KR20150033697A - 중합체성 표면의 개질 방법 - Google Patents

중합체성 표면의 개질 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150033697A
KR20150033697A KR1020157002165A KR20157002165A KR20150033697A KR 20150033697 A KR20150033697 A KR 20150033697A KR 1020157002165 A KR1020157002165 A KR 1020157002165A KR 20157002165 A KR20157002165 A KR 20157002165A KR 20150033697 A KR20150033697 A KR 20150033697A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polymeric surface
monomer
coating
intermittent
solution
Prior art date
Application number
KR1020157002165A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 아메링거
로렌스 미거
헬무트 티센
폴 패식
케이티 스타이안
Original Assignee
폴리머스 씨알씨 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2012902793A external-priority patent/AU2012902793A0/en
Application filed by 폴리머스 씨알씨 리미티드 filed Critical 폴리머스 씨알씨 리미티드
Publication of KR20150033697A publication Critical patent/KR20150033697A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J7/00—Chemical treatment or coating of shaped articles made of macromolecular substances
    • C08J7/12—Chemical modification
    • C08J7/16—Chemical modification with polymerisable compounds
    • C08J7/18—Chemical modification with polymerisable compounds using wave energy or particle radiation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D3/00—Pretreatment of surfaces to which liquids or other fluent materials are to be applied; After-treatment of applied coatings, e.g. intermediate treating of an applied coating preparatory to subsequent applications of liquids or other fluent materials
    • B05D3/06—Pretreatment of surfaces to which liquids or other fluent materials are to be applied; After-treatment of applied coatings, e.g. intermediate treating of an applied coating preparatory to subsequent applications of liquids or other fluent materials by exposure to radiation
    • B05D3/061—Pretreatment of surfaces to which liquids or other fluent materials are to be applied; After-treatment of applied coatings, e.g. intermediate treating of an applied coating preparatory to subsequent applications of liquids or other fluent materials by exposure to radiation using U.V.
    • B05D3/065—After-treatment
    • B05D3/067—Curing or cross-linking the coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/16—Apparatus for enzymology or microbiology containing, or adapted to contain, solid media
    • C12M1/18—Multiple fields or compartments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2325/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an aromatic carbocyclic ring; Derivatives of such polymers
    • C08J2325/02—Homopolymers or copolymers of hydrocarbons
    • C08J2325/04—Homopolymers or copolymers of styrene
    • C08J2325/06—Polystyrene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2433/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
    • C08J2433/04—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers esters
    • C08J2433/06—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers esters of esters containing only carbon, hydrogen, and oxygen, the oxygen atom being present only as part of the carboxyl radical
    • C08J2433/10—Homopolymers or copolymers of methacrylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2433/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
    • C08J2433/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
    • C08J2433/26—Homopolymers or copolymers of acrylamide or methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/20—Small organic molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Treatments Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Coating Of Shaped Articles Made Of Macromolecular Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 중합체성 표면을 적어도 하나의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 용액과 접촉한 중합체성 표면을 자외선에 노출시켜 중합체성 표면 위에 코팅된 단량체의 그라프트-중합체를 제공하는 단계를 포함하는 중합체성 표면의 개질 방법에 관한 것이다.

Description

중합체성 표면의 개질 방법{PROCESS FOR MODIFYING A POLYMERIC SURFACE}
본 발명은 중합체성 표면을 개질하여 그라프팅된 중합체성 코팅을 제공하는 방법에 관한 것이다.
중합체 코팅을 도포하여 기판 표면을 개질하는 것은 계면 특성, 예컨대 표면 에너지(예: 습윤 거동), 투과성, 생물-활성 및 화학 반응성을 제어하는 보편적이고도 효율적인 수단이다. 중합체 코팅을 도포한 결과로서 기판에 부여될 수 있는 이익으로는 화학적 감지 능력, 내마모성, 기체 장벽 증진, 단백질 내성, 생체적합성, 세포 성장 및 분화의 조장 및 선택적으로 생물분자에 결합하는 능력을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 따라서, 이러한 중합체 코팅을 형성하기 위한 방법론은 대단히 실제적인 이익을 준다.
예를 들어, 중합체성 재료, 예컨대 폴리스티렌은 우수한 성형성, 투명성 및 저비용을 나타내며, 이로 인해 이들은 다중웰 플레이트, 플라스크 및 마이크로캐리어 입자와 같은 세포 배양 기판을 형성하는데 이상적이다. 그러나, 작용기를 결여하는 소수성 표면은 세포 및 단백질과의 상호작용을 제어하는 능력을 제한한다.
표면 개질은 생체적합성을 증진하고, 세포 결합 또는 선별을 돕는 작용기의 부착을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 친수성 중합체 브러쉬의 그라프팅에 의해 개질된 기판 재료는 세포 배양 응용에 대한 특성을 상당히 증진할 수 있다. 다수의 표면 그라프팅 기술, 예컨대 감마 방사선, 전자빔 및 UV-개시 그라프팅이 연구되었지만, 코팅 특성에 대해 그리고 궁극적으로 생물학적 반응에 대해 우수한 제어를 제공하는 경제적인 처리 방법을 제공할 필요가 있다.
중합체성 표면 위에 중합체 코팅을 형성하는 한가지 접근법은 물리적 또는 화학적 흡착 기술을 사용하는 것이다. 물리적 흡착 기술이 가장 보편적으로 사용되며, 딥-코팅, 드롭 캐스팅, 스핀-코팅, 독터 블레이드 필름 적용, 및 롤투롤 코팅을 들 수 있다. 그러나, 이러한 코팅들은 특정의 화학적 및/또는 물리적 환경(예: 유기 용매, 온도 변화 및/또는 기계적 마모)에 노출되는 경우 탈층(delamination)되기 쉽다.
중합체 코팅을 형성하는 대안적인 접근법은 기판 표면에 중합체 쇄를 공유적으로 부착시키는 것을 수반한다. 상기 언급된 흡착 기술과 달리, 기판에 중합체 쇄를 공유적으로 부착시키면 코팅이 화학적 또는 물리적 수단에 의해 좀처럼 탈적층되지 않는다. 기판에 중합체 쇄를 공유적으로 부착시켜 그 위에 중합체 코팅을 형성하는 한 가지 특별한 방법은 소위 "그라프팅 투(grafting to)" 기술을 이용한다. 이 기술에 의해, 예비-형성된 중합체 쇄가 기판 표면에 공유적으로 부착된다. 그러나, 기판 표면 결합 부위에서의 확산 및 입체장애 제약으로 인하여, 이 기술은 비교적 열등한 그라프팅 밀도를 산출하기 쉽다. 또한, 이 기술에 의해 달성될 수 있는 코팅 두께는 제한적이다.
중합체 쇄는 또한 소위 "그라프팅 프롬(grafting from)" 기술을 이용하여 기판 표면에 그라프팅될 수 있다. "그라프팅 투" 기술과 달리, "그라프팅 프롬" 기술은 기판 표면에서 단량체를 중합하여 표면 "으로부터" 중합체 쇄를 생성하는 것을 수반한다. 이 기술은 "그라프팅 투" 기술의 확산 및 입체장애 제약을 덜 받기 때문에 비교적 높은 그라프팅 밀도를 더욱 용이하게 달성할 수 있다. 그러나, "그라프팅 프롬" 기술은 종종 복잡하며 다중 단계를 필요로 한다. 특히, 그라프트 중합체에 의해 코팅하고자 하는 기판의 표면은 일반적으로 어떤 방식으로 개질되거나 활성화되어, 예를 들어, 자유 라디칼 중합이 진행될 수 있도록 할 필요가 있다. 따라서, 기판 표면에 대해 글로(glow) 또는 코로나 방전(corona discharge) 예비-처리를 수행하여 그 위에 필요한 라디칼 부위를 산출할 수 있는 작용기의 형성을 촉진할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 자유 라디칼 개시제 화합물을 그라프팅하고자 하는 기판 표면 위에 고정시킬 수 있다. 많은 "그라프팅 프롬" 기술은 또한 3차원 표면 위에 균일한 중합체 코팅을 효과적이고 효율적으로 형성할 수 없다. 또한, 코팅 두께는 종종 비교적 좁은 한도 내에서만 제어될 수 있으며, 코팅 두께는 전형적으로 다중 인자에 의해 결정되기 때문에 제어가 달성되기 어려울 수 있다. 따라서, 기판 위에 그라프트 중합체 코팅을 형성하기 위한 종래 기술을 개선하거나, 적어도 이러한 그라프트 중합체 코팅을 제조하기 위한 유용한 대안적인 방법을 제공할 여지가 있다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 제품 등에 대한 논의는 전적으로 본 발명에 대한 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이들 중의 어느 하나 또는 전부가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하였기 때문에 선행기술의 일부를 형성한다거나 본 발명과 관련된 분야에서의 보편적인 일반 지식이라는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명자들은 하기 단계를 포함하는 중합체성 표면의 개질 방법을 제공한다:
중합체성 표면을 적어도 하나의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
용액과 접촉한 중합체성 표면을 자외선에 노출시켜 중합체성 표면 위의 코팅으로서 단량체의 그라프트-중합체를 제공하는 단계.
중합체성 표면 및 용액이 개시제를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
한 세트의 실시양태에서, 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액은 임의로 하나 이상의 수혼화성 용매를 포함하는 수용액이다. 따라서, 본 실시양태에서는 에틸렌적으로 불포화된 단량체가 물에 적어도 좀 녹으며 더욱 바람직하게 수용성인 것이 일반적으로 바람직하다.
자외선에 대한 표면의 노출은 일반적으로 UV 방사선에 대한 펄스 또는 단속적 노출일 것이다. 본 발명자들은 중합체성 표면이 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액과 접촉하는 중에 자외선에 단속적으로 노출되면 UV 그라프팅을 사용하는 경우 중합체성 표면 위의 에틸렌적으로 불포화된 단량체 및 특히 수용성 에틸렌적으로 불포화된 단량체로부터의 그라프트 알키텍처(architecture)가 상당히 개선된다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 중합체성 표면을 자외선에 펄스 또는 단속적으로 노출시키는 것을 수반할 수 있다. 자외선에 중합체성 표면을 단속적으로 노출시키는 것이 특히 바람직하며, 에틸렌적으로 불포화된 단량체로부터 형성된 그라프트 중합체의 알키텍처에 있어서 상당한 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 중합체성 표면의 단속적 노출에 의해 제공된 알키텍처는 연속적 노출에 의해 제조된 상응하는 그라프트 중합체 코팅과 비교하여 수성 환경에서 코팅의 개선된 팽윤을 제공한다.
이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니지만, 중합체성 표면을 자외선에 단속적으로 노출시키면 자외선에의 노출 피리오드(period) 및 자외선에 노출되지 않는 피리오드 중에 형성된 중합체 층 사이의 알키텍처에 차이를 만든다.
본 명세서에서 사용된 용어 단속적 노출은 적어도 약 0.5 초, 더욱 바람직하게 적어도 약 1 초, 더욱 바람직하게 적어도 약 2 초 기간의 UV 광 노출 피리오드(온-피리오드(on-period))를 지칭한다. 노출 기간(온-피리오드)은 약 3 분 이하, 더욱 바람직하게 약 60 초 이하 및 더욱 더 바람직하게 약 45 초 이하일 수 있다. 노출 사이의 피리오드(오프-피리오드(off-period))는 약 60 분 이하, 더욱 바람직하게 약 30 분 이하, 더욱 더 바람직하게 약 10 분 이하, 예컨대 5 분 이하, 2 분 이하 및 1 분 이하의 기간일 수 있다. 노출 사이의 피리오드(오프-피리오드)는 적어도 약 5 초, 바람직하게 적어도 약 10 초, 더욱 바람직하게 적어도 약 15 초, 더욱 바람직하게 적어도 약 20 초, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 25 초의 기간일 수 있다.
한 세트의 실시양태에서, 자외선에 중합체성 표면을 단속적으로 노출시키는 공정은 노출 사이의 시간을 5 초 내지 60 분 범위로 하여 0.5 초 내지 3 분 범위로 UV에 노출시키는 피리오드를 포함한다. 자외선에의 노출 횟수는 일반적으로 적어도 3회 노출이다. 추가 세트의 실시양태에서, 중합체성 표면을 단속적으로 노출시키는 공정은 표면을 수용액과 접촉시키는 중에 5 내지 100 회 범위로 0.5 초 내지 5 분, 예컨대 0.5 초 내지 3 분의 범위로 지속하여 자외선에 노출시키며 노출 사이의 시간 간격은 1 초 내지 60 분, 예컨대 5 초 내지 60 분 또는 10 초 내지 5 분 범위인 단계를 포함한다.
용어 펄스 노출은 노출 사이의 간격을 0.05 s 미만으로 하여 0.05 s 미만의 노출 피리오드(온-피리오드)를 지칭한다. 공업적 플래쉬 램프 시스템을 이용하여 10 μs 내지 300 μs의 펄스 폭(온 플러스 오프 피리오드)이 제공될 수 있다.
"그라프트" 중합체는 중합체 쇄가 중합체성 표면의 적어도 표면에 공유적으로 커플링되는 것을 의미한다. 그라프팅된 중합체 쇄는 단일중합체 쇄 또는 공중합체 쇄일 수 있다. 그라프트 중합체가 "코팅"이 되는 것은 복수개의 중합체 쇄가 중합체성 표면의 표면에 공유적으로 커플링되어 집합적으로 그라프트 중합체의 층을 형성하는 것을 의미한다. 그라프트 중합체 쇄는 가교될 수 있다. 코팅은 일반적으로 중합체성 표면의 그라프팅된 영역의 표면 특성을 개질할 것이다.
본 명세서의 상세한 설명 및 특허청구범위를 통해 용어 "포함하다"와 이 용어의 변형, 예컨대 "포함하는" 및 "포함하다(3인칭 단수형)"는 기타 첨가제, 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하고자 의도하지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 그 위에 중합체성 코팅을 그라프팅하고자 하는 중합체성 표면이 제공된다. 적합한 중합체성 표면의 예로는 하기로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 중합체를 포함하는 표면을 들 수 있으나, 이로 제한되지는 않는다: 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 실리콘 중합체, 예컨대 폴리디메틸실록산; 아크릴 단일중합체 및 공중합체, 예컨대 폴리아크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸아크릴레이트; 비닐 할라이드 단일중합체 및 공중합체, 예컨대 폴리비닐 클로라이드; 플루오로중합체, 에컨대 불화 에틸렌-프로필렌; 폴리비닐 에테르, 예컨대 폴리비닐 메틸 에테르; 폴리비닐리덴 할라이드, 예컨대 폴리비닐리덴 플루오라이드 및 폴리비닐리덴 클로라이드; 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤; 폴리비닐 방향족, 예컨대 폴리스티렌, 폴리비닐 에스테르, 예컨대 폴리비닐 아세테이트; 비닐 단량체 상호간 및 올레핀과의 공중합체, 예컨대 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, ABS 수지, 및 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체; 천연 및 합성 고무, 예를 들어, 부타디엔스티렌 공중합체, 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 부타디엔-아크릴로니트릴 공중합체, 폴리클로로프렌 고무, 폴리이소부틸렌 고무, 에틸렌프로필렌디엔 고무, 이소부틸렌-이소프렌 공중합체 및 폴리우레탄 고무; 폴리아미드, 예컨대 나일론 66 및 폴리카프로락탐; 폴리에스테르, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 알키드 수지; 페놀-포름알데히드 수지; 우레아-포름알데히드 수지, 멜라민-포름알데히드 수지; 폴리카보네이트; 폴리옥시알킬렌, 예컨대 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 및 이들의 블록 공중합체; 폴리이미드; 폴리에테르; 에폭시 수지, 폴리우레탄; 모; 면; 실크; 레이온; 레이온-트리아세테이트; 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 부티레이트; 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트; 셀로판; 셀룰로오스 니트레이트; 셀룰로오스 프로피오네이트; 셀룰로오스 에테르; 카복시메틸 셀룰로오스; 단백질, 폴리펩티드; 및 폴리사카라이드.
일부 실시양태에서, 중합체성 표면은 포화 탄소-탄소 결합 만으로 구성되고 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 포함하지 않는다. 이러한 중합체성 표면에서, 존재하는 최소의 결합 에너지는 전형적으로 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 중합체성 표면에서보다 더 크다. 이러한 중합체성 표면의 예는 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체 및 폴리비닐 방향족, 예컨대 폴리스티렌, 스티렌 공중합체, 폴리-이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 폴리클로로프렌 고무, 폴리이소부틸렌 고무, 에틸렌-프로필렌디엔 고무 및 이소부틸렌-이소프렌 공중합체를 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 중합체성 표면과 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액은 실질적으로 라디칼 개시제를 포함하지 않는다. "라디칼 개시제를 실질적으로 포함하지 않음"은 라디칼 개시제 자체가 중합체성 표면 또는 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액에 포함되거나 도입되지 않음을 의미한다. 예를 들어, 중합은 라디칼 개시제의 부재하에 실행된다.
일부 단량체는 UV 방사선에 노출되는 경우 분해되어 라디칼 종을 제공할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 의심을 피하기 위하여, 중합되어 그라프트 중합체 코팅을 형성하는 단량체는 라디칼 개시제의 정의 내에 포괄시키고자 하지 않는다. "라디칼 개시제"의 표현은 일차적으로 자유 라디칼을 생성할 목적으로 사용되며 광개시제, 예컨대 벤조페논 및 아세토페논 유도체, 예컨대 디에톡시 아세토페논 및 기타 라디칼 개시제, 예컨대 아조 개시제 및 퍼옥사이드를 포함하는 화합물을 의미하고자 한다.
표면은 코로나 방전과 같은 공정에 의해 처리될 수 있다. 이러한 처리 공정은 때때로 공정을 사용하여 개질될 수 있는 필름 또는 세포 배양 플레이트와 같은 중합체성 제품의 제조에 사용된다. 일반적으로 코로나 방전의 효과는 비교적 오래가지 못하므로 저장 후 표면이 불활성화된다.
개질하고자 하는 중합체성 표면은 본 발명의 방법이 적용되는 제품의 전체 또는 단지 부분을 구성할 수 있다. 예를 들어, 그라프트 중합체성 코팅이 중합체성 표면의 적어도 부분 위에 형성될 수 있다. 제품이 중합체로 형성되는 경우, 중합체 대부분은 개질되지 않은 상태로 남아 제품의 기계적 특성이 유지될 수 있다. 대안적으로, 개질하고자 하는 중합체성 표면은 그 자체가 기판 위의 코팅으로서 존재할 수 있다. 기판은 중합체성일 수 있거나, 대안적으로 비-중합체성 기판, 예컨대 유리, 세라믹 또는 금속 기판일 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체성 표면은 세포 배양에 사용되는 제품 위 또는 부분에 존재한다. 세포 배양 장치는 일정 범위의 당업계에 공지된 구조적 형태일 수 있다. 이러한 구조적 형태는 배양 플레이트, 예컨대 6, 12, 24, 48 96, 1536 또는 그 이상의 웰과 같은 다수의 웰을 포함하는 마이크로역가 또는 마이크로웰 플레이트 및 세포 배양 플라스크를 포함한다. 기판은 또한 캐리어 입자, 예컨대 마이크로캐리어 입자의 형태일 수 있다. 이들 실시양태에서, 개질하고자 하는 기판 표면이 투명한 것이 바람직하다.
이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 중합은 대개 중합체성 표면에서 발생하여 중합체가 표면으로부터 그라프팅되는 것으로 믿어진다. 대개의 경우 중합체가 중합체성 표면으로부터 그라프팅됨에 의해 적어도 코팅 효율에 대해서 개선된 제어가 달성될 수 있는 것으로 믿어진다.
복잡성의 결여로 인하여, 본 발명에 따른 방법은 비교적 낮은 작업 및 자본 비용으로 유리하게 실행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 다양한 형상 및 크기를 나타내는 기판 표면, 특히 3차원 표면으로 존재하는 기판 위에 비교적 넓은 범위의 두께를 지닌 그라프트 중합체 코팅을 제어된 방식으로 형성하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 중합체성 표면 및 단량체에 있어서의 커다란 가변성도 가능하다.
본 발명의 방법은 중합체 표면을 적어도 하나의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 용액은 수성, 부분적인 수성, 또는 비-수성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액이 적어도 부분적으로 수성이며 적어도 하나의 수혼화성 유기 용매를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 용액이 수성인 것이 바람직하다. 가장 적합한 용액의 선택은 중합체성 표면, 에틸렌적으로 불포화된 단량체, 및 중합체성 코팅의 의도된 응용에 따라 좌우될 것이다.
용액은 하나 이상의 용매, 예컨대 물, 수혼화성 용매 또는 이의 2가지 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 수혼화성 용매의 예로는 디메톡시설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 아세토니트릴, 아세톤 및 알콜, 예컨대 에탄올 및 이소프로판올을 들 수 있다. 하나 이상의 수혼화성 용매가 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액 내에 존재하는 경우, 이들은 중합 반응, 중합체성 표면, 또는 생성된 그라프트 중합체 코팅에 부정적인 영향을 주지 않도록 선택될 것이다.
본 발명의 방법은 통상적인 유기 용매를 기본으로 하는 중합 반응과 대조적으로 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 환경 친화적인 수용액을 이용하여 유리하게 실행된다. 또한, 수용액은 유기 용매를 기본으로 하는 반응 매질이 사용되는 경우 이용가능한 것과 비교하여 더욱 광범위한 중합체성 표면과 적합성이다. 수용액의 사용은 또한 생물학적 응용, 예컨대 세포 배양 또는 생물 의학적 표면으로서의 용도를 위해 쉽게 제조되는 제품을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 중합체성 코팅은 세포 배양물품(cultureware)으로 채용되며 용액은 수성이다.
용액 내에 존재하는 단량체 농도는 형성하고자 하는 중합체 코팅의 성질에 따라 변화할 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체 농도는 중합체 코팅의 두께에 적합하게 조정될 수 있다. 당업자는 소정의 중합에 필요한 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 농도를 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 용액 내의 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체 농도는 약 0.1%(w/v) 내지 약 25%(w/v) 범위 내에 들어갈 것이다.
수성 반응 매질에 존재할 수 있는 기타 첨가제로는 중합 저해제를 들 수 있다. 이들은 종종 유통기한을 연장하기 위해 상업적으로 이용가능한 단량체에 존재한다. 중합 전에 저해제를 제거할 필요 없이 단량체를 사용할 수 있으므로, 이들 저해제가 존재할 수 있다는 사실은 본 발명의 유리한 특징이다.
본 발명에 따른 중합은 실질적으로 산소가 없는 환경에서 바람직하게 실행된다. 즉, 중합은 실질적으로 산소가 없는 조건 하에 진행시키고자 한다. 이는 당업자에게 주지된 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 단량체 용액 및 용액 위의 임의의 헤드 공간은 불활성 기체, 예컨대 질소 또는 아르곤에 의해 퍼지될 수 있다. 산소의 존재는 중합 공정의 효율을 방해할 수 있다. 산소의 존재에도 불구하고, 비록 느리기는 하지만, 반응이 진행된다는 사실은 본 발명의 유리한 특징인데, 왜냐하면 중합 전에 산소를 완전히 제거할 필요 없이 사용될 수 있기 때문이다.
또한, 단량체 용액은 일반적으로 조사되기 전에 산소가 제거되어 라디칼의 포획을 감소시킨다. 적합한 산소제거 방법으로는 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 단량체 용액을 통한 불활성 기체의 버블링 또는 동결-융해-펌프 사이클(freeze-thaw-pump cycle)을 들 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 예로는 메틸 (메트)아크릴레이트, 에틸 (메트)아크릴레이트, 에틸-3,3-디메틸 (메트)아크릴레이트, 부틸 (메트)아크릴레이트, 이소부틸 (메트)아크릴레이트, 이소부틸(메트)아크릴레이트, tert-부틸 (메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실 (메트)아크릴레이트, 이소보닐 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴산, 하이드록시프로필 (메트)아크릴레이트, 하이드록시부틸 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 2-하이드록시에틸 (메트)아크릴레이트, N-메틸 (메트)아크릴아미드, 디메틸아미노에틸 (메트)아크릴레이트, 이타콘산, 2-카복시에틸 아크릴레이트, 스티렌, p-스티렌 카복실산, p-스티렌 설폰산, 비닐 설폰산, 비닐 포스폰산, 에타크릴산, 알파-클로로아크릴산, 크로톤산, 푸마르산, 시트라콘산, 메사콘산, 말레산, 글리시딜 (메트)아크릴레이트, 하이드록시에틸 (메트)아크릴레이트 석시네이트, 2-(메트)아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, 2-설포에틸(메트)아크릴레이트, 3-설포프로필 (메트)아크릴레이트, 모노-2-[(메트)아크릴로일옥시] 에틸 석시네이트, 하이드록시프로필 (메트)아크릴레이트, N-에틸 (메트)아크릴아미드, N,N-디메틸(메트)아크릴아미드, N,N-디에틸 (메트)아크릴아미드, N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-(하이드록시메틸) (메트)아크릴아미드, N-(2-하이드록시에틸) (메트)아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필) (메트)아크릴아미드, N-메틸올 (메트)아크릴아미드, N-비닐포름아미드, N-비닐아세트아미드, N-비닐-N-메틸아세트아미드, N-(n-프로필)아크릴아미드, N-(n-부틸)(메트)아크릴아미드, N-tert-부틸 (메트)아크릴아미드, 사이클로헥실 (메트)아크릴아미드, N-(3-아미노프로필) (메트)아크릴아미드, 2-아미노에틸 (메트)아크릴레이트, N-[3-(디메틸아미노)프로필] (메트)아크릴아미드, N-(메트)아크릴로일 트리스(하이드록시메틸) 아미노에탄, N-(메트)아크릴로일 트리스(하이드록시메틸) 아미노에탄, 디아세톤 (메트)아크릴아미드, 2-(메트)아크릴로일옥시 에틸 아세토아세테이트, [3-(메타크릴로일아미노)프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드, [3-(메타크릴로일옥시)에틸]-트리메틸암모늄 클로라이드, [2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드, [3-(메타크릴로일아미노)프로필] 디메틸(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 (메트)아크릴레이트, 폴리(프로필렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, 폴리(프로필렌 글리콜) 메틸 에테르 (메트)아크릴레이트, 프로파길 (메트)아크릴레이트, 4-(메트)아크릴로일몰폴린, N-비닐-2-피롤리돈, 글리세롤 모노(메트)아크릴레이트, 글리코실옥시에틸 (메트)아크릴레이트, 비닐 메틸 설폰, 비닐 아세테이트, 2-(메트)아크릴옥시에틸 글루코시드, 에틸렌 글리콜 (메트)아크릴레이트 포스페이트, 에틸렌적으로 불포화된 모노-, 디-, 트리 및 폴리사카라이드(들)(여기에서 사카라이드 부위는 순 중성이다), 양성이온성 단량체, 예컨대 3-((2-(메트)아크릴로일옥시)에틸)디메틸암모니오) 프로판-l-설포네이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸 2-(트리메틸암모니오)에틸 포스페이트, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 및 그의 조합을 들 수 있으나, 이로 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 또한 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 기를 포함하는 "리간드"를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "리간드"는 당업계의 통상의 의미를 취하고자 하며, 다수의 기타 생물분자 존재하에 특정 생물분자, 예를 들어, 세포의 표면에서 발현되는 생물분자와 결합할 수 있는 부위이다.
중합체성 표면에 그라프팅되는 중합체는 채용되는 에틸렌적으로 불포화된 단량체에 따라 단일중합체 또는 공중합체일 수 있다. 중합체는 추가로 하전되거나 중성일 수 있으며, 카복실산 중합체, 설폰산 중합체, 아미노 중합체, 양성이온성 중합체, 중성 친수성 중합체 및 소수성 중합체로 구성된 그룹 중에서 선택된 중합체 계열에 속할 수 있다.
일부 실시양태에서, 용액은 단일 유형의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함한다. 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 본 명세서에 기재된 것들의 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 용액은 적어도 2가지 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함한다.
당업자는 온도, pH 및/또는 수혼화성 공-용매(들)의 존재 또는 부재와 같은 인자들이 소정의 수성 단량체 용액에서 소정의 단량체의 용해도를 변경시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 이러한 인자들은 수용액에서 단량체의 용해도를 증진시키기 위해 편리하게 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 물에 적어도 좀 녹으며, 더욱 바람직하게는 수용성이다. 용어 "좀 녹는"은 100 mL의 용매에 대한 단량체 1 그램의 용해도를 지칭하며, "녹는"은 20 ℃에서 10 mL의 물에 대한 단량체 적어도 1 그램의 용해도를 지칭한다.
수용성인 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 바람직한 예로는 아크릴산, 메타크릴산, 2-카복시에틸 아크릴레이트, 하이드록시에틸 (메트)아크릴레이트 석시네이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, N-알킬 (메트)아크릴아미드(예컨대, N-이소프로필 아크릴아미드), N,N-디메틸 (메트)아크릴아미드, N-(3-아미노프로필) (메트)아크릴아미드, 2-아미노에틸 (메트)아크릴레이트, 디메틸아미노에틸 (메트)아크릴레이트, N-비닐-2-피롤리돈, 2-하이드록시에틸 (메트)아크릴레이트, N-(2-하이드록시프로필) (메트)아크릴아미드, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 3-설포프로필 (메트)아크릴레이트, [3-(메타크릴로일아미노)프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드, [3-(메타크릴로일옥시)에틸]-트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트 및 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트를 들 수 있다. 특히 바람직한 수용성 단량체의 예로는 아크릴산, 2-카복시에틸 아크릴레이트, 아크릴아미드, N-이소프로필 아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트 및 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트를 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 용액은 2가지 단량체를 포함한다. 제1 단량체는 바람직하게 카복실산 작용기를 포함하며, 그러면 중합체성 표면 위에 고정되어 생성되는 중합체성 코팅은 카복실산기를 포함한다. 바람직하게, 제1 단량체는 아크릴산, 메타크릴산 또는 2-카복시에틸 아크릴레이트이다. 제2 단량체는 바람직하게 낮은 생물부착(biofouling) 특성을 제공함으로써 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 중합체성 코팅이 혈청-함유 배양 배지 내의 포유류 세포에 비-부착성이 되게 한다. 바람직하게, 제2 단량체는 당업계에 공지된 바와 같이 아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 등이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제1 단량체는 아크릴산이고 제2 단량체는 아크릴아미드이다. 이들 실시양태에서, 용액 내의 제1 단량체 대 제2 단량체의 몰비는 적어도 1:99, 예컨대 적어도 5:95, 적어도 10:90 또는 적어도 20:80일 수 있고, 90:10 몰비 이하, 예컨대 80:20 이하일 수 있기는 하지만 낮은 생물부착성을 보유한다. 더욱 바람직하게, 비는 40:60 내지 80:20, 예컨대 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 또는 40:60이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 몰비는 40:60이다.
중합체성 표면을 에틸렌적으로 불포화된 단량체 용액과 접촉시킨 다음, 표면을 UV 방사선에 노출시켜 그 위에 라디칼 종을 생성시킨다. 당업자는 UV 방사선이 전형적으로 가시광선보다는 짧지만 X-선보다는 긴 파장을 나타내는 전자기 방사선으로 정의되며, 이에 따라 약 10 nm 내지 약 400 nm 범위의 파장을 나타냄을 인식할 것이다. 중합체성 표면 위에 자유 라디칼을 생성시킬 수만 있다면, 본 발명에따라 사용될 수 있는 UV 방사선의 파장에 대해서는 특별한 제한이 없다. 일반적으로, 사용되는 UV 방사선의 파장은 약 200 nm 내지 약 400 nm 범위일 것이다. 공정에 사용되는 자외선은 바람직하게 400 nm 이하의 파장이다. 공정에 사용되는 자외선은 더욱 바람직하게 300 nm 이하의 파장이다. 자외선의 다양한 적합한 공급원이 사용될 수 있으며, 고강도 마이크로파 무전극 전구 공급원이 특히 바람직하다.
자유 라디칼이 중합체성 표면 위에 생성될 수 있고, 표면이 불리한 영향을 받지 않는다면, 사용될 수 있는 UV 방사선의 강도에도 특별한 제한이 없다. 일반적으로, 적어도 약 200 W/㎠ 이하의 출력을 나타내는 UV 공급원이 사용될 수 있다.
바람직한 세트의 실시양태에서, 수용액은 조사에 노출된 후 물을 사용하여 표면으로부터 세척된다.
용액과 접촉하고 있는 중합체성 표면이 일정 피리오드의 조사에 노출된다. 1 피리오드의 조사는 중합체성 표면이 조사에 노출되는 온-피리오드 및 그 후 중합체성 표면이 조사에 노출되지 않는 오프-피리오드로 간주될 수 있다. 연속 노출의 경우, 정해진 길이의 온-피리오드 및 정해지지 않은 길이의 오프-피리오드를 동반하는 1 피리오드가 있다. 본 발명은 펄스 또는 단속적 조사에 관한 것이며, 이들은 양자 모두 적어도 2 피리오드의 노출을 나타낸다.
펄스 조사의 경우, 노출 피리오드(온-피리오드)는 일반적으로 0.05 s 미만이며 노출 사이의 간격(오프 피리오드)은 0.05 s 미만이다.
바람직한 실시양태에서, 용액과 접촉한 중합체성 표면은 단속적 조사에 노출된다. 정의에 의해, 단속적 조사는 적어도 2 피리오드의 노출을 포함한다. 노출 피리오드의 총 횟수는 중합체성 코팅의 목적하는 특성을 기준으로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 더 두꺼운 중합체성 코팅을 필요로 하는 응용에 있어서, 또는 UV 분해에 더욱 민감한 중합체 표면의 경우에, 노출 피리오드의 횟수가 증가할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 두꺼운 코팅은 밑에 있는 중합체성 표면이 중합체성 코팅 위에서 배양되는 포유류 세포에 '보이지 않도록' 하는데 필요하다. 이들 실시양태에서, 100 피리오드 이하의 노출이 채용될 수 있다.
조사 피리오드의 최적의 기간은 또한 그 위에 그라프팅을 하고자 하는 중합체성 표면의 성질 및 조사 강도에 좌우될 것이다. 일부 경우에, 연장된 조사 피리오드는 중합체성 표면의 변질 및/또는 변형을 유발할 수 있다. 예를 들어, 폴리스티렌으로 형성된 표면의 경우, 약 45 초를 초과하지 않는 노출 시간이 바람직하며, 약 30 초 미만이 더욱 바람직하다. 당업자는 표면의 성질 및 그라프트 단량체 조성, 및 본 명세서의 교시를 참고하여 UV 강도 및 노출 피리오드의 적합한 조합을 결정할 수 있을 것이다.
절대적이고 상대적인 자외선에의 노출(온-피리오드) 및 자외선에의 노출 사이(오프-피리오드)의 기간 및 파워는 중합체성 표면에 적합하도록 그리고 목적하는 특성의 중합체성 코팅을 제공하도록 선택되어야 한다. 일부 실시양태에서 특히 중요한 특성은 중합체성 코팅 두께 및 탄성률이다. 예를 들어, 상대적으로 더 큰 온-피리오드 노출은 더 치밀하고 더 얇은 중합체성 코팅을 초래하는 반면에 상대적으로 더 큰 오프-피리오드 노출은 더 무르고, 더 두껍고, 더 팽윤성이 큰 중합체성 코팅을 초래할 것으로 추정된다.
단속적 조사의 경우, 온-피리오드는 제품, 중합체성 표면의 구조적 온전성 및/또는 중합체성 코팅의 발생이 유지되도록 하여야 한다. 온-피리오드 동안 조사에의 노출은 결합 절단, 비교적 크게 가교된 중합체 성장, 및 실질적인 열 발생을 유발하는 것으로 추정된다. 공정에 관여하는 구성요소의 화학에 따라, 온-피리오드는 해로운 효과를 이끌어낼 수 있다. 이와 같이, 이들 해로운 효과를 피하거나 적어도 적합한 수준으로 감소시키도록 온-피리오드의 기간 및 파워가 선택되어야 한다. 온-피리오드는 또한, 중합을 개시하기에 충분하도록 선택되어야 한다.
예를 들어, 온-피리오드는 적어도 약 0.5 초, 더욱 바람직하게 적어도 약 1 초, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 2 초의 기간일 수 있다. 온-피리오드는 60 초 이하, 더욱 바람직하게 약 45 초 이하, 더욱 더 바람직하게 약 30 초 이하의 기간일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 중합체성 표면이 폴리스티렌을 포함하는 경우, 온-피리오드는 약 1 초 내지 약 45 초, 예컨대 약 5 초 내지 약 45 초의 기간이다.
바람직한 세트의 실시양태에서, 단속적 조사는 1 초 내지 15 초 범위의 온-피리오드 및 1 초 내지 60 초 범위의 오프-피리오드를 포함한다.
약 200 W/㎠ 이하의 출력을 나타내는 UV 광 공급원이 사용되었다.
단속적 조사의 경우, 오프-피리오드는 최종 중합체성 코팅이 충분한 특성을 나타내도록 하여야 한다. 오프-피리오드 동안, 조사에 노출되지 않음에도 불구하고, 중합체 성장은 비-가교로 '부터의 성장' 방식으로 계속되며, 온-피리오드 중에 발생된 열은 어느 정도 소멸될 수 있다고 추정된다. 오프-피리오드 기간은 이들 인자를 고려하여 선택되어야 한다. 특정 시점에, 이 오프-피리오드에서의 중합체 쇄 성장이 멈출것이며, 이에 따라 오프-피리오드로부터 예상되는 이익은 더 이상 없으나, 이 기간은 적어도 중합체 표면, 단량체 용매, 및 단량체에 의존할 것이다.
예를 들어, 오프-피리오드는 약 5 분 미만, 더욱 바람직하게 약 3 분 미만, 더욱 더 바람직하게 약 2 분 미만의 기간일 수 있다. 오프-피리오드는 약 10 초 초과, 더욱 바람직하게 약 20 초 초과, 더욱 더 바람직하게 약 30 초 초과, 더욱 더 바람직하게 약 45 초 초과의 기간일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 중합체성 표면이 폴리스티렌을 포함하는 경우, 오프-피리오드는 약 20 초 내지 약 60 초, 예컨대 20 초 내지 약 50 초의 기간이다.
이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 중합체성 표면을 UV 방사선에 노출시키는 것은 표면의 분자 구조를 이루는 결합이 분해되도록 하여 라디칼 종을 생성하는 것으로 믿어진다. 그 후, 생성된 라디칼 종은 단량체 용액 내에 존재하는 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 자유 라디칼 중합을 촉진할 수 있다. 이런 방식으로의 단량체의 중합은 중합체성 표면으로부터 그라프팅되는 중합체 쇄를 제공하는 것으로 믿어진다.
이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 중합체성 표면을 UV 방사선에 노출시키는 것은 또한, 또는 대안적으로, 단량체의 에틸렌적으로 불포화된 결합이 분해되도록 하여 라디칼 종을 생성하는 것으로 믿어진다. 생성된 라디칼 종은 중합체 표면으로부터의 수소 제거를 통해 단량체 용액 내에 존재하는 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 자유 라디칼 중합을 촉진할 수 있다. 이런 방식으로의 단량체의 중합은 중합체성 표면으로부터 그라프팅되는 중합체 쇄를 제공하는 것으로 믿어진다.
이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 탄소계 라디칼이 중합체성 표면 위에서 생성되는 것으로도 믿어지며, 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 중합을 촉진하는 원인이 되는 것이 이들 라디칼이다. 중합체성 표면이 탄소계 중합체를 포함하는 경우, 이러한 탄소계 라디칼의 형성은 사용되는 탄소계 중합체가 탄소-탄소 중합체 골격을 포함하는 경우 촉진되는 것으로 믿어진다.
중합체성 표면 위에 형성된 그라프트 중합체 코팅의 성질은 생성된 산물의 의도된 응용에 적합하게 유리하게 변화될 수 있다.
본 방법의 하나의 이점은 2차원 또는 3차원 표면인 중합체성 표면 위에 실질적으로 균일하고 연속적인 그라프트 중합체 코팅을 제공할 수 있다는 것이다. 그라프트 중합체 코팅이 "실질적으로 균일하고 연속적"이라는 것은 중합체성 표면의 목적하는 영역 위에 존재하며 비교적 일정한 두께를 갖는 완전한 코팅을 나타냄을 의미한다. 이렇게 말하기는 했지만, 그라프트 중합체 코팅은 물론, 표면의 부분 또는 부분들 위에만 형성될 수 있다는 점에서 중합체성 표면 위의 불연속 코팅으로 존재할 수 있다. 이 경우에 있어서도, 그라프트 중합체는 중합체성 표면의 이들 부분들 위에 실질적으로 균일하고 연속적인 코팅을 형성할 것이다. 예를 들어, 중합체성 표면 위에 그라프트 중합체 코팅의 특정 패턴 또는 배열을 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, UV 방사선 노출에 대해 중합체성 표면의 영역을 제한하는 적합한 마스크를 통해 UV 방사선을 통과시킴으로써 달성될 수 있다.
중합체성 표면에 적용된 그라프트 중합체 코팅의 두께는 당업자에게 주지된 방법의 변수들을 조정함에 의해 변화할 수 있다. 예를 들어, 용액 내에 존재하는 에틸렌적으로 불포화된 단량체 농도를 증가시키거나, UV 방사선 노출 시간 및/또는 강도를 증가시킴으로써 그라프트 중합체 코팅 두께를 증가시킬 수 있다. UV 공급원과 중합체성 표면 사이에 구배 마스크를 사용함으로써 구배 두께를 나타내는 코팅도 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물분자"는 유기체, 조직 또는 세포에 의해 생성되는 분자를 의미한다. 생물분자는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 뉴클레오티드, 탄수화물 및 지질을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
생물분자 흡착 및/또는 생물부착에 저항하는 그라프트 중합체 코팅의 형성에 대한 대안으로서, 또는 이와 조합하여, 그라프트 중합체 코팅의 부분으로서 특정 생물분자, 예컨대 용액 내의 특정 생물분자 또는 세포 표면에 발현된 특정 생물분자와 결합하기 위한 리간드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 접근법에 의해, 특정 생물분자 자체 또는 세포가 어세이 및 세포 배양과 같은 응용에 있어서 그라프트 중합체 코팅에의 부착에 대해 표적화될 수 있다.
그라프트 중합체 코팅은 임의의 적합한 수단에 의해 이러한 리간드와 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 그라프트 중합체 코팅을 형성하기 위하여 중합되는 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하거나 이에 공유적으로 결합될 수 있다.
대안적으로, 그라프트 중합체 코팅은 형성된 후에 개질되어 그라프트 중합체 코팅의 표면에 리간드를 공유적으로 커플링할 수 있다. 이 경우에, 중합되어 그라프트 중합체 코팅을 형성하는 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 그라프트 중합체 코팅의 형성 이후에 사용되어 그라프트 중합체 코팅에 리간드의 공유 부착을 촉진할 수 있는 작용기와 함께 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포"는 살아있거나 죽은 세포, 다세포, 조직 또는 세포 단편, 세포막, 리포솜 제제, 하위 세포 기관, 예컨대 미토콘드리아, 리보솜 또는 세포핵을 지칭한다. 용어 "세포"는 또한 부착 및 비-부착 세포 유형을 포함하고자 한다.
세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다.
진핵 세포는 동물/인간, 식물, 진균, 및 원생생물로부터 유래한 것들을 포함한다.
원핵 세포는 단세포 미생물, 예컨대 세균 및 고세균으로부터 유래한 것들을 포함한다.
용어 "세포"는 또한 줄기 세포를 포함하고자 한다. 동물/인간에서 대부분의 성인 줄기 세포는 계열-제한적이고(lineage-restricted)(다분화능) 일반적으로 이들의 조직 기원에 의해 지칭된다. 예를 들어, 배아 줄기 세포, 간엽성 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 피부 줄기 세포 등이 있다.
본 발명자들은 연속적 UV 조사를 이용하여 만들어진 코팅이 균등한 단속적 UV 조사 조건을 이용하여 제조된 코팅에 비해 유의적으로 더 얇은 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 조사 이벤트 사이의 지연을 동반하는 단속적 조사를 이용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅에 비해 유의적으로 더 두꺼운 것을 발견하였다.
3가지 코팅의 팽윤비를 분석한 결과(표 12 참조), PBS 용액을 사용하여 수화되는 경우 단속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 연속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅에 비해 훨씬 더 팽윤할 수 있는 것으로 나타났다. 이론에 의해 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 이러한 차이가 필시 코팅 내부의 가교도로 인한 것이라고 믿는다. 연속적 UV 조사는 4 공정을 초래할 것이다: (i) 자유 라디칼 형성, (ii) 쇄 절단, (iii) 가교 반응, 및 (iv) 중합체 쇄 성장. 이들 4가지 공정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조되는 그라프트 중합체 코팅의 경우에도 일어날 것이지만, 4가지 공정의 상대적인 균형은 아마도 상이할 것이다. 양자의 경우에 자유 라디칼 형성이 동일하다고 가정하면, 단속적 UV 조사는 연속적 경우에 비해 샘플이 UV를 사용하여 조사되지 않을 때 더 많은 중합체 성장을 초래하고, 코팅 내부에 더 적은 가교를 초래하여야 한다. 이 가정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 건조 및 수화 두께 양자 모두가 더 크다는 것으로부터 증명된다. 연속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 얻어진 팽윤비의 감소는 코팅 내부에 더 높은 정도의 가교가 있음을 시사한다. 동일한 정도의 가교를 동반하는 더 두꺼운 코팅들, 예컨대 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 코팅들은 매우 유사한 팽윤비를 나타낼 것이다. UV 조사가 없는 부가적인 시간(단속적 + 지연)은 중합체 그라프트 층 두께를 증가시키는데 영향을 미치며, 이는 다시금 샘플이 조사되지 않을 때, 더 짧은 비-조사 시간(단속적)의 경우에 비해 더 많은 중합체 성장이 이루어지며, 연속적 UV 조사 조건에 비해 훨씬 더 많은 중합체 쇄 성장이 이루어짐을 시사한다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 기재될 것이다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 어떤 방식으로든 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
실시예는 첨부된 도면을 참조하여 기재된다.
도 1a 및 도 1b는 실시예 1에 기재된 바와 같이 AAM의 UV 그라프트 중합 전(도 1a) 및 후(도 1b)에 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc) 상에서 얻은 대표적인 고해상도 XPS C 1s 스펙트럼을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 실시예 3에 기재된 바와 같이 PS(NunclonTM Δ) 대조군 표면 위의 세포 부착(도 2b)과 비교하여 AAM의 UV 그라프팅 후 PS (NunclonTM Δ) 기판 위에서 20 시간 후 HeLa 세포 부착의 위상차 이미지(phase contrast image)(도 2a)를 보여준다.
도 3은 AA 및 AAM 단량체 혼합물 용액으로부터 얻은 UV 그라프트 중합체 위에서 얻은 대표적인 고해상도 XPS C 1s 스펙트럼을 보여준다. 숫자(삽입)는 실시예 4에 기재한 바와 같이 단량체 혼합물 중의 AA 퍼센트를 지칭한다.
도 4a 및 도 4b는 실시예 6의 파트 B에 기재한 바와 같이, 37 ℃(도 4a)에서 및 20 ℃에서 30분간 인큐베이션한 후(도 4b) NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅된 기판 위의 L929 마우스 섬유아세포 부착의 위상차 이미지(10x 대물렌즈)를 보여준다.
도 5a 및 도 5b는 실시예 6의 파트 C에 기재한 바와 같이, 37 ℃(도 5a)에서 및 20 ℃에서 30분간 인큐베이션한 후(도 5b) NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅된 기판 위의 인간 MSC 부착의 위상차 이미지(10x 대물렌즈)를 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 실시예 7의 파트 B에 기재한 바와 같이, 37 ℃(도 6a)에서 및 20 ℃에서 30분간 인큐베이션한 후(도 6b) NIPAM 그라프트 중합체 코팅에 의해 코팅된 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자 위의 L929 세포 부착의 대표적인 위상차 이미지(10x 대물렌즈)를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 실시예 9의 파트 C에 기재한 바와 같이, 10% AA UV 그라프트 공중합체로 코팅된 96 웰 기판(도 7a) 및 c(RGDfK) 펩티드의 공유 고정화 후의 동일 표면(도 7b) 위의 L929 세포 부착의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 실시예 10의 파트 C에 기재한 바와 같이, 10% AA UV 그라프트 공중합체로 코팅된 MicroHexTM 기판(도 8a) 및 c(RGDfK) 펩티드의 공유 고정화 후의 동일 표면(도 8b) 위의 L929 세포 부착의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 9는 실시예 12의 파트 C에 기재한 바에 따라 중합체성 코팅의 조성의 함수로 2가지 상이한 UV 방법을 사용하여 제조된 코팅에 대응한 세포 부착을 보여주는 그래프이다.
도 10은 실시에 12의 파트 C에 기재한 바와 같이, 단속적 UV를 사용하는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성된 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM)를 기본으로 하는 공중합체 코팅에 대응한 상이한 세포 유형을 비교하는 그래프이다.
도 11은 실시예 14의 파트 B에 설명한 바와 같이, UV 통과 횟수에 따라 그라프트 중합체 코팅의 XPS 분석으로부터 얻은 원소비를 보여주는 그래프이다.
도 12는 UV 통과 횟수에 따라 40% AA-co-AAM 층의 나노미터 단위 두께의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 13의 A, B 및 C는 실시예 15의 파트 B에 기재한 바와 같이, 다양한 퍼센트의 UVA, UVB 및 UVC에 따른 고해상도 C 1s 스펙트럼이다.
실시예 1
조직 배양 폴리스티렌 기판으로부터의 UV 그라프트 중합
96 웰 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)를 수령한 대로 사용하여 글로브 박스 내에 위치시켰다. 글로브 박스(< 0.2% 산소를 함유하는 질소 분위기하) 내에서, 250 mg의 아크릴아미드(AAM), 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트(PEGMA-OH), 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트(PEGMA-OMe) 또는 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)를 5 ㎤ Milli-QTM 물에 용해시키고 용액을 10분 동안 질소를 사용하여 퍼지시켜 잔류 산소를 제거하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰을 0.15 ㎤의 단량체 용액으로 충전하였다. 글로브 박스 내에서 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 플레이트를 진공 밀봉한 후, UV 램프(λ~200-450 nm, 최대 강도 360-390 nm, 램프 길이 15 cm, 출력 1.8 kW, FUSION systems) 밑을 이동하는 컨베이어 벨트 위에 플레이트를 위치시켰다. 평균 벨트 속력을 1.8 m·min-1으로 유지하여 통과당 약 4 초의 조사 시간이 되도록 하였다. UV 램프 하에서 30회의 통과 중에 진공 밀봉된 플레이트를 UV 조사에 노출시켰다. NIPAM 그라프트 중합체 코팅의 경우에, UV 램프 하에서 20회의 통과 중에 플레이트를 노출시켰다. 각각의 통과 후에 플레이트 배향을 90도씩 회전시켰다. 그 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-QTM 물로 웰을 철저하게 세척하고 마지막에는 공기 건조시켰다. XPS 분석의 경우, 관심의 대상인 웰의 바닥은 절삭 공구를 사용하여 제거하였다.
표 1에는 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 위에서 UV 그라프트 중합 전후에 XPS 분석에 의해 얻은 원소비를 나타내었다. TCPS 기판 중합체에 대해 얻어진 것과 비교하여 각 단량체에 대해 관찰된 O/C 비의 유의한 변화와 AAM 및 NIPAM 단량체 용액을 사용한 그라프트 중합 후의 N/C 비에 대해 관찰된 변화는 각각의 단량체에 대한 성공적인 그라프트 중합을 나타낸다. 또한, 도 1a 및 도 1b에서는 AAM의 UV 그라프트 중합 전후에 조직 배양 폴리스티렌 플레이트로부터 얻어진 XPS 고해상도 C 1s 스펙트럼을 제공한다. 다시금, 이들 스펙트럼 사이의 유의한 차이는 AAM 단량체의 성공적인 그라프팅을 입증한다. 도 1AA에 제시된 고해상도 XPS 스펙트럼은 중성 탄소종 C1 및 C2(C-C/C-H)에 상응하는 285.0 - 285.5 eV 위치의 우세한 피크, 및 표면 처리 공정으로부터 유래한 산화종으로 인한 C5 구성요소(O-C=O) 및 약 292.0 eV 위치의 방향족 탄소 쉐이크-업 피크에 상응하는 C6 구성요소에 상응하는 더 높은 결합 에너지의 2개의 더 작은 피크를 함유한다. 비교하면, 도 1b의 스펙트럼은 지방족 탄소종 C1 및 C2(C-C/C-H)에 상응하는 285.0 - 285.5 eV 위치의 피크 및 아미드 종 C4(O=C-N)에 상응하는 더 높은 결합 에너지의 피크를 함유한다. 도 1b에서 방향족 쉐이크-업 피크의 완전한 감쇠는 또한 10 nm(XPS 샘플링 깊이) 초과의 코팅 두께를 시사한다.
UV 그라프트 중합 전후에 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc) 상에서 얻은 XPS 조망(survey) 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
샘플 O/C N/C
PS (NunclonTM Δ) 0.079 0.000
PS-AAM 0.258 0.273
PS-PEGMA-OH 0.464 0.000
PS-PEGMA-OMe 0.416 0.000
PS-NIPAM 0.131 0.095
실시예 2
낮은 단백질 결합 특성을 나타내는 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 인간 혈청 알부민(HSA)의 유로퓸 태깅
하기 방법을 사용하여 유로퓸 태깅된 인간 혈청 알부민(Eu-HSA)을 제조하였다. 델피아 유로퓸 표지 시약(Perkin Elmer)을 사용하여 4 ℃(pH 9.3)에서 밤새 HSA(Sigma, 99%, 본질적으로 지방산을 결여함)를 표지화하였다. Superdex 75(30/10) 크기 배제 칼럼(GE Healthcare)에서의 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC)(Akta Purifier, GE Healthcare)를 사용하여 과잉의 표지 시약으로부터 Eu-표지된 HSA를 분리한 후, Eu-HSA 용액 농도를 아미노산 분석(Waters Alliance HPLC)을 통해 결정하였다. 하기 방식으로 Eu:HSA 표지화비를 결정하였다. 먼저, 100 nM Eu 표준액 및 델피아 증강액(Delfia Enhancement Solution)(Perkin Elmer)의 다양한 희석액을 사용하여 다수의 Eu 표준액을 제조하였다. 그 후, PHERAStar 다중-웰 플레이트 리더(BMG Technologies, λex = 337 nm, λem = 620 nm, 카운트 지연 60 μs, 카운트 시간 400 μs)를 사용하여 이들 용액의 100 ㎕ 알리코트로부터 시간 분해 형광 카운트를 얻었다. 공지 농도의 Eu-HSA 용액 및 Eu 표준으로부터 얻은 시간 분해 형광 카운트를 비교하여 4.2의 Eu:HSA 표지화비를 계산하였다.
파트 B: 플레이트 준비
실시예 1에 기재된 실험 절차에 따라 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)를 AAM 및 PEGMA-OMe 그라프트 중합체로 코팅하였다. 그 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-QTM 물로 웰을 철저히 세척하고 마지막으로 공기 건조시켰다. 계속하여, Eu-HSA를 기본으로 하는 어세이를 이용하여 플레이트의 단백질 흡착량을 분석하였다.
파트 C: 단백질 흡착 어세이
UV 그라프트 중합(파트 B) 후에 인산 완충 식염수(PBS)중의 Eu-HSA 및 HSA(1:1500 몰비) 양자 모두의 용액을 함유하는 0.1 ㎤의 용액으로 각 웰을 충전하였다. 사용된 총 HSA 농도는 100, 10 및 1 μg/㎤였다. 웰을 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하고, PBS 완충액을 사용하여 6회 세척한 다음 델피아 증강액(Perkin Elmer)으로 처리하여 흡착된 Eu-HSA로부터 Eu 원자를 해리시켰다. PHERAStar 다중-웰 플레이트 리더(BMG Technologies, λex = 337 nm, λem = 620 nm, 카운트 지연 60 μs, 카운트 시간 400 μs)를 사용하는 시간 분해 형광을 통해 이런 방식으로 얻어진 용액을 분석하였다. 공지의 Eu 농도 용액을 사용하여 얻어진 표준 곡선과 이들 용액으로부터 얻어진 카운트를 비교하여 흡착된 단백질량을 정량하였다.
3가지 상이한 HSA 농도를 사용하여 수행된, 단백질 흡착 어세이로부터의 결과를 표 2에 나타내었다. 모든 단백질 농도에서, 상업적으로 구입가능한 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트[PS (NunclonTM Δ)] 위에서 검출된 흡착량은 미처리 폴리스티렌 플레이트(PS, Nunc)와 AAM[PS (NunclonTM Δ-AAM] 및 PEGMA-OMe[PS (NunclonTM Δ)-PEGMA-OMe]를 사용한 UV 그라프트 중합에 의해 개질된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 위에서 검출된 양을 훨씬 초과하였다. AAM 및 특히 PEGMA-OMe 개질된 플레이트 위에서 검출된 소량의 단백질은 UV 그라프트 중합 방법이 낮은 단백질 결합 표면 코팅을 생성하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
유로퓸 표지된 HSA를 사용한, UV 그라프트 중합 전후 표면에 대한 단백질 흡착량의 정량
용액 내의 단백질 농도
(㎍·cm-3)		 100 10 1
흡착량(ng·cm-2)
PS(NunclonTM Δ) 1101.0 153.5 18.0
PS 149.5 16.5 3.2
PS(NunclonTM Δ)-AAM 76.0 8.8 2.5
PS (NunclonTM Δ)-PEGMA-OMe 23.7 3.9 1.5
실시예 3
낮은 세포 부착 특성을 지닌 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 플레이트 준비:
실시예 1에 기재된 방법에 따라 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe 단량체 용액을 사용하는 UV 그라프트 중합체로 24 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)를 코팅하였다. PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe의 경우에, 용액을 글로브 박스로 옮기기 전에 저해제 제거 비드(Sigma)로 충전된 칼럼을 사용하여 단량체 용액으로부터 저해제를 제거하였다. 실시예 1에 따라 UV 그라프팅 및 후속의 Milli-QTM 물에 의한 세정 후에, 공기 건조시키기 전에 적어도 72 시간 동안 플레이트를 다량의 Milli-QTM 물에서 추출하였다.
파트 B: HeLa 세포를 사용한 세포 부착 어세이
세포 파종 전에 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco)을 각각 120 및 200 ㎍·cm-3의 농도로 함유하는 멸균 PBS(1 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 실온에서 4시간 동안 표면 개질된 24 웰 플레이트를 멸균하였다. 그 후, HeLa 세포를 각각의 시험 웰에 2x105 세포/웰의 농도로 파종하고 5% CO2를 함유하는 가습된 공기중에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 사용된 배양 배지는 10% 소 태자 혈청(FBS)를 함유하는 DMEM/Hams F12(Gibco)였다. 20시간의 인큐베이션 후, 4가지 샘플 복제물(replicate)을 각각 배양 배지 내에서 500 ㎍/㎤로 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)(MTT)에 의해 처리하고 추가의 4시간 동안 인큐베이션하여 24 웰 조직 배양 폴리스티렌(NunclonTM Δ, Nunc) 대조군 표면에 대한 세포 부착의 정량적 수치를 얻었다. 대조군 표면 위의 세포 부착을 100%로 설정하고 다른 모든 표면 위의 부착을 대조군 표면 위 부착의 퍼센트로 표시하였다. 4시간의 인큐베이션 단계 후에 MTT 함유 용액을 웰에서 제거하였다. 그 후, 웰을 멸균 PBS로 3회 세척한 다음 1 ㎤/웰의 DMSO를 사용하여 MTT 포르마잔 결정을 세포로부터 해리시켰다. 플레이트를 플레이트 진탕기 위에 위치시키고 15분간 부드럽게 진탕하여 결정이 용해되고 용액이 잘 혼합되도록 하였다. 그 후, λ= 595 nm 시험 파장 및 λ= 655 nm의 기준 파장에서의 광학 밀도를 측정하기 위해 각 웰로부터 100 ㎕ 샘플을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 20 시간에, MTT의 첨가 직전, 세포를 위상차 현미경(Olympus IMT-2, 10 x 대물렌즈)으로 관찰하고 세포 부착의 대표적인 이미지를 디지털 방식으로 기록하였다.
표 3에 MTT 어세이로부터 얻은 결과를 나타내었다. 결과는 PS(NunclonTM Δ) 대조군 표면 위의 세포 부착과 비교하여 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe UV 그라프트 중합체로 개질된 표면 위의 HeLa 세포 부착이 매우 낮은 수준으로 감소하였음을 명백히 보여준다. 이 결과는 도 2a 및 도 2b에 나타낸 위상차 이미지에 의해서 추가로 뒷받침되었다. 이때, 20시간 후 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe UV 그라프트 중합체 코팅 위에서 관찰된 HeLa 세포의 외관은 유사하여, 표면 위에 부착되지 않았거나 느슨하게 부착된 응집 세포, 진탕 또는 헹굼에 의해 표면으로부터 쉽게 제거되는 둥근 세포들이었다. 예를 들어, 도 2a는 AAM 개질된 표면 위의 HeLa 세포의 대표적인 이미지를 제시한다. 비교하면, PS(NunclonTM Δ) 대조군 표면 위에서 이 배양 피리오드 후에 HeLa 세포는 단단하게 부착되고 잘 퍼져있는 것으로 보였다(도 2b).
다양한 표면 위에서 24시간의 배양 후, MTT 어세이를 통해 얻어진 HeLa 세포 부착. 중합체 그라프팅된 표면 위의 세포 부착을 PS(NunclonTM Δ) 대조군 표면 위에서 얻어진 것에 대해 정규화하였다.
샘플 % 세포 부착 sd
PS(NunclonTM Δ)-AAM 2.30 0.30
PS(NunclonTM Δ)-PEGMA-OH 0.82 0.71
PS(NunclonTM Δ)-PEGMA-OMe 0.52 0.08
PS (NunclonTM Δ) 100.00 3.28
실시예 4
아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 코팅의 UV 그라프트 중합 및 후속의 활성화 및 아민 공유 결합
파트 A: AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프팅
실시예 1에 기재한 바와 같이, 글로브 박스 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 용액들을 혼합하여 5%, 10%, 20% 및 50%(v/v) AA 단량체를 함유하는 AAM 단량체 용액을 얻었다. 이 방식으로 만든 용액을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다(웰당 0.15 ㎤).
여전히 글로브 박스 안에서, 상기 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트의 웰을 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-QTM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다. XPS 분석의 경우, 관심의 대상인 웰의 바닥은 절삭 공구를 사용하여 제거하였다.
도 3 및 표 4에 나타낸 데이터를 분석하면 단량체 혼합물의 UV 그라프트 중합이 성공적인 코팅을 초래하였음을 명백히 알 수 있다. 또한, 이들 결과는 적절한 단량체 혼합물을 선택함으로써 UV 그라프트 중합체 코팅의 조성이 제어될 수 있음을 입증한다. 단량체 공급물 내의 AA 비율을 증가시켜 제조한 코팅의 XPS 스펙트럼(도 3 참조)에서는 코팅 내의 (AA 단량체로부터의) 카복실산 작용기에서 유래한 C5 구성요소로부터의 기여가 증가하였다. 5% AA의 단량체 조성에서는 (AAM 단량체로부터의) 아미드 결합에서 유래한 C4 시그널이 우세한 반면, 50% AA의 단량체 조성에서는 C4 및 C5 시그널이 거의 대등한 강도를 나타내었다.
도 3에 나타낸 XPS C 1s 고해상도 스펙트럼의 곡선 맞춤(curve fitting)에 의해 얻은 구성요소. 단량체 조성은 단량체 혼합물 내 AA의 퍼센트로 나타내며, 나머지는 AAM 단량체를 포함한다.
단량체 조성 C1+C2 C3 C4 C5
5% AA 77.7 0.8 20.8 0.6
10% AA 73.0 0.2 25.2 1.6
20% AA 71.1 1.0 17.7 7.0
50% AA 73.5 0.42 11.6 14.5
표 5에 나타낸 원소비는 이들 결과를 확인해준다. 단량체 공급물 내의 AA 함량을 증가시키면, 공중합체 코팅 내에 존재하는 산소량이 증가하는 반면 질소 함량은 감소하였다.
AA 및 AAM 단량체 혼합물 용액으로부터 제조된 UV 그라프트 중합체 코팅에서 얻은 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비. 단량체 조성은 단량체 혼합물 내 AA의 퍼센트로 나타낸다.
단량체 조성 O/C N/C
5% AA 0.288 0.228
10% AA 0.317 0.233
20% AA 0.329 0.182
50% AA 0.425 0.109
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화
Milli-QTM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N-하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 파트 A에 기재된 바와 같이 준비된 플레이트의 각 웰 내로 0.05 ㎤를 넣었다. 용액은 제조 직후에 웰에 첨가하였다. 20 분간 인큐베이션한 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)에서 Milli-QTM 물을 사용하여 웰을 3회 세척하고 질소 스트림을 사용하여 건조시켰다. 그 후, NHS 활성화 플레이트를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
파트 C: NHS 활성화 그라프트 중합체 코팅 위의 아민의 공유 고정화
0.1 M TFEA 용액을 Milli-QTM 물을 사용하여 제조한 다음, 이의 0.05 ㎤ 알리코트들을 파트 B에 기재된 바와 같이 금방 준비된 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 24 시간의 인큐베이션 후, Milli-QTM 물을 사용하여 웰을 철저하게 세척하고, 공기 건조시키고, XPS로 분석하였다.
AA 함량을 증가시킴에 따라 얻어진 F/C 비의 증가(표 6)는 NHS에 의한 아크릴산의 활성화가 성공적이며 이런 방식으로 제조된 NHS 활성화 표면이 아민 함유 분자에 대해 매우 반응성임을 입증하였다.
AA 및 AAM 단량체 혼합물 용액으로부터 만들어진 UV 그라프트 중합체 코팅, 후속의 NHS 활성화 및 TFEA와의 반응에서 얻은 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비. 단량체 조성은 단량체 혼합물 내 AA의 퍼센트로 나타낸다.
단량체 조성 O/C N/C F/C
5% AA 0.286 0.249 0.008
10% AA 0.260 0.221 0.035
20% AA 0.285 0.216 0.058
50% AA 0.366 0.175 0.243
실시예 5
PEGMA-OH 코팅의 UV 그라프트 중합 및 후속의 활성화 및 아민의 공유 결합
1 cm x 1 cm의 크기를 지닌 Si-ALAPP 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 1에 따라, Milli-QTM에서 5%(w/v) PEGMA-OH 용액을 제조하고, 글로브 박스 내에서 30분간 질소로 퍼지하여 탈기시켰다. 글로브 박스 안에서, 24 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)의 각 웰로 Si-ALAPP 웨이퍼 및 0.6 ㎤의 PEGMA-OH 용액을 첨가하였다.
여전히 글로브 박스 내에서, Si-ALAPP 샘플 및 PEGMA-OH 단량체 용액을 함유하는 24 웰 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트에서 샘플을 제거하고, Milli-QTM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다. 샘플을 무수 DMSO 중의 0.5 M 카보닐 디이미다졸(CDI) 용액 내에 2 시간 동안 담그었다. 그 후, 샘플을 Milli-QTM 물로 헹군 다음, 7일 동안 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 0.1 M TFEA 용액에 담그었다. 마지막으로 샘플을 Milli-QTM 물로 세척하고, 공기 건조시키고 XPS로 분석하였다.
PEGMA-OH의 UV 그라프트 중합 후에, 표 7의 데이터로부터 관찰될 수 있는 바와 같은 ALAPP 코팅으로부터 질소 시그널의 완전한 감쇠는 10 nm(XPS 샘플링 깊이)를 초과하는 두께로 성공적인 코팅이 이루어졌음을 나타낸다. PEGMA-OH 기의 OH기가 CDI와 반응한 후, N/C 비의 증가가 관찰되었는데(표 7), 이는 성공적인 표면 활성화 반응을 입증한다. 마지막으로 TFEA와 CDI 활성화 표면의 반응 후 불소의 존재(표 7)는 이런 방식으로 제조된 표면의 아민 함유 분자에 대한 반응성을 입증하였다.
후속적인 CDI 활성화 및 TFEA와의 반응 전후에 PEGMA-OH UV 그라프트 중합체 코팅에 대해 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
샘플 O/C N/C F/C
Si-ALAPP-PEGMA-OH 0.468 0.000 0.000
Si-ALAPP-PEGMA-OH-CDI 0.453 0.032 0.000
Si-ALAPP-PEGMA-OH-CDI-TFEA 0.458 0.018 0.018
실시예 6
열-대응성(thermo-responsive) 코팅의 경우 NIPAM 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: NIPAM 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(4 웰, NunclonTM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 실시예 1에 따라 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 단량체를 사용하여 이들 기판 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 NIPAM 용액을 Milli-QTM 물에서 제조하고 30분간 질소로 퍼지하였다. 이 단량체 용액의 알리코트(0.6 ㎤)들을 4 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트를 Milli-QTM 물로 5회 세척한 다음, 플레이트를 다량의 Milli-QTM 물에 72시간 동안 담그었다. 마지막으로 표면 개질된 플레이트를 공기 건조시켰다.
파트 B: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 세포 배양 기판 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청(FBS) 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(modified Eagles medium)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(안티-안티, Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.8 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 웰을 멸균하였다. 2x105 세포/웰의 파종 밀도로 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 4 웰 플레이트(파트 A에 기재됨)에 L929 세포를 파종하였다. 24 시간의 인큐베이션 후에, 플레이트를 가열된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 유지하면서 대표적인 샘플의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 가열된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 4a)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타낸 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 4b)의 세포는 둥근 형태이고 표면으로부터 쉽게 세척될 수 있다. 이들 세포 배양 결과는 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 열-대응성 성질을 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
파트 C: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 세포 배양 기판 위의 MSC 부착
표준 방법론을 사용하여 인간 골수 천자로부터 간엽성 줄기 세포(MSC)를 분리하였다. 즉, 골수를 먼저 밀도 구배(1.077 gms/100 ㎤)에 따라 분리하고 저밀도 분획을 수집하고, PBS에서 세척한 다음 세포를 20% FBS가 보충된 α-MEM 배지에 재현탁시켰다(예비-선별된 배치). 그 후, 세포를 약 5x105 세포/㎤의 밀도로 T-플라스크에 가하고 37 ℃에서 2-3 일간 인큐베이션하였다. 그 후, 비-부착성 분획을 제거한 다음, 신선한 배지 다음에 PBS를 사용하여 부드럽게 세척하여 부착성 MSC 만 남겼다. 신선한 알파-MEM 및 FBS를 첨가하고 세포를 7일간 배양하였다. EDTA와 Ca 및 Mg이 없는 PBS를 사용하여 이들을 분할하고(~1:3, 융합도(confluency)에 따라), 신선한 배지 및 혈청을 사용하여 다시 플레이팅하였다.
인간 MSC를 20% FBS 및 5 ng/㎤ 인간 재조합 FGF-2(Prospec)가 보충된 a-MEM 배지 내로 옮기고 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 4 웰 플레이트(파트 A에 기재됨) 위에 1x105 세포/웰의 파종 밀도로 파종하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 각 웰을 멸균하였다. 37 ℃ 및 5% CO2의 가습된 인큐베이터에서 24 시간의 인큐베이션 후에, 플레이트를 온도 제어된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 유지하면서 웰의 대표적인 영역에 대한 세포 부착의 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 온도 제어된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 5a)의 세포는 부착성이고 잘 퍼져 있으며 거의 융합되어 있는 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 5b)의 세포는 응집되어 있고 일부 영역에서 표면으로부터 들어올려져 있다. 이들 인간 MSC 배양 결과는 다시금 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 열-대응성 성질을 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
실시예 7
마이크로입자에서 열-대응성 코팅의 경우 NIPAM 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 마이크로캐리어 입자에서 NIPAM 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(24 웰, NunclonTM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 이들 플레이트의 각 웰에 50 mg의 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자(NunclonTM Δ, Nunc)를 첨가하였다. 실시예 1에 따라 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 단량체를 사용하여 마이크로캐리어 입자 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 간단히 서술하면, 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 NIPAM 용액을 Milli-QTM 물에서 제조하고 30분간 질소로 퍼지하였다. 이 단량체 용액의 알리코트(0.6 ㎤)들을 마이크로입자를 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 부드럽게 진탕하고 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 마이크로입자를 Milli-QTM 물로 10회 세척하고, 원심분리하고, 각각의 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 다량의 Milli-QTM 물에 72시간 동안 인큐베이션한 다음, 진공하에 건조시켰다.
NIPAM UV 그라프트 중합 전후에 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자를 XPS에 의해 분석하였다. 표 8에 나타낸 결과의 분석은 표면 코팅 절차가 성공적이었음을 입증하였다. 특히, 계산된 N/C 비율의 증가는 마이크로캐리어 입자 표면 위에 그라프트 중합체 층이 존재함을 나타내었다.
NIPAM UV 그라프트 중합체를 사용한 코팅 전후에 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자(NunclonTM Δ, Nunc)에 대해 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
O/C N/C
MicroHexTM 0.166 0.001
MicroHexTM-NIPAM 0.157 0.123
파트 B: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 마이크로캐리어 입자 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 실시예 3에 따라 비-세포 부착성 PEGMA-OH UV 그라프트 중합체 코팅으로 개질된 4 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)의 웰에 함유된 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 마이크로입자(파트 A에 기재됨) 위에 L929 세포를 파종하였다. 각 웰은 0.1 ㎤의 포장된(packed) 표면 개질된 입자를 함유하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.6 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 표면 개질된 마이크로캐리어 입자를 멸균하였다. 세포 파종 밀도는 2x104 세포/웰이었다. 24 시간의 세포 배양 피리오드 후, 플레이트를 가열된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 플레이트를 유지하면서 대표적인 샘플의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 가열된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 6a 및 도 6b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 6a)의 세포는 부착성이고 부분적으로 잘 퍼진 형태를 나타낸 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 6b)의 세포는 둥근 형태이고 표면으로부터 쉽게 세척 제거될 수 있다. 이들 세포 배양 결과는 마이크로입자 위의 열-대응성 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 효과를 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
실시예 8
3-차원 기판 위의 코팅의 평탄성(evenness)
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(96 웰, NunclonTM Δ, Nunc)를 수령한 대로 사용하였다. 실시예 1에 따라 AAM 단량체를 사용하여 이들 플레이트 위의 UV 그라프트 중합체 코팅을 얻었다. 간략히 설명하면, 글로브 박스(< 0.2% 산소를 함유하는 질소 분위기하) 내에서, 250 mg의 AAM을 5 ㎤ Milli-QTM 물에 용해시키고 용액을 10분 동안 질소를 사용하여 퍼지시켜 잔류 산소를 제거하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰을 0.15 ㎤의 단량체 용액으로 충전하였다. 글로브 박스 내에서 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 플레이트를 진공 밀봉한 후, UV 램프(λ~200-450 nm, 최대 강도 360-390 nm, 램프 길이 15 cm, 출력 1.8 kW, FUSION systems) 밑을 이동하는 컨베이어 벨트 위에 플레이트를 위치시켰다. 평균 벨트 속력을 1.8 m·min-1으로 유지하여 통과당 약 4 초의 조사 시간이 되도록 하였다. 30회의 통과 중에 진공 밀봉된 플레이트를 UV 조사에 노출시켰다. 각각의 통과 후에 플레이트 배향을 90도씩 회전시켰다. 그 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-QTM 물로 웰을 철저하게 세척하고 마지막에는 공기 건조시켰다. XPS 분석의 경우, 96 웰 플레이트 상의 선택된 웰의 바닥 및 벽면은 절삭 공구를 사용하여 제거하였다.
표 9에는 대표적인 웰의 상이한 영역에서의 UV 그라프트 중합 후에 XPS 분석에 의해 얻은 원소비를 나타내었다. 웰이 UV 그라프트 중합 중에 0.15 ㎤의 단량체 용액으로 충전되었으므로, 벽면 상부를 제외하고 웰의 모든 영역이 코팅될 것으로 예상되었다. 이 예상은 표 9에 나타낸 결과에 의해 확인되었다. 벽면의 상부(상부로부터 약 2 mm)에서 얻어진 O/C 및 N/C 비는 다른 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 샘플(NunclonTM Δ, Nunc)에서 얻어진 것(표 1 참조)과 유사하였는데, 이는 플레이트의 이 부분이 UV 그라프트 중합 공정에 의해 영향을 받지 않았음을 시사한다. 그러나, 벽면의 개질되지 않은 상부와 비교하여 각각의 다른 영역의 경우 관찰된 O/C 및 N/C 비에 있어서의 유의한 변화는 각 경우에 성공적인 AAM 그라프트 중합체 코팅을 시사한다. 또한, 웰의 바닥, 벽면의 하부(바닥으로부터 약 2 mm) 및 웰의 중간 부분(벽면의 중간까지 올라간 곳)으로부터 얻어진 원소비는 이론적으로 예상된 값에 근접한, 유사한 O/C 및 N/C 값을 보였는데, 이는 웰의 표면 개질된 영역 전반에 걸쳐 10 nm(XPS 샘플링 깊이)를 초과하는 평평한 코팅 두께를 시사한다.
부분적으로 AAM UV 그라프트 중합체 개질된 96 웰 플레이트의 단일 웰에서 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비. 웰 내에 존재하는 상이한 영역에 대해 스펙트럼을 기록하였다. 이들은 웰의 바닥, 벽면의 하부(바닥으로부터 약 2 mm), 웰의 중간 부분(벽면의 중간까지 올라간 곳) 및 벽면의 상부(상부로부터 약 2 mm)이다.
영역 O/C N/C
웰의 바닥 0.259 0.259
벽면(바닥) 0.259 0.248
벽면(중간) 0.259 0.255
벽면(상부) 0.085 0.010
실시예 9
96 웰 기판 위의 AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프트 공중합, 펩티드의 공유 고정화 및 세포 반응에 대한 효과
파트 A: AA 및 AAM 공중합체 코팅의 UV 그라프팅
실시예 1에 따라, 글로브 박스 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 탈기하였다. 10%(v/v) AA 및 90%(v/v) AAM 단량체 용액을 혼합함으로써 이들로부터 용액을 제조하였다(10% AA). 이 방식으로 제조된 용액을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다(웰당 0.15 ㎤).
여전히 글로브 박스 안에서, 상기 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트의 웰을 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-QTM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다.
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화 및 cRGD의 공유 고정화
Milli-QTM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N-하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 파트 A에 기재된 바와 같이 준비된 10% AA 개질된 96 웰 플레이트의 각 웰 내로 0.05 ㎤를 넣었다. 용액은 제조 직후에 웰에 첨가하였다. 20 분간 인큐베이션한 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)에서 Milli-QTM 물을 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 그 후, NHS 활성화 플레이트를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
트리-아미노산 모티프인 아르기닌-글리신-아스파르트산(c(RGDfK), Peptides International)을 함유하는 N-C 말단 폐환된 분자를 하기 방법에 따라 중합체 코팅에 공유적으로 부착시켰다. PBS 중의 200 ㎍/mL의 c(RGDfK)를 함유하는 용액의 알리코트(0.1 ㎤)를 상기 금방 제조된 NHS 활성화 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4 ℃에서 밤새(15 h) 용액을 웰 내에서 인큐베이션한 후, 용액을 제거하고 웰을 PBS로 10회 세척하였다.
파트 C: 표면 개질된 96 웰 플레이트 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청(FBS) 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 웰을 멸균하였다. 파트 B에 기재된 바와 같이 금방 제조된, 공유적으로 고정된 c(RGDfK)를 동반하는 플레이트의 웰 위에 L929 세포를 2x104 세포/웰의 파종 밀도로 파종하였다. 또한, NHS 활성화되지 않고 그 위에 c(RGDfK)가 공유적으로 고정되지도 않은 금방 제조된 플레이트의 웰에도 세포를 파종하였다. 20-22 시간의 인큐베이션 후, 대표적인 영역의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 얻어진 위상차 이미지를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 공유적으로 고정된 c(RGDfK)를 함유하지 않은 샘플에 대해 얻은 이미지(도 7a)의 세포는 비-부착성이고 둥근 형태인 반면, c(RGDfK)가 공유적으로 고정된 샘플에 대해 얻은 이미지(도 7b)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타내었다. 이들 세포 배양 결과는 10% AA 및 90% AAM의 단량체 공급물로부터 형성되고 c(RGDfK)가 공유적으로 고정된 UV 그라프트 중합체 코팅의 세포 부착 특성 및 c(RGDfK)가 공유적으로 고정되지 않은 UV 그라프트 코팅의 비-세포 부착성을 입증한다.
실시예 10
MicroHex TM 기판 위의 AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프트 공중합, 펩티드의 공유 고정화 및 세포 반응에 대한 효과
파트 A: 마이크로캐리어 입자 위의 AA 및 AAM 공중합체 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(24 웰, NunclonTM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 이들 플레이트의 각 웰에 50 mg의 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자(NunclonTM Δ, Nunc)를 첨가하였다. 실시예 7에 따라 마이크로캐리어 입자 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 간단히 서술하면, 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 15분 초과의 시간동안 질소로 퍼지하여 탈기시켰다. 10%(v/v)의 AA 및 90%(v/v)의 AAM 단량체 용액을 혼합함으로써 이들로부터 용액을 제조하였다(10% AA). 이 10% AA 단량체 혼합물의 알리코트(0.6 ㎤)들을 마이크로입자를 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 부드럽게 진탕하고 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 마이크로입자를 Milli-QTM 물로 10회 세척하고, 원심분리하고, 각각의 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 다량의 Milli-QTM 물에 72시간 동안 인큐베이션한 다음, 진공하에 건조시키고, XPS 분석하였다.
표 10에 나타낸 XPS 분석 결과는 마이크로캐리어 입자 위의 그라프트 중합이 성공적이었음을 명백히 입증한다. O/C 및 N/C 원자비 양자 모두 그라프트 중합 반응 후에 증가한 것으로 관찰되었다. 상대적인 O/C 및 N/C 비의 비교는 AAM 및 AA 단량체 양자 모두를 함유하는 코팅을 보여주었다. 이는 고해상도 C 1s 스펙트럼(나타내지 않음)의 분석에 의해 확인되었다.
10%(v/v)의 AA 및 90%(v/v)의 AAM 단량체 혼합물 용액으로부터 만들어진 UV 그라프트 중합체를 사용한 코팅 전후에 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자(NunclonTM Δ, Nunc)에 대해 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
O/C N/C
MicroHexTM 0.166 0.001
MicroHexTM-10% AA 0.258 0.149
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화 및 c(RGDfK)의 공유 고정화
Milli-QTM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N-하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 입자가 과량의 용액에 의해 덮이는 방식으로 10% AA 개질된 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자와 함께 인큐베이션하였다. 용액은 제조 직후에 개질된 마이크로입자에 첨가하였다. 때때로 진탕하면서 20 분간 인큐베이션한 후, 원심분리에 의해 마이크로입자를 Milli-QTM 물을 사용하여 3회 세척하고 Milli-QTM 물에 재현탁시켰다. 그 후, NHS 활성화 마이크로입자를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
트리-아미노산 모티프인 아르기닌-글리신-아스파르트산(c(RGDfK), Peptides International)을 함유하는 N-C 말단 폐환된 분자를 하기 방법에 따라 중합체 코팅에 공유적으로 부착시켰다. PBS 중의 200 ㎍/mL의 c(RGDfK)를 함유하는 용액의 알리코트(0.6 ㎤)를 상기 금방 제조된 NHS 활성화 MicroHexTM 마이크로캐리어 입자를 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 계속하여, 마이크로입자를 Milli-QTM 물로 10회 세척하면서 원심분리하고, 각 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 세포 배양 실험 전 72 시간 동안 다량의 Milli-QTM 물에서 인큐베이션하였다.
파트 C: 표면 개질된 마이크로캐리어 입자 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 실시예 3에 따라 비-세포 부착성 PEGMA-OH UV 그라프트 중합체 코팅에 의해 개질된 4 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)의 웰 내에 각각 함유된 10% AA 개질된 마이크로입자(파트 A에 기재됨) 및 c(RGDfK) 개질된 마이크로입자(파트 B에 기재됨) 위에 L929 세포를 파종하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 1%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 마이크로캐리어 입자를 멸균하였다. 각 웰은 0.1 ㎤의 포장된 표면 개질된 입자를 함유하였다. 세포 파종 밀도는 2x104 세포/웰이었다. 20-22 시간의 세포 배양 기간이 지난 후, 각 샘플에 대한 대표적인 영역의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 얻어진 위상차 이미지를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. 공유적으로 고정된 c(RGDfK)를 함유하지 않은 샘플에 대해 얻은 이미지(도 8a)의 세포는 비-부착성이고 둥근 형태인 반면, c(RGDfK)가 공유적으로 고정된 샘플에 대해 얻은 이미지(도 8b)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타내었다. 이들 세포 배양 결과는 10% AA 및 90% AAM의 단량체 공급물로부터 형성되고 c(RGDfK)가 공유적으로 고정된 UV 그라프트 중합체 코팅의 세포 부착 특성 및 c(RGDfK)가 공유적으로 고정되지 않은 UV 그라프트 코팅의 비-세포 부착성을 입증한다.
실시예 11
중합체 그라프팅: 연속적 대 단속적 UV 조사
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 약 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35? 계면활성제 용액에서 초음파 세정하고, 에탄올로 헹구고, Milli-QTM 물을 사용하여 철저히 헹군 다음, 정제 질소 하에 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleanerTM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 라디오-주파수 글로 방전(radio-frequency glow discharge; RFGD) 기술을 이용하여 알릴아민 단량체로부터의 아민 작용성을 지닌 가교된 중합체성 박막을 Si 웨이퍼 조각 위에 침착시켰다. 반응 챔버를 < 0.003 mbar의 압력까지 완전히 비운 다음 알릴아민 증기로 충전하여 서서히 0.200 mbar의 압력으로 상승시켰다. 이때, 200 kHz의 주파수 및 20 W의 부하 전력으로 25초간 전극에 전압을 적용하였다. 그 후, 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용하기 전에 Milli-QTM 물에서 헹구었다.
N2 글로브 박스 안에서 10%(w/v)의 농도로 H2O에서 AAM 용액을 제조하고 N2를 사용하여 60분간 퍼지하였다. 그 후, AAM 용액을 Si-ALAPP 샘플에 적용하여 AAM 용액이 3 mm 깊이가 되도록 하고 국내 진공 식품 저장 시스템(Sunbeam)을 사용하여 폴리프로필렌 백 내로의 산소 유입에 대해 밀봉하였다. 밀봉된 샘플을 N2 글로브 박스에서 빼내고 고전력 UV 램프(Fusion Systems FS300s with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 컨베이어(Fusion UV Systems, Inc. LC6B Benchtop Conveyor) 상의 램프 아래로 통과시키고, 각각의 통과는 2849(UVA), 822(UVB), 81.5(UVC), 및 2922(UVV) mJ/㎠(휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 측정됨)를 유발하였다. 이들 수치를 알게 됨으로써 상이한 공정 프로토콜에 대한 UV 방사선량을 동등하게 할 수 있었다. 시험된 프로토콜은 1) 단속적(벨트 위에서 22회 통과), 2) 단속적 + 지연(22회 통과 및 각 통과 사이에 30초 지연), 및 3) 연속적(22회 통과와 동등한 UV 방사선량을 전달하는 시간동안 램프 아래의 장소에 샘플을 고정시킴)이었다. 목적하는 UV 방사선 노출 후, 샘플을 넉넉한 물로 세척한 다음 여과되고 정제된 질소 스트림 하에 건조시키고 분석하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 표 11에 나타내었다. RFGD 박막 침착(Si-ALAPP) 후, 샘플의 조성은 이런 종류의 코팅에 대해 예상된 바와 같이 C 및 N이 풍부하였다. AAM 단량체 용액에서 샘플의 연속적 조사 후, O 및 N 양자 모두의 원자 퍼센트는 주로 폴리아크릴아미드를 포함하는 그라프트 중합체 코팅과 일치하게 증가하였다(PAAM 이론적 조성과 비교하여). 단속적 방식 및 단속적 + 지연 방식으로 AAM 단량체 용액의 존재하에 샘플을 조사한 것도 그라프트 폴리아크릴아미드 코팅에 대해 이론적으로 예상된 것과 부합하는 코팅을 생성하였다. 고해상도 C 1s 스펙트럼(나타내지 않음)은 3가지 모든 경우에 폴리아크릴아미드 코팅의 존재를 확인해주었다. 두께가 XPS 기술의 분석 깊이(5 - 10 nm) 미만이 아니면 일반적으로 XPS 기술에 의해 코팅의 두께를 추산하는 것은 가능하지 않다.
연속적, 단속적 또는 단속적 + 지연 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 XPS 분석으로부터 얻어진 원자 퍼센트 및 원소비. 비교를 위해 Si-ALAPP 샘플 및 이론적 조성의 폴리아크릴아미드(PAAM)에 대해 얻어진 분석 결과도 포함시켰다.
샘플 C
(at. %)		 O
(at. %)		 N
(at. %)		 O/C N/C
PAAM(이론적) 60.7 19.7 19.7 0.33 0.33
Si-ALAPP 76.8 12.6 10.4 0.16 0.14
연속적 64.6 18.3 17.1 0.28 0.27
단속적 62.3 18.8 16.8 0.30 0.27
단속적 + 지연 60.4 19.6 16.9 0.32 0.28
조사중인 3가지 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하기 위하여, 프로필로메트리(profilometry)를 사용하였다. 이 경우에, 주사기 바늘의 팁을 사용하여 코팅된 샘플을 스크래칭하여 아래의 Si 웨이퍼를 노출시켰다. 그 후, 다양한 스크래치/위치에 대해 프로필로미터(Dektak by Veeco)를 사용하여 스크래치의 깊이를 측정하고 Si-ALAPP 기판 표면과 비교하였다. 중복된 프로필로메트리 실험 결과를 표 12에 나타내었다. Si-ALAPP 샘플의 두께(전형적으로 25-30 nm 두께)에 대한 데이터는 포함되어 있지 않다. 그라프트 중합체 코팅에 대한 두께 데이터는 Si-ALAPP 기판의 표면을 기준으로 하였다.
표 12의 데이터는 제조된 코팅의 건조 두께가 연속적 < 단속적 < 단속적 + 지연의 순서로 증가하였음을 명백히 보여주었다. 분명히, 연속적 UV 조사를 사용하여 생성된 코팅의 건조 두께는 단속적 UV 조사 조건 하에 생성된 2가지 코팅보다 유의적으로 적었다. 또한, 단속적 + 지연 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅에 비해 유의적으로 더 두꺼웠다.
세포 배양 응용의 경우에, 생성된 코팅의 수화 두께는 건조 두께보다 더 관계가 있다. 코팅의 수화 두께를 추산하기 위하여, 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope; AFM) 기술을 이행하였다. 이때, 실리카 콜로이드 입자(직경 ~ 4 ㎛)를 외팔보 스프링(cantilever spring)에 접착시켜(Epon 1004, Shell) 공지 기하형태(예: 구형)의 탐침을 제공하였다. 그 후, 인산 완충 식염수(PBS)(pH 7.4) 용액 중의 실리카 콜로이드와 그라프트 중합체성 코팅 사이의 상호작용을 분리 거리의 함수로 측정하였다. 실리카 콜로이드가 코팅과 접촉함에 따라, 반발력이 발생하며, 그 범위는 코팅의 수화 두께를 추산할 수 있게 한다. 액세포(fluid cell) 내부에 장착된 샘플 위의 여러 위치에서 MFP-3D AFM(Asylum Research, Santa Barbara, CA)을 사용하여 상호작용력을 측정하였다. 외팔보(cantilever)의 스프링 상수는 문헌(Cleveland, J. et al., (1993), Rev. Sci. Instrum., 64, 403-5)의 공명법을 사용하여 결정하였고, 실리카 입자의 반경은 광학 현미경 검사를 사용하여 결정하였다. 이동한 피에조(piezo) 거리의 함수로서의 외팔보 굴절을 MFP-3D 소프트웨어를 사용하여 분리 거리의 함수로서의 힘에 대해 기준화하였다. 비-압축성 표면, 예컨대 Si 웨이퍼 조각을 사용하여 기준 측정을 수행하였고, 강성 접촉에서 굴절의 반대 기울기를 사용하여 광검출기를 보정하였다.
연속적, 단속적 또는 단속적 + 지연 조건에 의해 제조된 그라프트 중합체성 코팅에 대해 얻어진 결과. 프로필로메트리를 사용하여 건조 두께에 대한 데이터를 얻었다. PBS 용액에서 AFM 직접력 측정을 사용하여 수화 두께에 대한 데이터를 얻었다. 건조 및 수화 두께 값으로부터 팽윤비를 계산하였다. 상호작용력 데이터를 분석하고 헤르츠 이론(Hertz theory; reference for Hertz theory and the approach used is: Dimitriadis, E.K., et al. (2002), Biophysical J., 82, 2798-2810)을 사용하여 계산된 이론적 예상과 비교하여 샘플의 탄성률을 얻었다. 보고된 결과는 중복 샘플 위의 3군데 위치 분석으로부터의 평균이다.
샘플 건조 두께
(nm)		 수화 두께
(nm)		 팽윤비 탄성률
(Pa)
연속적 136 ± 38 708 ± 20 5.2 200
단속적 231 ± 11 4056 ± 155 17.5 90
단속적 + 지연 302 ± 10 5549 ± 288 18.3 90
표 12에 나타낸 연속적, 단속적 또는 단속적 + 지연 UV 조사 조건을 사용하여 제조된 그라프트 중합체성 코팅에 대한 수화 두께 데이터를 분석하면 연속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사 조건을 사용하여 제조된 2가지 코팅보다 유의적으로 더 얇은 것을 명백히 알 수 있다. 또한, 단속적 + 지연 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅보다 유의적으로 더 두꺼웠다.
3가지 코팅의 팽윤비(표 13 참조)를 분석하면, PBS 용액을 사용하여 수화되는 경우 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅이 연속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅보다 훨씬 더 팽윤할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 필시 코팅 내부의 가교도 때문이다. 연속적 UV 조사는 4 공정을 유발할 것이다: (i) 자유 라디칼 형성, (ii) 쇄 절단, (iii) 가교 반응, 및 (iv) 중합체 쇄 성장. 이들 4가지 공정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조되는 그라프트 중합체성 코팅의 경우에도 일어날 것이지만, 4가지 공정의 상대적인 균형은 아마도 상이할 것이다. 양자의 경우에 자유 라디칼 형성이 동일하다고 가정하면, 단속적 UV 조사는 연속적 경우에 비해 샘플이 UV를 사용하여 조사되지 않을 때 더 많은 중합체 성장을 유발하고, 코팅 내부에 더 적은 가교를 유발하여야 한다. 이 가정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 건조 및 수화 두께 양자 모두가 더 크다는 것으로부터 증명된다. 연속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 얻어진 팽윤비의 감소는 코팅 내부에 더 높은 정도의 가교가 있음을 시사한다. 동일한 정도의 가교와 함께 더 두꺼운 코팅들, 예컨대 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 코팅들은 매우 유사한 팽윤비를 나타낼 것이다. UV 조사가 없는 부가적인 시간(단속적 + 지연)은 중합체성 코팅 그라프트 층 두께를 증가시키는데 영향을 미치며, 이는 다시금 샘플이 조사되지 않을 때, 더 짧은 비-조사 시간(단속적)의 경우에 비해 더 많은 중합체 성장이 이루어지며, 연속적 UV 조사 조건에 비해 훨씬 더 많은 중합체 쇄 성장이 이루어짐을 시사한다.
표 12는 또한, AFM 직접 상호작용력 데이터를 분석하고 힘 곡선을 헤르츠 이론을 사용하여 생성된 모델 데이터에 맞게 조정함으로써 얻어진 3가지 코팅 조건에 대한 탄성률 값을 보고한다. 이때, 2가지 단속적 조건을 사용하여 생성된 코팅이 연속적 조사를 사용하여 제조된 것에 비해 약간 더 부드러운 것은 명백하다. 이 데이터는 단속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅 내부에 더 적은 가교가 존재한다는 가정을 뒷받침한다.
실시예 12
상이한 코팅 알키텍처에 대한 세포 반응
파트 A: UV 방사선의 단속적 노출을 사용하는, 개시제가 결여된 UV 그라프트 공중합체 코팅의 형성
실시예 1에 따라, 글로브 박스(산소 농도 <0.1%) 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체의 10%(w/v) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 이 방식으로 제조된 용액들을 96 웰 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)의 웰로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 0.07 ㎤였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트(Fusion Systems LC6B Benchtop Conveyor) 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems FS300s, 9 mm D-bulb) 아래로 35회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 180도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트를 흐르는 Milli-QTM 물로 철저히 세척한 다음, 실온에서 매일 물을 교체하면서 72 시간 동안 다량의 Milli-QTM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 B: 거대-개시제를 기본으로 하는 UV 그라프트 공중합체 코팅의 형성
96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)를 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 도입하였다. 다중웰 플레이트의 베이스와 동일한 치수를 갖는 직사각형 구리 전극 위에 플레이트를 놓았다. 그 후, 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.33 mbar의 초기 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다.
계속하여, 실온에서 2시간 동안 1%(w/v)의 PI 농도로 3.8 mg/mL의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)(Sigma)를 함유하는 90%(v/v) DMF(Merck) 및 10%(v/v) Milli-QTM 물의 혼합물과 인큐베이션하여 문헌[L. Meagher, H. Thissen, P. Pasic, R.A. Evans, G. Johnson, WO2008019450-A1] 기재되고 사내 합성된 거대-개시제 폴리(아크릴산-코-디에틸-디티오카밤산 4-비닐-벤질 에스테르)(PI)를 아민 작용기화 다중웰 플레이트 표면에 공유 고정화하였다. 그 후, 플레이트를 90%(v/v) DMF(Merck) 및 10%(v/v) Milli-QTM 물의 혼합물로 3회 및 Milli-QTM으로 3회 세척한 다음 공기 건조시켰다.
글로브 박스(산소 농도 <0.1%) 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체를 함유하는 10%(w/v) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 이 방식으로 제조된 용액들을 PI 개질된 ALAPP에 의해 처리된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 웰로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 0.20 ㎤였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Spectroline, model XX-15A) 밑에 놓고 6 시간 동안 주문 제작한 박스 내에서 10 mW/㎠의 강도로 연속적으로 조사하여 중합을 달성하였다. 그 후, 플레이트를 Milli-QTM 물로 적어도 3회 철저히 세척한 다음, 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-QTM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 C: 코팅 조성의 특성조사 및 세포 반응
각각 2가지 상이한 UV 기반-코팅법을 사용하여 TCPS(파트 A) 또는 TCPS-ALAPP-PI(파트 B) 기판 위의 AA 및 AAM 용액을 사용하여 제조된 단일중합체 및 공중합체 코팅에 대해 X-선 광전자 분광법(XPS) 분석을 수행하였다. 얻어진 결과를 표 13 및 14에 나타내었다. 결과를 분석하면, 모든 경우에 코팅이 기판으로부터 성공적으로 성장하였음이 입증되었다. 개시제-결여 단속적 UV 코팅법에 의해 생성된 코팅에 대해 관찰된 O/C 및 N/C 원소비(파트 A)는 특정 단량체 용액으로부터 유래한 단일중합체성 또는 공중합체성 코팅에 대한 예상된 이론치에 근접하였는데, 이는 코팅 내의 AA 및 AAM 몰비가 단량체 공급액 내의 몰비와 유사함에 대한 증거가 된다. O/C 및 N/C 양자 모두의 비에 있어서도 명백한 경향이 관찰되었다. 거대-개시제 기반 UV 방법에 의해 제조된 코팅(파트 B)에 있어서도 동일한 경향이 관찰되었다. 그러나, 후자의 경우에 관찰된 원소비는 이 방법에 의해 달성된 코팅 두께의 감소로 인하여 예상된 이론치와 다소 상이하였으며, 이는 XPS 기술의 탐침 깊이 미만의 건조 두께를 나타내는 코팅을 초래하였다(즉, 일부 데이터는 코팅 및 기판 양자 모두로부터의 기여를 포함한다).
다양한 조성의 AA 및 AAM 용액을 사용하여 TCPS 기판 위에 제조된 그라프트 단일중합체 및 공중합체 코팅을 XPS 분석하여 얻은 평균 원소비. 코팅은 개시제-결여 단속적 UV 그라프트 중합을 이용하여 형성되었다(파트 A).
몰% AA O/C N/C
0 0.299 0.281
5 0.301 0.256
10 0.339 0.230
15 0.341 0.224
20 0.366 0.212
25 0.396 0.201
30 0.399 0.187
40 0.414 0.170
50 0.505 0.131
55 0.455 0.134
60 0.453 0.140
70 0.510 0.076
85 0.562 0.045
100 0.566 0.033
다양한 조성의 AA 및 AAM 공급액을 사용하여 TCPS-ALAPP-PI 기판 위에 제조된 그라프트 단일중합체 및 공중합체 코팅을 XPS 분석하여 얻은 평균 원소비. 코팅은 거대-개시제 기반 UV 그라프트 중합을 이용하여 형성되었다(파트 B).
샘플 O/C N/C
ALAPP 0.152 0.112
ALAPP-PI 0.157 0.099
0 몰% AA 0.240 0.241
5 몰% AA 0.278 0.241
10 몰% AA 0.291 0.224
20 몰% AA 0.333 0.203
50 몰% AA 0.302 0.092
100 몰% AA 0.332 0.058
HeLa 세포, 인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 또는 L929 마우스 섬유아세포를 사용하여 코팅에 대한 세포 부착을 평가하였다. 표면 개질된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 및 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 대조군 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)를 사용하여 세포 배양 실험을 수행하였다. 개시제-결여 단속적 UV 코팅법을 사용하여 제조한 샘플을 15 kGy(Steritech)의 선량을 사용하여 감마 조사로 멸균하였다. 거대-개시제 기반 UV 코팅법을 사용하여 제조한 샘플을 실온에서 4 시간 동안 각각 120 및 200 ㎍/㎤의 농도로 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 용액과 인큐베이션하여 세포 배양 직전에 멸균하였다.
HeLa 세포 부착은 10% 소 태자 혈청(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 신선한 둘베코 개질된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)/Hams F12 배지에서 2x104 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 부착은 Mesencult?-XF 배지(StemcellTM Technologies)에서 7875 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
L929 세포 부착은 10% FBS, 1% v/v 비-필수 아미노산 및 1% v/v 안티-안티가 보충된 MEM + GlutaMAXTM-I 배지(Gibco)에서 7875 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
각각의 세포 유형에서, 플레이트는 5% CO2를 함유하는 가습된 공기 중에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
HeLa 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, DMEM/Hams F12 용액 중의 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)(MTT)를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에서 배지를 제거하고 DMSO(100 ㎕/웰)로 대체하였다. 595 nm의 파장에서 세포 생존력의 색채 측정(colorimetric measurement)을 하기 전에 플레이트 진탕기 위에서 15 분간 플레이트를 부드럽게 진탕하여 착색(stain)을 용해시켰다. 시험 샘플로부터 측정된 흡광도 값을 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 대조군 웰에서 측정된 것의 퍼센트로 표시하였다.
hMSC 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, 배양 배지 중의 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 490 및 655 nm에서 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 결과를 판독하였다. 양쪽 파장으로부터의 판독 결과 사이의 차이를 얻어 평균하였다. 그 후, TCPS 표면으로부터 얻은 판독결과와 비교하여 데이터를 정규화하였다.
L929 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, 10% FBS 및 최소의 필수 아미노산을 함유하는 MEM 배지(Gibco) 중의 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 490 및 655 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 결과를 판독하였다. 양쪽 파장에서의 판독 결과 사이의 차이를 얻어 평균하였다. 그 후, TCPS 표면으로부터 얻은 판독결과와 비교하여 데이터를 정규화하였다.
도 9는 2가지 상이한 UV 방법을 사용하여 제조된 코팅에 대응한 세포 부착 결과를 중합체성 코팅의 조성의 함수로서 보여준다. 코팅은 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM)의 한정된 몰비로부터 형성된 단일중합체 또는 공중합체였다. 단속적 UV 노출에 의해 생성된 개시제-결여 UV 기반 코팅의 경우(파트 A), hMSC 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 위에서 얻어진 세포 부착의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 비교하면, 거대-개시제 기반의 UV 접근법을 사용하여 제조된 코팅의 경우(파트 B), HeLa 세포 부착은 10% 미만의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 위에서 얻어진 값의 10% 미만의 수준으로만 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다(n≥3).
도 9에 나타낸 데이터를 분석하면, 이는 폴리스티렌 기판 표면 위에 존재하는 공중합체 코팅 내의 AA 및 AAM 몰비가 동일한 경우에, 코팅법에 따라 상이한 세포 부착 반응이 관찰됨을 명백히 시사한다. 단속적 UV 조사에 의해 생성된 개시제-결여 UV 기반 코팅의 경우에(파트 A에 기재됨), 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 값의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소될 수 있다. 비교하면, 거대-개시제 기반의 UV 접근법을 사용하여 제조된 코팅의 경우, 세포 부착은 10% 미만의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 값의 10% 미만의 수준으로만 효과적으로 감소하였다. 이들 결과는, 각각, 인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 및 HeLa 세포를 사용하여 얻어졌다. 또한, 도 10에 나타낸 데이터를 분석하면, 동일한 코팅 위에서는 상이한 세포 유형(hMSC 및 L929 세포)을 사용하여 유사한 세포 부착 결과가 얻어짐을 명백히 알 수 있다. 이 결과는 단속적 UV를 사용하는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성된, 전체 범위의 AA/AAM 몰조성에 걸쳐 얻어졌다. 결과는 유사한 세포 부착 결과가 달성됨을 명백히 입증한다. 양쪽 세포 유형의 경우, 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다.
비교하면, 실시예 13에 나타낸 데이터의 분석은 연속적 조사를 사용하여 제조된 40 몰% AA-co-AAM 표면의 경우 동일하게 낮은 L929 부착이 관찰되었음을 명백히 보여준다.
도 10은 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM)를 기본으로 하는 공중합체 코팅에 대한 상이한 세포 유형의 반응을 보여준다. 코팅은 단속적 UV를 사용하는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성되었다. hMSC 및 L929 세포를 사용하여 유사한 세포 부착 결과가 얻어졌다. 양쪽 세포 유형의 경우, 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다(n≥3).
도 9 및 10의 전반적인 데이터는 2가지의 매우 상이한 UV 기반 중합법에 의해 상이한 코팅 알키텍처가 생성되었으며 이 차이는 세포 반응(즉, 세포 부착)에서의 관찰된 차이에 책임이 있다는 가정을 명백히 뒷받침한다. 또한, 데이터는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성된 코팅이 AA 및 AAM 조성의 훨씬 더 넓은 범위의 몰비에 걸쳐 상이한 세포 유형의 세포 부착을 방지하는데 더욱 효과적임을 입증한다. 세포 부착이 혈청 단백질의 비-특이적 흡착에 의해 이루어진다는 사실로 인하여, 개시제-결여 UV 기반 코팅법이 훨씬 더 넓은 범위의 AA 및 AAM 몰비에 걸쳐 비-특이적 혈청 단백질 흡착을 방지하는데 더욱 효과적이라고 결론지을 수 있다.
실시예 13
중합체 그라프팅: 연속적 대 단속적 UV 조사
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35? 계면활성제, 2%(v/v) 에탄올 용액에서 초음파 세정하고, Milli-QTM 물을 사용하여 철저히 헹구고, 정제 질소 기체의 고속의 여과된 스트림을 사용하여 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleanerTM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 규소 웨이퍼 샘플을 도입하였다. 상부 전극과 동일한 치수를 나타내는 둥근 하부 구리 전극 위에 샘플을 놓았다. 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.20 mbar의 개시 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다. 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용할 때까지 공기 중에 놔두었다.
40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 PTFE 용기 내로 옮겼다. 각 용기에 첨가된 단량체 용액의 부피는 4 mL였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 용기를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 밀봉된 샘플을 고전력 UV 램프(Fusion UV Systems LH6 with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 램프 아래 고정된 스테이지 위에 위치시키고 조사하였다. 한정된 "온" 피리오드의 노출 및 한정된 "오프" 피리오드의 비-노출이 설정될 수 있도록 압축 공기 셔터가 열리고 닫히도록 프로그래밍하였다. 휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 임의의 주어진 설정값 하에 샘플에 도달하는 총 에너지 및 조도(irradiance)를 결정하였다. 이들 수치를 알게 됨으로써 상이한 공정 프로토콜에 대한 동일한 UV 방사선량을 결정할 수 있었다.
시험된 상이한 공정 프로토콜을 표 15에 나타내었다.
샘플 ON & (s) OFF & (s) 사이클 UVC (J/㎠)
연속적 1 15 n/a 1 0.58
연속적 2 30 n/a 1 0.99
연속적 3 45 n/a 1 1.41
연속적 4 60 n/a 1 1.83
연속적 5 75 n/a 1 2.25
연속적 6 90 n/a 1 2.67
연속적 7 120 n/a 1 3.51
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 1 20 53 2.67*
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 1.9 20 35 2.67*
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 1 20 19 0.99*
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 2.9 20 9 0.99*
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 4.7 20 6 0.99*
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 10 20 3 0.99*
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 15 20 2 0.99*
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 1 1 19 0.99*
단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 1 10 19 0.99*
단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 1 30 19 0.99*
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 1 60 19 0.99*
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 4.7 1 6 0.99*
단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 4.7 40 6 0.99*
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 4.7 60 6 0.99*
* 표적 수치
* &수치는 장비에 사용된 설정값을 나타낸다.
목적하는 UV 방사선 노출 후, 샘플을 풍부한 양의 물로 세척한 다음 여과 정제된 질소 스트림 하에 건조시키고 분석하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 표 16에 나타내었다.
연속적 및 단속적 공정 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 XPS 분석으로부터 얻어진 원자 퍼센트 및 원소비
샘플 O
(at. %)		 N
(at. %)		 C
(at. %)		 O/C N/C
Si-ALAPP(계열 1) 17.5 8.5 73.4 0.24 0.12
연속적 1 26.2 9.1 63.5 0.41 0.14
연속적 2 26.4 9.2 63.5 0.42 0.14
연속적 3 27.4 9.1 62.4 0.44 0.15
연속적 4 27.3 9.1 62.2 0.44 0.15
연속적 5 27.4 9.0 62.3 0.44 0.14
연속적 6 27.2 9.0 62.7 0.43 0.14
연속적 7 25.0 10.9 63.1 0.40 0.17
Si-ALAPP(계열 2) 17.6 8.5 73.0 0.24 0.12
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 27.2 9.3 62.3 0.44 0.15
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 27.6 9.3 61.8 0.45 0.15
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 27.6 9.2 61.9 0.45 0.15
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 27.7 9.1 61.9 0.45 0.15
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 27.5 9.2 61.9 0.44 0.15
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 27.8 9.2 61.7 0.45 0.15
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 27.3 9.1 62.3 0.44 0.15
Si-ALAPP(계열 3) 16.0 12.4 71.3 0.22 0.17
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 27.6 9.9 62.2 0.44 0.16
단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 27.3 9.8 62.7 0.43 0.16
단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 27.3 9.5 62.9 0.43 0.15
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 27.5 9.6 62.6 0.44 0.15
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 27.6 9.8 62.4 0.44 0.16
단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 26.6 9.9 63.3 0.42 0.16
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 27.1 9.7 62.9 0.43 0.15
알릴아민 플라즈마 중합체 박막 침착(Si-ALAPP) 후의 조성은 예상한 바와 같았다. 단량체 용액에서 샘플의 연속적 조사 후, 아크릴아미드 및 아크릴산으로 구성된 그라프트 공중합체 코팅과 일치하게 O 및 N 양자 모두의 원자 퍼센트가 증가하였다.
타원편광반사법(Ellipsometry)을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하였다(JA Woolam Co, M2000). 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 표 17에 나타내었다.
연속적 및 단속적 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 타원편광반사 분석으로부터 유래한 두께 데이터
샘플 두께* (nm)
Si-ALAPP(계열 1) 29.04
연속적 1 15.2
연속적 2 33.81
연속적 3 63.21
연속적 4 95.64
연속적 5 115.93
연속적 6 151.98
연속적 7 NM
Si-ALAPP(계열 2) 29.52
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 212.8
단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 196.44
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 28.68
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 22.61
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 37.17
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 38.33
단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 37.59
Si-ALAPP(계열 3) 32.9
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 122.09
단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 66.66
단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 96.97
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 115.53
단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 108.95
단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 134.79
단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 127.83
* NM = 불충분한 코팅 품질로 인하여 측정되지 않음
* 층 두께(즉, 밑에 있는 ALAPP 층을 포함하지 않음)
샘플 '연속적 7'은 측정될 수 없었다. 일부 중복 샘플 위에서, ALAPP는 온도 상승 및 장기간의 연속적 노출 시간에 의한 분해로 인하여 Si 기판으로부터 탈적층되었다. 다른 중복 샘플 위에서, 형성되었던 코팅은 매우 불균질하였다.
샘플 '연속적 6'은 탈적층되기 직전인 것으로 보였고, 일부 중복 샘플의 어떤 면적에서는 탈적층이 발생하였다. 그러나, 코팅 두께는 측정가능하였다. 샘플 '연속적 6' 및 샘플 '단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1' 및 '단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2'을 비교하면, 3가지 모든 샘플들이 0.99 J/㎠의 동일한 UVC 방사선량을 수령하였고, 연속적으로부터 단속적 노출 요법으로 이동함에 따라 a) Si로부터 ALAPP의 탈적층 없이 코팅을 제조할 수 있는 능력, 및 b) 더 두꺼운 코팅 양자 모두를 초래하였음은 분명하다. 연속적 노출과 비교하여 단속적 노출을 변화시키면서 이 계열의 샘플들에서 얻어진 두께의 증가는 실시예 11에 제시된 데이터 세트와 일치한다. 실시예 11에서, 단속적 UV 노출은 PBS에서 더 높은 정도로 팽윤하고 더 낮은 탄성률을 나타내는 더 두꺼운 코팅을 초래하였다. 본 실시예에 제시된 데이터 세트에서도 동일한 경향이 나타나리라고 가정하는 것이 합리적이다.
데이터 세트에서 분명한 경향 중의 하나는 "온" 시간이 변화하지만 UVC는 일정하게 유지되는 경우, 얻어지는 코팅 두께가 유사하다(그리고 일반적으로 연속적 조사에 의해 얻어지는 두께보다 더 두껍다)는 점이다. 이 데이터를 분석하면, 총 UVC 선량이 코팅 두께를 결정하는데 매우 중요하다는 결론에 이른다.
또한, 샘플 제조 중에 "오프" 시간의 영향을 고려할 때 관찰될 수 있는 일부 명백한 경향이 있다. 실시예 11은 조사 후 지연이 더 두꺼운 코팅을 초래함을 입증하였다. 본 발명자들은 이것이 샘플이 UV 램프로부터 옮겨진 후의 지속적인 중합때문이며, 다시금 UV 램프 아래에 놓여지기 전의 지연이 추가의 중합 및 더 두꺼운 코팅을 허용한다는 결론을 내렸다. 여기에서, 본 발명자들은 "오프" 시간이 증가할 때(지연 시간의 증가와 균등), 더 큰 코팅 두께가 얻어짐을 알 수 있다. 예를 들어, "오프" 시간이 10 s 에서 60 s로 증가하면(샘플: 단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1, 단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1, 및 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1), 두께는 67 nm 에서 116 nm로 증가하였다. 따라서, "온" 시간이 고려되는 경우, 두께 증가에 기여하는 것은 총 UVC 노출이다. "오프" 시간의 경우, 두께 증가에 기여하는 것은 "오프" 시간의 길이이다.
이전 실시예들과 유사한 프로토콜을 사용하여 공유 고정화된, 세포 부착성 사이클릭 RGDfK 펩티드와 함께 L929 섬유아세포를 배양하고 대조군(부착 펩티드 없음)과 비교하였다. 모든 경우에, 세포들이 부착되고 코팅 위에 잘 퍼졌다. 세포수, 세포 원형도 또는 세포에 의해 점유된 면적에 있어서 유의한 차이는 보이지 않았다. 연속적 조사에 의해 제조된 대조군 표면도 세포 부착에 저항성이었다.
실시예 14
중합체 그라프팅: 단속적 UV 조사의 사이클 증가
파트 A: 코팅의 제조
실시예 13에 따라, 40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 48-웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 웰 내로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 227 ㎕였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 5, 15, 25, 35, 또는 45회 통과시켰다. 그 후, 웨이퍼를 단량체 용액으로부터 제거하고 Milli-QTM 물로 적어도 3회 철저히 세척한 다음 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-QTM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 통과 회수가 증가함에 따라 결정된 조성이 ALAPP의 조성으로부터 40 몰% 폴리(AA-co-AAM) 공중합체의 이론적 조성을 향하여 변화하였는데, 이는 코팅 두께가 약 10 nm의 XPS 샘플링 깊이보다 커지는 것으로 증가함을 나타낸다. UV 통과가 많은 경우 관찰된 이론적 조성으로부터의 편차는 공중합의 동력학 때문일 수 있다.
타원편광반사법을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하였다(JA Woolam Co, M2000). 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 도 12에 나타내었다.
이전 실시예들과 유사한 프로토콜을 사용하여 공유 고정화된, 세포 부착성 사이클릭 RGDfK 펩티드와 함께 L929 섬유아세포를 배양하고 대조군(부착 펩티드 없음)과 비교하였다. 모든 경우에, 세포들이 부착되고 코팅 위에 잘 퍼졌다. 세포수, 세포 원형도 또는 세포에 의해 점유된 면적에 있어서 유의한 차이는 보이지 않았다. 하나의 예외가 UV 5회 통과로 제조된 샘플이었는데, 여기에서는 세포 부착이 관찰되었고, 이는 아마도 세포가 밑에 있는 ALAPP를 감지하였기 때문인 것으로 보인다.
실시예 15
중합체 그라프팅: UVB 및/또는 UVC 차단의 효과
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35? 계면활성제, 2%(v/v) 에탄올 용액에서 초음파 세정하고, Milli-QTM 물을 사용하여 철저히 헹구고, 정제 질소 하에 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleanerTM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 규소 웨이퍼 샘플을 도입하였다. 상부 전극과 동일한 치수를 나타내는 둥근 하부 구리 전극 위에 샘플을 놓았다. 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.20 mbar의 개시 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다. 그 후, 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용하기 전에 Milli-QTM 물에서 헹구었다.
40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 PTFE 용기 내로 옮겼다. 각 용기에 첨가된 단량체 용액의 부피는 4 mL였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 용기를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 또한, 샘플 표면 상의 UVA, UVB 및 UVC 강도를 감쇄시키기 위하여 일부 경우에 필터를 폴리머백 내부에 놓았다. 사용된 조건은 구체적으로 다음과 같다: 100% UVA, 100% UVB 및 100% UVC; 100% UVA, 30% UVB 및 0% UVC; 및 마지막으로 90% UVA, 0% UVB 및 0% UVC. 이들 수치는 Power Puck 강도 측정 디바이스 및 다양한 필터를 사용하여 결정하였다. 그 후, 밀봉된 샘플을 N2 글로브 박스에서 빼내어 고전력 UV 램프(Fusion UV Systems LH6 with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 램프 아래 고정된 스테이지 위에 위치시켰다. 한정된 "온" 피리오드의 노출 및 한정된 "오프" 피리오드의 비-노출이 달성될 수 있도록 압축 공기 셔터가 열리고 닫히도록 프로그래밍하였다. 휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 임의의 주어진 설정값 하에 샘플에 도달하는 총 에너지 및 방사선 유형을 결정하였다. 각 경우에, 샘플에 20 사이클의 UV 노출을 적용하였으며, 각 사이클에서 UV는 2 s 동안 "온"이고 10 s 동안 "오프"였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
코팅에 대해 얻어진 XPS 결과를 표 18에 나타내었으며, 여기에서는 얻어진 3가지 코팅 모두의 조성이 원자 퍼센트 뿐아니라 O/C 및 N/C 원소비 양자 모두의 측면에서 매우 유사함을 관찰할 수 있다. 도 xxx에 나타낸 것은 대표적인 고해상도 C 1s 스펙트럼이다. 분석된 샘플 각각에 대해 얻어진 3가지 스펙트럼의 형태도 매우 유사하였으며, 이는 조성이 유사할 뿐아니라 탄소계 작용기의 상대적 비율도 유사함을 시사한다. XPS 데이터를 분석하면 조사된 3가지 유형의 UV 광선 모두, 즉, UVA, UVB 및 UVC의 존재하에 그라프팅이 일어나며 생성된 모든 코팅이 약 10 nm의 XPS 분석 깊이보다 큰 두께를 나타냄을 알 수 있다.
UVA, UVB 및 UVC의 퍼센트를 변화시키면서 단속적 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 XPS 분석으로부터 얻어진 원자 퍼센트 및 원소비
샘플 O
(at. %)		 N
(at. %)		 C
(at. %)		 O/C N/C
샘플 2(100 % UVA, 100% UVB, 100% UVC) 27.7 9.0 60.9 0.45 0.15
샘플 3(90 % UVA, 0% UVB, 0% UVC) 26.8 9.2 63.4 0.42 0.14
샘플 4(100 % UVA, 30% UVB, 0% UVC) 27.5 9.4 62.2 0.44 0.15
UVA, UVB 및 UVC 퍼센트를 변화시키면서 만들어진 코팅이 조성에 있어서 유사하기는 하지만, 두께는 100% UVA, 100% UVB 및 100% UVC가 100% UVA, 30% UVB 및 0% UVC보다 두껍고, 이는 90% UVA, 0% UVB 및 0% UVC보다 두꺼은 순서로 다양했다.
실시예 16
중합체 그라프팅: 아르곤 분위기
파트 A: 코팅의 제조
상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체의 7.5%(w/v) 수용액을 밀폐 용기 내에서 3회 사이클의 동결-펌프-융해에 의해 탈기시킨 후 아르곤-충전된 글로브 박스 안으로 옮겼다(산소 농도 <0.03%). 실시예 13에 따라, 이 방식으로 제조된 용액을 일부 웰이 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 48-웰 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트(NunclonTM Δ, Nunc)의 웰 내로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 172 ㎕(웨이퍼 제외) 및 227 ㎕(웨이퍼 포함)였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 40회 통과시켰다. 그 후, 플레이트와 웨이퍼를 Milli-QTM 물로 철저히 세척한 다음 매일 물을 교체하면서 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-QTM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플 및 웨이퍼를 공기 건조시켰다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고, 얻어진 결과를 표 19에 나타내었다. XPS 분석으로부터 얻어진 데이터를 분석하면, 코팅 조성들이 예상된 바와 같음을 알 수 있었다. 예를 들어, 공급액 중의 AAM 단량체 몰퍼센트가 감소함에 따라 코팅 내 질소의 원자 퍼센트도 감소하였다. 질소 함량의 감소와 병행하여, 단량체 공급물 중의 AA 몰퍼센트가 증가함에 따라 산소 함량의 증가가 관찰되었다.
아르곤 분위기하에 단속적 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 XPS 분석으로부터 얻어진 원자 퍼센트 및 원소비
샘플 O
(at. %)		 N
(at. %)		 C
(at. %)		 O/C N/C
Si-ALAPP 15.6 12.6 71.8 0.22 0.18
0 몰% AA-co-AAM (즉, AAM) 16.6 19.3 64.1 0.26 0.30
10 몰% AA-co-AAM 18.8 17.0 64.1 0.29 0.27
20 몰% AA-co-AAM 21.2 14.7 64.1 0.33 0.23
30 몰% AA-co-AAM 23.3 12.4 64.3 0.36 0.19
40 몰% AA-co-AAM 25.9 10.2 63.8 0.41 0.16
50 몰% AA-co-AAM 27.5 8.8 63.8 0.43 0.14
60 몰% AA-co-AAM 27.8 8.2 63.9 0.44 0.13
70 몰% AA-co-AAM 31.1 5.2 63.8 0.49 0.08
80 몰% AA-co-AAM 32.4 3.7 63.8 0.51 0.06
90 몰% AA-co-AAM 34.1 2.0 63.5 0.54 0.03
100 몰% AA-co-AAM (즉, AA) 35.7 0.5 63.8 0.56 0.01
형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하기 위하여 타원편광반사법을 사용하였다. 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 표 20에 나타내었다. 얻어진 데이터를 분석한 결과, 단량체 공급물의 조성(즉, AA 및 AAM 단량체의 몰퍼센트)에 따라 두께에 있어서의 작은 차이가 명백히 나타났고, AA가 20 몰% 초과인 AA 및 AAM의 조합에서 가장 두꺼운 코팅을 얻은 반면 단일중합체 코팅은 약간 더 얇은 것으로 나타남을 알 수 있었다.
아르곤 분위기하에 단속적 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 타원편광반사 분석으로부터 얻어진 두께 데이터
샘플 두께* (nm)
Si-ALAPP 27.5
0 몰% AA-co-AAM(즉, AAM) 125.2
10 몰% AA-co-AAM 178.9
20 몰% AA-co-AAM 200.0
30 몰% AA-co-AAM 231.4
40 몰% AA-co-AAM 248.0
50 몰% AA-co-AAM 221.3
60 몰% AA-co-AAM 228.4
70 몰% AA-co-AAM 228.2
80 몰% AA-co-AAM 243.5
90 몰% AA-co-AAM 215.2
100 몰% AA-co-AAM(즉, AA) 206.6
* 당해 층의 두께(즉, 밑에 있는 ALAPP 층을 포함하지 않음)
이 데이터 세트는 코팅이 질소 기체 뿐아니라 아르곤의 존재하에서 제조될 수 있음을 명백히 입증한다.
실시예 17
광범위한 화학 분류로부터의 단량체를 사용한 중합체 그라프팅
파트 A: 코팅의 제조
표 21에 열거된 단량체들을 사용하여 0.4 내지 1.0 M 범위의 농도로 50% 이하의 DMSO(v/v)를 함유하는 수용액들을 글로브 박스 안에서 질소 분위기하에 제조하였다. 소량(40 - 300 ㎕)의 용액을 다중웰 플레이트(96 웰)의 웰에 첨가하였다. 단량체 용액을 함유하는 웰의 열 사이에 적어도 한 열의 비어있는 웰을 남겨 중합체 코팅의 교차-오염을 피하였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 60회 이하로 통과시켰다. 그 후, 플레이트를 그 안에서 중합체 코팅이 형성된 용액을 사용하여 적어도 3회 철저히 세척하고 Milli-QTM 물로 적어도 3회 세척한 다음, 다량의 Milli-QTM 물에서 72 시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 추가 및 마지막 세척 후, 샘플을 공기 건조시키고, 이중 백에 넣고 15 KGy의 선량에서 감마 조사를 이용하여 멸균한 다음 X-선 광전자 분광법(XPS)을 사용하여 특성조사하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고, 얻어진 결과를 표 21에 나타내었다. 비교를 위하여 기초 기판의 전형적인 표면 조성인 조직 배양 처리된 폴리스티렌(TCPS)을 포함시켰다. 용이하게 관찰할 수 있는 바와 같이, 표 21에 열거된 단량체로부터 형성된 코팅의 표면 조성은 모두 뚜렷하게 TCPS 기판과 상이하며, 이는 코팅이 각 경우에 형성되었음을 시사한다. TCPS 기판의 표면은 탄소 및 산소만을 함유한다. 일부 경우에, 조성은 TCPS 조성 및 관심의 대상인 중합체 코팅에 대한 이론적 조성의 중간이다. 이 경우에, 형성된 코팅 두께는 XPS 샘플링 깊이 미만이며, 표면 조성은 밑에 있는 기판으로부터의 기여를 포함하였다. 많은 경우에, TCPS 기판의 상부에 형성된 코팅의 표면 조성은 이론적 조성과 매우 유사하며, 이는 코팅이 적어도 XPS 샘플링 깊이(10 nm) 만큼 두꺼움을 나타낸다.
좌측 칼럼에 열거된 단량체로 제조된 단량체 용액을 사용하여 제조된 UV 그라프트 중합체 코팅을 XPS 분석하여 얻어진 원소 조성(원자%)
단량체/샘플 명칭 조성(원자 %)
C O N S Ca Na Cl K Si
TCPS 82.0 18.0
N-이소프로필아크릴아미드 75.6 12.2 12.2 　
메틸 메타크릴레이트 71.6 27.6 0.8
2-카복시에틸 아크릴레이트 63.0 37.0 　
3-설포프로필 아크릴레이트, 칼륨염 49.2 38.5 0.6 7.4 0.9 3.5 　
모노-2-(메타크릴로일옥시)에틸 석시네이트 64.3 35.7 　
N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드 71.2 14.2 13.5 0.6 0.6 　
2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드 62.3 27.7 8.7 0.3 0.4
2-하이드록시에틸메타크릴레이트 67.6 32.4 　
폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 475] 68.8 31.2 　
메틸 아크릴레이트 74.8 25.1 0.1 　
폴리(프로필렌 글리콜) 메틸 에테르 아크릴레이트[MW202] 72.2 27.8 　
4-하이드록시부틸 아크릴레이트 71.8 26.2 2.0 　
2-메타크릴로일옥시 에틸 아세토아세테이트 67.1 32.9 　
아크릴산 62.8 37.2 　
메타크릴산 69.6 30.4 　
하이드록시에틸아크릴레이트 석시네이트 60.7 35.4 3.9 　
2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 55.7 27.8 6.9 6.1 3.6 　
[3-(메타크릴로일아미노)프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드 73.3 13.5 10.1 0.7 2.4 　
[3-(메타크릴로일옥시)에틸]-트리메틸암모늄 클로라이드 72.0 19.2 5.8 0.5 2.6 　
2-하이드록시에틸아크릴레이트 64.6 35.4 　
폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트[MW 360] 67.5 32.5 　
폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 1100] 70.7 29.3 　
폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 2080] 70.6 29.4 　
폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 [MW 526] 68.3 31.8 　
아크릴아미드 64.0 18.6 17.5 　
1-비닐-2-피롤리돈 76.9 12.9 10.2 　
N,N,-디메틸아크릴아미드 72.7 14.1 13.2 　
N-[3-(디메틸아미노)프로필] 메타크릴아미드 72.4 16.3 11.0 0.4 　
메타크릴아미드 70.5 16.7 12.8 　
(2-디메틸아미노에틸) 메타크릴레이트 73.2 19.2 7.3 　
N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드 70.3 19.9 9.8 　
[2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드 63.9 26.8 4.7 4.6 　
[3-(메타크릴로일아미노)프로필] 디메틸(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드 65.1 21.9 8.7 4.3 　
4-아크릴로일몰폴린 70.2 21.0 8.5 0.5
N-(하이드록시메틸)아크릴아미드 62.6 24.4 12.8 0.2
N-2-하이드록시에틸 아크릴아미드 64.5 23.6 11.3 0.5
N-메타크릴로일 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 64.7 27.1 7.4 0.7
설포프로필메타크릴레이트 칼륨염 54.9 33.4 1.1 6.2 0.9 3.5 　
디아세톤 아크릴아미드 75.3 16.5 8.2 　
N,N-디에틸 아크릴아미드 78.2 11.1 10.7 　
N-에틸 아크릴아미드 70.2 16.6 13.2 　
N-(n-프로필)아크릴아미드 74.8 13.7 11.5 　
하이드록시프로필 아크릴레이트 67.4 31.7 0.9 　
N-tert-부틸 메타크릴아미드 75.0 18.8 6.2 　
N-tert-부틸 아크릴아미드 75.8 15.9 8.3 　
N-(n-부틸)메타크릴아미드 77.9 13.3 8.7 　 　 　 　 　 　

Claims (20)

  1. 하기 단계를 포함하는 중합체성 표면의 개질 방법:
    중합체성 표면을 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
    상기 용액과 접촉한 중합체성 표면을 자외선에 노출시켜 상기 중합체성 표면 상에 단량체의 그라프트-중합체 코팅을 제공하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 노출 단계가 상기 중합체성 표면을 자외선에 단속적으로 노출시키는 것을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 0.5 초 내지 3 분 범위로 3 피리오드(period) 이상의 UV 노출을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 1 초 내지 60 초 범위로 3 피리오드 이상의 UV 노출을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 5 초 내지 60 분 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 10 초 내지 5 분 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 1 초 내지 15 초 범위로 3 피리오드 이상의 UV 노출 및 1 초 내지 60 초 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체성 표면 및 상기 용액이 각각 실질적으로 개시제를 포함하지 않는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액이 수성인, 중합체성 표면의 개질 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 용액이 수혼화성 용매를 추가로 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    불활성 기체 분위기 하에 실행되는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체성 표면이 헤테로원자를 포함하지 않는 포화 중합체로 형성되는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체성 표면이 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌, 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 폴리스티렌, 스티렌 공중합체, 폴리-이소프렌, 폴리부타디엔, 폴리클로로프렌 고무, 폴리이소부틸렌 고무, 에틸렌-프로필렌디엔 고무 및 이소부틸렌-이소프렌 공중합체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 중합체로 형성되는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합체성 표면이 폴리스티렌으로 형성되며,
    상기 중합체성 표면이 1 초 내지 60 초 범위의 노출 사이의 간격으로 1 초 내지 15 초 범위의 피리오드 동안 3 피리오드 이상 자외선에 단속적으로 노출되는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체가 카복실산 작용기를 포함하는 제1 단량체 및 생물부착성(biofouling properties)이 낮은 제2 단량체를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제1 단량체는 아크릴산, 메타크릴산 및 2-카복시에틸 아크릴레이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하고, 상기 제2 단량체는 아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드 및 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 제1 단량체로서 아크릴산을 포함하고 상기 제2 단량체로서 아크릴아미드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액 중의 상기 제1 단량체 대 상기 제2 단량체의 몰비가 20:80 내지 90:10의 범위인, 중합체성 표면의 개질 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코팅이 세포 배양에 사용되는, 중합체성 표면의 개질 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 개질된 중합체성 표면을 포함하는 세포 배양 플레이트.
KR1020157002165A 2012-06-29 2013-06-28 중합체성 표면의 개질 방법 KR20150033697A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2012902793 2012-06-29
AU2012902793A AU2012902793A0 (en) 2012-06-29 Process for modifying a polymeric surface
PCT/AU2013/000710 WO2014000052A1 (en) 2012-06-29 2013-06-28 Process for modifying a polymeric surface

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150033697A true KR20150033697A (ko) 2015-04-01

Family

ID=49781964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157002165A KR20150033697A (ko) 2012-06-29 2013-06-28 중합체성 표면의 개질 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20150191693A1 (ko)
EP (1) EP2867285A4 (ko)
JP (1) JP2015527428A (ko)
KR (1) KR20150033697A (ko)
CN (1) CN104603189A (ko)
CA (1) CA2877757A1 (ko)
IL (1) IL236474A0 (ko)
SG (1) SG11201408620SA (ko)
WO (1) WO2014000052A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180005139A (ko) * 2016-07-05 2018-01-15 한국과학기술원 세포시트 제작방법 및 응용을 위한 고분자 박막 배양플레이트 제작방법 및 용도

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8709536B2 (en) * 2010-09-01 2014-04-29 International Business Machines Corporation Composite filtration membranes and methods of preparation thereof
PL3212684T3 (pl) 2014-10-31 2020-10-19 Illumina Cambridge Limited Polimery i powłoki z kopolimeru DNA
JP6362224B2 (ja) * 2016-05-09 2018-07-25 住友ゴム工業株式会社 表面改質方法
DE102018202000B4 (de) * 2018-02-08 2021-01-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung beschichteter Polymer-Substrate mittels Pfropfpolymerisation, Vorrichtung zur Herstellung beschichteter Polymer-Substrate mittels Pfropfpolymerisation sowie beschichtetes Polymer-Substrat
JP6978690B2 (ja) 2018-05-25 2021-12-08 日亜化学工業株式会社 透光性部材の形成方法および発光装置の製造方法、ならびに、発光装置
JP7315653B2 (ja) * 2018-08-16 2023-07-26 テルモ株式会社 細胞培養基材
JP7315652B2 (ja) * 2018-08-16 2023-07-26 テルモ株式会社 細胞培養基材
CN113817198B (zh) * 2020-06-17 2023-05-02 湖南宝升塑业科技开发有限公司 非释放型抗微生物黏附涂层在抗菌奶瓶中的应用
EP4168526A1 (en) * 2020-06-19 2023-04-26 FaCellitate GmbH Biocompatible device with an adsorbed layer of cationic comb copolymer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5463177A (en) * 1977-10-29 1979-05-21 Kansai Paint Co Ltd Surface modification of high polymer film
JPS58196238A (ja) * 1982-05-13 1983-11-15 Toyo Ink Mfg Co Ltd 無電解メツキ方法
JPH06104061B2 (ja) * 1989-02-10 1994-12-21 花王株式会社 細胞培養支持体材料
EP0521605A3 (en) * 1991-05-16 1993-03-10 Ioptex Research Inc. Biocompatible lubricious grafts
JP3352822B2 (ja) * 1994-07-15 2002-12-03 日本原子力研究所 カルボン酸の紫外光照射によるフッ素系高分子表面への有機官能基付与方法
EP0814116A1 (de) * 1996-06-19 1997-12-29 Hüls Aktiengesellschaft Hydrophile Beschichtung von Oberflächen polymerer Substrate
AU2003269873A1 (en) * 2002-05-13 2003-12-19 The Regents Of The University Of California Chemical modifications to polymer surfaces and the application of polymer grafting to biomaterials
KR100570952B1 (ko) * 2003-02-25 2006-04-13 시즈오까 다이가꾸쵸가 다이효스루 니혼고꾸 중합체의 제조 방법
JP4213577B2 (ja) * 2003-12-05 2009-01-21 独立行政法人科学技術振興機構 グラフト重合鎖固定基材、グラフト重合鎖固定基材の製造方法及び測定方法
JP4359544B2 (ja) * 2004-08-23 2009-11-04 富士フイルム株式会社 表面改質方法
JP2008104411A (ja) * 2006-10-26 2008-05-08 Fujifilm Corp 細胞培養用基板
KR20110007600A (ko) * 2008-01-30 2011-01-24 제론 코포레이션 세포배양 제품 및 스크리닝하는 방법
WO2009099539A2 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Corning Incorporated (meth)acrylate surfaces for cell culture, methods of making and using the surfaces
WO2010058848A1 (ja) * 2008-11-21 2010-05-27 日本メディカルマテリアル株式会社 グラフト重合方法およびその生成物
JP5349353B2 (ja) * 2010-01-28 2013-11-20 富士フイルム株式会社 重合体膜の形成方法及び積層フィルムの製造方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180005139A (ko) * 2016-07-05 2018-01-15 한국과학기술원 세포시트 제작방법 및 응용을 위한 고분자 박막 배양플레이트 제작방법 및 용도
WO2018008985A3 (ko) * 2016-07-05 2018-03-01 한국과학기술원 세포시트 제작방법 및 응용을 위한 고분자 박막 배양플레이트 제작방법 및 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN104603189A (zh) 2015-05-06
EP2867285A1 (en) 2015-05-06
SG11201408620SA (en) 2015-01-29
AU2013284282A1 (en) 2015-01-22
EP2867285A4 (en) 2016-03-30
US20150191693A1 (en) 2015-07-09
WO2014000052A1 (en) 2014-01-03
IL236474A0 (en) 2015-02-26
CA2877757A1 (en) 2014-01-03
JP2015527428A (ja) 2015-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150033697A (ko) 중합체성 표면의 개질 방법
Lee et al. Cell behaviour on polymer surfaces with different functional groups
Förch et al. Recent and expected roles of plasma‐polymerized films for biomedical applications
EP2135940B1 (en) Cell culture support and manufacture thereof
Babaei et al. Tuning the surface properties of oxygen-rich and nitrogen-rich plasma polymers: functional groups and surface charge
EP3000842A1 (en) Surface modification method and surface modification body
KR20110127168A (ko) 화학적으로 한정된 배지에서 세포 배양용 팽윤성 (메타)아크릴레이트 표면
JP2013500717A (ja) 細胞を培養するための合成マイクロキャリア
WO1993003139A1 (en) Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same
Akhavan et al. Substrate-regulated growth of plasma-polymerized films on carbide-forming metals
WO2010138486A1 (en) Substrates for adhering, culturing and assaying cells
Ibrahim et al. Atmospheric pressure dielectric barrier discharges for the deposition of organic plasma polymer coatings for biomedical application
EP3243862B1 (en) Surface modification method
Rühe et al. Tailoring of surfaces with ultrathin polymer films for survival and growth of neurons in culture
Yoshinari et al. Effect of cold plasma-surface modification on surface wettability and initial cell attachment
AU2013284282B2 (en) Process for modifying a polymeric surface
WO2019025207A1 (en) DEVICES FOR CULTURING CELLS COATED WITH A POLYETHYLENE GLYCOL METHACRYLATE COPOLYMER
JP2008178367A (ja) 胚様体形成用培養容器と、その製造方法、及び胚様体形成方法。
Lehmann et al. A new approach to biofunctionalisation and micropatterning of multi-well plates
JP2018009137A (ja) 重合体、コーティング組成物、および物品
Koegler et al. Controlling cell-material interactions using coatings with advanced polymer architectures
JP2019033742A (ja) 多能性幹細胞の培養基材及び多能性幹細胞の製造方法
JP2006280206A (ja) 細胞培養基材及び細胞培養方法
Wen-Juan et al. Amine-containing film deposited in pulsed dielectric barrier discharge at a high pressure and its cell adsorption behaviours
Yang et al. Photo-induced graft polymerization of acrylamide on polypropylene membrane surface in the presence of dibenzyl trithiocarbonate

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid