KR20150008825A

KR20150008825A - 아이소쿼사이트린을 함유하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물 및 아이소쿼사이트린의 경피 흡수를 증진시키는 리포좀

Info

Publication number: KR20150008825A
Application number: KR1020140182129A
Authority: KR
Inventors: 박수남; 김정은; 이혜진; 임명선; 박민아; 조나래; 구현아; 박수아; 한샛별
Original assignee: 서울과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2015-01-23

Abstract

본 발명은 여뀌 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 여뀌 추출물의 피부 흡수 능력을 증진시키는 피부 전달 시스템에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분의 함유하여 산화적 스트레스에 의한 산화적 손상으로부터 피부 보호 기능을 증진시킴으로써 피부 장벽을 강화시킬 수 있는 화장료 조성물 및 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분의 피부 흡수 능력을 최대화시키기 위한 에토좀 또는 탄성 리포좀에 관한 것이다.

Description

아이소쿼사이트린을 함유하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물 및 아이소쿼사이트린의 경피 흡수를 증진시키는 리포좀{Cosmetic composition for reinforcing skin barrier containing isoquercitrin, and the liposome for enhancing transdermal delivery of isoquercitrin}

많은 피부병은 태양 자외선에의 노출과 관련이 있다. 자외선은 피부암, 광노화 및 이들과 관련된 여러 가지 피부 질환을 유발한다. 자외선에 노출된 피부에서는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 활성산소는 노화, 특히 피부노화의 원인 물질로 작용하고 있다. 이들은 정상적인 대사과정이나 질병상태, 그리고 스트레스를 받을 때도 생성된다. 활성산소에 대항하여 피부에는 활성산소를 제거하는 항산화 방어 시스템이 있다. 그러나 이들 방어 시스템은 자외선 양이 많으면 압도당할 수 있다. 피부세포 및 조직 손상을 주도하는 가장 반응성이 큰 활성산소는 ¹O₂과 ·OH 등으로 알려져 있다. 이들은 항산화효소와 비효소적 항산화제들로 구성된 항산화 방어 시스템을 파괴함으로써 산화제/항산화제 균형을 산화상태 쪽으로 기울게 하고 결국에는 탄력감소, 주름 및 기미·주근깨 등의 피부노화를 가속화시킨다. 피부노화를 지연시키고 억제시키기 위해서는 생성된 활성산소를 효율적으로 제거하고 활성산소로부터 세포 및 조직을 보호할 수 있는 항산화 방어 시스템 구축이 반드시 필요하다(L. Packer, Utraviolet radiation (UVA, UVB) and skin antioxidants, In: Free radical damage and its control, (C. A. Rice-Evans and R. H. Burdon, eds), Elsevier Science B.V., 239 (1994); K. Scharffetter-Kochanek, Photoaging of the connective tissue of skin: Its prevention and therapy, In: Antioxidants in disease mechanisms and therapy, Advances Pharmacology, (H. Sies, eds) (1997).; 및 J. J. Thiele, C. O. Barland, R. Ghadially, P. M. Elias, Permeability and antioxidant Barriers in aged epidermis, Skin Aging (B. A. Gilchrest, J. Krutman, eds), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65 (2006))

한편, 최근에 생리활성 성분들의 피부 흡수능 향상을 위한 연구 중에서 리포좀을 이용한 연구들이 많은 관심을 받고 있다. 리포좀은 생체 친화성이 높고, 다양한 활성 물질을 생체 내로 전달할 수 있다는 장점을 가지고 있어서 의약품이나 화장품 분야에서 널리 사용되어 왔다(E. J. An, C. K. Kang, J. W. Kim, and B. S. Jin, Lipid-based vesicles as transdermal delivery system, KIC News, 13(4), 24 (2010); 및 M. M. A. Elsayed, O. Y. Abdallah, V. F. Naggar, and N. M. Khalafallah, Lipid vesicles for skin delivery of drugs: Reviewing three decades of research, Int . J. Pharm ., 332, 1 (2007)).

그러나, 최근 리포좀을 이루고 있는 지질 이중층 막의 물리적 불안정성이나 낮은 포집 효율, 그리고 제형 내에서의 낮은 유화 안정성 등에 대하여 문제가 제기되고 있으며(M. M. A. Elsayed, O. Y. Abdallah, V. F. Naggar, and N. M. Khalafallah, Deformable liposomes and ethosomes: Mechanism of enhanced skin delivery, Int . J. Pharm ., 332, 60 (2007); 및 E. Touitou, N. Dayan, L. Bergelson, B. Godin, and M. Eliaz, Ethosomes - novel vesicular carriers for enhanced delivery: characterization and skin penetration properties, J. Control. Release, 65, 403 (2000)), 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 시도들도 이루어지고 있다.

예를 들면, 기능성 소재들의 피부 투과성을 개선시키기 위한 목적으로 막이 유연하게 변형되어 각질세포 사이의 좁은 틈을 더 잘 통과하도록 더 유연하고 탄성이 있는 새로운 베지클(vesicle)들이 개발되고 있으며, 이러한 예로 에토좀(ethosome) 및 탄성 리포좀(elastic liposome) 등이 있다.

에토좀은 인지질을 에탄올에 녹여서 만드는 베지클로서, 생체 내 물질인 인지질로 만들어지기 때문에 생체 친화성이 높고, 다양한 활성 물질을 생체 내로 전달할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

또한, 탄성 리포좀은 인지질과 계면활성제로 이루어진 지질 이중층 구조로 되어 있는 것으로서, 계면활성제의 작용으로 베지클의 지질 이중층 막이 가변형성을 갖게 되어 외부에서 스트레스가 가해졌을 때 쉽게 변형될 수 있다.

본 발명자들은 여뀌(Persicaria hydropiper L.) 추출물의 효능에 대하여 연구한 결과, 여뀌 추출물 및 이의 효능 성분이 매우 우수한 세포 보호 효과를 가지며, 또한 특정 조건의 에토좀 및 탄성 리포좀을 제조하여 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 담지시킬 경우 매우 우수한 경피 흡수율을 가져 효능을 극대화할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 함유하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 피부에 보다 효과적으로 전달할 수 있는 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 함유하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 포집한 에토좀 및 탄성 리포좀을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 자외선 등에 의한 산화적 스트레스로부터 피부를 보호하는 능력이 우수하여 피부 장벽 기능을 복원하고 강화하는데 효과적이며, 또한 본 발명에 의한 경피 흡수 전달 시스템을 사용하게 되면, 다양한 피부 활성 효능을 가지는 여뀌 추출물 및 이의 효능 성분을 보다 높은 효율로 피부에 흡수시킴으로써 유효성분의 동일한 양을 사용하더라도 더 높은 항산화 효과, 미백 효과 등의 효능을 제공할 수 있다.

도 1은 여뀌 추출물의 제조 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 여뀌 추출물로부터 분리한 아이소쿼사이트린을 TLC를 나타낸 것이다. 용리액으로서 에틸 아세테이트:클로로포름:포름산:증류수를 8:1:1:1(v/v)의 비율로 혼합한 것을 사용하였으며, ①은 여뀌 추출물(에틸 아세테이트 분획)을 나타내고, ②는 아이소쿼사이트린을 나타낸다.
도 3은 로즈벵갈(rose-bengal)의 존재 하에서 사람 적혈구의 용혈 정도로 여뀌 추출물(에틸 아세테이트 분획), 아이소쿼사이트린 및 (+)-α-토코페롤의 세포 보호 효과를 나타낸 것이다(대조군의 τ₅₀은 31.0±0.30분).
도 4는 여뀌 추출물과 아이소쿼사이트린의 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 5는 UVB 조사선량에 따른 HaCaT 세포의 생존율을 나타낸 것이다. 세포를 UVB 조사로 노출시키고 세포독성 수준을 MTT로 측정하였다(대조군: UVB 노출 없음).
도 6은 HaCaT 세포 시스템에서 UVB로 유도된 세포 손상에 대한 여뀌 추출물(에틸 아세테이트 분획)과 아이소쿼사이트린의 세포 생존 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 여뀌 추출물의 농도에 따른 에토좀의 크기를 나타낸 것이다.
도 8은 아이소쿼사이트린의 농도에 따른 에토좀의 크기를 나타낸 것이다.
도 9는 2% 레시틴 및 20% 에탄올로 이루어진 시스템에서 상이한 농도의 아이소쿼사이트린으로 처리한 에토좀의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 10은 에토좀 제조 2주 후 아이소쿼사이트린의 농도에 따른 에토좀의 크기를 나타낸 것이다.
도 11은 에토좀 제조 2주 후 아이소쿼사이트린의 농도에 따른 에토좀의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 12는 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 시간에 따라 피부에 누적 투과된 여뀌 추출물의 양을 나타낸 것이다.
도 13은 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 24시간 후 각질층에 남아있는 여뀌 추출물의 양을 나타낸 것이다.
도 14는 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 여뀌 추출물의 총 피부 투과량을 나타낸 것이다.
도 15는 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 시간에 따라 피부에 누적 투과된 아이소쿼사이트린의 양을 나타낸 것이다.
도 16은 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 24시간 후 각질층에 남아있는 아이소쿼사이트린의 양을 나타낸 것이다.
도 17은 에토좀, 에탄올 용액, 리포좀 및 증류수의 사용시 아이소쿼사이트린의 총 피부 투과량을 나타낸 것이다.
도 18은 1주일 동안 여뀌 추출물을 함유하는 탄성 리포좀 제형의 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 탄성 리포좀에 포집된 여뀌 추출물의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 20은 탄성 리포좀에 포집된 아이소쿼사이트린의 포집 효율을 나타낸 것이다.
도 21은 피부 일정 면적에 대한 시간별 여뀌 추출물의 투과량을 나타낸 것이다.
도 22는 24시간 후 각질층에 존재하는 여뀌 추출물(Tape), 각질층을 제외한 표피와 진피에 존재하는 여뀌 추출물(Skin), 그리고 피부를 통과하여 수용체 상에 존재하는 여뀌 추출물(Transdermal)의 함량을 나타낸 것이다.
도 23은 피부 일정 면적에 대한 시간별 아이소쿼사이트린의 투과량을 나타낸 것이다.
도 24는 24시간 후 각질층에 존재하는 아이소쿼사이트린(Tape), 각질층을 제외한 표피와 진피에 존재하는 아이소쿼사이트린(Skin), 그리고 피부를 통과하여 수용체 상에 존재하는 아이소쿼사이트린(Transdermal)의 함량을 나타낸 것이다.

본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 유효성분으로 함유함으로써 피부 장벽기능을 강화시킬 수 있는 화장료 조성물을 제공하며, 특히 상기 효능 성분은 아이소쿼사이트린임이 바람직하다.

또한, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 효과적으로 피부에 전달할 수 있는 에토좀 및 탄성 리포좀을 제공한다.

피부 장벽은 자외선 등으로부터 유도된 산화적 스트레스에 의하여 붕괴되고, 이로써 피부 노화가 가속화되므로, 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스에 의한 산화적 손상으로부터 피부 장벽기능을 복원하고 이를 강화시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있게 된다.

본 발명에서 사용하는 여뀌(Persicaria hydropiper L.)는 북반구 온대 및 난대지방에 걸쳐 분포하는 마디풀목 마디풀과의 1년생 초본으로 흔히 습지 또는 물가에서 야생한다. 줄기는 40~100cm 정도로 자라고 가지가 많이 갈라지며 털이 없고, 어긋나게 달리는 잎은 잎자루가 없는 피침형으로 양끝이 좁고 표면에 털이 거의 없으며, 가장자리는 밋밋하고 뒷면에 선점이 산재한다. 6~9월에 가지나 줄기 끝에서 붉은빛을 띠는 백록색의 꽃이 수상화서로 달린다. 수과인 열매는 꽃받침에 싸여 검게 익는다. 꽃, 잎, 열매는 식용으로 사용할 수 있는데, 씹으면 매운맛이 난다. 지혈작용이 있어 자궁출혈, 치질출혈 및 그 밖의 내출혈에 사용하며, 잎과 줄기는 항균작용이 뛰어나고, 혈압을 내려주며 소장과 자궁의 긴장도를 강화시킨다.

한편, 플라보노이드는 식물계에 널리 존재하는 폴리페놀류의 물질로, 항바이러스, 항염증, 항산화 효과 등 다양한 생리활성을 갖으며 일반적으로 배당체 형태로 식물 조직에 존재하며, 대표적인 플라보노이드로는 쿼사이트린(3,3',4',5,7- penta-hydroxyflavone)이 있다. 이는 강력한 항산화 작용, 항염증, 항암, 항노화, 동맥 경화증 완화 등의 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 아이소쿼사이트린(quercetin 3-Ο-β-glucopyranoside)은 쿼사이트린의 배당체이다(화학식 1). 아이소쿼사이트린은 항알러지, 항염증 및 항산화 작용 등 생물학적 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들은 여뀌로부터 분리한 아이소쿼사이트린 및 여뀌 추출물이 현저한 항산화 활성을 가지고, UVB 조사에 의한 HaCaT 세포의 손상에 있어서도 큰 세포 보호 효과가 있음을 확인한 바 있다[J. E. Kim, H. J. Lee, M. S. Lim, M. A. Park, and S. N. Park, Cellular protective effect and liposome formulation for enhanced transdermal delivery of Persicaria hydropiper L. Extract, J. Soc . Cosmet . Scientists Kroea , 38(1), 15 (2012)].

본 발명에서 사용하는 여뀌 추출물은 통상적인 식물 추출법으로 제조할 수 있으며, 추출 부위는 특별히 한정되지 않고 전초 또는 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 등의 여러 부위에서 추출할 수 있다. 또한, 바람직하게는 추출 용매로서 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출하는 것이 적당하다. 또한 상기 유기 용매로는 메탄올, 에탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 헥산 가운데 선택된 1종 이상의 용매를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출 용매를 이용한 추출 방법으로는 일반적인 식물 추출 방법, 예컨대, 열수추출 또는 유기 용매 추출 등의 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 여뀌의 건조물 또는 그 분쇄물을 상기 추출 용매에 투입하고 필요에 따라 교반하면서 4~30℃에서 0.5~30일간 침적시키거나 30~70℃에서 2~72시간 동안 가열하여 추출하는 것이 적당하다. 추출에 사용되는 용매의 양은 추출 원료 대비 5~20배(중량비)인 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 리포좀은 상기 용매를 이용하여 추출한 여뀌 추출물을 그대로 유효성분으로 함유할 수 있으며, 이들 추출물을 다시 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축하여 얻은 건조 분말 형태로도 함유할 수도 있다.

또한 본 발명에 의한 리포좀은 상기의 여뀌 추출물을 감압 농축하여 얻어진 건조 분말에 1~10배 부피량의 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물을 단계적으로 처리하여 얻어진 분획들을 유효성분으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 여뀌 추출물을 감압 농축하여 얻어진 건조 분말을 물에 분산시킨 다음 동량 또는 1~10배 부피량의 n-헥산을 처리하여 분획하고 수득한 물층은 다시 n-헥산을 처리한 것과 동일한 방법으로 에틸아세테이트 및 부탄올을 단계적으로 처리하여 분획한다. 이 때 각각의 n-헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층 및 최종적으로 얻어진 물층을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압농축한 후 각각의 건조 분말을 수득하여 이를 유효성분으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 여뀌 추출물에 포함되어 있는 효능 성분을 이용할 수 있으며, 이는 여뀌 추출물로부터 공지된 방법을 이용하여 분리할 수도 있고, 시판되는 것을 이용할 수도 있다. 바람직하게, 여뀌 추출물에 포함되어 있는 효능 성분은 아이소쿼사이트린(isoquercitrin)이다.

또한, 본 발명은 여뀌 추출물 또는 이에 포함된 효능 성분의 경피 흡수율을 증진시키기 위한 시스템으로서 여뀌 추출물 또는 여뀌 추출물에 포함된 효능 성분을 담지한 리포좀을 제공하며, 그 중에서도 특히 에토좀 및 탄성 리포좀을 제공한다.

에토좀의 제조에 사용되는 에탄올은 피부 투과 증진작용이 있는 것으로 잘 알려져 있으며, 에토좀은 리포좀과 비교하여 베지클의 피부 친화도가 높은 것으로 보고되고 있다. 이러한 특징에 의해 에토좀은 활성 물질의 피부 전달에 더 효과적이며, 피부의 더 깊숙한 곳까지 활성 물질을 전달할 수 있다(V. Dubey, D. Mishra, T. Dutta, M. Nahar, D. K. Saraf, and N. K. Jain, Dermal and transdermal delivery of an anti-psoriatic agent via ethanolic liposmoes, J. Control. Release, 123, 148 (2007); 및 V. Dubey, D. Mishra, and N. K. Jain, Melatonin loaded ethanolic liposomes; physicochemical characterization and enhanced transdermal delivery, Eur . J. Pharm . Biopharm ., 67, 398 (2007)).

본 발명의 에토좀은 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린을 피부로 전달하는 능력을 고려할 때, 여뀌 추출물의 경우에는 사용한 에토좀이 분산되어 있는 용매의 부피에 대하여 0.04%(w/v)의 농도인 것을 담지하는 것이 바람직하고, 아이소쿼사이트린의 경우에는 에토좀이 분산되어 있는 용매의 부피에 대하여 0.03%(w/v)의 농도인 것을 담지하는 것이 바람직하다.

또한, 탄성 리포좀은 외부에서 스트레스가 가해졌을 때 쉽게 변형될 수 있으므로, 일반 리포좀보다 각질층을 더 잘 통과할 수 있으며, 피부 내에 활성 물질을 더 많이 침투시킬 수 있다(G. Ceve, A. Schatzlein, and H. Richardsen, Ultradeformable lipid vesicles can penetrate the skin and other semipermeable barriers unfragmented. Evidence from double lable CLSM experiments and direct size measurements, Biochim . Biophys . Acta, 1546, 21 (2002)). 기존에는 계면활성제로서 소듐 콜레이트, Tween 80, Span 80, 디포타슘 글리시리지네이트(dipotassium glycyrrhizinate) 등이 탄성 리포좀의 제조에 일반적으로 사용되었으나, 최근에는 화장품 원료의 안전성에 대한 관심 증대로 PEG(polyethylen glycol)이 함유되지 않은 계면활성제의 사용이 증가하고 있으며, 이러한 계면활성제의 예로는 Tego^® care 450(폴리글리세릴-3 메틸글루코오스 디스테아레이트(polyglyceryl-3 methylglucose distearate)) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 탄성 리포좀에 있어서, 인지질과 계면활성제의 중량 비율이 이에 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 여뀌 추출물을 담지하는 경우에는 95:5이고, 바람직하게 아이소쿼사이트린을 담지하는 경우에는 85:15이다.

본 발명의 탄성 리포좀은 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린을 피부로 전달하는 능력을 고려할 때, 탄성 리포좀이 분산되어 있는 용매의 부피에 대하여 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 농도가 0.1%(w/v)인 것을 담지하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 에토좀 및 탄성 리포좀과 같은 리포좀은 피부 투과율을 높이게 되므로, 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분을 동일함량으로 사용하더라도 피부 흡수율이 개선되어 보다 효과적으로 피부에 작용할 수 있게 된다.

본 발명의 화장료 조성물은 여뀌 추출물 또는 이의 효능 성분이 담지되어 있는 에토좀 또는 탄성 리포좀을 조성물 총 중량에 대하여 0.5~10중량%의 양으로 함유한다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 당업계에서 통상적으로 사용되는 첨가물 또는 부가물 등을 더 첨가하여 스킨, 스킨토너, 스킨소프트너, 스킨로션, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 세럼, 컨센트레이트, 팩, 마스크, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 파운데이션, 메이크업베이스, 팩트, 루스파우더, 프레스드파우더, 콤팩트, 아이섀도우, 아이라이너 또는 립스틱 등으로 제형화될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[참고예 1] 여뀌 추출물의 제조

건조된 여뀌(강원도 홍천군에서 채취한 것을 경동시장을 통하여 구입) 100g을 잘게 자른 후, 50% 에탄올 2L를 이용하여 일주일 동안 실온에서 혼합하면서 침적시킨 다음 여과하였다. 이 추출물을 감압·농축한 후 헥산을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 에틸아세테이트를 첨가한 후 얻은 에틸아세테이트 분획을 감압·농축하여 파우더를 얻었으며(도 1 참조), 이를 시험에 사용하였다.

[참고예 2] 아이소쿼사이트린의 분리

상기 참고예 1에서 제조한 여뀌 추출물로부터 박막크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분리하였고, 확인은 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하였다.

여뀌 추출물에서 아이소쿼사이트린의 분리는 분취 TLC(preparative TLC)를 이용하여 얻었으며, TLC의 전개용매는 에틸 아세테이트:클로로포름:포름산:증류수가 8:1:1:1의 비율인 것을 사용하였다.

TLC에서 여뀌 추출물은 총 6 개의 띠를 나타내었으며, 이는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 ①은 여뀌 추출물 중 에틸아세테이트 분획을 나타내는 것이고, ②는 아이소쿼사이트린을 나타내는 것이다.

아이소쿼사이트린의 성분 확인을 위하여 HPLC를 이용하였고, HPLC는 2% 아세트산과 50% 아세토니트릴 용액에 0.5% 아세트산의 농도로 하여 기울기 용리법으로 분리하였으며, 플라보노이드 표준물질의 R_f 수치와 발색법을 이용하여 확인하였다. 분리된 성분 중에서 R_f 값이 0.27인 아이소쿼사이트린은 여뀌 추출물 중 함량이 가장 많은 주요 성분임을 자외선-가시광선 분광기(UV-visible spectrophotometer), NP-PEG(NP-2-aminoethyl diphenylborinate PEG-Polyethylene glycol) 발색법 및 IR 등의 분광학적 방법을 통하여 확인하였다.

분리된 아이소쿼사이트린은 다시 정제하여 실험에 사용하였다.

[시험예 1] 광용혈(photohemolysis)법을 이용한 세포 보호 효과 측정

건강한 성인으로부터 얻은 적혈구를 채혈 즉시 헤파린이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 분리한 적혈구는 0.9% 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 3회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 4℃의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 12시간 이내에 행하였다. 광용혈 방법은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 10⁷ 세포수/mL이었다.

1.5 x 10⁷ 세포수/mL 적혈구 현탁액 3.5mL를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시험 물질로서 아이소쿼사이트린 또는 여뀌 추출물을 각각 50μL씩 첨가하였으며, 이 때 아이소쿼사이트린 및 여뀌 추출물의 농도는 각각 5μg/mL에 해당하였다. 또한, 이때 비교를 위하여 양성대조군으로서 (+)-α-토코페롤을 동량으로 처리한 것을 사용하였다. 시험 물질을 첨가한 적혈구 현탁액을 암소에서 30분 동안 전배양(pre-incubation)시킨 후, 광증감제로 로즈벵갈(rose-bengal)(12μM) 0.5mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 15분 동안 광조사하였다.

광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50cm × 20cm × 25cm 크기의 상자 안에 20W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15분 동안 광을 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(후배양(post-incubation)) ¹O₂으로 유도된 적혈구의 시간에 따른 파괴정도를 15분 간격으로 700nm에서 투광도(% transmittance)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 20℃의 항온실에서 행하였다. 아이소쿼사이트린이 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ₅₀을 구하여 비교하였다. 적혈구세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ₅₀)은 활성산소에 의한 세포 손상에 있어서 세포 보호 활성이 클수록 크게 나타난다. 이때, 광조사를 하지 않고, 시험물질을 처리하지 않은 적혈구를 음성대조군으로 사용하였다. 결과는 도 3에 나타내었으며, 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

음성대조군은 τ₅₀이 31.0 ± 0.30분으로서 오차 범위가 ± 1분 이내로 나타나 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다. 로즈벵갈을 첨가하고 광조사를 하지 않았을 경우와 로즈벵갈을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120분까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다.

도 3을 보면, 아이소쿼사이트린은 5μg/mL에서 τ₅₀이 351.5분이고, 여뀌 추출물은 5μg/mL에서 τ₅₀이 250.9분으로 측정되어, 지용성 항산화제이자 지질과산화반응의 라디칼 연쇄반응에서 차단제로 알려진 (+)-α-토코페롤(10μg/mL, τ₅₀= 34.0분)보다도 더 낮은 농도에서 훨씬 큰 세포 보호 활성을 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 아이소쿼사이트린은 여뀌 추출물의 에틸아세테이트 분획보다도 큰 보호 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린의 세포 독성 측정

여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린이 세포 독성이 미치는 농도를 조사하고, 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위하여 MTT 분석법을 시행하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소의 능력을 이용하여 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 포르마잔으로 변환시키는 방법으로 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.

구체적인 방법은 다음과 같다.

본 시험에서는 사람 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 사용하였으며, 이는 Dr. Fusenig(German Cancer Research Center, DKFZ)로부터 분양받았다. 세포배양에 사용된 배지인 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)은 10% 소태아혈청(PAA, Austria), 1% 페니실린-스트렙토마이신(PAA, Austria)을 혼합하여 사용하였다.

HaCaT 세포를 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 항온 배양하고, 시료인 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 3.125μg/mL, 6.25μg/mL, 12.5μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL의 농도로 처리하였다. 시료 처리 후, 24시간 동안 세포를 배양하고, PBS로 세척한 다음, 세포 생존율을 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide(MTT), Sigma, USA) 분석법으로 측정하였다. 구체적으로는 PBS로 세척한 세포에 MTT 용액(2μg/mL)을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후, 생성된 포르마잔을 DMSO에 녹여 570nm에서 측정하였다.

시료를 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 하여 100% 기준으로 잡아 상대적인 세포 생존율을 구하였으며, 세포의 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였고, 결과는 도 4에 나타내었다. 이 때 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

HaCaT 세포에 대한 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린의 세포 독성을 측정한 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 여뀌 추출물의 에틸아세테이트 분획은 50μg/mL 농도까지는 세포 생존율이 90% 이상으로 나타났으며, 여뀌 추출물에서 분리한 활성 성분인 아이소쿼사이트린의 경우는 25μg/mL 농도까지는 세포 생존율이 90% 이상으로 나타났으나, 50μg/mL 농도 이상에서는 세포독성이 보이기 시작했다.

따라서, 이후의 실험에서는 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린을 50μg/mL의 농도까지 사용하였다.

[시험예 3] UVB 조사선량에 따른 세포 생존율

본 시험에서도 상기 시험예 2와 동일한 HaCaT 세포를 사용하였다. 10% 소태아혈청(PAA, Austria), 1% 페니실린-스트렙토마이신(PAA, Austria)을 혼합한 DMEM을 사용하여 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 항온 배양한 후, 96 웰 플레이트에 5 × 10⁴ 세포수/웰로 부착시킨 HaCaT 세포를 PBS로 세척하고 자외선 조사기(CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP사(USA) 제품)를 이용하여 HaCaT 세포를 대상으로 UVB를 광량별(100~500mJ/cm²)로 조사하고 세포 생존율에 미치는 영향을 관찰하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 이 때 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

도 5를 보면, 100mJ/cm²의 UVB를 조사한 경우는 자외선을 조사하지 않은 경우와 같이 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않지만, 200mJ/cm²의 UVB를 조사한 경우의 세포 생존율은 80%를 나타내고, 300mJ/cm²에서는 63%, 400mJ/cm²에서는 36% 그리고 500mJ/cm²에서는 33%의 생존율을 나타냄을 알 수 있다.

상기 결과를 기초로 하여 하기 자외선으로부터 세포보호 효과를 측정하기 위한 시험에서는 자외선의 광량으로 400mJ/cm²를 이용하였다.

*[시험예 4] 자외선에 대한 HaCaT 세포 보호 효과

본 시험에서도 상기 시험예 2와 동일한 HaCaT 세포를 사용하였다. 10% 소태아혈청(PAA, Austria), 1% 페니실린-스트렙토마이신(PAA, Austria)을 혼합한 DMEM을 사용하여 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 항온 배양한 후, 96 웰 플레이트에 5 × 10⁴ 세포수/웰로 부착시킨 HaCaT 세포를 PBS로 세척하고 자외선 조사기(CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP사(USA) 제품)를 이용하여 UVB 400mJ/cm²를 조사하였다.

UVB 조사 전, 시료인 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 12.5μg/mL, 25μg/mL 및 50μg/mL의 농도로 처리하였다. 시료 처리 후, 24시간 동안 세포를 배양하고, PBS로 세척한 다음, 세포 생존율을 MTT 분석법으로 측정하였다. 구체적으로는 PBS로 세척한 세포에 MTT 용액(2μg/mL)을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후, 생성된 포르마잔을 DMSO에 녹여 570nm에서 측정하였다.

시료와 자외선 처리를 하지 않은 비조사군을 음성대조군으로 하여 100% 기준으로 잡아 상대적인 세포 생존율을 구하였으며, 세포의 생존율은 상기 수학식 1에 따라 계산하였고, 결과는 도 6에 나타내었다. 이 때 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

400mJ/cm²의 UVB를 조사한 후 세포 생존율은 UVB를 조사하지 않은 대조군에 비하여 36%의 생존율을 나타내었다. 그러나 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 자외선 조사 전 HaCaT 세포에 12.5μg/mL, 25μg/mL 및 50μg/mL의 여뀌 추출물을 처리한 경우 세포 생존율은 85%, 90% 및 92%로 나타나 여뀌 추출물은 자외선 조사에서 세포 사멸을 억제하는 효과가 매우 큰 것으로 나타났다. 또한 아이소쿼사이트린을 처리한 경우에도 12.5μg/mL, 25μg/mL 및 50μg/mL의 각각의 농도에서 세포 생존율이 87%, 90% 및 84%인 것으로 나타나 자외선에 대하여 세포 보호 활성이 매우 큼을 알 수 있다. 결과적으로 여뀌 추출물과 아이소쿼사이트린은 자외선 조사 전에 처리한 경우 자외선에 대항하여 큰 세포 보호 활성을 나타냄을 알 수 있다.

한편 아이소쿼사이트린의 경우 50μg/mL의 농도에서 세포 생존율이 동일 농도의 여뀌 추출물에서보다 8% 낮게 나타난 것은 아마도 50μg/mL에서 아이소쿼사이트린 자체의 세포에 대한 독성을 반영한 결과로 보인다.

[참고예 3] 에토좀의 제조

1. 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 제조

에토좀의 제조는 얇은 막 수화 방법을 사용하였다(Y. P. Fang, Y. H. Tsai, P. C. Wu, and Y. B. Huang, Comparison of 5-aminolevulinic acid-encapsulated liposome versus ethosome for skin delivery for photodynamic therapy, Int . J. Pharm., 356, 144 (2008); D. Paolino, G. Lucania, D. Mardente, F. Alhaique, and M. Fresta, Ethosomes for skin delivery of ammonium glycyrrhizinate: in vitro percutaneous permeation through human skin and in vivo anti-inflammatory activity on human volunteers, J. Control. Release, 106, 99 (2005); 및 Y. P. Fang, Y. B. Huang, P. C. Wu, and Y. H. Tsai, Topical delivery of 5-aminolevulinic acid-encapsulated ethosomes in a hyperproliferative skin animal model using the CLSM technique to evaluate the penetration behavior, Eur . J. Pharm . Biopharm ., 73, 391 (2009) 참조). L-α-포스파티딜콜린(Egg PC(phosphatidylcholine)(약 60%, Sigma (USA))(2% w/v, 에토좀이 분산되어 있는 용매인 최종 사용한 20% 에탄올 용액 기준))과 상기 참고예 1의 여뀌 추출물을 50mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 유기용매인 클로로포름 10mL를 넣어 녹였다. 이 때 여뀌 추출물은 유기 용매의 부피에 대하여 0.03% ~ 0.1%(w/v)의 양으로 녹였다. 그 후에 회전 증발기(rotary evaporator, BUCHI, Switzerland)를 이용해서 유기 용매를 증발시켰다. 유기 용매가 증발되면서 플라스크 벽면에 생긴 얇은 막에 상기 사용한 유기 용매와 동일 양(10mL)의 20% 에탄올 용액을 넣고 지질 전이 온도 이상에서 500rpm으로 교반하며 수화시켰다. 이렇게 얻어진 에토좀이 좀 더 균일한 크기의 베지클이 되도록 해 주기 위해서 유리 비드를 넣고 초음파 파쇄기(BRANSON, USA)를 30분 동안 가해주었다.

2. 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 제조

상기 1.에 기재한 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 제조 방법과 동일한 방법으로 여뀌 추출물 대신 아이소쿼사이트린을 사용하여 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀을 제조하였다.

다만, 사용한 아이소쿼사이트린은 유기 용매(클로로포름 10mL)의 부피에 대하여 0.01% ~ 0.05%(w/v)의 양으로 녹였다.

[참고예 4] 탄성 리포좀의 제조

1. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 제조

탄성 리포좀의 제조는 에토좀 제형 제조와 동일한 방법인 얇은 막 수화법에 의하여 다음과 같이 제조하였다. 50mL 둥근 바닥 플라스크에 여뀌 추출물 0.1%를 넣은 후, 계란 PC(phosphatidylcholine)와 계면활성제인 Tego^® care 450을 각각 다른 비율(100:0, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20)로 넣어 15mL의 클로로포름에 용해시켰다. 유기용매를 회전 증발기(BUCHI, Switzerland)를 이용하여 제거하면, 플라스크 벽면에 지질막이 형성되었다. 생성된 얇은 지질막을 인산완충액(1.6mM NaH₂PO₄·2H₂O,9.6mM Na₂HPO₄·12H₂O, pH 7.4) 10mL로 수화하여 탄성 리포좀을 형성시켰다. 이렇게 얻어진 탄성 리포좀의 입자 크기를 균일하게 하기 위하여 유리 비드를 넣고 30분 동안 초음파 파쇄기(BRANSON, USA)를 가해주었다. 탄성 리포좀에 포집되지 않은 여뀌 추출물의 에틸아세테이트 추출물은 1.2μm 필터를 이용하여 제거하였으며, 탄성 리포좀 제형의 최종 지질 농도는 최종 사용한 인산완충액 부피에 대하여 0.5wt%(w/v)이고, 여뀌 추출물의 농도는 인산완충액 부피에 대하여 0.1wt%(w/v)로 하였다.

2. 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 제조

상기 1.에 기재한 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 제조 방법과 동일한 방법으로 여뀌 추출물 대신 아이소쿼사이트린을 사용하여 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀을 제조하였다.

[시험예 5] 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 입자 크기 측정

1. 측정 방법

입자 크기가 작을수록 입체적으로 안정적일 수 있으므로, 사용하는 용매의 농도에 따른 에토좀을 제조하고 이들의 입자 크기를 확인하기 위하여, 2% 레시틴을 사용하고 에탄올의 농도를 달리하여 입자 크기 및 안정성 실험을 수행하였다. 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	2% 레시틴
20% EtOH	143.7nm
30% EtOH	192.3nm
40% EtOH	209.1nm

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 에탄올의 농도가 20%를 초과하게 되면 농도의 증가에 따라 입자의 크기도 증가한다.

따라서 작은 입자 크기를 가지는 20% 에탄올을 선정하여 하기 실험에 적용하였으며, 이를 바탕으로 다양한 농도의 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 첨가한 20% 에탄올 함유 에토좀을 제조하였다.

용액 중에 분산된 입자는 크기에 따라 브라운 운동을 하는데 이때 광을 조사하게 되면 큰 입자는 느리게 작은 입자는 빠르게 움직임을 나타낸다. 이때 이 움직임을 광전자상관법으로 해석함으로서 Einstein-stokes 식을 이용하여 입자의 크기가 구해지게 된다. 용매 중에 있는 리포좀 제형의 크기는 빛의 산란강도를 이용하여 입자 크기를 분석하는 입도분석기 Otsuka ELS-Z(OTSUKA, Japan)를 이용하여 측정하였다. He-Ne 레이저를 이용하여 측정하였으며 입자 크기는 누적분석법을 이용하였다. 또한 입경분포 해석방법은 Contin을 이용하여 입경분포를 구하였다.

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student′s t-test를 행하였다.

2. 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 크기

상기 참고예 3에 나타낸 방법으로 제조한 여뀌 추출물의 함량을 0.03%, 0.04%, 0.05% 및 0.10%로 담지하는 에토좀에 대하여 입자 크기를 측정하였으며, 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7을 보면, 0.03%, 0.04%, 0.05% 및 0.10%의 여뀌 추출물이 함유된 에토좀을 제조하였을 때 그 중에서 0.04% 여뀌 추출물 함유 에토좀의 경우 입자 크기가 대략 173.0nm로 단분산 형태의 안정한 입도 분포를 나타냄을 알 수 있다. 한편, 0.10%의 여뀌 추출물을 함유하는 에토좀의 경우도 단분산 형태로 입자 크기는 572.0nm를 나타냈으나 제조 후 다음날 층 분리가 발생해 불안정함을 나타내었다. 그 외에 0.03% 및 0.05%인 경우는 에토좀 제조 후 즉시 다분산 형태를 나타냈고 안정한 에토좀은 형성되지 않았다.

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 크기

상기 참고예 3에 나타낸 방법으로 제조한 아이소쿼사이트린의 함량을 0.01%, 0.02%, 0.03%. 0.04% 및 0.05%로 담지하는 에토좀에 대하여 입자 크기를 측정하였으며, 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8을 보면, 0.01%, 0.02%, 0.03%. 0.04% 및 0.05%의 아이소쿼사이트린이 함유된 에토좀을 제조하였을 때, 모든 입자 크기가 250nm 보다 작은 단분산 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 6] 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 포집 효율 측정

1. 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 포집 효율 측정

상기 참고예 3의 방법으로 제조한 0.04%의 여뀌 추출물을 담지하는 완성된 에토좀 현탁액에서 1mL를 취해 1.2μm 시린지 필터(Minisart CA 26mm)를 이용하여 포집되지 않은 여뀌 추출물을 제거하였다. 그 후 15~30mL의 에탄올을 이용하여 에토좀의 막을 파괴시켰다. 에탄올을 회전 증발기를 이용하여 증발시킨 후 다시 1mL의 에탄올을 넣어주었다. 그리고 에토좀 현탁액 속 에탄올에 녹아있는 여뀌 추출물의 양을 보정해주기 위해 동량의 여뀌 추출물을 20% 에탄올에 녹인 후 이 용액 역시 위와 동일한 방법으로 처리해주었다. 이렇게 준비된 시료를 UV를 이용해 여뀌 추출물의 최대 흡수파장인 360nm에서 측정하였다. UV를 이용해 나온 값을 하기 수학식 2에 대입하여 에토좀의 포집 효율을 계산하였다.

C_P: 1.2μm 시린지 필터를 통과한 여뀌 추출물 농도

C_E: 20% 에탄올 속에 녹아 있는 여뀌 추출물 농도

C₀ : 처음 넣어준 여뀌 추출물 농도

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student′s t-test를 행하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.

	0.04% 여뀌 추출물을 담지한 에토좀
입자 크기(nm)	제조 직후	173.0 ± 103.4
	제조 후 1주일	190.1 ± 136.9
포집 효율(%)	55.58 ± 7.33

상기 표 2는 0.04% 여뀌 추출물을 담지하는 에토좀의 포집 효율과 여뀌 추출물 함유 에토좀을 제조 직후와 제조 후 1주일에 입자 크기를 측정하여 시간에 따른 입자 크기 변화 및 안정성을 측정한 결과를 보여주고 있다. 0.04% 여뀌 추출물을 담지하는 에토좀의 입자 크기는 173.0±103.4nm, 포집 효율은 55.58±7.33%임을 확인하였다.

일주일 후에 0.04% 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 입자 크기는 190.1±136.9nm로 나타났으며 초기에 비해 입자 크기가 9.8% 증가하였다. 그러나 일주일 후에도 입자 분포가 단 분산형태를 유지하였고 침전이나 분리 현상이 관찰되지 않아 안정한 에토좀이 형성되었음을 알 수 있었다.

따라서 일정한 입도 분포와 적절한 입자 크기를 유지하는 안정성이 확인 되었으므로, 0.04% 여뀌 추출물을 포집시킨 에토좀을 하기 피부 투과 실험에 적용하였다.

2. 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 포집 효율 측정

상기 참고예 3에 나타낸 방법으로 제조한 아이소쿼사이트린의 함량을 0.01%, 0.02%, 0.03%. 0.04% 및 0.05%로 담지하는 완성된 에토좀 현탁액에서 1mL를 취해 1.2μm 시린지 필터(Minisart CA 26 mm)를 이용하여 포집되지 않은 아이소쿼사이트린을 제거하였다. 그 후 15~30mL의 에탄올을 이용하여 에토좀의 막을 파괴시켰다. 에탄올을 회전 증발기를 이용하여 증발시킨 후 다시 1mL의 에탄올을 넣어주었다. 이렇게 준비된 시료를 HPLC를 이용해 아이소쿼사이트린의 농도를 측정하였다. HPLC를 이용해 나온 값을 하기 수학식 3에 대입하여 에토좀의 포집 효율을 계산하였다.

C_F: 1.2μm 시린지 필터를 통과하지 못한 아이소쿼사이트린 농도

C₀ : 처음 넣어준 아이소쿼사이트린 농도

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student′s t-test를 행하였으며, 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9를 보면 0.03% 농도 이하에서는 포집 효율이 높은 반면, 0.04% 이상의 농도에서는 함량이 높아질수록 포집 효율이 감소하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 아이소쿼사이트린의 안정성을 확인하기 위하여 1주일 간격으로 2주 동안 입자 크기와 포집 효율을 측정하였으며, 이의 결과는 도 10 및 11에 나타내었다.

도 10을 보면, 아이소쿼사이트린 농도가 0.04% 이상에서는 시간이 경과함에 따라 입자 크기가 커지거나 불안정한 다분상 형태가 나타남을 확인1할 수 있으며, 도 11을 보면 아이소쿼사이트린 농도가 0.03%인 것을 제외한 다른 농도에서는 포집 효율이 감소하는 경향을 나타냄을 확인할 수 있다.

또한 0.03%의 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀은 222.85±0.85nm 입자크기와 82.26% 포집 효율을 나타내었다. 따라서 0.03% 아이소쿼사이트린을 함유한 에토좀은 입자 크기와 포집 효율에 큰 변화가 없었고 안정함을 확인하였다.

따라서 일정한 입도 분포와 포집 효율, 및 적절한 입자 크기를 유지하는 안정성이 확인 되었으므로, 0.03% 아이소쿼사이트린을 포집시킨 에토좀을 하기 피부 투과 실험에 적용하였다.

[시험예 8] 에토좀의 시험관내 피부 투과 실험(Franz diffusion cell)

1. 측정 방법

에토좀이 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 Franz diffusion cell과 상기 참고예 3의 방법으로 제조한 에토좀을 이용하여 피부 투과 실험을 진행하였다. 피부 투과 실험에 사용한 쥐의 피부는 경추탈골로 치사시킨 ICR 비근교계 알비노 마우스(outbred albino mice)(8주령, 암컷)의 등에서 적출하여 사용하였다. 적출한 피부는 피하지방과 조직을 제거한 후 사용하였다. 수용칸(receptor chamber)에 수용상(receptor phase)(HCO-60:에탄올:PBS = 2:20:78(w/w/w %)) 5mL를 채운 후 각질층이 위로 향하도록 공여체(donor)와 수용상 사이에 피부를 고정시켰다. 실험이 진행되는 동안 항온수조를 이용해 온도를 37±1℃로 유지하였다. 각 시료 0.2mL를 공여체를 통하여 피부 표면에 가한 후 시간에 따라 매 회 0.5mL의 수용상을 샘플링 포트(sampling port)를 통하여 채취하였다. 채취 직후 동량의 수용상을 수용칸에 보충하였다. 채취한 시료 속 여뀌 추출물의 양은 적절한 방법을 이용하여 측정하였다.

24시간 후 각질층과 피부에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 측정하기 위해 쥐의 피부를 PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후 수용상과 닿지 않은 부분을 잘라내고 남은 부분에 대해 테이프 스트리핑(tape stripping) 법을 이용해 각질층에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 따로 측정하였다. 각질층에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 측정하기 위해 테이프를 이용하여 피부의 각질층 부분을 3회 벗겨내었으며 이렇게 얻어진 테이프에 10mL의 에탄올을 넣고 1시간 동안 초음파 세척기를 이용하여 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 추출하였다. 그 후 회전증발기를 이용하여 에탄올을 증발시키고 추출된 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 0.5mL의 수용상에 녹여내었다. 테이프 스트리핑법을 거친 후 각질층이 제거 된 피부는 수술용 가위를 이용해 세절하였고 세절한 피부의 처리는 테이프와 동일하게 진행하였다. 이렇게 얻어진 시료 속 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양은 적절한 방법으로 측정하였다.

실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student′s t-test를 행하였다.

*2. 여뀌 추출물을 담지한 에토좀의 시험관내 피부 투과 실험

0.04% 여뀌 추출물을 담지한 20% 에탄올 함유 에토좀을 이용하여 상기 1.에 기술한 피부 투과 실험을 진행하였다. 이때, 대조군으로는 0.04% 여뀌 추출물만을 담지한 리포좀과 0.04% 여뀌 추출물을 녹인 에탄올 용액, 그리고 0.04% 여뀌 추출물을 증류수에 녹인 것을 사용하였다.

또한, 시료 속 여뀌 추출물의 양은 UV를 이용하여 360nm에서 측정하였으며, 결과는 도 12 내지 도 14에 나타내었다.

도 12를 보면, 시간에 따라 피부에 누적 투과된 여뀌 추출물의 양은 24시간 동안 에토좀 및 대조군으로 사용한 에탄올 용액에서 모두 시간 의존적으로 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 24시간 후의 피부 누적 투과량(Transdermal)은 에토좀이 50.08±1.01μg/cm²으로 가장 높고, 그 다음 에탄올 용액(42.82±1.40μg/cm²), 리포좀(23.91±0.93μg/cm²), 증류수(11.07±0.46μg/cm²) 순으로 나타났다.

또한 도 13을 보면, 24시간 후 각질층에 남아있는 여뀌 추출물의 양(Tape)은 에토좀(54.07±0.21μg/cm²) > 리포좀(41.11±0.15μg/cm²) > 에탄올 용액(29.59±0.07μg/cm²) > 증류수(2.67±0.04μg/cm²) 순으로 나타났고, 각질층을 제거한 피부에 남아있는 여뀌 추출물의 양(Skin) 또한 에토좀(13.26±0.11μg/cm²) > 리포좀(8.42±0.74μg/cm²) > 에탄올 용액(6.94±0.06μg/cm²) > 증류수(3.76±0.06μg/cm²) 순으로 나타남을 알 수 있다.

또한, 도 14를 보면, 피부 투과 실험에 사용한 여뀌 추출물의 양은 모든 제형에서 125.75μg/cm²이었고, 여뀌 추출물의 총 피부 투과량은 에토좀(117.41±1.28μg/cm²) > 에탄올 용액(79.34±1.43μg/cm²) > 리포좀(73.44±0.40μg/cm²) > 증류수(17.50±0.49μg/cm²) 순으로 나타남을 알 수 있다.

따라서 에토좀의 투과 효율은 93.37%로 거의 모든 여뀌 추출물이 투과가 된 것으로 나타났고, 에탄올 용액, 리포좀, 증류수에서 투과 효율이 각각 63.10%, 58.40%, 13.92%로 나타났으며, 이를 통해 0.04% 여뀌 추출물을 피부로 전달하는 능력은 에토좀이 가장 우수한 것으로 확인할 수 있다.

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 에토좀의 시험관내 피부 투과 실험

0.03% 아이소쿼사이트린을 담지한 20% 에탄올 함유 에토좀을 이용하여 상기 1.에 기술한 피부 투과 실험을 진행하였다. 이때, 대조군으로는 0.03% 아이소쿼사이트린만을 담지한 리포좀과 0.03% 아이소쿼사이트린을 녹인 에탄올 용액, 그리고 0.03% 아이소쿼사이트린을 증류수에 녹인 것을 사용하였다.

또한, 시료 속 아이소쿼사이트린의 양은 HPLC를 이용하여 측정하였으며, 결과는 도 15 내지 도 17에 나타내었다.

도 15를 보면, 시간에 따라 피부에 누적 투과된 아이소쿼사이트린의 양은 24시간 동안 에토좀 및 대조군으로 사용한 에탄올 용액에서 모두 시간 의존적으로 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 24시간 후의 피부 누적 투과량(Transdermal)은 에토좀이 65.48±0.95μg/cm²으로 가장 높고, 그 다음 리포좀(57.69±0.91μg/cm²), 에탄올 용액(39.1±1.26μg/cm²), 증류수(19.80±0.34μg/cm²) 순으로 나타났다.

또한 도 16을 보면, 24시간 후 각질층에 남아있는 아이소쿼사이트린의 양(Tape)은 에토좀(4.18±1.49 μg/cm²) > 에탄올 용액(2.31±1.3μg/cm²) > 증류수(1.98±0.05μg/cm²) > 리포좀(1.53±0.06μg/cm²) 순으로 나타났고, 각질층을 제거한 피부에 남아있는 아이소쿼사이트린의 양(Skin)은 에토좀(1.92±0.46μg/cm²) > 에탄올 용액(1.82±0.81μg/cm²) > 리포좀(1.50±0.04μg/cm²) > 증류수(1.44± 0.08μg/cm²) 순으로 나타났다.

또한, 도 17을 보면, 피부 투과 실험에 사용한 아이소쿼사이트린의 양은 모든 제형에서 125.75μg/cm²이었고, 아이소쿼사이트린의 총 피부 투과량은 에토좀(72.96±0.99μg/cm²) > 리포좀(66.93±0.75μg/cm²) > 에탄올 용액(41.98±1.75μg/cm²) > 증류수(23.22±0.47μg/cm²) 순으로 나타남을 알 수 있다.

따라서 에토좀의 투과 효율은 77.37% 로 나타났고, 에탄올 용액, 리포좀, 증류수에서 투과 효율은 각각 70.97%, 44.51%, 24.62%로 나타났다. 따라서 피부에 투과된 양과 시간을 살펴보았을 경우 0.03% 아이소쿼사이트린을 함유한 에토좀이 리포좀에 비하여 빠르고 좀 더 많은 양을 피부로 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.

[시험예 9] 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 입자 크기 측정

1. 측정 방법

상기 참고예 4에 나타낸 방법으로 탄성 리포좀을 제조하였으며, 제조된 리포좀 현탁액은 미니 압출기(mini extruder)(기공 크기가 80nm인 폴리카보네이트 막을 가짐)를 이용하여 압출시켜서 제조하였다.

용매 중에 있는 리포좀 제형의 크기는 빛의 산란강도를 이용하여 입자크기를 분석하는 입도분석기 Otsuka ELS-Z(OTSUKA, Japan)를 이용하여 측정하였다. He-Ne 레이저를 이용하여 측정하였으며 입자크기는 누적분석법을 이용하였다. 또한 입경분포 해석방법은 Contin을 이용하여 입경분포를 구하였다.

2. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 크기

탄성 리포좀의 구성 성분과 조성 및 압출 전과 후의 평균 입자 크기는 하기 표 3에 구체적으로 나타내었다.

제형 번호	PC^a ⁾: S^b ⁾ (%w/w)	여뀌 추출물 (%(w/v))	압출 전 크기 (nm)	압출 후 크기 (nm)
EL^c ⁾-1	100 : 0	-	161.3 ± 1.1	114.5 ± 9.1
EL^c ⁾-2	95 : 5	-	183.2 ± 6.2	185.4 ± 5.1
EL^c ⁾-3	90 : 10	-	121.6 ± 5.1	125.4 ± 5.1
EL^c ⁾-4	85 : 15	-	95.4 ± 6.1	96.7 ± 3.3
EL^c ⁾-5	80 : 20	-	137.3 ± 4.2	136.1 ± 1.6
ELP^d ⁾-1	100 : 0	0.1	178.6 ± 1.6	178.9 ± 10.0
ELP^d ⁾-2	95 : 5	0.1	176.5 ± 6.2	178.4 ± 0.1
ELP^d ⁾-3	90 : 10	0.1	172.9 ± 1.4	162.6 ± 3.1
ELP^d ⁾-4	85 : 15	0.1	105.5 ± 0.7	104.6 ± 1.2
ELP^d ⁾-5	80 : 20	0.1	107.1 ± 0.2	104.9 ± 2.6

a) PC:계란 포스파티딜콜린

b) S: 계면활성제(Tego^® care 450)

c) EL : 탄성 리포좀 제형(여뀌 추출물을 담지하지 않음)

d) ELP : 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀 제형

값은 평균 ± SD(n = 3)로 나타냄.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 빈 탄성 리포좀(EL-)의 경우 평균 입자 크기는 EL-1은 161.3nm, EL-2는 183.2nm로 측정되었고, 그 후 계면활성제의 농도가 증가할수록 입자 크기는 감소하는 경향을 보였으나 인지질과 계면활성제의 비율이 80:20인 EL-5의 경우는 입자 크기가 137.3nm로 나타났다. 여뀌 추출물이 함유된 탄성 리포좀(ELP-)은 계면활성제의 농도가 10%(w/w)까지는 입자 크기가 172.9~178.9nm로 단분산 형태의 거의 일정한 크기의 입도분포를 보여주었다. 계면활성제의 농도가 15%와 20%의 경우는 105.5~107.1nm로 입자 크기가 감소하는 경향을 나타내었다.

탄성 리포좀의 저장 기간에 따른 입자 크기 변화는 리포좀 막의 물리적 안정성을 평가하는데 중요하다. 일반적으로 리포좀 막이 불안정해지면 리포좀 입자 간의 간격이 좁아지게 되면서 입자 크기가 커지는 경향이 있는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 제조한 여뀌 추출물 함유 탄성 리포좀을 제조한 직후와 일주일 후(4℃에 보관)에 입자 크기에 변화가 있는지 알아보았다. 결과는 도 18에 나타내었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 제조 후 일주일이 경과된 탄성 리포좀의 입자 크기를 측정해본 결과 입자 크기는 제조 직후와 큰 차이가 없었고, 일주일 후에도 막이 깨지거나 또는 층 분리 현상이 관찰되지 않았다. 따라서 제조된 탄성 리포좀들은 일주일간 그 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다.

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 크기

탄성 리포좀의 구성 성분과 조성 및 압출 전과 후의 평균 입자 크기는 하기 표 4에 구체적으로 나타내었다.

제형 번호	PC^a ⁾: S^b ⁾ (%w/w)	아이소쿼사이트린 (%(w/v))	압출 전 크기 (nm)	압출 후 크기 (nm)
EL^c ⁾-1	100 : 0	-	161.3 ± 1.1	114.5 ± 9.1
EL^c ⁾-2	95 : 5	-	183.2 ± 6.2	185.4 ± 5.1
EL^c ⁾-3	90 : 10	-	121.6 ± 5.1	125.4 ± 5.1
EL^c ⁾-4	85 : 15	-	95.4 ± 6.1	96.7 ± 3.3
EL^c ⁾-5	80 : 20	-	137.3 ± 4.2	136.1 ± 1.6
ELI^d ⁾-1	100 : 0	0.1	195.75 ± 15.75	182.15 ± 3.45
ELI^d ⁾-2	95 : 5	0.1	290.85 ± 1.35	261.15 ± 0.45
ELI^d ⁾-3	90 : 10	0.1	303.05 ± 1.15	343.65 ± 11.15
ELI^d ⁾-4	85 : 15	0.1	341.2 ± 1.5	340.75 ± 13.95
ELI^d ⁾-5	80 : 20	0.1	251.65 ± 17.65	193.85 ± 7.05

a) PC:계란 포스파티딜콜린

b) S: 계면활성제(Tego^® care 450)

c) EL : 탄성 리포좀 제형(여뀌 추출물을 담지하지 않음)

d) ELI : 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀 제형

값은 평균 ± SD(n = 3)로 나타냄.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 아이소쿼사이트린이 함유된 탄성 리포좀(ELI-)은 계면활성제의 농도가 0~15%(w/w%)로 증가할수록 입자크기가 195.75nm에서 341.2nm로 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 실험에 사용된 Tego^®care 450은 비이온성 계면활성제로 음성 제타 포텐셜을 갖고 있는데, 이러한 음성 제타 포텐셜은 지질 이중층 사이의 반발력을 증가시켜 입자 크기를 증가시키기 때문인 것으로 판단된다.

그러나 계면활성제의 농도가 20%(w/w %)인 ELI-5의 입자 크기는 251.65nm로 다시 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 계면활성제의 비율이 일정 농도 이상으로 증가하게 되면 탄성 리포좀 외에도 마이셀이 형성되어 평균 입자 크기가 작게 측정되기 때문인 것으로 판단된다.

[시험예 10] 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 가변형성 측정

1. 측정 방법

계면활성제에 의한 리포좀 막의 가변형성은 탄성 리포좀 고유의 독특한 성질이자 다른 리포좀 제형과의 차이점이기도 하다. 이러한 탄성 리포좀은 지질막의 유동성이 증가되어 일반 리포좀보다 입자 크기가 더 큼에도 불구하고 쉽게 각질층을 통과할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 계면활성제의 함량을 증가시키면서 탄성 리포좀 제형의 가변형성 지수를 측정하였다.

제조된 탄성 리포좀의 가변형성 평가를 위해 미니 압출기를 사용하여 탄성 리포좀이 인공 투과장벽을 통과하는 정도를 측정하였다. 탄성 리포좀 현탁액을 0.2MPa의 압력을 1분 동안 가했을 때 0.08μm 크기의 기공을 갖는 폴리카보네이트 막을 통과하여 나온 리포좀 현탁액의 양을 측정하고 막을 통과한 리포좀 입자 크기를 측정하였다.

탄성 리포좀 막의 탄성 값은 하기 수학식 4에 따라 계산하였다.

여기서 J _flux 는 막을 통과한 리포좀의 양을 나타내고, r_v는 압출 후 리포좀 입자 크기, r_p는 막의 기공 크기를 말한다.

2. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 가변형성

상기 시험예 9에서 실험한 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 제형에 대하여 가변형성을 평가하였으며, 탄성 리포좀 제형의 가변형성 값에 대한 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

제형	가변형성 값
ELP-1	15.0 ± 1.2
ELP-2	16.4 ± 0.8
ELP-3	13.6 ± 0.4
ELP-4	5.3 ± 0.1
ELP-5	5.6 ± 0.2

여뀌 추출물을 담지한 ELP-2와 ELP-4를 비교해보면, 계면활성제 함량이 5%인 ELP-2의 입자 크기는 176.5nm로 계면활성제 함량이 15%인 ELP-4(105.5nm)보다 입자 크기가 크게 나왔다. 하지만, 가변형성 지수는 계면활성제 양이 적은 ELP-2가 16.4이고 계면활성제 양이 많은 ELP-4가 5.3으로 ELP-2의 가변형 지수가 훨씬 큼을 알 수 있다. 따라서, 계면활성제의 양이 일정 농도 증가하면 가변형 지수가 감소함을 알 수 있다.

이는 계면활성제의 농도가 어느 정도 증가하면 탄성 리포좀 내에 존재하는 계면활성제 이외에 용액 내에 별도의 보다 많은 마이셀이 형성된 결과 때문인 것으로 생각되고 있다. 따라서 ELP-4의 입자 사이즈는 작게 측정되었고, 또한 가변형성이 감소한 결과를 나타낸 것으로 판단된다. 이러한 결과는 계면활성제의 비율이 일정 이상이 되면 계면활성제가 탄성 리포좀 뿐만 아니라 마이셀을 형성하기 때문에 가변형성이 감소하는 결과를 나타낸다는 이전 보고와도 일치하는 결과임을 알 수 있다(S. Jain, N. Jain, D. Bhadra, A. K. Tiwary, and N. K. Jain, Transdermal delivery of an analgesic agent using elastic liposomes: preparation, characterization and performance evaluation, Curr Drug Deliv ., 2, 223 (2005)).

이러한 결과로 미루어 보아, 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 가변형성 지수는 계면활성제의 농도에 영향을 받는다는 것을 알 수 있다.

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 가변형성

상기 시험예 9에서 실험한 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 제형에 대하여 가변형성을 평가하였으며, 탄성 리포좀 제형의 가변형성 값에 대한 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

제형	가변형성 값
ELI-1	16.51 ± 0.63
ELI-2	34.05 ± 0.12
ELI-3	59.47 ± 3.86
ELI-4	59.89 ± 4.86
ELI-5	18.65 ± 1.35

ELI-1과 ELI-4를 비교해 볼 때, 계면활성제가 포함되지 않은 ELI-1(182.15nm)에 비해 계면활성제 함량이 15%인 ELI-4(340.75nm)의 입자크기가 훨씬 더 큼을 알 수 있다. 하지만 가변형성 지수를 비교해보면, ELI-1은 16.51, ELI-4은 59.89로 계면활성제의 함량이 많은 ELI-4의 가변형성 지수가 훨씬 큼을 확인할 수 있다.

이는 계면활성제 함량이 증가하게 되면 지질막의 유동성이 증가하여 탄성 리포좀의 가변형성이 증가하게 되기 때문이다. 그러나 계면활성제의 비율이 20%인 ELI-5의 경우 가변형성이 급격히 감소함을 알 수 있다. 이는 계면활성제의 비율이 일정 이상으로 증가하게 되면 용액 내에 탄성 리포좀 뿐만 아니라 마이셀이 형성되기 때문인 것으로 판단된다. 따라서 ELI-5의 경우에 마이셀 형성으로 인하여 가변형성 지수가 크게 감소하는 알 수 있다.

이러한 결과로 보아 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 가변형성 지수는 계면활성제의 농도에 영향을 받는다는 것을 알 수 있다.

[시험예 11] 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 포집 효율 측정

1. 측정 방법

완성된 탄성 리포좀 현탁액 일정량을 취하고 1.2μm 시린지 필터(Minisart CA 26mm)를 이용하여 탄성 리포좀 내 포집되지 않은 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 제거하였다. 그 후 15~30mL의 에탄올을 이용하여 탄성 리포좀의 막을 파괴시켰다. 에탄올은 회전 증발기를 이용하여 증발시킨 후 다시 1mL의 에탄올을 넣어주었다. 적절한 방법으로 탄성 리포좀에 포집된 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 정량하였다.

또한 농도별 여뀌 추출물 및 아이소쿼사이트린 각각의 검량선을 작성한 후 이들의 농도를 산출하였고, 탄성 리포좀의 포집 효율은 하기 수학식 5에 의해 계산하였다.

T : 처음 넣어준 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 농도

P : 1.2μm 시린지 필터를 통과하지 못한 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 농도

2. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 포집 효율

상기한 방법으로 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 포집 효율을 평가하였으며, 이 때 포집된 여뀌 추출물의 정량은 UV 분광기를 이용해 여뀌 추출물의 최대 흡수파장인 360nm에서의 흡광도를 구하여 이루어졌다. 평가 결과는 도 19에 나타내었다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 계면활성제가 없는 제형인 ELP-1의 경우 38.6%의 포집 효율을 나타내었으며, 계면활성제를 5% 포함하는 ELP-2 제형에서의 포집 효율이 68.8%로 실험한 제형 중에서 가장 큰 포집 효율을 나타내었다. 그러나 계면활성제의 농도가 10% 및 15%인 ELP-3와 ELP-4의 포집 효율은 각각 56.6%, 54.1%로 ELP-2 제형보다도 낮은 포집 효율을 나타내었다. 이는 위에서 설명한 탄성 리포좀의 가변 형성에서처럼 혼합 마이셀 형성이 포집 효율에도 영향을 미치는 것으로 판단된다.

다시 말해, 특정 농도 이상의 계면 활성제가 사용 되었을 때 마이셀이 형성되어 제형 내에 마이셀과 리포좀이 혼합되므로 리포좀의 포집 효율을 감소시켜서 오히려 피부에 자극을 일으킬 수도 있고 활성 물질의 피부 전달 시스템의 효율을 낮춘다는 이전의 보고와도 일치하는 결과를 나타내었다(S. Jain, N. Jain, D. Bhadra, A. K. Tiwary, and N. K. Jain, Transdermal delivery of an analgesic agent using elastic liposomes: preparation, characterization and performance evaluation, Curr Drug Deliv ., 2, 223 (2005); 및 C. Hofer, R. Hartung, R. Gobel, P. Deering, A. Lehmer, and J. Breul, New ultradeformable drug carriers for potential transdermal application of interleukin-2 and nterferon-alpha: theoretic and practical aspects, World J. Surg ., 24, 1187 (2000)).

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 포집 효율

상기한 방법으로 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 포집 효율을 평가하였으며, 이 때 포집된 여뀌 추출물의 정량은 HPLC를 이용해 이루어졌다. 평가 결과는 도 20에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 계면활성제가 포함되지 않은 ELI-1의 경우는 67.8%의 포집효율을 나타내었고, ELI-3과 ELI-4의 포집효율은 각각 57.50%, 54.30%로 확인되었는데, 이는 ELI-3과 ELI-4의 물리적 특성(입자크기, 가변형성 지수, 포집 효율)이 매우 유사함을 나타낸다.

한편 계면활성제가 포함된 ELI-2, 3, 4, 5의 경우 ELI-1보다 낮은 포집효율을 나타내었다. 이는 계면활성제의 농도가 증가하게 되면 탄성 리포좀과 혼합된 마이셀이 공존하게 되어 포집 효율이 감소한다는 보고와 일치한다. 이는 계면활성제의 농도가 일정 이상이 되면 탄성 리포좀의 포집효율을 감소시켜 유용한 피부전달 시스템으로서 이용될 수 없음을 나타낸다(S. D. Maurya, S. Aggarwal, V. K. Tilak, R. C. Dhakar, A. Singh, and G. Maurya, Enhanced Transdermal Delivery of Indinavir Sulfate via Transfersome, Pharmacie Globale, 1(06) (2010)]

[시험예 12] 탄성 리포좀의 시험관내 피부 투과 실험(Franz diffusion cell)

1. 측정 방법

탄성 리포좀이 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 Franz diffusion cell과 높은 가변형성과 최적화된 상기 참고예 4의 방법으로 제조되고 상기 시험예 9 내지 11에서 사용한 탄성 리포좀을 이용하여 피부 투과 실험을 진행하였다. 또한 탄성 리포좀의 피부 투과는 수분 기울기(hydration gradient)에 의해 피부에 침투되어 약물을 피부로 전달하므로 샘플 투여부위를 밀폐하지 않은 상태(non-occluded condition)의 조건에서 실시하였다.

피부 투과 실험에 사용한 쥐의 피부는 경추탈골로 치사시킨 ICR 비근교계 알비노 마우스(outbred albino mice)(8주령, 암컷)의 등에서 적출하여 사용하였다. 적출한 피부는 피하지방과 조직을 제거한 후 사용하였다. 수용칸(receptor chamber)에 수용상(receptor phase)(HCO-60:에탄올:PBS = 2:20:78(w/w/w %)) 5mL를 채운 후 각질층이 위로 향하도록 공여체(donor)와 수용상 사이에 피부를 고정시켰다. 실험이 진행되는 동안 항온수조를 이용해 온도를 37±1℃로 유지하였다. 각 시료 0.2mL를 공여체를 통하여 피부 표면에 가한 후 시간에 따라 매 회 0.5mL의 수용상을 샘플링 포트(sampling port)를 통하여 채취하였다. 채취 직후 동량의 수용상을 수용칸에 보충하였다. 채취한 시료 속 여뀌 추출물의 양은 적절한 방법을 이용하여 측정하였다.

24시간 후 각질층과 피부에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 측정하기 위해 쥐의 피부를 PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후 수용상과 닿지 않은 부분을 잘라내고 남은 부분에 대해 테이프 스트리핑(tape stripping) 법을 이용해 각질층에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 따로 측정하였다. 각질층에 남아있는 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양을 측정하기 위해 테이프를 이용하여 피부의 각질층 부분을 3회 벗겨내었으며 이렇게 얻어진 테이프에 10mL의 에탄올을 넣고 1시간 동안 초음파 세척기를 이용하여 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 추출하였다. 그 후 회전증발기를 이용하여 에탄올을 증발시키고 추출된 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린을 0.5mL의 수용상에 녹여내었다. 테이프 스트리핑법을 거친 후 각질층이 제거 된 피부는 수술용 가위를 이용해 세절하였고 세절한 피부의 처리는 테이프와 동일하게 진행하였다. 이렇게 얻어진 시료 속 여뀌 추출물 또는 아이소쿼사이트린의 양은 적절한 방법을 이용하여 측정하였다.

2. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀의 시험관내 피부 투과 실험

5%(w/w)의 계면활성제를 포함하는 제형인 상기 시험예 7의 ELP-2의 탄성 리포좀을 이용하여 상기 1.에 기술한 피부 투과 실험을 진행하였다. 이때, 대조군으로는 계면활성제가 없는 일반 리포좀인 ELP-1, 그리고 보습 효과는 있지만 피부 자극이 거의 없는 1,3-부틸렌글리콜을 대조군 용액으로 사용하였다.

또한, 시료 속 여뀌 추출물의 양은 UV를 이용하여 360nm에서 측정하였으며, 결과는 도 21 및 도 22에 나타내었다.

피부 일정 면적에 대한 시간별 여뀌 추출물의 투과량을 나타낸 도 21을 보면, 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀인 ELP-2는 대조군에 비하여 시간별 여뀌 추출물의 투과량이 유의적으로 크게 나타남을 알 수 있다. 여뀌 추출물을 담지한 탄성 리포좀인 ELP-2와 일반 리포좀인 ELP-1 그리고 대조군인 1,3-부틸렌 글리콜(원액(stock solution) 내 여뀌 추출물) 용액 모두 8시간까지는 시간 의존적으로 추출물의 투과량이 증가하였다. 또한 24시간 후 여뀌 추출물의 누적 투과량(Transdermal)은 1,3-부틸렌 글리콜 용액의 경우 61.8μg/cm²이었고, ELP-1은 72.5μg/cm², ELP-2은 77.6μg/cm²으로 초기 적하량 314.4μg/cm²에 대하여 각각 19.7%, 23.0% 및 24.7%의 투과율을 나타내었다.

도 22에는 24시간 후 각질층에 존재하는 여뀌 추출물(Tape), 각질층을 제외한 표피와 진피에 존재하는 여뀌 추출물(Skin), 그리고 피부를 통과하여 수용상에 존재하는 여뀌 추출물(Transdermal)의 함량을 나타내었다. 각질층에 존재하는 여뀌 추출물의 함량(Tape)은 1,3-부틸렌 글리콜 용액의 경우는 5.1%이었고, ELP-1이 11.1%, ELP-2의 경우 12.9%로 탄성 리포좀 제형인 ELP-2의 경우가 각질층에 약간 더 존재하는 것으로 나타났다. 각질층을 제외한 피부(표피 및 진피)로 침투된 여뀌 추출물의 함량(Skin)은, 1,3-부틸렌 글리콜과 ELP-1, ELP-3에서 각각 37.4μg/cm², 26.6μg/cm², 46.2μg/cm²(도 22a)로 초기 적하량에 대한 여뀌 추출물의 침투율로 환산할 경우 각각 11.8% 및 8.5%, 12.9%로 각질층과 마찬가지로 탄성 리포좀 제형인 ELP-2(95:5)의 경우 표피와 진피에 존재하는 여뀌 추출물의 양이 훨씬 많은 것으로 나타났다. 피부를 통과하여 수용상에 존재하는 여뀌 추출물(Transdermal)의 함량 비율은 1,3-부틸렌 글리콜과 ELP-1, ELP-2이 각각 19.7% 및 23.0%, 24.7%로 ELP-2이 다소 투과량이 크게 나타났음을 보여주고 있다(도 22b). 피부에 침투된 여뀌 추출물의 총 함량은 초기 적하량 314.4μg/cm²에 대하여 1,3-부틸렌 글리콜과 ELP-1, ELP-2에서 각각 115.3μg/cm², 133.9μg/cm² 및 164.5μg/cm²로 측정되었다. 이를 초기 적하량에 대한 여뀌 추출물의 피부 흡수율로 환산하면 각각 36.7%, 42.6% 및 52.3%이었으며, 이는 탄성 리포좀 제형을 이용할 경우 더 많은 양의 여뀌 추출물을 피부로 전달할 수 있음을 나타내는 결과이다. 피부로 침투한 여뀌 추출물의 총 함량을 측정한 결과 ELP-1과 ELP-2를 비교해 보면 계면활성제에 의해 약 18.6%정도 더 많은 여뀌 추출물을 피부로 전달하였음을 확인할 수 있다.

3. 아이소쿼사이트린을 담지한 탄성 리포좀의 시험관내 피부 투과 실험

높은 가변형성 지수를 나타냈을 뿐만 아니라 입자크기, 가변형성 지수, 포집효율 등의 물리적 특성이 유사한 ELI-3, ELI-4의 탄성 리포좀을 이용하여 상기 1.에 기술한 피부 투과 실험을 진행하였다. 이때, 대조군으로는 계면활성제가 없는 일반 리포좀인 ELI-1, 그리고 보습 효과는 있지만 피부 자극이 거의 없는 1,3-부틸렌글리콜을 대조군 용액으로 사용하였다.

또한, 시료 속 아이소쿼사이트린의 양은 HPLC를 이용하여 측정하였으며, 결과는 도 23 및 도 24에 나타내었다.

피부 일정 면적(0.6362cm²)에 대한 시간별 아이소쿼사이트린의 투과량을 나타낸 도 23을 보면, 아이소쿼사이트린을 담지한 4가지 실험 제형 모두 시간 의존적으로 피부 투과량이 증가함을 알 수 있다. 1,3-부틸렌 글리콜과 ELI-1의 24시간 후의 누적 투과량의 경우 35.51μg/cm², 50.82μg/cm²로 초기 적하량 314.4μg/cm²에 대하여 각각 11.29%, 16.17%의 투과율을 보여주었다. 특히 ELI-4의 경우 시간 의존적으로 피부 투과량이 급격히 증가하여 24시간 후의 누적 투과량은 118.48μg/cm² 이었고, 이를 초기 적하량에 대하여 환산하면 37.69%의 투과율을 나타내었다. 또한 ELI-4와 유사한 물리적 특성을 나타내었던 ELI-3의 경우 24시간 후의 누적 투과량은 59.33μg/cm²으로 초기 적하량 대비 18.87%의 투과율을 나타내었다. ELI-3의 경우 압출 전후에 입자 크기가 303.05nm에서 343.65nm로 증가했음을 알 수 있는데 이러한 입자 크기의 증가는 ELI-3의 지질막이 불안정하다는 것을 나타낸다. 이러한 지질막의 불안정성은 ELI-3의 피부 투과율이 유사한 물리적 특성을 갖는 ELI-4에 비해 월등히 낮은 이유를 설명해준다.

도 24에는 24시간 후 각질층에 존재하는 아이소쿼사이트린(Tape), 각질층을 제외한 표피와 진피에 존재하는 아이소쿼사이트린(Skin), 그리고 피부를 통과하여 수용상에 존재하는 아이소쿼사이트린(Transdermal)의 함량을 나타내었다. 각질층에 존재하는 아이소쿼사이트린의 함량(Tape)은 1,3-부틸렌 글리콜 용액과 ELI-1의 경우 각각 0.59%, 4.19%로 나타났으며, ELI-3과 ELI-4의 경우 각각 2.38%, 1.12% 로 비교적 적은 양의 아이소쿼사이트린이 각질층에 남아있는 것으로 확인 되었다. 각질층을 제외한 피부(표피 및 진피)로 투과된 아이소쿼사이트린의 함량(Skin)은, 1,3-부틸렌 글리콜과 ELI-1, ELI-3, ELI-4에서 각각 2.49μg/cm², 2.59μg/cm², 3.13μg/cm², 19.33μg/cm²으로 초기 적하량에 대한 아이소쿼사이트린의 투과율로 환산할 경우 각각 0.79%, 0.82%, 1.0%, 6.15%로 최적화된 비율인 ELI-4가 표피와 진피에 존재하는 아이소쿼사이트린의 양이 더 많은 것으로 나타났다. 피부를 통과하여 수용상에 존재하는 아이소쿼사이트린(Transdermal)의 함량 비율은 1,3-부틸렌 글리콜과 ELI-1, ELI-3, ELI-4가 각각 11.29%, 16.17%, 18.87%, 37.69%로 ELI-4의 투과량이 매우 크게 나타났음을 확인할 수 있다. 이를 종합해 보면 피부에 투과된 아이소쿼사이트린 총 함량을 비교해보면 ELI-4(54.40%) > ELI-3(22.25%) > ELI-1(21.18%) > 1,3-부틸렌 글리콜(12.68%)로 확인되었다. 특히 계면활성제 첨가로 인한 가변형성 증가로 인하여 ELI-4가 ELI-1 보다 약 31.72% 더 많이 아이소쿼사이트린을 피부로 전달하였음을 확인할 수 있다.

Claims

아이소쿼사이트린을 담지하고 있는 탄성 리포좀으로서, 인지질과 계면활성제를 85:15의 중량비로 함유하는 용매에 아이소쿼사이트린을 용해시켜 형성된 지질막을 인산완충액으로 수화시켜 형성된 것임을 특징으로 하는, 탄성 리포좀.
제1항에 있어서, 상기 용매는 클로로포름임을 특징으로 하는, 탄성 리포좀.
제1항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린임을 특징으로 하는, 탄성 리포좀.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜이 함유되지 않은 것임을 특징으로 하는, 탄성 리포좀.
제4항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리글리세릴-3 메틸글루코오스 디스테아레이트임을 특징으로 하는, 탄성 리포좀.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 탄성 리포좀을 함유하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 피부 장벽 강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 탄성 리포좀은 조성물 총 중량에 대하여 0.5~10중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.