JPH03180192A - 遺伝子組換えによるヒトプロＴＧＦ―β１の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は、骨形成促進作用および抗腫瘍作用等の生理作
用を有するヒトプロＴＧＦ−β１の遺伝子組換えによる
製造技術に関する。具体的には、ヒトプレプロＴＧＦ−
β１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ鎖を用いるヒト
プロＴＧＦ−β１の製造法、この製造に用いられる発現
ベクターおよび形質転換体、ならびに形質転換体によっ
て生産されるヒトプロＴＧＦ−β１に関スる。

〈従来の技術〉 ＴＧＦ−β１はマチュアー型で生理作用を示すタンパク
であるが、生体内で生合成される時には一旦前駆体部分
の付加されたプロ型として作られる。その後体内での酸
性条件およびプロテアーゼによって切断されてマチュア
ー型になると考えられている。従来、ヒトプロＴＧＦ−
β１はヒトの血小板から単離されていた。収量は血小板
３００ｇから４０μｇが得られる程度（０，００００１
３％）であり、実際上薬剤とするための生産法としては
、その供給源および収量の点からも非実用的な方法であ
った（言回らｒＴＧＦ−β１の潜在型高分子複合体」、
ジャーナル・オプ・バイオロジカル−ケミストリー、２
６３ニア６４Ｂ−７８５４，１９８８，Ｍｉｙａｚｏｎ
ｏ　ｋ。

ｅｔ　　ａｌ：　　Ｌａｔｅｎｔ　　ｈｌｇｈ　　５ｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　ｖｅｌｇｈｔ　　ｃｏｍｐｌｅｘｏ
ｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆ’ａ
ｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　１．　Ｊ、Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｓ＋、２８８ニア６４Ｂ−７６５４，１９８８，
）　、現在ではヒトプロＴＧＦ−β１の遺伝子がクロー
ニングされていることから〔プリンクら、ネイチャー、
　３１８ニア０１−７０５．１９８５．　Ｄｅｒｙｎｅ
ｋ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｎａｔｕｒｅ、３１Ｂ　：　７Ｇ
１−７０５、．１９８５．、プリンクら、ヌクレイツク
・アシッド・リサーチ、　１５：３１８ｇ−３１８９，
１９８７，Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔａｔ　：　Ｎｕｃｌｅ
ｌｅ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１５：３１ｇｇ−３１
８９，１９８７，）、遺伝子組換え技術を用いてヒトの
マチュアーＴＧＦ−β１を生産することが実現されてい
る。

すなわち、ヒトのマチュアーＴＧＦ−β１は、これに前
駆体部分が付加されたタンパクをコードするＤＮＡによ
り形質転換されたＣＨＯ細胞において発現され生産され
ている（特開昭６１−２１９３９５　ｒＴＧＦ−βをコ
ードしている核酸およびその用途」）。マチュアー型と
プロ型の相違点は、第７図に示した通りであり、マチュ
アーＴＧＦ−β１に前駆体部分のタンパクが付加された
ものがプロＴＧＦ−β１である。細胞内から分泌された
ときは、プロ型として存在しこれが生体内局所に移送さ
れマチュアー型となると考えられている。

先行特許に示されたこのマチュアー型の遺伝子組換え生
産法を詳述すると、以下の通りである。

すなわち、ＴＧＦ−β１のためのＤＮＡとしてはプロ型
の前駆体部分の一部と単純ヘルペスウィルスの膜タンパ
ク（ＨＳＶ−１ｇＤ）の一部を含む形でＣＨＯ細胞に導
入され、前駆体部分が３５９個のアミノ酸で構成される
（第８図のＢ’　−Ｃ部分）キメラペプチドとして生産
される。

その後、酸性環境下においてＣ部分が人為的に切断され
マチュア一部が生産されるという方法である。しかしな
がら、細胞から分泌される融合プロＴＧＦ−β１（第８
図参照）の発現量は培地１ｍＬあたり０．０００５μｇ
と非常に微量であり工業的生産には不適当と考えられる
。またマチュアーＴＧＦ−β１は、それ自体で免疫抑制
（すなわち、外部から生体内に侵入したバクテリア等を
補食したり、抗原の強さをＴ細胞に連絡するといった免
疫調節に重要な役割を演じるマクロファージの機能を抑
制すること）という副作用を有している〔ツナワキらｒ
ＴＧＦ−β１によるマクロファージの不活化」ネイチャ
ー　３１４：２８Ｇ−２８２，１９８８゜（Ｔｓｕｎａ
ｖａｋｌ　Ｓ、　ｅｔ　ａｔ：　Ｄｅａｃｔｌｖａｔｌ
ｏｎ　ｏｆ’　ｍａｃｒｏ−ｐｈａｇｃｓ　　ｂｙ　　
ＴＧＰ−Ｂｅｔａ、　　　　Ｎａｔｕｒｅ　　３３４二
２８０−２８２゜１９８８）　）。すなわち、マチュア
ー型を静脈注射等により生体内に投与すると、血中ある
いは正常臓器のマクロファージに作用しその機能を抑制
する。

ヒト以外のＴＧＦ−β１の生産に関する先行技術として
はサルのプロＴＧＦ−β１が知うれているが、ヒトのプ
ロＴＧＦ−β１と比較してアミノ酸レベルで３個（サル
では第１図における（Ｂ）−（Ｃ〉間の４８番目Ａｌａ
ａｌ９１番目Ａｓｐ。

および２２８番目ＡｒｇがそれぞれＴｈｒ。

Ａｓｎ、およびＬ　ｙ　ｓ　ｌ：置換されている）が異
なっており、上記のようにヒトに投与する場合、抗原性
を示すことが懸念され薬剤としては満足できる状態では
ない〔ジエントリー・エル・イーら、「遺伝子組換えＴ
ＧＦ−β１のプレプロ型からマチュアー型へのプロセッ
シングにおける分子構造上の変化」、モレキュラー・セ
ルラー・バイオロジー、８：４．１８２−４１８８．１
９８８．（Ｇｅｎｔｒｙ　ＬＥ、　ｅｔ　ａｌ：Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　ｅｖｅｎｔｓ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇ　ｏｌ’ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ　ｔｙｐ
ｅ　１　ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｒｏｒｌｔｎｇｇ
ｒｏｗｔｈ　Ｉ’ａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　１０　Ｌｈｅ
　ｍａｔｕｒｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８：４１Ｂ２−４１Ｂ８
．１９８８．　）　　；プランナー・ニー・エムら、「
チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）において生
産された遺伝子組換えＴＧＦ−β１前駆体はグリコジル
化およびリン酸化をうけている」、モレキュラー・セル
ラー・バイオロジー、８：２２２９−２２８２．１９８
８．（Ｂｒｕｎｎｅｒ　ＡＭ。

ｅｔ　ａｌ：Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ　ｔｙｐｅ　ｌ　
ｔｒａｎｓｌ’ｏｒｉｌｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ１’ａｃｔ
ｏｒ　ｂｅｔａ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｅ
ｄ　Ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ
　ｃｅｌｌｓ　ｉｓ　ｇ＋ｙｃｏｓｙ＋ａｔｅｄａｎｄ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
Ｂｌｏｌ、８：２２２９−２２３２゜１９８８、　）；
ズウー・シャー　ｒＴＧＦ−β１に関して、プロセッシ
ングと分泌のためのグリコシレージョンと酸性プロテア
ーゼの重要性」、モレキュラー・エンドクリノロジー、
１３：１０９０−１０９８゜１９８９、（Ｘｕｅ　Ｓｈ
ａ、　ｅｔ　ａｌ：　Ｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍｉｎｇ　ｇ
ｒｏｗｔｈｒａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　１：Ｉｍｐｏｒｔ
ａｎｃｅ　ｏｒ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｌｏｎａｎｄ　
Ａｃ１ｄｉｃ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄＳｅｃｒｅｔｉｏｎ、　Ｍｏ１．
Ｅｎｄｏ、１３：１０９０−１０９８．１９８９　）　
）。

その他の動物のＴＧＦ−β１については研究段階であり
、一部のアミノ酸配列が知られているにすぎない〔（セ
イディン・ニス・エムら、「軟骨誘導因子Ｂは構造上お
よび機能上ＴＧＦ−βと関連した特異なタンパクである
」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミトスリー、
２Ｇ２：１９４Ｂ−１９４９゜１９８７、（Ｓｅｙｅｄ
ｉｎ　ＳＭ、　ｅｔ　ａｌ：ｃａｒｔｌｌａｇｅ−１ｎ
ｄｕｃｉｎｇｆａｃｔｏｒ　Ｂ　Ｉｓ　ａ　ｕｎｉｑｕ
ｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙａｎｄ
　ｆ’ｕｎｃｔ１ｏｎａｌｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ
　ＴＧＦ−ｂｅｔａ、　Ｊ、Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２８２：１９４Ｂ−１９４９，１９８７，）
　　；チャイフエツツら、ｒＴＧＦ−βシステム：交叉
反応するリガンドとリセブターの複合パターン」、セル
、４８：４０９−４１５゜１９８７、　Ｃｈｃｉｆｃｔ
ｓ　Ｓ、　ａｔ　ａｌ：Ｔｈｃ　ＴＧＦ−ｂｅｔａ　ｓ
ｙｓｔｅｍ。

ａ　ｃｏｓ＋ｐｌｃｘ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｃｒｏ
ｓｓ−ｒｅａｃｔｔｖｅ　Ｉｌｇａｎｄｓａｎｄ　ｒｃ
ｃｃｐｔｏｒｓ、ｃｃｌｌ　４８　：　４０９−４１５
．１９８７）　）。

〔発明の概要〕

〈発明が解決しようとする課題〉 上述したように、マチュアー型のＴＧＦ−β１は免疫抑
制による副作用を有しているということから、プロ型の
ＴＧＦ−β１はより毒性が低いものと考えられる。すな
わち、マチュアー型を静脈注射等により生体内に投与す
ると、血中あるいは正常臓器のマクロファージに作用し
その機能を抑制するが、プロ型を同様に投与しても活性
部位が前駆体部分（第７図における（Ｂ）−（Ｃ）部分
）によってブロックされているため、プロ型のままでは
マクロファージの機能を抑制することはないと考えられ
る。ところが、骨形成および腫瘍増殖の場では、それぞ
れ酸の遊離あるいは乳酸蓄積によって細胞周辺の環境が
酸性化しており（須田立雄ら著、「骨の科学」医歯薬出
版（株）発行、１９８８年版、ｐ１８５ｒ骨の吸収作用
（破骨細胞）では、局所におけるｐＨの低下・・・」、
鎮目和夫ら著、「骨代謝調節因子」羊上社（株）発行、
１９８７年版、β３５「骨塩の溶解は破竹細胞から分泌
される酸によって行われるとされる。その酸は乳酸、ピ
ルビン酸またはクエン酸との報告もあるが、近年では胃
酸と同様、塩酸であろうとされている」）、この低ｐＨ
効果によってプロ型のＣ部位が切断される。それによっ
て、正常組織ではプロ型の状態で副作用を示さずＴＧＦ
−β１が最も作用して欲しい体内局所で効果的かつ特異
的に利用されることが可能となる。このような効果はヒ
トのプロＴＧＦ−β１のみに期待されるものであり、プ
ロ部分に異種タンパクを付加したＴＧＦ−β１あるいは
ヒト以外のサルのプロＴＧＦ−β１のような従来技術に
よって作られたものは、体内投与時に抗原性が現れる危
険性があるため医薬用途としての可能性は少ない。

以上のことから、ヒトのプロ型のＴＧＦ−β１の効率的
な製造が望まれるところである。

本発明は、上述の問題点を解決し、マチュア−ＴＧＦ−
β１よりも安全であると予想されかつ生体内において骨
形成作用および抗腫瘍作用を発揮するヒトのプロＴＧＦ
−β１の遺伝子組換えによる高生産法の手段を提供する
ことを目的とするものである。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは、上述のようにより副作用が少ないと期待
されるヒトプロＴＧＦ−β１の製造方法を開発し、これ
を用いてヒトプロＴＧＦ−β１を細胞において高率よく
発現させることを確認した。

すなわち本発明者らはヒトのプロＴＧＦ−β１を、融合
型ではなく天然と同じ配列で遺伝子発現させると融合型
と比較して約１０００倍の生産量増大がおこることを見
出し、この知見をもとに本発明を完成するに至った。

本発明はプロＴＧＦ−β１を細胞で効率よく製造するた
めの手段を提供するものである。すなわち、本発明によ
るヒトプロＴＧＦ−β１の製造法は、ヒトプレプロＴＧ
Ｆ−β１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ鎖を用意し
、このＤＮＡ鎖を、その遺伝情報が発現可能な状態で含
む発現ベクターの作成、この発現ベクターによる宿主細
胞の形質転換および得られる形質転換体の培養から成る
工程に付して培養物中にヒトプロＴＧＦ−β１を産生さ
せること、を特徴とするものである。

また、本発明はヒトプロＴＧＦ−β１にも関する。すな
わち本発明によるヒトプロＴＧＦ−β１は、この遺伝子
を含むＤＮＡによって形質転換された形質転換体を用い
て生産されるものであり、遺伝子組換え技術を用いて生
産されるものとして新規である。

さらに、本発明は、組換えＤＮＡおよび形質転換体に関
する。すなわち本発明による組換えＤＮＡは、ヒトプレ
プロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ鎖
が発現ベクターに組込まれたもの、である。本発明によ
る形質転換体は、上記の組換えＤＮＡにより宿主細胞が
形質転換されたもの、である。

〈発明の効果〉 本発明によれば、ＴＧＦ−β１の前駆体を完全な形で含
むヒトのプロＴＧＦ−β１を宿主細胞中で高率で生産す
ることができる。その生産量は後記実験例に示されるよ
うに、従来技術と比較すると約千倍の量に相当するもの
である。

またプロＴＧＦ−β１は単にＴＧＦ−β１の製造中間体
としての用途に限定されず、腫瘍抑制剤等医薬品の剤形
用途として用いることが可能である。本来ＴＧＦ−β１
の作用本体はマチュアーＴＧＦ−β１という１１２個の
アミノ酸から構成されるポリペプチドであるが、マチュ
アーＴＧＦ−β１はそのまま生体内に投与するとマクロ
ファージの機能抑制などによる毒性を示し医薬側形とし
ては不適当であるために「プロドラッグ」という考え方
が提案されたが、この方法ではマチュアーＴＧＦ−β１
の薬効を失わせるための修飾基の選択が困難で、抗原性
の問題があるという欠点があり、ＴＧＦ−β１に関して
直ちにこれを適用することは困難である。これに対して
、本発明によって生産することのできるヒトプロＴＧＦ
−β１は、その完全なプロ部分を有していることから、
体内投与時点では生理活性を示さず、従って生体毒性も
認められず、一方、体内循環中に局所部位に到達すると
、前駆体部分は除去され（プロセッシング）、マチュア
ーＴＧＦ−β１の形態をとり生理作用を示すという、い
わゆる「天然のプロドラッグ」としての効果が期待でき
る。

ＴＧＦ−β１はマチュアー型でその生理活性を発揮する
物質であるため、従来技術ではマチュア−ＴＧＦ−β１
の発現のみに力点がおかれ、前駆体部分の重要性は認識
されていなかったが、このような考え方の背景には、前
駆体は細胞内での発現調節には関与しないであろうとい
う認識が定説化していたことが挙げられる。以上のこと
からすれば、本発明によるヒトプロＴＧＦ−β１の完全
な前駆体部分の発現増強作用という特性は思いがけなか
ったことといえよう。

〔発明の詳細な説明〕

（Ｉ）ヒトプロＴＧＦ−β１の製造法 本発明によるヒトプロＴＧＦ−β１の製造法は、ヒトプ
レプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、その遺伝情報が発現可能
な状態で含む発現ベクター（すなわち組換えＤＮＡ）の
作成、この組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換およ
び得られる形質転換体の培養から成る工程に付して培養
物中にヒトプロＴＧＦ−β１を産生させること、を特徴
とするものである。

くヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を含
むＤＮＡ鎖〉 ヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列は、ヒ
トプロＴＧＦ−β１のＮ末端側に形質転換体からの分泌
後に除かれるシグナルペプチドを有するポリペプチド（
すなわち、ヒトプレプロＴＧＦ−β１）をコードするも
のであり、アミノ酸配列が実質的に第１図に示されてい
るアミノ酸配列のうちＡ−Ｄまでのものであるポリペプ
チド（すなわち、ヒトプレプロＴＧＦ−β１）をコード
するものである。ここで「アミノ酸配列が実質的に第１
図に示されているアミノ酸配列のうちＡ〜Ｄまでのもの
」ということは、このペプチドがヒトプレプロＴＧＦ−
β１の機能を有する限りアミノ酸のいくつかについて欠
失、置換、付加などがあってもよいことを示すものであ
る。

本発明における典型的なヒトプレプロＴＧＦ−β１ポリ
ペプチドは、第１図のアミノ酸配列のうちＡ−Ｄまでの
ものであって、３９０個のアミノ酸配列からなる公知の
ものである。第１図において、アミノ酸配列Ａ−Ｂはシ
グナルペプチド部分（アミノ酸２９個）、Ｂ−Ｄはヒト
プロＴＧＦ　−β１部分（アミノ酸３６１個）　、Ｃ−
ＤはＴＧＦ−β１部分（マチュア部分）（アミノ酸１１
２個）である。

従って、本発明におけるヒトプレプロＴＧＦ−β１をコ
ードする塩基配列は、第１図のＡ−Ｄの塩基配列を持つ
ものまたはその縮重異性体ならびに上記のようなポリペ
プチドのアミノ酸配列の変化に対応する塩基配列を持つ
ものまたはその縮重異性体、である。ここで「縮重異性
体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっている同一の
ポリペプチドをコードすることのできる塩基配列を持つ
ものを意味する。

本発明における上記の塩基配列を含むＤＮＡ鎖は、適当
な発現ベクターに縮合させてこれを宿主細胞に導入して
効率よく発現させるためのものであるが、この５′末端
および（または）３′末端に適当な長さのＤＮＡ鎖、た
とえば３′末端に停止コドンを１つまたは２つ以上有す
る非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖、が結合していてもよい
。このようなりＮＡ鎖の塩基配列としては、たとえば第
１図に示されたものが典型的な例としてあげられ、この
塩基配列は公知のものである。

ヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を含む
ＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核酸合成の方法に従
ってその鎖長の少なくとも一部を化学合成することであ
る。

結合アミノ酸の数を考えれば、この化学合成法よりも染
色体遺伝子のライブラリーから、あるいは組織、たとえ
ばヒト胎盤から単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し
、この遺伝子のライブラリーから、遺伝子工学の分野で
慣用されている方法、例えば適当なプローブによるハイ
ブリダイゼーション法、によりこれを取得する方が好ま
しいといえる（後記実験例参照）。

く組換えＤＮＡ＞ 本発明による組換えＤＮＡは、上記のＤＮＡ鎖を発現ベ
クターに組込んで結合させたものである。

この発現ベクターとは、上記のＤＮＡ鎖を、形質転換さ
せるための宿主細胞内へ移入させる役割を担う運搬体Ｄ
ＮＡであり、宿主細胞内において自律的に増殖する、あ
るいは宿主染色体に組込まれる環状あるいは直線状のも
のである。

このような発現ベクターには、プラスミド、ファージ、
コスミドなどが含まれるが、プラスミドがより好ましい
。

発現ベクターとしてはｐＢＫＴＫ−１（ＢＫウィルスベ
クター）　、ＥＢＶ　（ＥＢウィルスベクター）　、Ｈ
ＳＶ　（単純ヘルペスウィルスベクター）など種々の知
られているものが用いられる。

一方、ヒトプレプロＴＧＦ−β１の遺伝子を宿主細胞で
発現させるめにはそのＤＮＡをｍＲＮＡへ転写させる必
要がある。そのためには、転写のためのシグナルである
プロモーターの遺伝子を上記ＤＮＡ鎖の５′側上流に組
込めばよい。このプロモーターとしては、５ｖ４０初期
または後期プロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモー
ターヒトＴ細胞白血病つィルスエ型プロモーター、アデ
ノウィルスメジャーレートプロモーター、メタロチオネ
インｍＡプロモーターなど種々知られており、いずれを
も使用することができる。

また、転写を終結させるためのターミネータ−を上記Ｄ
ＮＡ鎖の３′側下流に組込むことが好ましい。ターミネ
ータ−を挿入することにより、プラスミドの安定性を高
めることができる。ターミネータ−としてはｔｒｐ　　
Ｔターミネータ−（トリプトファンオペロン）、λｔＲ
２ターミネータ、λｔＲ１ターミネーター等を用いるこ
とができる。

また、ｍＲＮＡをタンパクに翻訳させる段階でタンパク
合成の場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合
するために必要な配列をタンパク合成の開始信号である
ＡＴＧの前につける必要がある。

く形質転換体〉 本発明による形質転換体は、上記の組換えＤＮＡにより
宿主細胞を形質転換させたものである。

宿主細胞としては、適当なベクターが存在する限り、各
種の細胞が使用できるが、動物細胞、たとえばＮ５１細
胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞などが好ましい例とし
てあげられ、特にＣＨＯ細胞が好ましい。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子工学
ないし生物工学の分野で慣用されている合目的的な任意
の方法によって行うことができる。

その−船釣な事項については適当な底置または総説、た
とえばＴ、　Ｍａｎｌａｔｌｓ、　Ｅ、Ｐ、　Ｐｒ１ｔ
ｓｃｈ、　Ｊ。

５ａＩｌｂｒｏｏｋ：　　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩ
ｏｎＩｎｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＪ
　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ。

（１９ｇ２）、を参照することができる。

形質転換体は、上記ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝情
報による新しい形質（すなわちヒトプレプロＴＧＦ−β
１ひいてはヒトプロＴＧＦ−β１）および使用ベクター
由来の形質ならびに場合によって生じているかもしれな
い遺伝子組換時の使用ベクターからの一部の遺伝情報の
欠落による対応遺伝子の欠落を除けば、そのジェノタイ
プないしフェノタイプあるいは細胞学的性質において使
用宿主細胞と同じである。

くヒトプロＴＧＦ−β１の生産〉 上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物の細胞中にヒトプレプロＴＧＦ−
β１が生産され、ペリプラズムにおいてシグナルペプチ
ド部分が切断され、このペリプラズムおよび細胞外、す
なわち培養液中、にヒトプロＴＧＦ−β１が蓄積する。

形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用宿主細胞に対
するそれと本質的には変らない。また、培養物、すなわ
ち細胞および（または）培養液からの生産タンパクの回
収も合目的的な任意の方法（たとえば後記実験例６に記
載の方法）に従って行なうことができる。

宿主細胞にＣＨＯ細胞を用いた場合は、その生産量は後
記実験例に示されるように、従来技術と比較すると約千
倍の量に相当する。

また、必要に応じて、ヒトプロＴＧＦ−β１から公知の
方法（たとえば　Ｍｊｙａｚｏｎｏ、　ｅＬ　ａｔ：Ｌ
ａｔｅｎｔ　ｈｌｇｈ　５ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇ
ｈｔ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ’ｔｒａｎｓｌ’ｏｒｍｉ
ｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆ’ａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　１．
、Ｊ、　　Ｂｌｏｔ。

ｃｈｅｗ、　、２６３　：　７Ｇ４８−７８５４．１９
Ｈの方法）によりマチュアーＴＧＦ−β１を得ることも
できる。

（ｎ）　ヒトプロＴＧＦ−β１ 本発明によるヒトプロＴＧＦ−β１は、前記したヒトプ
ロＴＧＦ−β１遺伝子を含むＤＮＡ鎖によって形質転換
された形質転換体によって生産されるポリペプチドであ
る。

このヒトプロＴＧＦ−β１ポリペプチドのアミノ酸配列
は、典型的な第１図に示したアミノ酸配列Ｂ　−Ｄの外
に、このポリペプチドの生理活性を有する限りアミノ酸
のいくつかについて欠失、置換、付加などがあってもよ
いものである。

（ｍ）ヒトプロＴＧＦ−β１の用途／骨形成促進剤ある
いは抗腫瘍剤 ＴＧＦ−β１は多くの細胞に対して強力な増殖抑制因子
として働くが、ある種の細胞に対しては、分化誘導作用
を示す。なかでも骨形成に関与する細胞に対して増殖や
代謝を上昇活性化させ、骨形成因子と共同で骨の形成を
促進することが知られている。具体的には、骨芽細胞（
Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）を活性化し、一方また破骨細胞
（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）を刺激して、骨の代謝を賦活
化するという作用である。

マチュアーＴＧＦ−β１をそのまま生体内に投与すると
、マクロファージの機能抑制などによる毒性を示し〔ツ
ナワキら、ｒＴＧＦ−βによるマクロファージの不活化
」、ネイチャー３３４：２００−２６２　％　１９８８
（Ｔｓｕｎａｖａｋｌ　ｓ、　ａｔ　ａｌ：Ｄｅａｃｔ
ｌｖａｔｌｏｎｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｂｙ　
ＴＧＦ−Ｂｅｔａ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：　２８０−
２８２．１９８８）　）　、医薬剤形として不適当であ
るが、ヒトプロＴＧＦ−β１は、このままの形態で体内
に投与することにより、局所部位に到達すると予想され
るので骨形成促進作用あるいは抗腫瘍作用を示すため、
プロ体のままの形態で骨形成促進剤あるいは抗腫瘍剤と
して、すなわち「プロドラッグ」として、用いることが
できる。

プロドラッグの技術は、体内投与時には作用を示さず局
所部位に到達して初めて薬効を示すという製剤掌上の有
用な方法として考えられたものである。この方法は１９
５８年に、アルバート（Ａｌｂｅｒｉ）により提案され
た概念で、目的の物質が特殊な化学修飾によって薬効を
失うが、体内投与で代謝をうけ修飾基が切り離されて薬
効を発現するというものである。しかしながら修飾基の
選択が困難で、抗原性の問題があるという欠点があり、
ＴＧＦ−β１に関して直ちにこれを適用することは困難
であった。また前駆体はプロセッシングによって除去さ
れる運命にあるため、細胞内では一時的に他のタンパク
質との融合体で生産させておこうというのが従来の考え
方であった。

これに対して、本発明によるプロＴＧＦ−β１の形で投
与すると、その完全なプロ部分を有していることから、
体内投与時点では生理活性を示さず、従って生体毒性も
認められず、一方、体内循環中に局所部位に到達すると
、前駆体部分はプロセッシングによって除去され、マチ
ュアＴＧＦ−β１の形態をとり生理活性を示すという、
いわゆる「天然のプロドラッグ」としての効果が期待で
きる。

骨形成促進剤あるいは抗腫瘍剤として用いる場合のヒト
プロＴＧＦ−β１は合目的的な任意の投与経路で、また
採用投与経路によって決る剤型で、投与することができ
る。薬剤としては、そのままあるいは製薬上許容される
担体ないし希釈剤で希釈された形態が普通である。

骨形成促進剤あるいは抗腫瘍剤としてこの化合物を実際
に投与する場合には、これを注射用蒸留水または生理食
塩水に溶解して注射する方法が代表的なものの一つとし
て挙げられる。具体的には、動物の場合には、腹腔的注
射、皮下注射、静脈または動脈への血管内注射および局
所投与などの注射による方法が、ヒトの場合は静脈また
は動脈への血管内注射または注射による局所投与などの
方法がある。

この化合物の投与量は、動物試験の結果および種々の状
況を勘案して、連続的または間欠的に投与したときに総
投与量が一定量を越えないように定められる。具体的な
投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、例
えば年齢、体重、性別、感受性、食餌、投与時間、併用
する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて変化する
ことはいうまでもなく、また一定の条件のもとにおける
適量と投与回数は、上記指針を基として専門医の適量決
定試験によって決定されなければならない。

具体的には、成人１日当り５μｇ〜１００■程度である
。

く実験例〉 以下は、本発明の実験例を示すものであるが、これによ
って本発明は限定されるものではない。

実験例１：　ヒトプレプロＴＧＦ−β１ｃＤＮＡの単離 ヒトプレプロＴＧＦ−β１ｃＤＮＡの単離のためのｃＤ
ＮＡライブラリーは、ヒト胎盤から単離したｍＲＮＡか
らＧｕｂｌｅｒ　＆　ＨｏｆＴｍａｎらの方法〔ガルバ
ーら、ジーン、２５巻、Ｐ２８３．１９８３年）（Ｇｕ
ｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ；　Ｇｅｎｅ、　２５；　２Ｂ３
．１９８３　）　）に従ってｃＤＮＡを合成した後、λ
ｇｔｌｏベクター〔フユーン・ティー・ヴイーら、ＤＮ
Ａクローニング技術における実際的アプローチ、ＩＲＬ
出版、オックスフォード、Ｐ４９．１９８５年（ＩＩｕ
ｙｎｈ、Ｔ、Ｖ、ｅｔａｌ、　　Ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｌｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　Ａ　Ｐｒａｃｔ
ｌｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０
ｘｆｏｒｄ、　Ｄ、ＧＩｏｖｅｒ　ｅｄ）Ｐ４９゜１９
８５）に挿入して作成された。約３０万個のクローンか
らなるライブラリーより第２図に示した合成プローブを
用いてスクリーニングを実施した結果、約５０個のポジ
ティブなりローンが得られた。

この合成プローブとハイブリダイズしたクローンから１
個のクローンを選択し、これをＴＩと名づけ、このＴ１
についてさらに解析を進めた。クローンＴ１のｃＤＮＡ
はＥｃｏＲ１消化により切り出された後、Ｍ１３ベクタ
ー〔ヤーニッシュ、ペロン◆シーら、ジーン３３巻、Ｐ
２Ｏ３−１１９，１９８５年（Ｙａｎｎｌｓｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ！、　Ｇｅｎｅ、　３３．１０３
−１１９゜１９８５）にサブクローニングされ、ジデオ
キシ（ｄｌｄｅｏｘｙ　）法により塩基配列の決定がな
された。

これを第１図に示す。このクローンＴ１は、ヒトプレプ
ロＴＧＦ−β１の全コーティング配列を含んでおり、こ
れを再びｐＵｃ１９ベクター〔ヤーニッシュ、ペロン・
シーら、ジーン３３巻、Ｐ２Ｏ３−１１９，１９８５年
（Ｙａｎｎｌｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　
Ｇｅｎｅ。

３３．１０３−１１９．１９１ｉ５）のＥｃｏＲ１サイ
トにサブクロニングしｐＵＣ１９−ＴＧＦを得た。

実験例２：　ヒトプロＴＧＦ−β１発現用ベクターの作
成 上記の実験例１でクローン化したヒトプレプロＴＧＦ−
β１ｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現させるためのプラスミ
ドを構築した。このプラスミドｐＥＣβは、ＳＶ４０初
期及び後期プロモータートリ肉腫ウィルスプロモーター
、ヒトサイトメガウィルスプロモーター、ヒトプレプロ
ＴＧＦ−β１をコードしているｃＤＮＡ、ＳＶ４０後期
ポリアデニル化配列、マウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤ
ＮＡ、及びｐＢＲ３２２の一部の配列（大腸菌アンピシ
リン耐性マーカー及び複製起源）を含有している。

ヒトプレプロＴＧＦ−β１発現用プラスミドｐＥＣβの
構築工程図を第３図に示す。以下に構築方法について詳
細に説明する。

１）　ヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードしているｃＤ
ＮＡ１８００ｂｐをクローニングベクターｐＵｃ１９Ｔ
ＧＦからＥｃｏＲ１消化により得た。この断片をＤＮＡ
ポリメラーゼ１（フレノウフラグメント）で平滑末端化
した。

２）　プラスミド発現ベクターＣＤＭ８　（シード・ビ
ー・ネイチャー、３２９巻、Ｐ８４０−８４２．１９８
７（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、、　ＮａＬｕｒｅ、　３２９．８
４０−８４２．１９８７）から５ａＣ２、ＢａｍＨ１消
化によりサプレッサーｔＲＮＡ　（ＳｕｐＦ）遺伝子、
トリ肉腫ウィルスＬＴＲ，サイトメガロウィルスプロモ
ーター、Ｔ７プロモーター及びＳＶ４０初期ポリアデニ
ル化配列を含む２３２４ｂｐの断片を得た。この断片を
ＤＮＡポリメラーゼ１（フレノウフラグメント）で平滑
末端化した。

３）　プラスミド発現ベクターｐＳＶ２ｄｈｆｒ［サブ
ラマニ・ニスら、モレキュラー・セルラー・バイオロジ
ー、１巻、Ｐ２Ｓ５−８６４．１９８１年（Ｓｕｂｒａ
ｌａｎｉ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１
１．　ＢＩＯｌ、ｌ１８５４−８６４．１９８１）　］
をＰｖｕ２消化した後、アルカリホスファターゼで脱リ
ン酸化した。これと、２）の２３２４ｂｐ断片をＴ４リ
ガーゼによりライゲートした。

４）　プラスミド発現ベクターｐＳＶＬ　（ファルマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＳｍａ　１消化した後、ア
ルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これと、１）
の１８００ｂｐ断片をＴ４リガーゼによりライゲートし
た。

５）　　３）のプラスミドからＸｂａｌ。

ＥｃｏＲ１消化により、Ｔ７プロモーター、サイトメガ
ロウィルスプロモーター　トリ肉腫ウィルスＬＴＲＳＳ
ｕｐＦＳＳＶ４０初期および後期プロモーター、複製起
源、マウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ、ＳＶ４０初
期ポ初期ポリアル化ニル化配列３７００ｂｐ断片を得た
。

６）　４）のプラスミドからＸｂａｌ。

ＥｃｏＲ１消化によりヒトプレプロＴＧＦ−β１ｃＤＮ
Ａ、、ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列、大腸菌アンピ
シリン耐性マーカー及び複製起源を含む４５００ｂｐ断
片を得た。

７）　５）の断片と６）の断片とをＴ４リガーゼでライ
ゲートすることによりｐＥＣβを得た。

実験例３：　ヒトプロＴＧＦ−β１のＣＨＯ細胞におけ
る発現 ５×１０５個のＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂｌｌ（チャー
シン・エル・ニーとウアラウブ・ジ−プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、
７７巻、Ｐ４２１Ｂ−４２２０，１９８０年、　　（Ｃ
ｈａｓｉｎ、　Ｌ、Ａ、　＆　Ｕｒｌａｕｂ、　Ｇ、、
　Ｐ＃ＡＳ；７７、４２１８−４２２０　（１９８０）
参照）〉を６０ｍｍデイツシュにはん種し、２４時間後
、上記プラスミドｐＥＣβ（１０ｍｇ）をリン酸カルシ
ウム法によりトランスフェクトした。２日間、非選択培
地中（ＤＭＥＭ＋１０％Ｆ　ＣＳ　＋ＨＴ）で細胞を増
殖させた後１００＋ａｍデイツシュ５枚に再はん種した
。

この時、培養液を非選択培地から選択培地に（ＤＭＥＭ
＋１０％透析ＦＣ８）切り替えた。選択培地中で約２−
３週間培養した後、得られたコロニーをトリプシン処理
することによりデイツシュより剥離し、再び４８ウエル
プレートに１コロニー／ウエルになるように再はん種し
、フンフルエンドになるまで培養した。

各ウェルからの培養上清（約３５クローン）中のヒトマ
チュアーＴＧＦ−β１活性については上清を酸性条件下
で、すなわち０．２Ｍ　酢酸で処理しプロＴＧＦ−β１
から前駆体部分を切断し、マチュアーＴＧＦ−β１を得
た後、ＭｖｌＬｕ細胞を用いたバイオアッセイ法〔ヴア
ン・ゾーレン・イー・ジェイ・ジエイら、バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
、１４１巻、Ｐ１２２９−１２３５．１９８６年（Ｖａ
ｎ　Ｚｏｅｌｅｎ、Ｅ、Ｊ。

Ｊ、、　ｅｔ　ａｔ：　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　Ｂｌｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋ａ＋、　１４１゜１２２９
−１２３５．１９８８）により調べた。その結果、３４
クローン中１９クローンに活性を認めた。その内、安定
にしかも高いＴＧＦ−β１活性を示したクローン７２３
を得た。このクローン７２３を２段階のメトトレキセー
）　（ＭＴＸ）選択することにより恒常的に大量のＴＧ
、Ｆ−β１を産生ずる細胞株を作成することを試みた。

まず、１００ｎ１００ｎ存在下で細胞を培養して生存細
胞を選択した。さらに、５００ｎＭ　　ＭＴＸ存在下で
選択し、安定に多量のＴＧＦ−β１を産生する細胞株Ｔ
２３−７−１１を樹立した。

Ｔ２３−７−１１細胞の培養上清中のＴＧＦ　−β１を
抗ヒトマチュアーＴＧＦ−β１ポリクローナル抗体を用
いたウェスタンブロッティング法およびＳＤＳ　−ＰＡ
ＧＥ法にて検出したところ、非還元条件下でメインバン
ドおよびマイナーバンドが各々１０５，２５Ｋｄの位置
にＴＧＦ−β１が認められた。すなわち、１０５Ｋｄは
４０ＫｄのプロＴＧＦ−β１が２量体になったものに糖
鎖が付加された分子量であり、２５Ｋｄは１２．５Ｋｄ
のマチュアーＴＧＦ−β１が２量１体となった分子量と
考えられる。このことから、Ｔ２３−７−１１から産生
されるヒトＴＧＦ−β１はＳ−８Ｍ合を介した２量体と
して細胞から分泌され１、その大部分はプロ型であり、
若干量のマチュア型も生産されていることが観察された
。

実験例４：　組換えヒトプロ及びマチュアーＴＧＦ−β
１の生産 実験例３において樹立された７２３−７−１１細胞、１
．５×１０７個を８５０ｃ＃のローラーボトル（ファル
コン社製）にはん種し、血清を含む培地＜ＤＭＥＭ／Ｆ
　−１２（１；　１）　＋５％ＦＣ８〉中で３日間培養
した。３日後、血清培地を抜き取り、ＰＢＳｌｏｏｍｌ
で洗浄した後、血清を含まない無血清培地＜Ｅ−ＲＤＦ
　（極東製薬工業）。

５μｇ／ｍｌ　　ウシインシュリン、２０μＭ　モノエ
タノールアミン、５０ｎＭ　Ｎａ２ＳｅＯ３，０，２μ
ｇ／ｍｌ　　ウシアプロチニン、０．１％ＰＥＧ　　２
００００　（すべてシグマ社）＞２００ｍ１に交換し、
３７℃で７日間培養した。７日後に培養上清ＩＬを回収
した。

実験例５：　組換えヒトプロＴＧＦ−β１の精製実験例
４において得られた７２３−７−１１細胞培養上清４０
０ｍ１を出発材料とした。培養上清は０．４５ｄの膜を
もつフィルトロンカセット膜（富士フィルター工業）の
ような分子量１００００カツトの限外枦櫓膜を用いて１
０ｍ１にまで濃縮した。１１００００ｒｐで３０分間、
遠心した後、上清を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐ　Ｈ
７，４）　　（Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４Ｎ　ａ　２　ＨＰ
　Ｏ４）　Ｉ　Ｌに対して３回透析した。

イオン交換クロマトグラフィー 透析した濃縮物は、１０１Ｍリン酸バッファー（ｐｌＩ
７．４）で平衡化したＳ−セファロースカラム（５Ｘ５
０ｍｍ、ファルマシア社）にアプライした（Ａ：２０麿
Ｈリン酸バツフアー（ｐＨ７，４）、Ｂ：Ａ＋０．５Ｍ
　　ＮａＣ１）、このカラムを１００％溶媒Ａで１０分
間洗浄した後、直線濃度勾配法により溶出しく０％−１
００％溶媒Ｂ／３０ａｉｎ）、プｏＴＧＦ−β１含有画
分１１ｍ１を得た。

疎水性クロマトグラフィー 上記で得られた溶出物に４Ｍ硫酸アンモニウム−１００
ｍＭリン酸バッファー１１ｍ１を加えた後、２Ｍ硫酸ア
ンモニウム−１００５Ｍリン酸バッファー　（ｐＨ１７
，４）で平衡化したアルキル−スーパーロースＨＲ５１
５（ファルマシア社）にアプライした（Ａ：２Ｍ硫酸ア
ンモニウム−１００＋ｇＭリン酸バッファー（ｐＨ７，
４）　、Ｂ　：　１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７
、４）　）。このカラムを溶媒Ａで１０分間洗浄した後
、直線濃度勾配法により溶出し、（０％−６０％溶媒Ｂ
／４０ｍ１ｎ）第４図に示したフラクション３２−３６
のプロＴＧＦ−β１含有画分２．５ｍｌを得た。

ゲル濾過クロマトグラフィー 得られたプロＴＧＦ−β１両分はセントリコン１０濃縮
装置を用いて濃縮した後、ＰＢＳで平衡化したスーパー
ロース６カラム（ファルマシア社）にアプライした。溶
出はＰＢＳを用いて実施し、プロＴＧＦ−β１画分を含
有する画分３ｍｌを集めた。溶出図および活性測定結果
を第５図に示した。

以上の操作により精製標品２０００μｇを得た。

実験例６：組換えヒトプロＴＧＦ−’β１の均一性確認 上記の実験例５で精製されたヒトプロＴＧＦ−β１の均
一性を確認する目的で５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０−１５％
グラジェントゲル）によるゲル電気泳動法を用いて、そ
の純度の確認をおこなった。

その結果、本タンパクは、はぼ単一であると検定された
。すなわち第６図に示したように、７２３−７−１１ク
ローンの培養上清そのものでは、多くの不純物タンパク
を含むが（レーン２）、Ｓセファロースイオン交換クロ
マトグラフィー後では、１０５ｋｄおよび２５ｋｄの位
置にそれぞれプロ型およびマチュアー型の２量体と考え
られるバンドが検出された（レーン３）。前者は４０ｋ
ｄのプロＴＧＦ−β１が２量体を形成したものに、糖鎖
が付加されたため８０ｋｄよりも大きな分子量となって
いる。また後者は１２．５ｋｄのマチュアーＴＧＦ−β
１が２１１体を形成して２５ｋｄの分子量を示したもの
である。これらマチュアー型は、次のカラム操作（アル
キル−スーパーロースによる疎水性クロマトグラフィー
およびスーパーロース６によるゲル濾過クロマトグラフ
ィー）により除去されて、２量体のプロＴＧＦ−β１の
みが均一なタンパクとして得られた（レーン４およびレ
ーン５）。

参考側二組換えヒトマチュアーＴＧＦ−β１の精製 実験例４において得られたＴ２３−７−１１細胞培養土
清０．５Ｌを出発材料とした。

培養上清は０．４５ｄの膜をもつフィルトロンカセット
Ｂ　ＣＭ士ラフイルター工業のような分子量１ｏｏｏｏ
カツトの限外濾過膜を用いて２５ｍ１にまで濃縮した。

この濃縮物を排除分子量３０００−５０００の穴をもつ
スペクトルム（スペクトルメディカル産業社、Ｓｐｅｃ
ｔｒｕｍ　ＭｅｄｌｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎ
ｃ、）のような透析膜に入れ、０，２Ｎ酢酸溶液ＩＬに
対して３回透析を実施することにより、プロＴＧＦ−β
１から前駆体部分を切断し、マチュアーＴＧＦ−β１を
得た。このヒトマチュアーＴＧＦ−β１の濃縮物は、沈
殿したタンパク質を除去する目的で１０００００ｇで３
０分間、遠心した。不溶タンパク質を除去した上清は、
凍結乾燥した。

ゲル濾過クロマトグラフィー 上記の凍結乾燥標品は０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ／２０％アセ
トニトリル１ｍｌで再調製し、０．１％ＴＦＡ／２０％
アセトニトリルで平衡化したＧ３０００ＳＷ　（２１，
５Ｘ６００ｍ＋＊）カラム（東ソー■）にアプライした
。溶出は０．１％ＴＦＡ／２０％アセトニトリルを用い
て実施し、マチュアーＴＧＦ−β１含有画分１５ｍ１を
集めた。

逆相ＨＰＬＣ Ｇ３０００ＳＷから溶出されたマチュアーＴＧＦ−β１
を含む画分は、ＲＰ３０４Ｃ４（４，６Ｘ２５０＋ｍ）
カラム（Ｂｌｏ−Ｒａｄ社）を用いた逆相ＨＰＬＣによ
りさらに精製した。２０％溶媒Ｂで平衡化したカラムに
１ｍｌ／ｓｉｎの流量で上記の両分をアプライした（Ａ
：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０，Ｂ　：　０．０６％ＴＦＡ
／アセトニトリル）。

このカラムを２０％溶媒Ｂで１０分間、洗浄した後、直
線濃度勾配法により溶出した（２０％−５０％溶媒Ｂ／
６０分）。得られたＴＧＦ−β１画分を集めて凍結乾燥
した。以上の操作により精製標品的５００μｇを得た。

このヒトマチュア−ＴＧＦ−β１の均一性については、
５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認し、２量体として２５ｋ
ｄの分子量バンドが検出された。また還元条件下におけ
る５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、１２．５ｋｄの単量体も確
認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローン化したヒトプレプロＴＧＦ−β１遺
伝子の塩基配列および対応するアミノ酸配列を示す説明
図である。 第２図は、クローニングに用いた合成プローブの塩基配
列および対応するアミノ酸配列を示す説明図である。 第３図は、ヒトプレプロＴＧＦ−β１遺伝子発現用プラ
スミドｐＥＣβの構築を示す工程図である。 第４図は、疎水性クロマトグラム（アルキル−スーパー
ロース）および活性測定結果を示すグラフである。 第５図は、ゲル濾過クロマトグラム（スーパーロース６
）および活性測定結果を示すグラフである。 第６図は、各精製工程におけるプロＴＧＦ−β１の均一
性を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥによるゲル電気泳動図の模式
図である。 第７図は、プレプロＴＧＦ−β１を模式的に示した説明
図である。 第８図は、融合型のＴＧＦベータを模式的に示した説明
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を
   含むＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を有する発現ベク
   ターの作成、この発現ベクターによる宿主細胞の形質転
   換、および得られる形質転換体の培養、から成る工程に
   、該ＤＮＡ鎖を付して培養物中にヒトプロＴＧＦ−β１
   を産生させることを特徴とする、ヒトプロＴＧＦ−β１
   の製造法。 ２、形質転換される宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求
   項１記載の製造法。 ３、ヒトプレプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を
   含むＤＮＡ鎖を有する発現ベクター。 ４、ヒトプロＴＧＦ−β１をコードする塩基配列を含む
   ＤＮＡ鎖によって形質転換された形質転換体を用いて生
   産されるヒトプロＴＧＦ−β１。 ５、請求項３に記載の発現ベクターにより宿主細胞が形
   質転換された形質転換体。 ６、宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５記載の形質
   転換体。