KR20150009952A - 알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체 - Google Patents

알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체 Download PDF

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주니어 로버트 앨런 굿나우
매튜 마이클 해밀턴
아그니에시카 코발치크
아치유타라오 시두리
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 하기 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00120

[식 중, R1, R2, 및 n 은 상세한 설명 및 특허청구범위에 정의되어 있음].
특히, 본 발명은 알파-V-베타-3 을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 알파-V-베타-3 인테그린 안타고니스트에 연결되는 접합 부분, 예컨대 소분자, 펩티드, 핵산, 형광성 부분 및 중합체의 제조 및 전달에 사용되기 위한 식 I 의 화합물에 관한 것이다.

Description

알파-V-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체 {INTEGRIN ANTAGONIST CONJUGATES FOR TARGETED DELIVERY TO CELLS EXPRESSING ALPHA-V-BETA-3}
본 발명은 화학적 반응을 위한 적절한 링커 및 관능기를 포함하는 강력하고 선택적인 소분자 인테그린 안타고니스트의 합성 및 접합되는 부분과 표적으로 하는 본체 사이에 공유 결합이 형성되도록 티올과 같은 반응성 친핵체를 포함하는 여타 분자와의 반응에 관한 것이다. 안타고니스트를 표적으로 하는 소분자는 αVß3 이량체에 대한 인테그린 유형 알파-V-베타-3 (αVß3) 수용체 안타고니스트와 같은 동족 수용체 시스템에 결합한다. 공유결합으로 연결되는 부분에는 소분자 치료제, 중합체, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 상기 siRNA 의 표적화된 전달을 가능하게 하는 수단으로서 5'-티오-siRNA 유도체의 형성을 위해 5'-티오-포함 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 그러한 유도체화된 siRNA 는 적절한 형질주입제와 함께 siRNA 의 그러한 인테그린 수용체를 발현하는 세포로의 선택적인 전달을 보조함으로써 RNA 개입 (RNAi) 을 통해 표적 유전자의 발현을 방해하게 된다.
인테그린 유형 αVß3 는 비트로넥틴에 대한 수용체이다 [Hermann, P. et al. "The vitronectin receptor and its associated CD47 molecule mediates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23" [The Journal of cell biology 144 (1999): 767-75]. 이는 2 개의 성분 인테그린 알파 V 및 인테그린 베타 3 (CD61) 으로 구성되고 혈소판 및 다른 세포 유형에 의해 발현된다. 에타라시주마브와 같은 αVß3 의 저해제가 혈관형성억제제로서 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
RNA 개입은 메신저 RNA (mRNA) 의 단백질로의 번역이 소형 개입 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 완전 또는 부분적 상보적 올리고뉴클레오티드의 회합 또는 결합에 의해 개입되는 널리 공지된 프로세스이다. siRNA 는 이중-가닥 RNA 분자로, 일반적으로 RISC (RNA-유도성 침묵 복합체) 로 공지되어 있는 세포질 내 일정 셋트의 단백질과 회합하는 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드의 범위인 것이다. RISC 는 궁극적으로 이중 가닥진 siRNA 를 분리하여, 1 개의 가닥이, mRNA 이 RISC 에 의해 붕괴되거나 또는 그렇지 않으면 번역되는 것을 막아, 결과적으로 인코딩되는 단백질 또는 유전자 산물의 발현을 억제하게 된 후 mRNA 의 상보적 또는 부분 상보적 부분과 결합 또는 회합하도록 한다.
(특히 인체 전신 투여를 위한) 치료 적용시 siRNA 와 같은 핵산을 이용함에 있어서 대두되는 문제점 중 하나는 핵산을 다음과 같은 목적지에 전달하는 것이다: (1) 특정한 표적 조직 또는 세포 유형, 및 (2) 상기 세포의 세포질 (예컨대, mRNA 가 존재하고 단백질로 번역되는 곳). 전달 문제 중 일부는 핵산이 음으로 하전되어 있으며 쉽게 분해되고 (특히, 개질되지 않은 경우), 신장에 의해 효율적으로 여과되고, 자체로는 세포의 세포질로 쉽게 수송될 수 없다는 사실에 근거한다. 따라서, 수많은 연구는 리포좀, 미셀, 펩티드, 중합체, 컨쥬게이트 및 압타머를 포함하는 다양한 담체 및 제형물을 이용해 그러한 전달 문제 해결에 집중해 왔다. 문헌 [Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)] 을 참조한다. 더욱 유망한 전달 비히클 중 일부는 지질 나노입자를 포함하는 지질계의 이용을 고려한 바 있다. 참고문헌은, [Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009); 국제 특허 출원 공보 WO 2010/042877, Hope et al ("Improved amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids"]. 그러나, siRNA 뿐만 아니라 여타 물질들, 예컨대 소분자, 펩티드, 여타 핵산, 형광 부분 및 중합체의 특정한 표적 세포 및 그러한 세포의 세포질에 대한 추가적인 표적화 개선은 여전히 필요하다.
본 발명은 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00001
식 I
[식 중, R1, R2 및 n 은 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 정의되어 있음]. 특히, 본 발명은 다양한 치료 또는 여타 적용을 위한 인테그린 αVß3 이량체를 발현하는 접합 부분, 예컨대 소분자, 펩티드, 핵산, 형광 부분 및 중합체의 전달 개선을 위한 식 I 의 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
도 1a): 표 1 은 특정한 5'-유도체화된 siRNA 단일 및 이중 가닥의 조성을 보여준다.
도 1b): 표 2 는 소분자 siRNA 접합체에 대한 분석 데이터를 보여준다.
도 1c): 표 3 는 인테그린 안타고니스트 검정 및 siRNA KD 데이터에서의 소분자-siRNA 접합체 효력을 보여준다.
도 1d): 표 4 는 FITC 이성질체 표지된 시약의 정체, 특징 및 결합 효력을 보여준다.
도 1e) 는 막대그래프를 보여준다 (적색 Duplex-27 500 nM 및 실시예 140 10 μM; 녹색 Duplex-27).
도 2 는 대표적인 siRNA 흡수 영상 (Duplex-27 (500 nM) 을 보여준다.
도 3 은 실시예 FITC-5 (LFA-1 안타고니스트-표지된 FITC) 를 10 μM 로 이용해 접합된 FITC 를 이용한 Jurkat 세포의 영상을 보여준다.
도 4 는 실시예 FITC-14 (VLA-4 안타고니스트-표지된 FITC) 를 10 μM 로 이용하여 접합된 FITC 를 이용한 Jurkat 세포의 영상을 보여준다. 막대그래프는 VLA-4 를 표적 구성원이 있는 iRNA 의 이중구조물 존재 하의 변동을 표시한다. VLA-4 안타고니스트 실시예 140 의 존재시, 그러한 변동이 제공된다.
도 5 는 인테그린을 표적으로 하는 소분자를 이용해 5'-센스 가닥 상에서 유도된 siRNA 이중구조물로 처리시 H1299 세포에서의 AHA1 발현 감소를 보여준다. y-축은 AHA1 의 실측 발현 수준을 나타낸다. 높이가 더 낮은 막대는 더 큰 넉-다운 정도를 표시하며 (더 높은 정도의 siRNA 형질주입); 더 높은 막대는 더 적은 넉-다운 정도를 나타낸다 (예컨대, 더 낮은 정도의 siRNA 형질주입). 청색의 이중구조물은 센스 가닥의 5' 말단에 표적 개질을 갖고 있으며; 핑크색의 것은 센스 가닥의 5' 말단의 표적 개질 뿐 아니라 안티센스 가닥의 5' 가닥에 결합되어 있는 Nu547 형광단을 갖고 있다.
도 6 는 세포 건강의 지표인 GAPDH mRNA 발현 수준을 보여준다. 유도체화된 siRNA 로 처리된 세포의 발현 수준 대 mock 및 미처리 세포의 발현 수준의 유사성은 처리 농도 및 기간에서 세포 독성의 결핍의 표지이다.
달리 언급되지 않으면, 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 사용된 하기 특정 용어 및 어구가 다음과 같이 정의된다:
용어 " 부분 (moiety)" 는 하나 이상의 화학적 결합에 의해 또다른 원자 또는 분자에 연결되어 분자의 일부분을 형성하는 원자 또는 기를 지칭한다. 예를 들어, 식 I 의 변수 R1 및 R2 는 표시된 공유 결합에 의해 식 I 에 제시된 구조에 결합되어 있는 부분을 지칭한다.
용어 "접합된 부분" 는 치료용의 또는 유용한 화합물, 펩티드, 중합체, 소분자, 형광 부분, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산인 부분을 지칭한다. 예시는 약물, 치료 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 를 포함한다.
달리 언급되지 않으면, 용어 "수소" 또는 "히드로" 는 수소 원자의 부분 (-H) 이며 H2 가 아닌 부분을 지칭한다.
용어 "할로겐" 은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도의 부분을 지칭한다.
용어 "알킬" 은 탄소수 1 내지 12 의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 특정 구현예에서, 알킬은 1 내지 7 개의 탄소 원자를 갖고, 더욱 구체적으로 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸을 포함한다.
용어 "TFA" 는 트리플루오로아세트산을 지칭한다.
달리 언급되지 않으면, 용어 "식의 화합물" 또는 "식의 화합물들" 은 해당 식으로 정해지는 화합물들의 군으로부터 선택되는 임의의 화합물을 의미한다 (달리 언급되지 않는 한, 임의의 그러한 화합물의 임의의 약학으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함).
용어 "약학으로 허용되는 염" 은 생물학적으로 또는 그 외로 바람직하지 않은, 유리된 염기 또는 유리된 산의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 있는 염을 지칭한다. 염은 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산 등, 바람직하게는 염산 및 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 살리실산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, N-아세틸시스테인 등을 이용해 형성될 수 있다. 추가로, 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리된 산에 첨가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염은, 이에 제한되지 않으나, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유도된 염은, 이에 제한되지 않으나, 1 차, 2 차 및 3 차 아민, 자연 발생 치환 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 에컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 라이신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 치환 패턴에 따라서는, 본 발명의 화합물은 쯔비터이온으로 존재할 수도 있다.
본 발명의 화합물은 약학으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 약학으로 허용되는 에스테르 (예컨대, 프로드러그로서 사용되는 식 I 의 산의 메틸 및 에틸 에스테르) 의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 가용화, 예컨대 수화될 수 있다. 가용화는 제조 프로세스의 과정에 영향을 줄 수 있거나, 또는 예컨대 식 I 의 애초 무수성인 화합물의 흡습 특성의 결과로 일어날 수 있다 (수화).
동일한 분자식을 갖고 있지만, 그들의 원자들의 결합 본성 또는 순서 또는 공간에서의 그들 원자들의 배치에 있어서 상이한 화합물들을 "이성질체" 로 언급한다. 공간에서의 그들의 원자들의 배치가 상이한 이성질체는 "입체이성질체" 로 지칭한다. 부분입체이성질체는 거울상이성질체가 아닌 하나 이상의 키랄 중심에 반대편 배치를 가진 입체이성질체이다. 서로 겹쳐지지 않는 거울상인 하나 이상의 비대칭 중심을 갖고 있는 입체이성질체는 "거울상이성질체" 로 지칭된다. 화합물이 비대칭 중심을 갖고 있을 때, 탄소 원자가 4 개의 상이한 기에 결합되어 있다면, 한 쌍의 거울상이성질체가 존재할 수 있다. 거울상이성질체가 그의 비대칭적 중심 또는 중심들의 절대적인 공간배치를 특징으로 할 수 있으며, Cahn, Ingold 및 Prelog 의 R- 및 S-배열 규칙에 따라, 또는 분자들이 편광 평면을 회전하는 바익에 따라 기술될 수 있으며, 우선성 또는 좌선성 (예컨대, 각각 (+) 또는 (-)-이성질체로) 기재된다. 키랄 화합물은 개별 거울상이성질체로서 또는 그들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 동등한 비율의 거울상이성질체의 혼합물을 "라세미 혼합물" 로 지칭한다.
용어 "치료 유효량" 은 치료할 대상체의 질환의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 또는 생존을 연장시키기에 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료 유효량의 결정은 당업자의 재량에 달려 있다. 본 발명에 따른 화합물의 치료 유효량 또는 투여량은 넓은 범위 내에서 가변적일 수 있고, 당업계에 공지된 방식으로 결정될 수 있다. 그러한 투여량은 투여할 특정한 화합물, 투여 경로, 치료할 상태 뿐만 아니라 치료할 환자를 포함하는 각 특정한 경우의 개별적인 필요조건에 맞춰질 것이다. 1 일 투여량은 단일 투여량으로 또는 분할 투여량으로, 또는 비경구 투여로 투여될 수 있고, 이는 연속 주입으로 제공될 수도 있다.
용어 "약학으로 허용되는 담체" 는 약학 투여에 맞는, 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 및 여타 물질 및 화합물을 포함하는, 약학 투여에 맞는 임의의 모든 물질을 포함하는 것을 의도로 한다. 임의의 통상적 매질 또는 시약이 활성 화합물과 맞지 않는 것이 아닌 한, 본 발명의 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
구체적으로는, 본 발명은 식 I 의 화합물 또는 그의 약학으로 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다:
Figure pct00002
[식 중, n 은 1 내지 24 이고:
R1 은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(1) 하기 식의 화합물:
Figure pct00003
(이때 m 은 0 또는 1 임);
(2) 하기 식의 화합물:
Figure pct00004
(이때 X 는 N 또는 CH 임);
(3) 하기 식의 화합물:
Figure pct00005
(4) 하기 식의 화합물:
Figure pct00006
; 및
(5) 하기 식의 화합물:
Figure pct00007
;
R2 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(1) 하기 식의 화합물:
Figure pct00008
(2) 하기 식의 화합물:
Figure pct00009
(3) 하기 식의 화합물:
Figure pct00010
및
(4) 하기 식의 화합물:
Figure pct00011
식 중, R3 는 접합된 부분이고, X 는 황 또는 하기 식의 화합물을 나타냄:
Figure pct00012
].
상기 구조에 사용된 바와 같이, 기호
Figure pct00013
는 구조체 또는 부분이 공유 결합에 의해 베이스 분자에 결합되어 있는 위치를 나타내기 위해 이용된다. 추가로, 어구 "PEG 로" 또는 "S 로" 또는 상기 기호와 조합하여 사용된 유사한 용어들은 해당 구조 또는 부분이 여러 결합 지점이 있는 경우 염기 분자에 결합하는 위치 또는 방식을 표시한다. 예를 들어, R2 가 하기 식의 화합물인 경우:
Figure pct00014
[식 중, X 는 하기 식의 화합물임:
Figure pct00015
],
식 I 을 기초로 한 구조는 다음과 같다:
Figure pct00016
[식 중, R1, R3 및 n 은 식 I 에서 정의된 바와 같음].
본 발명은 또한 식 I 의 화합물의 제조 방법 및 사용 방법 뿐만 아니라 상기 화합물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 식 I 의 화합물은 소분자, 단백질, 핵산, 중합체, 형광 마커 및 여타 물질의 αVß3 수용체를 발현하는 표적 세포에 대한 전달을 개선함에 있어 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명은 RNA 개입을 통해 특정 표적 단백질의 발현을 억제하는 siRNA 를 αVß3 수용체를 발현하는 표적 세포의 세포질에 전달함에 있어 유용한 식 I 의 화합물을 함유하는 조성물 및 제형물에 관한 것이다.
더욱 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 siRNA 와 같은 핵산의 αVß3 수용체를 발현하는 종양 세포 및 여타 세포 유형들에 대한 전달을 촉진하는 제형물을 위한 식 I 의 화합물의 용도에 관한 것이다. 나아가, 암과 같은 증식 장애 및 염증 치료를 위한 전달 제형물을 합성하기 위한 식 I 의 화합물의 용도가 또한 본 발명의 일부분이다.
R1 은 식 I 의 화합물이 인테그린 수용체 복합체를 표적으로 하도록 하여, 그들의 그러한 수용체를 발현하는 세포에 대한 전달을 촉진하는 소분자 인테그린 안타고니스트를 나타낸다.
특정한 구현예에 있어서, R1 의 부분을 표적으로 하는 소분자 인테그린 안타고니스트는 소분자의 인테그린 수용체에 대한 결합 친화성이 유리된 소분자 인테그린 안타고니스트보다 실질적으로 감소되지 않도록 하는 위치에 결합되어 있다. 식 I 의 R1 부분은 αVß3 인테그린 이량체를 표적으로 한다.
특정 구현예에서, R1 은 하기 식의 부분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 표적으로 하는 αVß3 인테그린이다:
Figure pct00017
(식 중, m 은 0 또는 1 임).
다른 구현예에 있어서, R1 은 하기 식의 부분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 표적으로 하는 αVß3 인테그린이다:
Figure pct00018
(식 중, X 는 N 또는 CH 임).
다른 구현예에 있어서, R1 은 하기 식의 부분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 표적으로 하는 αVß3 인테그린이다:
Figure pct00019
.
다른 구현예에 있어서, R1 은 하기 식의 부분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 표적으로 하는 αVß3 인테그린이다:
Figure pct00020
.
다른 구현예에 있어서, R1 은 하기 식의 부분 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르를 표적으로 하는 αVß3 인테그린이다:
Figure pct00021
.
R2 는 티올-포함 분자와 같이 강력한 친핵성을 가진 치료제 또는 여타 유용한 화합물 또는 접합된 부분과 공유결합성 연결을 형성할 수 있는 반응성 부분을 나타낼 수 있다. 그러한 반응성 부분의 예시는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분을 포함한다:
Figure pct00022
.
대안적으로, R2 는 치료제 또는 여타 유용한 화합물, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드 (R3) 과 같은 접합된 부분에 이미 결합되어 있는 부분을 나타낼 수 있다. 더 구체적으로, R2 는 하기 식의 부분을 나타낼 수 있다:
Figure pct00023
[식 중, R3 는 접합된 부분이고, X 는 황 또는 하기 식의 화합물을 나타낸다:
Figure pct00024
.
특정 구현예에 있어서, R3 은 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 더욱 특정한 구현예에 있어서, R3 은 siRNA 분자와 같은 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 존재할 수 있는 RNA 분자의 센스 가닥의 5'-말단을 나타낸다. RNAi 시약으로도 공지되어 있는 그러한 siRNA 분자는 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제한다. 특정 구현예에 있어서, R3 은 본질적으로 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 올리고리보뉴클레오티드 가닥으로 이루어진 siRNA 분자인데, 여기서 센스 올리고리보뉴클레오티드 가닥의 5' 말단은 상기 구조에 제시된 바와 같이 R2 에 커플링되어 있고, 표적 유전자에 해당하는 mRNA 의 적어도 일부분에 상보적이다. 다른 구현예에서, R3 는 그의 5'-말단에 결합되어 있는 DNA 의 올리고뉴클레오티드이다. 그러한 유도체화된 DNA 는 단일 가닥으로서 또는 또다른 올리고뉴클레오티드의 상보적 가닥과 혼성화되어 있는 1 개 가닥으로서 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 가닥은 개질되어 있지 않거나 또는 대사 안정성을 위해 개질될 수 있다. 그러한 개질에는, 이에 제한되지 않으나, 포스페이트 (예를 들어, 포스포로티오에이트) 및 2' 히드록시 (예를 들어, 2'-O-메틸 및 2'-플루오로) 에서의 특정 위치에서의 치환기를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 식 I 의 R2 는 -X-S-CH2-R3 를 나타내고, 여기서 R3 은 식 5 에서 하기 제시되는 바와 같은 RNA 의 센스 가닥을 포함한다 (식 I 을 바탕으로 함):
Figure pct00025
식5
[식 중, R1, n 및 X 는 식 I 에서와 같이 정의됨].
또다른 한가지 특정 구현예에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 결합되어 있을 수 있다.
또다른 특정 구현예에 있어서, R2 는 -X-S-CH2-R3 를 나타내고, 여기서 R3 은 소분자 또는 단백질을 나타내고, 이로써 공유결합으로 결합되어 있는 구체적으로 식 I 의 표적화되는 본체를 형성하게 된다.
더욱 특정한 구현예에 있어서, R2 는 -X-S-CH2-R3 를 나타내고, 여기서 R3 은 치료제 소분자 또는 단백질을 나타낸다.
더욱 특정한 구현예에 있어서, R2 는 -X-S-CH2-R3 를 나타내고, 여기서 R3 는 세포 현미경 기법을 이용해 그러한 인테그린 수용체 결합을 가시화하는데 유용한 형광 부분을 나타낸다.
또다른 특정 구현예에 있어서, R2 는 -X-S-CH2-R3 를 나타내고, 여기서 R3 는 1 차 반응성 설파이드가 있는 중합체를 나타낸다. 더 구체적으로, R3 는 착물형성 및 세포 표면 및 세포의 세포질 도메인에 대한 siRNA 의 전달에 유용한 양이온성 중합체를 나타낼 수 있다.
더욱 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 R3 이 하기 제시되는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 의 구조 이성질체 중 하나인 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00026
.
더욱 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 R3 가 하기 제시된 구조 이성질체 FITC-14 중 하나인 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00027
다른 구현예에서, 본 발명은 n 가 9 내지 13, 바람직하게는 12 인 식 I 의 화합물에 관한 것이다.
더 구체적인 구현예에서, 본 발명은 하기 화합물 (또는 그의 약학으로 허용되는 염 또는 에스테르) 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 식 I 의 화합물에 관한 것이다:
αVβ3 리간드 시약 1: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 2: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 3: (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-[구아니디노]-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 트리플루오로아세테이트 염;
αVβ3 리간드 시약 4: (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 5: (S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]메틸]페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질우레이도)티아졸-4-카르보닐]아미노]아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 6: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 7: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]에톡시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 8 : (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-아세틸술파닐-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산;
αVβ3 리간드 시약 9: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐- 에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-페닐-3-일-프로피온산;
αVβ3 리간드 시약 10: 3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-페닐-3-일-프로피온산;
αVβ3 리간드 시약 11: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐- 에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-3-피리딘-3-일-프로피온산;
αVβ3 리간드 시약 12: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-3-피리딘-3-일-프로피온산.
추가로, 본 발명은 siRNA 와의 조합시 나노입자 제조를 위한 식 I 의 화합물를 함유하는 신규한 조성물 및 제형물로서, 결과물로 siRNA 와 같은 핵산의 αVß3 이량체를 발현하는 표적 세포의 세포질로의 전달 개선을 제공하게 되는 조성물 및 제형물에 관한 것이다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 하기를 함유하는 siRNA 제형물에 관한 것이다: (1) R2 가 5'-siRNA 올리고뉴클레오티드인 식 I 의 화합물; 및 (2)다가양이온성 형질주입제.
본 발명은 또한 상기 화합물 및 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 식 I 의 화합물의 화합물은 약물, 핵산 또는 여타 치료 화합물의 αVß3 이량체를 발현하는 조직 또는 세포로의 전달을 개선하는 조성물 또는 제형물의 구성성분으로 유용하다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 RNA 개입을 통해 특정 단백질의 발현을 억제하는 αVß3 이량체 표적 세포의 세포질로의 siRNA전달에 유용한 식 I 의 화합물을 포함하는 제형물에 관한 것이다. 더욱 특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 암 또는 염증 질환의 치료를 위해 종양 세포 및 αVß3 이량체를 발현하는 여타 세포 유형에 siRNA 를 유효하게 전달할 수 있는 식 I 의 화합물 및 그러한 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 그러한 화합물 및 조성물은 더욱 효능이 있으며, 식 I 의 화합물이 없는 유사 제형물에 비해 개선된 넉다운 능력을 보여준다.
본 발명의 화합물의 일반적인 합성
식 I 의 화합물을 합성하는 적합한 공정이 실시예에 제공되어 있다. 일반적으로, 식 I 의 화합물은 하기 제시된 반응식에 따라 제조될 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 하기 반응식에서 변수 n 및 R1 및 R2 는 식 I 의 맥락에서 상기에서 정의된 것과 같이 정의된다.
말레이미드-(PEG)n-인테그린 안타고니스트 접합화제의 일반적 합성
다양한 길이의 PEG 의 반응식 1 에서의 26 과 같은 화합물은 시판하여 입수가능하다 (예를 들어, Pierce BioScience 사에서 판매). 그러한 화합물들은 또한 아미드 결합 형성 조건 하에 PEG 아미노산의 아미노 말단을 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피온산을 이용해 아실화한 후, 에스테르 형성 조건 하에 N-히드록시 숙신산의 반응에 의해 반응성 N-히드록시숙신 에스테르를 형성하여 제조될 수 있다. 반응식 1 에 제시된 바와 같이, 26 의 화합물을 27 과 같은 1 차 또는 2 차 아민을 포함하는 화합물을 반응시키는 것은 실온에서 DIEA (디이소프로필에틸아민) 과 같은 염기성 아민의 존재 하에 비양자성 또는 양자성 용매에서 실시하여 28 의 PEG화 중간체를 제공하게 된다.
Figure pct00028
반응식 1
R4 가 티오아세틸 또는 2-디티오피리딜이고, 다양한 길이의 PEG 부분을 갖고 있는 반응식 2 에서의 29 과 같은 화합물은 시판하여 입수가능하다 (예를 들어, Pierce BioScience 사에서 입수). 29 의 구조를 갖고 있는 화합물의 1 차 또는 2 차 아민을 포함하는 화합물, 예컨대 27 과의 반응은 실온에서 염기성 아민, 예컨대 DIEA (디이소프로필에틸아민) 의 존재 하에 비양자성 또는 양자성 용매에서 실시되어 30 의 PEG 화 중간체를 생성하게 된다.
Figure pct00029
반응식 2
본 발명에 때한 구체적인 비제한적 예시로서, 중간체 26 을 반응식 3 에 제시된 바와 같이 31 과 반응시켜 말레이미드 중간체 32 를 제공한다:
Figure pct00030
반응식 3
유사한 방식으로, 반응식 4 에 제시된 바와 같이 중간체 26 는 33 와 반응시켜 말레이미드 중간체 34 를 제공할 수 있다:
Figure pct00031
반응식 4
유사한 방식으로, 반응식 5 에 제시된 바와 같이 중간체 29 를 35 와 반응시켜 R4 가 티오아세틸 또는 2-디티오피리딜을 나타내는 중간체 36 를 제공할 수 있다:
Figure pct00032
반응식 5
유사한 방식으로, 반응식 6 에 제시된 바와 같이 중간체 29 를 37 과 반응시켜 R4 가 티오아세틸 또는 2-디티오피리딜을 나타내는 중간체 38 를 제공할 수 있다:
Figure pct00033
반응식 6
일반식 26 또는 29 의 화합물에 대해, 당분야에서 상이한 PEG 길이의 것을 입수할 수 있거나 또는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다; 바람직하게는 n = 8-24. 그러한 주제는 폭넓게 보고되고 검토된 바 있다 (예를 들어, Chemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476).
중간체 31 은 반응식 7 에 제시된 바와 같이 기 보고된 것과 유사한 방식으로 합성될 수 있다 (예를 들어, Sidduri, A. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478):
Figure pct00034
반응식 7
구체적으로, 반응식 7 에 제시된 바와 같이, 중간체 41 은 시판하여 입수가능한 (S)-3-[4-니트로페닐]-2-tert-부톡시카르보닐아미노-프로피온산 40 으로부터 제공되었다. 메탄올 용액 중의 시판하여 입수가능한 출발 물질 40 의 니트로기를 암모늄 클로라이드의 존재 하에 실온에서 수시간 동안 아연 더스트로 환원시켜 아닐린 41 을 제공하게 된다. 니트로 환원을 위한 여타 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 아닐린 41 은 디이소프로필-에틸 아민과 같은 염기의 존재 하에 실온에서 비양자성 용매, 예컨대 디클로로메탄 중의 벤조일 할라이드 유도체, 예컨대 2,6-디클로로벤조일 클로라이드 42 를 이용해 아실화되었다. 그러한 방식으로, 아미드 43 이 형성되었다. t-부틸카르보닐 (Boc) 아민 보호기는 당업자에게 공지된 표준 방법, 예컨대 실온에서 디옥산 중의 HCl 용액을 이용한 처리로 제거되어; 히드로클로라이드 44 를 제공하게 되었다. 히드로클로라이드 44 를 공지된 1-(2-아지도에틸)-시클로펜탄카르복실산 45 의 존재 하에 아미드 결합 형성 조건 (당업자에게 널리 공지되어 있음) 으로 처리하여, 그 결과로서 디아미드 46 를 제공하게 되었다. 중간체 46 의 아지드기는 실온에서 테트라히드로푸란과 같은 비양자성 용매 중의 트리알킬 포스핀을 이용한 처리에 의해 환원되었다. 나아가, 메틸 에스테르는 상승된 온도, 예컨대 50℃ 에서 15 시간 동안 에탄올 및 테트라히드로푸란과 같은 용매 혼합물에서 나트륨 히드록시드로 처리하여 비누화했다. 상기 공정은 쯔비터 이온으로서 제시될 수도 있는 중간체 31 의 형성을 제공했다.
PEG 부분의 결합은 또한 반응식 8 에 제시된 바와 같이 합성되어진 중간체 39 를 이용하여 실시가능하다. 구체적으로, 3,5-디클로로페놀 47 은 염기, DMF 와 같은 극성 비양자성 용매 중의 염기, 예컨대 이미다졸의 존재 하에 트리이소프로필실릴클로라이드를 이용하여 탈보호된 후, 저온, 예컨대 -78℃ 에서 무수 테트라히드로푸란 중의 강한 염기, 예컨대 부틸 리튬을 이용해 반응시켰다. 결과로서 수득한 리튬 착물을 드라이 아이스의 형태로 첨가된 이산화탄소를 이용해 켄칭하여, 중간체 48, 벤조산 유도체를 제공하게 되었다. 이어서, 중간체 48 을 비양자성 용매, 예컨대 톨루엔과 술포닐 클로라이드 (SOCl2) 로 처리하여 염소화시켜 아실 클로라이드를 형성하게 된다. 이어서, 상기 시점에, 아실 클로라이드를 비양자성 용매, 예컨대 디클로로메탄 (DCM) 중의 염기, 예컨대 디이소프로필에틸 아민 (DIPEA) 의 존재 하에 히드로클로라이드 49 와 반응시킴으로써, 중간체 50 를 형성한다. 중간체 50 의 실릴 보호기를 실온에서 비양자성 용매, 예컨대 테트라히드로푸란 중의 테트라부틸 암모늄 플루오라이드 (TBAF) 를 이용한 처리로 제거한다. 상기 페놀 중간체를 비양자성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 (DMF) 중의 염기, 예컨대 칼륨 카르보네이트 (K2CO3) 의 존재 하에 3-N-t-부틸-카르보메이트-1-브로모프로판과 반응시킨다. 그러한 방식으로, 중간체 52 는 트리플루오로아세트산 (TFA) 을 이용한 탈보호화로 형성되며, 비양자성 용매, 예컨대 에탄올 중의 나트륨 히드록시드와 같은 염기를 이용한 후속 가수분해로 중간체 39 가 형성된다:
Figure pct00035
반응식 8
αVß3-1 안타고니스트 유도체화제의 합성
중간체 117 (αVß3 표적화 모듈) 는 하기 반응식 15 에서 나타낸 바와 같이 합성될 수 있다. 간단히 하면, 메타아미노벤조산 110 을 수은 아세테이트의 존재 하에서 DMF, 디클로로메탄, 및 피리딘 중에서 N,N-디-Boc-메틸티오우레아 111 과 반응시킨다. 이 시점에서, 벤질 에스테르 보호된 글리신을 표준 펩티드 형성 조건 하에서 상기 반응의 생성물인 카르복실산에 커플링시킨다. 수소화 분해 조건으로 벤질 에스테르를 제거하여, 유리 산 112 를 제공하였다. 별도 반응 순서로, 파라니트로페놀 113 은 비양성자성 용매 예컨대 테트라히드로푸란 중에서 트리페닐 포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트의 존재 하에서 (2-히드록시-에틸)카르밤산 tert-부틸 에스테르와 커플링시킨다. 이러한 생성물의 니트로 기는 상응하는 아닐린 114 로 환원되며, N-α-Fmoc-L-아스파르트산 β-tert-부틸 에스테르로의 아미드 결합 형성 조건 하에서 이에 커플링된다. 피페리딘을 이용한 처리에 의해 아미노 보호기 Fmoc 의 제거 후, 아미노 말단은 표준 아미드 결합 조건 하에서 다시 중간체 115 에 커플링되어 중간체 116 를 형성한다. 강산, 예컨대 트리플루오로아세트산으로 처리 시, 중간체 117 이 형성되고 당업자에게 익히 공지된 정제 방법에 의해 단리된다 (예를 들어 제조용 HPLC).
Figure pct00036
반응식 15
반응식 15 에 나타낸 바와 유사한 방식으로, (2-히드록시에틸)카르밤산 tert-부틸 에스테르 대신 (3-브로모프로필)카르밤산 tert-부틸 에스테르를 사용하여, 3-탄소 사슬 아민 유사체 117 를 제조할 수 있다.
다른 αVß3 표적화 모듈은 하기 반응식 6 에서 나타낸 바와 같이 합성될 수 있다. 2-아미노-티아졸-4-카르복실산 메틸 에스테르 120 가 보고되어 있다 (Amide derivatives 및 their preparation and use as pesticides, By Kobayashi, Yumi; Daido, Hidenori; Katsuta, Hiroyuki; Nomura, Michikazu; Tsukada, Hidetaka; Hirabayashi, Atsushi; Takahashi, Yusuke; Aoki, Yoji; Kawahara, Atsuko; Fukazawa, Yasuaki; et al US Pat. Appl. Publ. (2011), US 20110201687 A1 20110818). 중간체 120 는 표준 아미드 결합 형성 조건 하에서 알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드 121 과 반응하여 에스테르 중간체 122 를 생성한다. 별도로, tert-부틸 3-(2-(아미노메틸)페녹시)프로필카르바메이트 129 는 염기 예컨대 탄산칼륨의 존재 하에서 비양성자성 용매 예컨대 DMF 중에서 N-(2-히드록시벤질)아세트아미드 127 와 tert-부틸 3-브로모프로필카르바메이트 124 와의 반응에 의해 생성된다. 중간체 129 의 아미노 기는 히드라진 히드레이트를 이용한 처리에 의해 드러난다. 유리 아민 130 의 생성은 트리포스겐을 이용하여 처리되어 이소시아네이트 131 를 생성하고, 이는 비양성자성 용매 예컨대 DMF 중에서 [(2-아미노-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 메틸 에스테르 132 과 결합되어 중간체 133 를 생성한다. 중간체 133 의 메틸 에스테르의 변형은 표준 비누화 조건 하에서, 이어서 표준 아미드 결합 형성 반응 조건 하에서 시판 메틸 3-아미노-3-페닐프로파노에이트 히드로클로라이드 146 또는 메틸 3-아미노-3-(3-피리딜)프로파노에이트 히드로클로라이드 147 및 148 의 순수 거울상 이성질체의 거플링에 의해 달성되어, 중간체 135 를 형성한다. Boc 보호기는 소분자 136 을 표적으로 하여 αVß3 을 형성하기 위한 표준 조건 하에서 제거된다.
하기 예에 대한 반응식 16: αVβ3 리간드 시약 9, αVβ3 리간드 시약 10, αVβ3 리간드 시약 11, 및 αVβ3 리간드 시약 12:
Figure pct00037
Figure pct00038
반응식 16
용도
식 I 의 화합물은 다양한 치료 및 여타 적용을 위해 αVß3 인테그린 수용체 복합체를 발현하는 세포를 표적으로 하는 치료제, 소분자, 펩티드, 핵산, 형광 부분, 및 중합체와 같은 접합된 부분 전달에 유용하다. 따라서, 식 I 의 화합물은 αVß3-1 의 발현 또는 과발현과 연관된 다양한 질환 및 상태의 치료에 이용될 수 있다. 그러한 질환 및 상태는 염증, 암 및 대사 관련 질환을 포함할 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에서의 포유류 (바람직하게는 인간) 에서의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 방법은 치료유효량의 식 I 의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 조성물은 양호한 의학적 실시에 따르는 방식으로 투여될 수 있다. 그러한 맥락에서 고려되는 요인에는, 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의약 실무자에게 공지된 여타 요인들이 포함된다. 투여되는 화합물의 "유효량" 은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방 (예를 들어, 표적 단백질의 발현을 억제) 하면서 부적합한 독성을 피할 최소량으로 정해질 것이다. 예를 들어, 그러한 양은 정상적인 세포 또는 포유류 전신에 독성이 되는 양 미만일 수 있다. 본 발명의 식 I 의 화합물을 함유하는 조성물은 비경구적으로, 복강내로, 폐내 투여로 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 이들이 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.
시약은 Aldrich, Sigma, 및 Pierce BioScience 또는 하기 표기된 기타 공급사에서 구입했고, 추가 정제없이 사용했다. 수밀리그램 내지 수 그램 단위의 정제는 실리카 겔 플래쉬 컬럼의 용출과 같은 당업자에게 공지된 방법으로 실시했다. 조제용 플래쉬 컬럼 정제는 또한 일부의 경우 CombiFlash system 을 이용해 용출하는 1 회용의 미리-팩킹된 수 그램의 실리카 겔 컬럼 (RediSep) 을 이용하여 실시했다. BiotageTM 및 ISCOTM 이 또한 중간체의 정제를 위해 본 발명에 사용할 수 있는 플래쉬 컬럼 장치이다.
화합물의 정체 및 순도를 판단하기 위한 목적으로, LC/MS (액체 크로마토그래피/질량 분광학) 을 하기 시스템을 이용해 기록했다. 질량 스펙트럼 측정을 위해서는, 시스템은 Micromass Platform II spectrometer: 양극 모드의 ES Ionization (질량 범위: 150 내지 1200 amu) 로 이루어져 있다. 동시적인 크로마토그래피 분리는 하기 HPLC 시스템을 이용해 실시되었다: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å (3.2 x 30mm) 컬럼 카트리지; Mobile Phase A: Water (0.02% TFA) 및 상 B: 아세토니트릴 (0.02% TFA); 3 분 내에 구배 10% B 에서 90% B 로; 평형화 시간은 1 분; 유속은 2 mL/분. 일부의 경우, 20 밀리몰 농도의 암모늄 아세테이트를 조제용 HPLC 동안의 유효한 이온화를 위한 개질제로서 이용했다. 상기의 경우, 암모늄 염을 분리했다.
일부 분리에서, 초임계 유체 크로마토그래피가 유용할 수 있다. 초임계 유체 크로마토그래피 분리는 하기의 일반적인 조건을 이용한 Mettler-Toledo Minigram 시스템을 이용해 실시되었다: 100 bar, 30℃ 에서 초임계 유체 CO2 중 40% MeOH 를 이용해 2.0 mL/min 로 용출시키는 12 mm AD 컬럼. 염기성 아미노기가 있는 분석제의 경우, 0.2% 이소프로필 아민을 메탄올 개질제에 첨가했다.
화합물들은 Varian Inova 400 MHz NMR Spectrometer 또는 Varian Mercury 300 MHz NMR Spectrometer 을 이용하는 1H-NMR 뿐만 아니라, Bruker Apex-II 고해상도 4.7T FT-Mass Spectrometer 를 이용하여 고해상도 질량 분광계에 의해 특징분석했다. 최종 화합물들은 또한 Thermo Electron 사에서 판매하는 LTQ CL Orbitrap 를 이용하는 고해상도 질량 분광계로 특징분석했다.
본원에 사용된 약어는 다음과 같다:
AIBN 2,2'-아조비스이소부티로니트릴
Bu 부틸
DCE 1,2-디클로로에탄
DCM 디클로로메탄
DBU 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔
DIAD 디이소프로필 아조디카르복실레이트
DIEA 디에틸아민
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸술폭시드
EDC-HCl 1-에틸-3-(3-디메틸l아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에틸 알코올
FCC 플래쉬 컬럼 크로마토그래피
h 시간
HBTU O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트
HOBt 히드록시벤조트리아졸
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
HRMS 고해상도 질량 스펙트럼
LRMS 저해상도 질량 스펙트럼
LC 액체 크로마토그래피
L-Pro L-프롤린
MCPBA 메타-클로로퍼옥시벤조산
MeOH 메틸 알코올
MW 마이크로파
NIS N-요오도숙신이미드
NBS N-브로모숙신이미드
NMP 1-메틸-2-피롤리디논
PdCl2(dppf) [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센] 디클로로팔라듐(II)
PEGn 폴리에틸렌 글리콜 n 회 반복체 (예를 들어, PEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG 보호기
PyBroP 브로모-트리스피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트
rt 실온
TBAF 테트라부틸암모늄 플루오라이드
TBDMS tert-부틸-디메틸실릴
TBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트
TMS 트리메틸실릴
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라히드로푸란
TLC 박막 크로마토그래피
TPP 트리페닐포스핀
αVβ3 를 표적으로 하는 화합물의 합성
실시예 1
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 1
Figure pct00039
단계 1: 3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)-벤조산의 제조:
Figure pct00040
무수 디메틸-포름아미드 (600 mL) 및 무수 1,2-디클로로에탄 (600 mL) 의 혼합물 중 3-아미노벤조산 (82.3 g, 0.60 mole), N,N'-비스(tert-부톡시카르보닐)-S-메틸이소티오우레아 (1,3-디-boc-2-메틸이소티오우레아, CAS # 107819-90-9) (174.2 g, 0.6 mole), 및 피리딘 (94.92 g, 97 mL, 1.20 mole, 2.0 당량) 의 용액을 수은 아세테이트 (95.6 g, 0.30 mole, 0.5 당량) 로 처리하고 오버헤드 기계적 교반기로 5 h 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 고체를 여과시키고, 디클로로메탄로 세척하고 여과액을 결합하고 세척액을 증발시켜 미정제 생성물 (~307 g) 을 수득하였다. 이러한 미정제 물질에 메탄올 (240 mL) 을 첨가하고 혼합물을 2 h 동안 강하게 교반하였다. 이어서, 2400 mL 의 물을 강하게 교반하면서 천천히 첨가하였다. 필터, 고체를 물로 철저히 세척하고 밤새 흡인 건조시켜 3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)-벤조산을 이론치의 수율 초과로 수득하였다. 고 진공 하에서 펌핑 건조시켰다.
수득된 중량은 이론값을 초과하였다 (이론값 = 227.6 g, 실제값 = 251.2 g 1H NMR 은 ~10% 의 DMF 존재를 나타냄).
단계 2: 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산 벤질 에스테르의 제조:
Figure pct00041
무수 테트라히드로푸란 (1600 mL) 중 3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조산 (171.56 g, 0.4073 mole), 2-클로로-4,6-디메톡시-트리아진 (71.52 g, 0.4073 mole), 및 N-메틸모폴린 (41.2 g, 44.78 mL,0.4073 mole) 의 연한 갈색 용액을 2 h 동안 실온에서 교반하고 (오버헤드 기계적 교반기) 및 이어서 글리신 벤질에스테르 p-TsOH 염 (137.44 g, 0.4073 mole) 및 2 당량의N-메틸모폴린 (41.2 g, 44.78 mL,0.4073 mole) 을 첨가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 36 h 동안 교반하였다. 이어서, 테트라히드로푸란 회전 증발기 상에서 제거하고 에틸 아세테이트 (2000 mL) 를 이어서 첨가하였다. 생성 혼합물을 빙냉 0.5 N HCl (3 x 1000 mL), 물 (1 x 1000 mL), 5% 수성 탄산 나트륨 (1 x 1000 mL), 물 (1 x 1000 mL), 포화 수성 염화 나트륨 (1 x 1000 mL) 으로 연속적으로 세척하고 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 고체를 여과시키고, 및 용매를 증발시켜 미정제 생성물 (228.5 g) 오일로서 수득하였다. 미정제 물질을 디클로로메탄: 헥산: 에틸 아세테이트 (40:45:15 의 비율) 를 용리제로서 사용하여 Waters Prep500 (10 회 운행) 상에서 크로마토그래피 정제하여, 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산 벤질 에스테르 (79.3 % 수율) 를 수득하였다. (주석: 제 1 운행에서 152 g 의 세정 물질 및 33 g 의 약간의 불순물 (이는 제 2 운행에서 재크로마토그래피함) 을 수득하였다). ES(+)-HRMS m/e C27H34N4O7 (M+H)+ 에 대한 계산치 527.2500, 측정치. 527.2499.
단계 3: 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산의 제조
Figure pct00042
무수 에탄올 (2000 mL) 중 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산 벤질 에스테르 (170.0 g, 0.323 mole) 의 용액을 고압 시설에서 실온에서 60 psi 에서 밤새 (18 h) 탄소 상의 10% Pd (20 g 습윤 촉매, 이는 ~ 50 % 물을 함유함) 상에서 수소화시켰다. 촉매를 여과시키고, 용매를 증발시켜 생성물을 수득하였다. 생성물을 톨루엔 (3 회) 으로 공비화하여 모든 에탄올을 제거하여, 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산 (97.88% 수율) 을 백색 고체로서 수득하였다. ES(+)-HRMS m/e C20H28N4O7 (M+H)+ 에 대한 계산치 437.2031, 관찰치. 437.2030.
단계 4: [3-(4-니트로-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00043
무수 THF (40 mL) 중 (3-히드록시-프로필)-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (7.03 g, 40.1 mmol) 의 용액에 4-니트로페놀 (5.07 g, 36.5 mmol), 트리페닐포스핀 (10.5 g, 40.1 mmol) 을 실온에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 생성 용액을 빙수욕을 이용해 ~0 ℃ 로 냉각시키고 이어서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 8.1 g, 40.1 mmol) 를 15-20 분 동안 적가하였다. 첨가 후, 용액을 실온으로 가온시키고 LCMS 분석이 16% 의 출발 물질의 존재를 나타내는 시점에서 15 h 동안 교반하였다. 이어서, 모든 상기 시약의 추가 0.1 당량을 첨가하고 반응 혼합물을 추가 15 h 동안 교반하였다. 고체를 여과시키고 에틸 아세테이트로 세척하고 이어서 여과액을 포화 염화 나트륨 용액으로 세척하고 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축시키고, 미정제 잔사를 ISCO (340 g) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제시켜 [3-(4-니트로-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (64% 수율) 를 백색 고체로서 수득하였다. ES(+)-HRMS m/e C14H20N2O5 (M+Na)+ 에 대한 계산치 319.1264, 관찰치. 319.1266.
단계 5: [3-(4-아미노-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00044
메탄올 (200 mL, 출발 물질을 용해시키기 위해 가열됨) 중 [3-(4-니트로-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (7.7 g, 26 mmol) 용액에 물 (10 mL), 염화 암모늄 (20.9 g, 390 mmol, 15 당량), 및 아연 가루 (16.4 g, 260 mmol, 10 당량, 3-부분) 을 실온에서 첨가하였다. 아연 가루 첨가 후, 반응 혼합물은 발열성이고 반응 혼합물의 TLC 분석이 출발 물질의 부재를 나타내는 시점에서 반응 혼합물을 1-2 h 동안 교반하였다. 이어서, 고체를 여과시키고 물 및 에틸 아세테이트로 세척하고 여과액으로부터의 유기 화합물을 에틸 아세테이트 (3 x 100 mL) 로 추출하였다. 결합된 추출물을 염소 용액으로 세척하고 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축으로 미정제 잔사를 제공하고 이를 ISCO (330 g) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여, [3-(4-아미노-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (79% 수율) 를 백색 고체로서 단리하였다. ES(+)-HRMS m/e C14H22N2O3 (M+Na)+ 에 대한 계산치 289.1522, 관찰치. 289.1523.
단계 6: (S)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00045
DMF (40 mL) 중 [3-(4-아미노-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (5.41 g, 20.2 mmol) 및 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-숙신산 tert-부틸 에스테르의 용액에 HOBT (3 g, 22.2 mmol), 및 DIPEA (8.52 g, 66.6 mmol) 를 실온에서 첨가하였다. 생성 용액을 빙욕을 이용해 0 ℃ 로 냉각하고 고체 HBTU (8.43 g, 22.2 mmol) 를 5-10 분 기간 동안 3 부분으로 첨가하였다. 첨가 후, 냉각욕을 제거하고 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 LCMS 분석이 출발 물질의 부재를 나타내는 시점에서 2.5 h 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (400 mL) 로 희석하고 물 (400 ml), 포화 중탄산 나트륨 용액 (400 mL), 및 염수 용액 (400 mL) 으로 세척하였다. 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축시키고 미정제 잔사를 ISCO (330 g) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여, (S)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (95% 수율) 를 백색 고체로서 단리시켰다. ES(+)-HRMS m/e C37H45N3O8 (M+Na)+ 에 대한 계산치 682.3099, 관찰치. 682.3105.
단계 7: (S)-3-아미노-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00046
THF (95 mL) 중 (S)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (11 g, 16.67 mmol) 의 용액에 피페리딘 (4.26 g, 50 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 생성 용액을 LCMS 분석이 출발 물질의 부재를 나타내는 시점에서 4 h 교반하였다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고 톨루엔을 이용하여 잔사를 공비화하여 백색 고체를 수득하고 이를 최소 에틸 아세테이트 (25-30 mL) 중에서 고온 조건에서 용해시키고 이어서 침전될 때까지 헥산 (250-300 mL) 을 이용해 이를 희석시켰다. 생성 고체를 여과에 의해 수집하고 헥산을 이용해 세척하여, 공기 건조 후, (S)-3-아미노-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (81% 수율) 를 백색 고체로서 수득하였다. ES(+)-HRMS m/e C22H35N3O6 (M+Na)+ 에 대한 계산치 460.2418, 관찰치. 460.2416.
단계 8: (S)-3-(2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00047
(S)-3-아미노-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (2.0 g, 4.58 mmol), 2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)벤조일)-아미노-아세트산 (2.0 g, 4.58 mmol), HBTU (1.91 g, 5.04 mmol), 및 HOBT (681 mg, 5.04 mmol) 의 혼합물에 DMF (15 mL) 이어서 DIPEA (1.95 g, 15.12 mmol) 를 실온에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 겔 유사 고형물이 형성되는 시점에서 생성된 연한 갈색 용액을 2 일 동안 교반하였다. 이어서, 물 (~50 mL) 을 첨가하고 생성된 연한 갈색 페이스트를 고온 조건에서 에틸 아세테이트 (~200 mL) 에 용해시켰다. 이어서, 2 개의 층을 분리하고 수성 층을 에틸 아세테이트 (100 mL) 로 1회 이상 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 추출물을 포화 중탄산 나트륨 용액, 물, 및 염수 용액으로 세척하고, 이서서 유기 층을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축으로 미정제의 연한 갈색 고체를 수득하고 이를 ISCO (120 g) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 (S)-3-(2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (94% 수율) 를 백색 고체로서 단리하였다. ES(+)-HRMS m/e C42H61N7O12 (M+H)+ 에 대한 계산치 856.4450, 관찰치. 856.4451.
단계 9: (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-(3-(구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-숙신아믹산 트리플루오로아세테이트 염 αVβ3 리간드 1 의 제조:
Figure pct00048
디클로로메탄 (80 mL) 중 (S)-3-(2-(3-(N,N-비스-tert-부톡시카르보닐구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (3.7 g, 4.32 mmol) 에 과량의 트리플루오로아세트산 (40 mL) 를 0 ℃ (빙욕) 에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. 생성되는 무색 용액을 1-2 h 동안 이 온도에서 교반하고 이어서 냉각욕을 제거함으로써 이를 실온으로 가온시켰다. 15 h 동안 교반 후, 용매를 진공 하에 제거하고 톨루엔을 이용하여 잔사를 공비화하였다. 생성된 진청 페이스트를 tert-부틸 메틸 에테르로 분쇄하였으나, 이는 양호한 고형물을 제공하지 못했다. 이어서, 용매를 진공 하에 제거하고 잔사를 디클로로메탄 및 디에틸 에테르로 분쇄하였다. 생성되는 연한 갈색 고체를 여과에 의해 수집하고 디에틸 에테르로 세척하였다. 공기 중의 건조 후, 2.7 g 의 (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-(3-(구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-숙신아믹산을 트리플루오로아세테이트 염 (85% 수율) 으로서 단리하였다. ES(+)-HRMS m/e C23H29N7O6 (M+H)+ 에 대한 계산치 500.2252, 관찰치. 500.2252.
단계 10: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 1 의 제조:
Figure pct00049
DMSO (5 mL) 중 (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-(3-(구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-숙신아믹산 (245 mg, 0.289 mmol) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (200 mg, 0.289 mmol) 의 용액에 과량의 DIPEA(186 mg, 252 uL, 1.44 mmol) 를 실온에서 질소 분위기 하에서 첨가하였다. LCMS 분석이 출발 물질의 부재를 나타내는 시점에서, 생성되는 연한 황색 용액을 2 h 동안 교반하였다. 이어서 과량의 DIPEA 를 진공 하에 제거하고 HPLC 를 이용하여 원하는 생성물을 단리하여 212 mg (68% 수율) 의 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산을 연한 황색 고체로서 수득하였다. ES(+)-HRMS m/e C49H71N9O18 (M+H)+ 에 대한 계산치 1074.4990, 관찰치. 1074.4984.
실시예 2
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 2 의 제조:
Figure pct00050
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-(3-(구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-숙신아믹산 (245 mg, 0.289 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (250 mg, 0.289 mmol), 및 DIPEA (373 mg, 503 uL, 2.89 mmol) 로부터 출발, HPLC 정제 후, 연한 갈색 오일 (312 mg, 86%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C57H87N9O22 (M+H)+ 에 대한 계산치 1250.6039, 관찰치. 1250.6032.
실시예 3
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-[구아니디노]-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 트리플루오로아세테이트 염; αVβ3 리간드 시약 3 의 제조:
Figure pct00051
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-(3-(구아니디노)-벤조일아미노)-아세틸아미노)-숙신아믹산 (245 mg, 0.289 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (172 mg, 0.289 mmol), 및 DIPEA(503 uL, 2.89 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 황색 점성 오일 (172 mg, 73%) 을 생성. ES(+)-HRMS m/e C44H67N7O16S (M+H)+ 에 대한 계산치 982.4438, 관찰치. 982.4432.
실시예 4
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 4:
Figure pct00052
단계 1: 2-[3-(벤질옥시카르보닐메틸카르바모일)페닐이미노]-디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00053
표제 화합물을 실시예 1, 단계 2 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, 무수 테트라히드로푸란 (90 mL) 중 2-[3-카르복시페닐이미노]-디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르 (4.85 g, 11.56 mmol), 2-클로로-4,6-디메톡시-트리아진 (2.03 g, 11.56 mmol), N-메틸모폴린 (1.17 g, 1.27 mL,11.56 mmol), 글리신 벤질에스테르 p-TsOH 염 (3.9 g, 11.56 mmol), 및 2 당량의N-메틸모폴린 (1.17 g, 1.27 mL, 11.56 mmol) 으로부터 출발, 및 ISCO 컬럼 크로마토그래피 정제 후, 무색 점성 오일 (3.19 g, 49%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C30H38N4O7 (M+H)+ 에 대한 계산치 567.2813, 관찰치. 567.2810.
단계 2: 2-[3-(카르복시메틸-카르바모일)페닐이미노]-디히드로-피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00054
표제 화합물을 실시예 1, 단계 3 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, 무수 에탄올 (20 mL) 중 2-[3-(벤질옥시카르보닐메틸카르바모일)페닐이미노]-디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르 (475 mg, 0.84 mmol) 및 10% Pd/탄소 상 (250 mg) 로부터 출발, 무수 백색 고체 (355 mg, 89%) 생성. ES(+)-HRMS m/e C23H32N4O7 (M+H)+ 에 대한 계산치 477.2344, 관찰치. 477.2344.
단계 3: 2-[3-[[[(S)-2-tert-부톡시카르보닐-1-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)페닐카르바모일]에틸카르바모일]메틸] 카르바모일]페닐이미노]디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00055
표제 화합물을 실시예 1, 단계 8 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, DMF (5 mL) 중 2-[3-(카르복시메틸-카르바모일)페닐이미노]-디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르 (332 mg, 0.69 mmol), (S)-3-아미노-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (305 mg, 0.69 mmol), HBTU (290 mg, 0.76 mmol), HOBT (104 mg, 0.76 mmol), 및 DIPEA (297 mg, 400 uL, 2.3 mmol) 로부터 출발, 및 ISCO 컬럼 크로마토그래피 정제 후, 무수 백색 고체 (602 mg, 97%) 를 생성함. ES(+)-HRMS m/e C45H65N7O12 (M+H)+ 에 대한 계산치 896.4764, 관찰치. 896.4764.
단계 4: (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)벤조일아미노]아세틸아미노]숙신아믹산; αVβ3 리간드 2 의 제조:
Figure pct00056
표제 화합물을 실시예 1, 단계 9 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, 디클로로메탄 (20 mL) 중 2-[3-[[[(S)-2-tert-부톡시카르보닐-1-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)페닐카르바모일]에틸카르바모일]메틸]카르바모일]페닐이미노]디히드로피리미딘-1,3-디카르복실산 디 tert-부틸 에스테르 (595 mg, 0.66 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 로부터 출발, 트리플루오로아세테이트 염 (555 mg, 96%) 으로서 연한 갈색 고체를 생성함. ES(+)-HRMS m/e C23H29N7O6 (M+H)+ 에 대한 계산치 500.2252, 관찰치. 500.2252.
단계 5: (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 (αVβ3 리간드 시약 4) 의 제조:
Figure pct00057
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)벤조일아미노]아세틸아미노]-숙신아믹산 (265 mg, 0.3 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (179 mg, 0.3 mmol), 및 DIPEA (387 mg, 526 uL, 3.0 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 황색 점성 오일 (208 mg, 68%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C47H71N7O16S (M+H)+ 에 대한 계산치 1022.4751, 관찰치. 1022.4742.
실시예 5
(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] pro-pionyl아미노]메틸]페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질우레이도)티아졸-4-카르보닐]아미노]아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 5 의 제조:
Figure pct00058
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-아미노메틸페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질우레이도)티아졸-4-카르보닐]아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 (166 mg, 0.3 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (232 mg, 0.3 mmol), 및 DIPEA (387 mg, 522 uL, 3.0 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 갈색 오일 (362 mg, 99%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C54H81N7O20S2 (M+H)+ 에 대한 계산치 1212.5051, 관찰치. 1212.5058.
실시예 6
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 6:
Figure pct00059
단계 1: 2-아미노-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르 히드로브로마이드의 제조
Figure pct00060
콘덴서, 온도계, 및 기계적 교반을 장착한 3 L 3목 플라스크에 (오일욕 중 셋팅됨), 티오우레아 (48.2 g, 634 mmol) 및 에틸 브로모피루베이트 (137 g, 88.3 mL, 634 mmol) 를 충전시켰다. 투명한 용액이 형성될 때까지 (60℃) 반응물을 천천히 조심스럽게 가열시키고 반응물이 발열성이 될 때 (반응 온도가 110 ℃ 에 달함) 반응물이 고체화될 때까지 이를 교반하였다. 반응물에 EA (500 mL) 를 첨가하고, 반응물에서 열을 제거하고 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과시키고 EA 및 Et2O 로 세척하고 2-아미노-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르 히드로브로마이드 염을 백색 고체 (157 g, 98%) 로서 생성하였다.
단계 2: 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르의 제조:
Figure pct00061
2-아미노-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르 히드로브로마이드 염 (66.6 g, 263 mmol), 4-에틸모폴린 (60.7 g, 67.1 mL, 527 mmol), 및 무수 DMF (660 ml) 를 함유하는 반응관에 벤질 이소시아네이트 (42.1 g, 316 mmol) 를 첨가하고, 7 hr 동안 아르곤 하에서 실온에서 반응물을 교반하고, 더욱이 벤질 이소시아네이트 (42.1 g, 316 mmol) 를 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 아르곤 하에서 교반하였다. 다음날, 반응물을 2/3 로 농축시키고 물 (1.6 L) 로 희석하고, 생성되는 침전물을 여과하고 밤새 흡인 건조시켜 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르를 회백색 고체 (146 g, 182%) 로서 수득하였다. NMR 분석하여, 물질은 여전히 물 및 DMF 를 갖는 습식인 것으로 나타났으며, 이를 그 자체로서 사용하였다.
단계 3: 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산의 제조:
Figure pct00062
습식 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르 (146 g, assumed 이론치 263 mmol) 를 함유하는 반응관에 에탄올 (1.2 L) 및 1 N NaOH (1.31 L) 를 첨가하였다. 반응물을 가온시키고 (60℃) 4 hr 동안 아르곤 하에서 교반하였다. 반응물을 여과하고 고체를 버렸다. 여과액을 빙욕 중 냉각시키고 1 N HCl (1.31 L) 로 산성화하고 생성되는 침전물을 여과사키고 물로 세척하고 2일 동안 흡인 건조시켜 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산 (72 g, 99%) 을 수득하였다.
단계 4: {[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세트산 에틸 에스테르의 제조:
Figure pct00063
표제 화합물을 실시예 1, 단계 2 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, 2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르복실산 (72 g, 259 mmol), 2-클로로-4,6-디메톡시-트리아진 (45.5 g, 259 mmol), N-메틸모폴린 (26.2 g, 28.5 ml, 259 mmol), 글리신 에틸 에스테르 히드로클로라이드 (36.2 g, 259 mmol), 및 2당량의 N-메틸모폴린 (26.2 g, 259 mmol) 로부터 출발, 및 결정화 및 크로마토그래피 후 백색 결정을 고체 (72.6 g, 76%) 로서 생성하였다.
단계 5: {[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세트산의 제조:
Figure pct00064
표제 화합물을 실시예 1, 단계 3 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, {[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세트산 에틸 에스테르 (72.3 g, 199 mmol), 메탄올 (200 mL), THF (1 L), 1 N NaOH (0.2 L), 및 1 N HCl (0.2 L) 로부터 출발, 및 중성화, 증발 및 결정화 후, 백색 결정 (73.1 g, 109 %) 을 생성함. NMR 분석하여, 용매를 함유하는 생성물인 것으로 나타났으며, 이를 그 자체로서 사용하였다.
단계 6: (S)-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르의 제조:
Figure pct00065
표제 화합물을 실시예 1, 단계 8 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, {[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세트산, (S)-3-아미노-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (1.5 g, 3.43 mmol), HBTU (1.43 g, 3.77 mmol), HOBT (0.51 g, 3.77 mmol), 및 DIPEA (1.46 g, 1.97 mL, 11.3 mmol) 로부터 출발, 백색 고체 (1.83 g, 70%) 를 생성함. ES(+)-HRMS m/e C36H47N7O9S (M+Na)+ 에 대한 계산치 776.3048, 관찰치. 776.3050.
단계 7: (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-숙신아믹산 αVβ3 리간드 시약 8, 40389-052) αVβ3 리간드 3 의 제조:
Figure pct00066
표제 화합물을 실시예 1, 단계 9 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-N-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-페닐]-숙신아믹산 tert-부틸 에스테르 (1.83 g, 2.48 mmol) 로부터 출발 백색 고체 (1.29 g, 88%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C17H31N7O7S (M+H)+ 에 대한 계산치 598.2079, 관찰치 598.2077.
단계 8: (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산의 제조:
Figure pct00067
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-숙신아믹산 αVβ3 리간드 시약 8, 40389-052) (242 mg, 0.405 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (280 mg, 0.405 mmol), 및 DIPEA (262.2 mg, 353 μL, 2.03 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 갈색 검 (206 mg, 43%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C53H73N9O19S (M+H)+ 에 대한 계산치 1172.4816, 관찰치 1172.4806.
실시예 7
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]에톡시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 7, 40389-058) 의 제조:
Figure pct00068
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-숙신아믹산 αVβ3 리간드 시약 8, 40389-052) (155 mg, 0.260 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (225 mg, 0.260 mmol), 및 DIPEA (167 mg, 226 μL, 1.29 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 황색 검 (149 mg, 42%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C61H89N9O23S (M+H)+ 에 대한 계산치 1348.5865, 관찰치 1348.5864.
실시예 8
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-아세틸술파닐-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; αVβ3 리간드 시약 8 의 제조:
Figure pct00069
표제 화합물을 실시예 1, 단계 10 에서 기술된 바와 유사한 과정을 사용하여 제조함, (S)-N-[4-(3-아미노-프로폭시)-페닐]-3-(2-{[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노}-아세틸아미노)-숙신아믹산, 40389-052) (120 mg, 0.201 mmol), 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-아세틸술파닐-에톡시]-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피온산-2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (120 mg, 0.201 mmol), 및 DIPEA (129.2 mg, 174 μL, 1.01 mmol) 로부터 출발, 및 HPLC 정제 후, 연한 갈색 검 (206 mg, 43%) 을 생성함. ES(+)-HRMS m/e C48H69N7O17S2 (M+H)+ 에 대한 계산치 1080.4264, 관찰치 1080.4257.
N-(2-메톡시벤질)아세트아미드의 제조
Figure pct00070
깔끔한 화합물 2-메톡시벤질아민 (40 g, 0.29 mol) 에 Ac2O (80 mL, 0.85 mol) on an 빙수욕 상에서 Ac2O (80 mL, 0.85 mol) 를 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 추가 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 50 mL 의 물에 붓고, 에틸 아세테이트 (3 × 300 mL) 로 추출하였다. 결합된 유기 층을 물 (3 × 150 mL), 염수 (100 mL) 로 세척하고, 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔사를 석유 에테르 (200 mL) 에 현탁하고 10 분 동안 교반하고, 이어서 여과하고 건조시켜 표제 화합물 (36.5 g, 69.9 %) 을 순수한 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00071
N-(2-히드록시벤질)아세트아미드의 제조
Figure pct00072
N-(2-메톡시벤질)아세트아미드 (6.5 g, 0.036 mol) 를 DCM (100 mL) 에 용해시키고, 용액을 질소 하에 -10℃ 로 냉각시켰다. 이러한 용액에 BBr3 (15 mL, 0.15 mol) 을 적가하였다. 첨가 후, 빙욕을 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -10℃ 로 재냉각시키고 물 (20 mL) 로 켄칭하였다. 혼합물을 DCM (3 × 100 mL) 로 추출하고, 유기 층을 물 (3 × 100 mL), 염수 (100 mL) 로 세척하고 건조시켜 표제 화합물 (4.3 g, 71.7 %) 을 고체로서 제공하였다. 추가의 정제 없이 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
Figure pct00073
tert-부틸 3-브로모프로필카르바메이트의 제조
Figure pct00074
DCM (1000 mL) 중 3-브로모프로필아민 히드로브로마이드 (50 g, 0.228 mol) 의 현탁액에 (Boc)2O (52 g, 0.238 mol) 및 트리에틸아민 (100 mL, 0.722 mol) 을 첨가하였다. 이어서 반응물을 추가 3 시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고 잔사를 석유 에테르 (500 mL) 로 세척하였다. 혼합물 여과시키고 여과액을 증발시켜 표제 화합물 (54 g, 99.2 %) 을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00075
{3-[2-(아세틸아미노-메틸)-페녹시]-프로필}-카르밤산 tert-부틸 에스테르의 제조
Figure pct00076
DMF (100 mL) 중 N-(2-히드록시벤질)아세트아미드 (18.8 g, 0.11 mol) 의 교반 용액에 tert-부틸 3-브로모프로필카르바메이트 (32 g, 0.135 mol) 및 K2CO3 (47 g, 0.34 mol) 를 실온에서 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과사키고 용매를 진공 하에 제거하여 미정제 생성물을 제공하고 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (석유 에테르 /에틸 아세테이트 = 1:3-1:4) 로 정제하여 표제 화합물 (23 g, 62.8 %) 을 고체로서 수득하였다.
Figure pct00077
tert-부틸 3-(2-(아미노메틸)페녹시)프로필카르바메이트의 제조
Figure pct00078
{3-[2-(아세틸아미노-메틸)-페녹시]-프로필}-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (10.4 g, 0.032 mol) 를 히드라진 히드레이트 (150 mL, 85%) 중 현탁하고 반응 혼합물을 20 시간 동안 환류에서 교반하였다. 혼합물을 실온에서 냉각하고 디에틸 에테르 (3 × 150 mL) 로 추출하였다. 결합된 유기 상을 염수 (150 mL) 로 세척하고 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM / MeOH = 20:1 ~ 1:1) 로 정제하여 표제 화합물 (4 g, 44.6 %) 을 제공하였다.
Figure pct00079
화합물 2-아미노티아졸-4-카르복실산 120 의 합성
Figure pct00080
THF (2500 mL) 중 화합물 150 (125 g, 0.525 mol) 의 현탁액에, NaOH 용액 (63 g in 790 mL 물) 을 1 시간 기간에 걸쳐 적가하였다. 생성되는 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔사를 2 N HCl (770 mL) 로 처리하고, 여과시키고 건조시켜 화합물 120 (75 g, 99.1 %) 을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO): δ 7.38 (s, 1H), 7.13 (brs, 2H).
화합물 [(2-아미노-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 메틸 에스테르 8 의 합성
Figure pct00081
DMF (50 mL) 중 화합물 120 (1 g, 6.93 mmol) 의 용액에 화합물 121 (0.97 g, 7.73 mmol), DIPEA (3.5 mL, 21.1 mmol) 및 HATU (2.93 g, 7.7 mmol) 를 첨가하였다. 생성되는 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 85℃ 에서 진공 하에 증발 건조시키고 이를 30mL 의 THF 로 처리하고, 실온에서 약 0.5 시간 동안 교반하고, 이어서 여과시키고, 약간의 에탄올로 세척하고 건조시켜 화합물 122 (0.7 g, 46.9%) 를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO): δ 8.07 (t, 1H，J = 6.0 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.12 (brs, 1H), 3.97(d, 2H, J = 6.0 Hz), 3.64 (s, 3H).
[(2-{3-[2-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 메틸 에스테르의 제조
Figure pct00082
DCM (50 mL) 중 tert-부틸 3-(2-(아미노메틸)페녹시)프로필카르바메이트 (489 mg, 1.74 mmol) 의 교반 용액에 DCM (5.0 mL) 중 DIPEA (449 mg, 3.48 mmol) 용액을 첨가하였다. 0℃ 에서 질소 하에 이러한 용액을 DCM 중 트리포스겐 (180 mg, 0.61 mmol) 의 추가 용액에 적가하였다. 첨가 후, 혼합물을 추가 15 분 동안 0℃ 에서 교반하였다. 용액을 증발시켜 [3-(2-이소시아네이토메틸-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르를 백색 고체로서 수득하였다. 이를 2.5mL 의 DMF 에 용해시키고 다음 단계에 직접 사용하였다.
DMF (2.5 mL) 중 [(2-아미노-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 메틸 에스테르 (374 mg, 1.74 mmol) 및 DIPEA (449 mg, 3.48 mmol) 의 용액에 DMF (2.5 mL, 상기 제조됨) 중 [3-(2-이소시아네이토메틸-페녹시)-프로필]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 용액을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 80 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 냉각시키고 50 mL 의 물에 붓고, 에틸 아세테이트 (3 × 100 mL) 로 추출하였다. 유기 상을 염수 (20 mL) 로 세척하고 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔사를 크로마토그래피 (석유 에테르 / 에틸 아세테이트 = 1:2 ~ 1:1) 로 정제하여 표제 화합물 (165 mg, 18.2 % over two 단계s) 을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.55 (s, 1H), 7.17-7.14 (m, 2H), 6.87-6.77 (m, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.01-3.96 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.22-3.19 (m, 2H), 1.91-1.86 (m, 2H), 1.31 (s, 9H). LC-MS: 522.2 [M+H]+, tR = 2.73 min.
[(2-{3-[2-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산의 제조
Figure pct00083
THF (5 mL) 중 [(2-{3-[2-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 메틸 에스테르 (0.165 g, 0.31 mmol) 의 용액에 물 (1 mL) 중 LiOH.H2O (0.132 g, 3.1 mmol) 용액을 실온에서 적가하였다. 이어서 용액을 이 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔사를 5 mL 의 물로 희석시켰다. 수용액을 에틸 아세테이트 (10 mL) 로 추출하고, 수상을 pH ~ 5 가 될 때까지 1N 시트르산 용액으로 산성화시켰다. 수용액을 에틸 아세테이트 (3 × 15 mL) 로 추출하고, 결합된 유기 층을 염수 (10 mL) 로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 표제 화합물 (0.080 g, 50.9 %) 을 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO): δ 10.57 (brs, 1H), 8.06 (t, 1H, J = 5.8 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.26-7.20(m, 2H), 6.98-6.88 (m, 4H), 4.32 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 4.03-3.91 (m, 4H), 3.16-3.10 (m, 2H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.36 (s, 9H). LC-MS: 508.2 [M+H]+, tR = 2.58 min
메틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로폭시) ben-zyl)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-페닐프로파노에이트의 제조
Figure pct00084
THF (25 mL) 중 [(2-{3-[2-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 (0.7 g, 1.38 mmol) 용액에 DIPEA (1.4 g, 10.8 mmol) 및 HATU (0.525 g, 1.38 mmol) 를 실온에서 첨가하였다. 이어서 반응물을 20 분 동안 교반하였다. 메틸 3-아미노-3-페닐프로파노에이트 히드로클로라이드 (0.29 g, 1.34 mmol) 를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 167 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔사를 50 mL 의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 1N NaOH 용액 (3 × 15 mL), 이어서 1N HCl (3 × 15 mL) 및 물 (3 × 15 mL) 로 세척하고, 이어서 염수 (15 mL) 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 여과 및 농축 후, 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (용리: 에틸 아세테이트/석유 에테르 /메탄올 = 25:25:2) 로 정제하여 표제 화합물 (0.54 g, 58.6%) 을 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.67 (s, 1H), 7.37-7.24 (m, 7H), 6.99-6.92 (m, 2H), 5.40 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 4.46 (s, 2H), 4.13-4.04 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 3.34-3.32 (m, 2H), 2.90-2.86 (m, 2H), 2.03-1.98 (m, 2H), 1.43 (s, 9H). LC-MS: 669.2 [M+H]+, tR = 3.11 min
메틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-페닐프로파노에이트 히드로클로라이드의 제조
Figure pct00085
에틸 아세테이트 (250 mL) 중 교반된 HCl 포화 용액에 에틸 아세테이트 (30 mL) 중 메틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-페닐프로파노에이트 (5.5 g, 8.23 mmol) 의 용액을 적가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 하에 제거하고, 고체를 디에틸 에테르 (50 mL) 로 처리하고 이어서 여과시켜 표제 화합물 (4.7 g, 94.5%) 을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.69 (s, 1H), 7.36-7.27 (m, 7H), 7.02-6.95 (m, 2H), 5.40 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 4.48 (s, 2H), 4.19 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 4.06 (d, 2H, J = 2.1 Hz), 3.63 (s, 3H) 3.24 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.90-2.86 (m, 2H), 2.24-2.15 (m, 2H). LC-MS: 569 [M+H]+, tR = 3.00 min. HPLC: 99.85 % at 214 nm, 99.14 % at 254 nm, tR = 4.05 min
3-{2-[(2-{3-[2-(3-아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산 αVβ3 리간드 4 의 제조:
Figure pct00086
메탄올 (10 ml) 중 3-{2-[(2-{3-[2-(3-아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산 메틸 에스테르 히드로클로라이드 (2.0 g, 3.31 mmol, Eq: 1.00) 의 용액에 2 M 수산화 나트륨 (33.1 mmol, Eq: 10.00) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 55 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 1 N HCl 을 이용한 중성화 동안 미정제 생성물을 침전시키고 여과 수집하였다 (2.19 g). 미정제 생성물을 역상 HPLC 로 정제하여 1041 mg 의 표제 화합물을 TFA 염으로서 수득하였다.
HRMS m/e 555.2006 (M+H)+
(R)-에틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로폭시)벤질) 우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)프로파노에이트의 제조
Figure pct00087
THF (150 mL) 중 [(2-{3-[2-(3-tert-부톡시카르보닐아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세트산 (7.08 g, 13.9 mmol) 및 HATU (5.8 g, 15.2 mmol) 의 용액에 DIPEA (13.9 g, 107.7 mmol) 를 질소 하에 실온에서 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 추가 20 분 동안 교반하였다. 화합물 (R)-에틸 3-아미노-3-(피리딘-3-일)프로파노에이트 히드로클로라이드 (4.45 g, 16.8 mmol) 를 한번에 첨가하고, 반응물을 이 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔사를 500 mL 의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 0.3 N HCl (2 × 100 mL), 염수 (100 mL) 로 세척하고 건조시켜 미정제 생성물을 제공하고 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트 중 10% 메탄올로 용리) 로 정제하여 표제 화합물 (7.2 g, 77.3 %) 을 고체로서 수득하였다. LC-MS: 684.2 [M+H]+, tR = 2.60 min.
(R)-에틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4 카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)프로파노에이트 히드로클로라이드의 제조
Figure pct00088
에탄올 (50 mL) 중 (R)-에틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로폭시) 벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)프로파노에이트 (2.3 g, 3.36 mmol) 의 교반된 용액에 아세틸 클로라이드 (5 mL) 를 0℃ 에서 첨가하였다. 이어서 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 잔사를 에틸 아세테이트 (100 mL) 로 세척하여 표제 화합물 (1.1 g, 52.6 %) 을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8.97 (s, 1H), 8.83-8.81 (m, 1H), 8.73 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.73 -7.75 (m, 1H), 7.34-7.28 (m, 2H), 7.04-6.96 (m, 2H), 5.56-5.51 (m, 1H), 4.49 (s, 2H), 4.23-4.07 (m, 6H), 3.26 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 3.11 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 2.26-2.22 (m, 2H), 1.24 (t, 3H, J = 7.0 Hz). LC-MS: 584.0 [M+H]+, tR = 2.17 min. HPLC: 100 % at 214 nm, 100 % at 254 nm, tR = 5.91 min.
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)-프로피온산 αVβ3 리간드 5 의 제조
Figure pct00089
MeOH (10 mL) 중 (R)-에틸 3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)프로파노에이트 디히드로클로라이드 (1.99 g, 3.1 mmol) 의 용액에 2 N 수산화 나트륨 (15.5 mL, 31.0 mmol) 을 첨가하고 생성되는 반응 혼합물을 55 ℃ 에서 밤새 교반하였다. 이어서 1 N 염산을 이용하여 중성화하고 역상 HPLC 로 정제하여 1.10 g 의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 11
αVβ3 리간드 시약 9 의 제조
Figure pct00090
표제 화합물을 실시예 7 에 나타낸 바와 같이 3-{2-[(2-{3-[2-(3-아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산 및 3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-프로피온산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르와 유사한 방식으로 제조하였다. HRMS m/e 883.2978 (M+Na)+
실시예 12
αVβ3 리간드 시약 10 의 제조
Figure pct00091
표제 화합물을 실시예 7 에서 나타낸 바와 같이 3-{2-[(2-{3-[2-(3-아미노-프로폭시)-벤질]-우레이도}-티아졸-4-카르보닐)-아미노]-아세틸아미노}-3-페닐-프로피온산 및 1-(S-아세틸)-머캅토-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-산 N-히드록시숙시니미딜 에스테르와 유사한 방식으로 제조하였다. HRMS m/e 1213.5248 (M+H)+
실시예 13
αVβ3 리간드 시약 11 의 제조
Figure pct00092
표제 화합물을 실시예 7 에서 나타낸 바와 같이 (R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)-프로피온산 TFA 및 3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-프로피온산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르와 와 유사한 방식으로 제조하였다. HRMS m/e 884.2924 (M+H)+
실시예 14
αVβ3 리간드 시약 12 의 제조
Figure pct00093
표제 화합물을 실시예 7 에서 나타낸 바와 같이 (R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-아미노프로폭시)벤질)우레이도)티아졸-4-카르복스아미도)아세트아미도)-3-(피리딘-3-일)-프로피온산 TFA 및 1-(S-아세틸)-머캅토-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-산 N-히드록시숙시니미딜 에스테르와 유사한 방식으로 제조하였다. HRMS m/e 1214.5205 (M+H)+.
플루오레세인 (FITC) 표지 표적 시약의 제조
표적 시약은 표적 소분자에 대한 수용체를 발현하는 세포에 대한 결합 트랙킹을 연구하기에 유용할 수 있는 형광단을 이용해 유도체화될 수 있다. 그러한 분자는 두가지 방법 중 하나 또는 모두를 이용해 제조될 수 있다. 먼저, 표적으로 하는 말레이미드의 2-[(5-플루오로세이닐)아미노카르보닐]에틸머캅탄과의 반응을 실시할 수 있다. 대안적으로, 인테그린 안타고니스트 소분자 표적 리간드의, 2-[(5-플루오로세이닐)아미노카르보닐]에틸머캅탄 및 반응식 17 및 18 에 제시된 이관능성 PEG 시약과의 1-용기 반응을 실시할 수 있다.
방법 a) 의 실시예
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산-FITC 의 제조
Figure pct00094
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 (37.5 mg, 0.03 mmol) 및 2-[(5-플루오로세이닐)아미노카르보닐]에틸머캅탄 (FITC 시약) (15.6 mg, 0.036 mml) 의 메탄올 (5 mL) 중 황색 현탁액에 과량의 DIPEA (38.7 mg, 52 uL, 0.3 mmol) 를 실온에서 질소 분위기 하에 첨가했다. 결과로서 수득한 연황색 현탁액을 LCMS 분석이 출발 물질의 부재를 표시하는 2 시간 동안 교반했다. 이어서, 과량의 DIPEA 를 진공 하에 제거하고, 원하는 생성물을 HPLC 을 이용한 정제에 의해 분리해 25 mg (50% 수율) 의 (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산-FITC 유도체를 브라운 고체로 수득했다.
ES(+)-HRMS m/e C80H104N10O28S (M+2H)2+ 에 대한 산출값 843.3444, 실측값 843.3437.
LCMS 데이터 = M+H, 1687.6
방법 b) 의 실시예
Figure pct00095
반응식 17
단계 1. 시스타민 디히드로클로라이드 (68 mg, 0.301 mmol) 및 DIEA (110 ㎕, 2.1 eq.) 를 DMF (10 mL) 에 첨가한 후, NHS-플루오레세인을 첨가하고, 5- 및 6-카르복시플루오레세인 (300 mg, 0.634 mmol) 및 결과로서 수득한 혼합물의 혼합물을 밤새 실온에서 교반했다. 이어서, 그것을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 3 회 그리고 식염수로 1 회 세척했다. 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축하고, 소량의 메탄올 및 에틸 아세테이트에 재용해시킨 후, 디에틸 에테르로 저작시켜 140 mg 의 플루오레세인-시스타민 부가물을 밝은 오렌지색 고체로 수득했다.
단계 2. 플루오레세인-시스타민 부가물 (80 mg, 0.092 mmol) 을 메탄올 및 물의 3:1 혼합물 (4 mL) 에 녹이고, TCEP 히드로클로라이드 (80 mg, 3 eq.) 를 첨가했다. 결과로서 수득한 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반했다. 생성물을 HPLC 로 정제하여 78 mg 의 생성물을 수득했다. LRMS (ESI) 435.0
플루오레세인-표지 소분자-PEG 접합체의 제조
Figure pct00096
반응식 18
일반적인 과정: 리간드 (1 eq.) 의 DMSO 중 용액에 DIEA (2 eq.) 및 SM(PEG)4n (1 eq.) 를 첨가했다. 결과로서 수득한 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반했다. 후속하여, 티올 핸들 (thiol handle) (1 eq.) 이 있는 플루오레세인을 첨가하고, 반응 혼합물을 10 분 더 교반했다. 생성물을 HPLC 로 정제했다.
5'-티올-siRNA 올리고뉴클레오티드에 대한 리간드를 표적으로 하는 소분자 인테그린에 대한 공유성 결합을 위한 과정
siRNA 제조.
올리고리보뉴클레오티드 합성
올리고리보뉴클레오티드를 ABI 394 synthesizer (Applied Biosystems) 를 채용해 10 mmol 스케일로 고상 상에서 포스포르아미다이트 기법에 따라 합성했다. RNA 서열 정보에 대해서는 표 1 및 2 를 참조한다. 해당하는 siRNA 는 하우스 키핑 유전자 AHA1 에 대한 것이다. 합성은 제어된 포어 글래스 (CPG, 520Å, 75 mmol/g 로 로오딩, Prime Synthesis 사, Aston, PA, USA) 로 만든 고체 담체 상에서 실시했다. 보통의 RNA 포스포르아미다이트, 2'-O-메틸포스포르아미다이트 및 부차적인 시약들은 Proligo 사 (Hamburg, 독일) 에서 구입했다. 구체적으로, 하기의 아미다이트를 이용했다: (5'-O-디메톡시트리틸-N 6-(벤조일)-2'-O-t-부틸디메틸실릴-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시트리틸-N 4-(아세틸)-2'-O-t-부틸디메틸실릴-싸이티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N 2-(이소부티릴)-2'-O-t-부틸디메틸실릴-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-t-부틸디메틸실릴-유리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-O-메틸포스포르아미다이트는 보통의 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유하고 있다. 모든 아미다이트를 무수 아세토니트릴 (100 mM) 에 녹이고, 분자체 (3Å) 를 첨가했다. 올리고머의 5' 말단에 술프히드릴 링커를 생성하기 위해, Glen Research 사 (Sterling, Virginia, USA) 의 1-O-디메톡시트리틸-헥실 디설파이드, 1'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트를 이용했다. 소분자체 접합 전에, 디설파이드 링커를 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 하기 참조) 을 이용해 환원시켰다. Nu547 형광단을 이용한 5' 말단 표지를 위해서는 Thermo Fisher 사 (Milwaukee, Wisconsin) 로부터 입수한 상응하는 포스포르아미다이트를 채용했다. 5-에틸 티오테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 500 mM) 을 활성화제 용액으로 이용했다. 커플링 시간은 6 분이었다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해서는, 3-에톡시-1,2,4-디티아졸린-5-온 (EDITH, Link Technologies 사, Lanarkshire, 스코틀랜드) 의 무수 아세토니트릴 중의 100 mM 용액을 이용했다.
담체 결합 올리고머의 절단 및 탈보호
고상 합성 종결 후, 건조시킨 고체 담체를 15 mL 관으로 옮기고, 메탄올 중 메틸아민 (2M, Aldrich) 으로 180 분 동안 45℃ 에서 처리했다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 15 mL 관으로 옮기고, CPG 를 1200 ㎕ N-메틸피롤리딘-2-온 (NMP, Fluka, Buchs, 스위스) 으로 세척했다. 세척한 것은 메탄올계 메틸아민 용액과 조합하고, 450 ㎕ 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (TEA/THF, Alfa Aesar, Karlsruhe, 독일) 를 첨가했다. 상기 혼합물을 150 분간 65℃ 로 만들었다. 실온으로 냉각 후, 0.75 mL NMP 및 1.5 mL 의 에톡시트리메틸실란 (Fluka, Buchs, 스위스) 를 첨가했다. 10 분 후, 석출시킨 올리고리보뉴클레오티드를 원심분리로 수집하고, 상청액을 제거하고, 고체를 1 mL 완충액 A (하기 참조) 에서 재건시켰다.
올리고리보뉴클레오티드의 정제
미정제 올리고뉴클레오티드를 AKTA Explorer system (GE Healthcare) 상의 조제용 22x 250 mm DNA Pac 100 컬럼 (Dionex, Idstein, 독일) 를 채용하는 강한 음이온 교환 (SAX) HPLC 으로 정제했다. 완충액 A 는 10 mM NaClO4, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.4, 6M 우레아 및 20% 아세토니트릴로 이루어졌다. 완충액 B 는 완충액 A 중에 500 mM NaClO4 를 포함하고 있는 것이다. 4.5 mL/min 의 유속을 이용했다. 260 및 280 nm 에서의 UV 추적을 기록했다. 55 분 이내에서의 20%B 의 45%B 까지의 구배를 채용했다. 적절한 분획을 모아, 3M NaOAc, pH=5.2 및 70% 에탄올을 이용해 석출시켰다.
미정제 Nu547 표지 올리고머를 AKTA Explorer system (GE Helthcare) 상에서 XTerra Prep MS C8 10x 50 mm 컬럼 (Waters, Eschborn, 독일) 을 이용하는 RP HPLC 로 정제했다. 완충액 A 는 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트 (Biosolve, Valkenswaard, 네덜란드) 였고, 완충액 B 는 완충액 A 중에 50% 아세토니트릴을 함유하는 것이다. 5 mL/min 의 유속을 채용했다. 260, 280 및 547 nm 에서의 UV 추적 (Nu547 표지 올리고뉴클레오티드) 을 기록했다. 58 컬럼 부피 (CV) 에서의 5%B 로부터 60%B 로의 구배를 채용했다. 적절한 분획을 모아, 3M NaOAc, pH=5.2 및 70% 에탄올을 이용해 석출시켰다.
최종적으로, 정제된 올리고머를 Sephadex G-25 (GE Healthcare) 를 포함하는 크기 배제 크로마토그래피로 탈염시켰다. 용액의 농도는 UV 광도계 (Beckman Coulter, Krefeld, 독일) 에서 260 nm 에서의 흡광도 측정으로 결정했다. 어닐링될 때까지, 개별 표준들을 -20℃ 에서 냉동 용액으로 저장했다.
소분자 RNA 접합체의 제조
말레이미드 관능기가 제공된 소분자들을 티오에테르 연결을 통해 RNA 에 공유결합으로 접합시켰다. 그의 화학 반응을 가능하게 하기 위해, 약 60 mg 의, 5'-디설파이드 연결고리를 포함하는 RNA 를 물 (5 mL) 에서 1 mL TCEP (수중 0.5 M, Sigma Aldrich 로부터 입수) 를 이용해 상응하는 티올로 환원시켰다. 일단 분석등급의 음이온 교환 HPLC 가 반응의 완결을 표시하면 (실온에서 약 2 시간), RNA 를 밤새 -20℃ 에서 30 mL 에탄올/3M NaOAc (pH 5.4) 32:1 (v/v) 을 이용해 침전시켰다. 펠렛을 원심분리로 수집하고, 후속 소분자 접합에 사용했다.
전형적 접합 반응에서, 10 mg RNA 를 2 mL 나트륨 포스페이트 완충액 (0.1 M, pH 7.0) 에 용해시켰다. 상기 용액에, ACN/NMP 1:1 (v/v) 중의 소분자 (0.12 mM) 를 5 분의 기간에 걸쳐 첨가했다. 일단 RP LC-ESI MS 가 주입 RNA 의 소비를 나타내면, 혼합물을 물 (약 10 mL) 로 희석하고, 약 40 mL 에탄올/3M NaOAc (pH 5.4) 32:1 (v/v) 을 첨가해, 접합된 RNA 를 밤새 -20℃ 에서 석출시켰다. 펠렛을 원심분리로 수집하고, 물에 녹여, 필요에 따라 상기 제시된 음이온 교환 HPLC 로 정제했다. 접합된 것이 충분히 순수하면, 반응 혼합물을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (Sephadex G-25, GE Healthcare) 을 통해 여과했다.
siRNA 생성을 위한 올리고리보뉴클레오티드의 어닐링
상보적 가닥은 동몰 RNA 용액을 조합해 어닐링되었다. 혼합물을 동결건조시키고, 적정 부피의 어닐링 완충액 (100 mM NaCl, 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8) 를 이용해 원하는 농도를 제공하도록 했다. 상기 용액을 95℃ 의 수조에 위치시키고, 3 시간 내에 실온으로 냉각시켰다.
하기 검정은 본 발명의 αVß3-표적화 화합물의 αVß3 결합 친화도를 평가하기 위해 수행된 것이다.
인간 αVß3 고체 상 검정:
면역 96-웰 플레이트 (NUNC, Part# 439454) 를, 각 웰에 100 uL 의 αVß3 (1x) 를 첨가함으로써 코팅하고 밤새 40℃ 에서 플레이트를 인큐베이션하였다. 사용된 버퍼는 버퍼 A 였다 - 버퍼 A: 20 mM 트리s, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH7.4. 코팅 시약의 제거 후, 버퍼 A 중의 150 uL 의 3.5% BSA 를 각 웰에 첨가하여 370℃ 에서 105분 동안 플레이트를 차단하였다. 차단 후, 플레이트를 200 uL 의 버퍼 B (버퍼 A + 1 mM MnCl2) 로 5회 세척하였다. 이후, 5% DMSO 중 50 uL 의 시험 화합물 용액 (2x) 및 50 uL 의 피브리노겐 (2x) (Innovative Research, Cat# IFIB) 을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2분 동안 진탕하고, 이어서 370℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 uL 의 버퍼 B 로 5회 세척한 후, 1st 항체 토끼 항-인간 피브리노겐 (Innovative Research, Cat IASHFBGN-GF) 을 100 uL/웰의 양으로, 2nd 항체 염소 항-토끼 IgG 말-래디쉬 퍼옥시다아제 접합 (Invitrogen, Cat#G21234) 를 50 uL/웰의 양으로 플레이트에 각각 첨가하였다. 1st 항체의 첨가 후 및 2nd 항체의 첨가 후, 플레이트를 2분 동안 진탕하고 370℃ 에서 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 200 uL 의 버퍼 B 로 상응하게 5회 세척하였다. 고체 상 검정의 최종 농도는 다음과 같다: [avβ3] = 1.25 ug, [피브리노겐] = 0.75 ug/mL, [Anti-FG] = 1/2400 (diluted), [HPR-Anti-rabbit] = 1/1000 (diluted). 결합 검정이 완료되었을 때, 100 uL/웰의 검출 시약 ABTS (혼합물 of 시약 A 및 시약 B) (KPL, Cat#50-62-00) 을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 5-8분 동안 RT 에서 진탕하고, 녹색 색상이 점차적으로 나타났다. 100uL/웰 정지 버퍼 (1.0 M 인산 (HPO4)) 첨가 후, 플레이트를 Envision (Absorbance mode 450 nm) 상에서 판독하였다.
대조군 화합물 (141) 은 약 2 nM 의 IC50 을 갖는 것으로 측정되었다 (즉, 50%의 세포가 웰의 표면 상의 αVß3 에 결합하지 못하였는데, 왜냐하면 세포의 αVß3 수용체가 아마도 대조군 화합물에 결합되거나 이에 연계되었기 때문이다). 이들 결과를 표 3 및 4 에 나타낸다.
Figure pct00097
141
세포 투과성 및 표적으로 하는 전달을 위해 FITC 형광단 및 siRNA 에 대해 공유결합으로 연결된 인테그린 안타고니스트에 대한 소분자 유도체의 편재의 증거
과정
생장 배지 (10% FBS 가 있는 RPMI 1640) 중의 AML MV4-11 세포를 Duplex-27 (500 nM) 와 함께 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. VLA-4 독립적 결합을 측정하기 위해, 140 (10 μM) 를 VLA-4 의존적 결합을 차단하는 한가지 조건에 포함시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 D-PBS 로 2 회 세척하고, 1% 파라포름알데히드에서 10 분간 고정시켰다. siRNA 의 흡수는 ImageStreamx (Aminis Corporation, Seattle) 를 이용해 유세포 분석을 영상으로 분석했다. 결과를 표 A 및 도 1 내지 4 에 제시한다.
표 A
Figure pct00098
세포 시스템에서의 AHA1 mRNA 의 넉-다운에 대한 5'-센스 가닥 개질 siRNA 의 검정
재료 및 방법
기준 유전자: GAPDH
세포주: H1299_Nut-Onc
플레이팅 밀도: 웰 당 5,000 개의 세포
플레이팅 포맷: 96-웰
플레이팅으로부터 처리하기까지의 시간: 0
대조군 처리: mock, 미처리, 대조군 siRNA
형질주입 시약: DharmaFect1
형질주입 방법 Reverse TF
TF 시약 부피/웰 0.15 mL
siRNA 최종 농도 50 nM
검정 방법: Day 1 manual/Day 2 Washer
역방향 형질주입: H1299 세포는 DharmaFect-1 형질주입 시약을 0.15 ㎕/웰로 이용해 50 nM 의 최종 농도로 표시된 siRNA 로 형질주입했다. 이어서, 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 5000 개의 세포로 플레이팅하고, 37℃ 에서 48 시간 동안 인큐베이션했다.
siRNA 넉-다운의 효능은 판매사에 의해 보고된 바와 같은 Branched DNA 검정법으로 측정했으며; 그러한 넉다운의 결과는 도 5 에 제시된다. 상대적 세포 생존력은 동일한 웰에서의 GAPDH 의 절대적인 발현으로 평가했다 (도 6).
달리 언급되지 않으면, 실시예에서의 모든 화합물든 기재된 바와 같이 제조되며 특징분석된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 공보들은 본원에 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann - La Roche AG <120> Integrin Antagonist Conjugates for Targeted Delivery to Cells Expressing Alpha-V-Beta-3 <130> 30843 WO <150> US61/591299 <151> 2012-01-27 <150> US61/678669 <151> 2012-08-02 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting AHA1 <400> 1 ggaugaagug gagauuagut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting AHA1 <400> 2 acuaaucucc acuucaucct t 21

Claims (22)

  1. 하기 식 I 의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르:
    Figure pct00099

    [식 중, n 은 1-24 이고,
    식 중, R1 은 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:
    (1) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00100

    (이때 m 은 0 또는 1 임);
    (2) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00101

    (이때 X 는 N 또는 CH 임);
    (3) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00102
    ;
    (4) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00103
    ; 및
    (5) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00104
    ;
    식 중, R2 는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:
    (1) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00105
    ;
    (2) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00106
    ;
    (3) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00107
    ; 및
    (4) 하기 식의 화합물:
    Figure pct00108

    (이때, R3 은 접합 부분이고, X 는 황 또는 하기 식의 화합물 중 하나를 나타냄:
    Figure pct00109
    )].
  2. 제 1 항에 있어서, R1 이 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00110

    [식 중, m 은 0 또는 1 임].
  3. 제 1 항에 있어서, R1 이 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00111

    [식 중, X 는 N 또는 CH 임].
  4. 제 1 항에 있어서, R1 이 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00112
    .
  5. 제 1 항에 있어서, R1 이 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00113
    .
  6. 제 1 항에 있어서, R1 이 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00114
    .
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 가 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00115
    .
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 가 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00116
    .
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 가 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00117
    .
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, R2 가 하기 식의 화합물인, 화합물:
    Figure pct00118

    [식 중,
    R3 은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드이고,
    X 는 황 또는 하기 식의 화합물 중 하나를 나타냄:
    Figure pct00119
    ].
  11. 제 10 항에 있어서, R3 이 siRNA 분자인 화합물.
  12. 제 10 항에 있어서, R3 이 플루오레세인 이소티오시아네이트인 화합물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물:
    (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; 및
    (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(구아니디노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산,
    3-(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-[구아니디노]-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산 트리플루오로아세테이트 염; 및
    (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-1-옥소프로필]아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[3-(테트라히드로피리미딘-2-일리덴아미노)-벤조일아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산,
    (S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]메틸]페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질우레이도)티아졸-4-카르보닐]아미노]아세틸아미노]-숙신아믹산; 및
    (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산,
    (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-프로피오닐아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]에톡시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산; 및
    (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-아세틸술파닐-에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로피오닐아미노]프로폭시]-페닐]-3-[2-[[2-(3-벤질-우레이도)-티아졸-4-카르보닐]-아미노]-아세틸아미노]-숙신아믹산.
  14. 제 1 항에 있어서, (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-페닐-3-일-프로피온산인 화합물.
  15. 제 1 항에 있어서, 3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-페닐-3-일-프로피온산인 화합물.
  16. 제 1 항에 있어서, (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-3-피리딘-3-일-프로피온산인 화합물.
  17. 제 1 항에 있어서, (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아세틸술파닐-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-프로피오닐아미노)-프로폭시]-벤질}-우레이도]-티아졸-4-카르보닐)-아미노}-아세틸아미노]-3-피리딘-3-일-프로피온산인 화합물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증, 암 또는 대사성 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  20. 염증, 암 또는 대사성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한, 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  21. 염증, 암 또는 대사성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  22. 본원에 기술된 바와 같은 발명.
KR1020147023904A 2012-01-27 2013-01-22 알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체 KR20150009952A (ko)

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