KR20150079830A - 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과를 사용하는 폴리펩타이드의 정제 - Google Patents

듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과를 사용하는 폴리펩타이드의 정제 Download PDF

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페터 벡커
세바슈티안 노이만
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과 (dual stage tangential-flow ultrafiltration: "TFF") 를 사용하여 관심 분자를 상기 분자를 함유하는 용액으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 후속하는, 즉, 다운스트림에서의 청징 (refining) 단위 조작 이전에 오염물 및/또는 불순물의 수준을 극적으로 감소시키기 위한 조건화 세포 배양물 상청액과 같은 미가공 공급물 스트림의 처리에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 발효 또는 다른 세포 배양 공정과 같은 생물학적 생산 시스템으로부터의 미가공 공급물 스트림의 처리에 사용될 수 있으며, 크로마토그래피 단위 조작과 같은 높은 불순물 로드에 민감한 다운스트림 공정 이전의 시간 소모적인 불순물 침전 (예를 들면, pH 에 의한) 및/또는 침전물 여과 공정에 대한 필요성을 추가로 제거할 수 있다. 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 공정은 상기 공급물 스트림, 예를 들면, 세포 배양물 상청액의 pH 에 상응하는 pH 또는 대략 이의 pH, 전형적으로는 7.5±1.0 의 pH 에서 유리하게 수행될 수 있는 2 개 이상의 TFF 단위 조작을 조합한다. 공급물 스트림에 대한 관심 단백질의 전통적인 정제 공정을 보완, 개선 또는 대체하기 위한 TFF 단위 조작의 사용은 직접 및 간접 가공비 둘다에 있어서 유의미한 절약을 제공할 수 있다. 예를 들면, 침전 및 침전물 여과 공정의 제거에 의한 간접 절약에 추가하여, 듀얼 스테이지 TFF 단위 조작에 의해 제공되는 불순물 로드의 감소는 다운스트림 컬럼 성능, 예를 들면, 크로마토그래피 분리, 동적 결합 능력, 작동 수명의 개선 및/또는 필요한 컬럼 크기의 감소에 의한 간접 절약을 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역글로불린 분자, 예를 들면, 항체의 정제를 위한 공정에서 사용되는데, 여기서, 상기 공정은 친화도 정제 단계, 예를 들면, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 정제를 가지지 않는다.

Description

듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과를 사용하는 폴리펩타이드의 정제 {PURIFICATION OF POLYPEPTIDES USING DUAL STAGE TANGENTIAL-FLOW ULTRAFILTRATION}
본 발명은 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과 (dual stage tangential-flow ultrafiltration: "TFF") 를 사용하여 관심 분자를 상기 분자를 함유하는 용액으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 후속하는, 즉, 다운스트림에서의 청징 단위 조작 (refining unit operation) 이전에 오염물 및/또는 불순물의 수준을 극적으로 감소시키기 위한 조건화 세포 배양물 상청액과 같은 미가공 공급물 스트림의 처리에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 발효 또는 기타 세포 배양 공정과 같은 생물학적 생산 시스템으로부터의 미가공 공급물 스트림의 처리에 사용될 수 있으며, 크로마토그래피 단위 조작과 같은 높은 불순물 로드 (load) 에 민감한 다운스트림 공정 이전의 시간 소모적인 불순물 침전 (예를 들면, pH 에 의한) 및/또는 침전물 여과 공정에 대한 필요성을 추가로 제거할 수 있다. 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 공정은 공급물 스트림, 예를 들면, 세포 배양물 상청액의 pH 에 상응하는 pH 또는 대략 이의 pH, 전형적으로는 7.5±1.0 의 pH 에서 유리하게 수행될 수 있는 2 개 이상의 TFF 단위 조작을 조합한다. 공급물 스트림에 대한 관심 단백질의 전통적인 정제 공정을 보완, 개선 또는 대체하기 위한 TFF 단위 조작의 사용은 직접 및 간접 가공비 둘다에 있어서 유의미한 절약을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 침전 및 침전물 여과 공정의 제거에 의한 간접 절약에 추가하여, 듀얼 스테이지 TFF 단위 조작에 의해 제공되는 불순물 로드의 감소는 다운스트림 컬럼 성능, 예를 들면, 크로마토그래피 분리, 동적 결합 능력, 작동 수명의 개선 및/또는 필요한 컬럼 크기의 감소에 의한 간접 절약을 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역글로불린 분자, 예를 들면, 항체의 정제를 위한 공정에서 사용되는데, 여기서, 상기 공정은 친화도 정제 단계, 예를 들면, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 정제를 가지지 않는다.
본 발명은 관심 분자, 특히, 생체분자 (예를 들면, 단백질) 를 상기 분자를 함유하는 미가공 생산 용액 및/또는 생산 용액으로부터 분리 및/또는 정제하는 방법에 관한 것이다. 생명공학 분야가 진보함에 따라, 미가공 생산 용액으로부터의 대량의 생체분자의 경제적 처리가 점점 더 중요해지고 있다. 특히, 생산 및 처리의 경제성은 효소, 항체 및 기타 특수 단백질 및 펩타이드를 포함한 생체분자 및/또는 약제의 개발 및 제조에 관련되는 결정에 있어서 결정적인 역할을 할 수 있다. 다수의 이러한 생체분자 (예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드, 항체) 의 제조를 위해, 재조합 DNA 기술의 사용은 선택되는 생산 방법이 되었다. 이러한 방법을 사용하여, 대량의 목적하는 생체분자는 각종 생물학적 시스템에서 발현될 수 있다. 이러한 시스템은 세포 기반 시스템 (예를 들면, 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포 배양물 (예를 들면, 형질전환 세포 배양물의 관심 단백질의 내생성 발현을 가짐)), 형질전환 동물 및 형질전환 식물을 포함한다. 세포 배양 시스템 또는 생체내 시스템의 생체분자 경로는 또한 시험관내 생산 시스템의 실시를 위한 필수 구성성분으로 감소하였다. 그러나, 이들 생산 시스템에 의해, 생물약제 산업은 미가공 생산 용액 또는 생산 물질로부터의 목적하는 생체분자 (예를 들면, 단백질) 의 회수를 위한 개선된 또는 신규한 시스템을 개발하는 병행 도전에 직면하고 있다. 미가공 생산 용액은 조건화 세포 배양 배지, 정화된 균질화/용해된 조건화 세포 배양물, 형질전환 동물로부터의 체액 (예를 들면, 혈액, 혈청, 모유 및 소변), 및 선택되는 생체분자에 추가하여 출발 물질 및 구성성분을 포함하는 시험관내 생산 용액을 포함한다. 회수 방법은 정부의 순도 및 안정성 표준을 충족하는 회수 생성물을 제공해야 할 뿐만 아니라, 경제성이 높아야 한다.
미가공 생산 용액으로부터의 생체분자의 단리에 특히 유리한 정제 공정은 전형적으로는 친화도 기반 크로마토그래피 공정 및/또는 단위 조작을 포함한다. 친화도 기반 크로마토그래피는 관심 생체분자와 고체 기질, 예를 들면, 매트릭스 또는 겔에 고정된 결합 잔기의 특이적인 상호작용에 기초하여 생체분자를 분리한다. 따라서, 관심 생체분자는 기질 (전형적으로는 컬럼 내에 함유됨) 에 결합하는 반면, 공급물 스트림의 오염물 및 기타 원치 않는 구성성분은 시스템을 통해 흐른다. 이어서, 생체분자는 결합 잔기 및/또는 컬럼으로부터 용출되고 수집된다. 따라서, 친화도 크로마토그래피 컬럼은 고도로 특이적이고, 매우 순수한 생성물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양 배지로부터의 항체의 정제와 관련하여, 친화도 크로마토그래피에 가장 종종 사용되는 결합 잔기는 단백질 A 이다. 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 항체에 대해 고도로 선택적이고, 조건화 세포 배양 배지와 같은 입력 샘플로부터 출발하여 95 % 초과의 생성물 순도를 제공할 수 있다.
비록 친화도 크로마토그래피가 강력한 포획 및 정제 단계이지만, 목적하는 생체분자에 결합하는 생체친화성 잔기 (또한 생체친화성 리간드로서도 당업계에서 공지됨) 의 사용은 또한 높은 가공비와 관련되어 있다. 예를 들면, 생체친화성 리간드 (통상적으로 생체분자 자체임), 예를 들면, 단백질 A 는 다른 크로마토그래피 물질의 7 배 내지 15 배 정도로 비용이 든다 (문헌 [Gottschalk, Process Scale Purification of Antibodies (John Wiley & Sons, 1st ed., 2009), chapter 5.3.1] 참조). 추가로, 생체친화성 리간드는 기질 및 컬럼으로부터 침출된다. 이것은, 예를 들면, 여과 막을 사용하는 것에 비해 컬럼의 수명을 유의미하게 단축시킬 뿐만 아니라, 침출된 리간드는 변성될 잠재성을 가지며 관심 분자에서 응집물 형성을 유도할 수 있다. 추가로, 다수의 생체친화성 리간드, 예를 들면, 단백질 A 는 생성물 스트림을 그 존재에 대해 지속적으로 모니터링할 것을 요구하는 독소로 여겨지고/여겨질 것이다. 따라서, 생체친화성 리간드의 사용은 컬럼 물질 자체 및 교체 일정 증가와 같은 직접 비용 뿐만 아니라, 공정 유지, 모니터링 및 잠재적인 추가의 단위 조작 (예를 들면, 침전물/응집물 여과 및/또는 재처리를 위한 요건) 와 관련된 간접 비용의 유의미한 경비를 초래한다. 그러므로, 생체친화도 컬럼, 이의 유지 및 이의 모니터링은 임의의 정제 계획에 있어서 가장 중요한 비용을 초래하고, 비용 효율적인 방식으로 산업적 운용에 통합하기에 곤란할 수 있다.
생체친화성 리간드의 사용과 관련된 높은 비용을 고려하여, 합성 친화성 리간드 및 혼합 모드의 수지를 포함한 다수의 대체물이 친화도 크로마토그래피 방법을 보완 또는 개선하기 위해 탐색되었다 (문헌 [Gottschalk 2009, chapter 5.3.2] 참조). 추가로, 친화성 단위 조작을 완전히 제거하는 처리/정제 방법도 또한 연구되었다. 이러한 방법은 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피를 포함하지 않는 항체의 정제를 위한 3 단계 크로마토그래피 공정의 체계적 평가는 문헌 [Follmann et al., J. Chromatog . 1024 (2004), 79-85] 에 공개되어 있다.
친화도 기반 처리의 보완 또는 대체를 위해 가장 광범위하게 연구된 몇몇 생체분자 정제 공정은 이온 교환 크로마토그래피 공정을 포함하는 것들이다. 특히, 양이온 교환 크로마토그래피 ("CEX") 는 다수의 단백질 정제 계획에서 친화도 기반 단위 조작과의 결합으로 및 이에 대한 대체로서 모두 연구되었다 (예를 들면, 문헌 [Arunakumari et al., Adv . Process Chromatog . (Supp . BioPharm Int.) (2007), 36-40; Arunakumari et al, BioPharm . Int . Supp . March 2, 2009; Wang et al., BioPharm . Int . Supp . March 2, 2008; Gottschalk 2009, chapter 5.3.3; Cacciuttolo, Pharmaceutical Process Scale-Up (CRC Press), 2nd ed. (2006), chapter 5; Morrow, Gen. Eng . Biotech. News 28 (2008; 온라인으로만 이용가능)] 참조). 이의 장래성에도 불구하고, 이온 교환 크로마토그래피는 친화도 크로마토그래피를 완전히 대체하지 못하고, 일반적인 산업적 정제 공정에서 친화도 크로마토그래피와 결합하여 추가의 정제 공정으로서 역할을 하도록 조정되었다. 그러나, 크로마토그래피 공정에서, 로드 물질 (예를 들면, 공정/단위 조작/컬럼에 도입되는 생성물 스트림) 의 조성은 컬럼의 적절한 기능에 중요하다. 그러므로, 크로마토그래피 공정/단위 조작을 가지는 정제 방법에서, 크로마토그래피 공정 이전의 로드 물질의 처리는 필수적인 제 1 단계이다. 예를 들면, 크로마토그래피 단위 조작 이전에, 공급물 스트림 (관심 분자를 함유함) 은 통상적으로 관심 분자의 특정한 등전점 및 특정한 컬럼 파라미터에 따라 적당한 pH, 완충작용 및 전도도로 조정되어야 한다. 따라서, 공급물 스트림의 어떠한 변형이 필요한지를 결정하는 것은 특정한 크로마토그래피 공정 뿐만 아니라 공급물 스트림 조성이다. 따라서, 공급물 스트림에서의 변형은 이온 크로마토그래피 공정의 업스트림에서의 공급물 스트림 처리 및 단위 조작의 유의미한 변형을 필요로 할 수 있다.
공급물 스트림 파라미터의 처리/조정은 종종 정용여과/접선 유동 여과 ("TFF") 를 사용하여 수행된다. 이러한 처리 단계 동안, 공급물 스트림 용매는 특정한 크로마토그래피 조작에 적절한 완충액과의 TFF 동안 정용여과에 의해 점점 교환된다. 예를 들면, CEX 를 사용하는 항체의 정제와 관련하여, 대부분의 공정은 CEX 이전에 공급물 스트림을 낮은 전도도와 함께 약 5 내지 7 의 pH 로 조정하는데, 이는 다수의 항체가 7 초과의 등전점을 나타내기 때문이다. 그러나, 공급물 스트림이 조건화 세포 배지 (예를 들면, 상청액 또는 균질화 세포 배양물) 인 경우, 완충액 교환 동안 공급물 스트림을 중성 미만의 pH 로 조절하면, 오염물, 예를 들면, 숙주 세포 DNA ("HCDNA") 및 숙주 세포 단백질 ("HCP") 의 침전이 종종 발생한다 (예를 들면, [Gottschalk 2009, chapter 5.3.3; Wang et al, 2008] 참조).
침전 사례는 유의미하게 경제적으로 중요한데, 이는 이것이 하나 이상의 추가의 단위 조작 (침전물을 제거하기 위함) 의 부가를 강제할 뿐만 아니라, 침전 공정이 완충액 교환 단위 조작 자체에 부정적으로 영향을 미치기 때문이다 (예를 들면, 조작 동안, 정용여과/TFF 컬럼은 침전물로 폐쇄될 수 있다). 따라서, 크로마토그래피 공정을 사용하는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질의 처리는 통상적으로 침전 탱크 및/또는 여과 장치와 같은 고비용의 단위 조작의 사용을 필요로 한다 (문헌 [Wang et al, 2009] 참조).
그러므로, 이온 교환 크로마토그래피의 장래성에도 불구하고, 산업 현장에서 친화도 기반 단위 조작을 완전히 대체하기에 실현가능한 것으로 거의 입증되지 않았으며, 생물약제의 상업적 생산 공정의 대부분은 이온 교환 단위 조작과 결합된 친화도 정제 단계를 보유하고 있다. 그러나, 상기에서 상세히 설명된 바와 같이, 정제 계획에 비용 및 시간을 추가하는 완충액 파라미터의 유의미한 변형을 종종 요구하는 이들 다중 단위 조작은 좀처럼 양립될 수 없다. 따라서, 비-친화도 기반 공정에 의해 제공되는 정제 가능성을 보다 일관된 방식으로 잘 실현되도록 허용하는, 재조합적으로 생산된 생체분자, 예를 들면, 단백질을 위한 정제 공정의 추가의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 광범위한 공급물 스트림과 양립가능하고; 오염물 로드, 특히, 오염물 숙주 세포 단백질 (HCP) 및/또는 숙주 세포 DNA (HCDNA) 를 상당히 감소시킬 수 있고; 친화도 기반 크로마토그래피와 같은 기타 단위 조작 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 다운스트림 공정과 양립가능한 처리 단계에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과 ("TFF") 를 사용하여 관심 분자를 상기 분자를 함유하는 세포 배양액으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 기재되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 생성물 공급 스트림 중의 오염물 및/또는 불순물의 수준을 실질적으로 감소시키고, 생성물 스트림을 최종 제형 및/또는 순도로 제공하는데 사용될 수 있는 표준 정제 및 단리 단위 조작, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 이전에 실시되는 업스트림 공정으로서 특히 유용하다. 본원에서 기재되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 친화도 기반 크로마토그래피 단위 조작 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 표준 정제 방법을 보완하고 따라서 그것과 양립가능하기 위해 특히 구상된다. 그러나, 본 발명은 또한 개시된 듀얼 스테이지 TFF 방법이 관심 분자의 생산 및/또는 정제에서 친화도 기반 크로마토그래피 단위 조작을 대체하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 불순물 또는 오염물, 예를 들면, 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 숙주 세포 DNA (HCDNA) 를 실질적으로 감소시키기 위해 발효 또는 기타 세포 배양 공정을 포함한 임의의 세포 배양 시스템으로부터의 미가공 공급물 스트림 (즉, 세포 배양액) 의 처리에 사용될 수 있는데, 여기서, 출력 스트림은 이후 친화도 기반 크로마토그래피 단위 조작을 포함 또는 불포함하는 표준 정제 방법을 사용하여 처리될 수 있다. 개시된 듀얼 스테이지 TFF 방법의 사용에 의해 제공되는 공급물 스트림 (즉, 세포 배양물 상청액으로부터) 의 오염물 및/또는 불순물의 실질적인 감소는, 예를 들면, pH 에 의한 불순물 침전 및/또는 침전물 여과와 같은 표준 정제 단위 조작 (완충액 조성에서의 필요한 변화로 인해 이온 교환 크로마토그래피 이전에 통상적으로 요구됨) 에 대한 필요성을 제거하고/하거나, 고비용의 친화도 기반 단위 조작의 효율성을 개선시키거나 이를 심지어 제거할 수 있다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 크로마토그래피 단위 조작과 같은 불순물 로드에 특히 민감한 단위 조작 이전에 실시되는 업스트림 공정으로서 특히 유용하다. 예를 들면, 다운스트림 크로마토그래피 단위 조작, 예를 들면, 컬럼의 사용과 관련하여, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 오염물 로드에서의 실질적인 감소는 크로마토그래피 분리의 개선, 동적 결합 능력의 개선, 작동 수명의 증가 및/또는 필요한 컬럼 크기의 감소를 위해 작용할 수 있는데, 이들 모두는 관심 분자의 생산, 처리 및 정제와 관련된 직접 비용과 간접 비용 둘 다를 유의미하게 감소시킨다.
특히, 본 발명의 방법은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 분자를 함유하는 세포 배양액으로부터 상기 분자의 분리를 제공하는 것으로서, 상기 방법은 실질적으로 오염물 및/또는 불순물의 수준을 감소시킨다. 본 발명자들은 2 개 이상의 TFF 단위 조작 (잔류물 중의 관심 분자를 처리하는 TFF 단위 조작 및 투과물 중의 관심 분자를 처리하는 TFF 단위 조작) 을 조합하는 듀얼 스테이지 TFF 공정이 생성물 스트림 (즉, 처리 동안 관심 분자를 함유하는 세포 배양액) 중의 오염물 및/또는 불순물의 수준을, 표준 처리 (예를 들면, 침전 (특히, pH 조정을 통해 매개됨), 침전물 여과 및 친화도 기반 분리) 를 통한 다운스트림 오염물 제거가 최소화 또는 제거될 수 있도록, 놀라울 정도까지 감소시킬 수 있는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명의 방법은 생성물 스트림의 조성에 특히 민감할 수 있는 다운스트림 크로마토그래피 공정을 포함하는 공정에서 특히 유용하다. 이점에 있어서, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 생성물 스트림의 오염물 및/또는 불순물의 수준에서의 실질적인 감소를 가져올 뿐만 아니라, 이들이 다운스트림 단위 조작과 양립할 수 있도록, 생성물 스트림 파라미터, 예를 들면, pH 및/또는 전도도를 조정하는데 함께 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 ("CEX") 및 음이온 교환 크로마토그래피 ("AEX") 와 같은 다운스트림 크로마토그래피 공정에 매우 유리하다.
듀얼 스테이지 TFF 공정은 다운스트림, 예를 들면, 생성물 스트림을 최종 제형 및/또는 순도를 초래하는데 사용되는 크로마토그래피, 정제 및 단리 공정 이전에 세포 배양액을 처리하는데 적합하다. 본원에서 개시되는 TFF 공정은 유리하게는 생물학적 공정으로부터의 전형적인 미가공 생성물 스트림/세포 배양액 (예를 들면, 조건화 세포 배양 배지, 세포 배양 용해물, 조건화 발효 배지 등) 에 상응하는 pH 또는 대략 이의 pH 에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 개시되는 TFF 방법은 7.5±1.0 또는 7.5±0.5 의 pH 에서 수행된다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 친화도 정제와 같은 당업계에 공지된 다운스트림 표준 정제 공정과 조합될 수 있거나, 특히, 친화도 단리에 기초하지 않는 다운스트림 정제 공정, 예를 들면, 크로마토그래피 공정과 결합될 수 있다. 특히, 본원에서 개시되는 방법은 생성물 스트림에 존재할 수 있는 숙주 세포 단백질 (HCP) 및/또는 숙주 세포 DNA (HCDNA) 와 같은 임의의 잔류 오염물의 침전 없이, 생성물 스트림의 pH 가 다운스트림에서 변경될 수 있도록, 예를 들면, 약 5 이상으로 감소할 수 있도록 오염물 수준을 감소시킨다.
본 발명의 방법은 임의의 분자 종에 사용될 수 있으며, 단백질을 함유하는 용액으로부터 단백질의 분리를 위한 바람직한 실시형태로 본원에서 예시된다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 광범위한 크기 및 분자량에 걸친 단백질 (예를 들면, 폴리펩타이드, 펩타이드, 면역글로불린, 항체, 효소) 에 일반적으로 적용가능한 강력하고 확장가능한 공정 (robust and scalable process) 이다. 본원에서 개시되는 방법은 일반적으로 크기에 기초하여 용액으로부터 관심 단백질을 분리한다. 환언하면, 본 발명의 방법은 임의의 특이적 친화도 또는 친화도 기반 정제 공정에 근거하지 않고, 그러므로, 각종 세포 배양액 공급물 스트림으로부터의 각종 단백질의 처리를 경제적이고 가속적으로 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 단백질 처리, 생산 및/또는 정제와 관련된 간접 비용의 절약, 예를 들면, 공급물 스트림 분석 또는 기존 시스템과의 호환성을 보장하기 위한 공급물 스트림의 전처리와 관련된 비용 절약을 초래할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포 배양액인 공급물 스트림으로부터의 관심 단백질의 분리에 특히 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 세포 배양액 및 유사한 용어는 관심 단백질을 함유할 것으로 예상되는 생물학적 공정 또는 시스템의 임의의 용액을 의미한다. 그러므로, 용어 세포 배양액은 세포 배양물의 발효, 즉, 이종 기원 또는 내생성 단백질의 생산이 수행된 용기의 전체 내용물을 의미할 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양액은 관심 단백질 뿐만 아니라, 기타 단백질 또는 단백질 단편 (예를 들면, 세포 배양물에 의해 내생성 또는 이종 기원으로 생산되거나, 배지 (예를 들면, 공급된 바와 같음) 중에 존재함); 세포 배양물의 세포; 세포 단편; 및/또는 세포 성장 및 단백질 생산을 지원하는 영양 배지로 제공된 기타 성분 또는 배양 동안 숙주 세포에 의해 생산된 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양액은 조건화 세포 배양물 상청액; 정화된 조건화 세포 배양물 상청액 (예를 들면, 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 제거된 미립자 물질을 가지는 조건화 세포 배양물 상청액); 및 정화된 균질화/용해된 세포 배양물을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 모든 측면에서, 세포 배양액은 관심 분자를 함유하는 것으로 이해되며; 즉, 이것은 조건화 세포 배양액, 예를 들면, 조건화 세포 배양물 상청액인 것으로 이해된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 의 공급물 스트림은 발효 반응으로부터의 세포 배양물 상청액이다.
당업계에서 인식되는 바와 같이 그리고 본원에서 개시되는 바와 같이, 세포 배양액은, 임의의 처리 계획에서의 제 1 스테이지로서, 일반적으로 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기를 가지는 필터, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 필터를 통해 여과함으로써 정화 또는 멸균된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 업스트림에서 (즉, 상기 2 개 이상의 TFF 단위 조작의 업스트림에서), 멸균에 적당한 필터, 예를 들면, 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 멸균에 적당한 필터를 통한 세포 배양액의 여과를 포함한다. 세포 배양액의 멸균을 위한 본원에서 개시된 범위를 벗어난 필터의 기타 크기의 사용은, 바람직하든지 바람직하지 않든지 간에, 당업계에 공지되어 있거나 이해되며, 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 모유, 모유로부터의 분획 용액 및/또는 모유로부터의 생성물, 예를 들면, 유청 단백질 단리물의 처리를 포함하지 않는다. 따라서, 본원에서 개시되는 모든 실시형태를 위해, 관심 분자, 예를 들면, 단백질을 함유하는 공급물 스트림 및/또는 생성물 스트림은 모유, 모유로부터의 분획 용액 및/또는 모유로부터의 생성물, 예를 들면, 유청 단백질 단리물이 아니다.
본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 세포 배양액으로부터 분리하는 방법을 제공하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록, 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록, 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과한다.
본원에서 개시되는 바와 같이, 본 발명의 TFF 단위 조작은 한외여과 막의 사용을 포함한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같이, 약어 "TFF" 는, 본원의 맥락에서 사용될 때, 그 단위 조작이 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같은 접선 유동 한외여과를 의미하는 것으로 이해된다. 2 개 이상의 TFF 단위 조작 (즉, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작) 의 막의 컷 오프 값은, 관심 분자, 예를 들면, 단백질이, (i) 제 1 TFF 단위 조작의 막을 통과하지 않고 (즉, 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되고), (ii) 제 2 TFF 단위 조작의 막을 통과하도록 (즉, 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록), 선택된다. 그러므로, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 단백질을 함유하는 용액으로부터 상기 단백질을 분리하는 방법을 추가로 특징으로 할 수 있는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 제 1 TFF 단위 조작의 한외여과 막은, 상기 관심 분자가 제 1 TFF 단위 조작 동안 상기 막을 통과하지 않도록 (즉, 상기 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록), 선택되고, 제 2 TFF 단위 조작의 한외여과 막은, 상기 관심 분자가 제 2 TFF 단위 조작 동안 상기 막을 통과하도록 (즉, 상기 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록), 선택된다. 통상적으로, 여과 막은 기공 크기 또는 컷 오프 값에 의해 분류되는데, 이것은 막의 최대 기공 크기 및/또는 자유롭게 투과가능한 분자의 최대 분자량 (kD) 에 근거하여 막 성능을 정의하고; 따라서, 최대 기공 크기의 컷 오프 값을 초과하는 크기의 분자 및/또는 최대 분자량을 초과하는 크기의 분자는 막을 통과하지 않아야 한다. 그러나, 당업계에서 인식되는 바와 같이, 여과 막 성능은 또한 엄격한 분자 크기 이외의 요인, 예를 들면, 분자 전하에 좌우될 수 있기 때문에, 본 개시내용은, 관심 분자, 예를 들면, 단백질이 제 1 TFF 단위 조작에서 제 1 막을 통과하지 않고, 제 2 TFF 단위 조작의 제 2 막을 통과한다면, 막이 선택될 수 있는 기준을 제한하지 않는다. 그러므로, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따라 사용되는 막의 컷 오프 값은 주장된 컷 오프 값 또는 기공 크기 (예를 들면, 제조사의 사양에 따름) 에만 근거하기 보다는 오히려 막 성능에 근거하여 선택될 수 있다. 막 성능을 결정하는 방법, 구체적으로, 관심 분자, 예를 들면, 단백질에 대한 막의 투과도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 일상적으로 실시된다.
본 발명의 TFF 단위 조작, 예를 들면, 본 발명과 관련하여 개시되는 제 1 TFF 단위 조작과 관련하여, 문구 "막을 통과하지 않음" 및 "상기 TFF 단위 조작의 잔류물로 존재함" 은 동등하며, 상기 TFF 단위 조작의 막이 관심 분자, 예를 들면, 단백질에 본질적으로 불투과성임을 나타낸다. 추가로, 막 성능은 당업계에서 인식되는 바와 같이 생물학적 용액 및 분자 (예를 들면, 단백질) 와 관련하여 달라질 수 있기 때문에, 문구 "막을 통과하지 않음", "상기 TFF 단위 조작의 잔류물로 존재함" 및/또는 "본질적으로 불투과성임" 은, 이들 용어 및 문구가 본 개시내용을 통해 사용되는 바와 같이, 절대적인 표현으로 해석되지 않는 것으로 이해된다. 오히려, 본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 당업계에서의 이해에 따르면, 상기 문구는, 제 1 여과 막이 "누출 (breakthrough)" 을 나타낼 수 있지만 (즉, 최소량의 관심 분자가 막을 투과하도록 허용하지만), 제 1 TFF 단위 조작에 적용되는 관심 분자의 양의 90 % 이상이 잔류물로 존재하거나 회수될 수 있다는 인식으로 사용된다.
마찬가지로, 본 발명의 TFF 단위 조작, 예를 들면, 본 발명과 관련하여 개시되는 제 2 TFF 단위 조작과 관련하여, 문구 "막을 통과함" 및 "상기 TFF 단위 조작의 투과물로 존재함" 은 동등하며, 상기 TFF 단위 조작의 막이 관심 분자, 예를 들면, 단백질에 본질적으로 자유롭게 투과성임을 나타낸다. 추가로, 막 성능은 당업계에서 인식되는 바와 같이 생물학적 용액 및 분자 (예를 들면, 단백질) 와 관련하여 달라질 수 있기 때문에, 문구 "막을 통과함", "상기 TFF 단위 조작의 투과물로 존재함" 및/또는 "본질적으로 투과성임" 은, 이들 용어 및 문구가 본 개시내용을 통해 사용되는 바와 같이, 절대적인 표현으로 해석되지 않는 것으로 이해된다. 오히려, 본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 당업계에서의 이해에 따르면, 상기 문구는, 여과 막이 필터에/필터를 통해 적용되는 관심 분자의 100 % 에 대해 자유롭게 투과가능할 수 없고, 상기 막이 관심 분자의 적용된 로드의 약간의 퍼센트에 대해 불투과성을 나타낼 수 있다는 인식으로 사용된다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 문구는 제 2 TFF 단위 조작에 적용되는 관심 분자의 양의 90 % 이상이 투과물로 존재하거나 회수될 수 있는 것을 나타낸다.
따라서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 전형적으로는 상이한 컷 오프 값, 기공 크기 및/또는 투과도 측정치를 각각 가지는 2 개 이상의 한외여과 막의 사용을 포함한다. 제 1 TFF 단위 조작의 한외여과 막은, 상기 관심 분자가 조작 동안 막을 통과하지 않고 조작의 잔류물로 회수될 수 있도록, 선택된다. 전형적으로, 이것은 관심 분자의 분자량 미만인 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막 (즉, 제 1 TFF 단위 조작의 막) 을 선택함으로써 달성된다. 그러나, 당업계에서 인식되는 바와 같이, 막 성능은 분자 크기를 넘어 기타 요인에 좌우될 수 있고; 따라서, 특정한 컷 오프 값을 가지는 막은 그럼에도 불구하고 명시된 컷 오프 값 미만의 크기를 가지는 분자의 통로를 차단하는데 극히 효율적일 수 있다. 그러므로, 관심 분자의 분자량 초과의 컷 오프 값을 가지는 막은, 관심 분자가 제 1 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않는다면, 제 1 TFF 단위 조작에서 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따르면, 제 1 TFF 단위 조작에서의 사용을 위해 선택된 특정 막은 임의의 다른 방식으로 제한되지 않으며, 본원에서 제시된 다른 기준을 충족한다면 제조 용이성 또는 상업적 이용가능성에 근거하여 선택될 수 있다. 개시된 본 발명의 비제한적인 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은, 관심 분자가 제 1 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않는다면, 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 1.5, 1, 1/2, 1/3, 1/5, 1/10 또는 1/15 배일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자의 분자량의 1/15 미만이다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 약 절반 이하이다. 환언하면, 이들 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하이다. 특정한 막의 선택은 또한 추가의 파라미터, 예를 들면, 이용가능성 (예를 들면, 상업적으로 이용가능하든지 또는 자체 제조에 의해 이용가능하든지) 또는 성능 (예를 들면, 구체적으로 공지된 오염물/불순물로부터 관심 분자를 분리하는데 있어서의 성능) 에 좌우될 수 있다.
본 발명은, 제 2 TFF 단위 조작의 한외여과 막이 관심 분자가 조작 동안 막을 통과하고 상기 단위 조작의 투과물로 회수될 수 있도록 선택되는 것을 또한 제공한다. 전형적으로, 이것은 관심 분자의 분자량을 초과하지만 최대 1000 kD (본원에서 설명되는 "한외여과" 를 위한 분자의 최대 크기임) 인 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막 (즉, 제 2 TFF 단위 조작의 막) 을 선택함으로써 달성된다. 따라서, 제 2 TFF 단위 조작에서의 사용을 위해 선택되는 특정한 막은 임의의 다른 방식으로 제한되지 않고, 본원에서 제시된 다른 기준을 충족한다면 제조 용이성 또는 상업적 이용가능성에 근거하여 선택될 수 있으며, 즉, 관심 분자는 제 2 TFF 단위 조작에서 막을 통과하고, 여기서, 제 2 막은 1000 kD 의 최대 컷 오프 값을 가진다. 개시된 본 발명의 비제한적 실시형태에서, 제 2 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은, 관심 분자가 제 2 TFF 단위 조작 동안 필터 막을 통과하고, 컷 오프 값이 1000 kD 를 초과하지 않는다면, 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 100 배일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 용액으로부터 분리하는 방법을 또한 제공하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고/하거나, 제 1 한외여과 막의 컷 오프 값은 상기 단백질의 분자량의 0.5 배이고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고, 제 2 한외여과 막의 컷 오프 값은 1000KD 를 초과하지 않는다.
개시된 본 발명은 한외여과의 방법에 관한 것이고; 따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 막의 최대 컷 오프 값 (즉, 제 2 TFF 단위 조작에서) 은 당업계에서 정의되는 한외여과를 위한 상한 크기인데, 즉, 분자의 여과와 관련하여 1000 kD 이하이다. 따라서, 이것은 또한 본 발명의 방법에 포함되는 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 크기 및/또는 분자량을 제한한다. 본 발명에 따른 관심 분자는 한외여과를 위한 상한 크기, 즉, 1000 kD 이하이다. 개시된 본 발명의 비제한적 실시형태에서, 제 2 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은, 관심 분자가 제 2 TFF 단위 조작 동안 필터 막을 통과하고, 막 컷 오프 값이 1000 kD 이하라면, 관심 분자의 분자량의 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 배일 수 있다. 본 발명에 따른 관심 분자는 약 10 kD 내지 약 1000 kD 의 분자량을 가지는 분자일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 관심 분자는 약 25 kD 내지 약 667 kD 의 분자량을 가지는 단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 관심 분자는 약 25 kD 내지 약 300 kD 의 분자량을 가지는 단백질이다. 가장 바람직한 실시형태에서, 관심 분자는 150 kD±75 kD 의 분자량을 가지는 항체, 항체 단편 및/또는 단백질이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 2 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 2 배 이상 1000 kD 이하이다. 환언하면, 이들 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 2 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자의 분자량의 2 배 이상 1000 kD 미만이다. 본 실시형태에 따르면, 관심 분자는 약 500 kD 의 최대 분자량을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 세포 배양액으로부터 분리하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 는 적어도 하기를 포함한다:
(i) 관심 단백질의 분자량 미만의 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하는 제 1 접선 유동 한외여과 단위 조작; 및
(ii) 관심 단백질의 분자량 초과의 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하는 제 2 접선 유동 한외여과 단위 조작.
본 발명의 구성성분 (i) 및 구성성분 (ii) 는, 추가의 실시형태에서, 상기 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되고 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 세포 배양액으로부터 분리하는 방법을 또한 제공하는 것으로서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 는 적어도 하기를 포함한다:
(i) 관심 단백질의 분자량의 0.5 배 이하의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하는 제 1 접선 유동 한외여과 단위 조작; 및
(ii) 관심 단백질의 분자량의 2 배 이상 1000 KD 미만의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하는 제 2 접선 유동 한외여과 단위 조작.
본 발명의 구성성분 (i) 및 구성성분 (ii) 는, 추가의 실시형태에서, 상기 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되고 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다.
본원에서 이미 개시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 의 공급물 스트림은 세포 배양물 상청액이다. 세포 배양물 상청액은 본원에서 개시되고/되거나 당업계에서 공지된 임의의 방법에 따른 듀얼 스테이지 TFF 방법/조작의 실시 이전에 멸균될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법/조작의 업스트림에서 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 필터를 통한 세포 배양물 상청액의 여과를 포함한다. 추가로 또는 다르게는, 본 발명은 세포 상청액이 본원에서 기재되는 나머지 듀얼 스테이지 TFF 조작의 업스트림에서 0.22 μm 이하의 기공 크기를 가지는 필터, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기의 필터를 통해 여과되는 방법 및/또는 조작을 포함한다. 따라서, 세포 배양물 상청액은 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 실시 이전에 하나 이상의 추가의 조작에 의해 처리될 수 있거나, 본 발명의 2 개 이상의 TFF 단위 조작 중 하나에 직접 공급될 수 있다. 그러므로, 특정 실시형태에서, 세포 배양물 상청액 (0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기의 필터, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기의 필터를 통해 임의로 여과됨) 은 각각 본원에서 정의되는 제 1 TFF 단위 조작 또는 제 2 TFF 단위 조작에 의해 여과된 제 1 생성물 스트림 또는 제 2 생성물 스트림이다. 따라서, 이들 실시형태에서, 예를 들면, 본원에서 기재되는 여과에 의한, 임의의 멸균을 제외하고, 본원에서 정의되는 제 1 TFF 단위 조작 또는 제 2 TFF 단위 조작은 미가공 세포 배양물 상청액을 처리하는 제 1 단위 조작이다.
그러므로, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 용액으로부터 분리하는 방법을 또한 제공하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고/하거나, 제 1 한외여과 막의 컷 오프 값은 상기 단백질의 분자량의 0.5 배이고,
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 관심 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 통해 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고, 제 2 한외여과 막의 컷 오프 값은 1000KD 를 초과하지 않고;
상기 용액은 상기 듀얼 스테이지 TFF 의 업스트림에서 0.1 μm 와 0.45 μm 의 기공 크기의 필터를 통해 여과되는 세포 배양물 상청액이다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 정용여과의 하나 이상의 스테이지를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 정용여과는 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작과 결합될 수 있다 (즉, 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물은, 예를 들면, 당업계에서 공지된 바와 같이 완충액 교환 및/또는 관심 분자의 농축을 위해 정용여과된다). 본 개시내용을 통해 사용되는 바와 같이, 본원에서 정의되는 특이적인 2 개 이상의 TFF 단위 조작과 관련한 용어 "제 1" 및 "제 2" 는 단지 개별 TFF 단위 조작의 지정번호인 것으로 이해되며, 듀얼 스테이지 TFF 방법 자체 내의 임의의 공정 또는 시간 순서를 시사하는 것으로 의도되지 않는다. 구체적으로, 본원에서 정의되는 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 관심 분자가 막을 통과하지 않도록, 필터 막을 포함하는 것을 특징으로 하고, 본원에서 정의되는 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 관심 분자가 막을 통과하도록, 필터 막을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작에서 사용되는 필터 막은 관심 분자의 분자량의 약 1/2 (0.5) 배 이하인 컷 오프 값을 가지는 것을 특징으로 하고, 본원에서 개시되는 제 2 TFF 단위 조작에서 사용되는 필터 막은 관심 분자의 분자량의 2 배 이상 1000 kD 미만인 컷 오프 값을 가지는 것을 특징으로 한다.
TFF 단위 조작과 관련한 식별번호 제 1 및 제 2 는 공정 또는 시간 순서를 시사하지 않으며, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작이 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있는 실시형태 뿐만 아니라, 제 1 TFF 단위 조작이 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있는 실시형태도 포함한다. 제 1 TFF 단위 조작이 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있는 경우, 제 1 TFF 단위 조작의 공급물 스트림은 제 2 TFF 단위 조작의 투과물 스트림일 수 있다. 제 1 TFF 단위 조작의 공급물 스트림이 제 2 TFF 단위 조작으로부터의 투과물 스트림인 경우, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 병렬로 (예를 들면, 동시에) 수행하여 제 2 TFF 단위 조작으로부터 투과물의 저장에 대한 필요성을 제거할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있다. 본 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 에 대한 공급물 스트림은 최대 0.22 μm 필터를 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액일 수 있으며, 여기서, 공급물 스트림은 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작에 의해 직접 처리된다 (즉, 하나 이상의 추가의 단위 조작에 의한 추가의 처리를 가지지 않는 제 1 공급물 스트림을 형성한다). 본 실시형태에 따르면, 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있으며, 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물 스트림은 제 2 TFF 단위 조작의 공급물 스트림을 직접 형성하거나 형성하지 않을 수 있다 (즉, 제 1 TFF 단위 조작에 이어서, 다운스트림에서 바로 제 2 TFF 단위 조작이 따를 수 있거나, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작은 하나 이상의 추가의 단위 조작에 의해 분리될 수 있다). 바람직한 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작에 이어서, 다운스트림에서 바로 제 2 TFF 단위 조작이 따른다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 하나 이상의 추가의 TFF 단위 조작을 포함할 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 추가의 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 업스트림에, 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에, 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에, 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있을 수 있고/있거나, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 사이에 배치될 수 있다.
듀얼 스테이지 TFF 방법의 하나 이상의 추가의 TFF 단위 조작은 제 3 TFF 단위 조작일 수 있다. 제 3 TFF 단위 조작의 한외여과 막은, 관심 분자가 제 3 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않도록, 선택된다. 그러므로, 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 선별을 위한 기준은 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 선별을 위한 기준과 동일하다. 제 1 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막은 동일하거나 상이할 수 있으며; 제 1 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작의 막의 컷 오프 값 또는 기타 투과도 파라미터 (예를 들면, 기공 크기) 는 동일하거나 상이할 수 있다.
제 1 TFF 단위 조작과 관련하여 본원에서 기재되는 바와 같이, 제 3 TFF 단위 조작의 막의 컷 오프 값은 전형적으로는 관심 분자의 분자량 미만일 것이다. 그러나, 막 성능에 근거하여, 관심 분자의 분자량 초과의 컷 오프 값을 가지는 막은, 관심 분자가 제 3 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않는다면, 제 3 TFF 단위 조작에서 사용될 수 있다. 따라서, 제 3 TFF 단위 조작에서의 사용을 위해 선택된 특정 막은, 임의의 다른 방식으로 제한되지 않으며, 본원에서 제시된 다른 기준을 충족한다면 제조 용이성 또는 상업적 이용가능성에 근거하여 선택될 수 있다. 개시된 본 발명의 비제한적인 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은, 관심 분자가 제 3 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않는다면, 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 1.5, 1, 1/2, 1/3, 1/5, 1/10 또는 1/15 배일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자의 분자량의 1/15 미만이다. 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막과 같이, 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 선택도 또한 추가의 파라미터, 예를 들면, 이용가능성 (예를 들면, 상업적으로 이용가능하든지 또는 자체 제조에 의해 이용가능하든지) 또는 성능 (예를 들면, 구체적으로 공지된 오염물/불순물로부터 관심 분자를 분리하는데 있어서의 성능) 에 좌우될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분자량의 약 절반 이하이다. 환언하면, 이들 실시형태에서, 본원에서 개시되는 제 3 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하이다.
제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 한외여과 막과 동일하거나 상이한 물질인 한외여과 막을 가질 수 있다. 따라서, 제 3 TFF 단위 조작의 한외여과 막은 제 1 TFF 단위 조작의 한외여과 막의 컷 오프 값과 동일하거나 상이한 컷 오프 값을 가질 수 있다. 제 3 TFF 단위 조작은 본원에서 기재되거나 당업계에서 공지된 임의의 방법에 따른 정용여과와 결합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 3 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값은 제 1 TFF 단위 조작의 컷 오프 값과 동일하다.
특정 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 둘 다의 업스트림에 있는 제 3 TFF 단위 조작을 포함하는 것으로서, 여기서, 상기 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있다. 본 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 직접 있거나 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 수행될 수 있어서, 즉, 제 2 TFF 단위 조작의 투과물 (관심 분자를 함유함) 은 제 3 TFF 단위 조작을 위한 생성물 스트림을 형성할 수 있다. 제 3 TFF 단위 조작은 하나 이상의 추가의 단위 조작 또는 공정에 의해 제 2 TFF 단위 조작과 분리될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작은 상기 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하인 컷 오프 값을 가지는 필터 막을 가진다. 추가의 특정 측면에서, 제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 필터 막의 컷 오프 값과 동일한 컷 오프 값을 가지는 필터 막을 가진다. 제 3 TFF 단위 조작을 포함하는 모든 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법의 공급물 스트림은 0.22 μm 이상의 필터를 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액일 수 있으며, 여기서, 공급물 스트림은 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작에 의해 직접 처리된다 (즉, 하나 이상의 추가의 단위 조작에 의한 추가의 처리를 가지지 않는 제 1 공급물 또는 생성물 스트림을 형성한다). 본 실시형태에 따르면, 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있으며, 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물 스트림은 제 2 TFF 단위 조작의 생성물/공급물 스트림을 직접 형성할 수 있거나 이를 형성하지 않을 수 있다 (즉, 제 1 TFF 단위 조작에 이어서, 다운스트림에서 바로 제 2 TFF 단위 조작이 따르거나, 하나 이상의 추가의 단위 조작이 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 분리할 수 있다).
특정 실시형태에서, 관심 분자는 약 10 kD 내지 약 300 kD, 약 25 kD 내지 약 300 kD, 약 50 kD 내지 약 300 kD, 약 75 kD 내지 약 300 kD, 약 100 kD 내지 약 300 kD, 약 120 kD 내지 약 300 kD, 약 135 kD 내지 약 300 kD, 약 10 kD 내지 약 200 kD, 약 25 kD 내지 약 200 kD, 약 50 kD 내지 약 200 kD, 약 75 kD 내지 약 200 kD, 약 100 kD 내지 약 200 kD, 약 120 kD 내지 약 200 kD, 약 135 kD 내지 약 200 kD, 약 10 kD 내지 약 175 kD, 약 25 kD 내지 약 175 kD, 약 50 kD 내지 약 175 kD, 약 75 kD 내지 약 175 kD, 약 120 kD 내지 약 175 kD 또는 약 135 kD 내지 약 175 kD 의 분자량을 가지는 단백질인 생체분자이다.
바람직한 실시형태에서, 관심 분자는 150 kD±75 kD 의 분자량을 가지는 단백질인 생체분자이다. 따라서, 비제한적 실시형태에서, 관심 단백질은 약 75 kD, 약 80 kD, 약 90 kD, 약 95 kD, 약 100 kD, 약 105 kD, 약 110 kD, 약 115 kD, 약 120 kD, 약 125 kD, 약 130 kD, 약 135 kD, 약 140 kD, 약 150 kD, 약 155 kD, 약 160 kD, 약 165 kD, 약 170 kD, 약 175 kD, 약 180 kD, 약 185 kD, 약 190 kD, 약 195 kD, 약 200 kD, 약 205 kD, 약 210 kD, 약 215 kD, 약 220 kD 또는 약 215 kD 일 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 관심 단백질은 150 kD±15 kD, 150 kD±30 kD, 150 kD±50 kD 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 한다. 150 kD±75 kD 의 분자량을 가지는 단백질의 비제한적인 예는 면역글로불린 및 항체를 포함한다. 150 kD±75 kD (예를 들면, 150 kD±30 kD 및/또는 150 kD±15 kD) 의 분자량을 가지는 단백질과 함께 사용될 수 있는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 비제한적인 예는, 제 1 TFF 단위 조작에 대해서는 50 kD 이하의 컷 오프 값을 가지는 필터 막; 제 2 TFF 단위 조작에 대해서는 300 kD 이상 1000 KD 이하의 컷 오프 값을 가지는 필터 막; 및 50 kD 이하의 컷 오프 값을 가지는 임의의 제 3 TFF 단위 조작을 포함한다. 이러한 단백질을 위한 듀얼 스테이지 TFF 방법의 특정 예는, 제 1 TFF 단위 조작에 대해서는 30 kD 내지 50 kD (바람직하게는 50 kD) 의 컷 오프 값을 가지는 필터 막; 제 2 TFF 단위 조작에 대해서는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 필터 막; 및 30 kD 내지 50 kD (바람직하게는 50 kD) 의 컷 오프 값을 가지는 필터 막을 가지는 임의의 제 3 TFF 단위 조작의 사용을 포함한다.
본원에서 개시되는 바와 같이, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 세포 배양물 상청액 (예를 들면, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마 세포 배양물의 상청액) 으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작, 및 임의의 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 30 kD 내지 50 kD (바람직하게는 50 kD) 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 이상 1000 kD (바람직하게는 300 kD) 이하인 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 임의의 제 3 TFF 단위 조작은 30 kD 내지 50 kD 이하 (바람직하게는 50 kD) 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과한다.
본 단락에 기재된 실시형태와 관련된 바람직한 측면에서, 제 1 생성물 스트림은 임의로 멸균된 세포 배양물 상청액이다. 임의의 멸균은 당업계에서 공지되고/되거나 본원에서 기재된 임의의 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들면, 제 1 TFF 단위 조작의 업스트림에서의 제 1 생성물 스트림의 멸균은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 실시되고, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 실시된다. 본 단락에서 기재된 실시형태와 관련된 추가의 바람직한 측면에서, 제 2 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고; 즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다. 본 단락에서 기재된 실시형태와 관련한 추가의 바람직한 측면에서, 임의의 제 3 TFF 단위 조작은, 존재한다면, 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 직접 있거나 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 수행되고; 즉, 본 측면에서, 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 (존재하는 경우) 사이에 개재 단위 조작은 없다.
개시내용을 통해 요약된 바람직한 측면 및/또는 실시형태는 듀얼 스테이지 TFF 방법으로 개별적으로 실시될 수 있는 별개의 측면으로서 명백히 개시되어 있으며, 또한 하나 이상의 다른 바람직한 측면과 결합될 수 있는 조합 측면으로서 개시되어 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 세포 배양물 상청액 (예를 들면, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마 세포 배양물의 상청액) 으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작, 및 임의의 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 임의의 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고,
여기서, 상기 제 1 생성물 스트림은 0.22 μm 이하의 기공 크기를 가지는 필터 막을 통한 여과에 의해 임의로 멸균된 세포 배양물 상청액이고; 상기 제 2 TFF 단위 조작은 바로 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있고; 상기 임의의 제 3 TFF 단위 조작은, 존재한다면, 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 바로 있거나 상기 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 수행된다.
상기에서 바로 기재된 듀얼 스테이지 TFF 방법의 특정 실시형태에서, 제 1 생성물 스트림은 0.22 μm 필터로 단지 임의로 여과된 세포 배양물 상청액이고, 제 1 TFF 단위 조작은 바로 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있고, 제 2 TFF 단위 조작은 바로 임의의 제 3 TFF 단위 조작의 업스트림에 있다 (즉, 듀얼 스테이지 TFF 방법의 본 특정 실시형태는 제 1 단위 조작, 제 2 단위 조작 및 임의의 제 3 TFF 단위 조작 사이에서의 다른 단위 조작의 사용을 포함하지 않는다). 추가로, 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 수행될 수 있거나 제 2 TFF 단위 조작의 완료 후에 실시될 수 있다 (즉, 각각의 TFF 단위 조작은 배치식으로 수행된다). 다른 관련 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작의 사이에, 및/또는 제 2 TFF 단위 조작과 임의의 제 3 TFF 단위 조작의 사이에 개재될 수 있는 하나 이상의 추가의 단위 조작의 사용을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "업스트림에서 바로 조작됨", "직접 다운스트림에서 조작됨", "업스트림에 바로 있음", "다운스트림에 바로 있음" 및 유사한 문구는 시간 순서의 구성성분을 시사하지 않고; 따라서, 예를 들면, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작의 조작 또는 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작의 조작은 임의의 특정 시간 내에 일어나거나 처리될 필요는 없다. 오히려, 상기 문구는 생성물 스트림이 제 1 단위 조작과 제 2 단위 조작 사이에서 또는 제 2 단위 조작과 제 3 단위 조작 사이에서 다른 단위 조작에 의해서 처리되지 않는 것을 나타내고; 따라서, 예를 들면, 제 1 TFF 단위 조작은, 예를 들면, 배치 방식으로 수행될 수 있고, 생성물 스트림, 즉, 잔류물 스트림이 저장/수송 및 저장될 수 있고, 이어서 미래의 어느 시점에서, 생성물 스트림은 제 2 TFF 단위 조작에 의해 처리된다 (어떠한 개재 단위 조작도 일어나지 않는 한).
특정한 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고,
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
여기서, 상기 제 2 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고; 즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고.
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고.
여기서, 상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작된다 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다).
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
특정한 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작된다 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다).
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 상기 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 관심 분자를 함유하는 용액으로부터 오염물 및 불순물의 수준을 감소시키는데 효과적이다. 특히, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 하나 이상의 단위 조작 (예를 들면, 크로마토그래피 컬럼) 에서의 다운스트림 처리 전에 세포 배양액의 미가공 공급물 스트림 (예를 들면, 0.22 μm 의 막을 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액) 에서 오염물 및/또는 불순물 수준을 감소시키는데 효과적이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오염물", "불순물" 및 유사한 용어는 당업계에서 공지된 이들의 표준 의미를 가지며, 특히, 관심 분자를 함유하는 용액에서의 원치않는 구성성분을 나타낸다. 세포 배양액 (예를 들면, 0.22 μm 의 막을 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액) 의 미가공 공급물 스트림에서 발견될 수 있는 이러한 원치않는 구성성분의 비제한적인 예는 원치않는 단백질, 원치않는 소형 분자, 관심 분자의 단편, 관심 분자의 응집물, 세포 배양 배지의 원치않는 구성성분, 세포에 의해 생산된 원치않는 구성성분 (내생성이든지 또는 이종 기원이든지). 일반적으로, 이러한 오염물 및/또는 불순물은 문헌에서 숙주 세포 단백질 ("HCP") 및 숙주 세포 DNA ("HCDNA") 로서 언급된다.
비제한적인 예에서, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 의 공급물 스트림을 형성하는 세포 배양액 (예를 들면, 세포 배양물 상청액) 은 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 조작 이전에 적어도 500,000 pg/mg 관심 단백질, 적어도 750,000 pg/mg 관심 단백질, 또는 적어도 1,000,000 pg/mg 관심 단백질의 HCDNA 농도를 가질 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 의 공급물 스트림을 형성하는 세포 배양액 (예를 들면, 세포 배양물 상청액) 은 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 조작 이전에 적어도 100,000 ng/mg 관심 단백질, 적어도 150,000 ng/mg 관심 단백질, 또는 적어도 200,000 ng/mg 관심 단백질의 HCP 농도를 가질 수 있다.
본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 (예를 들면, 세포 배양물 상청액) 중의 HCP 의 수준을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45 % 또는 50% 이상 감소시킬 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 (예를 들면, 세포 배양물 상청액) 중의 HCDNA 의 수준을 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90 % 이상 또는 95% 이상 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 상기 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 HCDNA 의 수준을 85% 내지 95% 감소시킨다. % 감소는 HCP 및/또는 HCDNA 의 농도의 측정에 적합한 본원에서 개시되고/되거나 당업계에서 공지된 임의의 방법에 따라 측정되며, 듀얼 스테이지 TFF 의 실시 후의 관심 단백질을 함유하는 용액 중의 HCP 및/또는 HCDNA 의 수준을 듀얼 스테이지 TFF 의 실시 전의 관심 단백질을 함유하는 용액 중 (예를 들면, 미가공 공급물 스트림 중) 의 HCP 및/또는 HCDNA 의 수준과 비교함으로써 계산된다. 듀얼 스테이지 TFF 는 본원에서 개시되는 정용여과 및/또는 완충액 교환 중의 하나 이상의 단계를 포함하기 때문에, HCP 및 HCDNA 이외의 구성성분과 관련한 관심 단백질을 함유하는 용액의 조성은 또한 상기 방법 동안 유의미하게 변할 수 있다.
듀얼 스테이지 TFF 방법의 실시 전의 관심 단백질을 함유하는 용액이 세포 배양물 상청액인 특정 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 상기 용액 중의 DNA 의 농도를 상기 단백질 mg 당 600,000 pg 이하까지, 상기 단백질 mg 당 500,000 pg 이하까지, 상기 단백질 mg 당 400,000 pg 이하까지, 상기 단백질 mg 당 300,000 pg 이하까지 또는 상기 단백질 mg 당 200,000 pg 이하까지 감소시키고/시키거나, 상기 용액 중의 HCP 의 농도를 상기 단백질 mg 당 450,000 ng 이하까지, 상기 단백질 mg 당 400,000 ng 이하까지, 또는 상기 단백질 mg 당 350,000 ng 이하까지 감소시킨다.
본 발명의 방법은, 특정 실시형태에서, 발효 반응으로부터의 관심 단백질의 정제에 적합한데, 여기서, 상기 발효 반응은 고농도의 단백질을 생산한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양액으로부터의 관심 단백질의 정제를 포함하는데, 여기서, 상기 단백질은 상기 용액 중에서 200 mg/l, 400 mg/l, 600 mg/l, 700 mg/1, 800 mg/l, 900 mg/l, 1 g/l, 1.5 g/l, 2 g/l, 2.5 g/l, 3 g/l, 3.5 g/l, 4 g/l, 4.5 g/l 또는 5 g/l 이상의 농도를 가진다.
특정한 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고.
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고.
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 상기 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
특정한 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고,
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하여 관심 면역글로불린 (예를 들면, 항체) 을 상기 면역글로불린을 포함하는 세포 배양물 상청액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 것으로서,
상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작을 포함하고,
(i) 상기 제 1 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
(ii) 상기 제 2 TFF 단위 조작은 300 kD 과 1000 kD 사이, 바람직하게는 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
(iii) 상기 제 3 TFF 단위 조작은 50 kD 이하, 바람직하게는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 관심 면역글로불린을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하고;
상기 제 2 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 1 TFF 단위 조작과 상기 제 2 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 직접 또는 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 조작되고 (즉, 본 측면에서, 상기 제 2 TFF 단위 조작과 제 3 TFF 단위 조작 사이의 개재 단위 조작은 없다);
상기 제 1 생성물 스트림은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기 (바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm) 를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 세포 배양물 상청액이고;
상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 조작 이후,
(a) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCP 농도에 비해 10 % 이상 감소하고/하거나;
(b) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCP 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 400,000 ng 이하이고/이거나;
(c) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 농도에 비해 30 % 이상 감소하고/하거나;
(d) 상기 면역글로불린을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 상기 면역글로불린 mg 당 1,500,000 pg 이하이고;
상기 방법은 상기 제 1 TFF 단위 조작, 상기 제 2 TFF 단위 조작 및 상기 제 3 TFF 단위 조작의 다운스트림에서 크로마토그래피 공정 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정 및/또는 친화도 크로마토그래피 공정) 을 추가로 포함한다.
모든 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 본 발명의 측면 및/또는 실시형태로서 기재되는지, 및 바람직하든지 아닌지, 친화도 정제와 같은 당업계에서 공지된 다운스트림 표준 정제 공정과 또는, 특히, 친화도 단리에 근거하지 않은 다운스트림 정제 공정, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 공정과 결합될 수 있다. 특정 예에서, 모든 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 예를 들면, 단백질 A (예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피) 의 사용을 포함하는 친화도 정제 공정의 업스트림에 있을 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 모든 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 예를 들면, CEX 및/또는 AEX 와 같은 크로마토그래피 공정/단위 조작을 포함하는 비-친화도 정제 공정의 업스트림에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 CEX 와 AEX 를 둘 다 포함하는 비-친화도 정제 공정의 업스트림에 있을 수 있으며, 여기서, AEX 는 임의로 CEX 의 업스트림에 있다.
특정 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 CEX 공정/단위 조작의 업스트림에 있으며, 여기서, 관심 분자를 함유하는 용액의 pH 는 CEX 공정/단위 조작 이전에 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0 으로 조정된다. 본 실시형태의 특정 측면에서, 본 발명의 방법에 따른 CEX 이전의 pH 의 조정은 용액 내의 HCP 및/또는 HCDNA 의 침전과 관련되지 않는다. 본 실시형태에 따른 특정한 측면에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 CEX 공정/단위 조작의 업스트림에 있으며, 여기서, 침전 또는 침전물 여과 공정은 CEX 공정/단위 조작 이전에 실시되지 않는다.
본 발명의 기타 목적 및 장점은 본 발명의 실례 및 실시예, 특정 실시형태에 의해 의해 제시되는 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
정의
일반적으로, 하기 용어 또는 문구는 요약, 설명, 실시예 및 특허청구범위에서 사용될 때에 명시된 정의를 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 수와 관련된 용어 "약" 은 그 수의 ±5 % 를 나타낸다. 장치에 의해 수행된 측정 (예를 들면, pH 미터에 의해 측정된 pH) 또는 당업계에서 공지된 표준 방법에 따라 수행된 측정 (예를 들면, HPLC, UV 흡착, ELISA, 표준 키트 (예를 들면, 비색 분석법) 에 의해 측정된 용액의 단백질 농도) 과 관련하여 사용될 때, 이것은 이러한 장치에 대해 알려진 표준 오차 내의 수 또는 이러한 방법에 대한 측정치의 표준 편차 내의 수를 나타낸다.
용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는, 예를 들면, 단일 모노클론 항체 (작용제, 길항제 및 중화 항체; 뿐만 아니라 탈면역화된, 쥐과동물, 키메라, 인간화 및 인간 항체), 폴리-에피토프 특이성을 가지는 항체 조성물, 단일 쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 면역 접합체, 합성 항체, 카멜화 항체 (camelized antibody), 단일 쇄 Fv (scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합 Fv (sdFv), 인트라바디, 및 상기의 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 용어 "항체" 는 또한 임의의 타입 (예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 범위의 정의와 관련한 용어 "사이" 는 그 범위의 끝점을 분명히 포함한다. 따라서, 파라미터가 "X 와 Y 사이" 인 것으로 본원에서 정의되는 경우, 그 파라미터는 X 와 동일하거나 X 보다 큰 값을 가질 수 있고, 그 값은 최대 Y 이고, 즉, Y 보다 크지 않다. 환언하면, 문구 "X 와 Y 사이" 및 유사한 구조로 정의된 값은 분명히 X 및 Y 값을 포함한다. 예를 들면, 본 개시내용을 통해 사용되는 문구 "막은 300 kD 와 1000 kD 사이의 컷 오프 값을 가짐" 은 막이 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 실시형태 뿐만 아니라, 막이 1000 kD 의 컷 오프 값을 가지는 실시형태를 포함하는 것으로 분명히 의도된다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭은 파생어를 포함한다. 특히, 본 발명은 세포, 세포주 및 세포 배양물의 생산물로부터의 관심 분자, 예를 들면, 단백질의 분리 및/또는 정제를 포함한다. 이러한 생산물은 전형적으로는 조건화 세포 배지 및/또는 용해 및 균질화 세포 및 세포 배양물 (예를 들면, 조건화 세포 배지 내의 균질화 세포 및 세포 구성성분) 을 포함한다. 본 발명의 방법은 형질전환 세포, 세포주 및 세포 배양물로부터의 생산물의 처리에 특히 적합하며, 여기서, 상기 형질전환 세포, 세포주 및 세포 배양물은 관심 분자를 발현한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 정화된 조건화 세포 배양 배지의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법은 관심 분자, 예를 들면, 단백질을 함유하는 용액으로부터의 상기 분자의 분리, 정제 및/또는 처리에 관한 것으로 이해된다. 이와 같이, 관심 분자를 함유하는 용액이 세포 배양 배지 또는 세포 배양 배지의 분획 또는 정화된 부분인 경우, 이러한 배지는 필연적으로 조건화 세포 배양 배지 (관심 분자를 포함하기 위함) 인 것으로 이해된다. 그러므로, 본원에서 사용되는 용어 "세포 배양액" 및 유사한 용어는 관심 분자를 함유할 것으로 예상되는 생물학적 공정 또는 시스템의 임의의 용액을 의미하며, 예를 들면, 조건화 세포 배양물 상청액; 정화된 조건화 세포 배양물 상청액; 정화된 균질화/용해된 세포 배양물 등을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 의 공급물 스트림은 본원에서 정의된세포 배양물 상청액이다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작의 업스트림에서, 즉, 본 개시내용에서 기재되는 듀얼 스테이지 TFF 단위 조작의 조작 이전에 정화 및/또는 멸균을 위한 세포 배양 배지의 임의의 처리를 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "정화됨" 및 "정화" 는 여과 멸균을 포함하여 용액으로부터의 미립자 물질의 제거를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "멸균됨" 은 단백질을 함유하는 용액과 관련하여 사용되는 것으로 이해되고; 따라서, 이러한 용액의 "멸균" 은 바람직하게는 단백질 변성 및/또는 단백질 응집을 방지하기 위해 열에 의해서가 아니라 여과에 의해 실시되는 것으로 이해된다. 본 발명의 방법에 포함되는 임의의 세포 배양 배지에 관한 "정화된" / "멸균된" 용액은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 막, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 필터를 통해 여과된 용액이다.
본원에서 사용되는 용어 "듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과", "듀얼 스테이지 TFF" 및 유사한 용어는 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작을 결합하여 사용하는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 용어 "듀얼 스테이지 TFF" 는 3 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작을 결합하여 사용하는 것을 의미한다. 용어 "결합함" 의 사용은 관심 분자 (예를 들면, 단백질) 를 함유하는 용액이 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작을 통해 진행하는 순서를 제한하지 않는다. 용어 "결합함" 은 또한 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작을 즉각적인 순서 (즉, 하나의 단위 조작 이후 바로 다른 단위 조작) 로 사용하는 것으로 공정 방법을 제한하지 않으며; 그러므로, 듀얼 스테이지 접선 유동 여과는 본원에서 기재되는 방법에 의해 명백히 정의된 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작 사이에 개재된 TFF 및/또는 정용여과/TFF가 아닌 하나 이상의 단위 조작을 포함하는 공정을 포함한다. 용어 "결합함" 의 사용은 또한 본원에서 기재되는 각각의 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작의 타이밍을 제한하지 않으며, 2 개 이상의 각각의 단위 조작은 1 분, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 간격으로 분리될 수 있다. 추가로, 2 개 이상의 각각의 단위 조작은 서로 수반하여 진행할 수 있고, 예를 들면, 당업계에서 공지된 바와 같이 병렬로 수행된다. 용어 "듀얼 스테이지 TFF" 는 또한 2 개 이상의 TFF 및/또는 정용여과/TFF 단위 조작을 당업계에서 공지된 표준 정제 프로토콜 또는 공정, 예를 들면, CEX 및 AEX 와 결합하여 사용하는 것을 의미한다.
본원에서 개시되는 방법의 맥락에서 사용되는 표현 "미가공 공급물 스트림" 은 전형적으로는 초기 단위 조작에 전달되는 생산 계획으로부터 유도된 원재료 또는 원료 용액을 의미하며, 여기서, 상기 원재료는 관심 분자 (예를 들면, 생체분자, 단백질, 폴리펩타이드, 항체 등) 를 함유하며 각종 오염물 (예를 들면, 원치않는 단백질, 세포 단편, 바이러스, DNA 등) 을 추가로 함유할 수 있다. 대조적으로, "생성물 스트림" 은 전형적으로는 일부 처리 (예를 들면, 정화, 여과 등을 포함하는 하나 이상의 단위 조작) 가 이미 실시되었을 수 있거나 실시되지 않았을 수 있는 관심 분자를 함유하는 용액을 의미하기 위해 보다 일반적인 맥락에서 사용된다. 그러나, 본 발명의 방법의 목적상, "공급물 스트림" 과 "생성물 스트림" 사이의 임의의 구별은 무관한데, 이는 두 용어가 간단히 관심 생산물 (예를 들면, 생체분자, 단백질, 폴리펩타이드, 항체 등) 을 함유하는 용액에 관한 것이며, 이 용액이 일반적으로 사전의 업스트림 처리가 일어나는지와 무관하게 본 발명의 방법에 따라 처리될 수 있기 때문이다. "공급물 스트림" 과 "생성물 스트림" 사이의 임의의 구별이 본 개시내용의 목적상 필요한 경우, 이것은 문맥으로부터 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "미세여과" 및 "한외여과" 는 당업계에서 일반적으로 이해되는 여과 파라미터를 의미한다. 특히, 용어 미세여과는 일반적으로 0.1 μm 와 10 μm 사이의 기공 크기를 가지는 여과 막의 사용을 의미하며, 용어 한외여과는 0.001 μm 와 0.1 μm 사이의 기공 크기를 가지는 여과 막의 사용을 의미한다. 미세여과는 전형적으로는 미세미립자의 정화, 멸균, 제거를 위해 및 세포 수확물을 위해 사용되며; 한외여과는 전형적으로는 용해된 분자 (예를 들면, 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물 및 기타 생체분자) 의 분리 및 농축을 위해, 완충액 교환을 위해 및 총 분획 (gross fractionation) 을 위해 사용된다. 본 발명의 방법은 TFF 및 정용여과/TFF 단위 조작을 이용하는 한외여과에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 본원에서 기재되는 개시/제 1 TFF 단위 조작 이전에, 즉, 업스트림에서 멸균과 같은 단위 조작을 위해, 예를 들면, 하나 이상의 정용여과 장치에서 한외여과 막 또는 훨씬 더 큰 기공 크기를 가지는 막의 사용을 또한 포함할 수 있다. 여과 방법을 통한 로드 유체, 예를 들면, 관심 단백질을 함유하는 세포 배양물 상청액의 멸균은 당업계에서 잘 공지되어 있으며, 전형적으로는 약 0.1 μm 내지 약 0.45 μm 범위의 기공 크기를 가지는 필터 막을 통한 상기 상청액의 여과를 포함한다. 따라서, 본 발명은 개시/제 1 TFF 단위 조작의 조작 이전에 세포 배양물 상청액의 멸균을 포함하는 듀얼 스테이지 TFF 방법을 또한 포함하며, 여기서, 상기 멸균은 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기를 가지는 적합한 필터 막, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 필터를 통한 여과에 의해 실시된다.
본원에서 사용되는 표현 "관심 분자" 및 유사한 표현은 용액 또는 현탁액으로부터 분리되는 분자를 의미한다. 관심 분자는 관심 분자의 크기에 근거하여 용액 또는 현탁액 중의 다른 입자 또는 분자로부터 분리된다. 본원에서 개시되는 방법의 일부 실시형태에서, 관심 분자는 또한, 예를 들면, 정용여과 단위 조작을 통한 완충액 교환의 공정에 의해 용액 또는 현탁액의 최초 유체 구성성분으로부터 분리된다. 용액 또는 현탁액의 오염물 및/또는 다른 원치않는 구성성분으로부터의 관심 분자의 분리는 또한 "정제" 로서 언급될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 관심 분자는 생체분자이다. 즉, 관심 분자는 생물학적 또는 생화학적 기원의 것이고/이거나, 포유동물 또는 미생물 (예를 들면, 박테리아, 진균, 효모) 세포 배양물에 의해 생산되며, 여기서, 상기 세포 배양물은 형질전환될 수 있거나 형질전환되지 않을 수 있다. 그러므로, 관심 분자, 예를 들면, 단백질은 세포 배양에 의해 천연적으로 생산된 분자일 수 있거나, 재조합 생산물일 수 있다. 관심 분자는 또한 동물 모델, 예를 들면, 형질전환 동물을 사용하여 생체내에서 생산될 수 있거나, 시험관내 공정에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 공정은 포유동물 및/또는 미생물 세포에서 발견된 생화학적 경로에 근거할 수 있다. 본 방법의 맥락에서의 관심 분자의 비제한적인 예는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 효소 및 이들의 단편을 포함한다.
도 1 은 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/농축 단위 조작에 이어서, 300 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/정용여과 단위 조작을 가지는 150 kD±30 kD 의 분자량을 가지는 단백질 (예를 들면, 항체) 의 분리를 위한 듀얼 스테이지 TFF 공정의 개략도이다.
도 2 는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/정용여과 단위 조작에 이어서, 300 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/정용여과 단위 조작을 가지는 150 kD±30 kD 의 분자량을 가지는 단백질 (예를 들면, 항체) 의 분리를 위한 듀얼 스테이지 TFF 공정의 계락도이다.
도 3 은 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/농축/정용여과 단위 조작에 이어서, 300 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/정용여과 단위 조작, 이어서 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 제 3 TFF/농축 단위 조작을 가지는 150 kD±30 kD 의 분자량을 가지는 단백질 (예를 들면, 항체) 의 분리를 위한 듀얼 스테이지 TFF 공정의 개략도이다.
도 4 는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/농축/정용여과 단위 조작에 이어서, 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 제 3 TFF/농축 단위 조작과 병렬로 연결되어 있는 300 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 포함하는 TFF/정용여과 단위 조작을 가지는 150 kD±30 kD 의 분자량을 가지는 단백질 (예를 들면, 항체) 의 분리를 위한 듀얼 스테이지 TFF 공정의 개략도이다.
놀랍게도, 관심 분자를 상기 분자를 함유하는 용액으로부터 분리하기 위한 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과 ("듀얼 스테이지 TFF") 의 사용은 표준 정제 공정에 비해 상기 용액 중의 오염물의 수준을 극적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 기존 정제 계획을 보완하고/하거나 기존 정제 계획 내에서 하나 이상의 단위 조작을 대체할 수 있다. 특히, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 분자의 다운스트림 처리 및/또는 정제가 추가의 불순물 침전 및 정화/침전물 여과 공정에 대한 필요성 없이 진행할 수 있을 정도로 오염물의 수준을 감소시킨다. 본원에서 개시되는 방법은 생체분자를 위한 분리 및/또는 정제 공정에서 특히 유용하다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 용액으로부터의 관심 분자의 분리/정제/단리를 위한 임의의 공정에서 사용될 수 있다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 의해 제공되는 오염물/불순물의 수준의 실질적 감소는 또한 오염물/불순물의 수준이 공정 성능 및/또는 단위 조작 기능에 부정적으로 영향을 미치는 임의의 공정과 관련된다. 예를 들면, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 친화도 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 컬럼, 또는 이온 교환 크로마토그래피 단위 조작의 업스트림에서 사용되어, 예를 들면, 친화성 분자, 예를 들면, 단백질 A 또는 크로마토그래피 수지를 (불순물 로드 감소를 통해) 보호하고 실질적인 가용 시간을 연장시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 기존 정제 계획에서의 하나 이상의 단위 조작, 예를 들면, 친화도 크로마토그래피를 대체할 수 있고, 따라서, 생체분자를 함유하는 용액으로부터의 생체분자, 예를 들면, 항체의 비-친화도 정제/단리/분리에서 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 친화도 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피를 또한 포함하는 공정에서 사용될 수 있다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 다운스트림 정제 공정이 중간 침전 및 정화 공정, 예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 이전의 침전 및 정화 공정의 사용 없이 진행할 수 있도록, 오염물/불순물의 수준을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 또한 전통적인 정제 공정, 예를 들면, 친화도 크로마토그래피의 하나 이상의 단위 조작을 대체할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 임의의 생산, 처리 및/또는 정제 스트림과 관련된 직접 비용과 간접 비용 둘 다의 실질적인 절약을 초래할 수 있다. 직접 비용과 관련하여, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 특정 실시형태에서, 친화도 기반 크로마토그래피 방법을 대체할 수 있다. 여과 막은 친화도 기반 크로마토그래피 물질 보다 비용이 실질적으로 덜 들고 (예를 들면, 전형적인 산업적 컬럼을 공급하기 위함, 비용이 1/4 이상 덜 듬), 더 긴 작동 수명을 나타내기 때문에, 막 기반 듀얼 스테이지 TFF 방법의 사용은 이러한 초기 정제 단계를 위한 재료비를 직접 절약할 수 있다. 또한, 친화도 크로마토그래피의 사용은 또한 친화성 물질과의 상용성을 보장하기 위한 로드 물질의 신중한 제조; 친화성 물질 누출 (leeching) 의 모니터링; 및 친화성 물질을 재생하기 위한 공정 정지 시간을 포함한 다수의 간접 비용과 관련되어 있다. 추가로, 친화도 크로마토그래피를 위한 결합 및/또는 용출 완충액의 파라미터는 다운스트림 공정과 양립불가능하기 때문에, 생성물 스트림은 이온 교환 크로마토그래피와 같은 일반적인 추가의 다운스트림 정제/연마 단계 이전에 완충액 교환과 같은 추가의 단위 조작을 필요로 할 수 있다. 이들 추가 비용의 각각은 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법의 사용에 의해 간접적으로 절약될 것이다. 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 막 성능이 공급물 스트림 파라미터에 민감하지 않은 크기에 근거하며, 누출이 일어날 수 없기 때문에 모니터링을 필요로 하지 않는다. 추가로, 임의의 출력 스트림이 최소의 추가적 처리로 다운스트림 공정, 예를 들면, CEX 와 완전히 양립가능하도록, 스트림 용액 파라미터를 동시에 처리하면서, 공급물 스트림 중의 관심 분자를 처리/정제하는 것이 가능하다.
크기, 예를 들면, 분자량에 근거한 관심 분자의 분리 방법은 공지되어 있다. 가장 널리 실시되는 이러한 방법은 막 여과 공정이다. 현재, 2 개의 주요 막 여과 방법이 있다: 단일 통과 (Single Pass) 또는 직접 유량 여과 (Direct Flow Filtration: DFF) 와 직교류 (Crossflow) 또는 접선 유동 여과 (TFF). 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 구체적으로는 TFF 에 관한 것이다. TFF 는, 여과되는 용액의 유량이 DFF 에서와 같이 막에 대해 수직으로 힘을 받지 않고 오히려 여과 막에 대해 평행하게 진행하는 점에서 DFF 와 구별되는 한외여과 시스템이다. TFF 는 공급물 스트림의 유체 유량 패턴을 조절하도록 설계되어 막 표면을 떠나 공급물의 벌크로 되돌아 가는 보유된 용질 (들) 의 수송을 증가시킨다.
TFF 에서, 관심 분자를 함유하는 스트림은 막의 평면과 접선인 벡터로 고속으로 막 위로 지나간다. TFF 동안, 압력차가 막의 길이를 따라 적용되어 유체 및 여과성 용질이 필터를 통해 흐르게 한다. 이것은 물질 이동 계수를 증가켜 역확산을 허용하게 한다. 필터 막에 평행한 방향으로 흐르는 유체는 또한 필터 표면을 연속적으로 청소하는 작용을 하고, 이로 인해 폐쇄를 방지한다. 보유된 용액 (잔류물) 은 재순환되고 막 위로 반복적으로 지나가면서, 필터를 통과하는 유체 (투과물) 는 별도의 장치로 연속적으로 빠져나간다. 본원에서 기재되는 본 발명의 방법에 따르면, 필터의 컷 오프 값, 기공 크기 또는 기타 투과도 파라미터에 따라, 관심 분자는 각각의 TFF 단위 조작의 투과물 또는 잔류물 중에서 발견될 수 있고, 따라서, 임의의 TFF 단위 조작의 투과물 또는 잔류물 중 하나는 본원에서 기재되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따른 다운스트림 처리 또는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 후속하는 다운스트림 처리를 위해 수집될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, TFF 의 조작은 드물게 완전히 효율적이다. 즉, TFF 단위 조작의 잔류물 중에 보유될 것으로 예상되는 작은 비율의 분자는 그럼에도 불구하고 필터 막을 통과하여 투과물에서 발견될 수 있으며; 마찬가지로, TFF 단위 조작의 투과물에서 막을 통과할 것으로 예상되는 소량의 분자는 그럼에도 불구하고 막에 의해 보유되어 잔류물에서 잔류할 수 있다. 따라서, TFF 단위 조작의 조작과 관련하여, 용어 "막을 통과하지 않음" 및 "잔류물 중에서 발견됨" 은 절대적으로 해석되는 것이 아니라, TFF 단위 조작에 적용된 관심 분자의 90 % 이상이 잔류물로 회수되는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 용어 "막을 통과하지 않음" 및 "투과물 중에서 발견됨" 은 절대적으로 해석되는 것이 아니라, TFF 단위 조작에 적용된 관심 분자의 90 % 이상이 투과물 중에서 발견되는 것을 나타낸다.
TFF 단위 조작의 사용 및 실시는 당업계에서 잘 공지되어 있다. TFF 방법은 혈액 구성성분의 여과에서 (예를 들면, 미국 특허 4,888,115 참조), 식품 제조에서 (예를 들면, 맥주, EP-A2 0,208,450), 모유 또는 초유로부터의 면역글로불린의 정제에서 (예를 들면, 미국 특허 4,644,056 참조) 및 인터페론 생산 세포 배양물과 같은 항바이러스 물질의 분리에서 (예를 들면, 미국 특허 4,420,398 참조) 유용한 것으로 입증되었다. 따라서, 본원에서 개시되거나 당업계에서 공지된 임의의 방법은 본원에서 개시되는 방법의 각각의 TFF 단위 조작을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법의 사용의 본 개시내용은 모유 또는 모유의 분획 용액, 예를 들면, 카제인 풍부 또는 카제인 빈약 모유 용액/분획, 유청 단백질 단리물 등의 처리를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법에 포함되는 공급물 스트림 또는 생성물 스트림은 모유 또는 모유의 분획 용액이 아니다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 관심 분자의 크기에 근거하여 상기 분자를 분리하는 2 개 이상의 TFF 단위 조작 (즉, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작) 의 사용을 포함한다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 제 1 TFF 단위 조작은, 관심 분자가 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수될 수 있거나 회수되도록, 상기 분자를 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하는 것을 특징으로 한다. TFF 단위 조작의 잔류물 중의 관심 분자의 보유는, 관심 분자에 불투과성이 되도록 하는 한외여과 막의 선택에 의해 실시된다. 비록 그 선택이 관심 분자의 실제 또는 유효 크기에 근거하여, 예를 들면, 당업계에서 인식되는 바와 같이 실제 또는 유효 크기 미만의 컷 오프 값 또는 기공 크기를 가지는 막을 선택함으로써, 이루어질 수 있지만, 막 성능은 다른 요인 (예를 들면, 막 전하) 에 좌우될 수 있다. 그러므로, 보고된 컷 오프 값 또는 관심 분자의 크기 초과의 기공 크기를 가지는 막은 그럼에도 불구하고 TFF 단위 조작 동안 상기 분자에 기능적으로 불투과성일 수 있다. 따라서, 제 1 TFF 단위 조작은 관심 분자의 분자량 미만인 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하고/하거나, 상기 분자가 제 1 TFF 단위 조작 동안 막을 통과할 수 없는 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작의 한외여과 막은 관심 분자의 분자량의 절반 이하인 컷 오프 값, 즉, 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하의 컷 오프 값을 가진다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 제 2 TFF 단위 조작은, 관심 분자가 TFF 단위 조작의 투과물로 회수될 수 있거나 회수되도록, 상기 분자를 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하는 것을 특징으로 한다. TFF 단위 조작의 투과물 중의 관심 분자의 회수는 관심 분자에 자유롭게 투과성이 되도록 하는 한외여과 막의 선택에 의해 실시된다. 비록 그 선택이 관심 분자의 실제 또는 유효 크기에 근거하여, 예를 들면, 당업계에서 인식되는 바와 같이 실제 또는 유효 크기 초과의 컷 오프 값 또는 기공 크기를 가지는 막을 선택함으로써, 이루어질 수 있지만, 막 성능은 다른 요인 (예를 들면, 막 전하) 에 좌우될 수 있다. 그러므로, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 제 2 TFF 단위 조작은 관심 분자의 분자량 초과인 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하고/하거나, 상기 관심 분자가 막을 통과할 수 있는 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 한외여과 막은 관심 분자의 분자량의 두 배 이상인 컷 오프 값, 즉, 관심 분자의 분자량의 2 배 이상의 컷 오프 값을 가진다.
본 개시내용을 통해 상세히 설명된 바와 같이, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 임의로 정화 및/또는 멸균된, 예를 들면, 0.1 μm 와 0.45 μm 사이의 기공 크기를 가지는 막을 통해 여과된, 바람직하게는 0.2 μm 또는 0.22 μm 의 기공 크기를 가지는 막을 통해 여과된, 단백질을 함유하는 용액, 예를 들면, 세포 배양물 상청액으로부터의 단백질, 예를 들면, 면역글로불린의 분리에 관한 것이다. 본 발명의 일반적인 방법에 따르면, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 컷 오프 값은 각각 관심 분자의 분자량 미만 및 초과가 되도록 선택된다. 이것은 특히, 관심 분자가 필터 막을 통과하지 않는 제 1 TFF 단위 조작, 및 관심 분자가 필터 막을 통과하는 제 2 TFF 단위 조작을 초래한다. 그러나, 여과 막 성능이 또한 엄격한 분자 크기 이외의 요인에 좌우될 수 있기 때문에 (예를 들면, 분자 전하에 좌우될 수 있음), 본 개시내용은 막이 선택될 수 있는 기준을 제한하지 않는다 (관심 분자가 제 1 TFF 단위 조작의 막을 통과하지 않고, 제 2 TFF 단위 조작의 막을 통과하는 경우). 따라서, 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따라 사용되는 막의 컷 오프 값은 주장된 컷 오프 값 (예를 들면, 제조사의 사양에 따름) 에 엄격하게 근거하기 보다는 오히려 막 성능에 근거하여 선택될 수 있다. 막 성능을 결정하는 방법, 구체적으로, 관심 분자, 예를 들면, 단백질에 대한 막의 투과도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 일상적으로 실시된다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 2 개 이상의 TFF 단위 조작의 식별번호로서의 용어 "제 1" 및 "제 2" 의 사용은 순서를 시사하지 않는 것을 강조한다. 환언하면, 본원에서 개시되는 방법은 제 1 TFF 단위 조작 (잔류물인 관심 분자를 특징으로 함) 이 제 2 TFF 단위 조작 (투과물인 관심 분자를 특징으로 함) 의 업스트림에 있을 것을 필요로 하지 않는다. 오히려, 본원에서 사용되는 용어 제 1 및 제 2 는 단순히 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 2 개 이상의 TFF 단위 조작을 구분하는 식별번호이다. 따라서, 본원에서 개시되는 특정 실시형태에서, 제 2 TFF 단위 조작은 제 1 단위 조작의 업스트림에 있다. 바람직한 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있다. 특정 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물 스트림은 본원에서 개시되는 제 2 TFF 단위 조작의 제 2 생성물 스트림을 형성한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 단위 조작이 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 사이에 개재될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 또한 본원에서 기재되는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작에 추가하여 하나 이상의 TFF 단위 조작을 함유하거나 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 TFF 단위 조작은, 제 1 TFF 단위 조작과 동일하거나 상이한 한외여과 막의 사용을 포함할 수 있거나, 컷 오프 값이 관심 분자의 분자량 미만이고/이거나 관심 분자가 막을 통과할 수 없도록 한다면, 제 1 TFF 단위 조작과 상이한 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 관심 분자가 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수될 수 있거나 회수되도록, 상기 분자를 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하는 것을 특징으로 하는 제 3 TFF 단위 조작을 제공한다. 이와 같이, 본 실시형태에 따른 제 3 TFF 단위 조작의 조작을 위한 기준은 제 1 TFF 단위 조작의 조작을 위한 기준과 동일하다. 그러므로, 본 실시형태에 따른 제 3 TFF 단위 조작은 관심 분자의 분자량 미만인 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하고/하거나, 관심 분자가 제 3 TFF 단위 조작 동안 막을 통과할 수 없는 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작의 한외여과 막은 관심 분자의 분자량의 절반 이하인 컷 오프 값, 즉, 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하의 컷 오프 값을 가진다.
본원에서 개시되는 바와 같이, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작은 임의의 순서로 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법에서, 제 1 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있을 수 있거나, 제 2 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 업스트림에 있을 수 있다. 추가로, 본원에서 기재되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작에 추가하여 하나 이상의 TFF 단위 조작, 예를 들면, 제 3 TFF 단위 조작의 사용을 또한 포함할 수 있으며, 여기서, 추가의 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 또는 다운스트림에 있거나, 이들 사이에 개재될 수 있다. 제 3 TFF 단위 조작을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 제 1 TFF 단위 조작은 제 3 TFF 단위 조작의 업스트림에 있는 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있을 수 있으며, 여기서, 상기 제 3 TFF 단위 조작은 관심 분자의 분자량 미만인 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하고/하거나, 관심 분자가 제 3 TFF 단위 조작 동안 막을 통과할 수 없는 것을 특징으로 한다. 본 실시형태에 따르면, 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작은 서로에 이어서 직접 실시될 수 있거나, 하나 이상의 추가의 단위 조작이 그 사이에 배치될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작과 병렬로 수행될 수 있거나, 제 2 TFF 단위 조작의 완료 이후에 실시될 수 있다.
제 1 단위 조작 및 제 2 단위 조작 및/또는 제 2 단위 조작 및 제 3 단위 조작은서로의 업스트림/다운스트림에서 바로 조작될 수 있다. 본원에서 사용되는 문구 "업스트림에서 바로 조작됨", "다운스트림에서 직접 조작됨", "업스트림에 바로 있음", "다운스트림에 바로 있음" 및 유사한 문구는 시간순서의 구성성분을 시사하지 않고; 따라서, 예를 들면, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작 또는 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작은 임의의 특정 시간 내에 일어나거나 진행할 필요가 없다. 오히려, 상기 문구는 생성물 스트림이 제 1 단위 조작과 제 2 단위 조작 사이에서 또는 제 2 단위 조작 과 제 3 단위 조작 사이에서 어떠한 다른 단위 조작에 의해서도 진행되지 않는 것을 나타내고; 따라서, 예를 들면, 제 1 TFF 단위 조작은, 예를 들면, 배치 방식으로 수행될 수 있고, 생성물 스트림이 저장, 및/또는 수송 및 저장되고, 이어서 미래의 어느 시점에서, 생성물 스트림은 제 2 TFF 단위 조작에 의해 처리된다 (어떠한 개재 단위 조작도 일어나지 않는 한).
비록 특정 실시형태에서의 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법이 임의의 정제 또는 처리 계획에서 친화도 기반 크로마토그래피 공정을 대체할 것으로 고려되지만, 본 발명은 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 공정과 친화도 기반 정제 둘 다를 포함하는 정제 방법을 또한 고려한다. 따라서, 본 발명은 듀얼 스테이지 TFF 방법과 친화도 기반 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피를 포함한 하나 이상의 추가의 정제 단계 및/또는 단위 조작의 조합을 고려한다. 추가의 정제 단계 또는 단위 조작의 예는 본원에서 명백히 개시되는 방법 및/또는 당업계에서 공지된 방법, 예를 들면, 미생물-유래된 단백질을 이용하는 친화도 크로마토그래피 (예를 들면, 언급된 바와 같은 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들면, 양이온 교환 (카복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 모드 교환 크로마토그래피), 친황성 흡착 (예를 들면, 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드를 가짐), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들면, 페닐-세파로오스, 아자-친아레노성 수지 (aza-arenophilic resin) 또는 m-아미노페닐보론산을 가짐), 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피 (예를 들면, Ni(II)-친화성 물질 및 Cu(II)-친화성 물질을 가짐), 크기 배제 크로마토그래피, 및 제조용 전기영동 방법 (예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동) 을 포함한다 [Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)]. 당업계에서 잘 공지된 정제 단계 또는 단위 조작의 추가의 비제한적인 예는 하이드록실 에퍼타이트 크로마토그래피; 투석, 단백질을 포획하기 위해 항체를 이용하는 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (hydrophobic interaction chromatography: HIC), 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 (hydrophobic charge interaction chromatography: HCIC), 암모늄 설페이트 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing) 및 겔 여과를 포함한다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따른 하나 이상의 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 조합은 관심 분자를 상기 관심 분자를 포함하는 용액의 원치않는 구성성분으로부터 분리할 뿐만 아니라, 다운스트림 공정을 방해할 수 있는 오염물을 유의미하게 감소시킨다. 따라서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 각종 입력 스트림을 위한 처리를 제공하고, 가속적, 효율적 및 경제적 방식으로 당업계에서 공지된 다운스트림 정제 방법에 의해 추가로 처리될 수 있는 출력 생성물 스트림을 초래한다. 특히, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 고비용 단위 조작, 예를 들면, 침전 및 침전물 여과를 사용하지 않고 생성물 스트림으로부터 오염물 및 불순물을 유의미하게 감소시킨다. 예비적으로, 침전물 분획으로부터 생성물 용액을 회수하는 것이 불가능하기 때문에, 침전 공정은 바람직하지 못하고 수율을 감소시키는 것으로 당업계에 인식되어 있다. 수율 감소에 추가하여, 침전물 및 침전물 여과 단위 조작은 처리 시간 증가 (예를 들면, 침전물 형성 및 여과에 필요한 시간), 에너지 비용 증가 (예를 들면, 침전 동안의 냉장) 및 장비 비용 증가 (예를 들면, 침전 반응을 위한 대형 저장 탱크) 를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 이러한 요인으로 인해 직접 비용 증가를 초래한다. 따라서, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 단위 조작을 사용하는 다운스트림 침전 단위 조작의 잠재적 제거는 처리 수율 증가, 처리 시간 감소 및 고정 비용 제거 (예를 들면, 침전 단위 조작과 관련됨) 를 포함한 유의미한 경제적 이점을 초래한다. 추가로, 불순물/오염물의 수준에서의 실질적인 감소는 크로마토그래피 공정과 같은 다운스트림 공정에 대한 추가의 경제적 이점을 제공한다. 예를 들면, 듀얼 스테이지 TFF 방법의 오염물 감소는 다운스트림 컬럼 성능 개선 (예를 들면, 개선된 동적 결합, 더 적은 부착을 통해), 처리 시간 증가 (예를 들면, 더 높은 유속 허용) 및 컬럼 수명 개선을 초래할 수 있다. 추가로, 본원에서 예시된 바와 같이, 다운스트림 공정을 위한 오염물 로드에서의 실질적 감소는 보다 소형의 크로마토그래피 컬럼을 과부하의 위험 없이 사용할 수 있게 하여 보다 큰 경제적 이점을 초래한다. 그러므로, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 이들의 사용을 포함하는 공정에 다수의 경제적 이점을 제공한다.
특정 실시형태에서, 관심 분자는 포유동물 세포, 미생물 배양물, 및/또는 동물 (이들 모두는 형질전환될 수 있거나 형질전환되지 않을 수 있다) 로부터 생산된 생체분자이고, 여기서, 상기 생체분자는 배양액 또는 동물의 체액으로부터 분리된다. 다르게는, 관심 분자는 생화학 반응 및 경로에 근거하여 시험관내 시스템에서 생산된 생체분자일 수 있으며, 시험관내 시스템의 구성성분, 예를 들면, 생체분자의 제조에 사용되는 효소 및 출발 물질로부터 분리될 필요가 있다. 바람직한 실시형태에서, 관심 분자는 세포 배양액 (예를 들면, 0.22 μm 의 막을 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액) 으로부터 분리되는 단백질, 예를 들면, 항체이다.
본원에서 개시되는 방법은 한외여과 막을 가지는 TFF 단위 조작의 사용을 포함한다. 당업계에서 정의된 바와 같이, 한외여과 전형적으로는 0.001 μm 내지 0.1 μm 의 범위를 가지는 기공 크기를 가지는 막의 사용을 포함한다. 추가로 또는 다르게는, 한외여과 막은 막을 자유롭게 통과할 수 있는 최대 근사치 분자량인 컷 오프 값 (kD) 에 따라 등급이 매겨질 수 있다. 한외여과 막은 단백질, 폴리펩타이드, 콜로이드, 면역글로불린, 융합 단백질, 면역글로불린 단편, 마이코플라즘, 내독소, 바이러스, 아미노산, DNA, RNA 및 탄수화물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 것들의 분리에 유용한 것으로 알려져 있다.
본원에서 개시되는 방법은 각종 유형의 막이 공지되어 있고, 상업적으로 구입될 수 있고/있거나, 목적하는 분자량의 컷 오프를 가지고 관심 분자 (예를 들면, 단백질, 항체 등) 를 흡착하지 않도록 당업계에서 잘 공지된 방법에 따라 제조될 수 있는 점에서 임의의 특정 한외여과 막에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 적합한 한외여과 막의 비제한적인 예는 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 예를 들면, 셀룰로오스 아세테이트 (CA), 폴리설폰 (PS), 폴리에테르설폰 (PES), 폴리비닐리덴플루오라이드 (PVDF), 폴리아미드 (PA) 및/또는 폴리아크릴로니트릴 (PAN) 로부터 형성된 막을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 2 개 이상의 TFF 단위 조작의 하나 이상은 고성능 접선 유동 여과 (high performance tangential flow filtration: HPTFF) 이다. HPTFF 는 크기와 전하 둘 다에 근거하여 단백질 용질을 분리하여 크기가 10배 미만 상이한 단백질 종의 분리를 가능하게 하는 2 차원 단위 조작이다. TFF 단위 조작과 HPTFF 단위 조작 사이의 주요 구분은 후자에서 하전된 막의 사용이다 (특히, 단위 조작의 잔류물로 회수되길 원하는 단백질 종과 동일한 극성을 가짐). 당업계에서 공지되는 바와 같이, HPTFF 는 생성물/공급물 스트림에서 상이한 하전된 종의 유효 용량의 차이를 최대화하기 위해 완충액 pH 및 이온 강도의 세심한 조절에 의해 높은 민감성을 수득한다. 이것은 조작 동안 투과물 플럭스 및 완충액 대체/정용여과를 세심하게 조절함으로써 실시된다. 하전된 단백질의 유효 용량 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정됨) 은 단백질을 둘러싸는 분산된 전기적 이중층의 존재를 설명한다. 단백질 전하의 증가 또는 용액 이온 강도의 감소는 유효 용량의 단백질을 증가시키고, 따라서 막을 통한 단백질 투과를 감소시킨다. 따라서, HPTFF 는 크기와 전하 둘 다에서의 차이를 이용함으로써 분리를 가져오며, 기여도의 크기는 단백질의 특성, 막 및 완충액 조건에 의해 결정된다. 최적 분리는 전형적으로는 (1) 막을 (통해 필터를) 투과하는 종의 등전점과 가깝게 그리고 (2) 정전기적 상호작용을 최대화하기 위해 비교적 낮은 염 농도로 조작함으로써 달성된다. 직접적인 전하 효과는 또한 조작 조건 하에 보유 및/또는 여과되기를 원하는 종에 대해 유리한 전하 프로파일을 가지는 필터 막을 선택함으로써 수득될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Zydney and Kuriyel, Methods in Biotechnol. 9(2000), 35-46; Lebreton et al., Biotechnol . Bioeng . 2008(100), 964-974] 및 U.S. 특허 5,256,294 참조).
본원에서 개시되는 바와 같이, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 (1) 관심 분자, 예를 들면, 단백질이 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록 제 1 생성물 스트림을 여과하는 제 1 TFF 단위 조작; 및 (2) 관심 분자, 예를 들면, 단백질이 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록 제 2 생성물 스트림을 여과하는 제 2 TFF 단위 조작을 포함하는 2 개 이상의 TFF 단위 조작의 사용을 필요로 한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 (1) 제 1 TFF 단위 조작이 관심 분자의 분자량 미만인 컷 오프 값 (바람직한 실시형태에서, 관심 분자의 분자량의 절반 이하 (즉, 관심 분자의 분자량의 0.5 배 이하의 컷 오프 값)) 을 가지는 한외여과 막 및/또는 관심 분자가 제 1 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않는 것을 특징으로 하는 한외여과 막을 포함하고; (2) 제 2 TFF 단위 조작이 관심 분자의 분자량 초과인 컷 오프 값 (바람직한 실시형태에서, 관심 분자의 분자량의 두 배 이상 (즉, 관심 분자의 분자량의 2 배 이상 1000 kD 미만의 컷 오프 값) 을 가지는 한외여과 막 및/또는 관심 분자가 제 2 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하는 것을 특징으로 하는 한외여과 막을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본원에서 개시되는 방법에 따른 사용을 위한 한외여과 막은 달리 제한되지 않으며, 본원에서 제시된 전반적인 배제 기준 (즉, 관심 분자가 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하지 않도록 하는 제 1 TFF 단위 조작에서의 막의 컷 오프 값; 및 관심 분자가 TFF 단위 조작 동안 막을 통과하도록 하는 제 2 TFF 단위 조작에서의 막의 컷 오프 값) 을 충족한다면, 임의의 재료의 것이거나 임의의 컷 오프 값 (들) 을 가질 수 있다. 각종 재료, 컷 오프 범위, 기공 크기 및 투과도 프로파일의 막은 당업계에서 공지된 일상적인 방법 (예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 2010/0190965 참조) 에 의해 제조되고/되거나 상업적으로 수득된다. 예를 들면, Pall GmbH (Dreieich, Germany) 는 1, 5, 10, 30, 50, 70, 100 및 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 제공하고; Satorius AG (Goetting, Germany) 는 1, 2, 3, 5, 10, 30, 50, 100 및 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 제공하고; EMD Millipore (MA, USA) 는 1, 3, 5, 10, 30, 100, 300, 500 및 1000 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 제공하고; Novasep (Pompey, France) 는 1, 3, 5, 10, 30, 50, 70, 100 및 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 제공한다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 상업적 규모로 사용하기에 매우 적합하다. 상기 방법은 배치식 또는 연속식 조작으로, 또는 반-연속식 방식으로, 예를 들면, 전체 대량의 배치가 여과될 때까지 2 개 이상의 TFF 단위 조작을 통과한 목적하는 종을 함유하는 용액의 연속 유동에 기초하여 수행될 수 있다 (여과 스테이지들 사이에 삽입된 하나 이상의 임의의 세척 단계를 가짐). 이러한 방식으로, 연속 사이클 공정은 비교적 단시간에 걸쳐 큰 수율의 목적하는 생성물을 허용되는 순수한 형태로 제공하도록 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 방법에 따른 각각의 TFF 단위 조작은 정용여과와 조합될 수 있다. 정용여과는 TFF 필터 막을 통과한 소형 분자를 세척하고 잔류물 중의 대형 분자를 잔류시키는 것을 포함하는 분획 공정이다. 이것은 관심 분자의 농축, 및/또는 염의 제거 또는 교환, 세정제의 제거, 결합 분자로부터의 자유로운 분리, 저분자량 물질의 제거, 또는 이온성 또는 pH 환경의 신속한 변화를 위한 편리하고 효율적인 기술이다. 전형적으로, 정용여과는 관심 분자가 잔류물에 잔류하는 완충액 교환을 위해 사용된다. 정용여과는 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 임의의 TFF 단위 조작에서 사용되고/되거나 이와 조합될 수 있다. 예를 들면, 정용여과는, 예를 들면, 공급물 스트림의 구성성분을 추가의 처리에 적합한 완충액으로 대체하기 위해, 듀얼 스테이지 TFF 방법의 최고 업스트림 TFF 단위 조작에서 사용될 수 있다 (예를 들면, 도 1 참조). 다르게는 또는 추가로, 정용여과는, 예를 들면, 농축 동안 및/또는 처리 경과에 따른 다수의 완충액 교환을 실시하기 위해, 듀얼 스테이지 TFF 방법의 TFF 단위 조작의 하나 이상에서 사용될 수 있다 (예를 들면, 도 2 참조). 정용여과 공정은 잘 공지되어 있고, 당업계에서 일상적으로 사용되며, 당업계에서 공지되고/되거나 본원에서 기재되는 임의의 적합한 방법에 의해 실시될 수 있다.
본원에서 개시되는 방법은 재조합 단백질 생산 공정으로부터의 공급물 스트림로부터의 오염물의 제거에 특히 적합하다. 구체적으로, 개시되는 방법은 세포 배양액으로부터의 단백질의 처리에 특히 유용하고, 다운스트림 처리 동안의 HCP 및 HCDNA 의 침전이 감소 또는 제거되도록, 일반적인 오염물/불순물 HCP 및 HCDNA 를 감소시킬 수 있다. 특히, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 생성물 스트림이 다운스트림 공정, 예를 들면, CEX 이전에 HCP 및/또는 HCDNA 의 침전 없이 조정될 수 있도록, 생성물 스트림 (예를 들면, 세포 배양액, 예를 들면, 세포 배양물 상청액) 의 HCP 및 HCDNA 로드 수준을 감소시킨다. 세포 배양액으로부터의 단백질의 처리와 관련하는 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은, 용액이 HCP 및/또는 HCDNA 의 침전 없이 약 5 의 pH 로 조정될 수 있도록, 생성물 스트림의 HCP 및 HCDNA 로드 수준을 감소시킨다.
세포 배양액 (예를 들면, 0.1 μm 내지 0.45 μm 의 기공 크기를 가지는 막을 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액) 으로부터의 단백질의 분리와 관련되는 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 미가공 공급물 스트림 (즉, 0.1 μm 내지 0.45 μm 의 기공 크기를 가지는 필터를 통한 임의의 여과를 배제하는 임의의 단위 조작 이전의 초기 세포 배양액) 중의 HCDNA 로드를 50% 이상 감소시킨다. 환언하면, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법으로부터 초래되고/되거나 상기 방법 이후의 관심 단백질을 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 조작 이전의 미가공 세포 배양액 중의 HCDNA 농도에 비해 50 % 이상 감소할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 HCDNA 로드의 감소에서 보다 양호한 효율을 입증하였으며, 특정 실시형태에서, 관심 분자를 함유하는 용액 중의 HCDNA 의 농도를 90 % 이상 또는 95% 이상 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 개시되는 방법은 관심 분자를 함유하는 용액 중의 HCDNA 농도를 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 또는 95% 이상 감소시킬 수 있다.
세포 배양액 (예를 들면, 0.1 μm 내지 0.45 μm 의 기공 크기를 가지는 막을 통해 임의로 여과된 세포 배양물 상청액) 으로부터의 단백질의 분리와 관련되는 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 미가공 공급물 스트림 (즉, 0.1 μm 내지 0.45 μm 의 기공 크기를 가지는 막을 통한 임의의 여과를 배제하는 임의의 단위 조작 이전의 초기 세포 배양액) 중의 HCP 로드를 10% 이상 감소시킬 수 있다. 환언하면, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법으로부터 초래되고/되거나 상기 방법 이후의 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 HCP 의 농도는 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법의 조작 이전의 세포 배양액 중의 HCP 농도에 비해 10% 이상, 15% 이상, 20 %, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45 % 또는 50 % 이상 감소시킬 수 있다.
관심 분자가 단백질 (예를 들면, 항체) 이고 공급물 스트림이 세포 배양물 상청액인 특정 실시형태에서, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 실시로부터 초래되고/되거나 상기 실시 이후의 관심 분자를 함유하는 용액의 HCP 로드는 단백질 mg 당 450,000 ng 이하이고, 수득된 용액 중의 HCDNA 로드는 단백질 mg 당 600,000 pg 이하이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산된다. 항체의 재조합 생산을 위한 일반적인 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 단백질 발현 (예를 들면, 하기 검토 참조: [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]). 본 발명에 따른 방법은 원칙적으로 임의의 항체의 생산에 적합하다. 하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법으로 생산된 면역글로불린은 재조합 면역글로불린이다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린은 인간화 면역글로불린, 키메라 면역글로불린, 인간 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 접합체이다. 본 발명의 다른 측면에서, 항체는 모노클론 및 폴리클론 항체이다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 모노클론 항체이다. 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 항체는 치료 항체 또는 진단 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 치료 항체이다. 치료 항체의 비제한적인 예는 종양 항원 (예를 들면, 성장 인자 수용체 및 성장 인자), 예를 들면, EGFR, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-IR, CTLA-4, 섬유아세포 활성화 단백질 (fibroblast activation protein: FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 (melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan: MCSP), 전립선-특이적인 막 항원 (prostate-specific membrane antigen: PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGFl-R, TSLP-R, PDGF-R, TIE-I, TIE-2, TNF-알파, 아폽토시스의 TNF 성 약한 유도자 (TNF like weak inducer of apoptosis) (TWEAK), IL-IR, VEGF, EGF, PDGF, HGF 및 안지오포이에틴에 관한 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 또한 알렘투주맙, 아폴리주맙, 세툭시맙, 에프라투주맙, 갈릭시맙, 겜투주맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 니모투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, 페르투주맙 또는 ING-I 일 수 있다.
특정 실시형태에서, 관심 분자는 150 kD±75 kD (예를 들면, 150 kD±30 kD 또는 150 kD±15 kD) 의 분자량을 가지는 단백질이고, 듀얼 스테이지 TFF 는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 제 1 TFF 단위 조작; 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 제 2 TFF 단위 조작; 및 50 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 가지는 임의의 제 3 TFF 단위 조작의 사용을 포함한다. 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용은 잔류물 (관심 단백질을 함유함) 로부터 240-475 개 미만의 염기쌍의 크기를 가지는 이중 가닥 핵산을 제거하고; 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막의 사용은 투과물 (관심 단백질을 함유함; 즉, 1450-2900 개 초과의 염기쌍의 크기를 가지는 이중 가닥 핵산은 TFF 잔류물 내에 보유되는 반면, 관심 분자는 막을 통과하고 투과물로부터 수집된다) 로부터 1450-2900 개 초과의 염기쌍의 크기를 가지는 이중 가닥 핵산을 제거한다. 임의의 제 3 TFF 단위 조작이 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있는 경우, 임의의 제 3 TFF 단위 조작은 제 2 TFF 단위 조작으로부터 수득된 투과물 용액으로부터의 단백질을 농축하는데 사용될 수 있다.
본원에서 개시되는 모든 실시형태를 위해, 임의의 제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작에서 사용되는 것과 동일하거나 상이한 한외여과 막의 사용을 포함할 수 있다; 즉, 관심 단백질의 분자량 미만의 컷 오프 값을 가지는 것을 특징으로 하고/하거나, 상기 단백질이 막을 통과하지 못하고 제 3 TFF 단위 조작에 대한 잔류물로서 회수될 수 있는 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 제 3 TFF 단위 조작은 관심 단백질의 분자량의 0.5 배 이하의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 포함하는 것을 특징으로 하고, 관심 단백질이 조작 동안 통과하지 못하게 하는 한외여과 막을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 TFF 단위 조작과 관련하여 사용되는 식별번호 "제 1" 및 "제 2" 와 같이, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따른 TFF 단위 조작과 관련하는 식별번호 "제 3" 은 개시된 방법에서의 각각의 TFF 단위 조작의 실시에 대한 임의의 지정 순서를 시사하지 않는다; 즉, 제 3 TFF 단위 조작은 반드시 뒤따를 필요가 없다, 즉, 본원에서 개시되는 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있을 필요가 없다. 오히려, 제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 업스트림에, 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있을 수 있거나, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 둘 다의 업스트림에 있을 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작의 다운스트림에, 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있을 수 있거나, 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 둘 다의 다운스트림에 있을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 듀얼 스테이지 TFF 방법은 제 1 TFF 단위 조작, 다운스트림 제 2 TFF 단위 조작, 및 제 1 단위 조작과 제 2 단위 조작 둘 다의 다운스트림에 있는 제 3 TFF 단위 조작의 사용을 포함하며, 여기서, 제 3 TFF 단위 조작은 제 1 TFF 단위 조작에서 사용되는 것과 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있고/있거나 관심 단백질의 분자량의 0.5 배 이하인 한외여과 막의 사용을 포함한다.
특정 실시형태에서, 관심 분자는 150 kD±75 kD 의 분자량을 가지는 단백질이고, 듀얼 스테이지 TFF 는 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 제 1 TFF 단위 조작, 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 가지는 다운스트림 제 2 TFF 단위 조작, 및 제 1 TFF 단위 조작과 제 2 TFF 단위 조작 둘 다의 다운스트림에 있는 50 kD 의 컷 오프를 가지는 한외여과 막을 가지는 제 3 TFF 단위 조작의 사용을 포함한다. 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및/또는 제 3 TFF 단위 조작은 정용여과와 조합될 수 있다. 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및/또는 제 3 TFF 단위 조작은 배치식으로 및 서로에 직접 뒤따라 실시될 수 있거나, 연속 유동 시스템으로서 순차적으로 실시될 수 있다. 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 본 발명에 따른 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및/또는 제 3 TFF 단위 조작 사이에 개재된 하나 이상의 단위 조작의 사용을 또한 포함한다. 제 1 TFF 단위 조작, 제 2 TFF 단위 조작 및/또는 제 3 TFF 단위 조작의 하나 이상은 본 발명의 다른 TFF 단위 조작과 병렬로 조작될 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 단위 조작과 병렬로 조작될 수 있다.
다운스트림 CEX 과 관련하여 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 당업계에서 공지된 상응하는 공정에 비해 단백질 처리에 대해 뚜렷한 이점을 제공하고, 특히, 단백질의 추가의 다운스트림 처리/정제에 대한 이점을 제공한다. 구체적으로, 단일 스테이지 TFF 를 포함하는 공정과 비교하여, 본 발명의 방법에 따라 처리된 관심 단백질을 함유하는 공급물 스트림 및/또는 생성물 스트림의 다운스트림 처리 (예를 들면, CEX) 는 뚜렷한 처리 및 경제적 이점을 제공하였다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 따른 듀얼 스테이지 TFF 를 사용하는 세포 배양물 상청액의 처리는 놀랍게도 CEX 이전에 임의의 침전 및 침전물 여과 공정에 대한 필요성을 제거하였다. 대조적으로, 단일 스테이지 TFF 방법을 포함하는 공정은 CEX 이전에 생성물 스트림으로부터 HCDNA 및 HCP 오염물을 제거하기 위해 추가의 침전/침전물 여과 단계의 삽입을 필요로 하였다. 따라서, 현재 본원에서 개시되는 방법은 다운스트림 정제 공정 동안 직접적 및 간접적 시간 및 비용 절약의 이점을 제공한다.
종래 기술의 비-친화도 공정에서의 침전/침전물 여과를 위한 요건은 다운스트림 크로마토그래피 처리 이전에 샘플 스트림으로부터 오염물 (예를 들면, HCP 및/또는 HCDNA) 을 충분히 제거하는 공지된 방법에 따른 단일 스테이지 TFF 처리의 불능으로부터 초래한다. 예를 들면, 당업계에서 공지된 방법에 따른 비-친화도 단백질 처리/정제는 생성물 스트림을 추가로 청징/정제하기 위해 전형적으로는 AEX 및/또는 CEX 를 사용한다. 그러나, 단일 스테이지 TFF 로부터 초래되는 오염 수준은 전형적으로는 컬럼 용량의 과부하로 인해 다운스트림에서 바로 AEX 또는 CEX 의 사용을 불가능하게 한다 (예를 들면, 본원에서의 실시예 섹션 참조). 추가로, 샘플 스트림으로부터의 오염물의 충분한 정제의 실패는 또한 다수의 크로마토그래피 정제 공정, 예를 들면, CEX 처리 이전에 필요한 pH/완충액 조정시에 침전을 초래할 수 있다. 따라서, 표준 처리 방법 동안의 오염물 수준 자체 및/또는 이의 침전은 친화도 정제 대신에 사용되는 크로마토그래피 공정에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 오염물, 특히, 생성된 침전물의 필요한 제거는 정제 공정에 상당한 시간 및 비용 (예를 들면, 냉장 비용, 산업적 침전은 통상적으로 4 ℃ 내지 8 ℃ 에서 하룻밤 동안 수행되기 때문이다) 을 추가시킨다. 침전 공정은 또한 생성물의 회수가 침전물의 성질 및 용적에 따라 불량할 수 있다는 단점을 가진다. 예를 들면, 필터 차단의 유도로 인해, 침전물과 상청액 둘 다를 적층형 필터 (depth filter) 에 적용하는 것은 전형적으로는 적합하지 않으며; 그러므로, 침전물 분획 중에 존재하는 가용성 생성물은 통상적으로 손실된다.
대조적으로, 본 발명의 방법 (즉, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 를 포함함) 은 놀랍게도 생성물 스트림 오염물을 최소를 나타내는 농도 또는 다운스트림 공정, 예를 들면, pH 조정시 통상적으로 필요한 침전/침전물 여과 공정을 제거하는 공정에 영향을 미치지 않는 농도까지 감소시킨다. 예를 들면, 당업계에서 공지된 세포 배양물 상청액의 단일 스테이지 TFF 처리의 사용하여, HCDNA 는 단지 17% 내지 24% 감소할 수 있지만; 대조적으로, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 세포 배양물 상청액 중의 HCDNA 수준을 적어도 85% 내지 92%, 및 잠재적으로 더 이상 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 당업계에서 공지된 단일 스테이지 TFF 처리를 사용하여, HCP 는 세포 배양물 상청액 중에서 단지 0% 내지 28% 감소할 수 있지만; 대조적으로, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법은 세포 배양물 상청액의 HCP 수준을 적어도 17% 내지 46 % 또는 더 이상 감소시킬 수 있다.
본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법의 각각의 공정과 관련하여, 제 2 TFF 단위 조작은 관심 분자, 예를 들면, 단백질을 함유하는 용액으로부터의 다수의 오염물 정제를 제공하며, 특히, 상기 공정에 대한 공급물 스트림은 세포 배양액 (즉, 세포 배양물 상청액) 이다. 예를 들면, 세포 배양물 상청액 공급물 스트림에 대한 제 2 TFF 단위 조작의 조작 (즉, 관심 분자가 투과물로 회수되는 것을 특징으로 함) 은 관심 단백질을 함유하는 수득된 용액으로부터 86% 이상의 HCDNA 로드 및 22% 이상의 HCP 로드를 제거할 수 있다. 제 2 TFF 단위 조작은 또한 관심 분자를 함유하는 용액 중의 HCDNA 로드를 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상 제거할 수 있다. 제 2 TFF 단위 조작은 또한 관심 분자를 함유하는 용액 중의 HCP 로드를 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상 또는 30% 이상 제거할 수 있다.
본원에서 개시되는 바와 같이, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법에 따른 오염물 수준에서의 유의미한 감소는 다운스트림 공정과 업스트림 공정 둘 다와 관련하여 유의미한 효과를 가진다. 예를 들면, 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법을 사용하는 오염물의 강력한 제거는 상기 방법을 광범위한 공급물 스트림 품질에 대해 유효하게, 예를 들면, 광범위한 공급물 스트림 오염물의 수준/농도에 대해 유효하게 한다. 따라서, 본원에서 개시되는 방법은 공급물 스트림 품질 (예를 들면, 조건화, 정화된 세포 배양물 상청액의 품질) 에 관계없이 실시될 수 있으며, 최소 품질 요건을 충족시키기 위한 업스트림 처리에 대한 의존도를 제거할 수 있다. 마찬가지로, 오염물의 유의미한 제거는 또한 이온 교환 컬럼 용량과 같은 다운스트림 처리에 관한 고려사항을 제거할 수 있어서 유량 증가 및 처리 시간 개선을 가능하게 한다. 듀얼 스테이지 TFF 처리는 또한 현재 당업계에서 공지된 방법, 예를 들면, 침전 및 침전물 여과 단계를 포함하는 방법과 비교하여 보다 덜 시간 소모적이다.
본 개시내용의 듀얼 스테이지 TFF 방법을 형성하는 각각의 TFF 단위 조작 (즉, 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작 및 임의로 하나 이상의 제 3 TFF 단위 조작) 은 연속 유동 공정을 제공하도록 조합적으로 결합될 수 있거나, 별도의 배치 조작으로서 개별적으로 수행될 수 있다. 본원에서 개시되는 방법의 각각의 TFF 단위 조작은 또한 당업계에서 공지되는 바와 같이 병렬적으로, 예를 들면, 하나의 조작의 생성물 스트림이 다른 조작에 공급되고, 이어서 다른 조작의 생성물 스트림이 최초의 조작으로 재순환되도록 결합될 수 있다. 병렬적인 각각의 단위 조작의 사용은 또한 저장 용량 및 처리 시간의 증가와 관련된 비용을 경감시킬 수 있다.
본 발명에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법은 당업계에서 인식되는 바와 같이 바로 확장될 수 있다. 이것은 침전이 없는 다운스트림 공정이 바람직한 임의의 공정에서 사용하는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 듀얼 스테이지 TFF 는 컬럼 수명을 증가시키기 위해 임의의 크로마토그래피 단계 이전에 실시될 수 있다. HCP 및 HCDNA 로드의 극적 감소는 직접 수단과 간접 수단 둘 다를 통해 칼럼 수명의 증가를 초래할 수 있다. 직접 방식으로, 본 발명의 방법은 흡착기에 접촉하지 않는 불순물의 양을 감소시키고, 필터 폐쇄/부착을 방지한다. 간접적으로, 오염물 감소는 컬럼 재생에 필요한 정치 세정 조건의 소음진동 (harshness) 에서의 감소를 허용할 수 있다. 본 발명의 방법은 진단 목적 (non-Pharma) 을 위한 항체의 정제를 위한 특정 용도를 고려할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 기술자의 수준을 나타낸다. 본 발명의 특정 형태가 예시되지만, 이들은 본원에서 기재되고 보여지는 부분의 특정 형태 또는 배열에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 각종 변형이 본 발명의 범위를 벗어 나지 않고 이루어질 수 있으며 본 발명이 본 명세서에서 보여지고 기재되는 것에 한정되는 것으로 간주되지 않아야 하는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본원에서 기재된 발명을 보다 더 완전히 이해할 수 있도록, 하기의 비제한적인 예를 제시한다.
실시예
실시예 1:
단일 스테이지 TFF 를 사용하는 용액으로부터의 단백질의 처리
본 실시예는 비-친화도 정제 방법, 특히, 음이온 교환 크로마토그래피 ("AEX") 및 양이온 교환 크로마토그래피 ("CEX") 를 사용하는 항체를 함유하는 용액으로부터의 항체의 분리 및/또는 정제에 관한 것이다. 항체를 함유하는 초기 용액은 정화된 조건화 세포 배양 배지의 공급물 스트림이다. 공급물 스트림은 50 kD 의 컷 오프를 가지는 접선 유동 여과 ("TFF") 의 단일 스테이지를 사용하여 예비처리된다. 본 실시예는 전형적인 공급물 스트림으로부터의 항체의 비-친화도 분리 동안 당업계에서 일상적으로 사용되는 일반적인 관례에 관한 것이다 (예를 들면, [Gottschalk 2009; Alahari et al., BioPharm Int. March 2, 2009 (Supp.); Wang et al., BioPharm . Int . October 2, 2009] 참조). 특히, 항체의 분자량 미만의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막을 사용하는 TFF 의 단일 스테이지를 사용하여 항체를 처음 농축한다 (그리고, 본원에서 개시되는 바와 같이 부분적으로 정제함). TFF 공정에 이어서, 크로마토그래피 공정 이전에 완충액 교환/정용여과를 수행한다. 비록 본원에서 개시되고 예시되는 특정 방법에 대해 무관하지만, 본 실시예에 사용되는 특이적 상체는 항-콜로니 자극 인자 1 수용체 항체 (항-CSFR1; WO 2011/131407 참조) 였다.
방법:
단일 스테이지 접선 유동 여과 및 정용여과 (잔류물 중의 생성물)
Tandem Pump Model 1082 (Satorius Stedim Biotech S.A., Aubagne, France) 및 Sartocon Slice Cassette PESU 50 kD (200 cm2 의 여과 면적, 제품 # 3081465002 E-SG; Satorius Stedim) 를 가지는 Satorius Sartocon Slice 장치를 사용하여 단일 스테이지 접선 유동 여과를 실시하였다. TFF 의 단일 스테이지에서, 945 ml 의 정화된 관심 항체를 2.9 mg/ml 의 농도로 함유하는 세포 배양물 상청액 (즉, 공급물 스트림) 을 136 ml 로 농축시켰다.
이어서, 10 배 용적의 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5 에 대해 완충액 교환을 정용여과에 의해 수행하였다. 당업계의 표준 관례에 따라 TFF/정용여과 조건을 선택하였다. 특히, 단일 스테이지 TFF 의 컷 오프 값인 50 kD 는 생성물 스트림으로부터 저분자량의 숙주 세포 단백질, DNA 및 생산물 단편을 여과하면서 생산물 (즉, 면역글로불린) 을 농축하기 위해 일상적으로 선택되는 10 kD 내지 50 kD 의 컷 오프의 예시이다.
음이온 교환 크로마토그래피
당업계에서 공지된 표준 방법에 따라 TFF/완충액 교환 단계 (즉, 잔류물) 로부터의 생성물 스트림에 음이온 교환 크로마토그래피 ("AEX") 를 적용하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:
교환 물질: Q-세파로오스 FF (GE Healthcare, Freiburg, Germany)
컬럼: 8 mm 내부 직경, 100 mm 길이, 5.03 ml 용적
유속: 150 cm/시간 (1.25 ml/분)*
평형 용액: 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5
로딩 (loading): 80 g 단백질/l 크로마토그래피 물질
세척 용액: 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5
용리 방법: 등용매
(*) 유속은 샘플 로딩 및 용리 동안 관찰된 배압의 증가로
인해 감소하였다.
항체 함유 샘플 (생산물 공급 또는 생성물 스트림) 을 상기에서 나타낸 바와 같이 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 세척 용액으로 세척하고, 등용매 용리 방법을 사용하여 항체를 회수하였다 (관류 모드).
5. 0 으로의 pH 조정
상기에서 나타낸 바와 같이, AEX 컬럼으로부터 용출된 항체는 7.5 의 pH 를 가지는 완충액 중에 있었다. 후속적인 CEX 를 수행하기 위해, 항체 함유 용출액을 1 M 시트르산의 첨가에 의해 5.0 의 pH로 pH 조정하였다.
당업계에서 종종 보고되는 바와 같이, 처리에서 이러한 상응하는 스테이지에서의 pH 조정은 공급물 오염물, 예를 들면, 숙주 세포 단백질 ("HCP") 및 숙주 세포 DNA ("HCDNA"; 예를 들면, [Gottschalk 2006; Anakumari et al., BioPharm Int . Feb. 2007 (Supp); Arunakumari et al., BioPharm . Int. Mar. 2, 2009 (Supp); Arunakumari, Bioprocess Int. Feb. 2009; Jue et al., BioPharm Int. Mar. 2, 2008 (Supp); Jue et al.., BioPharm Int. Oct. 2, 2009] 참조) 의 침전을 초래하였다. 그러므로, CEX 이전에, 샘플을 원심분리 및 여과에 의해 정화해야 했다.
양이온 교환 크로마토그래피: 결합 및 용리 모드
pH 조정 및 여과에 후속적으로, CEX 를 사용하여 항체를 생성물 스트림으로부터 단리하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다.
교환 물질: Poros 50HS (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)
컬럼: 8 mm 내부 직경, 100 mm 길이, 5.03 ml 용적
유속: 150 cm/시간 (= 1.25 ml/분)
평형 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, pH 5.0
로딩: 40 g 단백질/l 크로마토그래피 물질
세척 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, pH 5.0
용리 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, 750 mM NaCl, pH 5.0
용리 방법: 22.5 컬럼 용적에서 0 % (v/v) 내지 100 % (v/v) 용리 용액
의 선형 구배
상기에서 나타낸 바와 같이 CEX 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 세척 용액으로 세척하였다. 선형 구배 용리 방법을 사용하여 모노머성 형태의 항체를 회수하고, pH 값을 일정하게 유지하고, 염화나트륨의 첨가에 의해 전도도를 달라지게 하였다 (증가하였음).
항체 및 오염물 측정
개시 및 최종 생성물 스트림에 대해서 뿐만 아니라, 정제 공정의 다양한 중간 스테이지에서 (전형적으로는 각각의 단위 조작 이후), 항체와 오염물, 즉, 숙주 세포 단백질 ("HCP") 및 숙주 세포 DNA ("HCDNA") 둘 다의 농도를 측정하였다. 정화된 세포 배양물 상청액 (개시 공급물 스트림) 및 모든 중간 생성물 스트림에 대한 항체 농도를 단백질 A-HPLC (단백질 A 친화도 고성능 액체 크로마토그래피; 적용 컬럼: PA ImmunoDetection® Sensor Cartridge for Perfusion Immunoassay™ Technology, Applied Biosystems) 에 의해 측정하였다. CEX 로부터의 통합 용출액 중의 항체 농도를 UV 280 nm 흡착에 의해 측정하였다.
모노머성 항체의 비율을 SE-HPLC (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피; 적용 컬럼: TSK-GEL G3000SWXL; 7.8 mm ID x 30.0 cm L, 5 μm, Tosoh Bioscience) 에 의해 측정하였다.
잔류하는 숙주 세포 단백질 (HCP) 을 폴리클론 샌드위치 유형 효소 결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 에 의해 측정하였다. 간단히 말하면, 스트렙타아비딘으로 예비 코팅된 마이크로타이터 플레이트를, 비오틴-스트렙타아비딘 상호작용을 통해 비오틴으로 표지된 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) HCP 에 대한 항체로 코팅하고, "생산물 항체" 용액과 함께 항온처리하였다. 고추냉이 퍼옥시다아제와 접합된 항-디곡시게닌-항체와 결합된 디곡시게닌과 접합된 항-CHO HCP 항체에 의해 결합된 HCP 를 검출하였다. 기질 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산) (ABTS) 을 첨가하여 결합된 CHO HCP 를 가시화하였다. "생산물 항체" 용액의 측정과 병행하여, 표준 곡선을 모니터링하였다.
CHO DNA 의 정량 측정을 위해 q-PCR 기반 분석법을 사용하였다. 샘플 (필요에 따라 분석 완충액으로 희석함) 을 고도의 변성 조건 하에 용해시켜 온전한 DNA 의 단리를 보장하였다. 단리된 DNA 를 실리카겔계 막에 결합시키고, 원심분리에 의해 잔류하는 완충액 및 샘플 매트릭스로부터 분리하였다. DNA 를 용리 완충액에 용리하였다. DNA 의 열 변성 후, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 표적 서열에 선택적으로 결합시켰다. 2 개의 프라이머 사이에서, 서열 특이적 CHO DNA 프로브를 표적 DNA 와 혼성화하였다.
프로브를 5' 말단에서 형광성 리포터 염료 (reporter dye) 로, 3' 말단에서 켄쳐 염료 (quencher dye) 로 표지하였다. 프로브가 온전하게 유지되는 한, 형광은 리포터 염료에 대한 켄쳐 염료의 상대적 근접으로 인해 소광된다. 증폭 동안, Taq-폴리머라제는 이의 5'-->3' 엑소뉴클라아제 활성으로 인해 표적 서열에 결합된 프로브를 가수분해한다. 리포터 염료는 방출되고, 형광 강도의 증가는 PCR 생성물의 양에 직접 비례한다. 샘플 중의 DNA 의 양을 외부 표준 곡선에 의해 정량화하였다.
최종 결과를 위해, 측정된 CHO DNA 농도에, 적용가능하다면, 샘플의 희석 배수를 곱하고, 단백질 농도로 나누었다.
결과
개시 공급물 스트림, 중간 생성물 스트림 및 최종 용출액에 대한 항체의 농도, 항체 모노머의 비율, 오염물의 수준은 표 1 에 제공된다. 단계 수율은 특정 단위 조작 동안 보유된 항체의 백분율을 제공한다.
표 1
Figure pct00001
상기에서 보고되는 바와 같이, 초기 공급물 스트림은 2.9 g/l 의 항체 농도를 가지는 945 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액이었다. HCP 로드는 245635 ng/mg 이었으며, HCDNA 로드는 6982759 pg/mg 이었다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 단일 스테이지 TFF 및 완충액 교환/정용여과 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 대략 77% 이었다 (즉, 적용된 공급물 중의 모노머성 항체의 77% 가 단위 조작으로부터 회수되었다). SE-HPLC 에 의해 검출된 잔류물의 "모노머 피크" 는 69% 이었다. 단일 스테이지 TFF 는 생성물 스트림 중의 HCP 로드를 28%, HCDNA 로드를 24% 감소시켰다.
TFF/정용여과에 후속하는 AEX 를 관류 모드로 조작하였다. 컬럼 로딩은 80 g/l 이었다. AEX 컬럼에 대한 샘플의 로딩 동안, 컬럼 배압에서의 극적 증가 관찰되었다. 그러나, 로딩 공정을 정지시키지 않고, 체적 유량을 감소시킨 채로 계속하였다. 배압의 증가는 공급물 생성물 스트림의 높은 HCDNA 농도 (5300722 pg/mg) 로 유발되었고, 이것은 AEX 컬럼의 용량을 과부하시킨 것으로 믿어진다. HCDNA ELISA 데이터에 근거하여, 컬럼은 0.42 μg/ml HCDNA (5300722 pg/mg HCDNA x 80 mg/ml 로딩) 에 봉착한 것으로 계산되었다. 유사한 HCDNA 농도에 봉착한 과부하의 예방은 유의하게 더 큰 컬럼을 필요로 할 것이다.
AEX (모노머성 항체) 에 대한 단계 수율의 계산치는 90% 이었다 (즉, 적용된 공급물 용액 (단일 스테이지 TFF/정용여과로부터) 의 모노머성 항체의 90% 가 본 단위 조작 이후 회수되었다). SE-HPLC 에 의해 검출된 "모노머 피크" 는 공급물 샘플 (69%) 과 비교하여 약간 더 높은 73% 이었다. 완충액 교환/AEX 단위 조작은 생성물 스트림의 HCP 로드를 65% 감소시킨 반면, HCDNA 로드는 5% 만큼 약간 증가하였다. HCDNA 데이터는 AEX 단계가 적어도 본 실험에서 HCDNA 에 관한 정제 공정에 유의미하게 기여하지 않는 것을 실증한다. 본 실험에서의 HCDNA 에 관한 정제의 부족은 컬럼 과부하로 인한 것으로 믿어지며, 이의 예방은 유의미하게 더 큰 컬럼의 사용에 의해 잠재적으로 개선될 수 있다.
CEX 단계 이전에, 생성물 스트림의 pH 를 5.0 로 조정하였다. 침전이 본 스테이지에서 샘플 중에 관찰되었다. 생성물 스트림의 항체 농도가 pH 조정 이전의 값에 비해 변하지 않았기 때문에 불순물만이 침전된 것으로 추정되었다. 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 그러나, pH 조정/여과 단계는 단지 25% 의 낮은 생성물 수율과 관련되어 있었다. 이것은 소규모에서의 여과 동안 샘플의 체적 손실에 기인한다. 광범위한 불순물 침전 사례는 상응하는 침전 및 여과 단계 동안의 체적 손실로 인해 생성물 회수의 감소를 초래할 가능성이 가장 높다 (여기에서 관찰되는 바와 같음). 그러나, 대규모 공정에서의 상응하는 체적 손실은 여기에서 제시되는 소규모 데이터와 비교하여 감소할 것으로 예상할 수 있다.
pH 조정 및 여과 이후, SE-HPLC 에 의해 검출되는 생성물의 "모노머 피크" 는 73% 이고, 이것은 공급물 샘플과 비교하여 동일하다. pH 조정/여과는 생성물 스트림의 HCP 로드를 60% 감소시켰고, HCDNA 로드를 99.9% 감소시켰다.
이어서, 생성물 스트림을 결합-및-용출 모드 (bind-and-elute mode) 로 조작되는 CEX 컬럼에 로딩하였다. 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 73% 이었다. 생성물에 대해, SE-HPLC 에 의해 검출되는 "모노머 피크" 는 86% 이었으며, 이것은 공급물 샘플 (73%) 과 비교하여 유의미하게 더 높았다. CEX 는 생성물 스트림의 HCP 및 HCDNA 로드를 각각 88% 및 98% 감소시켰다. 항체 응집물 및 단편의 제거 뿐만 아니라, HCP 및 HCDNA의 극적 감소는, CEX 가 40 g/l 의 컬럼 로딩에서의 잔류하는 불순물을 효율적으로 제거하는 것을 입증한다.
실시예 2:
듀얼 스테이지 TFF 를 사용하는 용액으로부터의 단백질의 처리
본 실시예는 비-친화도 정제 방법, 특히, AEX 및 CEX 를 사용하는 항체를 함유하는 용액으로부터의 항체의 분리 및/또는 정제에 관한 것이다. 초기 용액은 정화된 조건화 세포 배양 배지의 공급물 스트림이다. 본 실시예는 공급물 스트림이 듀얼 스테이지 접선 유동 여과를 사용하여 예비 조건화되는 것을 제외하고는 실시예 1 과 동일하다. 본 실험에서, 듀얼 스테이지 TFF 의 제 1 TFF 단위 조작은 실시예 1 에서 사용된 단일 TFF 스테이지와 동일하였다, 즉, 50 kD 의 컷 오프 값을 가지는 한외여과 막에 이어서, 완충액 교환/정용여과로 수행되었다. 그러나, 실시예 1 과 달리, 본 연구는 듀얼 스테이지 TFF 를 제공하는, 300 kD 컷 오프를 가지는 컬럼으로 수행되는 제 2 TFF 단위 조작의 부가를 입증한다. 이러한 설정은 도 1 또는 도 2 에서 보여질 수 있다. 예시된 연구는 300 kD TFF 에 후속하는, 50 kD 의 컷 오프를 가지는 컬럼으로 수행되는 제 3 TFF/농도 단위 조작을 추가로 부가하였다. 본 실시예에서 사용되는 듀얼 스테이지 TFF 의 개략도는 도 3 에서 제공된다. 제 2 TFF 단위 조작 및 제 3 TFF 단위 조작 (정용여과와 임의로 조합됨) 은 도 4 에서의 개략도에서 보여지는 바와 같이 병렬로 조합될 수 있다. 듀얼 스테이지 TFF 처리 (TFF 50 kD, TFF 300 kD, TFF 50 kD) 에 이어서, AEX 및 CEX 를 실시예 1 에서와 동일하게 수행하였다 (하기에 설명되는 바와 같은 원심분리/여과 단계를 제외함). 본 연구를 실시예 1 에서 사용된 항-CSFR1 항체로 수행하였다.
방법:
제 1 스테이지 접선 유동 여과 및 정용여과 (잔류물 중의 생성물)
실시예 1 에서 보고된 단일 스테이지 TFF 에 대해 기재된 바와 같이 제 1 스테이지 TFF 및 정용여과를 실시하였다. 제 1 스테이지에서, 관심 항체를 2.9 mg/ml 의 농도로 함유하는 945 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액을 136 ml 로 농축하였다.
이어서, 10 배 용적의 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5 에 대하여 완충액 교환을 정용여과에 의해 수행하였다.
제 2 스테이지 접선 유동 여과 ( 투과물 중의 생성물)
제 2 스테이지 TFF 를 제 1 스테이지의 TFF 와 유사하게 수행하지만, Sartocon Slice Cassette PESU 300 kD (200 cm2 의 여과 면적, 제품 # 3081467902E-SG; Satorius Stedim) 를 사용하였다. 본 제 2 스테이지 TFF 동안, 생성물 (항체) 은 필터를 통과하고, 투과물 중에서 발견된다 (따라서, 본 제 2 스테이지 TFF 의 투과물은 생성물 스트림을 형성한다). 본 제 2 스테이지 TFF 동안, 항체를 15.2 mg/ml 의 농도로 함유하는 108 ml 의 샘플 (즉, 제 1 스테이지 TFF 로부터의 잔류물) 을 제 2 컬럼 상에서 15 배의 완충액 용적 (25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) 에 대해 정용여과하였다.
농도
생성물이 투과물로 존재하고 생성물을 함유하는 샘플의 용적에서의 극적 증가 (즉, 생성물 스트림의 용적에서의 극적 증가) 를 초래하도록, 제 2 스테이지 TFF 를 설계하였다. 따라서, 50 kD 의 컷 오프를 가지는 컬럼을 사용하는 제 3 TFF 는 생성물을 농축시키고 생성물 스트림의 용적을 감소시키기 위해 사용되었다. 본 제 3 TFF 스테이지는 상기에서 및 실시예 1 에서 기재된 제 1 스테이지 TFF 와 동일한 50 kD 의 컷 오프를 가지는 컬럼을 사용하였다. 본 제 3 스테이지에서, 1.1 mg/ml 의 농도에서의 1627 ml 의 생성물 스트림 (즉, 제 2 스테이지 TFF 로부터의 투과물) 을 143 ml 의 용적으로 농축시켰다.
음이온 교환 크로마토그래피
듀얼 스테이지 TFF 처리 단계에 뒤따르는 AEX 는 실시예 1 에서와 동일하게 진행하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:
교환 물질: Q-세파로오스 FF (GE Healthcare, Freiburg, Germany)
컬럼: 8 mm 내부 직경, 100 mm 길이, 5.03 ml 용적
유속: 150 cm/시간 (1.25 ml/분)
평형 용액: 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5
로딩: 86 g 단백질/l 크로마토그래피 물질
세정 용액: 25 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5
용리 방법: 등용매
생성물 공급물을 상기에서 나타낸 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩한 후, 컬럼을 세척 용액으로 세척하고, 등용매 용리 방법을 사용하여 항체를 회수하였다 (관류 모드). 실시예 1 과 대조적으로, AEX 동안 배압에서의 어떠한 극적 증가도 관찰되지 않았으며, 유속에서의 감소는 필요하지 않았다.
5. 0 으로의 pH 조정
실시예 1 에서와 동일하게, CEX 이전에, AEX 컬럼으로부터 용출된 샘플을 1 M 시트르산의 첨가에 의해 5.0 의 pH 로 pH 조정하였다. 그러나, 실시예 1 과 대조적으로, 어떠한 침전도 본 스테이지에서 관찰되지 않았고, 따라서, 생성물 스트림의 원심분리/여과는 필요하지 않았다. 오히려, 생성물 스트림을 CEX 컬럼 상에 직접 로딩하였다.
양이온 교환 크로마토그래피: 결합 및 용출 모드
pH 조정에 이어서, 실시예 1 에서 기재된 CEX 를 사용하여 생성물 스트림으로부터 항체를 단리하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다.
교환 물질: Poros 50HS (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)
컬럼: 8 mm 내부 직경, 100 mm 길이, 5.03 ml 용적
유속: 150 cm/시간 (= 1.25 ml/분)
평형 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, pH 5.0
로딩: 20 g 단백질/l 크로마토그래피 물질
세척 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, pH 5.0
용리 용액: 10 mM 시트르산 나트륨, 750 mM NaCl, pH 5.0
용리 방법: 22.5 컬럼 용적에서 0% (v/v) 내지 100% (v/v) 용리 용액의
선형 구배
상기에서 나타낸 바와 같이 CEX 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 세척 용액을 세척하였다. 모노머성 형태의 항체를 선형 구배 용리 방법으로 회수하고, 이에 의해 pH 값은 일정하게 유지하고, 염화나트륨의 첨가에 의해 전도도를 달라지게 하였다 (증가하였음).
항체 및 오염물 측정
항체 농도 및 오염물, 숙주 세포 단백질 ("HCP") 및 숙주 세포 DNA ("HCDNA") 의 농도를 실시예 1 에서 기재된 방법에 따라 실험의 다양한 스테이지에서 측정하였다.
결과
개시 공급물 스트림, 중간생성물 스트림 및 최종 용출액에 대한 항체의 농도, 항체 모노머의 비율 및 오염물 수준은 표 2 에서 제공된다. 단계 수율은 특정 단위 조작 동안 보유된 항체의 백분율을 제공한다.
표 2
Figure pct00002
상기에서 보고되는 바와 같이, 초기 공급물 스트림은 2.9 g/l의 항체 농도를 가지는 945 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액이었다. HCP 로드는 245635 ng/mg 이었고, HCDNA 로드는 6982759 pg/mg 이었다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 제 1 스테이지 TFF 및 완충액 교환/정용여과 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 대략 77% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 생성물 스트림 (잔류물) 의 "모노머 피크" 는 69% 이었다. 단일 스테이지 TFF 는 생성물 스트림 중의 HCP 로드를 28% 감소시켰고, HCDNA 로드를 24% 감소시켰다. 이것은 실시예 1 에서 보고된 단일 스테이지 TFF 와 동일한 단위 조작이다.
300 kD 컷 오프를 가지는 제 2 스테이지 TFF 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 112% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 72% 이었으며, 이것은 적용된 공급물 (69%) 보다 다소 더 높다. 제 2 스테이지 TFF 는 생성물 스트림의 HCP 로드 및 HCDNA 로드를 각각 22% 및 94% 감소시켰다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 컬럼을 사용하는 후속적인 TFF/농도 단계 동안, 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 93% 이었다. 용출된 샘플에 대해, SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 72% 이었으며, 이것은 적용된 공급물 샘플과 동일하였다. TFF/농도 스테이지는 생성물 스트림의 HCP 로드를 5% 감소시킨 반면, HCDNA 로드는 78% 증가하였다 (이것은 분석법 변화에 기인한다).
듀얼 스테이지 TFF 예비 조건화에 후속하는 AEX 는 관류 모드로 조작되었다. 컬럼 로드는 86 g/l 이었다. AEX (모노머성 항체) 에 대한 단계 수율의 계산치는 92% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 공급물 샘플 (72%) 과 비교하여 다소 더 높은 75% 이었다. AEX 단위 조작은 생성물 스트림의 HCP 로드를 85% 감소시킨 반면, HCDNA 로드는 89% 감소하였다. 실시예 1 에서와 동일한 단일 스테이지 TFF 예비 조건화를 사용하는 AEX 와 대조적으로, HCP 및 HCDNA 데이터는 듀얼 스테이지 TFF 예비 조건화에 후속하는 AEX 가, 비록 이것이 필적할 만한 높은 컬럼 로드에서 관류 모드로 조작되지만, 정제 공정에 유의미하게 기여하였다는 것을 나타낸다.
CEX 단계 이전에, 생성물 스트림의 pH 를 5.0 으로 조정하였다. 실시예 1 의 단일 스테이지 TFF 와 대조적으로, 어떠한 침전도 본 스테이지에서의 샘플에서 관찰되지 않았으며, 샘플/생성물 스트림을 CEX 컬럼 상에 직접 로딩하였다.
CEX 컬럼을 결합 및 용출 모드로 조작하였다. 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 90% 이었다. 생성물에 대해서, SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 96% 이었으며, 이것은 공급물 샘플 (72%) 과 비교하여 훨씬 더 높았다. CEX 는 생성물 스트림의 HCP 및 HCDNA 로드를 각각 73 % 및 99% 감소시켰다. 항체 응집물 및 단편의 제거 뿐만 아니라, HCP 및 HCDNA 의 극적 감소는, CEX 가 20 g/l 의 컬럼 로딩에서의 잔류하는 불순물을 효율적으로 감소하는 것을 입증한다.
실시예 3:
단일 스테이지 TFF 를 사용하는 용액으로부터의 단백질의 처리
상이한 관심 단백질, 특히, 항-안지오포이에틴 2 (Ang2)/VEGF 항체를 함유하는 공급물 스트림을 사용하여 실시예 1 을 반복하였다 (예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 2010/0111967 참조). 실시예 1 의 방법으로부터의 유도체만을 본원에서 보고한다.
방법:
단일 접선 유동 여과 및 정용여과 (잔류물 중의 생성물)
단일 스테이지 TFF 에서, 항-Ang2/VEGF 항체를 2.7 mg/ml 의 농도로 함유하는 950 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액을 134 ml 로 농축시켰다. 이어서, 완충액 교환을 또한 실시예 1 과 동일하게 실시하였다.
음이온 교환 크로마토그래피
컬럼의 로드이 19 g 단백질/l 컬럼 물질인 것을 제외하고는 AEX 를 실시예 1 에 따라 진행하였다. 실시예 1 에서 보고된 AEX 공정과 대조적으로, 어떠한 배압 증가도 항-Ang2/VEGF 항체 처리의 본 스테이지에서 관찰되지 않았으며; 150 cm/시간의 유속을 전체 단위 조작 동안 유지하였다. 이것은 실시예 1 에서의 초기 항-CSFR1 공급물 스트림과 비교하여 초기 항-Ang2/VEGF 항체 공급물 스트림 중에서 극적으로 더 낮은 농도의 HCDNA 로 인해 그럴 가능성이 크다 (대략 80 % 미만; 표 1 및 표 3 비교). 이것은 침전 및 여과 이전에 모든 단위 조작 동안 HCDNA 의 농도를 더 낮게 한다.
5. 0 으로의 pH 조정
실시예 1 에서와 비교하여 본 공정 내내 더 낮은 농도의 HCDNA 에도 불구하고,침전이 또한 5.0 으로의 pH 조정 동안 항-Ang2/VEGF 생성물 스트림에 대해 관찰되었다. 또한, 생성물 스트림 중의 항체의 농도가 변하지 않았기 때문에, 오염물만이 침전된 것으로 추정된다. 실시예 1 에서와 동일하게, 샘플을 CEX 이전에 원심분리 및 여과에 의해 정화하였다.
양이온 교환 크로마토그래피: 결합 및 용출액 모드
컬럼 로드를 13 g 단백질/l 크로마토그래피 물질로 감소시킨 것을 제외하고는 실시예 1 에서와 동일하게 항-Ang2/VEGF 샘플의 CEX 를 수행하였다.
항체 및 오염물 측정
항체 농도 및 오염물 HCP 및 HCDNA 의 농도를 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 실험을 통해 측정하였다.
결과
공급물 스트림, 중간 생성물 스트림 및 최종 용출액에 대한 항체의 농도, 항체 모노머의 비율 및 오염물 수준은 표 3 에서 제공된다.
표 3
Figure pct00003
상기에서 보고되는 바와 같이, 초기 공급물 스트림은 2.7 g/l의 항체 농도를 가지는 950 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액이었다. HCP 로드는 420531 ng/mg 이었고, HCDNA 로드는 1443609 pg/mg 이었다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 단일 스테이지 TFF 및 완충액 교환/정용여과 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 대략 86% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 잔류물의 "모노머 피크" 는 65% 이었다. 단일 스테이지 TFF 는 생성물 스트림 중의 HCP 로드를 약 6 % 감소시켰고, HCDNA 로드를 17% 감소시켰다.
TFF/정용여과에 후속하는 AEX 를 관류 모드에서 조작하였다. 컬럼 로딩은 79 g/l 이었다. AEX (모노머성 항체) 에 대한 단계 수율의 계산치는 79% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 공급물 샘플 (65%) 과 비교하여 약간 더 높은 78% 이었다. 완충액 교환/AEX 단위 조작은 생성물 스트림의 HCP 로드를 62% 감소시킨 반면, HCDNA 로드는 3% 만큼 약간 증가하였다. 비록 HCP 제거가 어느 정도까지 달성될 수 있지만, 본 데이터는 실시예 1 의 결과를 확인해 준다, 즉, TFF 처리의 단일 스테이지에 후속하는 AEX 단계는 항체를 위한 정제 공정에 유의미하게 기여하지 못하였다. 또한, 실시예 1 과 일치하게, AEX 처리는 컬럼의 과부하로 인해 HCDNA 농도의 감소에 유의미하게 기여하지 못한 것으로 믿어진다. 과부하의 예방은 유의미하게 더 크고 보다 고가의 컬럼의 사용에 의해 개선될 수도 있다.
CEX 단계 이전에, 샘플의 pH 를 5.0 으로 조정하였다. 실시예 1 의 상응하는 샘플과 비교하여 유의미하게 감소된 HCP 및 HCDNA 의 농도를 가지는 샘플에도 불구하고, 침전이 본 생성물 스트림에서 다시 관찰되었다. 또한, 샘플의 항체 농도가 pH 조정 이전의 값에 비해 변하지 않았기 때문에, 불순물만이 침전된 것으로 추정되었다. 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 샘플의 pH 조정/침전/여과 이후에 항체 모노머 분석도 오염물 분석도 수행하지 않았다.
이어서, 샘플을 결합 및 용출액 모드로 조작되는 CEX 컬럼 상에 로딩하였다. 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 99% 이었다. 생성물에 대해서, SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 94% 이었다. 상기에서 보고되는 바와 같이 중간 생성물 스트림을 오염물 농도에 대해 테스트하지 않았기 때문에, 오염물 감소에 대한 CEX 의 단계 기여를 평가할 수 없었다. 그러나, 최종 HCP 로드는 16308 ng/mg 이었고, 최종 HCDNA 로드는 65 pg/ml 이었다.
실시예 4:
듀얼 스테이지 TFF 를 사용하는 용액으로부터의 단백질의 처리
본 실시예는 실시예 3 의 공급물 스트림, 즉 항-Ang2/VEGF 항체를 함유하는 공급물 스트림을 사용하여 실시예 2 를 반복한다. 실시예 2 의 방법을 다시 상세하게 설명하지 않고, 상기 방법으로부터의 편차만을 본원에 보고한다.
방법:
제 1 스테이지 접선 유동 여과 및 정용여과 (잔류물 중의 생성물)
제 1 스테이지 TFF 에서, 관심 항체를 2.7 mg/ml 의 농도로 함유하는 950 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액을 134 ml 로 농축시켰다. 완충액 교환을 실시예 2에서와 동일하게 진행하였다.
제 2 스테이지 접선 유동 여과 ( 투과물 중의 생성물)
제 2 스테이지 TFF 에서, 항체를 11.9 mg/ml 의 농도로 함유하는 98 ml 의 생성물 스트림 샘플 (즉, 제 1 스테이지 TFF 로부터의 잔류물) 을 18 배의 완충액 용적에 대해 정용여과하였다.
농도
제 3 스테이지 TFF/농축에서, 1.0 mg/ml 의 항체를 함유하는 1524 ml 의 생성물 스트림을 157 ml 의 용적으로 농축시켰다.
음이온 교환 크로마토그래피
로딩이 80 g 단백질/l 크로마토그래피 물질인 것을 제외하고는 AEX 를 실시예 2 의 방법에 따라 진행하였다.
5. 0 으로의 pH 조정
pH 조정을 실시예 2 에서 상세하게 설명된 바와 같이 수행하였다.
양이온 교환 크로마토그래피: 결합 및 용출액 모드
CEX 를 실시예 2 에서 상세하게 설명된 바와 같이 수행하였다.
항체 및 오염물 측정
항체 농도 및 오염물, 즉, 숙주 세포 단백질 ("HCP") 및 숙주 세포 DNA ("HCDNA") 의 농도를, 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 실험 내내 측정하였다.
결과
개시 공급물 스트림, 중간 생성물 스트림 및 최종 용출액에 대한 항체의 농도, 항체 모노머의 비율 및 오염물 수준은 표 4에서 제공된다.
표 4
Figure pct00004
상기에서 보고되는 바와 같이, 초기 공급물 스트림은 2.7 g/l 의 항체 농도를 가지는 950 ml 의 정화된 세포 배양물 상청액이었다. HCP 로드는 420531 ng/mg 이었고, HCDNA 로드는 1443609 pg/mg 이었다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 제 1 스테이지 TFF 및 완충액 교환/정용여과 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 대략 86 % 이었다. 잔류물 SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 65% 이었다. 단일 스테이지 TFF 는 생성물 스트림의 HCP 로드를 6% 만큼 약간 증가시켰고, HCDNA 로드는 17% 감소하였다. 이것은 실시예 3 에서 보고된 단일 스테이지 TFF 와 동일한 단위 조작이다.
300 kD 컷 오프를 가지는 제 2 스테이지 TFF 이후, 모노머성 항체에 대한 단계 수율의 계산치는 100% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 75% 이었으며, 이것은 적용된 공급물 (65%) 보다 유의미하게 더 높았다. 제 2 스테이지 TFF 는 생성물 스트림의 HCP 로드 및 HCDNA 로드를 각각 29 % 및 86% 감소시켰다.
50 kD 의 컷 오프를 가지는 컬럼을 사용하는 후속적인 TFF/농도 단계 동안, 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 100% 이었다. 용출된 샘플에 대해, SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 76% 이었으며, 이것은 적용된 공급물 샘플 보다 약간 더 높았다. TFF/농도 스테이지는 생성물 스트림의 HCP 로드를 10% 증가시킨 반면, HCDNA 로드는 3% 감소하였다.
듀얼 스테이지 TFF 예비 조건화에 후속하는 AEX 는 관류 모드로 조작되었다. AEX (모노머성 항체) 에 대한 단계 수율의 계산치는 90% 이었다. SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 공급물 샘플 (76%) 과 비교하여 약간 더 높은 80% 이었다. AEX 단위 조작은 생성물 스트림의 HCP 로드를 64% 감소시킨 반면, HCDNA 로드는 87% 감소하였다. 실시예 3 (및 실시예 1) 에서와 동일하게 단일 스테이지 TFF 처리를 사용하는 AEX 와 대조적으로, HCP 및 HCDNA 데이터는 실시예 2 의 결과를 확인해 준다, 즉, 비록 이것이 필적할 만한 높은 컬럼 로드에서 관류 모드로 조작되지만, 듀얼 스테이지 TFF 처리에 후속하는 AEX 는 정제 공정에 유의미하게 기여한다.
CEX 단계 이전에, 생성물 스트림의 pH 를 5.0 으로 조정하였다. 또한, 실시예 1 및 실시예 3 에서 보고된 단일 스테이지 TFF 처리와 대조적으로, 그리고 실시예 2 에서 보고된 듀얼 스테이지 TFF 처리와 일치하게, 어떠한 침전도 본 스테이지에서의 생성물 스트림에서 관찰되지 않았으며, 샘플을 CEX 컬럼 상에 직접 로딩하였다.
CEX 컬럼을 결합 및 용출액 모드로 조작하였다. 단계 수율 (모노머성 항체) 의 계산치는 100% 이었다. 생성물에 대해서, SE-HPLC 에 의해 측정되는 "모노머 피크" 는 95% 이었으며, 이것은 공급물 샘플 (80%) 과 비교하여 훨씬 더 높았다. CEX 는 공급물 샘플의 HCP 및 HCDNA 로드를 각각 93 % 및 99.8% 감소시켰다. 항체 응집물 및 단편의 제거 뿐만 아니라, HCP 및 HCDNA 의 극적 감소는, CEX 가 20 g/l 의 컬럼 로드에서의 잔류하는 불순물을 효율적으로 제거하는 것을 입증한다 (실시예 2 와 일치함).
실시예 1 내지 실시예 4 의 결과를 고려한 일반적 결론
당업계에서 공지된 방법에 따른 단일 스테이지 TFF 방법의 사용은 오염물 수준 (예를 들면, HCP 및 HCDNA) 을 만족스럽게 감소시키지 못하여 다운스트림 크로마토그래피 공정, 예를 들면, AEX 의 과부하를 초래하였다. 그러나, 본 발명에 따른 듀얼 스테이지 TFF 방법을 사용함으로써, AEX 컬럼의 과부하는 소정의 컬럼 크기에서 예방되었다. 이것은 듀얼 스테이지 TFF 방법이 현재 실시되는 것 보다 유의미하게 더 작은 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 동일한 초기 공급물 스트림에 대한 효율적인 오염물 감소, 예를 들면, HCDNA 및/또는 HCP 제거를 가능하게 하는 것을 나타낸다. 이것은 본원에서 개시되는 듀얼 스테이지 TFF 방법과 관련된 유의미한 경제적 이점을 나타낸다.
당업계의 기술은 비-친화도 기반 정제, 예를 들면, AEX 및 CEX 를 사용하는데 있어서 관심을 보여준다. 그러나, 이들 방법은 불만족스러웠으며, 친화도 기반 시스템에 대한 의미있는 대체로 현재 여겨지지 않는다. 특히, 비-친화도 크로마토그래피 공정의 실시는 종종 생성물 스트림 중에서의 침전물 형성과 같은 원치않는 효과와 관련되어 있다. 예를 들면, CEX 이전에 pH 를 7.5 에서부터 5.0 으로 조정하기 위한 단일 스테이지 TFF 의 다운스트림에서의 생성물 스트림 처리는 불순물 침전을 초래하였다. 침전물을 제거하기 위한 생성물 스트림의 처리는 시간 소모적이고, 본원에서 상세하게 설명된 바와 같이 유의미한 비용과 관련되어 있다. 그러나, 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 방법의 실시는 처리 단계 동안 침전물 형성을 제거시키고, 수율을 증가시키고, 침전물 처리와 관련된 비용을 절약시켜 주었다.
단일 스테이지 TFF 와 본 발명의 듀얼 스테이지 TFF 의 직접 비교는 후자가 생성물 품질, 모노머성 생성물의 수준, HCP 수준 및 HCDNA 수준에 대해 탁월한 것으로 나타났다.

Claims (15)

  1. 듀얼 스테이지 접선 유동 한외여과 (dual stage tangential-flow ultrafiltration: TFF) 를 사용하여 관심 단백질을 상기 단백질을 함유하는 세포 배양액으로부터 분리하는 방법으로서,
    상기 듀얼 스테이지 TFF 는 제 1 TFF 단위 조작 (first TFF unit operation) 및 제 2 TFF 단위 조작 (second TFF unit operation) 을 포함하고,
    상기 제 1 TFF 단위 조작은, 상기 단백질이 제 1 TFF 단위 조작의 잔류물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 1 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 1 생성물 스트림을 여과하고;
    상기 제 2 TFF 단위 조작은, 상기 단백질이 제 2 TFF 단위 조작의 투과물로 회수되도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 2 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 2 생성물 스트림을 여과하고;
    상기 제 1 생성물 스트림 또는 상기 제 2 생성물 스트림은 세포 배양물 상청액인 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 생성물 스트림은 세포 배양물 상청액이고, 상기 제 1 TFF 단위 조작은 상기 제 2 TFF 단위 조작의 업스트림에 있는 것인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 는, 상기 단백질이 제 3 TFF 단위 조작 (third TFF unit operation) 의 잔류물로 존재하도록, 일정한 컷 오프 값을 가지는 제 3 한외여과 막을 사용하여 상기 단백질을 함유하는 제 3 생성물 스트림을 여과하는 제 3 TFF 단위 조작을 추가로 포함하고, 상기 제 3 TFF 단위 조작은 상기 제 1 TFF 단위 조작 및 제 2 TFF 단위 조작의 다운스트림에 있는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 제 3 한외여과 막의 컷 오프 값은 상기 제 2 한외여과 막의 컷 오프 값과 동일한 것인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 10 kD 이상 500 kD 이하의 분자량을 가지는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 1 한외여과 막은 상기 단백질의 분자량의 절반 (0.5 배) 이하의 컷 오프 값을 가지고;
    상기 제 2 한외여과 막은 상기 단백질의 분자량의 두 배 (2 배) 이상 1000 kD 이하의 컷 오프 값을 가지는 것인 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 단백질은 150±75 kD 의 분자량을 가지는 것인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항체인 것인 방법.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 한외여과 막은 50 kD 이하의 컷 오프 값을 가지고; 상기 제 2 한외여과 막은 300 kD 과 1000 kD 사이의 컷 오프 값을 가지는 것인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 제 1 한외여과 막은 50 kD 의 컷 오프 값을 가지고; 상기 제 2 한외여과 막은 300 kD 의 컷 오프 값을 가지는 것인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 는 상기 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 숙주 세포 단백질 (HCP) 의 농도를 상기 세포 배양물 상청액에 비해 10 % 이상 감소시키고/시키거나, 상기 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 숙주 세포 DNA (HCDNA) 의 농도를 상기 세포 배양물 상청액에 비해 30 % 이상 감소시키는 것인 방법.
  12. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 는 상기 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 HCP 의 농도를 상기 단백질 mg 당 400,000 ng 이하까지 감소시키고/시키거나, 상기 관심 단백질을 함유하는 세포 배양액 중의 HCDNA 의 농도를 상기 단백질 mg 당 1,500,000 pg 이하까지 감소시키는 것인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 듀얼 스테이지 TFF 의 다운스트림에서 컬럼 크로마토그래피 공정을 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피 공정은 비-친화도 컬럼 크로마토그래피 공정인 것인 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 컬럼 크로마토그래피 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 단위 조작 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 단위 조작인 것인 방법.
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