KR20150003059A - 뇨 중 글리아돌핀(Gliadorphin) 농도 측정을 위한 면역분석법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지금까지 알려지지 않은 뇨를 이용한 글리아돌핀 농도를 측정하는 신규 면역분석법에 관한 것으로 면역분석법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

뇨 중 글리아돌핀(Gliadorphin) 농도 측정을 위한 면역분석법{A immunoassay for measuring a concentration of Gliadorphin in Urine}

본 발명은 뇨 중 글리아돌핀의 농도를 측정할 수 있는 항원-항체반응을 이용한 면역분석법에 관한 것이다.

글루텐(gluten)은 보리, 밀 등의 곡류에 존재하는 불용성 단백질로써 밀가루에 소량의 물을 가하고 반죽하여 덩어리를 만든 다음, 다량의 물 속에서 주무르면 녹말이 물 속에 현탁하여 제거되고, 점착성을 가진 덩어리로 남는 것이 글루텐이다. 글루텐을 50~70% 에틸알코올과 섞으면 녹는 성분과 녹지 않는 성분이 있는데 녹는 성분을 글리아딘(gliadin), 녹지 않는 성분을 글루테닌(glutenin)이라고 한다. 글리아돌핀(gliadorphin)은 글리아딘 단백질이 소화될 때 나오는 펩타이드의 하나로 오피오이드 펩타이드(opioid peptide) 혹은 아편상 펩타이드라고도 불리는 물질이다. 오피오이드 펩타이드는 모르핀 수용체(morphine receptor)와 특이적으로 결합하여 진통작용을 나타낸다. 따라서 여러 정신적인 부작용 및 질병을 유발하기도 한다. 글루텐이 음식으로 섭취가 되면 위장에서 펩타이드 사슬로 분해가 되고, 이어서 더 작은 분자의 아미노산 조각, 즉 글리아돌핀 등으로 소화가 된 후 장벽을 통과해 혈액으로 흡수가 되어 순환하다가 뇌로 이동하여 정신분열증, 자폐증 등의 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다.

면역분석법(immunoassay)은 측정하고자 하는 대상물질과 특이적으로 반응하는 항체와의 경쟁성 반응 원리에 의하여 호르몬과 같은 미량성분을 분석하는 기술로 다른 정량법으로는 분석이 어려운 글리아돌핀의 경우 적합한 분석법으로 글리아돌핀을 측정하는 방법으로 사용되고 있는 방법은 효소와 기질반응을 활용한 효소결합면역흡착측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)이다. 그러나 이 방법도 국내에서는 전무하고 외국에도 아직 보편화되어 있지 못하며 다른 물질에 비해 많은 비용이 요구된다.

현재 면역측정하는 방법은 효소와 기질반응을 활용한 방법으로 대한민국 공개특허 제 10-2012-0127280에 개시된 바 있으며, 또한 다중필터를 이용한 경쟁여과면역분석방법으로 대한민국 등록특허 제 10-0436567에 개시된 바 있다. 그러나 특이한 형광성을 갖는 희토류의 일종인 Eu (유로피움; europium)이라는 물질을 이용하여 최종적으로 형광성을 측정하는 방법으로 형광물질을 이용한 소위 DELFIA(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay)로 불리는 방법으로 글리아돌핀 농도를 측정하여 면역분석한 방법에 대하여는 암시되거나 교시된바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 소변으로 배설되는 글리아돌핀을 측정할 수 있는 분석법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 글리아돌핀 측정 분석법을 통해 관련된 질병들을 진단할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 항체생산을 위한 면역원 글리아돌핀-KLH 항원을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 제조된 면역원 글리아돌핀-KLH 항원을 완전면역증강제와 혼합하고 이를 측정대상에 주사하여 다중클론 항체를 생산하는 단계와; 상기 단계에서 글리아돌핀-KLH를 주사한 측정대상에 B cell과 myeloma cell을 융합하여 생산한 후 항체의 역가가 좋고 특이성이 좋은 것 만을 선택하는 단계와; 글리아돌핀 정량을 위한 DELFIA법을 적용하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명에 따른 면역분석법은 지금까지 상용되고 있는 면역분석법보다 민감도와 활용성이 높은 새로운 방법으로 뇨 중의 글리아돌핀을 정량할 수 있는 방법을 제공하여 아직까지 임상적으로 널리 활용되고 있지 못하는 뇨 중 글리아돌핀 측정에 의한 각종 질병 진단을 위한 방법으로 활용 될 수 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 글리아돌핀 단일클론항체 생성방법 도면이다.
도 2는 글리아돌핀 단일클론항체 역가 그래프이다.
도 3은 글리아돌핀 측정을 위한 ELISA의 원리를 나타낸 도면이다.
도 4는 ELISA 실험의 표준곡선이다.
도 5는 글리아돌핀 측정을 위한 DELFIA의 원리를 나타낸 도면이다.
도 6은 DELFIA 실험의 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 기존 키트와 ELISA법을 적용한 결과를 비교한 그래프이다.
도 8은 기존 키트와 DELFIA법을 적용한 결과를 비교한 그래프이다.
도 9는 ELISA법과 DELFIA법의 결과를 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.

<실시예 1> 소변 샘플 수집

측정하고자 하는 대상의 소변을 수집하여 4℃에서 원심분리하여 상등액만 채취하여 분석 전까지 -20℃에 보관한다.

<실시예 2> 글리아돌핀 합성

글리아돌핀 펩타이드는 Tyr-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Phe의 7개의 아미노산(amino acid)으로 Fmoc SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법으로 C-terminal부터 하나씩 coupling 하였다. C-terminal 첫 번째 아미노산이 resine에 attach 된 것으로 사용하였다. 상기 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-terminal이 Fmoc으로 보호(protection)되고 잔기(residue)는 모두 trifluoroacetic acid (TFA)에서 제거되는 보호기(protection group)을 사용하고 20% piperidine이 든 N,N-dimethylmethanamide(DMF) 용액을 이용하여 Fmoc를 제거하였다. 상기 합성된 펩타이드를 resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 TFA:EDT:Thioanisole: TIS:H₂0를 각각 90:2.5:2.5:2.5:2.5의 비율로 혼합하여 사용하였다.

본 발명에 따라 합성된 글리아돌핀의 그 구조식은 하기 화합물(Ⅰ)과 같다.

<실시예 3> 글리아돌핀과 KLH 단백질 결합

불완전항원(hapten)인 글리아돌핀 펩타이드를 면역원(immunogen)으로 사용하기 위하여 담체(carrier)로서 키홀-림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)을 결합하였다. 상기 합성된 글리아돌핀 펩타이드 2 mg을 200 uL 증류수 혹은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹였다. 상기 용액 1 uL를 ellmans reagent 10 uL와 증류수 89 uL의 혼합용액에 넣어 노란색 free thiol을 확인하고 KLH 2 mg을 800 uL에 녹인 용액과 펩타이드 용액을 섞어 2시간 동안 흔들며 반응시켰다. 상기 반응액에 5 uL를 ellmans reagent 10 uL와 증류수 85 uL의 혼합용액에 넣어 반응 여부를 확인하였다. DMSO에 녹인 샘플의 경우 상층액만 Hi-trap column(GE healthcare)을 이용하여 탈염(desalting) 하고 침전물(pellet)과 섞어주어 글라이돌핀과 KLH 단백질을 결합하였다.

<실시예 4> 글리아돌핀과 BSA 단백질 결합

작은 크기의 글리아돌핀 펩타이드에 표지자 결합을 용이케 하기 위하여 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 결합하였다. 상기 합성된 글리아돌핀 펩타이드 2 mg을 200 uL 증류수 혹은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여주고 상기 용액 1 uL를 ellmans reagent 10 uL와 증류수 89 uL의 혼합용액에 넣어 노란색 free thiol을 확인하고 BSA 2 mg 을 800 uL에 녹인 용액과 펩타이드 용액을 섞어 2시간 동안 흔들며 반응시켰다. 상기 반응액에 5 uL를 ellmans reagent 10 uL와 증류수 85 uL의 혼합용액에 넣어 반응 여부를 확인하였다. DMSO에 녹인 샘플의 경우 상층액만 Hi-trap column(GE healthcare)을 이용하여 탈염(desalting)하고 침전물 (pellet)과 섞어주어 글리아돌핀과 BSA 단백질을 결합하였다.

<실시예 5> 글리아돌핀에 대한 단일클론항체 생산

도 2에 나타낸 바와 같이 글리아돌핀 펩타이드에 KLH를 결합한 면역원을 준비한 후 면역보조제(adjuvant)와 1:1로 혼합하여 실험용 Balb/c 마우스에 마리당 100 ug의 항원을 주사하였다. 상기 항원을 주사한 마우스에 2주 후 같은 항원을 면역보조제와 혼합하여 2차 보조 주사하고 1주 후 실험동물을 희생하여 비장 (spleen)으로부터 B 세포를 분리한 후 골수종양세포(myeloma tumor cell), 'SP/20'와 융합시키고 선택배지; HGPRT 배양액에서 배양하여 하이브리도마 세포(hybridoma cell)를 얻어 이 중 항체를 분비하는 클론을 선택하여 한계희석법으로 단일클론을 만들었다. 상기 클론은 각각 4H2, 5E1, 8C1, 9H1, 10D2으로 명명하였다. 상기 생성된 단일클론 하이브리도마 중 항체의 역가가 높은 클론을 선택하고 이들 중에서도 특성이 가장 좋은 하이브리도마 10D2를 선택하였다. 항체를 대량으로 생산하기 위하여 Freund's adjuvant를 200 uL씩 주사한 실험용 Balb/c 마우스에 하이브리도마 세포를 주사하여 복수(ascitic fluid)를 얻었으며 Protein-G 혹은 Protein-A affinity column(Pharmacia, USA)를 이용하여 분리정제한 후 항체로 사용하였다.

<실시예 6> 글리아돌핀 avidin 결합

상기 글리아돌핀 펩타이드 2 mg을 200 uL 증류수 혹은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹이고 녹인용액 1 uL를 ellmans reagent 10 uL와 증류수 89 uL의 혼합용액에 넣어 노란색 free thiol을 확인하였다. 상기 avidin 2 mg 을 800 uL에 녹인 용액과 펩타이드 용액을 섞어 2시간 동안 흔들며 반응시킨 후 5 uL를 ellmans reagent 10 uL과 증류수 85 uL의 혼합용액에 넣어 반응 여부를 확인하였다. 상기 DMSO에 녹인 샘플의 경우 상층액만 Hi-trap column(GE healthcare)을 이용하여 탈염 (desalting) 하고 침전물(pellet)과 섞어주어 avidin을 결합하였다.

<실시예 7> 글리아돌핀 유로피움 부착

글리아돌핀-BSA 결합물에 Eu-labelling kit(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 유로피움(europium, Eu)을 결합시켜 DELFIA 측정에 활용하였다. 1 mg의 유로피움이 결합된 글리아돌핀을 얻기 위해 4 mg/mL의 농도로 글리아돌핀-BSA를 준비하고 250 uL의 글리아돌핀-BSA를 pH 9.3의 100 mmol/L Na₂CO₃ 용액에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. pH 7.8의 50 mmol/L Tris-HCl 용액에 0.9% NaCl과 0.05% sodium azide가 포함된 TSA buffer를 elution buffer로 활용하여 Sephadex G-50 column을 통과시켜 280 nm 파장에서 피크를 확인하였다. 분리된 유로피움이 결합된 글리아돌핀-BSA-Eu 결합물을 그 농도를 측정하여 사용하였다.

<실험예 1> 글리아돌핀 단일클론항체 역가 측정

상기 생산한 글리아돌핀 단일클론항체의 적절한 희석비율을 확인하기 위하여 역가(titer)를 측정하였다. 글리아돌핀-BSA를 96 well plate에 피복하고 단일클론항체를 1:1,000부터 1:256,000까지 2배씩 희석하여 농도별로 처리한 후 HRP가 결합된 마우스 면역글로블린 G(immunoglobulin G, IgG)에 대한 2차 항체를 넣고 반응시켰다. 상기 반응액에 HRP에 대한 기질인 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 용액을 넣어주고 그 색의 변화를 ELISA reader (Bio-Tek Industries, USA)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도 (optical density, OD value)를 측정하였다.

실험결과 도 4에 나타낸 바와 같이 글리아돌핀 단일클론항체의 역가는 약 10만인 것을 확인하였다.

<실험예 2> 글리아돌핀 정량을 위한 ELISA법 적용

글리아돌핀에 대한 단일클론항체를 96 well에 피복하고 글리아돌핀 표준 (standard) 또는 희석된 소변 샘플을 0.1 mL씩 각각의 칸에 넣어준 뒤, 모든 칸에 동일한 양의 글리아돌핀-avidin을 넣어서 단일클론항체에 대해 경쟁반응을 유도하였다. 상기 유도액에 동일한 양의 Biotin-HRP를 넣어 avidin과 반응시키고 HRP의 기질인 TMB 용액을 넣어주고 그 색의 변화를 ELISA reader로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과 표 1에 나타낸 바와 같이 약 20 pg/tube까지 측정할 수 있는 민감도를 보였다. 도 6은 표 1을 표준곡선 그래프로 나타낸 것이다.

<실험예 3> 글리아돌핀 측정을 위한 DELFIA법

글리아돌핀-BSA-Eu 합성물과 증폭용 용액 (enhancement solutiuon, Perkin Elmer, USA)을 이용하여 DELFIA reader (Perkin Elmer, USA)를 사용하여 형광성을 측정하였다.

실험 결과 표 3에 나타낸 바와 같이 측정에 필요한 시료의 최소양은 약 4 pg/tube로서 기존 키트보다 10배나 더 민감하며 실험예 2의 ELISA법보다 4배나 더 높은 민감도를 나타내었다. 도 7은 표 3을 표준곡선 그래프로 나타낸 것이다.

<실험예 4> 발명된 ELISA법과 DELFIA법에 대한 평가

50명의 소변 샘플을 이용하여 기존에 판매중인 키트, ELISA법, DELFIA을 이용하여 각각 결과를 구하고 그 결과를 비교하였다.

실험결과 도 8에 나타낸 바와 같이 같이 기존 키트와 본 발명에서 적용한 ELISA법은 약 96%의 결과적인 유사성을 보였으며 기존 키트와 본 발명에서 적용한 DELFIA법을 비교했을 때도 결과 값이 역시 약 96% 유사성을 보였다. 마지막으로 도 9에서 나타낸 본 발명의 ELISA법과 DELFIA법은 약 98%의 유사성을 보였다. 이를 통해 기존 유통되고 있는 키트와 유사한 결과를 보임으로 높은 신뢰성을 보였다.

본 발명에 따른 면역분석법은 기존 방법 대체용으로 활용은 물론 사업용 키트로 생산 활용할 수도 있어 사업성도 기대되는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 하기 단계로 이루어지고 하기 구조식을 가지는 글리아돌핀 화합물(Ⅰ)의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
   
   (a) 면역원 글리아돌핀-KLH 항원을 제조하는 단계;
   (b) 상기 단계에서 제조된 면역원 글리아돌핀-KLH 항원을 완전면역증강제와 혼합하고 이를 측정대상에 주사하여 다중클론 항체를 생산하는 단계;
   (c) 상기 단계에서 글리아돌핀-KLH를 주사한 측정대상에 B cell과 myeloma cell을 융합하여 생산한 후 항체의 역가가 좋고 특이성이 좋은 것 만을 선택하는 단계;
   (d)글리아돌핀 정량을 위한 DELFIA법을 적용하는 단계
   
   

   

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