KR20150079789A - 인터루킨-6의 길항제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

IL-6의 사이트(site) 2에 특이적으로 결합하는 IL-6 길항제(antagonist)를 제공한다. 이와 같은 억제제를 IL-6 관련된 질환, 예를 들면, 당뇨성 황반부종(diabetic macular edima, DME)과 같은 눈의 질환에 치료하기 위한 방법을 제공한다.

Description

인터루킨-6의 길항제 및 이의 용도{IL-6 ANTAGONISTS AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 상호참조

본 발명은 2012년 11월 08일 출원된 미국특허 출원번호 61/823,972, 2013년 06월 06일 출원된 미국특허 출원번호 61/831,699의 우선권을 주장한다. 상기 명세서의 각각의 전체 내용은 본 명세서에 전체적으로 참조로 통합된다.

본 발명은 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6)에 관한 것으로, 더욱 바람직하게는 IL-6의 조절제(modulator) 및 이의 안과 질환 같은 질환의 치료 용도에 관한 것이다.

IL-6는 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인(cytokine)으로 염증, 혈액 생성, 혈관신생, 세포 분화 및 신경 세포 생존에 관여하는 것으로 알려져 있다.

요약

본 발명은 IL-6의 사이트 2(site II)에 대한 결합 특이성을 포함하는 특징을 갖는 IL-6 항체 및 단편, 및 이들의 항체 및 단편의 유도체, 및 상기 항체, 단편 및 유도체의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단편, 또는 이의 유도체에 관한 것이다. 어떤 실시예에서, 항체, 단편 또는 유도체는 240 pM 또는 그 이하의 KD에서 IL-6의 사이트 2에 결합할 수 있다. 어떤 실시예에서, 항체, 단편 또는 유도체는 70℃ 또는 그 이상의 Tm을 가진다. 어떤 실시예에서, 항체, 단편 또는 유도체는 240 pM 또는 그 이하의 K_D에서 IL-6에 결합할 수 있고, 70℃ 또는 그 이상의 Tm을 갖는다. 어떤 경우에, 항체 또는 단편 또는 이들의 유도체는 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 또는 V121의 적어도 하나에 결합할 수 있다; 어떤 경우에, 항체 또는 단편 또는 이들의 유도체는 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121에 결합할 수 있다. 실시예에서, 항체 또는 단편 또는 이들의 유도체는 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯에 결합할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 인간 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 제공한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 200 pM 또는 그 이하의 KD에서 IL-6와 결합할 수 있다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 200 pM 또는 그 이하의 KD에서 IL-6와 결합 및/또는 70℃ 또는 그 이상의 Tm을 갖는다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 200 pM 또는 그 이하의 KD에서 IL-6와 결합 및/또는 80℃ 또는 그 이상의 Tm을 갖는다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 하나에 결합한다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 두 개에 결합한다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 세 개에 결합한다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 네 개에 결합한다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121의 적어도 다섯 개에 결합한다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121에 결합한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열번호 4로 시작하는 VH CDR1, 서열번호 5로 시작하는 VH CDR2 및 서열번호 6으로 시작하는 VH CDR3; 및 선택적으로 (b) 서열번호 7로 시작하는 VL CDR1, 서열번호 8로 시작하는 VL CDR2 및 서열번호 9로 시작하는 VL CDR3로 구성되는 항체(예를 들어, 분리된 항체, 예를 들어, 분리된 단일클론 항체) 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 이의 항원 결합 단편)은 인간 IL-6에 특이적으로 결합할 수 있다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 각각 시작하는 CDR 서열과 동일한 중쇄 CDRs VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하고, 또는 총괄하여 상기 CDR 서열과 단지 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 서열이 다르다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 각각 시작하는 CDR 서열과 동일한 경쇄 CDRs VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하고, 또는 총괄하여 상기 CDR 서열과 단지 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 서열이 다르다.

한 측면에서, 본 발명은 240 pM 또는 그 이하(예를 들면, 표면 플라스몬 공명(surface plamon resonance)에 의해 결정된 값)의 K_D에서 인간 IL-6와 분리될 수 있는 IL-6 항체(예를 들면, 분리된 IL-6 항체) 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 제공한다. 실시예에서, 항체는 예를 들면, 시험관 내에서(in vitro) HEK-Blue™ IL-6 어세이로 결정된 255 pM 또는 그 이하의 IC50 값에서 IL-6의 활성을 중화할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편), 또는 서열번호 3 및 서열번호 2로 구성되는 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편)에 의해 인간 IL-6에의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있는 IL-6 항체(예를 들면, 분리된 IL-6 항체) 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편)을 제공한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 pH 5.5에서 2 nM 또는 그 이상의 1가의 Kd를 가진다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 IgG2 항체이다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 참조의 항체와 비교하여 변형된 FcRn 결합을 가진다. 실시예에서, FcRn 결합은 참조의 항체와 비교하여 감소한다. 실시예에서, 항체 또는 단편의 Fc 도메인은 참조의 항체와 비교하여 변형된다.

한 측면에서, 본 발명은 변형된 Fc 도메인을 갖고, 야생형(wild type) Fc 도메인을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합이 존재하는 IL-6 항체(IL-6, 예를 들면 인간 IL-6의 사이트 2에 결합할 수 있는 항체) 또는 이의 단편을 제공한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 서열번호 23의 H311, I254 및 H436의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 서열번호 23의 H311, D313, I254 및 H436의 둘 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 서열번호 23의 H311, D313, I254 및 H436의 셋 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 서열번호 23의 H311, D313, I254 및 H436의 넷 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 서열번호 23의 H311, D313, I254 및 H436의 각각에 돌연변이를 포함한다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 H311A, H311E, H311N, D313T, I254A, I254R 및 H436A로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 돌연변이(예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 돌연변이)로 구성된다.

실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 분리된다.

실시예에서, 항체는 단일클론항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)이며, 실시예에서, 항체는 인간 단일클론항체이다.

실시예에서, 항체는 분리된 단일클론항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)이다.

실시예에서, 항체(예를 들면, 분리된 단일클론항체)는 서열번호 23으로 구성된다.

또한, 본 발명은 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편)(예를 들면, 본 명세서에 서술된 바와 같은 IL-6 항체 또는 이의 단편), 또는 IL-6 관련 질환의 치료(예를 들면, IL-6와 관련된 질환을 갖는 개체, 예를 들면, 인간 개체의 치료를 위한 용도)에 사용하기 위해 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예에서, 상기 질환은 유리체(vitreous)에서 IL-6의 수준이 상승한 것을 특징으로 하는 안과 질환이다. 실시예에서, 상기 질환은 당뇨성 황반부종(diabetic macular edima, DME), 당뇨 망막증(diabetic retinopathy,), 포도막염(uveitis), 안구 건조증(dry eye syndrome), 포도막염(uveitis), 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 증식성 당뇨 망막증(proliferative diabetic retinopathy, PDR), 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion, RVO), 시신경 척수염(neuromyelitis optica, NMO), 각막 이식(corneal transplant), 각막 찰과상(corneal abrasion) 또는 눈의 물리적 손상이다. 실시예에서, 상기 질환은 DME이다. 실시예에서, 상기 질환은 안구 건조증이다. 실시예에서, 상기 질환은 포도막염이다. 실시예에서, 상기 질환은 AMD이다. 실시예에서, 상기 질환은 PDR이다. 실시예에서, 상기 질환은 PDR이다. 실시예에서, 상기 질환은 각막 이식, 각막 찰과상 또는 눈의 물리적 손상이다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편)은 눈의 유리체로 전달되기에 적합하다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 항원 결합 단편)은 눈의 유리체로 전달된다.

또한, 본 발명은 IL-6 관련 질환의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체에 IL-6 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편), 예를 들면, 본 명세서에 서술된 IL-6 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 실시예에서, IL-6 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)으로 투여된다. 실시예에서, IL-6 관련 질환은 유리체에서 IL-6 수준이 상승된 것을 특징으로 하는 안과 질환이다. 실시예에서, IL-6 관련 질환은 당뇨성 황반부종, 당뇨 망막증, 포도막염, 안구 건조증, 포도막염, 나이관련 황반변성, 증식성 당뇨 망막증, 망막 정맥 폐색, 시신경 척수염, 각막 이식, 각막 찰과상 또는 눈의 물리적 손상이다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 눈의 유리체로 전달되기에 적합하다. 실시예에서, 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)은 개체의 눈의 유리체로 전달된다. 실시예에서, IL-6 관련 질환은 당뇨성 황반부종이고 항체 또는 이의 단편은 개체의 눈의 유리체로 전달된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 서술된 IL-6 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 실시예에서, 상기 벡터는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9로 암호화된 서열로 구성된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 서술된 IL-6 항체 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)의 서열을 발현할 수 있는 세포를 제공한다. 실시예에서, 상기 세포는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9의 하나 또는 그 이상을 발현한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 IL-6 억제의 전신작용(systemic effect) 감소 방법과 관련되고, 상기 방법은 IL-6의 활성을 억제할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여 및 야생형 Fc 도메인을 갖는 상응하는 항체 또는 이의 단편과 비교하여 Fc 활성을 감소시키는 것을 포함한다. 어떤 경우에, 개체에서 IL-6 억제의 전신작용 감소 방법은 개체에 1 μM 이상, 예를 들어, pH 5.5와 같은 낮은 pH에서 FcRn 결합을 갖는 IL-6 길항제(antagonist)를 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 '항체'는 면역글로불린(immunoglobulin)과 동의어이며 기술분야에서 통상적으로 알려진 의미로 이해된다. 용어 항체는 항체 생산의 어느 특정한 방법으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 용어 항체는, 그 중에서도(inter alia) 재조합 항체, 단일클론항체 및 다클론항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한 항체는 사량체(tetramer)이며, 각각은 폴리펩타이드 사슬의 동일한 두 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 경쇄(light chain) 및 하나의 중쇄(heavy chain)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단(amino terminus)은 항원 인식에 1차적인 역할을 하는 약 100 내지 120개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역(variable region)으로 구성된다. 각 사슬의 카르복시 말단(carboxy-terminal) 부분은 항체의 작용기 기능에 1차적인 역할을 하는 불변영역(constant region)으로 구성된다. 인간 경쇄의 종류는 카파(kappa) 및 람다(lamda) 경쇄로 불린다. 중쇄의 종류는 뮤(mu), 델타(delta), 감마(gamma), 알파(alpha), 또는 엡실론(epsilin)이 있으며, 항체의 아이소타입(isotype)을 결정한다. 항체의 아이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE이다. 경쇄와 중쇄 내에서, 가변 및 불변영역은 또한, 약 3개 또는 그 이상의 아미노산의 "D" 부위를 포함하는 중쇄와 약 12개 또는 그 이상의 아미노산의 'J' 부위에 의해 연결된다.

각각의 중쇄/경쇄 쌍에서 가변영역(VH 및 VL)은 항원 결합 부위를 형성한다. 따라서, 완전한 IgG 항체는 예를 들어, 두 개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능(bifunctional) 또는 이중특이성(bispecific) 항체를 제외하고, 상기 두 개의 결합 부위는 동일하다.

항체 경쇄 및 중쇄의 가변영역은 상보성 결정부위(complementary determining regions, CDRs)라고 불리는 3개의 초가변영역(hypervariable regions)에 의해 연결된 비교적 보존된 뼈대 영역(framework regions, FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 용어 '가변(variable)'은 항체 사이의 서열이 광범위하게 다르고, 결합 및 이의 특정 항원에 대해 각각 특정 항체의 특이성(specificity)에 포함되는 가변부위의 특정 위치를 나타낸다. 다양성은 주로 CDRs에 위치하고, 이는 더욱 많이 보존된 FR에 의해 분리되어 있다. 각 도메인의 아미노산의 번호는 기술분야에서 알려진 방법에 따라 카밧 서열(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Intetest, 국립보건원, 미국, 1987 및 1991), Chotia and Lesk(J Mol Biol 196:901-917, 1987); 및 Chothia 등(Nature 342:878-883, 1989)에 따라 만들었다.

'야생형(wild type)'은 대립형질(allele) 또는 다형성(polymorphism), 또는 재조합 방법 및 항원-결합 분자의 아미노산 변화를 이용한 돌연변이화(mutagenesis)와 같은 조작(manipulation)에 의해 수득된 변이체(variant) 또는 유도체(derivative)와 비교하여 비-조작된(non-manipulated) 동물로부터 수득된 집단 또는 항체에서 발견된 가장 일반적인 대립형질 또는 종(species)을 나타낸다.

용어 '항체 단편(antibody fragment)'은 완전한 또는 전장(full-length)의 사슬 또는 항체의 부분, 일반적으로 표적 결합 또는 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함하나 이에 한정하지 않는다. '기능성 단편(functional fragment)' 또는 '항-IL-6 사이트 2 항체의 유사체(analog of an anti-IL-6 site II antibody)'는 IL-6의 수용체에 대한 결합능을 막을 수 있거나 지속적으로 감소시키며, IL-6/IL-6R 복합체(complex)의 gp130에 대한 결합능을 감소시키고, 리간드의 gp130에 대한 결합 또는 신호 시작의 능력을 감소시키는 단편이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 기능성 단편은 일반적으로 '항체 단편(antibody fragment)'와 동의어이고, 항체와 관련하여, Fv, Fab, F(ab')2와 같은 단편을 나타내며, IL-6의 수용체에 대한 결합능을 막을 수 있거나 지속적으로 감소시키며, IL-6/IL-6R 복합체(complex)의 gp130에 대한 결합, 또는 신호 시작의 능력을 감소시킨다.

항체의 '유도체(derivative)'는 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있고, IL-6 사이트 2 항체와 서열을 공유하는, 예를 들면, 인간 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 적어도 한 CDR을 공유하는 폴리펩타이드이다.

'경쟁(compete)'은 2차 항체 또는 이의 단편과 결합을 위해 경쟁할 수 있는 1차 항체, 또는 이의 단편을 의미하고, 이와 같은 1차 항체와 이의 에피토프(epitope)와의 결합은 2차 항체가 존재하지 않을 때 1차 항체의 결합과 비교하여 2차 항체가 존재할 때 탐지할 수 있게 감소한다. 어떤 경우에, 상기 용어는 1차 항체가 존재할 때 탐지할 수 있게 감소하는 2차 항체와 이의 에피토프와의 결합을 또한 나타낸다. 상기 경쟁 기전(mechanism)의 예는 입체 장애(steric hindrance), 구조적 변화 및 공통 항원결정기 결합을 통할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

핵산 서열의 맥락에서 '퍼센트 서열 동일성(percent sequence identity)'은 최대 관련성(correspondence)을 위해 정렬하였을 때 동일한 두 서열에서 잔기를 의미한다. 서열 유사 비교의 길이는 적어도 약 9 뉴클레오티드 이상, 예를 들면, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 약 24 뉴클레오티드, 적어도 약 28 뉴클레오티드, 적어도 약 32 뉴클레오티드, 적어도 약 36 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 48 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 것이다. 기술분야에 잘 알려진 알고리즘(algorithm)이 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열은 FASTA, Gap 또는 Bestfit(Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI)를 이용하여 비교할 수 있다. 예를 들면, FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하는 FASTA는 정렬(alignment) 및 문의 및 검색서열 사이에 가장 겹치는 부위의 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol 183:63-98, 1990; Pearson, Methods Mol Biol 132:185-219, 2000; Pearosn, Methods Enzymol 266:227-258, 1996; Pearson, J Mol Biol 276:71-84, 1998; 본 명세서에 참조로 통합). 특정 프로그램 또는 알고리즘을 위한 디폴트 파라미터(default parameter)가 일반적으로 사용된다. 예를 들면, 핵산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 본 명세서에 참조로 통합된 FASTA와 이의 디폴트 파라미터의 사용(글자 크기 6 및 스코링 매트릭스(scoring matrix)를 위한 NOP AM 요소), 또는 GCG 버전6.1에서 제공된 바와 같은 Gap과 이의 디폴트 파라미터의 사용으로 결정될 수 있다.

아미노산 서열의 맥락에서 용어 '퍼센트 서열 동일성(percent sequence identity)'은 최대 관련성을 위해 정렬하였을 때 동일한 두 서열에서 잔기를 의미한다. 서열 유사 비교의 길이는 적어도 약 5개 아미노산 잔기 이상, 예를 들면, 적어도 약 20개 아미노산 잔기, 적어도 약 30개 아미노산 잔기, 적어도 약 50개 아미노산 잔기, 적어도 약 100개 아미노산 잔기, 적어도 약 150개 아미노산 잔기, 또는 적어도 약 200개 또는 그 이상의 아미노산 잔기일 것이다. 폴리펩타이드를 위한 서열 동일성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 퍼센트 서열 동일성의 결정을 위한 알고리즘은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아미노산 서열은 FASTA, Gap 또는 Besfit(Wisconsin Package Version 10.0, Genetic Computer Group(GCG), Madison, WI)을 이용하여 비교할 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환(substitution), 결실(deletion) 및 보전적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)을 포함하는 다른 변형들로 부여된 동일성의 측정을 사용하여 서열을 맞춘다. 예를 들면, GCG는 생물체의 다른 종류 또는 야생형 단백질 및 이의 유사체 사이의 차이로부터 상응하는(homologous) 폴리펩타이드와 같이 가깝게 관련된 폴리펩타이드 사이의 서열 상동성(homology) 또는 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램으로 명시된 바와 같이 디폴트 파라미터와 사용될 수 있는 'Gap' 및 'Bestfit'과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들면, GCG 버전6.1(University of Wisconsin, Madison, WI)을 참조하라.

폴리펩타이드 서열은 또한 디폴트 또는 추천하는 파라미터를 사용하여 FASTA를 이용하여 비교할 수 있고, GCG 버전6.1. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 문의 및 검색서열 사이에 가장 겹치는 부위의 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol 183:63-98, 1990; Pearson, Methods Mol Biol 132:185-219, 2000). 다른 생물체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스에 대한 서열을 비교할 때 사용할 수 있는 다른 알고리즘은 프로그램에서 공급된것으로 디폴트 파라미터를 사용한 컴퓨터 프로그램 BLAST, 예를 들면, blastp 또는 tblastn이다. 예를 들면, Altschul et al, J Mol Biol 215:403-410, 1990; Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402, 1997을 참조하라.

샘플의 적어도 약 60 내지 75%가 폴리펩타이드의 단일 종에 존재할 때, 단백질 또는 폴리펩타이드가 '대체로 순수(substanitially pure)', '대체로 균질(substanitially homogeneous)' 또는 '대체로 정제(substanitially purified)' 이다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 것이다. 대체로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 순수로 구성될 수 있다; 예를 들면, 대체로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 순수이다. 단백질 순도 또는 동질성은 단백질 샘플의 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 후에 단백질 또는 폴리펩타이드와 연결된 하나 또는 그 이상의 밴드를 시각화(예를 들면, 젤 염색에 의해), 크기-배제 고성능액체크로마토그래피(size-exclusion high performance liquid chromatography(HPLC)), 양이온-교환 HPLC, SDS에서 감소된 모세관 전기영동(reduced capillary electrophoresis in SDS), 펩타이드 맵핑(peptide mapping), 또는 글리칸 맵핑(glycan mapping)과 같은 어떤 적절한 의도에 의해 평가될 수 있다. 더 높은 해상도는 기술분야에서 통상 알려진 방법, 예를 들면, 또는 정제의 다른 의도를 이용해서 달성될 수 있다.

핵산 또는 이의 단편을 나타낼 때 용어 '실질적 동일성'은 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실과 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)을 선택적으로 정렬하였을 때를 의미하고, 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 염기와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 및 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하고, 예를 들면, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% 또는 99% 서열 동일성이 FASTA, BLAST 또는 Gap와 같은 서열 동일성의 어떤 알려진 알고리즘에 의해 측정된다.

적용되는 폴리펩타이드로서, 용어 '실질적 동일성(substanitial identity)' 또는 '실질적 유사성(substanitial similarity)'은 적용된 프로그램으로써 디폴트 갭 무게(gap weight)를 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 선택적으로 정렬되었을 때, 두 아미노산 서열을 의미하고, 이때 적어도 약 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성; 예를 들면, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 어떤 실시예에서, 동일하지 않은 잔기의 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다.

'치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)'는 IL-6 관련 질환의 치료를 위해 유용한 다른 치료(예를 들면, 다른 치료 제제(therapeutic agent))의 예방(prophylactic) 및/또는 치료 영향을 치료 또는 증가 또는 개선하는 질환의 적어도 하나의 징후(sign) 또는 증상을 개선하도록 투여되는 치료 제제의 양을 나타낸다. 치료학적으로 유효한 양이란 제한된 시간 동안 또는 만성 치료로서 다중 투여량(multiple doses)으로 투여될 것이다.

'치료(treat)', '처리(treating)' 및 '치료(treatment)'는 징후 또는 증상 또는 질병의 개선 방법을 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 '질병(disease)'은 질병(disease) 및 장애(disorder)를 포함한다.

각각의 특허문헌 및 과학적 기사의 전체적인 공개는 본 명세서에 참조로 포함되고, 그렇게 인용된 이들 특허문헌 및 과학적 기사는 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로 분명히 고려된다.

본 명세서에 공개된 각각의 특허 및 과학기사와 특허문헌 및 과학기사는 명확하게 참조에 포함되어 있다.

본 발명의 추가적인 특징 및 이점은 하기에 더욱 구체적으로 서술되어 있다.

도 1은 랫트 CNV 모델에 항-IL-6 항체를 IVT로 투여한 실험의 결과를 나타내는 도이다. 항-VEGF 항체는 양성 대조군으로서 투여되었고, 음성 대조군은 비히클(vehicle) 단독이며, 항-IL-6 대 비히클 대조군을 위한 15일째 p=0.0054 및 22일째 p=0.0005이다.
도 2는 IL-6/IL-6R의 gp130에 대한 결합을 억제하는 쥣과(murine) 64 항체의 능력의 결합 실험 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 수용성 IL-6Ra의 초과량(excess)이 없을 때, 020의 IL-6 신호를 막는 능력을 시험한 실험을 나타낸 도이다. 실험은 0.2 ng/㎖ IL-6 및 2 ㎍/㎖ IL-6Rα와 함께 HEK-Blue-IL-6 세포에서 수행되었다.
도 3b는 수용성 IL-6Ra의 초과량의 존재가 없을 때, 020의 IL-6 신호를 막는 능력을 시험한 실험을 나타낸 도이다. 실험은 0.2 ng/㎖ IL-6 및 2 ㎍/㎖ IL-6Rα와 함께 HEK-Blue-IL-6 세포에서 수행되었다.

인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)는 류마티스성 관절염과 같은 여러 가지 질병에서 역할을 하는 것이 알려졌고, 안질환을 포함하는 다수의 질병에서 유의적으로 상향-조절됨(up-regulated)이 보고되었다. IL-6는 시스-(cis-) 및 트랜스-(trans-) 기전 모두를 통해 작용할 수 있다. 시스 기전에 있어서, 자유 IL-6가 IL-6 수용체(IL-6R 또한 IL-6Ra 및 CD126으로 나타냄)가 결합된 막(membrane)에 결합하고, 그리고나서 상기 IL-6/IL-6R 복합체는 복합체를 포함하는 세포에서 신호를 활성화하기 위해 gp130(CD130, 온코스태틴(oncostatin) M 수용체, IL-6R베타, 및 IL-6 신호 변환체로 또한 나타냄)과 상호작용한다. 트랜스 기전에 있어서, 자유 IL-6는 수용성 IL-6 수용체(sIL-6R)에 결합한다. 상기 IL-6/sIL-6R 복합체는 그리고나서 세포막에 존재하는 gp130에 결합한다. 이들 기전 사이의 중요한 차이는 많은 세포가 IL-6R을 발현하는 세포가 제한적이어서, gp130을 발현하는 세포가 더 많다는 것이다. 그러므로, IL-6 신호를 제한하기 위한 이상적인 질병, 예를 들면, IL-6 신호를 광범위하게 억제하는데 이상적인 질병에 있어서, 시스- 및 트랜스- IL-6 신호를 모두 억제하는 것이 유용하다. 본 발명자들은 IL-6 길항제(antagonist), 예를 들면, IL-6의 시스 및 트랜스 신호를 모두 억제할 수 있는 항-IL-6 항체, 단편, 및 유도체를 제작하였다. 또한, 본 발명자들은 증가된 유리체 잔류(retention) 및 더 빠른 전신 청소(systemic clearance)를 달성하기 위해 이와 같은 IL-6 길항제를 제작하였다.

IL-6 길항제의 특징(IL-6a)

일반적으로, 본 명세서에서 서술된 IL-6 길항제(IL-6a)는 IL-6의 사이트 2(site 2)에 특이적으로 결합하고, IL-6 관련 안과 질환 및 특정 다른 질환의 치료를 위해 유용하다. IL-6 관련 안과 질환은 IL-6의 발현 또는 존재와 함께 연관된 질환의 원하지 않는 증상 또는 생물학적 활성 중 하나이다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 자유 또는 결합된 IL-6 모두를 위한 높은 결합력을 갖고, 생물체 내에서 상대적으로 안정적이며, IL-6R에 결합된 IL-6의 gp130(본 명세서에서 IL-6/IL-6R 복합체 또는 IL-6/IL-6R로 사용됨)에 결합하여 억제할 수 있으며, 치료적 영향을 가질 수 있다. 일반적으로, IL-6a는 항체이거나, 항체로부터 유래된다. 예를 들면, IL-6a는 친화력이 높고, 인간화된 Fab는 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있고, 시스- 및 트랜스- IL-6 신호를 모두 잠재적으로 막을 수 있다. 다른 예에서, IL-6a는 전장의 항체, 예를 들면, IgG1 또는 IgG2 항체이다.

어떤 실시예에서, Fab는 Fc-조작된 서열로서 또한 설정되거나, 전장의 항체이다. 어떤 실시예에서, 상기 Fc-조작된 IL-6a(예를 들면, Fc-조작된 Fab)는 적절한 대조군과 비교하여, 예를 들면, 조작된 Fc를 갖지 않는 상응하는 항체, 단편 또는 이의 유도체와 비교하여 증가된 유리체 잔류시간 및/또는 더 빠른 전신 청소를 갖는다. IL-6a의 상기 및 다른 특징은 본 명세서에 추가적으로 서술되었다.

본 발명자들은 IL-6가 막 IL-6R 또는 sIL-6R에 결합된 것과 관계없이 IL-6에 대한 gp130의 결합을 억제할 수 있는 이와 같은 분자에 의한 IL-6 신호의 광범위한 억제를 제공하기 위한 IL-6의 사이트 2dp 선택적으로 결합하는 IL-6 길항제를 디자인하였다.

게다가, IL-6 수용체와 대응하는 리간드(ligand)의 타겟팅(targeting)은 수용체 매개의 청소(clearance) 및 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)에 의한 독성을 피할 수 있다. IL-6는 질환에서 병리학적(pathologic) 및 보호(protective) 역할 모두를 하기 때문에, 증가된 IL-6와 관련된 질환의 치료를 위한 IL-6 길항제(IL-6a)의 용도는 상태의 특정 측면을 개선시킬 수 있으나, 또한 유의적인 부작용(adverse effect), 예를 들면, 전신 효과(systemic effect)의 원인이 될 것이다. 이러한 IL-6 경로의 이중성(즉, 이상적인 및/또는 이상적이지 않은 효과를 갖기 위한 능력)은 전신 억제제와 함께 IL-6 관련 질환을 치료하기 위해 이상적이지 않게 만들어질 것이다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 적어도 한 IL-6 활성을 억제하는 치료를 위해 유용할 수 있으나, 부분적으로는 상기 조성물이 국소 전달(local delivery), 예를 들면, 눈으로의 국소 전달을 위해 제형화될 수 있기 때문에 IL-6의 긍정적인 활성에 대한 부당한 결과를 가져오지 않는다. 예를 들면, 특정 측면에서, IL-6a는 특정 위치에의 전달을 위해 적절한 크기로 디자인된다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 전장의 항체이다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 항체로부터 유래되고, 눈의 유리체에서 더욱 긴 체류 시간 및 제한된 전신 누출(leakage)을 가질 것인 구성 방식을 가진다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 상응하는 변형되지 않은 항체와 비교하여 눈의 유리체에서 더욱 긴 체류 시간 및/또는 제한된 전신 누출(leakage)을 갖는 변형된 항체(예를 들면, 변형된 Fc 도메인을 가지는 항체)이다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 IgG2 항체이다.

어떤 측면에서, IL-6a는 항체의 단편 또는 전장의 항체보다 짧은 항체의 유도체, 예를 들면, IL-6 항체로부터 유래된 Fab와 같이 상대적으로 작은 IL-6a이다. 어떤 경우에, IL-6a는 상응하는 전장의 IL-6 항체와 비교하여 증가된 동역학(kinetic)와 함께 조직의 한 부분으로부터 다른 부분으로 통과할 수 있는 구성방식이다. 어떤 실시예에서 IL-6a는 더 큰 분자로 조작된 Fab이고, 이는 Fab 단독, 예를 들면, IL-6a가 Fc 도메인을 통해 이량체화된 것과 비교하여 그 위치에서 증가된 잔류를 가지기 쉽다. 특정 실시예에서, Fc 도메인은 증가된 국소 체류, 예를 들면, 야생형 Fc를 포함하는 동일한 IL-6 결합 독립체(entity)와 비교하여 증가된 유리체 잔류 및 전신 축적 감소의 결과 일 수 있는 Fc 모이어티(moiety)가 변화하거나, FcRn 결합의 감소와 같이 조작되었다.

본 명세서에서 서술된 IL-6 길항제는 또한, IL-6의 적어도 하나의 이상적이지 않은 영향을 개선함에 있어서, 그들의 타겟인 IL-6와 충분히 강한 결합력을 가진다. 저해제는 또한, 치료적으로 유용하기 위해 충분히 안정적이다.

일반적으로, IL-6a의 PK, 예를 들면, 눈 사용을 위해 적절한 IL-6a는 전달의 위치, 예를 들면, 유리체에서 PK를 갖고, 이는 치료학적 효과를 제공하기 위해 충분하다. 제한 없는 예는 PK가 적어도 12시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 8일, 10일, 14일, 21일, 28일 또는 30일의 반감기 일 수 있다.

사이트 2에 결합하는 IL-6 길항제의 동정

일반적으로, 기술분야에 알려진 어떤 방법으로도 IL-6에 결합할 수 있는 물질을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들면, 폴리펩타이드 라이브러리(polypeptide libraries) 또는 분자 라이브러리(molecular libraries)를 IL-6에 결합하는 폴리펩타이드 또는 화합물의 능력을 위한 어세이(assay)에서 후보 화합물을 스크리닝 할 수 있다. 일단 이와 같은 후보 화합물이 동정되면, 화합물의 결합 부위가 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 분자는 야생형 IL-6에 결합하는 화합물의 능력이 시험될 수 있고, 상기 결합은 사이트 1, 사이트 2, 또는 사이트 3에서 돌연변이된 IL-6에 결합하기 위한 화합물의 능력을 비교한다. 어떤 실시예에서, 본 명세서에 서술된 바와 같이 IL-6a는 IL-6/IL-6Ra 복합체 및 IL-6에 결합하는 능력이 유지하고, IL-6/IL-6Ra가 gp130에 결합하는 것을 막는다. 실시예에서, 본 명세서에 서술된 바와 같이 IL-6a는 IL-6a는 IL-6/IL-6Ra 복합체에 대한 결합, 예를 들면, IL-6의 사이트 2에 대한 결합을 위해 gp130과 경쟁할 수 있다. 이와 같은 결합 활성은 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 분석될 수 있다.

IL-6a 후보 물질은 예를 들면, HEK-Blue™ IL-6 어세이 시스템(InvivoGen, San Diego)을 이용하여 시험될 수 있다. HEK-Blue™ IL-6 세포는 인간 IL-6R 및 STAT3-유도성 SEAP 리포터 유전자가 안정적으로 형질전환된 HEK293 세포이다. IL-6가 존재하면, STAT3가 활성화되고 SEAP이 분비된다. SEAP은, 예를 들면, QUANTI-Blue™(InvivoGen, San Diego)를 사용하여 평가된다. 세포에 대한 IL-6 길항제의 추가는 자유 및 수용성 수용체 결합된 IL-6의 억제 결과로서 SEAP의 분비가 억제되거나, 수준이 감소한다.

K_D는 특정 항체-항원 상호작용 또는 항체 단편-항원 간의 상호작용의 결합 선호도 평형 상수(binding affinity equilibrium constant)를 나타낸다. 항체 또는 이의 단편은 K_D가 250 pM과 동일하거나 또는 그 이하일 때, 예를 들면, 225 pM, 220 pM, 210 pM, 205 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 1 pM과 동일하거나 또는 그 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. K_D는 기술분야에 잘 알려진 방법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 예를 들면, BioCore™ 시스템을 사용하여 결정될 수 있다.

K_off는 특정 항체-항원 상호작용 또는 항체 단편-항원 복합체의 해리율 상수(dissociation rate constant)를 나타낸다. 해리율 상수는 표면 플라스몬 공명의 사용, 예를 들면, BioCore™ 시스템 사용으로 결정될 수 있다. 상대적으로 느린 K_off는 치료학적의 이상적인 특징, 예를 들면, 이와 같은 치료를 필요로 하는 개체에 대해 억제제를 더 낮은 빈도로의 투여 허용에 기여할 수 있다.

특이성(specificity)

본 명세서에서 서술된 IL-6 길항제의 특징은 그들의 결합 특이성과 관련이 있다. 상기 언급한 바와 같이, IL-6는 자유 IL-6 및 수용성 IL-6Ra에 결합된 IL-6로서 존재할 수 있다. 본 발명자들은 IL-6의 사이트 1에 결합하는 저해제와 비교하여 IL-6 길항체를 위해 최적의 타겟으로 IL-6의 사이트 2를 동정하였다. 사이트 1 저해제는 자유 IL-6가 IL-6Ra에의 결합을 방해할 것이다. 그러나, 이와 같은 저해제는 복합체의 K_off에 의해 제한된 치환에 의한 경우를 제외하고는 이미 존재하는 IL-6/IL-6R 복합체에 의해 개시되는 활성을 막을 수 없다. 다른 대안으로는, IL-6Ra에 결합하는 저해제는 포화 농도로 존재하지 않는 한 IL-6의 활성을 막기 위한능력이 제한될 것이므로 때문에 덜 적절하다. IL-6 수용체의 양이 IL-6의 양과 비교하여 일반적으로 매우 높기 때문에, 이러한 접근방법은 수용체에 결합한 IL-6의 활성을 억제하는 조성물의 이상적이지 않은 많은 양의 투여가 요구될 것이다. 실시예에서, 본 명세서에 서술된 IL-6 길항제(예를 들면, 본 명세서에서 서술된 항체 및 단편 및 이의 유도체)는 심지어 IL-6가 IL-6R에 결합하였을 때에도 IL-6의 활성을 막을 수 있다. 따라서, 본 명세서에 서술된 바와 같이 조성물에서 상대적으로 적은 IL-6a의 이점은 IL-6 수용체를 타겟으로 하는 저해제와 비교하여 치료학적 효과를 성취하도록 투여되기 위한 필요가 있을 것이다. 항-수용체 항체는 유의적으로 제한하는 청소에 매개된 수용체에 의해 빠르게 분해되는 것으로 보고되어있고, 따라서 더 많은 투여량, 더 빈번한 투여, 또는 양쪽 모두가 요구된다. 게다가, 항-수용체 및 항-사이트 1 IL-6 항체 모두는 리간드의 청소 기전에 매개된 정상 수용체의 방해에 의해 IL-6의 조직 농도가 유의적으로 증가하는 문제를 제기하고, 그렇게함으로써, 조직에서 IL-6의 잠재적인 이상적이지 않은 수준으로 개체에 노출한다. 게다가, IL-6a를 타겟팅하는 저해제의 용도는 저해가 요구되는 사이트 및 이상적이지 않은 사이트, 예를 들면, 전신치료(systemic treatment) 모두에 가까운 저해제의 존재가 필요할 것이다. gp130이 결합하는 사이트 2에 결합하는 IL-6a의 용도는 자유 IL-6뿐만 아니라, gp130을 통해 IL-6의 경로가 아직 활성화되지 않은 IL-6R에 결합된 IL-6를 통한 저해가 허용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 서술된 IL-6 길항제는 IL-6의 모든 형태(수용성 및 수용체 결합된)에 결합하기 위해 디자인되었고, 바람직하게, IL-6 길항제는 양쪽 형태에 접근 가능한 IL-6의 사이트 2에 결합한다. 본 명세서에 서술된 IL-6a를 포함하는 조성물은 IL-6에 의한 시스 및 트랜스 신호 모두를 억제할 수 있다.

어떤 경우에, 본 명세서에서 제공된 화합물 및 방법은 IL-6와 관련된 질환, 예를 들면, 혈관신생 및/또는 염증의 적어도 한 가지 징후 또는 증상을 치료하기 위해 충분하게 효율적으로 IL-6 봉쇄를 제공하기 위해 디자인되었다.

본 명세서에서 서술된 화합물은 IL-6의 수준이 비이상적으로 높게 특징지어진 안과 질환, 예를 들면, 유리체(Yuuki et al., J Diabetes Compl 15:257(2001); Funatsu et al, Ophthalmology 110: 1690,(2003); Oh et al, Curr Eye Res 35: 1116(2010); Noma et al., Eye 22:42(2008); Kawashima et al., Jpn J Ophthalmol 51:100(2007); Kauffman et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 35:900 (1994); Miao et al, Malec Vis 18:574(2012)를 참조)를 치료하기 위해 유용하다.

일반적으로, 본 명세서에서 서술된 바와 같이 IL-6a는 IL-6 신호의 잠재적인 길항제이다. 이는 IL-6에 대해 높은 결합력을 갖는 지정된 분자, 예를 들면, 10 pM IL-6를 사용한 HEK-Blue IL-6 어세이에서 IC50 값이 100 pM과 동등 또는 그 이하에 의해 부분적으로 달성된다. IL-6a의 높은 결합력은 IL-6a의 K_D, 예를 들면, 1 nM 이하이거나 동일, 500 pM 이하이거나 동일, 400 pM 이하이거나 동일, 300 pM 이하이거나 동일, 240 pM 이하이거나 동일, 200 pM 이하이거나 동일한 K_D에 근거하여 결정된다.

증가된 IL-6 발현 또는 활성과 연관된 질환의 치료를 위해 유용한 생물학적 IL-6a(예를 들면, 항체, 단편, 또는 이의 유도체와 같은 단백질 또는 폴리펩타이드)의 생산을 위해 일반적으로 생물학적 IL-6a가 높은 생산성을 갖는 것이 이상적이다. 예를 들면, 적절한 생산성은 1 g/L 이상 또는 동일(예를 들면, 2 g/L 이상 또는 동일, 5 g/L 이상 또는 동일, 또는 10 g/L 이상 또는 동일)하다.

IL-6 길항제를 효과적으로 투여하기 위해서, 저해제 투여시의 농도가 양립가능한 용해도를 갖는 것이 필요하다. 예를 들면, 전장의 항체 IL-6a의 경우, 용해도는 20 ㎎/㎖ 이상 또는 동일, 10 ㎎/㎖ 이상 또는 동일, 5 ㎎/㎖ 이상 또는 동일, 또는 1 ㎎/㎖ 이상 또는 동일하다.

게다가, 성공적인 치료를 위해서 저해제는 전달 및 활성 사이트뿐만 아니라 저장 안정성에 있어서 체온에서 높은 안정성을 가져야한다. 예를 들면, Tm은 60℃ 이상 또는 동일하고(예를 들면, 60℃ 이상 또는 동일, 62.5℃ 이상 또는 동일, 65℃ 이상 또는 동일, 70℃ 이상 또는 동일, 73℃ 이상 또는 동일, 75℃ 이상 또는 동일), Tonset은 45℃ 이상 또는 동일, 예를 들면, 50℃ 이상 또는 동일, 51℃ 이상 또는 동일, 55℃ 이상 또는 동일, 60℃ 이상 또는 동일하다. Tm 및 Tonset의 결정방법은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 결정할 수 있다.

이상적인 특징을 가진 길항제는 통상의 기술자에게 잘 알려진 분자의 적합한 형태, 예를 들면, 부모 IL-6 항체(예를 들면, 이상적 결합 특징)의 충분한 특징을 일반적으로 유지 또는 지속하는 IL-6 사이트 2 표적의 항체 단편 및 유도체를 포함하는 항체로부터 선택될 수 있다. 이와 같은 길항제는 Fab 단편, scFvs, Fc 모이어티를 포함하는 조작된 Fab 단편, 및 부모 IL-6 사이트 2 표적의 항체와 다른 뼈대(framework)를 갖는 조작된 전장 항체을 포함한다.

어떤 측면에서, 본 명세서에서 공개된 IL-6a는 IL-6의 사이트 2와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편과 경쟁 또는 교차-경쟁(cross-compete) 할 수 있는 인간 항체 항원-결합 사이트로 구성된다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 본 명세서에서 공개된 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성되고, 상기 VH 및 VL 도메인은 본 명세서에서 공개된 IL-6/사이트 2 결합 항체의 CDR 셋트(set)로 구성된다.

어떠한 적절한 방법이 IL-6a에 결합되는 도메인 및/또는 에피토프(epitope), 예를 들면, IL-6의 다양한 사이트의 돌연변이를 결정하기 위해 사용될 것이다. IL-6a 및 IL-6 리간드의 결합을 막거나 감소시키는 돌연변이 사이트는 IL-6a에 직접적으로, 또는 결합 사이트에 간접적인 영향, 예를 들면, IL-6의 구조(conformation) 영향에 의한 것을 포함한다. 다른 방법은 IL-6a에 의해 결합된 아미노산을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 펩스캔-기초의 효소 결합 면역 침강 분석법(PEPSCAN-based enzyme linked immuno assay, ELISA)와 같은 펩타이드-결합 스캔이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 펩타이드-결합 스캔에 있어서, 항원에서 유래된 짧고 중복되는 펩타이드는 결합 구성원에 대한 결합을 위해 조직적으로 스크리닝된다. 상기 펩타이드는 펩타이드의 집합체(array)를 형성하기 위해 지지면(support surface)에 공유결합으로 연결될 수 있다. 펩타이드는 선형이거나, 구조를 제한할 수 있다. 제한된 구조는 펩타이드 서열의 각 끝에 말단(terminal) 시스테인(cysteine) 잔기를 가지고 있는 펩타이드를 이용하여 생산될 수 있다. 상기 시스테인 잔기는 펩타이드의 고리 구조에서 고정된 것과 같은 지지면에 직접적 또는 간접적으로 공유결합으로 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용된 펩타이드는 항원의 단편에 상응하는 펩타이드 서열의 말단에 추가된 시스테인 잔기를 가질 것이다. 이중 고리 펩타이드가 펩타이드 서열의 중간 또는 근처에 위치한 추가적인 잔기로 또한 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 중앙 시스테인 잔기의 각 사이드(side)의 한 고리와 함께 이중-고리 구조를 형성하는 펩타이드와 같이 지지면에 직접적 또는 간접적으로 공유결합으로 연결될 수 있다. 펩타이드는 합성되어 생산될 것이고, 시스테인 잔기는 그러므로 IL-6 사이트 2 서열에서 자연적으로 발생하지 않음에도 불구하고 이상적인 위치에 조작될 수 있다. 선택적으로, 선형 및 제한된 펩타이드는 펩타이드-결합 어세이에서 모두 스크리닝될 수 있다. 펩타이드-결합 스캔은 결합 구성원 결합에 대한 펩타이드 셋트의 동정(예를 들면, ELISA를 사용)을 포함할 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 IL-6a의 단편에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(예를 들면, IL-6a의 약 5, 10, 또는 15 인접한 잔기를 포함하는 펩타이드), 및 결합 구성원에 의해 결합된 잔기의 풋프린트(footprint)를 결정하기 위해 펩타이드가 정렬되며, 여기서 상기 풋프린트는 중복된 펩타이드에 대한 일반적인 잔기로 구성되고, 그 대신에 또는 추가적으로 상기 펩타이드-결합 스캔 방법은 적어도 선택된 signahnoise 비율과 함께 IL-6a 결합하는 펩타이드를 동정하기 위해 사용될 수 있다.

통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 방법이 항체에 의해 결합된 잔기의 결정, 및/또는 펩타이드-결합 스캔 결과, 예를 들면, 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis(즉, 본 명세서에 서술된 바와 같이), 수소 중수소 교환(hydrogen deuterium exchange), 질량 분석(mass spectrometry), NMR 및 엑스선 결정분석(X-ray crystallography)을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 명세서에 서술된 바와 같이 유용한 IL-6a는 인간 항체 분자, 인간화된 항체 분자, 또는 이의 결합 단편이다. 일반적으로, 상기 항체는 단일클론항체이다. 이와 같은 항체의 기원은 인간, 쥣과(murine), 랫트(rat), 카멜리드(camelid), 토끼, 양(ovine), 돼지, 또는 소일 수 있고, 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다.

일반적으로, IL-6a는 IL-6(예를 들면, 인간 IL-6)의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 적어도 CDR로 구성된다. 본 발명의 CDR 또는 CDR 셋트를 운반하기 위한 구조는 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 상당부분인 항체일 수 있고, 여기서 CDR 또는 CDR 셋트는 재배열된 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자에 의해 암호화된 자연적으로 생성된 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 셋트에 상응하는 위치에 위치할 수 있다. 상기 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat, et al., 1983(National Institutes of Health)의 참조에 의해 결정될 수 있고, 이의 업데이트는 어떤 인터넷 검색 엔진을 이용하여 'Kabat'으로 찾을 수 있다.

항체인 IL-6a는 일반적으로 VH 도메인(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 3) 및/또는 VL 도메인(예를 들면, 서열번호 2)으로 구성된다. VH 도메인은 중쇄 CDR(VHCDR)의 셋트로 구성되고, VL 도메인은 경쇄 CDR(VLCDR)의 셋트로 구성된다. 이와 같은 CDR의 예는 실시예 3에 제공되고, 이의 예는 서열번호 4 내지 9로 묘사된다. 항체 분자는 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 및 뼈대로 구성된 항체 VH 도메인으로 구성될 수 있다. 이는 그 대신에 또는 또한 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 및 뼈대로 구성된 항체 VL 도메인으로 구성될 수 있다.

본 명세서에서 공개된 것은, 본 명세서에서 공개된 이들과 같은 본 명세서에서 공개된 것 및/또는 VHCDR1 및/또는 VHCDR2 및/또는 VHCDR3과 같은 VHCDR1 및/또는 VHCDR2 및/또는 VHCDR3로 구성된 IL-6 길항제이다. IL-6a는 본 명세서에서 서술된 어떤 항체, 단편 또는 유도체의 하나 또는 그 이상의 CDR로 구성될 수 있다. IL-6a는 VHCDR의 셋트(예를 들면, VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3)로 구성될 수 있고, 선택적으로 이는 또한 VHCDR의 셋트(예를 들면, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3)로 구성될 수 있다. 상기 CDR은 본 명세서에 서술된 하나 또는 그 이상의 항체, 단편, 또는 유도체로부터 유래될 수 있다.

일반적으로, VH 도메인은 항체 항원-결합 사이트를 제공하기 위해 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 HC 도메인은 서열번호 2의 LC 도메인과 쌍을 이룬다. 어떤 경우에, VH 또는 VL 도메인 단독으로 IL-6a로써 사용될 수 있다.

어떤 측면에서, IL-6a는 (i) 본 명세서에 서술된 VH 도메인, 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열, 또는 (ii) 이들 서열((i)에 정의된 서열)의 VHCDR 세트(예를 들면, VHCDR1, VHCDR2 및/또는 VHCDR3)로 구성되는 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체이다. 실시예에서, 상기 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 서열번호 1의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 또는 서열번호 3의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3로 구성된다. 실시예에서, 상기 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 서열번호 1과 1개 미만, 2개 미만, 3개 미만, 4개 미만, 또는 5개 미만의 아미노산에 의해 서열번호 1의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3와 전체적으로 다른 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3로 구성된다. 실시예에서, 상기 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 서열번호 1과 1개 미만, 2개 미만, 3개 미만, 4개 미만, 또는 5개 미만의 아미노산에 의해 서열번호 3의 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3와 전체적으로 다른 VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3로 구성된다.

항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 본 명세서에 서술된 VL 도메인, 예를 들면, 서열번호 2와 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열, (ii) 이들 서열((i)에 정의된 서열)의 VHCDR 세트(예를 들면, VLCDR1, VLCDR2 및/또는 VLCDR3)로 구성된다. 실시예에서, 상기 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 서열번호 2의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3로 구성된다. 실시예에서, 상기 항체 분자, 단편, 또는 이의 유도체는 1개 미만, 2개 미만, 3개 미만, 4개 미만, 또는 5개 미만의 아미노산에 의해 서열번호 3의 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3와 전체적으로 다른 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3로 구성된다. 알고리즘이 두 아미노산 서열의 퍼센트 동일성(percent identity)을 계산하기 위해 예를 들면, BLAST, FASTA, 또는 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm), 예를 들면, 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 서술된 IL-6a는 항체 불변영역(constant region) 또는 이의 부분, 예를 들면, 인간 항체 불변영역 또는 이의 부분으로 구성될 수 있다. 예를 들면, VL 도메인은 인간 CK 또는 CL 사슬을 포함하는 항체 경쇄의 불변영역의 C-말단(C-terminal end)에 부착될 것이다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 IL-6a은 어떤 항체 아이소타입(isotype), 예를 들면, IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 어떤 아이소타입의 하위분류(sub-class), 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전체 또는 부분(예를 들면, CH1 도메인)의 C-말단에 부착될 것이다.

어떤 경우에, 본 발명의 항체는 특이적인 동종이형(allotype), 예를 들면, 특정 지리적 기원을 가지는 집단에서 우세한 동종이형을 갖는 서열을 만들기 위해 통상의 당업계에 알려진 방법을 사용하여 추가적으로 변형된다. 어떤 경우에, 인간 중쇄 불변 영역은 이런 목적을 위해 변형된다.

IL-6a는 항체 뼈대(framework) 내에서 하나 또는 그 이상의 CDR, 예를 들면 CDR 세트를 갖는 항체 분자, 이의 결합 단편, 또는 변이체일 수 있다. 예를 들면, 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR 또는 CDR 세트(예를 들면, 본 명세서에 서술된 항체 또는 단편 또는 이의 유도체)는 항체 분자를 제공하기 위해 뼈대(예를 들면, 인간 뼈대)에 이식될 것이다. 뼈대 영역(framework region)은 인간 생식세포 유전자 서열, 또는 비-생식세포에서 유래될 수 있다.

VH 및/또는 VL 뼈대 잔기는 본 명세서에서 논의 및 예시된 바와 같이, 예를 들면, 부위 지정 돌연변이를 사용하여 변형될 수 있다.

아미노산 변형은 당업계에 잘 알려진 방법 및 파라메터를 이용하여 IL-6(본 명세서에서 '참조의 IL-6 항체')의 사이트 2를 표적으로 하는 항체 IL-6a로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 뼈대 영역 및/또는 하나 또는 그 이상의 CDR로 만들어 질 수 있다. 또한, 본 명세서는 IL-6의 사이트 2(예를 들면, 인간 IL-6의 사이트 2)에 결합을 유지하는 IL-6 길항체 결과를 포함하고, 참조의 IL-6 항체와 비교하여 적어도 동일한 결합 또는 증가된 결합력을 일반적으로 갖는다. 어떤 경우에, 안정성과 같은 파라메터를 개선하기 위하여 참조의 IL-6a(예를 들면, 참조 항체)와 비교하여 유래된 IL-6a의 결합능의 감소 결과 변화는 유용한 IL-6a를 제조하기 위해 도입될 수 있다. 어떤 실시예에서, 예를 들면, 어떤 경우에 참조는 FcRn 결합 또는 유리체 내에서 반감기(half-life) 또는 전신 반감기(예를 들면, 혈액, 혈장(plasma), 혈청(serum), 림프(lymph), 간, 신장, 다른 조직, 또는 체액)와 같은 약물동력학(pharmacokinetic, PK)과 관련되고, 참조 항체는 IL-6에 특이적으로 결합하지 않는 항체일 것이다.

IL-6a 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 변화는 서열 내에서 비-자연적 발생 또는 비-표준적인 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 치환, 비-자연적으로 발생 또는 비-표준적 형태의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 변형, 또는 비-자연적 발생 또는 비-표준적인 하나 또는 그 이상의 아미노산 삽입을 포함한다. 본 발명의 서열에서 변화의 수 및 위치의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 서술된다. 자연적으로 발생한 아미노산은 그들의 표준 단일 문자 코드(standard single-letter code)에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R,H, D, E로서 동정된 20개의 '표준' L-아미노산을 포함한다. 비-표준의 아미노산은 폴리펩타이드 백본(backbone)에 삽입될 어떤 다른 잔기를 포함하고, 이는 존재하는 아미노산 잔기의 변형의 결과이다. 비-표준 아미노산은 자연적으로 발생 또는 비-자연적으로 발생할 것이다. 몇몇의 자연적으로 발생하는 비-표준 아미노산은 4-하이드로시프롤린(4-hydroxyproline), 5-하이드록시라이신(5- hydroxylysine), 3-메틸히스티딘(methylhistidine), 및 N-아세틸세린(N-acetylserine)과 같이 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 그들의 N-알카 위치에 유도된 이들 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 상기 아미노산은 일반적으로 L-아미노산이다. 어떤 경우에, 상기 아미노산은 D-아미노산이다. 그러므로 변형은 L-아미노산이 D-아미노산 내로, 또는 D-아미노산으로 치환된 변형으로 구성될 것이다. 아미노산의 메틸화된, 아세틸화된 및/또는 인산화된 형태 또한 잘 알려져 있고, 본 명세서의 아미노산은 변형의 대상일 것이다.

본 발명의 항체 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열은 본 명세서에서 논의된 비-자연적 또는 비-표준 아미노산으로 구성될 수 있다. 비-표준 아미노산(예를 들면, D-아미노산)은 통상의 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들면, 분자의 합성 또는 합성 후 변형 또는 아미노산 치환을 사용하여 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다. 어떤 경우에, D-아미노산은 IL-6a의 PK를 증가시키기 위해 사용된다.

본 발명의 CDR-유래 서열을 운반하는 신규한 VH 또는 VL 부위는 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 유발하기 위해 하나 또는 그 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 핵산 서열의 무작위 돌연변이를 사용하여 생성될 것이다. 예를 들면, 에러-프론 중합효소연쇄반응(error-prone PCR)이 사용될 수 있다(Chao et al., Nature Protocols, 1:755-768 (2006)). 어떤 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환은 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 만들어진다. 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 방법, 예를 들면, 부위-지정 돌연변이가 일반적으로 하나 또는 그 이상의 CDR에 돌연변이를 유발하기 위해 사용될 수 있다.

IL-6a 항체를 생산하기 위한 한 방법은 하나 또는 그 이상의 아미노산을 첨가, 결실, 치환 또는 삽입하여 서열번호 1 및 서열번호 3으로 묘사된 이들과 같은 VH 도메인의 변형을 위한 것이다. 상기 변형된 VH 도메인은 서열번호 2로 묘사된 것과 같은 VL 도메인과 결합할 수 있고, 이는 본 명세서에서 서술된 바와 같이 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 이와 같은 변형된 분자는 IL-6의 사이트 2 및 참조 분자와 비교하여 증가한 결합력과 같은 다른 이상적인 특징을 위해 선택적으로 시험된다. 어떤 경우에, 변이체 VH 또는 VL 도메인은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환)을 가질 수 있다.

본 발명의 IL-6a는 항원 결합 사이트로 구성된 단편에 제공된 IL-6의 사이트 2에 결합하는, 예를 들면, IL-6의 사이트 2에 결합할 수 있는 항체의 단편일 수 있다. 본 발명의 항체 단편은 일반적으로 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 2로 이루어진 항체 분자와 같은 시작한 참조(부모(parene)) 항체와 함께 수득된다. 항체 단편은 재조합 DNA(recombinant DNA), 효소 절단(enzymatic cleavage)(예를 들면, 펩신 또는 파파인 이용), 항체의 화학적 절단(chemical cleavage of an antibody)(예를 들면, 이황화 다리의 화학적 환원)과 같이 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.

항체 항원-결합 사이트로 구성되는 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd 및 dsFv(disulfice stabilized variable region)와 같은 분자를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 하나 또는 그 이상의 항체 항원-결합 부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자가 만들어질 수 있으며, 예를 들면 F(ab')2, F(ab)3, 다이아바디(diabodies), 트라이아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies) 및 미니바디(minibodies)를 포함한다. 항체 분자 및 이들의 제작 방법 및 용도의 예는 Holliger and Hudson, 2005, Nat Biotechnol 23: 1126- 1136에 서술되어 있다. 결합 단편의 비-제한적 예는 VL, VH, 불변 경쇄 도메인(constant light chani domain, CL) 및 불변 중쇄 도메인 1(constant heavy chain domain 1, CHI) 도메인으로 구성된 Fab 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편; 분리된 CDR 영역; F(ab')2 단편, 연결된 두 개의 Fab 단편으로 구성된 이가 단편; 단일 사슬 Fv 분자(single chain Fv molecule, scFv), 여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 항원 결합 사이트를 형성하기 위해 두 도메인의 결합을 허용하는 펩타이드 링커에 의해 연결됨; 이중특이성 단일 사슬 Fv 이량체(예를 들면 WO 1993/01 1161에서 공개된 것) 및 유전자 융합(예를 들면 WO94/13804에서 공개된 것)을 이용하여 제조된 다가(multivalent) 또는 다가특이성(multispecific) 단편인 다이아바디이다. Fv, scFv, 또는 다이아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 다리(disulfide bridges)의 삽입에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인과 연결된 scFv로 구성된 미니바디 또한 IL-6a로써 이용될 수 있다. IL-6a로서 사용될 수 있는 항체의 다른 단편 및 유도체는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 아미노산 잔기의 삽입에 의해 Fab 단편과 다른 Fab'를 포함하고, 이는 항체 힌지 부위(hinge region)로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인, 및 Fab'-SH를 포함하며, 여기서 Fab' 단편은 자유 티올(thiol) 그룹을 갖는 불변 도메인의 시스테인 잔기이다.

어떤 경우에, 항체 단편인 IL-6a는 이상적인 특징을 개선 또는 도입, 예를 들어 페길화(PEGylation)하기 위해, 반감기 또는 삽입을 증가시키기 위해 화학적으로 변형되었다.

dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단일사지(monomelic) 항원-결합 단편이다(항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역). VH dAb는 카멜리드(예를 들면, 낙타 및 라마)에서 자연적으로 발생하고, 표적 학원, 분리된 항원-특이적 B 세포 및 각각의 B 세포로부터 직접적인 dAb 유전자 클로닝에 의해 카멜리드에 면역력을 갖게 하여 생산될 수 있다. 본 발명의 IL-6a는 본 명세서에서 많이 명시된 바와 같이 VH 또는 VL 도메인 구성된 dAb, 또는 본 명세서에서 많이 명시된 바와 같이 CDR의 셋트로 구성된 VH 또는 VL 도메인일 수 있다.

본 발명의 항체는 같은 분자에 두 다른 가변 영역이 결합된 이중특이성 항체를 포함한다. IL-6a는 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들면, 화학적으로 또는 잡종 융합세포(hybrid hybridomas)로 제조된 이중특이성 항체의 부분으로 삽입될 수 있다. 이와 같은 분자는 상기 서술된 형태의 이중특이성 항테 단편일 수 있다. 이중특이성 항체를 제조하기 위한 방법의 비-제한적인 예는 BiTE^TM 기술이고, 여기서 다른 특이성을 갖는 두 항체의 결합 도메인이 사용될 수 있고, 짧은 플렉시블 펩타이드(flexible peptides)를 통해 직접적으로 연결된다. 이는 짧은 단일 폴리펩타이드 사슬에 두 항체를 연결한다. 다이아바디 및 scFv는 Fc 부위 없이, 오직 가변 도메인만 사용하여 제조될 수 있고, 이는 잠재적으로 항-이디오타입 반응(anti-idiotypic reaction)의 영향을 감소시킨다. 이중특이성 항체는 전체의 IgG로서, 이중특이성 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 다이아바이로서 또는 다른 이중특이성 scFv로서 제조될 수 있다. 추가적으로, 두 이중특이성 항체는 4가 항체를 형성하기 위해 통상의 기술자에게 잘 알려진 일반적인 방법을 사용하여 연결될 수 있다.

이중특이성 전체 항체와 반대로, 이중특이성 다이아바디는 이들이 제조되고, 대장균에서 발현될 수 있기 때문에 부분적으로 유용하다. 적절한 결합 특이성의 다이아바이(및 항체 단편과 같은 다른 많은 폴리펩타이드)는 라이브러리(libraries)로부터 파지 디스플레이(phage display, WO 1994/13804)를 이용하여 쉽게 선택될 수 있다. 만약, 다이아바디의 한쪽 팔이 불변, 예를 들어 IL-6의 사이트 2에 대한 직접적인 특이성을 유지한다면, 그 다음에 라이브러리는 다른 팔이 가변으로 만들어질 수 있고, 적절한 특이성의 항체가 선택된다.

이중특이성 전체 항체는 WO 1996/27011, WO 1998/50431 및 WO 2006/028936에 서술된 바와 같이 선택가능한 조작 방법에 의해 만들어질 것이다.

어떤 경우에, 본 발명의 IL-6a는 하기 추가적으로 서술된 바와 같이 비-항체 분자, 예를 들면, 비-항체 단백질 내에서 스캐폴드(scaffold)의 하나 또는 그 이상의 CDR, 즉 CDR 세트의 삽입에 의해 항원-결합 사이트로 구성된다. 어떤 경우에, 상기 CDR은 비-항체 스캐폴드에 삽입된다. IL-6 사이트 2 결합 사이트는 피브로넥틴(fibronectin) 또는 사이토크롬 B(cytochrome B)와 같은 비-항체 단백질 스캐폴드 위의 CDR의 배열(arrangement)에 의해서, 또는 IL-6 사이트 2를 위한 결합 특이성을 부여하기 위해 단백질 스캐폴드 내에서 루프(loop)의 무작위화(randomizing) 또는 돌연변이화(mutating)한 아미노산 잔기에 의해 제공될 수 있다. 단백질 내에서 조작한 신규한 결합 사이트를 위한 스캐폴드는 통상의 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체 모방체(mimic)를 위한 단백질 스캐폴드는 WO200034784에 공개되어 있고, 여기서 적어도 하나의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 서술한다. 하나 또는 그 이상의 CDR, 즉 HCDR 셋트가 이식된 적절한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리(superfamily)의 어떤 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 상기 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 이점은 작고 및/또는 적어도 어떤 항체 분자보다 제조가 용이한 스캐폴드 분자에 있어서, 항원-결합 사이트를 제공할 수 있다. 결합 구성원의 작은 크기는 세포로 들어가는 능력, 조직 내로 깊게 침투하는 능력 또는 다른 구조내에서 표적에 도달하는 것, 또는 표적 항원의 단백질 구멍 내에 결합하는 것과 같은 용이한 생리학적 특징을 부여한다. 안정적인 백본 및 하나 또는 그 이상의 가변적인 루프를 갖는 단백질이 일반적이고, 여기서 루프의 아미노산 서열 또는 루프는 표적 항원에 결합하는 항원-결합 사이트를 생성하기 위해 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이된다. 이러한 단백질들은 황색포도상구균(S. aureus) 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린(transferrin), 테트라넥틴(tetranectin), 피브로넥틴(fibronectin)(예를 들면, 10번째 피브로넥틴 타입 3 도메인 이용), 리포칼린(lipocalins)뿐만 아니라 감마-크리스탈린(gamma-crystalline) 및 다른 Affilin™ 스캐폴드(Scil Proteins, Halle, 독일)를 포함한다. 다른 접근의 예는 분자 내 이황화 결합을 가지고 있는 사이클로티드-스몰 단백질(cyclotides-small protein), 마이크로단백질(microprotein)(예를 들면, VersabodiesTM, Amunix Inc., Mountain View, CA, 미국) 및 앤키린 반복 단백질(ankyrin repeat protein)(DARPins, 예를 들면, Molecular Partners AG, Zurich-Schlieren, 스위스)에 기초하고 있는 합성 마이크로바디를 포함한다. 이런 단백질은 또한 예를 들면, 면역-도메인(immono-domains)(예를 들면, 미국 특허공보 Nos. 2003/08260 및 2003/157561를 참조하라)과 같은 작고, 조작된 단백질 도메인을 포함한다. 면역-도메인은 항체의 적어도 하나의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)를 포함한다.

IL-6a는 예를 들면, 항원에 결합하기 위한 능력에 더하여 다른 기능적 특징의 분자에 전달하기 위한 추가적인 아미노산으로 구성될 수 있다.

어떤 경우에, IL-6a는 탐지가능한 표식을 갖거나, 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소(예를 들면, 펩티딜 결합(peptidyl bond) 또는 링커를 통해)에 결합된다. 예를 들면, IL-6a는 촉매 사이트(catalytic site)(예를 들면, 효소 도메인에서)뿐만 아니라 항원 결합 사이트(예를 들면, IL-6의 사이트 2에 대한 결합 사이트)를 포함할 수 있고, 항원 결합 사이트는 항원에 결합하고, 따라서 IL-6 또는 IL-6/IL-6R 복합체에 대한 촉매 사이트를 표적한다.

어떤 측면에서, 본 발명은 참조 참조항체와 비교하여 변형된, 예를 들면, IL-6a의 생물학적 영향기능이 증가, 감소 또는 제거를 위해 변형된 항체 IL-6a를 포함한다. 한 실시예에서, Fc 부위는 변형되거나, 부모 Fc 도메인은 변형되지 않은 부모와 비교하여 변형된 IL-6a의 약물동력학을 변화시키기 위해 변형된 Fc 도메인과 교체된다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 IgG2 뼈대를 갖기 위해 조작된다. 다른 실시예에서, IgG1 또는 IgG2 뼈대에서 IL-6a는 pH 6.0에서 IL-6a의 결합능력이 증가한 변형된 Fc를 갖고, 부모 또는 다른 참조 IL-6a와 비교하여 pH 7.0에서 결합능력이 많이 변하지 않으며, IL-6a는 부모 또는 다른 참조 IL-6a와 비교하여 증가된 반감기를 갖는다.

어떤 실시예에서, 항체 IL-6a는 보체 결합(complement fixation) 및 보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity)이 증가하도록 변형된다. 다른 측면에서, 상기 항체 IL-6a는 작용세포(effector cell)의 활성화를 위해 참조 항체와 비교하여 항체의 능력을 증가하도록 변형되고, 항체-의존적 세포독성(antibody-dependent cytotoxicity, ADCC)에 참여한다. 어떤 경우에, 본 명세서에 공개된 바와 같이 상기 항체는 활성 작용세포의 그들의 능력 및 항체-의존적 세포독성에 참여를 증가시키기 위해, 및 결합한 보체의 그들의 능력 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여를 증가시키기 위해 모두 변형될 것이다.

어떤 실시예에서, 본 명세서에 공개된 항체는 보체와 결합하기 위한 그들의 능력 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여를 줄이기 위해 변형된다. 다른 실시예에서, 상기 항체는 작용세포를 활성화하기 위한 그들의 능력 및 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여를 줄이기 위해 변형된다. 다른 실시예에서, 본 명세서에서 공개된바와 같이 항체는 작용세포를 활성화하기 위한 그들의 능력 및 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여를 줄이기 위해, 및 보체와 결합하기 위한 그들의 능력 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여를 줄이기 위해 모두 변형될 수 있다.

IL-6a의 투여량의 빈번한 전달을 피하는 것이, 예를 들면, 눈 안으로 주사하여 전달할 때, 일반적으로 유리하다. 상기 특징을 가능하게 하기 위하여, 특정 실시예에서, 본 명세서에서 공개된 바와 같이 IL-6a의 전달의 사이트, 예를 들면, 유리체에서의 반감기는 적어도 4일, 예를 들면, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 또는 적어도 14일이다. 특정 실시예에서, IL-6a의 평균 반감기는 적어도 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 25일, 30일, 40일, 50일, 또는 60일이다. 항체의 반감기를 증가시키는 방법은 예를 들면, 미국특허번호 제 6,277,375호 및 국제공개 번호 WO 1998/23289 및 WO 1997/3461에 서술된 바와 같이 통상의 당업계에 잘 알려져 있다. 어떤 실시예에서, IL-6a의 반감기는 전신의 반감기(systemic half-life), 예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 간, 신장, 또는 다른 조직 또는 체액보다 표적 전달 사이트, 예를 들면, 유리체에서 크다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 용기(container)를 포함하는 제조품(article of manufacture)을 제공한다. 상기 용기는 본 발명에 공개된 바와 같은 IL-6a를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물이 IL-6 관련된 질환의 치료를 위해 치료될 수 있음을 나타내는 부속물(insert) 또는 라벨(label) 패키지를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가물(excipient)로 구성된 조성물에 있어서 IL-6a이다.

어떤 경우에, 본 발명은 본 발명에 공개된 바와 같은 IL-6a를 포함하는 조성물, 및 치료를 필요로하는 개체에 조성물을 투여하기 위한 설명서(instruction)로 구성된 킷트이다.

큰 IL-6가 이상적인 실시예에서, 예를 들면, 전달 사이트 또는 근처에서 IL-6a의 잔류를 증가시키기 위해, 크기는 증가하지만, IL-6a의 기능(예를 들면, IL-6 또는 IL-6/IL-6R 복합체를 위한 IL-6의 결합능력)에는 유의적인 악영향을 미치지 않는 모이어티는 H-6a와 결합할 수 있다. 예를 들면, Fab는 Fab 및 Fc 모이어티를 포함하는 단일 폴리펩타이드로서 발현되도록 유전적으로 조작될 수 있다.

IL-6a를 위해 상대적으로 작은 것이 이상적인 실시예에서, IL-6 항체의 단편, 예를 들면, scFv 또는 Fab 단편이 사용될 수 있다. IgG 항체는 약 150 kD, Fab는 약 50 kD 및 scFv는 약 25 kD 크기이다. 어떤 실시예에서, 본 명세서에서 서술된 바와 같이 IL-6a는 약 50 kD 이하 크기이다. 이와 같은 길항제는, 예를 들면, 50 kD 이하 또는 동일 및 10 kD 이상, 50 kD 이하 또는 동일 및 20 kD 이상, 또는 50 kD 이하 또는 동일 및 25 kD 이상 또는 동일할 수 있다.

어떤 경우에, IL-6 길항제, 예를 들면, 이황화물(disulfides)을 갖는 항체 또는 다른 저해제의 안정성은 변이체 생성에 의해서 개선될 수 있고, 여기서 하나 또는 그 이상의 이황화 다리가 부모 분자보다 더욱 안정하다.

본 명세서에 서술된 특정 IL-6a 분자의 또 다른 이점은 그들의 전달 방법, 전달 사이트, 또는 활성 방법을 위해 적절한 크기를 갖는 효율적인 분자의 유용성일 수 있다. 예를 들면, Fab 구성방식의 IL-6a는 일반적인 적용을 위해 사용될 것이다. 이와 같은 분자의 조작 방법은 본 명세서에 서술되어 있고, 통상의 당업계에 잘 알려져 있다.

징후(indication)/IL-6 관련된 질환

본 발명의 IL-6a로 치료될 수 있는 질환은 증가된 IL-6가 질환의 상태 또는 질환의 상태에 대한 전제조건과 함께 관련된 질환들을 포함한다. 이와 같은 질환은 IL-6에 의해 촉진되는 혈관신생(angiogenesis) 및 염증(inflammation)이 질병 병리학(disease pathology)에 기여하는 것을 포함한다. 이는 일반적인 수준과 비교하여 IL-6가 증가된 질환, 예를 들면 IL-6가 유리체 내에서(예를 들면, 당뇨성 황반 부종(diabetic macular edema), 당뇨 망막증(diabetic retinopathy), 및 포도막염(uveitis)) 또는 눈의 조직 내에서 증가한 질병을 포함한다. 예는 안구 건조증(dry eye syndrome, 포도막염, 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 증식성 당뇨 망막증(proliferative diabetic retinopathy, PDR), 당뇨성 황반부종, 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion, RVO), 시신경 척수염(neuromyelitis optica, NMO)을 포함하나 이에 한정하지 않는 특정 안과 질환을 포함한다. 치료될 수 있는 다른 안구 질환은 각막 이식(corneal transplant), 각막 찰과상(corneal abrasion), 또는 눈의 물리적 손상과 같은 다른 것들과 같은 트라우마(trauma)에 의해 유발되는 것이 포함된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 서술된 IL-6a와 함께 IL-6 관련된 질환을 갖는 개체의 치료를 포함한다. 어떤 실시예에서, 개체의 치료는 또한 개체가 IL-6 관련된 질환을 갖는지 여부, 및 선택적으로 스테로이드 또는 항-VEGF 치료와 같은 다른 비-IL-6 저해제 치료에 대한 저항성인 개체인지 여부를 결정하는 것을 포함한다.

눈, 예를 들면, 유리체와 같이 특정 위치(locus)에서 효과적인 특정 항체-기반 치료의 한가지 문제점은 전신 투여에 의한 결과의 부작용이다. 한 해결법은 본 명세서에 서술된 분자에 의해 예시된 바와 같이 전신의 반대로서 국소로 전달될 수 있는 치료법을 제공하기 위한 것이다. 국소, 예를 들면 유리체로 전달된 어떤 치료법이 다소 전신적으로 나타낼 것이기 때문에 이는 상대적으로 빠른 전신 순환(turnover)을 갖는 분자를 디자인하기 위해 유리하다. 본 발명자들은 이와 같은 분자의 예를 조작하였다; 빠른 전신 순환을 위해 디자인된 IL-6a 항체, 예를 들면, 부모 분자 또는 참조 항체와 비교. 이는 IL-6a의 순환에 매개된 FcRn의 감소를 위해 분자의 FcRn 결합 변형에 의해 동반된다. 이와 같은 조작, 예를 들면, 감소한 FcRn 순환의 추가적인 이점은 IVT 투어에 의한 유리체로부터 항체의 유출(efflux) 감소에 의해 유리체의 잔류가 증가될 수 있다는 것이다. 따라서, 어떤 실시예에서, 낮은 FcRn 결합을 갖는 IL-6a는 투여 빈도가 감소할 수 있다.

당뇨성 황반 부종(DME), 당뇨성 황반 부종은 시력 감소 및 잠재적 시력상실을 유발하는 망막 혈관의 폐색 및 누출을 포함한다. DME의 일반적인 치료법은 스테로이드 또는 항-VEGF 항체의 국소 투여를 포함한다. 그러나, 많은 환자들은 이들 치료법으로 치료하기 어렵다. 당뇨성 황반 부종의 발생은 혈관신생, 염증 및 산화적 스트레스의 요인을 포함한다. IL-6는 저산소증(hypoxia) 및 고혈당에 의해 유도되고, 혈관 염증, 혈관 삼투 및 병리학적 혈관신생을 증가시킬 수 있다. IL-6는 VEGF 발현을 직접적으로 유도할 수 있고, 동물모델에서 맥락막의 신혈관 생성을 촉진시킬 수 있다. DME 환자에서, 눈의 IL-6 수준은 황반 두께 및 병의 심각성과 양의 상관관계가 있다. IL-6 수준은 항-VEGF 민감한(responsive) 환자에서 감소되는 동안 항-VEGF 치료에 실패한 환자에서 증가한다고 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에 서술된 바와 같이 IL-6a의 투여는 항-VEGF 치료법과의 조합으로, 또는 항-VEGF 치료법의 대안으로써 항-VEGF 치료에 반응하지 않는 환자를 포함하는 당뇨병의 치료에 유용하다. IL-6a로의 황반부종(macular edema) 치료는 병을 억제하기 위한 어느 하나의 기전을 완전하게 억제하기 위한 필요성을 제거하여 또한 안전하게 개선될 것이고, 따라서 각각의 사이토카인의 이상적인 생리학적 역할의 일부가 보존된다. 따라서, VEGF 억제와 조합한 국소 IL-6a 치료는 투여 빈도를 감소시키고, 치료의 부작용을 줄일 수 있다.

DME에 있어서, 유리체의 IL-6 수준 및 질병 심각성 및 VEGF 난치성 개체 모두의 사이에는 양의 상관관계가 있다. 따라서, 본 명세서에 서술된 바와 같이 IL-6a는 스테로이드 치료법, 항-VEGF 치료법, 또는 양쪽 모두에 난치성이 있는 DME 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 어떤 경우에, IL-6a는 예를 들면, DME를 치료하기 위해 항-VEGF 치료법 또는 스테로이드 치료법과 병행하여 사용된다.

본 명세서에 서술된 IL-6a는 암, 예를 들면, 전립선암, 백혈병(leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 염증(만성 염증성 증식 질환과 같은) 및 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염(rhematoid arthritis), 캐슬병(Castlemans's disease)(거대 또는 혈관여포양 림프선 증식증(giant or angiofollicular lymph node hyperplasia), 림프 과오종(lymphoid haamartoma), 혈관여포양 림프선 증식증(angiofollicular lymph node hyperplasia)), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis)(다관절 소아 특발성 관절염(polyarticular juvenile idiopathic arthritis) 및 전신 소아 특발성 관절염(systemic juvenile idiopathic arthritis)을 포함), 스틸병(Still's disease)(소아 특발성 관절염 및 성인형 스틸병(adult onset Still's disease)을 포함), 성인형 스틸병, 아밀로이드 A 아밀로이드증(amyloid A amyloidosis), 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 요흔성 부종(pitting edema)과 함께 완화형 혈정 반응 음성 대칭적 활막염(remitting seronegative symmetrical synovitis), 척추관절염(spondyloarthritides), 베쳇병(Behcet's disease)(눈의 징후 치료를 포함), 동맥경화증(atherosclerosis), 건선(psoriasis), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosis), 다발성 근염(polymyositis)(염증성 근육병증), 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis), 후천적 혈우병 A(acquired hemophilia A), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 염증에 의한 빈혈(anemia of inflammation), 및 크론병(Crohn's disease)과 같은 질환의 치료를 위해 또한 사용될 수 있다.

IL_6 길항제는, 특정 신경 질환, 예를 들면, 우울증, 및 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 서술된 IL-6a로 치료될 수 있는 다른 질병은 전신 경화증(systemic sclerosis), 다카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 이식편 대 숙주질환(graft versus host disease), 및 종양괴사인자-수용체-관련 주기성 증후군(TNF-receptor-associated periodic syndrome, TRAPS)을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

투여(dosing)

IL-6 항체 또는 이의 단편은 예를 들면, 비정상적으로 높은 수준의 IL-6를 발현하는 개체(예를 들면, 환자)에 투여될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 1회로 투여될 수 있고, 여러 번 투여될 수 있다. 항체는 예를 들면, 하루에 3회에서 6개월마다 1회까지 또는 그 이상 투여될 것이다. 투여는 하루에 3회, 하루에 2회, 하루에 1회, 이틀에 1회, 삼일에 1회, 일주일에 1회, 2주에 1회, 1달에 1회, 2달에 1회, 3달에 1회 및 6달에 1회와 같이 스케쥴될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 미니펌프(minipump), 또는 주입할 수 있는 서방형 캡슐(slow-release capsule) 또는 항체 또는 이의 단편을 생산할 수 있는 캡슐화된 세포와 같이 다른 경로를 통하여 지속적으로 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 점막(mucosal), 구강(buccal), 비강(intranasal), 흡입(inhalable), 정맥(intravenous), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 비경구(parenteral), 안내(intraocular), 또는 종양내(intratumor) 경로를 통하여 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 1회, 적어도 2회 또는 적어도 증상이 치료, 완화 또는 치유될 때까지의 기간 동안 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 일반적으로 증상이 나타나는 동안 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 상태가 존재하는 한 일반적으로 투여될 것이다. 항체 또는 이의 단편은 본 명세서에서 서술된 바와 같이 약학적 조성물의 부분으로써 일반적으로 투여될 것이다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.1 내지 100 ㎎/㎏, 0.5 내지 50 ㎎/㎏, 1 내지 20 ㎎/㎏, 및 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위이다. 항체 또는 이의 단편의 혈청 농도는 어떤 적절한 방법에 의해서 측정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 화합물의 한 특징은 그들이 상대적으로 드물게 투여, 예를 들면, 1주에 1회, 1주에 2회, 1주에 3회, 4주에 1회, 2주에 1회, 8주에 1회, 12주에 1회, 16주에 1회, 32주에 1회, 1달에 1회, 2달에 1회, 3달에 1회, 또는 6달에 1회가 요구된다는 것이다. 어떤 경우에, 화합물은 필요에 따라 예를 들면, 개체의 상황에 따라 결정된 기본 양으로 투여된다. 상대적으로 드문 투여를 허용하는 본 명세서에서 서술된 IL-6 길항제의 특징은 적어도 일부분에서 IL-6에 결합 후에 낮은 해리속도(off-rate) 및 화합물의 상대적으로 높은 농도를 전달하기 위한 능력에 동반하는 높은 효능의 조합이다.

어떤 경우에, IL-6a는 단일요법(monotherapy)으로 투여된다. 다른 실시예에서, IL-6a는 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 변형한 항관절염에 의한 다른 질환과 병용하여 투여된다.

항체의 생성(Generation of antibodies)

항체 IL-6a 또는 유도체 또는 이들의 단편은 단일클론 항체 방법론(예를 들면, Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495를 참조)과 같이 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 단일클론 항체를 생산하기 위한 다른 기술에는 B 림프구의 바이러스(viral) 또는 종양 형질전환(transformation)과 같은 방법을 또한 사용할 수 있다.

키메릭(chimeric) 또는 인간화 항체는 통상의 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 제조된 쥣과의 단일클론 항체의 서열에 기반하여 제조될 수 있다. 경쇄 및 중쇄 면역글로불린을 암호화하고 있는 DNA는 관심의 쥣과 융합세포로부터 수득할 수 있고, 표준 분자생물학 기술을 사용하여 비-쥣과(예를 들면, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하기 위해 조작된다. 예를 들면, 키메릭 항체를 제조하기 위하여, 쥣과 가변영역은 통상의 기술분야에 알려진 방법(예를 들면, 미국특허번호 4,816,567호)을 사용하여 인간 불변영역과 연결될 수 있다. 인간화된 항체의 제조를 위하여, 쥣과 CDR 영역이 통상의 기술분야에 알려진 방법(예를 들면, 미국특허번호 제 5,225,539호 및 제 5,530,101호; 제 5,585,089호; 제 5,693,762호; 및 제 6,180,370호)을 사용하여 인간 뼈대로 삽입될 수 있다.

실시예에서, 본 명세서에 서술된 IL-6a(예를 들면, 항-IL-6 항체 또는 유도체 또는 이의 단편)는 인간 IL-6에 특이적으로 결합할 수 있다. 실시예에서, IL-6a는 IL-6의 사이트 2(예를 들면, 인간 IL-6의 사이트 2)에 특이적으로 결합할 수 있다.

어떤 실시예에서, IL-6a 항체는 인간 단일클론 항체이다. 상기 항체는 마우스 시스템보다 인간 면역 시스템의 부분을 포함하는 유전자 변형(transgenic) 또는 염색체 변형(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 상기 유전자 변형 및 염색체 변형 마우스는 각각 HuMAb Mouse^® 및 KM Mouse^®로 본 명세서에서 언급되는 마우스를 포함하고, 전체적으로 "인간 Ig 마우스"로 본 명세서에서 언급된다(예를 들면, 미국특허번호 제 5,545,806호; 제 5,569,825호; 제 5,625,126호; 제 5,633,425호; 제 5,789,650호; 제 5,877,397호; 제 5,661,016호; 제 5,814,318호; 제 5,874,299호; 및 제 5,770,429호; 미국특허번호 제 5,545,807호; PCT공개번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 PCT 공개번호 제 WO 01/14424).

또 다른 측면에서, 인간 항-IL-6 항체는 인간 중쇄 트랜스 유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 운반하는 마우스와 같이, 트랜스유전자(transgene) 및 트랜스염색체(transchromosome)에 인간 면역글로불린 서열을 운반하는 마우스을 사용하여 형성시킬 수 있다. 이와 같은 마우스는 PCT 공개번호 제 WO 02/43478에 상세하게 서술되어 있다.

인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 다른 유전자 변형 동물 시스템은 당업계에서 유용하고, 항체 IL-6a를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 선택가능한 유전자 변형 시스템은 Xenomouse™(Abgenix, Inc.)가 사용될 수 있다고 연급되었다; 이와 같은 마우스는 예를 들면, 미국특허번호 제 5,939,598호; 제 6,075,181호; 제 6,114,598호; 제 6,150,584호; 및 제 6,162,963호에 서술되어 있다.

게다가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 염색체 변형 동물 시스템은 당업계에서 유용하고, 항체 IL-6a를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 모두를 운반하는 마우스는 Tomizuka et al.(2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:722-727) 서술되어 있다. 인간 단일클론항체는 인간 면역세포에 인간 항체 반응이 면역화(immunization)와 같이 재구성된 SOD 마우스를 사용하여 또한 제조될 수 있다. 상기 마우스는 예를 들면, 미국특허번호 제 5,476,996호 및 제 5,698,767호에 서술되어 있다.

파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)

어떤 경우에, 항체 IL-6a 또는 유도체 또는 이의 단편은 파지를 사용한 인간 항체 라이브러리 합성, IL-6, 예를 들면, 인간 IL-6, 도는 이의 단편으로 라이브러리 스크리닝, IL-6에 결합하는 파지의 분리, 및 파지로부터의 항체 수득을 포함하는 방법으로 생산된다.

재조합 인간 항체 IL-6a는 또한 재조합 조합 항체 라이브러리 스크리닝에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 라이브러리는 B 세포에서 분리한 mRNA에서 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 만들어진 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 이와 같은 라이브러리의 제조 및 스크리닝을 위한 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카달로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurtZAP™ phage display kit, 카달로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리의 제작 및 스크리닝에 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약들이 통상의 기술분야에 잘 알려져 있고(예를 들면, 미국 특허 제 5,223,409; PCT 공개번호 제 WO 92/18619, 제 WO 91/17271, 제 WO 92/20791, 제 WO 92/15679, 제 WO 93/01288, 제 WO 92/01047, 제 WO 92/09690; Fuchs 등., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay 등., Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse 등., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty 등, Nature 348:552-554 (1990); Griffiths 등, EMBO J 12:725-734 (1993); Hawkins 등, J Mol Biol 226:889-896 (1992); Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991); Gram 등., Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garrad 등, Biotechnology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom 등., Nuc Acid Res 19:4133-4137 (1991); 및 Barbas 등., Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982 (1991)), 모두 본 명세서에 참조로 인용되어 있다.

원하는 특성을 갖는 인간 IL-6 항체를 분리 및 생산하는 예로, 본 명세서에 참조로 인용된 PCT 공개번호 WO 93/06213에 기재된 에피토프 임프린팅 방법(epitope imprinting method)을 사용하여 IL-6에 대해 유사한 결합 활성을 갖는 선택된 인간 중쇄 및 경쇄 사슬 서열을 사용하기 위한 것이 첫 번째이다. 본 방법에 사용된 항체 라이브러리는 일반적으로 본 명세서에 참조로 인용된 PCT 공개번호 WO 92/01047; McCafferty 등, Nature 348:552-554(1990); 및 Griffiths 등., EMBO J 12:725-734(1993)에 서술된 방법으로 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리이다.

초기 인간 VL 및 VH 도메인이 선택되면, "믹스 앤드 매치(mix and match)" 실험이 수행되었고, 여기서 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택하기 위하여 IL-6 결합을 위해 초기에 선택된 VL 및 VH 부분의 다른 쌍을 스크리닝하였다. IL-6a의 원하는 특징을 선택하기 위하여, 선택된 쌍의 VL 및/또는 VH 부분은 무작위로 돌연변이될 수 있다. 이러한 시험관 내에서의 친화도 성숙(affinity maturation)은 예를 들면, 선택된 VH 및 VL 도메인의 하나 또는 모두의 CDR에 상보적인 PCR 프라이머(primers)를 사용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭하여 달성될 수 있으며, 여기서 프라이머는 특정 위치에 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물을 포함하므로, ㄱ결과의 PCR 생산물은 VH 및/또는 VL에 무작위 돌연변이가 도입된 VH 및 VL 부분을 암호화한다. 상기 무작위 돌연변이된 VH 및 VL 부분은 IL-6, 예를 들면, IL-6의 사이트 2에 결합하기 위해 재스크리닝될 수 있다.

재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 항체 IL-6a를 스크리닝 및 분리한 뒤, 선택된 항체를 암호화하는 핵산은 디스플레이 패키지(display package)(예를 들면, 파지 게놈으로부터)로부터 복구될 수 있고, 통상의 기술분야에 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 다른 발현벡터에 서브클로닝될 수 있다. 이와 같은 항체는 본 명세서에서 서술된 것과 같이 항체 단편을 생산하기 위해 추가적으로 조작될 수 있다.

약물동력학(pharmacokinetics, PK)

PK를 위한 시험법은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 동물의 사용을 필요로 하는 결정, 예를 들면, PK의 결정의 한가지 어려움은 인간 IL-6가 이와 같은 시험에 일반적으로 사용되는 어떤 동물과 50% 미만의 상동성(homology)을 갖는 인간 IL-6이다. PK의 한 방법은 그러므로, 인간 IL-6를 발현하는 유전자 변형 마우스를 사용하기 위한 것이다. 어떤 실시예에서, 비-인간 영장류(primate)가 PK를 결정하기 위해 사용되었다.

어떤 실시예에서, 항-IL-6 항체는 이의 PK를 변화시키기 위해, 예를 들면, FcRn 결합의 pH 민감성을 변화시켜서 돌연변이된다. 이와 같은 돌연변이 수득의 방법은 실시예에 서술되어있다. 따라서, 어떤 실시예에서, IL-6a는 부모 IL-6a 또는 참조 분자와 비교하여 변형된 전신 PK를 갖는다. 어떤 경우에, PK는 변하지 않고, 유리체 내에서 개선된다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 유리체에서 같거나 증가된 PK(예를 들면, 증가된 반감기)를 갖고, 전신 PK(예를 들면, 혈액, 혈장, 림프, 혈청, 간, 신장, 다른 조직, 또는 다른 체액과 같은 순환 체액에서 분석됨)가 부모 IL-6a 또는 참조 분자와 비교하여 감소되었다.

IL-6 길항제를 시험을 위한 모델(Models for testing IL-6 antagonist)

IL-6 길항제는 IL-6 연관된 전달, 구체적으로 치료의 효과 및 이로운 IL-6 특성에의 제한된 해로운 영향을 위해 질환의 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들면, 포도막염은 완전 프로인트 항원보강제(complete Freund's adjuvant, CFA) 면역화에 있어서, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(interphotoreceptor retinoid-binding protein)을 사용하여 랫트 또는 마우스의 실험적인 자가면역 포도막염 모델(Caspi, Invest Ophthalmol Vis Sci 52:1873; Agarwal 등., 900:443-69, 2012)에서 시험될 수 있다. 다른 모델은 수지상 세포 유도성 포도막염(dendritic cell-induced uveitis), 배양된 작용 T 세포의 입양 전송(adoptive transfer), IRBP TCR Tg 마우스에서 자연적인 EAU, 내독소 유도된 포도막염(endotoxin-induced uveitis), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveoretinitis)을 위해 통상의 기술분야에 잘 알려진 것을 포함한다(Haruta 등, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:3264 (2011); Yoshimura 등, Rheumatology 48:347-354 (2009)). IL-6a 질환의 영향을 시험하기 위해 사용될 수 있는 다른 모델 시스템은, 예를 들면, 맥락막 신혈관 형성(choroidal neovascularization, CNV) 모델(Izumi-Nagai 등., Am J Pathol 170:6 (2007); Krzystolik 등, Arch Ophthalmol 120:338 (2002)) 및 Kern 등(Animal Models Of Diabetic Complications Consortium(POl DK57733) , Update Report(September 2001 - January 2004)에 서술된 바와 같이 당뇨병 모델이 있다. 류마티스성 관절염에 있어서 IL-6a 시험을 위해 유용한 동물 모델은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, Asquith 등.(Eur J Immunol 39:2040-4(2009)) 및 Kollias 등.(Ann Rheum Dis 70:1357-62 (2011)을 참조하라.

병용 요법(Combination therapies)

어떤 실시예에서, IL-6a는 2차 치료상의 독립체와 병용하여 투여된다. 예를 들면, IL-6a는 라니비주맙(ranibizumab)과 같은 VEGF 저해제를 포함하는 치료 요법에 있어서 투여된다. 어떤 실시예에서, IL-6a는 항-PDGF 항체 또는 항-PDGF 수용체 항체(예를 들면, 이마티닙(imatinib)과 같은 PDGF 저해제를 포함하는 치료 요법에 있어서 투여된다.

IL-6 길항제의 전달(Delivery of IL-6 antagonist)

IL-6 길항제는 IL-6 억제를 타겟으로 하는 세포 또는 조직과 직접 접촉 또는 근처에서 국부적으로 전달될 수 있다. 이와 같은 전달 방법의 비-제한적인 예는 IL-6 길항제를 포함하는 물질(substance)의 주사(injection), 주입(infusion) 또는 피하주입(implantation)을 포함한다.

어떤 실시예에서, IL-6a 조성물은 안과 제형(ophthalmic formation)으로써 투여된다. 상기 방법은 IL-6a 조성물 및 안과적으로 허용가능한 담체(ophthalmically acceptable carrier)의 투여로 구성될 수 있다. 어떤 실시예에서, 안과 제형은 액체, 반-고체, 부속물(insert), 필름(film), 마이크로입자(microplate), 또는 나노입자(nanoplate)이다.

어떤 실시예에서, IL-6a 조성물은 국부투여, 예를 들면, 눈을 위해 제형화된다. 국부 제형은 액체 또는 반-고체일 수 있고, 예를 들면, 국부 제형은 수용성 용액, 수용성 현탁액, 연고(ointment) 또는 젤을 포함할 수 있다. 안과의 IL-6a 제형은 눈의 전방, 상안검 아래, 하안검 및 쿨데삭(cul-de-sac)에 국부적으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 안과 제형은 살균된다. IL-6a 안과 제형은 안과 제형의 제조를 위해 하나 또는 그 이상의 약학적 첨가제를 포함할 수 있다. 이와 같은 첨가제의 예는 보존제, 완충제, 킬레이팅제, 항산화제 및 삼투압 조절용 염이 있다. 연고 및 현탁액을 모두 포함하는 안과 제형은 일반적으로 선택된 투여 경로를 위해 적절한 점성(viscosity)을 갖는다. 어떤 실시예에서, 안과 제형은 약 1,000 내지 약 30,000 센티포아즈(centipoise)의 점성을 갖는다.

어떤 실시예에서, 제형은 중합체(polymer)로 구성되는 액체 제형이다. 이와 같은 중합체는 생체이용률(bioavailability)을 개선하고, 점성을 증가하며, 또는 액체 제형의 눈에서의 배출을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 중합체는 Wagh 등.(Asian J Pharm, 2:12-17, 2008)에 서술된 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 비-제한의 예에서, 중합체는 히알루로나제 나트륨(sodium hyaluronase), 키토산(chitosan), 사이클로덱스트린(cyclodextrin)(예를 들면, 하이드록시프로필-P-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-P-cyclodextrin)), 폴리갈락트론산(polygalactoronic acid),자일로글루칸(xyloglucan), 잔탄 검(xanthan gum), 젤란 검(gellan gum), 티오머(thiomer), 폴리(오르소 에스터(ortho ester))(예를 들면, Einmahl, Adv Drug Deliv Rev 53:45-73, 2001), 또는 타마린드씨 다당체(tamarind seed polysaccharide)(예를 들면, Ghelardi 등, Antimicrob Agents Chemother 48:3396-3401, 2004)이다.

어떤 실시예에서, 안과 전달을 위한 IL-6a 조성물로 구성되어 있는 제형은 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 보강제, 완충제, 항산화제, 긴장성 조정제(tonicity adjusters), 방부제(예를 들면, EDTA, 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride, BAK), 염화나트륨(sodium chloride), 염화퍼보네이트(sodium perbonate), 폴리쿼터늄-1(polyquaterium-1)), 두께 또는 점성 변형제(예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 하이드록시메틸 셀룰로오스(hydroxymethyl cellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 글라이콜 400(glycol 400), 프로필렌 글라이콜 하이드록시메틸 셀룰로오스(propylene glycol hydroxymethyl cellulose), 하이드록시프로필-구아(hydroxpropyl-guar), 히알루론산(hyaluronic acid), 및 하이드록시프로필 셀룰로오스(and hydroxypropyl cellulose)) 및 이와 같은 것을 포함할 수 있다. 제형에 있어서 첨가제는 염화나트륨(sodium chloride), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 소르빈산(sorbic acid), 메틸 파라벤(methyl paraben), 프로필파라벤(propyl paraben), 클로로헥시딘(chlorhexidine), 피마자유(castor oil), 및 과붕산나트륨(sodium perborate)을 포함할 것이나, 이에 한정하지 않는다.

어떤 실시예여서, 정제된 또는 탈이온화된 물이 조성물에 사용된다. pH는 약 5.0 내지 8.5의 범위내에서, 예를 들면, pH 7.0, pH 7.3, pH, 7.4, 또는 pH 7.5에서 어떤 생리학적 및 안과적으로 허용가능한 pH 조절용 산, 염기 또는 완충용액을 첨가하여 조절할 수 있다. 산의 안과적으로 허용가능한 예는 아세트산( acetic), 붕산(boric), 구연산(citric), 젖산(lactic), 인산(phosphoric), 염산(hydrochloric), 및 이와 같은 것을 포함하고, 염기의 예는 수산화나트륨(sodium hydroxide), 인산화나트륨(sodium phosphate), 붕산나트륨(sodium borate), 구연산나트륨(sodium citrate), 아세트산나트륨(sodium acetate), 젖산나트륨(sodium lactate), 트로메타민(tromethamine), 트리스하이드록시메틸아미노-메탄(trishydroxymethylamino-methane), 및 이와 같은 것을 포함한다. 제형에 사용될 수 있는 염 및 완충용액의 예는 구연산(citrate)/덱스트로스(dextrose), 탄산수소나트륨, 염화암모늄(ammonium chloride) 및 상기 서술한 산 및 염기의 혼합물을 포함한다.

어떤 실시예에서, 안과 조성물의 삼투압(osmotic pressure)은 약 10 밀리오스몰랄(milliosmolar, mOsM) 내지 400 밀리오스몰랄, 예를 들면, 200 내지 400 mOsM, 또는 220 내지 370 mOsM일 것이다. 일반적으로, 삼투압은 생리학적 및 안과적으로 허용가능한 염 또는 첨가제를 사용하여 조절할 수 있다.

어떤 실시예에서, 염화나트륨은 제형제 포함되고, 예를 들면, 염화나트륨은 조성물의 전체 중량 대비 0.01% 내지 1% 중량부, 또는 0.05% 내지 0.45% 중량부 범위의 농도에서 제형으로 존재한다. 칼륨(potassium), 암모늄(ammonium) 및 이와 같은 것의 양이온 및 염화물(chloride), 구연산염(citrate), 아스코르브산염(ascorbate), 붕산염(borate), 인산염(phosphate), 탄산수소염(bicarbonate), 황산염(sulfate), 티오황산염(thiosulfate), 중황산염(bisulfate), 황화수소나트륨(sodium bisulfate), 황산나트륨(ammonium sulfate) 및 이와 같은 것으로 만들어지는 하나 또는 그 이상의 염의 동등한 양은 또한 이상적인 범위 내에서 오스몰랄리티(osmolalities)를 달성하기 위해 염화나트륨을 추가 또는 대신하여 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 만니톨(mannitol), 덱스트로오스(dextrose), 소르비톨(sorbitol), 포도당(glucose), 및 이와 같은 당이 오스모랄리티를 조절하기 위해 또한 사용된다.

어떤 실시에에서, 상기 방법은 안구의 외부 표면과 접촉하는 제제(agent)의 저장소(depot)를 형성 또는 공급하는 것을 포함한다. 저장소는 눈물 또는 다른 안구 청소 기전(eye clearance mechanism)에 의해 빠르게 제거되지 않는 제재의 소스(source)로 나타낸다. 이는 단일 적용에 의한 안구 외부 표면의 체액에서 존재하는 제제의 높은 용도를 지속적으로 유지하는 것을 허용한다. 어떤 실시예에서, 저장소는 8 시간 또는 그 이상동안 유지된다. 어떤 실시예에서, 안과 저장소 제형은 수용성 폴리머 현탁액(aqueous polymeric suspensions), 연고(ointments), 및 고체 부속물(solid inserts)을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

어떤 실시예에서, 반-고체 조성물은 일반적으로, 온도, pH 또는 전해액 농도의 변화와 함께 생성되는 점성의 증가를 위한 액제 제형에 있어서 폴리머의 존재에 의해 안구에 적용에 근거하여 점성이 증가하는 액체 제형이다. 중합체는, 예를 들면, 셀룰로오스아세토프탈레이트(celluloseacetophthalate), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 젤란검(gellan gum), 히알루론산분해효소(hyaluronase), 키토산(chitosan), 알긴산염(salts of alginic acid)(예를 들면, 알긴산나트륨(sodium alginate)), 또는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 및 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)의 공중합체(block copolymer)(예를 들면, 플루로닉(Pluronic®), BASF; 폴록사머(poloxamer))일 수 있다. 어떤 실시예에서, 폴리아크릴산(polyacrylic acid)은 교차결합된(cross-linked) 아크릴산(acrylic acid)(예를 들면, 카보폴(Carbopol®))이다. 어떤 실시예에서, 반-고체 조성물은 카보폴(carbopol) 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 공중합체의 혼합물; 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose) 및 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose)의 혼합물; 또는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 공중합체의 혼합물로 구성된다.

어떤 실시예에서, 안과 제형을 함유하는 IL-6a는 연고 또는 젤이다. 어떤 실시예에서, 안구 제형은 오일-기반 전달 운반체이다. 예를 들면, 상기 제형은 IL-6a 조성물이 첨가된(예를 들면 0.1 내지 20%) 석유(petroleum) 또는 라놀린(lanolin) 베이스, 및 첨가제로 구성될 수 있다. 일반적인 베이스는 미네랄 오일(mineral oil), 바셀린(petrolatum) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 상기 연고는 아래 눈꺼풀에 띠(ribbon)로서 적용될 수 있다.

어떤 경우에, 안과 조성물은 안과 삽입제(ophthalmic insert)이다. 예를 들면, 안과 삽입제는 치료 제제에 노출 후에도 멸균에 대해 생물학적 삽입, 부드러운, 생흡수성(bierodible), 점탄성(viscoelastic), 안정성, 기균(air borne bacteria)으로부터의 감염에 대한 내성, 생흡수성, 생체적합성(biocompatible), 및/또는 점탄성을 나타낸다. 어떤 실시예에서, 상기 삽입제는 안과적으로 허용가능한 매트릭스(matrix), 예를 들면, 중합체 매트릭스를 포함한다. 상기 매트릭스는 일반적으로 중합체이고, IL-6a 조성물은 매트릭스 내에서 또는 중합체 매트릭스에 결합하여 확산된다. 어떤 실시예에서, 제제는 공유결합의 용해 또는 가수분해를 통해서 매트릭스로부터 천천히 방출된다. 어떤 경우에, 상기 중합체는 생흡수성(bioerodible)(수용성)이고, 이의 용해율(dissolution rate)은 여기에 확산된 제제의 방출률을 조절할 수 있다. 다른 형태에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 가수분해와 같은 것에 의해 분해되고, 이에 의해 결합된 제제가 방출되며, 여기에 확산되는 생분해성(biodegradable) 중합체이다. 추가적인 실시예에서, 매트릭스 및 제제는 추가적인 방출 조절을 위해 추가적인 중합체의 코팅으로 둘러싸일 수 있다. 어떤 실시예에서, 부속물은 폴리카프로락톤(polycaprolactone,PCL), 에틸렌/비닐 아세테이트 공중합체(ethylene/vinyl acetate copolymer, EVA), 폴리알킬 시아노아크릴레이트(polyalkyl cyanoacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 나일론(a nylon), 또는 폴리(디엘-락티드-코글리콜리드)(poly(dl-lactide-co-glycolide)), PLGA), 또는 이들의 공중합체와 같은 생분해성 중합체로 구성된다. 어떤 경우에, 제제는 매트릭스 물질 안으로 확산되고, 중합체화 이전의 매트릭스 물질을 제조하기 위해 사용된 단량체 조성물 중에 확산된다. 어떤 실시예에서, 제제의 양은 약 0.1 내지 약 50%, 또는 약 2 내지 약 20%이다. 생분해성 또는 생흡수성 중합체 매트릭스는 눈으로부터 제거될 필요가 없는 사용된 삽입제로 사용될 수 있다. 생분해성 또는 생흡수성 중합체는 분해되거나, 용해되며, 제제가 방출된다.

추가적인 실시예에서, 안과 삽입제는 본 명세서에 전체가 참조로 삽입되어 있는 Wagh 등, "Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems", Asian J. Pharm., pages 12-17(January 2008)에 서술된 중합체를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 삽입제는 폴리비닐피로리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 아크릴레이트(acrylate) 또는 메타크릴레이트(methacrylate) 중합체 또는 공중합체(예를 들면, 롬(Rhon) 또는 데구싸로부터의 중합체의 Eudragit® 패밀리), 하이드록시메틸 셀룰로오스(hydroxymethyl cellulose), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리(아미도아민) 덴드리머(poly(amidoamine) dendrimers), 폴리(디메틸실록산)(poly(dimethylsiloxane)), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리(락티드-코-글리코리드)(poly(lactide-co-glycolide)), 폴리(2-하이드록시에틸메타아크릴레이트)(poly(2-hydroxyethylmethacrylate)), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 또는 폴리(프로필렌 푸마레이트)(poly(propylene fumarate))로부터 선택된다. 어떤 실시예에서, 상기 삽입제는 Gelfoam®로 구성된다. 어떤 실시예에서, 상기 삽입제는 450 kDa-시스테인 결합체(conjugate)의 폴리아크릴산이다.

삽입제는 IL-6a 조성물 및 외부 튜브(outer tube)(예를 들면, 미국공개특허 제 20040009222호에 서술된 바와 같이)를 포함하는 코어(core)로 구성될 수 있다. 어떤 경우에, 외부 튜브는 약물에 대해 투과성, 반-투과성, 또는 불투과성일 수 있다. 어떤 실시에에서, 상기 코어는 IL-6a 조성물 방출의 비율에 유의적인 영향을 나타내지 않는 중합체 매트릭스를 포함한다. 어떤 경우에, 코어의 외부 튜브, 중합체, 또는 이들 모두는 생흡수성이다. 공압출된 산물은 약물 전달 장치안으로 분절될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 장치는 코팅되어 있지 않아, 각각의 끝은 열려있거나, 장치는 예를 들면, IL-6a 조성물에 투과성, IL-6a 조성물에 반-투과성, 또는 생흡수성을 나타내는 층(layer)로 코팅된다. 특정 실시예에서, IL-6a 조성물 및 적어도 하나의 중합체는 분말(powder) 형태로 혼합된다.

어떤 실시예에서, 안과 조성물은 안과 필름이다. 이와 같은 필름으로 적합한 중합체는 Wagh, 등.(상기와 같이)에 서술된 바와 같은 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 상기 필름은 소프트 콘택트렌즈, 예를 들면, 에틸렌글라이콜 디메틸아크릴레이트(ethyleneglycol dimethacrylate)와 교차결합된 N,N-디에틸아크릴아마이드(N-diethylacrylamide) 및 메타크릴산(methacrylic acid)의 공중합체로 구성된 렌즈이다.

특정 실시예에서, IL-6a는 튜브로 된 형태이고, 분절될 것인 삽입체이다.

어떤 실시예에서, IL-6a 조성물은 과립(granular) 또는 미립자 형태(particulate form)인 IL-6a 조성물과 같은 중합체 매트릭스에서 코팅되거나, 확산되는 치료학적으로 유효한 양으로 제형화된다. 어떤 실시예에서, IL-6a 조성물은 매트릭스 내 또는 안에서 용해한 과립으로부터 약물로써 방출되고, 매트릭스를 통해 분산되며, 주변의 생리학적 체액 안으로 방출된다. 어떤 실시예에서, 방출의 속도는 매트릭스 내로의 과립/미립자로부터 IL-6a 조성물의 용해율에 의해 일차적으로 제한된다; 매트릭스를 통해 분산되는 단계 및 주변의 체액으로 확산은 일차적으로 방출-속도-제한(release-rate-limiting)을 받지 않는다. 특정 실시예에서, 중합체 매트릭스는 비-생흡수성이고, 다른 실시예에서 이는 생흡수성이다. 바람직한 비-생흡수성 중합체 매트릭스는 폴리우레탄(polyurethane), 폴리실리콘(polysilicone), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)(poly(ethylene-co-vinyl acetate), EVA), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 및 유도체 및 이들의 공중합체로부터 형성될 수 있다. 바람직한 생흡수성 중합체 매트릭스는 폴리안하이드리드(polyanhydride), 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리오르소에스터(polyorthoester), 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 및 유도체 및 이들의 공중합체로부터 형성될 수 있다.

어떤 경우에, IL-6a 조성물은 콜라겐 물질(collagenous material)로 제형화된다. 예를 들면, 삽입제는 수용성 안과 약물 삽입제(예를 들면, 약물 전달을 위해 위쪽 결막낭(conjuctival sac)에 도입될 수 있는 중합체 계란형(oval) 필름; 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate)로 만들어진 타원형의 OCUSERT®(Alza에 의해 개발된 필로카프핀 안구 치료 시스템(pilocarpine ocular therapeutic system)); 셀룰로오스로 만들어진 막대 모양 삽입제, Lacrisert®; 폴리비닐 알코올로 만들어진 새로운 안과 약물 전달 시스템(New Ophthalmic Drug System, NODS); 또는 Fabrizio(Adv Drug Deliv Rev 16: 95-106, 1998)에 서술된 바와 같은 부속물일 수 있다. 어떤 경우에, 상기 부속물은 콜라겐, 젤라틴, 또는 중합체로 구성될 수 있고, 여기서 중합체는 폴리카프로락톤(PCL), 에틸렌/비닐 아세테이트 공중합체(EVA), 폴리알킬 시아노아크릴레이트(polyalkyl cyanoacrylate), 폴리우레탄(polyurethane), 나일론(nylon), 또는 폴리(디엘-락티드-코글리콜리드)(PLGA), 또는 이들의 공중합체로부터 선택된다. 어떤 경우에, 상기 삽입제는 윗눈꺼풀 아래에 이식된다. 어떤 경우에, 상기 삽입제는 눈의 뒤쪽, 맥락막 공간(choroidal space), 또는 공막(sclera)에 이식된다. 어떤 경우에, 삽입제는 유리체강내(intravitreally) 또는 하위-레티놀(sub-retinally)에 이식된다. 투여 방법 및 이들의 제조를 위한 기술은 본 명세서에 전체가 참조로 삽입되어 있는 Remington's: The Practice of Science of Pharmacy, 20 edition(Lippincott Williams & Silkins, 2006)에 기재되어 있다.

다른 실시예에서, IL-6a 조성물을 포함하는 부속물은 눈의 유리체에 제제의 지속적인 방출을 제공한다. 본 명세서에 사용된 '지속적인 방출(sustained release)'은 조성물의 조절된 방식에서 시간이 길어진 제제의 방출을 의미한다. 어떤 실시예에서, 삽입제는 비율로 제제가 방출되고, 이와 같은 수용성 제제 농도는 방출동안 유리체의 제제 농도보다 낮게 유지된다. 어떤 실시예에서, 수용성 제제의 농도는 약 0.002 ㎍/㎖ 내지 약 0.01 ㎍/㎖ 또는 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 약 0.05 ㎍/㎖, 또는 0.05 ㎍/㎖ 미만이다. 어떤 실시예에서, 상기 제제는 약 1 ㎍/일 내지 약 50 ㎍/일, 또는 약 1 ㎍/일 내지 약 10 ㎍/일의 속도로 방출된다. 어떤 실시예에서, 상기 삽입제는 상기 서술된, 예를 들면, 플루오시놀론 아세토나이트(fluocinolone acetonide)(안과 삽입제 Retisert®에서 찾을 수 있는 것과 같은)와같은 추가적인 치료학적 제제를 추가적으로 포함한다.

어떤 실시예에서, 안과 조성물은 마이크로스피어(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle)로 구성된다. 어떤 실시예에서, 마이크로스피어는 젤라틴으로 구성된다. 어떤 실시예에서, 마이크로스피어는 눈의 뒤쪽 부분, 맥락막 공간, 공막, 유리체강내 또는 하위-레티놀에 주입된다. 어떤 실시예에서, 마이크로스피어 또는 나노입자는 Wagh, et al.(Asian J Pharm 2:12-17, 2008)에 서술된 중합체를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 상기 중합체는 키토산, 폴리아크릴산(polyacrylic acid)과 같은 폴리카르복실산(polycarboxylic acid), 알부민(albumin) 입자, 히알루론산 에스터(hyaluronic acid ester), 폴리이타코닉산(polyitaconic acid), 폴리(부틸)시아노아크릴레이트(poly(butyl)cyanoacrylate), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리(이소부틸)카프로락톤(poly(isobutyl)caprolacton), 폴리(락틴산-공-글리콜산)(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 또는 폴리(락틱산)이다. 어떤 실시예에서, 마이크로스피어 또는 나노입자는 고체 지질 입자로 구성된다.

어떤 실시예에서, IL-6a 조성물은 이온-교환 수지(ion-exchange resin)로 구성된다. 어떤 실시예에서, 상기 이온-교환 수지는 무기물의 제올라이트(zeolite) 또는 합성 유기 수지(synthetic organic resin)이다. 어떤 실시예에서, 상기 이온-교환 수지는 본 발명의 명세서에 전체적으로 참조로 포함되어 있는 상기 Wagh, et al.에 서술된 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 이온-교환 수지는 부분적으로 중성화된 폴리아크릴산(polyacrylic acid)이다.

IL-6a 조성물은 수용성 중합체 현탁액으로 제공될 수 있다. 어떤 실시예에서, IL-6a 조성물 또는 중합체 현탁액 제제는 수용성 배지(예를 들면, 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는)에 현탁된다. 중합체 현탁제제(suspending agent)는 덱스트란(dextran), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피로리돈, 폴리사카라이드 겔(polyssacharide gel), Gelrite®, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose)와 같은 셀룰로오스 중합체, 및 아크릴산(acrylic acid)의 중합체 또는 공중합체와 같은 카복시-포함(carboxy-containing) 중합체뿐만 아니라 다른 중합체 완화제(demulcent)를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시예에서, 중합체 현탁제제는 팽윤성(water swellable), 불수용성(water insoluble) 중합체, 특히 교차결합된 카복시-포함 중합체이다. 어떤 실시예에서, 중합체 현탁제제는 하나 또는 그 이상의 카복시-포함 모노에틸렌성 불포화 단량체(monoethylenically unsaturated monomers)의 총 중량을 기준으로 적어도 약 90% 내지 약 99.9%, 또는 약 95% 내지 약 99.9%로 구성된다. 어떤 실시예에서, 카복시-포함 모노에틸렌성 불포화 단량체는 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴산(methacrylic acid), 에타크릴산(ethacrylic acid), 메틸아크릴산(methylacrylic acid)(크로톤산(crotonic acid)), 시스-. 알파.-메틸크로톤산(methylcrotonic acid)(안젤산(angelic acid)), 트랜스-어-메틸크로톤산(trans-a-methylcrotonic acid)(티글린산(tiglic acid), 어-부틸크로톤산(a-butylcrotonic acid), 알파-페닐아크릴산(alpha-phenylacrylic acid), a-벤질아크릴산(a-benzylacrylic acid), a-사이클로헥실아크릴산(a-cyclohexylacrylic acid), 페닐아크릴산(phenylacrylic acid)(신남산(cinnamic acid)), 쿠마르산(o-하이드록시신남산(coumaric acid(o-hydroxycinnamic acid)), 및 엄베릭산(p-하이드록시쿠마르산)(umbellic acid(p-hydroxycoumaric acid))를 포함한다. 어떤 실시예에서, 중합체는 다기능성 교차결합 제제(polyfunctional corsslinking agent)(예를 들면, 이중기능성(bifunctional) 교차결합 제제)에 의해 교차결합된다. 어떤 실시예에서, 교차결합 제제는 단량체의 총중량에 대하여 약 0.01% 내지 약 5%, 또는 약 0.1% 내지 약 5.0%, 또는 약 0.2% 내지 약 1%의 양을 포함한다. 어떤 실시예에서, 교차결합 제제는 디비닐 글라이콜(divinyl glycol), 2,3-디하이드록시헥사-1,5-디엔(2,3-dihydroxyhexa-1,5-diene), 2,5-디메틸-1,5-헥사디엔(2,5-dimethyl-1,5-hexadiene), 디비닐벤젠(divinylbenzene), N,N-디아릴아크릴아마이드(N,N-diallylacrylamide), N,N-디알리메타크릴아마이드(N,N-diallymethacrylamide)와 같은 비폴리알케닐 폴리에테르(nonpolyalkenyl polyether)이중기능성 교차결합 단량체이고; 폴리알케닐 폴리에테르(polyalkenyl polyether) 교차결합 제제는 예를 들면, 폴리아릴 수크로오스(polyallyl sucrose), 폴리아릴 펜타에리스리톨(polyallyl pentaerythritol), 또는 이와 같은 알케닐 할로겐화물(halide) 또는 이와 같은 적어도 4개의 탄소 원자 및 적어도 3개의 수산기(hydroxyl group)을 포함하는 다가 알콜(polyhydric alcohol)의 에테르화에 의해 제조되는 말단 H₂C=C 그룹을 포함하는 알케닐 에테르(alkenyl ether) 그룹핑(grouping)과 같은 분자당 둘 또는 그 이상의 알케닐 에테르 그룹핑을 포함하며; 불용성 디아크릴레이트(diacrylate) 및 폴리아크릴레이트(polyacrylate) 및 디올(diol) 및 폴리올(polyol) 메타크릴레이트(methacrylate), 디이소시아네이트 하이드록시알킬 아크릴레이트(diisocyanate hydroxyalkyl acrylate) 또는 폴레에테르 디올로부터 유래된 이소시아네이트(isocyanate) 종료된 중합체의 메타크릴레이트 반응 산물, 하이드록시알킬메타크릴레이트, 및 이와 같은 것과 함께의 폴리에테르 디올 또는 폴리실록산(polysiloxane) 디올과 같은 약 400 내지 약 8000의 분자량을 갖는 디올레핀(diolefinic) 비-친수성 대분할구의(macromeric) 교차결합 제제를 포함한다.

어떤 실시예에서, 교차결합된 중합체는 카복시-포함 모노에틸렌성(monoethylenically) 불포화 단량체 또는 단일 모노에틸렌성 불포화 단량체 자체로서의 단량체, 교차결합 제제 또는 제제들 모두로부터 만들어진다. 어떤 실시예에서, 상기 중합체는 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate), 에틸 아크릴레이트(ethyl acrylate), 부틸 아크릴레이트(butyl acrylate), 2-에틸헥실아크릴레이트(2-ethylhexylacrylate), 옥틸 메타크릴레이트(octyl methacrylate), 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(2-hydroxyethylmethacrylate), 3-하이드록시프로필아크릴레이트(3-hydroxypropylacrylate), 등, 비닐 아세테이트(vinyl acetate), N-비닐피롤리돈(N-vinylpyrrolidone), 및 이와 같은(예를 들면, Mueller et al., 미국특허번호 제 4,548,990호) 아크릴 및 메타크릴산 에스터를 포함하는 오직 생리학적 및 안과학적으로 무해한 치환기(substituent)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 비-카복시-포함 모노에틸렌성 불포화 단량체 또는 단량체들에 의해 교체된 카복시-포함 모노에틸렌성 불포화 단량체 또는 단량체들의 무게에 의해 약 40%까지, 및 바람직하게는 중량에 의해 약 0% 내지 약 20%이다. 어떤 실시예에서, 중합체는 폴리카보필(polycarbophil)(Noveon AA-1), Carbopol®, 및 DuraSite®를 포함한다. 어떤 실시예에서, 교차결합된 중합체는 동등한 구형 직경에서 약 50 ㎛을 넘지 않는 건조 입자 크기를 위해 통상적인 자유 라디칼 중합체화 촉매(catalyst)를 사용하여 현탁액 또는 에멀젼(emulsion) 중합체화 단량체에 의해 제조된다. 어떤 실시예에서, 평균 건조 입자 크기는 동등한 구형 직경에서 약 1 내지 약 30 ㎛, 또는 약 3 내지 약 20 ㎛이다. 어떤 실시예에서, 중합체 입자는 큰 중합체 입자를 기계적으로 갈아서 수득된다. 추가적인 실시예에서, 이와 같은 중합체는 약 250,000 내지 약 4,000,000 및 3,000,000,000 내지 4,000,000,000의 분자량을 가질 것이다. 다른 실시예에서, 교차결합된 중합체의 입자는 단순분산(monodisperse)이고, 이는 이들이 주요입자 크기 분포의 ㎛ 밴드(band)내에서 적어도 약 80%, 약 90%, 또는 약 95%의 입자 감소와 같은 입자 크기 분포를 가짐을 의미한다. 추가적인 실시예에서, 단순분산 입자 크기는 ㎛ 이하의 크기에서 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% 이하의 입자 크기를 가짐을 의미한다. 어떤 실시예에서, 수용성 중합체 현탁액은 제제의 약 0.05 내지 약 1%, 약 0.1 내지 약 0.5%, 또는 약 0.1 내지 약 0.5% 및 중합체 현탁제제의 약 0.1 내지 약 10%, 약 0.5 내지 약 6.5%, 약 0.5 내지 약 2.0%, 약 0.5% 내지 약 1.2%, 약 0.6 내지 약 0.9%, 또는 약 0.6 내지 약 0.8%로 구성된다. 비록 단수형으로 언급되도 이는 중합체 현탁제제의 하나 또는 그 이상의 종이 정해진 범위 내에서 떨어지는 총량과 함께 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 불용성의 약하게 교차결합된 중합체 입자, pH, 및 삼투압의 양은 25번 축(spindle) 및 12 rpm에서 13R 작은 샘플 어댑터(adapter)가 갖춰진 브룩필드 디지털 LVT 비스코메터(Brookfield Digital LVT Viscometer)를 사용하여 상온(약 25℃)에서 측정된 바와 같이 서로 및 약 500 내지 100,000 센티포아즈, 및 바람직하게는 약 1,000 내지 약 30,000 또는 약 1,000 내지 약 10,000 센티포아즈의 범위 내에서 점성을 갖는 조성물을 제공하기 위해 교차결합 정도와 상호비교될 수 있다. 어떤 실시예에서, 점성은 약 10 내지 400 센티포아즈, 약 10 내지 200 센티포아즈 또는 약 10 내지 25 센티포아즈이다.

어떤 실시예에서, 수용성 중합체 현탁액은 제형화될 것이고, 그러므로 그들은 눈에 투여되기 전에 눈에서 같거나 상당히 같은 점성을 유지한다. 어떤 실시예에서, 그들은 제형화될 것이고, 그러므로 누액(tear fluid)과 접촉하여 젤라틴이 증가된다. 예를 들면, DuraSite® 또는 다른 유사한 폴리아크릴산-형(polyacrylic acid-type) 중합체를 포함하는 제형이 약 6.7 미만의 pH에서 눈에 투여될 때, 중합체는 높은 pH(약 7)를 가진 이후로 누액과 접촉하여 팽창할 것이다. 이런 젤라틴 또는 젤라틴의 증가는 현탁된 입자의 구속을 초래할 것이고, 그러므로 눈에서 조성물의 체류시간을 연장한다. 어떤 실시예에서, 제제는 시간을 초과하여 용해된 현탁된 입자로써 천천히 방출된다. 어떤 실시예에서, 상기 전달 경로는 환자의 편안함을 증가시키고, 눈 조직과 제제와의 접촉을 증가시키므로써 눈에서 약물 흡수 및 제형의 활성 기간의 연장을 증가시킨다. 이들 약물 전달 시스템에 포함된 제제는 약물 자체 및 이의 물리 형태(physical form)로써 이와같은 요소 의존적인 속도에서 젤로부터 방출될 것이고, 약물 로딩(loading) 및 시스템의 pH뿐만 아니라 존재하는 안구 표면과 호환되는 이온-교환 수지와 같은 어떤 약물 전달 보강제를 연장한다.

어떤 실시예에서, IL-6 길항제는 유전적 전달, 예를 들면, 국부 유전적 전달에 사용하기 위한 목적으로 제공된다. 이와같은 전달은 일과성 발현 시스템(transient expression system), Bluebird Bio(Cambridge, MA)에 의해 제조된 렌티바이러스 전달 시스템과 같은 안정적인(예를 들면, 삽입된) 발현 시스템, 또는 Neurotech(Cumberland, Rhode Island)에 의해 제조된 것들과 같은 세포 공장(cell factory)에 있어서 전달을 통해 전달될 수 있다.

모든 기술적 특징은 이와 같은 특징의 모든 가능한 혼합물에 있어서 각각 혼합될 수 있다.

등가물(Equivalents)

본 발명은 정신(spirit) 또는 이의 기본적인 특징으로부터 출발하지 않은 다른 특징의 형태에 있어서 구현된다. 전술한 실시예는 본 명세서에 서술된 본 발명을 제한하기보다 모든 측면의 묘사로 고려될 것이다.

실시예

하기 비-제한적 예는 본 명세서에서 서술된 본 발명의 실시예를 추가적으로 묘사한다.

실시예 1: 맥락막 신혈관 형성(choroidal neovascularization, CNV) 모델에서 국부 IL-6 차단의 확인

국부 IL-6 차단이 안질환(eye disease), 예를 들면, 당뇨성 황반부종(diabetic macular edema, DME) 또는 습성(wet) AMD의 치료를 위해 효과적인지를 결정하기 위해, 항-IL-6 항체를 맥락막 신혈관 형성을 위한 모델 시스템을 사용하여 국부적으로 투여되었다. 레이저(laser)-유도된 CNV 모델(eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/)은 염증 및 혈관신생을 포함하는 근본적인 DME 병리과정의 다수를 재생산하였다. 연구는 EyeCRO(Oklahoma City, OK)에서 랫트로 수행되었다. 각 그룹의 6마리는 눈 하나당 세 병변을 생산하기 위하여 0일째에 양쪽 레이져 처리를 수행하였다. 3 및 10일째, 다중클론 항-랫트-IL-6 항체(R&D Systems AF506; Minneapolis, MN) 3 ㎍을 유리체내(intravitreal, IVT) 주입에 의해 시험 그룹에 투여되었고, PBS 또는 항-VEGF 다중클론 항체(R&D Systems AF564)가 운반체(vehicle) 및 양성 대조군으로 각각 투여되었다. 생체 내 혈관촬영이 병변부위를 측정하기 위하여 15 및 22일째에 수행되었다. 15 및 22일째 모두 항-IL-6 처리된 그룹은 운반체 대조군과 비교하여 신혈관 형성이 유의적으로 감소하였다. 항-IL-6 처리된 그룹 및 항-VEGF 양성 대조군 사이의 반응에 있어서는 유의적인 차이가 없었다. 도 1은 이와 같은 실험 결과를 나타낸다. 이들 데이타는 IVT로 투여된 IL-6a, 예를 들면, 항-IL-6 항체가 랫트 CNV 모델에서 양성대조군인 항-VEGF와 유사한 수준으로 신혈관 성형을 감소시킬 수 있음을 나타낸다(항-IL-6 대 운반체 대조군을 위한 15일째 p=0.0054 및 22일째 p=0.0005).

이들 데이터는 IL-6의 국부 차단이 혈관 누출, 예를 들면, 황반부종을 포함하는 이와 같은 안질환의 치료에 유용할 수 있음을 나타낸다.

실시예 2: 항체 IL-6 길항체 후보물질

항체 IL-6 길항체 후보물질을 먼저 면역화를 포함하는 과정을 사용하여 개발되었다. 면역화는 연구기관(research organization, CRO)와 접촉하여 발명자의 의도대로 수행되었다. 5마리의 BALB/C 마우스에 1M NaCl과 함께 프로이트 보강제(Freud's adjuvant)를 포함하는 PBS에 80 ㎍ 인간 IL-6(R&D Systems, cat# 206-IL/CF, Minneapolis, MN)를 피하로 주사하였다. 두개의 부스트(boost)가 80 ㎍ 및 50 ㎍ IL-6와 함께 수행되었다. 췌장 세포가 가장 높은 역가(titer) 마우스로부터 모아졌고, 융합세포 형성을 위해 P3x763Ag8.653 골수세포와 융합되었다.

융합세포 상청액(supernatant)는 IL-6 결합 및 안타고니즘(antagonism)을 위해 선별되었다. 결합 ELISA를 위해, Costar 9018 플레이트(plate)가 4℃에서 하룻밤동안 PBS에 1 ㎍/㎖ 인간 IL-6로 코팅하였다. 웰(well)은 2% BSA를 포함하는 PBS로 전처리하였고, 세척되었으며, 그리고나서 2% BSA가 포함된 PBS와 함께 1:2로 희석된 각 융합세포 상청액 50 ㎕와 함께 배양하였다. 60분 후, 웰은 0.1% 트윈-20(tween-20)을 포함하는 300 ㎕ PBS로 세번 세척하였다. PBS-BSA에 1:3000으로 희석된 항-마우스-HRP는 그리고나서 각각의 웰에 첨가되고, 30분 동안 배양되었다. 웰은 상기 서술된 바와 같이 세척되었고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) 기질을 첨가하여 신호는 450 및 550 nm에서 측정되었다. 안타고니즘 연구를 위하여, HEK-Blue™-IL-6 수용체 세포(InvivoGen, San Diego, CA)를 1:10으로 희석된 융합세포 상청액이 존재하는데 인간 IL-6의 농도를 증가시켜 배양하였다. 20 내지 24시간 후, 상청액 20 ㎕를 QuantiBlue™(InvivoGen)과 혼합한뒤 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결합 및 한타고니즘 연구에 근거하여, 융합세포 64가 초래된바와 같이 발명자에 의해 선택되었고, CRO에 서브클론되었다. 융합세포(쥣과 단일클론의) 64는 효소 결합 면역 침강 분석법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)를 사용하여 gp130에 대한 IL-6/IL-6Ra 복합체의 결합을 억제하는 능력이 추가적으로 시험되었다. 1.5 ㎍/㎖의 농도에서 융합세포 64는 ELISA에 의해 고정된 gp130에 대해 IL-6/IL-6Ra 복합체의 결합을 유의적으로 감소시켰다.

서브클론(subclone)은 재선별되었고, 서브클론 64.58의 가변 도메인이 5' RACE PCR에 의해 증폭되었으며, 서열분석되었다. 마우스 가변 도메인 서열(m64로서 언급됨)은 하기와 같다:

m64 VH(가변 중쇄)

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVITPGSGTINYNEKFKGKAVLTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCAKSRWDPLYYYALEYWGQGTSVTVSS(서열번호 13)

m64 VL(가변 경쇄)

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPLTFGAGTKLELK(서열번호 14)

인간화된 서열을 만들기 위해, m64 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR)이 컴퓨터의 알고리즘에 의해 마우스 서열에 대한 유사성이 선택된 인간 생식세표(germline) 뼈대안으로 이식되었다. 상기 인간화된 서열(h64로서 언급됨)은 하기와 같고(m64 서열과 비교하여 변화된 잔기는 밑줄을 그었다), 이들은 쥣과 서열과 함께 약 79.5% 동일성(identity)(VH) 및 84.4% 동일성(VL)을 갖는다:

h64 VH

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGOGTTVTVSS(서열번호 15)

h64 VL

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPLTFGQGTKLEIK(서열번호 16)

인간화된 서열은 DNA2.0(Menlo Park, CA)에 의해 합성되었고, 그리고나서 인간 IgG1 불변 도메인과 일렬로 융합된 pcDNA3.1 유래의 발현 벡터안으로 클로닝되었다. IgG는 Freestyle™-293 세포(invitrogen, Grand Island, NY)에서 일과성 발현 시스템에 의해 발현되었고, 단백질-A 크로마토그래피(protein-A chromatography)에 의해 정제되었다. 결합 및 안타고니즘의 모든 연구에 있어서, 상기 h64 IgG는 이의 m64 선행자(predecessor)와 비교하여 효능이 유의적으로 감소함을 나타낸다. 그러므로, 효모 디스플레이(display)는 잃어버린 친화도를 복구하는데 유용하다.

인간화된 h64IgG의 친화도를 회복 또는 개선시키기 위해 디자인 된 친화도 성숙을 수행하기 위하여, h64 항체 서열이 (G4S)3 링커를 통해 항-FITC scFv 4m5.3에 융합된 FabH 쇄에 있어서 pYC2/CT 유래된 효모 벡터에서 Fab 분자를 생성하기 위해 다시 클로닝되었다. h64 변이체 라이브러리는 그리고나서 Chao et al. (2006, Nature Protocols, 1:755-768)의 프로토콜을 따라 실수-유발 PCR(error-prone PCR)에 의해 생성되었다. H64 변이체는 발현되고, 표면이 FITC-PEG-NHS로 표지된 효모에 의해 포획된 뒤, 바이오티닐화된(biotinylated) 인간 IL-6과 함께 배양되었다. 결합된 IL-6는 스트렙타비딘-APC(streptavidin-APC)로 탐지되고, 디스플레이된 Fab의 양과 관련된 결합된 IL-6의 가장 높은 양을 갖는 세포는 BD FACSAria™ 세포 선별기(sorter)에서 선택되었다. 4번의 선택과정 후, 더 높은 친화도 변이체의 집단이 선택되고 서열분석되었다. 친화도 성숙(h64-1.4로서 언급됨)에 의해 선택된 클론(clone)의 서열은 굵은 글씨의 선택된 돌연변이(예를 들면, h64 VH 및 VL의 서열과 비교하여 돌연변이된) 및 밑줄 친 CDR과 함께 다음과 같다. 이는 018(뿐만 아니라 하기 서술된 020 및 029 IL-6a 분자)의 가변 도메인이다. 전체 Fab는 CK 및 IgG1 CH1 도메인을 포함한다. 본 명세서의 맥락에서, 'Fab' 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로 언급된 것은 서열이 경쇄 유래 서열 및 중쇄 유래 서열로 구성되는 기능적 Fab의 부분일 수 있는 서열을 의미한다.

h64-1.4 VH(018VH)(가변 도메인)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYA L SNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSS(서열번호 17)

h64-1.4 VL(018VL)(가변 도메인)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGI P FMNWYQQKPGQPPKLLIYAASN R GSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQS E EVPLTFGQGTKLEIKRTV(서열번호 18)

h64-1.4 가변 도메인은 pcDNA3.1 인간 IgG1 벡터안으로 다시 클로닝되었고, Freestyle™-HEK293 세포(Life Technologies)에서 전장의 IgG1으로써 발현되었다. 결과의 정제된 IgG는 결합 및 세포의 안타고니즘 모두의 연구에 있어서 원래의 h64 항체보다 유의적으로 더 강했다. 효모 시스템을 사용한 친화도 시험에서 친화도는 원래 인간화된 분자에서 343 pM에서 43 pM로 증가하였다. 상기 길항제 효능은 HE-Blue 세포 시스템을 사용하여 분석된 바와 같이 약 10배 증가하였다.

h64-1.4 IgG는 눈 및 다른 징후에서 사용을 위한 Fab로서 재구성되었다.

추가적으로, 라이브러리 생성 및 효모 기반의 선별의 다른 회(round)가 추가적으로 친화도를 개선하기 위해 수행되었다. 4회의 선별 후, A79V 돌연변이를 갖는 VH 변이체가 유의적으로 풍부하였다. A79V 변이체를 포함하는 항체, 변이체 및 이의 단편은 019 IL-6a 항체, 변이체, 및 이의 단편으로 언급된다.

실시예 3: 구성방식 선택

항체-근거의 IL-6 길항제를 위한 적합한 구성방식을 조사하기 위하여, 상기 서술된 바와 같이 선택된 IL-6 항체가 018 서열의 형태인 Fab, SCFV(VH-VL) 및 SCFV(VL-VH)을 사용한 일과성 발현, 안정성, 응집(aggregation) 특성, 결합 친화도, 및 IC50를 위해 시험되었다.

후보 IL-6a 분자(018 가변영역을 포함하는 서열) 하나를 위한 이들 연구의 결과는 하기 표 1에 나타냈다.

파라메터	Fab	scFv(VH-VL)	scFv(VL-VH)
일과성 발현	45 ㎎/㎖	2 ㎎/ℓ	4 ㎎/ℓ
안정성(TM)	73℃	43℃	46℃
응집(SEC, MALS)	No	Yes	N/A
결합 친화도(KD)	240 pM	1 nM	720 pM
10 pM IL-6에서 IC50	255 pM	160 pM	125 pM

이들 데이터는 항체-기반의 IL-6 길항체의 다양한 구성방식의 주요 특징 동정의 방법을 나타내고, 018 가변영역을 포함하는 IL-6 길항제를 위해, 상기 018Fab 구성방식이 scFv 배열과 비교하여 가장 주요 카테고리, 예를 들면, 발현, 안정성, 응집, 및 결합 친화도에 있어서, 가장 알맞은 특징을 가짐을 나타낸다. 018 Fab의 IC50는 치료학적 용도를 위해 타당한 범위내에서 떨어진다.

실시예 4: IL-6a 항체, 단편, 및 유도체의 예

본 발명자들은 본 명세서에 서술된 방법을 사용하여 하기의 서열을 동정하였다. 밑줄친 서열은 중쇄 및 경쇄의 CDR을 나타낸다. 다른 서열은 본 명세서를 통해서 찾을 수 있다.

IgG1 뼈대에서 018 중쇄(전장; fl018HC) 폴리펩타이드 서열

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 19)

IgG1 뼈대에서 018 중쇄(전장; fl018HC) 핵산 서열

CAAGGCGAAAGGTCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTTTATACACTGCCTCCCTCACGCGACGAATTAACAAAGAATCAGGTGTCTCTCACCTGTCTCGTCAAGGGCTTTTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACAACTCCCCCAGTCCTGGATTCAGATGGGTCGTTCTTTCTATATAGTAAGTTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAACAGGGGAACGTGTTCTCTTGCTCTGTTATGCATGAAGCGCTGCACAATCATTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGGAAG(서열번호 20)

IgG1 뼈대에서 018 Fab 중쇄(018FabHC) 폴리펩타이드 서열. CDR은 밑줄을 그었다.

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(서열번호 1)

018 전장 경쇄(fl018LC) 폴리펩타이드 서열. CDR은 밑줄을 그었다.

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC(서열번호 2)

이는 또한 020 및 029 IL-6 길항체를 위한 경쇄 서열이다.

IgG1 뼈대에서 018 전장 경쇄(018LC) 핵산 서열

GACATAGTGA TGACTCAAAG TCCGGACAGC CTGGCGGTGT CACTCGGCGA ACGGGCAACT ATCAACTGCC GAGCCAGCGA GAGCGTCGAT AATTACGGCA TCCCCTTCAT GAACTGGTAT CAGCAGAAGC CAGGACAGCC GCCCAAGCTG CTTATCTACG CCGCTTCCAA CCGGGGATCA GGGGTGCCCG ATCGATTTAG TGGAAGCGGT AGTGGGACCG ATTTCACACT GACCATCAGC TCCCTTCAGG CCGAGGATGT GGCTGTCTAT TATTGTCAGC AATCCGAGGA AGTGCCGCTC ACGTTTGGTC AGGGAACCAA ACTGGAGATC AAGCGGACCG TAGCGGCGCC TAGTGTCTTC ATCTTCCCAC CCTCCGACGA ACAGCTGAAG TCTGGCACTG CTTCCGTCGT GTGCCTGCTC AACAACTTTT ACCCTAGAGA GGCAAAAGTT CAATGGAAAG TAGACAATGC CTTGCAGTCC GGGAACTCCC AGGAGTCTGT CACAGAGCAG GATAGTAAGG ACTCAACCTA CAGCCTGTCC AGCACACTGA CCCTCTCCAA AGCCGACTAC GAGAAGCACA AAGTGTACGC TTGCGAAGTT ACGCATCAGG GGCTGTCCTC ACCCGTTACA AAAAGTTTTA ACAGAGGGGA GTGC(서열번호 26)

019 Fab 중쇄(019FabHC, A79V(굵은/이탤릭)을 제외하고 018FabHC와 같은 서열)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTST V Y MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSC(서열번호 3)

019 VH(가변영역/019HC, A79V(굵은/이탤릭)을 제외하고 018HC 가변영역과 같은 서열)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTST V Y MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SS(서열번호 27)

019 항체 경쇄(019LC) 서열(폴리펩타이드 및 핵산)은 018LC와 동일하다.

018HC의 CDR1(VH CDR1 018): GYALSNYLIE(서열번호 4)

018HC의 CDR2(VH CDR2 018): VITPGSGTIN(서열번호 5)

018HC의 CDR3(VH CDR3 018): SRWDPLYYYALEY(서열번호 6)

018LC의 CDR1(VL CDR1): RASESVDNYGIPFMN(서열번호 7)

018LC의 CDR2(VL CDR2): AASNRGS(서열번호 8)

018LC의 CDR3(VL CDR3): QQSEEVPLT(서열번호 9)

019HC의 CDR1(VH CDR1 019): GYALSNYLIE(서열번호 4)

019HC의 CDR2(VH CDR2 019): VITPGSGTIN(서열번호 5)

019HC의 CDR3(VH CDR3 019): SRWDPLYYYALEY(서열번호 6)

실시예 5: 에피토프 및 구조 지도제작(mapping)

에피토프 지도제작

기능성 에피토프 지도제작은 선택된 후보 IL-6 길항제에서 수행되었다. 이는 후보 항체(쥣과 64 항체)가 ELISA에 있어서 IL-6Ra 내지 IL-6의 결합을 감소시키지 않음을 나타내고, 이는 후보 항체가 사이트 1에 결합하지 않음을 나타낸다. 추가적인 실험이 항체를 위한 결합 사이트가 숨겨진 IL-6의 사이트 2 및 사이트 3중 하나를 나타내는 ELISA에 있어서, gp130에 대한 IL-6/IL-6R 복합체의 결합을 감소시키는 키메릭(chimeric) 쥣과 64 항체를 증명하기 위해 수행되었다. 또한, 쥣과 64 항체는 후보 항체가 IL-6의 사이트 2에 결합하는 것을 나타내는 IL-6에 대한 항체 AH-64(Immunotech, Marseille, France)에 결합하는 사이트 3로 알려진 결합을 유의적으로 차단하지 않았다. 이들 데이터는 사이트 2에 대한 항체 생성 및 이와 같은 항체의 동정 방법이 증명될 수 있음을 나타낸다.

추가적인 에피토프의 정의를 위하여, IL-6의 돌연변이가 4m5.3(Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA97, 10701-10705l Chao et al., 2006, Nat Protoc 1, 755-768)의 융합된 바와 같은 효모에서 생성되었다. 상기 돌연변이는 하기 단일 또는 이중 돌연변이와 함께 인간 IL-6에서 발현되었다: R24E/D27E, R30E, Y31E, D34R, S118R/V121E, W157E, Q159E/T162P, K171E, 및 R179E. 상기 발현된 돌연변이 IL-6 분자는 018(Fab)의 결합 연구에 사용되었다. 018(Fab)를 위한 감소된 친화도는 R24E/K27E, Y31E, D34R, 및 S118R/V121R에서 관찰되었다. 이들 모두는 IL-6의 사이트 2에 위치한다. 따라서, 본 명세서에 서술된 본 발명은 인간 IL-6 또는 IL-6에서 동등한 사이트의 24, 27, 31, 34, 118, 및 121 위치의 아미노산의 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯개에 결합하는 항체를 포함한다.

사이트 2 에피토프의 구조 결정

하기의 거리는 사이트 2 구조적 결정을 위해 계산되었다. 상기 계산은 IL-6/IL-6a/pg130 6합체(hexameric) 크리스탈 구조, PDB 1P9M(Boulanger et al., 2003, Science 300: 2101-2104)를 기반으로 하였다. IL-6의 헬릭스(helix) 1은 사이트 2에 가깝게 떨어지나, IL-6Ra의 세포외 도메인으로 언급되는 사이트 1, 예를 들면, R30, D2, 및 D3에 대한 포인트인 측쇄(side chain)를 갖는 특정 잔기에 있어서 결과인 사이트 1 및 사이트 2 사이에서 운영된다.

하기의 IL-6 아미노산은 gp130-D2-D3: L19, R24, K27, Q28, R30, Y31, D34, E110, QU I, R113, A114, M117, S118, V121, Q124, F125, 및 K128의 5 Å내에서 떨어지도록 결정되었다.

하기의 아미노산은 gp130-D2-D3: L19, E23, R24, 125, K27, Q28, 129, R30, Y31, D34, K41, Q102, E109, El 10, QU I, A112, R113, A114, V115, Q116, M117, S118, 120, V121, L122, Q124, F125, 및 K128의 7 Å내에서 떨어지도록 결정되었다.

따라서, 분자, 예를 들면, 사이트 2의 5 Å 또는 7 Å내에서 떨어진 하나 또는 그 이상의 IL-6 아미노산에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편은 IL-6a일 수 있다.

인간 IL-6의 서열은 참조로 하기에 제공된다(밑줄친 서열은 리더 서열(leader sequence)이다). gp130-D2-D3의 7 Å내의 아미노산은 이탤릭이다. 아미노산 번호, 예를 들면, 에피토프를 정의하기 위해 사용된 돌연변이는 리더 서열이 없다.

인간 IL-6

MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM(서열번호 21)

실험은 h64-1.4 인간화된 항체의 Fab 단편 시험을 수행하였고, 사이트 2를 표적으로 하기때문에 시스 및 트랜스 IL-6 신호 모두를 차단하는 것이 가능함을 확인하였다. Fab 단편의 효능은 수용성 IL-6 수용체(sIL-6R)의 존재에서 변하지 않았다. 이는 sIL6R이 존재할 때 감소된 효능을 갖고, 시스 신호만을 차단하는 항-IL-6R IgG와는 반대이다.

실시예 6: 영장류 연구

비-영장류 활성은 영장류 사이에서 매우 다를 수 있기 때문에, 비-인간 영장류를 사용하여 후보 IL-6 길항제의 PK 및 다른 파라메터를 추가적으로 일반적으로 평가하였다. 인간 IL-6는 IL-6의 6개 사이트에서 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) 및 붉은털 원숭이(rhesus monkey)와는 다르고, 이들 중 하나는 사이트 2(28번째 아미노산)에 있으며, 아프리카 그린 원숭이(African green monkey) IL-6의 사이트 2와 같다. 이는 018 서열을 포함하는 항체의 결합이 오직 약 3 내지 4배정도 감소함을 나타낸다. 비-인간 영장류 IL-6에 결합하는 능력은 IL-6 길항체의 유용한 특징이고, 약물로서 후보의 개발을 촉진하고, 예를 들면, 비-인간 영장류에서 시험한 독성학과 같은 시험을 가능하게 한다.

대부분의 IL-6 항체와 함께, 본 명세서에서 서술된 항-IL-6 항체는 낮은 서열 상동성 때문에 설치류(rodent), 토끼, 또는 개(canine) IL-6와 교차반응하지 않는다. 그러나, 친화도 연구에 있어서, 018 Fab가 시노몰구스 원숭이 및 아프리카 그린 원숭이 IL-6와 인간 친화도와 근접하게 결합하는 것을 확인하였다(표 2).

다양한 종의 다양한 IL-6를 위한 1가 친화도(018 Fab)

종	KD
인간	200 pM
아프리카 그린 원숭이	280 pM
시노몰구스 원숭이	840 Pm
개(dog)	> 1 μM
마우스	> 1 μM
토끼	> 1 μM
랫트	> 1 μM

상기 데이터는 본 명세서에 서술된 바와 같이 IL-6a의 특이적 결합 능력 및 적합한 동물모델에서 시험을 허용하는 특징, 예를 들면, 독성학 및 재생연구(reproductive study)를 갖는 분자를 개발하기 위한 능력을 추가적으로 확인하였다.

실시예 7: IL-6a의 증가하는 발현

018 Fab 및 019 Fab 폴리펩타이드의 발현을 증가시키기 위하여, 컨스트럭트(construct)가 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 CH1/힌쥐 영역의 중쇄에 5개 추가적인 아미노산(DKTHT)을 도입하여 만들어졌다. 상기 변화된 018Fab 중쇄의 서열은 서열번호 24로서 하기에 나타낸다. 변화된 018 서열은 본 명세서에서 020으로 언급되고, 변화된 019 서열은 본 명세서에서 021로서 언급된다. 020 분자(020 Fab 중쇄 및 018Fab 경쇄)는 018Fab 중쇄 및 018Fab 경쇄를 갖는 부모 Fab와 비교하여 발현이 개선되었다. 019 분자는 020 분자와 비교하여 유의적인 친화도 차이가 존재하지 않았다. 020 및 019 모두의 발현은 각각 약 2배 증가하였고, 친화도는 변화에 의해 영향을 받지 않는다.

020 중쇄(카복시 말단에 DKTHT(서열번호 30)를 갖는 Fab)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT(서열번호 24)

020Fab를 사용한 IL-6 안타고니즘은 HEK-Blue™ IL-6 리포터(reporter) 세포(InvivoGen, San Diego, CA)에서 측정되었다. 세포는 10 pM IL-6의 혼합물 및 020 또는 IL-6Ra 항체(Cell Sciences, Canton, MA) 중 하나의 다양한 농도를 IL-6Ra가 있거나 없을 때로 배양되었다. 배양 20 내지 24시간 후, 세포 배양 상청액의 20이 QuantiBlue™(InvivoGen) 기질의 180 μE와 혼합되었고, 한 시간 동안 배양되었다; 그리고나서 흡관도는 655 nm에서 측정되었다. 도 3a 및 도 3b는 이들 실험으로부터의 데이타를 보여주고, IL-6R이 있거나 없을 때 IL-6 억제활성에 대한 020의 능력을 나타낸다.

실시예 8: IgG2 IL-6 항체

018는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 IgG1 구성구성된 항체와 비교하여 FcyR 결합 감소 및 ADCC 감소를 위해 인간 IgG2 아이소타입 뼈대안으로 재구성되었다. 추가적으로, 전장의 구성방식, 예를 들면, IgG2에 대해 재구성한 018은 분자의 더 큰 사이즈때문에 유리체로부터 청소율을 감소시킬 것으로 예상된다.

항-IL-6 IgG2 항체의 컨스트럭션(construction)/정제

상기 서술된 항-IL-6 서열을 사용한 인간 IgG2 항체 컨스트럭트를 위하여, 인간 IgG2 불변 도메인의 N- 및 C-말단 각각에 Nhel 및 Mlul 제한 사이트(restriction site)와 함께 cDNA로부터 PCR 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 정제되고, Nhe1 및 Mlu1 제한효소로 절단된 뒤, 그리고나서 항-IL-6 가변 도메인, 예를 들면, 서열번호 1(상기 참조)을 포함하는 pTT5 벡터 내로 결찰되었다. 이렇게 전장 IgG2 중쇄 서열을 얻었다. 018 서열을 포함하는 전장 경쇄를 포함하는 플라스미드는 경쇄를 제공하기 위해 사용되었다.

추가적인 FcRn 결합을 감소시키고, 그에 따라 IL-6a의 재순환(recycling)을 감소시키기 위하여, 점 돌연변이(point mutation)가 중쇄에 만들어졌다. 상기 돌연변이는 QuikChange® 돌연변이유발(mutagenesis)(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 의해 만들어졌다. 중쇄 및 경쇄 플라스미드는 HEK293-6E 세포의 100 ㎖ 일과성 배양(transient culture) 내로 폴리(에틸렌이민)(poly(ethylenimine)을 사용하여 공-형질감염되었고(co-transfected), 약 5일 동안 발현을 위해 배양되었다. 이는 항-IL-6 사이트 2 결합 모이어티 및 IgG2 구조를 포함하는 항체를 생성하였다. 018 CDR을 포함하는 이와 같은 구조는 본 명세서에 018IgG2 또는 029로 명명하였다. 점 돌연변이는 I253 잔기에 만들어졌다.

IgG2 분자는 잘 발현되었고, 020Fab와 비교하여 약간 증가된 효능과 함께 세포의 어세이(cellular assay)에서 IL-6를 차단하였다.

029 성숙서열(mature sequences)(CDR은 밑줄)

029 중쇄

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK(서열번호 11)

029 경쇄

DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD NYGIPFMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNRGS GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSEEVPL TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC(서열번호 12)

변화된 FcRn 결합

IL-6는 특정 양성의 전신 영향을 가질 것이다. 그러므로, 이는 유리체 내에서 좋은 잔류(retention)를 갖는 IL-6a를 조작하기 위한 이점이나, 전신의 반감기를 제한한다. 상기 FcRn 결합의 감소 또는 제거(elimination)는 순환에서 달아나는 어떤 약물의 전신 축적을 감소시켜야 할 것이고, 그에 따라 IL-6a의 안전성을 개선시킨다.

따라서, FcRn 매개의 수송량(trafficking)은 눈으로부터 항체의 유출량(efflux)이 증가할 것이기 때문에, 020 IgG2는 Martin et al., Molecular Cell, 7:4, 867-877(2001)에 따라 번호가 매겨진 I254, H311, 또는 H436 잔기(서열번호 23 참조)에서 Fc 돌연변이 도입에 의해 FcRn 결합을 제거하기 위해 추가적으로 변형되었다. 상기 돌연변이된 사이트는 서열번호 23에 굵은 글씨로 나타내었다; I254는 A 또는 R로 돌연변이 되었고, H311은 A 또는 E로 돌연변이 되었으며, H311은 D313이 T로 돌연변이 된 것과 함께 N으로 돌연변이 되었고, H436은 A로 돌연변이 되었다(번호는 서열번호 23에 밑줄로 표시된 리더 서열 이후로 시작). 이와 같은 서열을 포함하는 IL-6 길항제는 018IgG2m으로 명명하였다.

돌연변이 사이트(굵은 글씨)를 보여주는 항-IL-6 중쇄(IgG2)(일반 글씨체: VH; 이탤릭체: CH)(리더서열 없음)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYALSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGVITPGSGTINYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWDPLYYYALEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 23)

리더서열을 포함하고(밑줄), 돌연변이 사이트(굵은 글씨)를 보여주는 항-IL-6 중쇄(IgG2)(일반 글씨체: VH; 이탤릭체: CH)

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYALS NYLIEWVRQA PGQGLEWMGV ITPGSGTINY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSR WDPLYYYALE YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLM I SRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV H QDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHN H YTQK SLSLSPGK(서열번호 28)

따라서, 어떤 실시예는 H311이 N으로 돌연변이 된 것과 함께 I254(예를 들면, A 또는 R), H311(A 또는 E로 돌연변이됨), H436(A로 돌연변이됨), 또는 D313(T로 돌연변이됨)에 돌연변이를 갖는 서열번호 23으로 묘사되는 중쇄 서열을 갖는 항체를 포함한다.

그러므로, 서열번호 25는 H190(예를 들면, H190N과 함께 D192T)과 함께 I133(예를 들면, I133A 또는 I133R), H190(예를 들면, H190A 또는 H190E), H315(예를 들면, H315A), 또는 D192에 돌연변이가 낮은 pH, 예를 들면, pH5.5 또는 리소좀의(lysosomal) pH에서 감소된 Fc 결합을 갖는 폴리펩타이드 및/또는 부모 또는 서열에 포함되지 않은 다른 참조 분자와 비교하여 전신의 반감기가 감소된 폴리펩타이드를 생산하기 위한 항체, 단편 또는 이의 유도체로 사용될 수 있는 서열을 제공한다.

SASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK(서열번호 25)

항-IL-6 경쇄 QgG2(일반 글씨체: VK; 이탤릭체: CK)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGIPFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSEEVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC(서열번호 22)

실시예 9: 제형 안정성

항-IL-6/IgG1 Fab 단편(IgG1CH1 도메인 포함)의 안정성은 범위 시차주사 형광측정기(differential scanning fluorometry)를 사용하여 범위 내의 완충용액인 PBS 및 첨가제에서 초기 T_m 결정에 의해 시험되었다. 이는 구연산염(citrate) 완충용액, pH 5.5에서 T_m이 80℃ 이상으로 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 어떤 실시예에서, IL-6a는 구연산염 완충용액을 제공하고, 어떤 경우에 적어도 80℃의 T_m을 갖는다.

응집은 SEC-MALS를 사용하여 시험되었고, 인산염 완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)에서 20 ㎎/㎖일 때 응집이 관찰되지 않았다.

실시예 10: 증가된 PK를 위한 pH 민감성 항체

IL-6는 특정 양성 전신영향을 가질 수 있다. 그러므로, 이는 유리체 내에서 좋은 잔류(retention)를 갖는 IL-6a를 조작하기 위한 이점이나, 전신의 반감기를 제한한다. 상기 FcRn 결합의 감소 또는 제거(elimination)는 순환에서 달아나는 어떤 약물의 전신 축적을 감소시켜야 할 것이고, 그에 따라 IL-6a의 안전성을 개선시킨다. 따라서, FcRn 매개의 수송량(trafficking)은 눈으로부터 항체의 유출량(efflux)이 증가할 것이기 때문에, 020 IgG2는 I253, H310, 또는 H435 잔기(Martin et al., Molecular Cell, 7:4, 867-877(2001)에 따라 번호가 매겨진)에서 Fc 돌연변이 도입에 의해 FcRn 결합을 제거하기 위해 추가적으로 변형되었다. 이와 같은 항체는 본 명세서에 IL-6pH 항체 또는 항-IL-6pH로서 언급되었고, 하기에 추가적으로 서술되었다.

IL-6ipH 항체의 제조

히스티딘의 pK는 약 6.0이고, 결합 인터페이스(interface)에 삽입된 히스티딘은 낮은 pH에서 측쇄 양성자첨가(protonation)에 의해 결합이 방해될 수 있다. 본 명세서에 서술된 바와 같이 항-IL-6 사이트 2를 표적하는 항체의 용도에서, 라이브러리가 018로부터 CDR의 히스티딘-풍부한 변이체를 포함하여 생성되었고, 라이브러리는 효모 디스플레이를 사용한 pH-민감한 결합을 위해 스크리닝되었다. 생성된 라이브러리는 야생형(wild-type) 잔기(예를 들면, 부모 항체와 동일한) 또는 히스티딘 잔기 중 하나의 잔기와 같은 코돈(codon) 퇴보에 의해 암호화된 CDR과 함께인 조합의 라이브러리이다. 스크리닝은 생리적 pH(7.4)에서 높은 결합을 하고, 엔도솜의(endosomal) pH(5.5)에서 낮은 결합을 하는 것을 교류정렬(alternating sorting)에 의해 수행되었다.

효모-선택된 돌연변이는 pH 7.4에서 상대적으로 높은 결합력을 갖고(부모 분자의 192 pM과 비교하여 돌연변이는 409 pM의 1가의 Kd), pH 5.5에서 상대적으로 낮은 결합력을 갖는(부모 195 pM과 비교하여 2,362 nM의 1가의 Kd) 것이 확인되었다. 이는 pH 5.5에서 친화도가 약 5.8배 변화하는 것으로 여겨진다. 이들 돌연변이는 경쇄 CDR1에 있어서 다중 히스티딘 돌연변이를 포함한다. 따라서, 상기 돌연변이는 pH 7.4에서 부모 분자와 유사하게 결합하고, pH 5.5에서 친화도가 유의적으로 감소함을 나타낸다. 이들 관찰은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법인 ELISA, FACS, 및 SPR 분석(analysis)을 사용하여 확인되었다.

이들 데이터는 항체에 근거한 IL-6a가 IL-6의 사이트 2를 표적으로 항-IL-6의 특징을 갖도록 제조될 수 있고, IL-6의 시스 및 트랜스의 모든 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있음을 나타내며, 부모 항체 또는 pH 5.5에서 변화된 결합에 의해 적어도 부분에서 영향을 받은 야생형 Fc 도메인을 갖는 다른 항체와비교하여 증가된 P를 갖는다.

다른 실시예가 하기 청구항의 범위(scope) 내이다.

<110> ELEVEN BIOTHERAPEUTICS, INC. <120> Interleukin-6 antagonists and uses thereof <130> 2015FPI-03-12 <150> 61/723972 <151> 2012-11-08 <150> 61/831699 <151> 2013-06-06 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys 225 <210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Pro Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys 225 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Pro Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Gln Gln Ser Glu Glu Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Gln Gln Ser Glu Glu Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 11 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Pro Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Val Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Pro Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val <210> 19 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 20 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 20 caagtgcagc tggtgcagtc aggggccgag gttaagaagc cagggagcag cgtcaaggta 60 tcttgtaaag cgtctggtta cgccctttca aactacctga tcgaatgggt gaggcaggct 120 cccggccaag gcctggaatg gatgggagtt atcacccctg ggagcggcac cattaattac 180 gcccagaaat ttcagggacg agtgacgatt accgccgacg agtccaccag tactgcctac 240 atggagctgt cctcactccg cagcgaggac acggcagttt actactgcgc ccggagtcga 300 tgggaccctc tttactatta tgctctggaa tactggggcc agggaacgac cgttacagtg 360 tcatctgcta gcacaaaagg accatcagtc ttcccacttg ctccttcatc taagagcaca 420 agtggtggca ctgcagccct tggctgcctg gtgaaagatt atttccccga acctgttaca 480 gtttcttgga actccggtgc actgacatcc ggagtacaca ctttcccagc tgtgctgcag 540 agctcaggac tgtatagcct gtcttcggtg gtcactgttc catcgtcgag tcttggcaca 600 cagacatata tttgcaacgt caatcacaag ccctccaaca caaaagtgga taagaaggtc 660 gagcccaaat cttgtgacaa gacccatacg tgtcctccct gtcccgcccc tgaactgctg 720 ggaggccctt ctgtgttcct gttcccacct aagccaaagg acactctgat gatcagccgg 780 actcccgagg ttacctgtgt ggtggtggat gtgtctcatg aagaccctga ggttaagttc 840 aattggtacg tggatggcgt cgaggtgcat aacgcaaaaa ccaagccgag agaggagcag 900 tacaatagca cctatagagt agtgagcgtc ctgactgtct tacatcagga ttggctcaat 960 ggtaaagaat ataagtgcaa ggtaagcaac aaggccctac ccgcaccaat agagaagacc 1020 atctccaagg cgaaaggtca gcccagggag ccccaggttt atacactgcc tccctcacgc 1080 gacgaattaa caaagaatca ggtgtctctc acctgtctcg tcaagggctt ttacccttcc 1140 gacatcgccg tggagtggga atccaatggc cagcctgaga acaattataa gacaactccc 1200 ccagtcctgg attcagatgg gtcgttcttt ctatatagta agttgaccgt ggataagtct 1260 cgctggcaac aggggaacgt gttctcttgc tctgttatgc atgaagcgct gcacaatcat 1320 tatacccaga agtccctgtc cctgagcccc gggaag 1356 <210> 21 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 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Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu 85 90 95 Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 24 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 <210> 25 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 25 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 1 5 10 15 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 35 40 45 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln 65 70 75 80 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 85 90 95 Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 100 105 110 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 26 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 26 gacatagtga tgactcaaag tccggacagc ctggcggtgt cactcggcga acgggcaact 60 atcaactgcc gagccagcga gagcgtcgat aattacggca tccccttcat gaactggtat 120 cagcagaagc caggacagcc gcccaagctg cttatctacg ccgcttccaa ccggggatca 180 ggggtgcccg atcgatttag tggaagcggt agtgggaccg atttcacact gaccatcagc 240 tcccttcagg ccgaggatgt ggctgtctat tattgtcagc aatccgagga agtgccgctc 300 acgtttggtc agggaaccaa actggagatc aagcggaccg tagcggcgcc tagtgtcttc 360 atcttcccac cctccgacga acagctgaag tctggcactg cttccgtcgt gtgcctgctc 420 aacaactttt accctagaga ggcaaaagtt caatggaaag tagacaatgc cttgcagtcc 480 gggaactccc aggagtctgt cacagagcag gatagtaagg actcaaccta cagcctgtcc 540 agcacactga ccctctccaa agccgactac gagaagcaca aagtgtacgc ttgcgaagtt 600 acgcatcagg ggctgtcctc acccgttaca aaaagtttta acagagggga gtgc 654 <210> 27 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 28 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu 35 40 45 Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Val Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Trp Asp Pro Leu Tyr Tyr Tyr Ala Leu 115 120 125 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 210 215 220 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 225 230 235 240 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 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30 Asp Lys Thr His Thr 1 5

Claims (36)

1. 인간 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6)의 사이트 2(site II)에 특이적으로 결합할 수 있는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antibody binding fragment).
   
2. 하기를 포함하는 분리된 단일클론 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 항원 결합 단편:
   a. 서열번호 4로 시작되는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region, VH) 상보성 결정부위(complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 5로 시작되는 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 2 및 서열번호 6으로 시작되는 중쇄 가변영역 상보성 결정부위 3.
   b. 서열번호 7로 시작되는 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL) 상보성 결정부위 1, 서열번호 8로 시작되는 경쇄 가변영역 상보성 결정부위 2 및 서열번호 9로 시작되는 경쇄 가변영역 상보성 결정부위 6.
   여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-6에 특이적으로 결합할 수 있음(예를 들면, 인간 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있음).
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 240 pM 또는 그 이하의 해리상수(dissociation constant, Kd)값에서 IL-6와 결합할 수 있고, 70℃ 또는 그 이상의 녹는점(Tm)을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 240 pM 또는 그 이하의 해리상수(Kd)값에서 IL-6와 결합할 수 있고, 80℃ 또는 그 이상의 녹는점을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
5. 제 1항, 제 2항, 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118, 또는 V121의 적어도 하나에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
6. 제 1항, 제 2항, 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 IL-6의 R24, K27, Y31, D34, S118 및 V121에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
   
7. 하기 특징을 갖는 분리된 IL-6 항체 또는 이의 항원 결합:
   (1) 표면플라스몬공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정된 240 pM 또는 그 이하값의 3/4에서 인간 IL-6와 분리될 수 있음; 및
   (2) 시험관 내의 HEK-BlueTM IL-6 어세이에서 255 pM 또는 그 이하의 IC50에서 IL-6의 활성을 중화시킬 수 있음.
   
8. 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 서열번호 3 및 서열변호 2로 기재되는 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인간 IL-6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있는 분리된 IL-6 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
9. 인간 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합할 수 있고, 하기로 구성되는 분리된 항체 또는 이의 단편:
   (a) 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 95%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(a light chain variable domain), 및 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 95%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(a heavy chain variable domain).
   
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 pH 5.5에서 단결합 해리상수(monovalent Kd) 값이 2 nM 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 분리된 IL-6 항체 또는 이의 항원 결합.
    
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG2 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 참조의 항체 또는 이의 단편과 비교하여 변화된 FcRn 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
13. 제 12항에 있어서, 상기 FcRn 결합은 참조의 항체와 비교하여 감소한 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 Fc 도메인은 참조의 항체와 비교하여 변형된 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
15. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열변호 23의 H311, D313, I254, 또는 H436의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
16. 제 15항에 있어서, 상기 항체는 H311A, H311E, H311N 및 D313T, I254A, I254R, 및 H436A로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
    
17. 서열번호 25로 기재되는 분리된 단일클론 항체.
    
18. 인간 IL-6의 사이트 2에 특이적으로 결합하고, 야생형(wild type)의 Fc 도메인을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 감소된 FcRn 결합이 존재하는 분리된 IL-6 항체 또는 이의 단편.
    
19. 상기 청구항들 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 개체(예를 들면, 인간)에서 IL-6와 관련된 질환의 치료를 위한 용도.
    
20. 제 19항에 있어서, 상기 질환은 유리체에서 IL-6의 수준이 상승된 것으로 특징된 안구 질환의 치료 목적인 것을 특징으로 하는 용도.
    
21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 당뇨성 황반부종(diabetic macular edima, DME), 당뇨 망막증(diabetic retinopathy,), 포도막염(uveitis), 안구 건조증(dry eye syndrome), 포도막염(uveitis), 나이관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 증식성 당뇨 망막증(proliferative diabetic retinopathy, PDR), 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion, RVO), 시신경 척수염(neuromyelitis optica, NMO), 각막 이식(corneal transplant), 각막 찰과상(corneal abrasion) 또는 눈의 물리적 손상을 갖는 개체(예를 들면, 인간)의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
    
22. 제 21항에 있어서, DME를 갖는 개체(예를 들면, 인간)의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
    
23. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
    
24. 인간 단일클론항체인 제 1항 또는 제 2항의 항체를 포함하는 조성물.
    
25. 제 23항 또는 제 24항의 조성물을 IL-6 관련된 질환의 치료를 위한 용도.
    
26. 제 25항의 조성물을 유리체에서 IL-6의 수준이 상승된 것으로 특징된 안구 질환의 치료를 위한 용도.
    
27. 제 23항 또는 제 24항의 조성물의 당뇨성 황반부종, 당뇨 망막증, 포도막염, 안구 건조증, 나이관련 황반변성, 증식성 당뇨 망막증, 망막 정맥 폐색, 시신경 척수염, 각막 이식, 각막 찰과상 또는 눈의 물리적 손상의 치료를 위한 용도.
    
28. 제 1항 내지 제 18항 중의 어느 한 항의 IL-6 항체 또는 이의 단편의 치료학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 IL-6와 연관된 질환의 치료 방법.
    
29. 제 28항에 있어서, 상기 IL-6 연관 질환은 유리체에서 IL-6의 수준이 상승된 것으로 특징된 안구 질환인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
    
30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 IL-6 연관 질환은 당뇨성 황반부종, 당뇨 망막증, 포도막염, 안구 건조증, 나이관련 황반변성, 증식성 당뇨 망막증, 망막 정맥 폐색, 시신경 척수염, 각막 이식, 각막 찰과상 또는 눈의 물리적 손상인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
    
31. 제 29항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개체의 눈 유리체로 전달되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
    
32. 제 29항에 있어서, 상기 IL-6 관련 질환은 당뇨성 황반부종이고, 항체 또는 이의 단편은 개체의 눈 유리체로 전달되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
    
33. 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터.
    
34. 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9를 하나 또는 그 이상 발현할 수 있는 세포.
    
35. 야생형 Fc 도메인을 갖는 상응하는 항체 또는 이의 단편과 비교하여 감소된 FcRn 결합 활성을 가지고, IL-6 활성을 저해할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 IL-6 억제의 전신 작용 감소 방법.
    
36. 제 35항에 있어서, Kd는 pH 5 내지 6에서 1 ㎛ 이상인 것을 특징으로 하는 감소방법.

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