KR20150076523A - Manufacturing Method Of Saccharides From Biomass Using Immobilized Enzyme - Google Patents
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
Abstract
Description
본 발명은 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 유성분쇄 방식, 또는 마멸분쇄 방식의 물리적 전처리 단계에 의하여 바이오매스를 분쇄하여 고정화 효소의 접근성을 높임으로써 독성 부산물의 발생과 바이오매스의 손실을 줄이고 당 수율을 향상시켜 친환경적으로 바이오연료를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감할 수 있는 당화합물의 제조방법에 대한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a sugar compound from biomass using an immobilized enzyme, and more particularly, to a method for preparing a biomass by immobilizing biomass by physical pretreatment steps of an oil-based grinding method or an abrasive grinding method, It is possible to produce eco-friendly biofuel by reducing the generation of toxic byproducts and loss of biomass and improving sugar yield, minimizing the decrease of activity due to repeated use of enzymes, and increasing the recovery rate of enzymes, And a method for producing the sugar compound.
바이오매스의 당화(saccharification) 공정은 셀룰로오스를 분해해서 글루코스로 변환하거나 헤미셀룰로오스를 분해해서 자일로스나 만노스(mannose) 등으로 분해하는 공정으로 셀룰라아제나 헤미셀룰라아제 같은 효소가 촉매로 작용한다.The saccharification process of biomass is a process of decomposing cellulose into glucose or decomposing hemicellulose and decomposing it into xylose or mannose. Enzymes such as cellulase or hemicellulase act as a catalyst.
이때, 상기 당화 공정에 사용되는 효소들은 매우 고가의 물질로서 전체 바이오에너지 생산이나 바이오리파이너리(biorefinery)의 비용을 증가시키는 주요 원인이 되고 있다. At this time, the enzymes used in the saccharification process are very expensive substances and are a major cause of increasing the cost of biorefinery production or biorefinery.
또한, 바이오매스의 당화 공정은 상당한 시간(72~144시간)이 소요되는데 상기 당화 공정을 수행하는 동안 수용액 상에서 쉐이킹(shaking)되면서 효소의 3차원 구조가 변형되어 효소 활성(activity)을 잃게 되는 경우가 많다. 이는 효소의 반복적인 사용을 어렵게 만들어 전체 당화공정의 소요비용을 높이게 되며, 이 외에도 효소를 단독으로 사용하는 경우 사용된 효소를 회수하기가 쉽지 않아 효소의 재사용률이 낮아지는 원인이 되고 있다.In addition, the saccharification process of the biomass takes a considerable time (72 to 144 hours). When the enzyme is shaken in the aqueous solution during the saccharification process and the three-dimensional structure of the enzyme is modified to lose the enzyme activity There are many. This makes it difficult to repeatedly use the enzyme, which increases the cost of the whole saccharification process. In addition, when the enzyme is used alone, it is difficult to recover the used enzyme, which causes the reuse rate of the enzyme to be lowered.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 효소를 고정화하여 사용하는 기술이 제안되고 있다. 특히, 나노파티클, 자성나노입자, 나노파이버와 같은 나노구조체에 효소를 고정화하여 사용하는 경우, 부피대비 표면적이 넓어 효소의 당화 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다. In order to solve such a problem, a technique of immobilizing and using an enzyme has been proposed. In particular, when an enzyme is immobilized on a nanostructure such as a nanoparticle, a magnetic nanoparticle, or a nanofiber, the saccharification efficiency of the enzyme can be increased by increasing the surface area relative to the volume.
그러나, 이와 같은 효소 고정화 기술을 바이오매스의 당화공정에 적용하는 경우, 도 1a, 1b에 도시한 것과 같이, 바이오매스가 매우 큰 물질이기 때문에 고정화된 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 분해하기가 어려워진다. However, when such an enzyme immobilization technique is applied to the saccharification process of biomass, since the biomass is a very large substance as shown in FIGS. 1A and 1B, the immobilized enzyme penetrates into the biomass and is difficult to decompose Loses.
즉, 효소는 일반적으로 수십 나노 수준의 분자인데 일반 화학물질을 분해하는 경우 화학물질이 작아 효소가 화학물질과 제대로 반응할 수 있지만, 바이오매스의 경우 그 크기가 상대적으로 크기 때문에 고정화되어 자유롭게 움직이지 못하는 상태의 효소가 바이오매스를 완전히 분해하기가 매우 어려워진다. In other words, enzymes are generally molecules of tens of nanometers. When decomposing general chemicals, the enzyme is able to react properly with chemicals because of the small size of the chemical. However, the biomass is immobilized because it is relatively large in size and moves freely It is very difficult for enzymes that can not be completely decomposed to completely decompose biomass.
한편, 바이오매스의 전처리 공정은 섬유소의 함량을 증가시키고 미세섬유의 결정성을 감소시켜 바이오매스의 단위면적당 효소의 흡착율을 높임으로써, 섬유소의 반응성을 증가시키고 효소 가수분해 능력을 증가시키기 위한 공정이다.Meanwhile, the pretreatment process of biomass is a process for increasing the content of fibrin and decreasing the crystallinity of fine fiber to increase the adsorption rate of enzyme per unit area of biomass, thereby increasing the reactivity of fibrin and increasing the hydrolysis capacity of enzyme .
상기 전처리 방법으로는 바이오매스의 종류에 따라 다양한 물리적, 화학적 방법이 있으며, 예를 들어 증기 폭쇄법, 알칼리 처리법, 이산화황 처리법, 과산화수소 처리법, 초임계 암모니아 처리법, 약산 추출 처리법, 암모니아 동결 폭쇄법 등이 알려져 있다. As the pretreatment method, there are various physical and chemical methods depending on the kind of the biomass. For example, steam explosion method, alkali treatment method, sulfur dioxide treatment method, hydrogen peroxide treatment method, supercritical ammonia treatment method, weak acid extraction treatment method, ammonia freeze- It is known.
이중 가장 많이 사용되는 약산 추출 처리법은 고온고압의 반응기에 목재 등을 미분쇄하여 장입하고 그 틈새로 저농도의 산을 흘러 보내주어 헤미셀룰로스와 일부 리그닌을 추출하여 제거하는 방법이다. 그러나, 상기 방법은 바이오매스 조직의 물리적 파쇄를 유발하기 어렵고 추출수에 미세입자가 동반하여 배관이 폐색되거나 처리 전 미분쇄에 과도한 동력이 소요되는 등의 문제점이 있다. The most widely used weak acid extraction method is a method in which wood or the like is finely pulverized in a high-temperature and high-pressure reactor and low-concentration acid is flowed into the gap to extract and remove hemicellulose and a part of lignin. However, the above method has a problem that it is difficult to cause physical breakdown of the biomass structure, the piping is closed due to the fine particles in the extraction water, or excessive power is required for the pulverization before the treatment.
또한, 알칼리 전처리의 경우 높은 pH 값(≥ 10)에 의해서 이후에 따르는 셀룰로스 분해 효소 및 자일란 분해 효소의 활성을 저해하게 되어 이후에 pH 저해 공정이 뒤따라야 한다. 이 공정에서는 다량의 물을 사용해야 하며 산 처리시는 불필요한 염류를 형성하여 여전히 해결해야 하는 문제로 남아있다. In addition, the alkaline pretreatment inhibits the activity of the cellulolytic enzymes and xylenolytic enzymes due to the high pH value (≥ 10), and subsequent pH inhibition processes must be followed. In this process, a large amount of water must be used, and the acid treatment still forms an undesirable salt and remains a problem to be solved.
무엇보다도 현재 가장 많이 사용되는 두 가지 전처리 방법 모두 단당류만 생성되는 것이 아니라 약산, 퓨란 유도체, 페놀계 화합물 등이 발생하게 되며, 이런 화학물들은 이후 발효 공정에서 활용될 미생물에 치명적인 독성을 유발하게 되어 뒤따르는 발효 공정의 효율을 저감시키는 영향을 미치게 된다. First of all, the two most common pre-treatment methods are not only producing monosaccharides but also weak acid, furan derivatives, phenol compounds, etc. These chemicals cause toxicities to the microorganisms to be used in the fermentation process. Thereby reducing the efficiency of the following fermentation process.
이런 문제를 해결하기 위해 화학적인 처리 방법이 아닌 물리적인 처리 방법을 이용한 바이오매스 처리 방법들이 최근 연구되고 있다. 대한민국 등록특허 10-1171922에서는 바이오매스의 전처리를 위해 먼저 스톤 그라인딩, 기계적 째기, 찢기, 핀 그라인딩, 공기 마찰 밀링에 의해 초기 바이오매스의 크기를 감소시키고 이후 전자빔 조사를 통해 바이오매스를 분해하는 공정이 개시하고 있다. 그러나, 이 경우 두 번의 전처리 공정을 수행하게 되고 무엇보다도 전자빔 조사는 에너지 소비가 높아서 실제 바이오매스 분해를 통해서 생성되는 에너지보다 더 많은 에너지를 소비하게 되는 문제점이 있다. To solve these problems, biomass treatment methods using physical treatment methods rather than chemical treatment methods have been recently studied. Korean Patent No. 10-1171922 discloses a process for pretreatment of biomass by first reducing the size of initial biomass by stone grinding, mechanical tearing, tearing, pin grinding, air friction milling and then decomposing biomass through electron beam irradiation Lt; / RTI > However, in this case, two pre-processing steps are performed. In particular, electron beam irradiation consumes more energy than energy generated through actual biomass decomposition because of high energy consumption.
또한, 대한민국 특허 10-1159290은 디스크 밀링 방법을 사용하여 바이오매스를 전처리하는 방법을 사용하고 있으나, 이는 비교적 겉 표면막이 약한 해조류 바이오매스에만 적용될 수 있으며, 전처리 후에도 H2SO, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA(para-toluene sulfonic acid)와 같은 고체산 촉매 처리가 뒤따르는 2단계 전처리 공정이 필요하다. Korean Patent No. 10-1159290 uses a method of pretreating biomass using a disc milling method. However, this method can be applied only to a weak seaweed biomass with a relatively outer surface film. Even after pretreatment, H2SO, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH , HCOOH, HClO4, H3PO4, and para-toluene sulfonic acid (PTSA).
한편 Energy & Fuels (2006) 20, 807-811에서는 볼 분쇄(ball milling)를 통해서 셀룰로오스의 결정성을 약화시키는 기술이 개시하고 있으나, 이 기술은 볼 분쇄된 셀룰로오스를 약산 처리하여 셀룰로오스 결정성 약화의 효과를 얻는 것이다. 또 다른 공지 기술인 AIChE Journal (2010) 57, 793-800 에서도 마찬가지로 볼 분쇄를 사용하여 셀룰로오스의 분해에 미치는 영향을 공지하였으며 이 기술의 경우 고압증기에 상태에서 볼 분쇄를 병행하여 사용하고 있다. On the other hand, Energy & Fuels (2006) 20, 807-811 discloses a technique for weakening the crystallinity of cellulose through ball milling. However, this technology is a technique for weakening the crystallinity of the cellulose by weakly processing ball milled cellulose. Effect. Another known technique, AIChE Journal (2007) 57, 793-800, similarly uses ball milling to affect the degradation of cellulose, and this technique uses ball milling in combination with high pressure steam.
즉, 오로지 물리적인 분쇄(milling) 만을 이용한 바이오매스의 효율적인 전처리 공정은 아직 개발되지 못하였다.
That is, an efficient pretreatment process of biomass using only physical milling has not yet been developed.
본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제점을 해결함과 동시에 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있으며, 고정화 효소의 바이오 매스에 대한 접근성을 높여 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감할 수 있는 당화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
DISCLOSURE OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to solve the problems of conventional chemical pretreatment methods such as production of toxic by-products, loss of mass of biomass, environmental pollution, A process for preparing a sugar compound capable of solving the problem of grinding efficiency and capable of reducing accessibility to the biomass of the immobilized enzyme and minimizing the degradation due to repeated use of the enzyme and increasing the recovery rate of the enzyme, .
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계; 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계;를 포함하며, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법을 제공한다. Means for Solving the Problems To achieve the above object, the present invention provides a method for producing biomass comprising: i) a physical pretreatment step of crushing biomass; And ii) a saccharification step of decomposing the physically pretreated biomass using an enzyme, wherein an immobilized enzyme is used in the saccharification step for decomposing the physically pretreated biomass The present invention provides a method for producing a sugar compound using an immobilized enzyme.
이때, 상기 고정화 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 당화가 충분히 이루어질 수 있도록, 상기 물리적 전처리 단계는 a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식으로 이루어지는 것이 바람직하다.The physical pretreatment step may include a) a planetary mill for grinding a mixture of the biomass and the buffer by means of a ball in a container for confinement, so that the immobilized enzyme penetrates into the inside of the biomass, , Or b) an attrition mill method in which a mixture of biomass and buffer is crushed using a ball in a container equipped with a stirrer.
상기 고정화 효소는 다양한 방식으로 제조될 수 있으나, 바람직한 일 실시예로 버퍼용액에 효소를 첨가하여 효소용액을 준비하는 단계, 상기 준비된 효소용액에 나노구조체를 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계, 및 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다. The immobilized enzyme may be prepared in various ways, but in one preferred embodiment, the enzyme solution is prepared by adding an enzyme to the buffer solution, adding the nanostructure to the prepared enzyme solution, Stirring the solution, adsorbing the enzyme on the surface of the nanostructure, and coagulating and cross-linking the adsorbed enzyme on the surface of the nanostructure.
이때, 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교 결합시키기 위하여, 응집제 및 가교결합제가 별도로 첨가될 수 있는데, 상기 응집제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. At this time, in order to coagulate and cross-link the enzymes adsorbed on the surface of the nanostructure, a coagulant and a crosslinking agent may be separately added. The coagulant may be methanol, ethanol, 1-propanol, 2- , Ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate and aqueous solutions thereof may be used, and the crosslinking agent may be a diisocyanate, a dianhydride, Is selected from the group consisting of diepoxide, diepoxide, dialdehyde, diimide, 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide, glutaraldehyde, bis (imidoesters), bis (succinimidyl esters) Or a mixture thereof may be used.
상기 응집제 및 가교결합제를 통하여 응집 및 가교 결합된 효소는 상기 나노구조체의 표면을 둘러싼 쉘을 형성하는 것을 특징으로 한다. 상기 나노구조체를 둘러싼 쉘의 형태를 가진 고정화 효소는 물리적으로 분쇄된 바이오매스를 분해하여 효율적으로 당화가 이루어질 수 있도록 한다. The coagulated and cross-linked enzyme through the coagulant and the crosslinking agent forms a shell surrounding the surface of the nanostructure. The immobilized enzyme having a shell-like structure surrounding the nanostructure can physically degrade the pulverized biomass so that saccharification can be efficiently performed.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 고정화 효소는, 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 나노구조체를 풀어주는 단계, 및 상기 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the immobilized enzyme may include a step of releasing the nanostructure so that the nanostructure is spread well in the enzyme solution and the reaction area in which the enzyme is immobilized is widened, Adding the enzyme solution to the enzyme solution, stirring the enzyme solution to which the nanostructure is added, and culturing the enzyme solution to adsorb the enzyme on the surface of the nanostructure.
이때, 상기 나노구조체가 버퍼용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 풀어주기 위하여, 나노구조체를 에탄올에 30초~5분간 담구는 것이 바람직하다.At this time, it is preferable that the nanostructure is immersed in ethanol for 30 seconds to 5 minutes in order to spread the nanostructure well in the buffer solution and to loosen the reaction area where the enzyme can be immobilized.
한편, 본 발명에 따른 i) 물리적 전처리 단계가 효율적으로 이루어지기 위하여, 물리적 전처리는 100~120분 동안 진행되며, 바이오매스의 농도는 20~40g/ℓ인 것이 바람직하며, 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ이고, 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것이 바람직하다. Meanwhile, in order to efficiently perform the physical pretreatment step according to the present invention, the physical pretreatment is performed for 100 to 120 minutes, the concentration of the biomass is preferably 20 to 40 g / l, 1 to 5Φ, and the rotation speed of the vessel or the agitator for pulverizing the biomass is preferably 150 to 400 rpm.
또한, 상기 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1 : 0.5~1.5(혼합물 : 볼)이고, 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기의 60~70%인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 i) 물리적 전처리 단계에서 사용되는 버퍼는 후속공정인 ⅱ) 당화 단계에서 사용되는 버퍼와 동일하며, 상기 i) 물리적 전처리 단계 후에 별도의 부산물 제거 단계 없이 바로 ⅱ) 당화 단계가 이어지는 것이 바람직하다. Preferably, the volume ratio of the mixture of the biomass and the buffer to the bowl is 1: 0.5 to 1.5 (mixture: ball), and the total volume of the biomass, the buffer and the bowl is 60 to 70% of the volume of the vessel. The buffer used in the i) physical preprocessing step is the same as the buffer used in the subsequent step ii) the saccharification step, and ii) the saccharification step is preferably followed by i) the physical pretreatment step without any additional by- Do.
한편, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 효소 처리가 30~40 시간 동안 진행되며, 효소 사용량이 0.8~1 FPU/g-biomass인 것이 바람직하다.
Meanwhile, in the ii) saccharification step, the enzyme treatment is carried out for 30 to 40 hours, and the amount of enzyme used is preferably 0.8 to 1 FPU / g-biomass.
본 발명의 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법은 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제점을 해결함과 동시에 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있으며, 고정화 효소의 바이오 매스에 대한 접근성을 높여 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다.
The method of producing the sugar compound from the biomass using the immobilized enzyme of the present invention solves the problems of toxic byproducts, mass loss of biomass, environmental pollution, and the like, which the conventional chemical pretreatment method has, It is possible to solve the problem of low grinding efficiency of the grinding method and to improve the accessibility to the biomass of the immobilized enzyme so as to minimize the decrease in activity due to the repeated use of the enzyme and to increase the recovery rate of the enzyme, Can be obtained.
도 1a,b는 바이오매스의 당화공정에서 고정화되지 않은 효소(a)와 고정화효소를 사용하는 경우의 당화 여부를 설명하기 위한 도면이다.
도 2a,b는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리 방법으로서, 유성분쇄 방식(a)과 마멸분쇄 방식(b)의 원리를 설명하는 도면이다.
도 3은 전처리 전과 유성분쇄와 마멸분쇄 방식의 전처리 후의 볏짚의 SEM 사진 모습이다. (전처리 전의 볏짚의 모습(a), 유성 분쇄 후 볏짚의 모습(전처리 볏짚 농도 5 g/ℓ(b), 10 g/ℓ(c), 20 g/ℓ(d), 40 g/ℓ(e), 60 g/ℓ(f)), 마멸 분쇄 후 볏짚의 모습(전처리 볏짚 농도 5 g/ℓ(g), 10 g/ℓ(h), 20 g/ℓ(i), 40 g/ℓ(j), 60 g/ℓ(k))
도 4는 본 발명의 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스와 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 본 발명의 실시예에 따른 고정화 효소(1)(2)를 이용하여 당화 공정을 수행한 경우 생성된 단당류 글루코오즈의 농도를 표시한 그래프이다.
도 5a,b는 본 발명의 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 실시예에 따른 고정화 효소(1)(2)를 이용하여 당화 공정을 5회 반복 수행하는 경우 효소의 활성(activity) 저하 정도를 표시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 물리적 전처리를 한 바이오매스에 대하여 고정화 효소(2)를 이용하여 바이오매스 분해를 시행하는 경우, 효소 반응기에서의 단당류 생성 정도를 시간에 따라 표시한 그래프이다.Figs. 1A and 1B are diagrams for explaining whether glycation occurs when enzyme (a) and immobilized enzyme which are not immobilized in the glycation process of biomass are used.
FIGS. 2A and 2B are diagrams for explaining the principle of the oil-based grinding method (a) and the abrasive grinding method (b) as a pretreatment method according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a SEM photograph of the rice straw after pretreatment, pre-treatment with oily crushing and abrasive crushing method. (B), 10 g / ℓ (c), 20 g / ℓ (d) and 40 g / ℓ (e) of pretreated rice straw (a) ), 60 g / ℓ (f), 20 g / ℓ (i), and 40 g / ℓ of pretreatment rice straw concentration (5 g / j), 60 g / l (k)
FIG. 4 is a graph showing the results of a biomass without physical pretreatment and a biomass with a physical pretreatment according to the present invention when the saccharification process was carried out using the immobilized enzyme (1) (2) according to the embodiment of the present invention. It is a graph showing the concentration of Oz.
FIGS. 5A and 5B show the degree of activity decrease of the enzyme when the saccharification process is repeated 5 times using the immobilized enzyme (1) (2) according to the embodiment for the biomass with the physical pretreatment of the present invention It is a graph.
FIG. 6 is a graph showing the degree of monosaccharide formation in an enzyme reactor over time when biomass decomposition is performed using the immobilized enzyme (2) on the biomass having the physical pretreatment of the present invention.
이하, 본 발명의 고정화 효소를 이용하여 바이오매스로부터 당화합물을 제조하는 방법을 첨부된 도면 및 실시예들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, a method for preparing a sugar compound from biomass using the immobilized enzyme of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings and embodiments.
본 발명의 당화합물의 제조방법은 i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계, 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계를 포함하며, 상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 한다. The method for producing the sugar compound of the present invention comprises i) a physical pretreatment step of pulverizing biomass, and ii) a saccharification step of decomposing the physically pretreated biomass using an enzyme, wherein ii) in the saccharification step, An immobilized enzyme is used for the decomposition of the pretreated biomass.
이때, 상기 고정화 효소가 상대적으로 더 큰 바이오매스의 내부까지 침투하여 충분히 분해할 수 있도록, 상기 물리적 전처리 단계가 도 2a,b에 도시된 것과 같이 a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식으로 이루어지게 된다.
At this time, the physical pretreatment step is performed such that a) a mixture of the biomass and the buffer is transferred to the inside of the vessel for confinement so that the immobilized enzyme penetrates into the inside of the relatively larger biomass and can be sufficiently decomposed. , Or b) an attrition mill method in which a mixture of biomass and buffer is crushed using a ball in a vessel equipped with a stirrer.
바이오매스의 당화 공정에 사용되는 효소들은 매우 고가의 물질일 뿐만 아니라, 당화 공정을 수행하는 동안 효소의 3차원 구조가 변형되어 활성을 잃게 되는 경우가 많으며, 사용된 효소의 회수가 어려워 당화 공정의 소요비용을 높이는 주된 원인이 되고 있다. The enzymes used in the saccharification process of biomass are not only very expensive materials but also the three-dimensional structure of the enzyme is deformed during the saccharification process and the activity is lost. Since it is difficult to recover the used enzyme, It is becoming a major cause of cost increase.
이에, 효소의 변형을 방지하고 회수를 손쉽게 하기 위하여 고정화 효소를 사용하는 방법이 제안될 수 있으나, 고정화 효소를 바이오매스의 당화공정에 적용하는 경우, 도 1a, 1b에 도시한 것과 같이 바이오매스가 고정화 효소보다 상대적으로 큰 물질이기 때문에 고정화된 효소가 바이오매스 내부까지 침투하여 분해하기가 어려워진다. Therefore, a method using an immobilized enzyme may be proposed to prevent deformation of the enzyme and to facilitate recovery. However, when the immobilized enzyme is applied to the saccharification process of biomass, as shown in FIGS. 1A and 1B, Since the immobilized enzyme is relatively larger than the immobilized enzyme, the immobilized enzyme penetrates into the biomass and becomes difficult to decompose.
본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 바이오매스를 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 마멸분쇄(attrition mill) 방식의 물리적 전처리로 분쇄하여 목질계 바이오매스에 존재하는 리그닌과 같이 일반적인 볼 분쇄로는 처리가 어려운 단단한 껍질도 분쇄할 수 있을 뿐만 아니라, 고정화 효소가 내부까지 침투하여 충분히 분해할 수 있도록 바이오매스를 분쇄하는 것을 특징으로 한다. In order to solve this problem, in the present invention, a biomass is pulverized by a physical pretreatment such as a planetary milling or an attrition milling so that a typical ball milling furnace such as lignin present in woody biomass The present invention is characterized not only of crushing a hard shell which is difficult to be treated but also of pulverizing the biomass so that the immobilized enzyme penetrates into the inside and is sufficiently decomposed.
종래의 물리적 전처리 방법인 볼 분쇄(ball milling) 방법은 일정 속도 이상 회전력을 높이면 세라믹볼에 작용하는 원심력과 구심력이 평형을 이루게 되면서 세라믹볼이 더 이상 낙하하지 않아 분쇄가 발생하지 않게 되어 분쇄 효율을 향상시키는데 한계가 있었다. 또한, 목질계 바이오매스와 같이 셀룰로오즈를 둘러싼 리그닌을 깨뜨려야 비로소 셀룰로오즈를 통한 당화와 발효 공정이 가능한 경우에는 낮은 분쇄 효율로 인하여 충분한 전처리가 이루어지기 어려웠다.Conventional physical pretreatment method, ball milling method, is a method in which a centrifugal force acting on a ceramic ball is balanced with a centrifugal force when a rotational speed is higher than a predetermined speed, so that the ceramic ball no longer falls, There was a limit to improvement. In addition, when lignin surrounding cellulose such as woody biomass is broken, saccharification and fermentation process through cellulose can be performed, it is difficult to perform sufficient pretreatment because of low grinding efficiency.
이에 반해, 본 발명에 따른 물리적 전처리 방법은 a) 도 2a에 도시된 바와 같이 용기가 서로 다른 회전축으로 공전과 자전을 동시에 함으로써, 두 개의 서로 다른 회전축을 가진 회전력을 통해 내부의 세라믹볼의 회전을 극대화하여 바이오매스를 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식을 이용하거나, b) 도 2b에 도시된 바와 같이 샤프트 핀(shaft pin)이 형성된 교반기(agitator)에 의해서 용기 내에 힘의 구배를 유도하고, 상기 힘의 구배가 형성된 용기 내에서 세라믹볼 간의 마찰을 유도하여 내부에 있는 바이오매스를 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식을 이용하여 물리적 전처리를 수행하는 것을 특징으로 한다. On the contrary, the physical pretreatment method according to the present invention is characterized in that: (a) as shown in FIG. 2A, the container simultaneously revolves and rotates at different rotational axes to rotate the internal ceramic balls through rotational force having two different rotational axes A planetary mill method of crushing the biomass to maximize the biomass, or b) inducing a gradient of force in the vessel by means of an agitator formed with a shaft pin as shown in Fig. 2b, And physical pretreatment is performed using an attrition mill method of inducing friction between the ceramic balls in the vessel in which the gradient of the force is formed to crush the biomass therein.
이와 같이 본 발명의 물리적 전처리 방법은 종래의 화학적 전처리 방법이 가지고 있는 독성 부산물의 생성, 바이오매스의 질량 손실, 환경 오염 등의 문제 및 종래의 볼 분쇄 방법이 가지는 낮은 분쇄 효율의 문제를 해결할 수 있다.As described above, the physical pretreatment method of the present invention can solve the problem of generation of toxic by-products, loss of mass of biomass, environmental pollution, and low pulverization efficiency of the conventional ball milling method that the conventional chemical pretreatment method has .
이때, 분쇄가 충분히 이루어지면서 전처리에 소요되는 에너지 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 상기 물리적 전처리가 100~120분 동안 진행되는 것이 바람직하며, 내부 용액의 점성을 높이지 않으면서도 볼과 바이오매스와의 충돌이 충분히 이루어지도록 상기 바이오매스의 농도는 20~40g/l 인 것이 바람직하다.In this case, it is preferable that the physical pretreatment is performed for 100 to 120 minutes in order to maximize the monosaccharide production efficiency with respect to the energy required for the pretreatment while the pulverization is sufficiently performed, The concentration of the biomass is preferably 20 to 40 g / l so that sufficient collision can be achieved.
또한, 충분한 분쇄효과를 얻으면서도 볼과 용기의 손상을 방지하기 위하여, 상기 물리적 전처리 단계에서 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ인 것이 바람직하며, 상기 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것이 바람직하다.In order to prevent damage to the bowl and the vessel while obtaining a sufficient grinding effect, the size of the balls used in the physical pretreatment step is preferably 1 to 5Φ, and the rotating speed of the vessel or the agitator for crushing the biomass Is preferably 150 to 400 rpm.
그리고, 최적의 분쇄 효과를 얻기 위하여, 상기 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1:0.5~1.5, 바람직하게는 1:1의 부피비로 사용될 수 있으며, 상기 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기의 60~70%인 것이 바람직하다.In order to obtain an optimum grinding effect, the volume ratio of the mixture of the biomass and the buffer to the volume of the ball may be 1: 0.5 to 1.5, preferably 1: 1, and the total volume of the biomass, The volume is preferably 60 to 70% of the vessel.
한편, 상기 바이오매스는 볏짚 등 다양한 바이오매스가 사용될 수 있으며, 효율적인 분쇄를 위하여 버퍼와의 혼합물 형태로 용기 내로 투입된다. 이때, 상기 버퍼는 다양한 물질이 사용될 수 있으나, 본 발명의 전처리 방법은 독성 부산물 제거 및 세척 등을 위한 후처리 공정이 필요하지 않으므로, 바이오연료 제조를 위한 후속 공정인 당화 공정에 사용되는 버퍼와 동일한 버퍼를 사용하여 후속공정에서 그대로 이용할 수 있으며, 이 경우 버퍼를 교환하는 추가 공정 및 비용이 발생하지 않는다. On the other hand, the biomass can be used as various biomass such as rice straw, and is put into a container in the form of a mixture with a buffer for efficient pulverization. At this time, various materials can be used for the buffer. However, since the pretreatment method of the present invention does not require a post-treatment step for removing toxic by-products and washing, the buffer used in the subsequent saccharification step The buffer can be used directly in the subsequent process, in which case no additional process and no expense of exchanging the buffer.
또한, 효소 처리에 소요되는 시간 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 효소 처리는 30~40 시간 동안 진행되는 것이 바람직하며, 또한, 효소 사용량 대비 단당류 생성 효율을 최대화하기 위하여 효소 사용량은 0.8~1 FPU/g-biomass인 것이 바람직하다.
In order to maximize the monosaccharide production efficiency with respect to the time required for the enzyme treatment, the enzyme treatment is preferably performed for 30 to 40 hours. In order to maximize the monosaccharide production efficiency with respect to the enzyme usage amount, the enzyme usage is 0.8 to 1 FPU / g-biomass.
한편, 물리적 전처리가 완료된 바이오매스는 바로 당화 공정으로 넘어가게 되는데, 이때 고정화 효소(immobilized enzyme)가 분쇄된 바이오매스 사이사이로 침투하여 바이오매스의 당화를 수행하게 된다. On the other hand, the biomass that has been physically pretreated is transferred directly to the saccharification process. At this time, the immobilized enzyme permeates between the pulverized biomass to perform saccharification of the biomass.
이때, 상기 고정화 효소는 다양한 방식으로 제조될 수 있으나, 바람직한 일 실시예로 포스페이트(phosphate) 버퍼와 같은 버퍼용액(buffer solution)에 효소를 첨가하여 효소용액(enzyme solution)을 준비하는 단계, 상기 준비된 효소용액에 나노구조체를 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계, 및 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다. At this time, the immobilized enzyme can be prepared in various ways, but in one preferred embodiment, an enzyme solution is prepared by adding an enzyme to a buffer solution such as a phosphate buffer, Adding an enzyme solution to a nanostructure, stirring the enzyme solution with the nanostructure added thereto and culturing the enzyme solution to adsorb the enzyme on the surface of the nanostructure, and coagulating and cross-linking the enzyme adsorbed on the surface of the nanostructure ≪ / RTI >
상기 나노구조체는 나노파티클, 자성나노입자, 나노파이버 등 다양한 형태가 사용될 수 있으며, 상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교 결합시키기 위하여, 응집제 및 가교결합제가 별도로 첨가될 수 있다.The nanostructure may be in various forms such as nanoparticles, magnetic nanoparticles, and nanofibers. To agglutinate and cross-link the enzymes adsorbed on the surface of the nanostructure, an aggregating agent and a crosslinking agent may be separately added.
상기 응집제는 나노구조체 표면에 흡착된 효소들이 서로 응집하여 더 큰 덩어리를 형성하는 효과를 얻기 위한 것으로, 효소의 활성에 영향을 주지 않으면서 응집효과를 가져올 수 있는 모든 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. The coagulant is used for the purpose of obtaining an effect of coagulating the enzymes adsorbed on the surface of the nanostructure to form a larger lump. Any substance capable of effecting coagulation without affecting the activity of the enzyme can be used, Is any one selected from methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butyl alcohol, acetone, PEG, ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate, Mixtures of these may be used.
또한, 상기 가교결합제는 상기 응집된 효소들이 서로 가교결합하여 나노구조체를 쉘(shell)처럼 둘러싸도록 하는 효과를 얻기 위한 것으로, 효소의 활성에 영향을 주지 않으면서 가교결합을 형성할 수 있는 모든 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. In addition, the crosslinking agent is used for obtaining an effect of cross-linking the coagulated enzymes to surround the nanostructure as a shell, and it is possible to use any substance capable of forming crosslinking without affecting the activity of the enzyme May be used, and preferably diisocyanate, dianhydride, diepoxide, dialdehyde, diimide, 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide, glutaraldehyde, bis (imido ester) (Succinimidyl ester) and diacid chloride, or a mixture thereof may be used.
상기 응집제 및 가교겹합제를 통하여 응집 및 가교 결합된 효소는 상기 나노구조체의 표면을 둘러싼 쉘을 형성하게 되며, 이러한 구조를 통하여 나노구조체와 효소간에 실질적인 결합이 형성되지 않은 경우에도 나노구조체의 표면에 최대한 많은 양의 효소가 고정화될 수 있다. The coagulated and cross-linked enzyme through the coagulant and the crosslinked pellet form a shell surrounding the surface of the nanostructure. Even if no substantial bond is formed between the nanostructure and the enzyme through the structure, the surface of the nanostructure As much enzyme as possible can be immobilized.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 고정화 효소는, 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 나노구조체를 풀어주는 단계, 및 상기 풀어진 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계를 통해서 제조될 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the immobilized enzyme may include a step of releasing the nanostructure so that the nanostructure is spread well in the enzyme solution and the reaction area where the enzyme can be immobilized is widened, Is added to the enzyme solution, and the enzyme solution to which the nanostructure is added is stirred and cultured to adsorb the enzyme on the surface of the nanostructure.
나노파이버 등의 나노구조체는 물에 잘 퍼지지 않는 경우가 많아, 효소용액 내에서 물과 경계층이 생기거나, 아예 효소용액 내에서 가라앉지 못하고 표면에 떠버려 효소와 제대로 반응하지 못하는 경우가 있을 수 있다. 이에, 상기 나노구조체를 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록 풀어주기 위하여, 나노구조체를 에탄올과 같은 소수성 액체에 30초~5분간 담구어 그 구조를 풀어준 후 사용하는 것이 바람직하다. Nanostructures such as nanofibers often do not spread well to water, so that water and boundary layers may form in the enzyme solution, or they may not sink into the enzyme solution and float on the surface, resulting in failure to react properly with the enzyme . The nanostructure was immersed in a hydrophobic liquid such as ethanol for 30 seconds to 5 minutes to dissolve the nanostructure so that the nanostructure was spread well in the enzyme solution and the reaction area where the enzyme could be immobilized was widened. It is preferable to use it afterwards.
이와 같이 제조된 고정화 효소는 반복사용에 따른 초기 안정성은 응집제 및 가교겹합제를 사용한 경우보다는 다소 떨어지지만 바이오매스의 당화 효율을 높이는 효과를 얻을 수 있다.The initial stability of the immobilized enzyme thus produced is somewhat lower than that of the coagulant and the crosslinked double layer, but the effect of increasing the saccharification efficiency of the biomass can be obtained.
이하 본 발명에 따라 볏짚을 이용하여 당화합물을 제조한 실시예들을 통하여 본 발명의 효과를 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the effects of the present invention will be described in detail with reference to examples in which a sugar compound is prepared using rice straw according to the present invention. However, these embodiments are intended to illustrate one or more embodiments, and the scope of the invention is not limited to these embodiments.
마멸 분쇄와 유성 분쇄를 이용한 Using abrasive milling and oil milling 바이오매스Biomass 전처리 Pretreatment
본 발명의 전처리 공정을 실시하기 위해 먼저 볏짚을 먼저 400μm ~ 2cm 의 크기로 가정용 분쇄기(Blending)로 분쇄한 후 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 시행하였다. In order to perform the pretreatment process of the present invention, the rice straw was first pulverized by a household grinder with a size of 400 μm to 2 cm, and then subjected to attrition milling and planetary milling.
상기 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 사용할 때에는 버퍼(Buffer)를 첨가하되, 후에 진행할 당화 공정을 생각하여 효소 분해공정에서 사용되는 동일한 버퍼인 50 mM의 소디움 포스페이트 혹은 소디움 포스페이트버퍼를 사용하였다. When the attrition mill and the planetary mill are used, a buffer is added, and a 50 mM sodium phosphate or sodium phosphate buffer (50 mM) used in the enzymatic digestion process Were used.
또한, 이때 3Φ 크기의 볼(ball)을 사용하였으며, 볏짚과 버퍼(Buffer)를 합한 혼합물과 볼(Ball)의 부피비가 1:1의 비율이 되도록 하였으며, 용기(Vessel) 안의 볏짚과 버퍼(Buffer), 볼(Ball)을 포함하는 총 부피가 65%가 되도록 하였다. The volume ratio of the mixture of the rice straw and the buffer to the volume ratio of the balls was 1: 1. The rice straw in the vessel and the buffer (Buffer) ), And the ball (ball) was 65%.
상기의 조합으로 세라믹 볼과 볏짚을 넣고 마멸 분쇄기와 유성 분쇄기에 넣은 후, 300 rpm의 회전속도로 분쇄를 실시하여 샘플을 채취하였다.
The ceramic ball and rice straw were put in the above combination, put in a wax crusher and an oil crusher, and pulverized at a rotating speed of 300 rpm to collect a sample.
전처리시 바이오매스의 농도에 따른 볏짚의 크기 분석Analysis of rice straw size according to biomass concentration in pretreatment
먼저 본 발명에 따른 전처리시 바이오매스의 농도에 따라 얻어진 볏짚의 크기를 알아보고자 8시간 동안 마멸 분쇄(Attrition mill)와 유성 분쇄(Planetary mill)를 실시한 후 SEM(Scanning Electron Microscop) 분석을 시행하였고 이를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 전처리된 볏짚은 농도가 낮을수록 분쇄 효율이 더 좋았고 마멸 분쇄(Attrition mill)보다는 유성 분쇄(Planetary mill)로 분쇄를 시행하였을 때 좀 더 향상된 효과를 보였다. In order to investigate the size of the rice straw obtained according to the concentration of the biomass in the pretreatment according to the present invention, SEM (Scanning Electron Microscope) analysis was performed after performing attrition milling and planetary milling for 8 hours, 3. As can be seen from FIG. 3, the lower the concentration of the pretreated rice straw, the better the crushing efficiency and the more effective the crushing by the planetary mill than the attrition mill.
전체적인 모습을 봤을 때 유성 분쇄의 경우 볏짚을 깨뜨리는 것과 같은 형상을 보이지만 마멸 분쇄는 볏짚을 표면부터 마모시키는 형상을 보이고 있다.
In the case of oily crushing, the shape of crushing straw is similar to that of crushing straw.
나노파이버의Nanofiber 제조 Produce
PS(polystyrene)와 PSMA(poly(styrene-co-maleic anhydride))을 2:1의 중량비로 THF 용매에 용해하여 고분자 혼합 용액을 준비하였다. 상기 준비된 고분자 혼합 용액을 30-gauge 스텐레스 스틸 니들이 형성된 플라스틱 실린지(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 채운 후, 고전압 서플라이(ES30P-10W, Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL,USA)를 사용하여 상기 니들에 7kV의 전압을 걸어 나노파이버를 전기방사하였다. 상기 전기방사된 나노파이버를 니들 팁으로부터 7cm 떨어진 거리에 위치한 알루미늄 포일에 모았다. 생성된 나노파이버는 200~1000nm의 직경을 가지는 것으로 관찰되었다.
PS (polystyrene) and PSMA (poly (styrene-co-maleic anhydride)) were dissolved in a THF solvent at a weight ratio of 2: 1 to prepare a polymer mixed solution. The prepared polymer mixture solution was filled into a plastic syringe (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) having a 30-gauge stainless steel needle and charged with a high voltage power supply (ES30P-10W, Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, ), A voltage of 7 kV was applied to the needle to electrospun nanofibers. The electrospun nanofibers were collected in an aluminum foil located at a distance of 7 cm from the needle tip. The resultant nanofibers were observed to have a diameter of 200 to 1000 nm.
고정화 효소(1)의 제조Preparation of Immobilized Enzyme (1)
셀룰라아제-나노파이버 복합체를 제조하기 위하여, 먼저 100-mM 포스페이트 버퍼(pH 8.0)에 10㎎/㎖의 효소 용액을 준비하였다. 상기 실시예3에서 제조한 나노파이버를 효소용액 1㎖에 첨가한 후, 30분 동안 상온에서 200rpm으로 교반한 후, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 2시간 동안 60rpm으로 교반하였다. 그 다음, 3% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 1㎖와 암모늄 설페이트 0.5g 를 첨가하고, 2시간 동안 상온에서 200rpm으로 교반한 후, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 밤새 30rpm으로 배양하였다.To prepare the cellulase-nanofiber composite, 10 mg / ml of enzyme solution was first prepared in 100-mM phosphate buffer (pH 8.0). The nanofibers prepared in Example 3 were added to 1 ml of the enzyme solution, stirred at 200 rpm for 30 minutes at room temperature, transferred to a locker, and stirred at 60 rpm for 2 hours at 4 ° C. Subsequently, 1 ml of 3% glutaraldehyde and 0.5 g of ammonium sulfate were added, stirred at 200 rpm at room temperature for 2 hours, transferred to a locker, and cultured at 4 ° C overnight at 30 rpm.
이와 같이 제조된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 100-mM 포스페이트 버퍼로 워싱(washing)한 후, 글루타르 알데하이드의 결합되지 않은 기능기들은 100mM Tris-HCL을 사용하여 캐핑(capping)하였다. 캐핑된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 100-mM 포스페이트 버퍼로 워싱 용액에 효소가 관찰되지 않을 때까지 워싱(washing)하였다.
The thus-prepared cellulase-nanofiber composite was washed with 100-mM phosphate buffer, and the unbound functional groups of glutaraldehyde were capped using 100 mM Tris-HCL. The capped cellulase-nanofiber composite was washed with 100-mM phosphate buffer until the enzyme was not observed in the wash solution.
고정화 효소(2)의 제조Preparation of Immobilized Enzyme (2)
보다 많은 양의 셀룰라아제를 고정화셀룰라아제-나노파이버 복합체로 형성하기 위하여, 먼저 상기 실시예 3에서 제조한 나노파이버를 에탄올에 1분간 담가서 소수성으로 뭉쳐있는 나노파이버를 보다 넓게 풀어주고 이를 꺼내서 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 제조하였다. In order to form a larger amount of the cellulase into the immobilized cellulase-nanofiber composite, the nanofibers prepared in Example 3 were immersed in ethanol for 1 minute to release the hydrophobic nanofibers more widely, and then the nanofibers were taken out from the cellulase- Complex.
먼저, 셀룰라아제를 100 mM 포스페이트 (pH 8.0)에 10㎎/㎖의 농도로 준비하였다. 상기 실시예 3에서 제조하고 에탄올에 담근 나노파이버를 상기 효소용액 1㎖에 첨가한 후, 30분 동안 상온에서 200rpm으로 교반하고, 라커(locker)로 옮겨 4℃에서 2시간 동안 60rpm으로 교반하였다. 이와 같이 제조된 셀룰라아제-나노파이버 복합체를 워싱 용액에 효소가 관찰되지 않을 때까지 워싱(washing)하였다.
First, cellulase was prepared at a concentration of 10 mg / ml in 100 mM phosphate (pH 8.0). The nanofibers prepared in Example 3 and immersed in ethanol were added to 1 ml of the enzyme solution, stirred at 200 rpm at room temperature for 30 minutes, transferred to a locker, and stirred at 60 rpm for 2 hours at 4 ° C. The thus prepared cellulase-nanofiber composite was washed in the washing solution until no enzyme was observed.
두가지 방법에 따른 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 효소 분해능 비교Comparison of Enzymatic Resolution of Cellulase-Nanofiber Composites by Two Methods
상기 실시예 4,5에서 준비된 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 바이오매스 분해능을 비교하기 위하여, 상기 셀룰라아제-나노파이버 복합체가 단위 나노파이버 무게당 얼마만큼의 고정화되지 않은 셀룰라아제의 성능을 나타내는지 측정하여 하기 표 1에 나타내었다. In order to compare the biodegradability of the cellulase-nanofiber composite prepared in Examples 4 and 5, it was determined how much the cellulase-nanofiber composite exhibited the performance of the immobilized cellulase per unit nanofiber weight, Respectively.
<실시예 4,5의 셀룰라아제-나노파이버 복합체의 효소 분해능 비교><Comparison of enzymatic resolution of the cellulase-nanofiber composite of Examples 4 and 5>
상기 표1에서 보는 바와 같이 에탄올을 사용하여 나노파이버를 풀어준 경우 에탄올을 사용하지 않은 경우에 비해서 약 3.5배 가량 분해능이 더 좋았다. 이는 에탄올을 통해서 나노파이버를 풀어줘서 효소가 고정화될 수 있는 반응 면적이 훨씬 넓어져 더 많은 양의 셀룰라아제가 고정화됐기 때문으로 볼 수 있다.
As shown in Table 1, when nanofibers were loosened using ethanol, the resolution was about 3.5 times better than the case where no ethanol was used. This can be attributed to the release of nanofibers through ethanol, which results in a much wider reaction area where the enzyme can be immobilized, resulting in the immobilization of larger amounts of cellulase.
전처리 여부에 따른 단당류 생성 향상 효과 비교Comparison of effect of preprocessing on monosaccharide production
상기 실시예 4, 5에서 준비된 고정화 효소(1),(2)를 사용하여 실시예 1의 유성분쇄 전처리를 한 바이오매스와 본 발명의 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스에 대하여 당화공정을 수행하여 생성된 단당류 글루코오즈의 농도를 측정하였다.Using the immobilized enzymes (1) and (2) prepared in Examples 4 and 5, the biomass obtained by pretreating the oil-based pulverization of Example 1 and the biomass without physical pretreatment of the present invention were produced The concentration of the monosaccharide glucoside was measured.
도 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 고정화 효소(1),(2)의 경우 모두 물리적 전처리를 하지 않은 바이오매스보다 전처리를 한 바이오매스에서 훨씬 높은 당화 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
As can be seen from the results of FIG. 4, it was confirmed that the immobilized enzymes (1) and (2) exhibited much higher glycosylation efficiency in the biomass pretreated than the biomass without physical pretreatment.
전처리 시간에 따른 단당류 생성 향상 효과 비교Comparison of effect of pretreatment time on monosaccharide formation
상기 실시예 4, 5에서 준비된 고정화 효소(1),(2)를 사용하여 실시예 1의 유성분쇄 전처리를 한 바이오매스에 대하여 당화공정을 5회 반복 수행하여 효소의 활성(activity) 저하 여부를 측정하였다.Using the immobilized enzymes (1) and (2) prepared in Examples 4 and 5, the saccharification process was repeated five times for the biomass pretreated with the oil-based pulverization of Example 1 to determine whether the activity of the enzyme decreased Respectively.
도 5a,b의 결과에서 볼 수 있듯이, 고정화 효소(1)의 경우에는 안정성이 뛰어나 효소의 활성이 지속적으로 유지되고, 고정화 효소(2)의 경우에는 초기에는 안정성이 조금 떨어지지만 이후에는 활성이 지속적으로 유지되는 것으로 확인되었다.
As can be seen from the results of FIGS. 5A and 5B, the stability of the immobilized enzyme (1) is excellent and the activity of the enzyme is continuously maintained. In the case of the immobilized enzyme (2) It is confirmed that it is maintained continuously.
효소반응기에서 장시간 In an enzymatic reactor, 바이오매스Biomass 분해에 따른 단당류 생성 Production of monosaccharide by decomposition
상기 실시예 4,5에서 준비된 고정화 효소(1),(2) 중 효소의 담지량이 많아서 분해능이 높고 반복 사용에도 효소 활성을 유지하는 고정화 효소(2)를 사용하여 전체 반응 부피 20㎖의 회분식 효소 반응기에 볏짚 바이오매스를 넣고 당화공정을 실시하였다.Using the immobilized enzyme (2), which has a large amount of enzyme to be loaded in the immobilized enzymes (1) and (2) prepared in Examples 4 and 5 and has a high resolution and maintains enzyme activity for repeated use, Rice straw biomass was added to the reactor and saccharification process was performed.
도 6에서 보는 바와 같이 시간이 지나면서 단당류인 글루코즈가 점점 증가하다가 52시간에 이르러서 더 이상 당화가 이루어지지 않고 saturation되는 것을 확인할 수 있어서 본 연구에서 준비된 고정화 효소(2)를 사용하면 52시간 만에 바이오매스의 분해를 충분히 할 수 있다는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 6, it was confirmed that the glucose, which is a monosaccharide, gradually increased over time, and that the sugar was saturated after 52 hours. Thus, the immobilized enzyme (2) It was confirmed that biomass could be decomposed sufficiently.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 당화합물 제조방법은 물리적 전처리 단계에 의하여 고정화 효소의 접근성을 높임으로써, 독성 부산물의 발생과 바이오매스의 손실을 줄이고 당 수율을 향상시켜 친환경적으로 바이오연료를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 효소의 반복사용에 따른 활성저하를 최소화하고 효소의 회수율을 높여 전체공정의 소요비용을 절감하는 효과를 얻을 수 있다. As described above, the method for producing the sugar compound of the present invention increases the accessibility of the immobilized enzyme by the physical pretreatment step, thereby reducing the generation of toxic by-products and the loss of biomass and improving the sugar yield, In addition, it is possible to minimize the decrease in activity due to the repeated use of the enzyme and increase the recovery rate of the enzyme, thereby reducing the cost of the whole process.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.The present invention is not limited to the above-described specific embodiments and descriptions, and various modifications can be made to those skilled in the art without departing from the gist of the present invention claimed in the claims. And such modifications are within the scope of protection of the present invention.
Claims (14)
i) 바이오매스를 분쇄하는 물리적 전처리 단계; 및 ⅱ) 상기 물리적 전처리된 바이오매스를 효소를 이용하여 분해시키는 당화 단계;를 포함하며,
상기 ⅱ) 당화 단계에서, 물리적 전처리된 바이오매스의 분해를 위하여 고정화 효소(immobilized enzyme)가 사용되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.A method for producing a sugar compound from a biomass using an immobilized enzyme,
i) a physical pretreatment step of pulverizing the biomass; And ii) a saccharification step of decomposing the physically pretreated biomass using an enzyme,
(Ii) an immobilized enzyme is used for digestion of physically pretreated biomass in the saccharification step.
상기 물리적 전처리 단계는, a) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 공자전하는 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 유성분쇄(planetary mill) 방식, 또는 b) 바이오매스와 버퍼의 혼합물을 교반기가 구비된 용기 내에서 볼을 이용하여 분쇄하는 마멸분쇄(attrition mill) 방식 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method according to claim 1,
The physical pretreatment step may comprise the steps of: a) a planetary mill method of grinding a mixture of biomass and buffer using a ball in a container for co-electrification; or b) mixing a mixture of biomass and buffer in a vessel equipped with a stirrer And an attrition mill system for pulverizing by using a ball in an immobilized enzyme.
상기 고정화 효소는,
버퍼용액에 효소를 첨가하여 효소용액을 준비하는 단계;
상기 준비된 효소용액에 나노구조체를 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계; 및
상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키는 단계;
를 통해서 제조되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method according to claim 1,
The above-
Preparing an enzyme solution by adding an enzyme to the buffer solution;
Adding the nanostructure to the prepared enzyme solution, and then stirring and culturing the enzyme solution to which the nanostructure is added to adsorb the enzyme on the surface of the nanostructure; And
Aggregating and cross-linking the enzymes adsorbed on the surface of the nanostructure;
≪ / RTI > wherein the method comprises the steps of:
상기 나노구조체 표면에 흡착된 효소들을 응집 및 가교결합시키기 위하여, 응집제 및 가교결합제가 첨가되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method of claim 3,
Wherein a coagulant and a crosslinking agent are added to coagulate and cross-link enzymes adsorbed on the surface of the nanostructure.
상기 응집제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.5. The method of claim 4,
Wherein the flocculant is selected from the group consisting of methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butyl alcohol, acetone, PEG, ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate, Or a mixture thereof. ≪ Desc / Clms Page number 24 >
상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.5. The method of claim 4,
The crosslinking agent is selected from the group consisting of diisocyanate, dianhydride, diepoxide, dialdehyde, diimide, 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide, glutaraldehyde, bis (imidoester) Ester), and diacid chloride, or a mixture thereof.
응집 및 가교결합된 효소가 상기 나노구조체의 표면을 둘러싼 쉘을 형성하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method of claim 3,
Wherein the coagulated and cross-linked enzyme forms a shell surrounding the surface of the nanostructure.
상기 고정화 효소는,
나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록, 나노구조체를 풀어주는 단계; 및
상기 나노구조체를 효소용액에 첨가한 후, 상기 나노구조체가 첨가된 효소용액을 교반, 배양하여 상기 나노구조체 표면에 효소를 흡착시키는 단계;
를 통해서 제조되는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method according to claim 1,
The above-
Releasing the nanostructure so that the nanostructure is spread well in the enzyme solution and the reaction area where the enzyme can be immobilized is widened; And
Adding the nanostructure to an enzyme solution, and then agitating and culturing the enzyme solution to which the nanostructure is added to adsorb the enzyme on the surface of the nanostructure;
≪ / RTI > wherein the method comprises the steps of:
상기 나노구조체가 효소용액에 잘 퍼지게 함과 동시에 효소가 고정화될 수 있는 반응면적이 넓어지도록, 나노구조체를 에탄올에 30초~5분간 담그는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.9. The method of claim 8,
Wherein the nanostructure is immersed in ethanol for 30 seconds to 5 minutes so that the nanostructure is spread well in the enzyme solution and the reaction area in which the enzyme can be immobilized is widened.
상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 물리적 전처리는 100~120분 동안 진행되며, 바이오매스의 농도는 20~40g/ℓ인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.3. The method of claim 2,
Wherein the physical pretreatment is performed for 100 to 120 minutes and the biomass concentration is 20 to 40 g / l in the i) physical pre-treatment step.
상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 사용되는 볼의 크기는 1~5Φ이며, 바이오매스의 분쇄를 위한 용기 또는 교반기의 회전 속도는 150~400rpm인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.3. The method of claim 2,
The method for producing a sugar compound using the immobilized enzyme according to any one of the preceding claims, wherein i) the size of the balls used is 1 to 5Φ in the physical pretreatment step, and the rotation speed of the vessel or agitator for pulverizing the biomass is 150 to 400 rpm.
상기 i) 물리적 전처리 단계에서, 바이오매스와 버퍼의 혼합물과 볼의 부피비는 1 : 0.5~1.5(혼합물 : 볼)이고, 바이오매스, 버퍼 및 볼의 총 부피는 상기 용기 부피의 60~70%인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.3. The method of claim 2,
Wherein the volume ratio of the mixture of the biomass and the buffer to the volume of the bowl is 1: 0.5 to 1.5 (mixture: ball), and the total volume of the biomass, the buffer and the bowl is 60 to 70% ≪ / RTI > wherein the method comprises the steps of:
상기 i) 물리적 전처리 단계에서 사용되는 버퍼가 후속공정인 ⅱ) 당화 단계에서 사용되는 버퍼와 동일하며,
상기 i) 물리적 전처리 단계 후에 별도의 부산물 제거 단계 없이 바로 ⅱ) 당화 단계가 이어지는 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.3. The method of claim 2,
The buffer used in the i) physical preprocessing step is the same as the buffer used in the subsequent step ii) the saccharification step,
Wherein the step i) is preceded by a saccharification step ii) without any additional by-product removal step after the physical pretreatment step.
상기 ⅱ) 당화 단계에서, 효소 처리가 30~40 시간 동안 진행되며, 효소 사용량이 0.8~1 FPU/g-biomass인 것을 특징으로 하는 고정화 효소를 이용한 당화합물의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the enzymatic treatment is carried out for 30 to 40 hours in the saccharification step and the enzyme is used in an amount of 0.8 to 1 FPU / g-biomass.
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| KR101996934B1 (en) * | 2018-05-24 | 2019-07-05 | 한국세라믹기술원 | Fusion apparatus for treating biomass continueously using chemical method and physical method simultaneously and treating method of biomass using the same |
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