에 있어서, X가 O인 단백질-페이로드 접합체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 단백질이 항체인 단백질-페이로드 접합체.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 단백질이 백신 담체인 단백질-페이로드 접합체.
  20. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 치료제, 검출가능한 표지, 항원 또는 결합기인 단백질-페이로드 접합체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L이 절단가능한 링커를 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, L이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, L이 화학식 (CH2)1-6 또는 (CH2CH2O)1-4의 적어도 하나의 스페이서를 포함하는 것인 단백질-페이로드 접합체.
  24. 디술피드 결합을 함유하는 단백질을 안정화하는 방법이며,
    (a) 디술피드 결합을 환원시켜 2개의 유리 티올기를 형성하고,
    (b) 2개의 티올기를 함께 연결하는 -CH2-C(=N-X-L-PL)-CH2- 연결을 도입하는 것
    을 포함하고, 여기서 X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2 또는 O이고; L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고; PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 연결 -CH2-C(=O)-CH2-가 2개의 유리 티올을 함께 연결하기 위해 사용된 후, 연결의 카르보닐이 화학식 H2N-X-L-PL의 기와 반응하는 것인 방법.
  26. 고리화된 단백질 접합체를 형성하기 위해 2개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 단백질을 고정하는 방법이며,
    (a) 단백질의 일부를 고리화하기 위해 2개의 시스테인 잔기의 티올기를 함께 연결하는 -CH2-C(=O)-CH2- 연결을 도입하고,
    (b) 고리화된 단백질의 고정된 접합체를 형성하기 위해 고리화된 단백질을 화학식 H2N-X-L-PL의 아민화 페이로드와 접촉시키는 것
    을 포함하고, 여기서 X는 NH, N(C1-4 알킬), N-L2-PL2 또는 O이고; L 및 L2는 각각 연결기이고, 동일하거나 상이할 수 있고; PL 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있는 페이로드 모이어티인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 1,3-디할로아세톤이 2개의 시스테인 티올을 -CH2-C(=O)-CH2- 연결과 함께 연결하기 위해 사용된 후, 연결의 카르보닐이 화학식 H2N-O-L-PL의 아민화 페이로드 화합물과 반응하는 것인 방법.
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