KR20140144176A - 잠복중인 hiv 바이러스의 재활성화에서 인게놀 유도체 - Google Patents

잠복중인 hiv 바이러스의 재활성화에서 인게놀 유도체 Download PDF

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KR20140144176A
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루이즈 프란시스코 피아노우스키
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아마조니아 피토메디카멘토스 엘티디에이
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Abstract

잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화에서 인게놀 유도체
본 발명은 전반적으로, 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스의 HIV 재활성제로서 일정한 인게놀 유도체의 용도에 관계한다. 다른 양상에서, 본 발명은 이런 인게놀 유도체 및 활동적으로 복제하는 바이러스에 실질적으로 대항하는 항레트로바이러스 작용제를 포함하는 합동에 관계한다.

Description

잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화에서 인게놀 유도체{INGENOL DERIVATIVES IN THE REACTIVATION OF LATENT HIV}
본 발명은 전반적으로, 일정한 인게놀 유도체, 그리고 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스의 재활성제로서 이들의 용도에 관계한다. 다른 양상에서, 본 발명은 상기 인게놀 유도체 및 활동적으로 복제하는 바이러스에 실질적으로 대항하는 항레트로바이러스 작용제를 포함하는 합동과 조성물에 관계한다.
발명의 배경
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)는 AIDS - 면역계의 파괴에 의해, 생명체가 치명적인 기회적 감염 (opportunistic infection)에 적절하게 반응할 수 없도록 하는 것으로 특징되는 치명적인 질환인 후천성 면역결핍 증후군을 주도하는 병인체 (etiological agent)인 것으로 알려져 있다.
고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART로서 알려져 있음)이 HIV 복제를 억제하는데 이용되고 있다. 이것은 역전사효소 저해제, 인테그라아제 저해제, 프로테아제 저해제 및 진입 저해제를 내포하는 최소한 3가지 활성 항레트로바이러스 화합물을 이용한, 항-AIDS "칵테일"로서 알려져 있는 치료로 구성된다.
하지만, 감염된 환자에서, 잠복 감염된 (즉, 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 잔여 잠복중인 프로바이러스 DNA를 내포하는) CD4+ T 림프구 세포의 병원소 (reservoir)로부터 바이러스는 HAART 치료의 중단 후 바이러스 복제를 즉시 재개한다.
따라서 HIV는 이런 지속성 잠복 감염이 억제되지 않을 때 만성 바이러스 감염으로 존속한다.
당분야에서 현재의 근거에 따르면, 항레트로바이러스 약물의 존재에서 이런 병원소에 내포된 잠복 바이러스의 활성화는 이들이 신체 면역계에 의해 검출될 수 있고 바이러스에 대항하는 활성 약제에 접근가능하도록 만들어 숙주 면역계의 반응에 의해, 바이러스 단백질을 발현하는 세포의 파괴를 유발하고 및/또는 이들 세포가 아폽토시스 (apoptosis)되어, 항레트로바이러스 약물의 작용에 의해 병원소로부터 출현하는 바이러스의 복제를 저해하고, 따라서 HIV 지속성 감염의 병원소를 고갈시키고 감염의 완전한 근절을 가능하게 하는 것을 의도한다.
다시 말하면, 잠복중인 감염의 선별적 유도 (selective induction)는 항레트로바이러스 약물과 항바이러스 면역 반응이 잔여 HIV 감염에 접근하고 이를 근절할 수 있도록 한다 - 다시 말하면, 항레트로바이러스의 후기 사용 없이 면역계를 단순히 일시적으로 안정시키는 것이 아니라, 인체 내에서 HIV 감염을 명확히 억제한다.
용어 설명
본 발명의 문맥에서, 용어 "잠복 바이러스" 또는 "잠복중인 HIV 바이러스"는 감염된 세포의 핵 내로 이입되고 숙주 세포 게놈 DNA 내로 통합되는, 후천성 면역결핍 증후군을 유발하는 바이러스의 DNA 서열을 의미하고, 이것은 이런 통합 후, 잠복 상태, 다시 말하면, 바이러스 유전자 발현의 수준이 검출되지 않고, 따라서 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART) 하에 오랜 기간 동안 검출되지 않는 바이러스 하중을 갖는 환자를 비롯하여, 숙주 면역계에 의한 바이러스와 감염된 세포의 검출이 가능하지 않고 감염 지속성 (infection persistence)을 유발하는 상태가 될 수 있다.
표현 "활동적인 복제 하에 바이러스"는 숙주 세포 내로 바이러스 유전자의 발현 및 바이러스 입자 자손의 생산으로, 감염된 세포에서 활성 바이러스 DNA에 관계한다.
표현 "바이러스 병원소"는 HIV 바이러스가 심지어 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART로서 알려져 있음) 동안에도, 잠복 형태에서 면역계에 의해 검출되지 않고 지속할 수 있는 숙주 세포에 관계한다. 이런 병원소는 뇌, 골수, 림프양 조직과 비뇨생식관을 비롯한 숙주 생물체 전역에 분포된다. HIV 바이러스의 주요 바이러스 잠복 병원소는 CD4+ 기억 T 세포 내에 있다.
표현 "잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화"는 바이러스 잠복 유전자의 발현 및 새로운 바이러스 입자의 차후 형성으로, 감염된 세포가 숙주 면역계에 의해 다시 검출될 수 있도록 하는, 바이러스의 재활성화를 의미한다.
표현 "활성 항레트로바이러스 작용제"는 HIV 수명 주기의 상이한 단계에서 작용하지만, 숙주 바이러스 병원소 내에 존재하는 잠복 감염에서 HIV 바이러스에 대항하여 실질적으로 작용하지 않거나, 또는 제한된 방식으로만 작용하는 작용제, 활성 성분 또는 의약품에 관계한다.
"바이러스 역가"로서 알려져 있는 용어 "바이러스 하중"은 이용된 검출 방법의 결과에 따라, 환자로부터 유체 시료 내에 존재하는 바이러스 입자의 숫자의 추정치를 의미한다.
용어 "어쥬번트"는 질환, 장애 또는 질병의 최초, 일차 또는 주요 치료에 부가하여 전달되는 작용제 또는 활성 성분에 관계한다. "어쥬번트"의 단리된 효과는 질환 또는 장애를 효과적으로 해결하지 못하지만 치료를 보완하고, 그리고 일차 또는 주요 요법으로 통상적으로 달성되는 생존율, 삶의 질 또는 치유 속도를 개선한다.
용어 "리포좀"은 수성 매체 내에서 자발적으로 정렬되는 하나 또는 그 이상의 구심성 인지질 이중층으로 구성되는 작은 소낭을 의미한다. 이들은 의약품 제어된 방출 시스템으로서 이용될 수 있다. 리포좀은 활성 성분을 화학적, 물리적 및 효소적 분해로부터 보호할 수 있고, 표적 부위 내에서 약물 농도의 증가를 가능하게 하고, 소수성 약물을 가용화하는 비-독성 부형제로서 이용될 수 있고, 그리고 순환에서 소낭과 약물의 수명을 연장하여 활성 성분의 약물동력학과 독성의 특징에 대한 긍정적인 효과를 발생시킬 지도 모른다.
용어 "나노입자"는 활성 성분 또는 약물을 캡슐화하거나 보호할 수 있고, 그리고 제어된 약물 방출 시스템으로서 이용될 때 잠재적으로 유리한 성질을 나타내는, 1 내지 100 나노미터 직경을 갖는 초-박편 입자를 의미한다. 이들 나노입자는 활성 성분을 화학적, 물리적 및 효소적 분해로부터 보호할 수 있고, 표적 부위 내에서 약물 농도의 증가를 가능하게 하고, 소수성 약물을 가용화하는 비-독성 부형제로서 이용될 수 있고, 그리고 순환에서 약물의 수명을 연장하여 활성 성분의 약물동력학과 독성의 특징에 대한 긍정적인 효과를 발생시킬 지도 모른다.
표현 "활성 성분"은 제제 내에 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 내포할 수 있는 제약학적 조성물에서 생물학적 활성 물질을 의미한다.
용어 "합동 (association)"은 최소한 화학식 I의 인게놀 유도체 (요소 a) 및 활동적으로 복제하는 바이러스에 실질적으로 대항하는 최소한 하나의 항레트로바이러스 작용제 (요소 b)를 내포하고 개체에 투여되는, 배합, 혼합, 조제, 제조 또는 등가물에서 적절한 용량의 임의의 형태를 의미한다.
용어 "제약학적으로 허용되는 부형제"는 제약학적 조성물에서 희석제 또는 운반제로서 이용되는 비활성 물질에 관계한다. 제약학적으로 허용되는 부형제의 실례는 간행물 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition or later, Lippincott Publishing House, Williams & Wilkins; "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., 7th edition, Lippincott Publishing House, Williams & Wilkins; "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (2000) A. H. Kibbe et al, 3rd edition, American Pharmaceutical Association Publishing House"에서 설명된다.
용어 "아폽토시스"는 예정된 세포 사멸의 과정으로서, 괴사 (necrosis) 와 달리 조직화된 방식으로 일어나는, 자가분해 (autolysis)가 뒤따르지 않는 세포 사멸의 과정을 의미한다.
표현 "CD4 수용체의 하향조절" 또는 "CD4 HIV 수용체의 하향조절"은 CD4+ 세포의 원형질 막의 표면으로부터 CD4 수용체의 소멸을 의미하고, 이것은 세포가 AIDS 바이러스 또는 CD4 수용체를 이용하는 다른 바이러스에 의한 차후 감염에 불응하도록 만들고, 중복감염 (superinfection)에 대한 세포 면역 (cell immunity)의 상태를 창출한다.
표현 "항레트로바이러스 치료"는 효소에 의해 합성된 뉴클레오티드 사슬의 중단에 의해 바이러스 복제를 저해하는 뉴클레오시드, 또는 활성 부위에서 역전사효소 효소의 결합에 의해 바이러스 복제를 저해하는 비-뉴클레오시드, 숙주 세포 게놈 DNA 내로 바이러스 DNA의 통합을 저해하는 인테그라아제 저해제, 숙주 세포 내로 바이러스의 결합과 진입을 간섭하는 진입 또는 융합 저해제, 그리고 숙주 세포의 세포 막으로부터 새로운 바이러스 입자의 형성과 방출을 저해하는 프로테아제 저해제를 포함할 수 있는 역전사효소 저해제 중에서 최소한 3가지 활성 항레트로바이러스 약제를 통상적으로 포함하는 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (항-AIDS 칵테일 또는 HAART로서 알려져 있음)을 의미한다.
발명의 상세한 설명
하기 문서에서 "활동적인 복제 하에 바이러스에 대항하는 항레트로바이러스 작용제"에 대한 언급은 인체 내에 HIV 바이러스 병원소에서 실질적으로 작용하지 않거나, 또는 단지 제한된 방식으로만 작용하는 작용제에 관계하는 것으로 이해된다.
본 발명은 첫 번째 양상에서, HIV 감염의 치료 또는 AIDS 치료에서 산물 어쥬번트의 제조에 이용되는 하기 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체의 용도에 관계한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
, 여기서 Z는 Z1 또는 Z2이고
Figure pct00002
Figure pct00003

Z = Z1일 때, 본 발명의 인게놀 유도체는 하기 화학식 II에서 묘사된 바와 같다:
[화학식 II]
Figure pct00004
x와 y는 정수이고, x는 2와 10 사이에서 변하고, 그리고 y는 2와 7 사이에서 변한다.
특히, 화학식 II의 경우에, x는 3과 5 사이에서 변하고, 그리고 y는 3과 4 사이에서 변한다. 화학식 II의 특정 구체예가 인용될 수 있는데, 여기서 x = 3이고 y = 4:
Figure pct00005
(3-(2,4,6-도데카트리에노일)-인게놀)
그리고, x = 4이고 y = 4:
Figure pct00006
(3-(2,4,6,8-테트라데카테트라노일)-인게놀)이다.
화학식 I과 관련하여, Z = Z2일 때, 본 발명의 인게놀 유도체는 하기 화학식 III에서 묘사된 바와 같다:
[화학식 III]
Figure pct00007
A는 페닐, CH3- 또는 CH2=CH-이고, 그리고
B는 -CH=CH-, [-CH2-]q 또는 [-CH2-]w이고,
여기서 q는 1과 10, 바람직하게는 2와 6 사이에서 변하는 정수이고, 그리고 w는 1과 10, 바람직하게는 8과 10 사이에서 변하는 정수이고,
단서로서:
A가 페닐일 때, B는 -CH=CH-이고;
A가 CH3-일 때, B는 [-CH2-]q이고;
A가 CH2=CH-일 때, B는 [-CH2-]w이다.
본 발명에 적합한 화학식 III의 인게놀 유도체의 특정 실례는 무제한적 방식으로, 하기 구조 A, B, C와 D이다:
A B
Figure pct00008
Figure pct00009
C D
Figure pct00010
Figure pct00011

특히 Z = Z2일 때, 3-신나밀 (실례 A), 3-헥사노일 (실례 B), 3-도데카노일 (실례 C) 및 3-도데카-11-에노일 (실례 D) 라디칼을 갖는, 본 발명으로부터 유래된 산물은 대사 후, 독성 분해 산물을 발생시키는 낮은 잠재력으로 인하여 선택되었다.
특히, 본 발명의 인게놀 유도체의 화학식 I은 하기 입체형태를 나타낸다:
Figure pct00012

본 발명의 인게놀 유도체는 예로서, 식물 원료 (가령, 국제 특허 출원 WO2007000618에서 설명된, 유포르비아 티루칼리 (Euphorbia tirucalli L.) 라텍스로부터 부탄올성 추출물의 크로마토그래피 분리로부터 발생하는 활성 분획물)로부터, 또는 임의의 다른 적절한 원료, 예를 들면, 유리 염기 인게놀, 테르펜 등으로부터, 합성 또는 반-합성 공정에 의해 당업자에게 공지된 상이한 방법에 의해 제조될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 인체의 바이러스 병원소 내에 잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화에서, 상기 화학식 I의 인게놀 유도체의 용도에 관계한다. 이것은 의학 요법에서 용도이다.
다른 양상에서, 본 발명은 HIV 바이러스의 감염의 치료 또는 예방을 위한 유용한 합동에 관계하고, 이것은 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체, 그리고 활동적인 복제 하에 바이러스에서 특히 뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제, 공동-수용체 길항제, 레트로바이러스 인테그라아제 저해제, 바이러스 흡착 저해제, 특정한 바이러스 전사 저해제, 사이클린-의존성 키나아제 저해제 및 이들의 조합 중에서 선택되는 최소한 하나의 활성 항레트로바이러스 작용제를 포함한다.
본원에서 이용된 의미에 따르면, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체 (요소 a) 및 하나 또는 그 이상의 항레트로바이러스 작용제 (요소 b)의 합동은 단일 투약 단위 (가령, 정제, 캡슐, 앰플, 가방 등) 또는 상이한 투약 단위에서 가용한 것으로 이해되고, 여기서 요소 (a)와 (b)는 서로 함께 또는 별개로, 동시에 또는 순차적으로 환자에 투여 목적으로 제공된다.
이미 언급된 것들 이외에, 리포좀과 나노입자 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 형태를 비롯한 본 발명의 합동을 위한 제형에는 특별한 제한이 없다.
특히, 본 발명은 앞서 언급된 합동, 그리고 제약학적으로 허용되는 부형제를 내포하는 제약학적 조성물에 관계한다.
다른 특정 양상에서, 본 발명의 조성물은 화학식 I의 인게놀(들)과 상이한 다른 활성 성분(들) 및 항레트로바이러스 작용제를 더욱 내포할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 화학식 I의 인게놀 유도체 이외에, 인체 내에 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스를 재활성화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 인체 내에 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스를 재활성화시키는데 유용한 부가물에 관계하고, 이것은 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체, 그리고 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것으로 특징된다.
다른 양상에서, 본 발명은 HIV 감염의 치료 또는 예방의 방법에 관계하고, 상기 방법은 전술한 바와 같이, 이런 치료가 필요한 환자에 합동을 투여하는 것을 포함하는 것으로 특징된다. 상기 치료는 합동 요소를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 특정 양상에서, 본 발명은 인체 내에 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스를 재활성화하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체를 환자에 투여하는 것으로 특징된다.
본 발명에 적합한 역전사효소 뉴클레오시드 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, 화합물 AZT (지도부딘), 3TC (라미부딘), d4T (스타부딘), 아바카비르, ddl (디다노신), ddC (잘시타빈), FTC (엠트리시타빈), PMPA (R)-9-(2-포스포닐메톡시프로필)아데닌), 테노포비르, 아데포비르, 암독소비르, 엘부시타빈, 알로부딘, 라시비르, 아프리시티빈, 포스파지드 및 포지부딘 티독실이 언급될 수 있다.
본 발명의 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, 화합물 네비라핀, 에파비렌즈, 델라비르딘, 로비리드, 에트라비린, (+)칼라놀리드, 릴피비린 및 레르시비린이 언급될 수 있다.
본 발명에 적합한 프로테아제 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, 화합물 리토나비르, 로피나비르, 넬피나비르, 사퀴나비르, 인디나비르, 아타자나비르, 암프레나비르, 다루나비르, 포삼프레나비르 및 티르파나비르가 언급될 수 있다.
본 발명에 적합한 인테그라아제 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, 화합물 랄테그라비르, 엘비테그라비르 및 돌루테그라비르가 언급될 수 있다.
본 발명에 적합한 융합 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, 화합물 엔푸비르티드 및 티푸비르티드가 언급될 수 있다.
본 발명에 적합한 공동-수용체 저해제 중에는 비-배타적인 방식으로, CCR5 공동-수용체 저해제 비크리비록 및 마라비록이 언급될 수 있다.
복제하는 바이러스에 대항하는 항레트로바이러스제인 본 발명의 인게놀 유도체 또는 이들을 내포하는 본 발명의 합동은 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 경피, 설하, 직장, 근육내, 경협점막, 비강내, 리포좀, 흡입, 질, 피하, 지방내, 안구내, 관절내 또는 척수강내 경로에 의해, 그리고 카테터 또는 스텐트 등을 이용한 투여에 의해 환자에 투여될 수 있다.
본 발명의 인게놀 유도체 또는 본 발명의 합동에서 이용되는 제형과 관련하여 별다른 제약이 없다. 가령, 정제, 알약, 캡슐, 과립, 펠릿 등이 경구 투여를 위해 이용될 수 있다. 액상 경구 투여의 경우에, 용액, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 오일 등이 이용될 수 있다.
제형은 즉시, 느린 또는 통제된 방출 형태일 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 본 발명의 인게놀 유도체, 이하 앞서 도시된 Markush 구조에서 Z = Z1일 때 KyoII의 상이한 농도에서 Jlat 8.4 클론에서 잠복 유도의 그래프를 나타낸다. 20 ng의 TNF-α가 양성 대조로서 이용되었고, 그리고 결과는 유도된 세포의 %로서 도시된다.
도 1B는 전술한 KyoII 유도체의 상이한 농도에서 Jlat 6.3 클론에서 잠복 유도의 그래프를 나타낸다. 20 ng의 TNF-α가 양성 대조로서 이용되었고, 그리고 결과는 유도된 세포의 %로서 도시된다.
도 1C는 전술한 4 μM의 KyoII 유도체에서 Jlat 6.3 클론에서 잠복 유도를 보여주는 히스토그램이다. 이러한 경우에, 20 ng의 TNF-α가 양성 대조로서 이용되었고, 그리고 결과는 유도된 세포의 %로서 도시된다.
도 2는 전술한 인게놀 유도체 KyoII의 상이한 농도에서 72시간 동안 배양된 인간 PBMC (말초 혈액 단핵구 세포) 세포에서 아폽토시스 활성화를 보여주는 히스토그램이다. 약물 농도는 각 그래프 옆에 도시되고, 그리고 아폽토시스 하에 세포의 %는 각 그래프의 왼쪽 사분면 상에 표시된다.
도 3 내지 6은 Jlat 6.3 클론에서 HIV 잠복의 유도, 그리고 KyoII 유도체 (여기서 Z = Z1) 및 A, B와 C 유도체 (여기서 Z = Z2) 둘 모두에 대한 상응하는 세포독성을 보여주는 복합 그래프이다.
도 7과 8은 에파비렌즈 단독 (도 7), 그리고 에파비렌즈와 본 발명의 인게놀 B 유도체의 혼합물 (도 8)로 치료된 환자로부터 혈액 세포에 대한 PCR (중합효소 연쇄 반응) 그래프이다.
도 9 내지 12는 유동 세포분석 시도인데, 이들은 KyoII 유도체 (여기서 Z = Z1) 및 A, B와 C 인게놀 유도체 (여기서 Z = Z2)에 대한, 인간과 원숭이 림프구의 표면 상에서 CD4 HIV-1 수용체의 하향 조정을 지시한다.
실시예
본 발명의 예시적인 구체예는 이런 실시예에 대한 무제한적 의미에서 하기에 제공되는데, 그 이유는 본 발명의 한정이 첨부된 청구항에 의해서만 진술되기 때문이다.
본 발명의 인게놀의 Z1 유도체
실시예 1과 2는 디메틸 술폭시드 용액에서 20 mM의 농도에서, Z = Z1일 때 화학식 (I)의 2가지 인게놀 유도체, 3-(2,4,6-도데카트리에노일)-인게놀 (x = 3 및 y = 4) 및 3-(2,4,6,8-테트라데카테트라노일)-인게놀 (x = 4 및 y = 4)의 1:1 혼합물, 본원에서 KyoII로 불리는 혼합물에 관계한다. 이런 용액은 활성 농도를 달성하기 위해 배양 배지에서 희석액을 만드는데 이용된다.
KyoII 혼합물은 예로서, 특허 출원 WO2007000618에서 언급된 바와 같이, 유포르비아 티루칼리 (Euphorbia tirucalli) 식물로부터 라텍스 부탄올성 추출물의 크로마토그래피 분리에 의해 획득될 수 있다.
실시예 1
하기 검사는 잠복중인 HIV-1의 시험관내 모델로서 기능하는, Jurkat 계통으로부터 유래된 J-lat로 불리는 세포주로 수행되었다. HIV-1 바이러스로 감염된 휴지기 CD4+ T 세포와 유사하게, J-Lat 세포는 활성화될 수 있는 세포 게놈 영역 내로 통합된 HIV-1의 완전한 게놈을 보유한다; 하지만, 이들 영역의 전사는 일시적으로 저해된다. 부가적으로, J-Lat 세포주에서 통합된 잠복중인 프로바이러스는 GFP (녹색 형광 단백질) 유전자를 인코딩하고, 따라서 HIV-1 전사 활성의 형광 리포터를 제공한다. 이들 세포는 바이러스 재활성화를 위한 양성 대조로서 TNF-α (20 ng/ml)로 처리되고, 그리고 효과는 인게놀 Z1 유도체의 혼합물과 비교되었다. HIV 바이러스 유전자의 발현은 유동 세포분석을 통해, TNF-α로 처리 후 48-72시간 동안 GFP 리포터 유전자에 의해 모니터링되었다.
Jlat 클론 세포 6.3과 8.4 (Dr. B. Matija Peterlin, University of California, San Francisco, CA, USA에 의해 제공됨)는 10% FBS (우 태아 혈청)를 내포하는 RPMI 배양 배지 (Rosewell Park Memorial Institute - sold by Invitrogen, USA)에서 유지되었다. Jlat 클론 세포 6.3과 8.4는 106 세포/mL의 농도에서, 상이한 농도의 유래된 KyoII로 24시간 동안 유도되고, 그리고 TNF-α가 20 ng/mL 농도에서 양성 대조로서 이용되었다.
배양 단계 후, 이들 세포는 RPMI 배지로 세척되고, 이후 10% 우 태아 혈청을 내포하는 RPMI 배지에서 재현탁되고 잠복 바이러스의 유도를 달성하기 위해 24시간 이상 동안 배양되었다.
유도 후, 30,000 세포는 GFP 마커 단백질을 발현하는 세포를 판독하기 위해 BD-Excalibur 유동 세포분석기 (Beckton Dickinson Company and Co., USA)에서 판독되었다. 한 세포 시료는 모의 대조 ("가짜"로 지칭됨)로서 역할하고, 따라서 프로바이러스의 자발적 유도 (배경)를 표시하기 위해, 유도되지 않고 배양 상태에서 48시간 동안 유지되었다.
도 1A와 1B의 히스토그램은 KyoII 시료가 24-시간 유도 후, Jlat 클론 6.3과 8.4 내에 존재하는 잠복 바이러스를 용량-의존성 방식으로 활성화시킬 수 있고, 그리고 심지어 매우 낮은 용량 (0.4 μM)에서도 배양 중인 Jlat 클론 세포 6.3과 8.4의 8%까지를 유도할 수 있고, 그리고 40 μM 농도에서 이들 세포의 거의 30%를 유도하고, 따라서 TNF-α 효능을 극복한다는 것을 보여준다.
도 1c는 4 μM KyoII를 이용한 전술한 동일한 프로토콜에 따라서, Jlat 6.3 클론에서 잠복 유도를 증명하는 Cellquest 소프트웨어 (Becton Dickinson and Company, USA)로부터 획득된 미가공 데이터를 제공하는 히스토그램을 보여준다. 이 경우에, 20 ng의 TNF-α가 양성 대조로서 이용되고, 그리고 결과는 유도된 세포의 %로서 도시된다.
실시예 2 - 독성
본 검사에서 실시예 1의 KyoII 혼합물에서 유도체는 J-lat 세포에서 잠복을 유도하는 농도에서, 인간 PBMC 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확증된다. 따라서, 인간 PBMC 세포는 106 세포/mL의 농도에서 10% 우 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 배양되고, 상이한 농도의 KyoII에 노출되고, 72시간 동안 배양되었다. 노출 후, 이들 세포는 프로피디움 요오드화물로 염색되었다. 따라서, 이들 세포는 1000G에서 3분 동안 원심분리되고 2% 우 태아 혈청을 내포하는 1 x PBS (Ca2+와 Mg2+ 없음, Cat No. 9240, Irvine Scientific Company, USA)로 동일한 부피에서 세척되었다. PBS, 또는 "인산염 완충된 식염수"는 인산염으로 완충된 식염수이다. 이러한 세척은 3회 반복되고, 그리고 이들 세포는 500 μg의 프로피디움 요오드화물을 내포하는 1 X PBS에서 현탁되고, 그리고 유동 세포분석에 의해 판독될 때까지 4℃에서 5분 동안 배양되었다. 배양 후, 30,000 세포는 BD-Excalibur 유동 세포분석기에서 판독되었다. 이러한 프로토콜로, 분해된 DNA를 갖거나 또는 아폽토시스의 진전된 상태에 있는 세포의 양을 확인하는 것이 가능하였다 (도 2). 10 μM까지의 농도에 대해, 인게놀 유도체는 PBMCs 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않고, 그리고 100 μM에서 100%의 사멸이 나타난다는 것을 관찰하는 것이 가능하였다.
실시예 3 - 세포독성 검증 vs. 재활성화
본 실시예의 목적은 상기 실시예 1과 2의 인게놀 유도체 (여기서 Z = Z1)의 KyoII 혼합물, 그리고 A, B와 C로서 앞서 지시된 화학식 I (여기서 Z = Z2)의 3가지 인게놀 유도체 둘 모두에 대한 세포독성 효과와 HIV 재활성화를 상관시키는 것이었다. 이들 경우에, 106 세포/mL JLat 6.3의 농도는 24시간 동안 상이한 농도의 KyoII, A, B, 그리고 C로 유도되었다. 배양 단계 후, 이들 세포는 RPMI 배지로 세척되고, 10% 우 태아 혈청을 내포하는 RPMI 배지에서 재-현탁되고, 그리고 잠복 바이러스의 유도를 위해 추가의 24시간 동안 배양되었다.
유도 후, 30,000 세포는 GFP 마커 단백질을 발현하는 세포를 판독하기 위해 BD-Excalibur 유동 세포분석기에서 판독되었다. 한 세포 시료는 모의 대조 ("가짜"로 지칭됨)로서 역할하고, 따라서 프로바이러스의 자발적 유도 (배경)를 표시하기 위해, 유도되지 않고 배양 상태에서 48시간 동안 유지되었다. 프로피디움 요오드화물로 염색 기술이 화합물의 세포독성을 측정하는데 이용되었다. 따라서, 이들 세포는 1000G에서 3분 동안 원심분리되고, 그리고 2% 우 태아 혈청을 내포하는 1 x PBS (Ca2+와 Mg2+ 없음, Cat No. 9240, Irvine Scientific Company, USA)로 동일한 부피에서 세척되었다. 이러한 세척은 3회 반복되고, 그리고 이들 세포는 500 μg의 프로피디움 요오드화물을 내포하는 1 X PBS에서 현탁되고, 그리고 유동 세포분석에 의해 판독될 때까지 4℃에서 5분 동안 배양되었다. 배양 후, 30,000 세포는 BD-Excalibur 유동 세포분석기 (Beckton Dickinson and Co., USA)에서 판독되었다. 이러한 프로토콜로, 정확 세포 생존능 (precision cell viability)으로 측정에 의해 분해된 DNA를 갖거나 또는 아폽토시스의 진전된 상태에 있는 세포의 양을 정확하게 확인하는 것이 가능하였다 (도 2). 획득된 결과는 작성된 그래프에서 플롯팅되었는데, 이것은 화합물의 세포독성 활성과 대비하여 화합물의 유도 능력을 비교하였다.
실시예 4 - 항레트로바이러스 치료 하에 환자로부터 기원된 HIV+ 인간 세포로 검사
본 실험에서, 1년 이상 동안 항레트로바이러스 치료를 이미 받고 있고 바이러스 하중이 검출되지 않는 환자로부터 잠복 세포를 활성화시키는, B로서 언급된 화학식 I (여기서 Z = Z2)의 인게놀 유도체의 능력이 조사되었다. 한 환자 (MLV로서 확인됨)가 선택되었는데, 상기 환자는 14개월 이상 동안 지도부딘 + 라미부딘 (AZT + 3TC) 및 에파비렌즈로 이미 치료를 받았고, 검출되지 않는 바이러스 하중 및 CD4 > 500 세포/mm3를 보였다. 20 mL의 혈액이 환자로부터 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에서 수집되고, 그리고 PBMC 세포가 단리되고, 이들은 10% 우 태아 혈청 및 50 IU/mL의 IL2 (인터류킨 2)를 포함하는 RPMI 배양 배지 내에 배치되고, 그리고 상이한 선별 조성물에서 5 mL의 동일한 세포 (106/mL)를 포함하는 2개의 병에서 성장되었다. 배양된 세포로부터 궁극적으로 발생하는 바이러스 복제를 차단하기 위해 10 μM 에파비렌즈 (항바이러스)가 대조 병에 첨가되었다. 다른 검사 병에는 에파비렌즈 (10 μM)와 본 발명의 B 유도체 (1 μM) 둘 모두 포함되었다. 양쪽 병은 37℃에서 72시간 동안 배양되고, 이후 PBMC로부터 세포내 RNA가 RNEasy 키트 (QiaGen Company, USA)로 추출되고, 그리고 HIV-1 게놈 RNA의 양이 비-절단접합된 바이러스 RNA GAG1 Sense I, II ((5' TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT 3'; 게놈 위치 1280-1303; TM = 58.3℃) 및 SK431 안티센스 I (5' TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT 3'; 게놈 위치 1474-1500; TM = 61.5℃)를 갖는, HIV-1 게놈의 개그 영역과 혼성화하는 프라이머를 10 라운드의 PCR로서 이용한 반 중첩 실시간 PCR 반응에 의해 제공되고, 프라이머 GAG1 Sense I, II (5' TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT3'; 게놈 위치 1280-1303; TM = 58.3℃) 및 안티센스 AG2 II (5' CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT 3'; 게놈 위치 1341-1362 55.1 TM = 57℃)와의 반 중첩 실시간 반응이 그 뒤를 잇고, 그리고 GAG3 프로브 (FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-TAMRA; 게놈 위치 1311-1337; TM = 61℃)로 확인되었다. HIV-1 vRNA를 검출하기 위한 반 중첩 PCR 실시간 반응은 아래와 같이 수행되었다: 추출된 세포 RNA는 물에서 10회 희석되고 임의의 미량의 프로바이러스 DNA를 제거하기 위해 15분 동안 Dnase I (Invitrogen Corporation, USA)로 처리되었다. 이후, DNase I는 1 mM EDTA와 50 mM DTT (디티오트레이톨)의 존재에서 70℃에서 10분 동안 배양 하에 비활성화되었다. RNA의 역전사는 42℃에서 60분 동안 무작위 헥사머 프라이머와 SuperScript III (cDNA 합성을 위한 브랜드 효소, Invitrogen, USA)으로 수행되었다. cDNA는 이후, PCR 반응에 종속되었다. 첫 번째 PCR 라운드에서 이용된 프라이머의 쌍은 HIV-1의 개그 내부 영역을 증폭하는 GAG1과 SK431이었다. 이러한 첫 번째 라운드는 전통적인 PCR 기계 상에서 25 μL 부피에서 5 μL의 cDNA, 20 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (pH 8.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.4 mM DNTPs (데옥시뉴클레오티드 삼인산염) 및 1U Ampli-Taq (DNA 중합효소, Applied Biosystems, USA), 그리고 50 ng의 각 프라이머로 수행되었다. PCR 조건은 아래와 같았다: 3분 동안 94℃, 그 이후에 30 s 동안 94℃, 30 s 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃의 15 사이클. 이러한 첫 번째 PCR의 산물은 0.2 μm의 프라이머 GAG1과 GAG2, 그리고 0.2 μm FAM GAG3 프로브와 함께, 50회 희석된 2 μl의 첫 번째 라운드를 포함하는 25 μl의 총 부피에서 TaqMan 반응 혼합물을 이용한 ABI Prism 7000 기계 실시간 PCR (Applied Biosystems, USA)에서 두 번째 반 중첩 실시간 PCR을 겪었다. 실시간 PCR 조건은 아래와 같았다: 2분 동안 50℃ 및 10분 동안 95℃, 그 이후에 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 50 사이클. 앰플리콘 (amplicon)의 크기는 첫 번째 라운드의 경우에 221 bp 및 (실시간) PCR의 경우에 83 bp이었다.
도 7에서, 10 μM 에파비렌즈를 내포하는 MLV 환자로부터 PBMC 배양액은 세포내 vRNA를 생산하지 못하고, 따라서 실시간 반 중첩 PCR에서 검출가능 산물을 산출하지 못하는 것으로 관찰될 수 있다.
다른 한편, 10 μM 에파비렌즈 및 1 μM 본 발명의 B 유도체가 첨가된 PBMC 배양액 (도 8)에서, 이들 혈액 세포에서 HIV 잠복 바이러스의 징후인 세포내 HIV-1 vRNA의 출현이 확증된다.
실시예 5
인간 CD4+ T 림프구와 대식세포 및 돼지-꼬리 원숭이 (Macaca nemestrina)의 표면 상에서 CD4 수용체의 하향조절.
본 검사에서 화학식 1 (여기서 Z = Z2)의 인게놀 유도체는 실시예 3에서 Jlat 세포에서 잠복으로부터 HIV를 활성화시키는 농도에서, HIV- 인간과 SIV- 돼지-꼬리 원숭이 CD4+ T 림프구와 대식세포의 표면 상에서 CD4 세포 수용체의 발현을 하향 조절하는 것으로 확증된다. 이러한 실험을 위하여, 인간과 원숭이로부터 PBMC 세포는 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 (수성 용액에서 쉽게 용해되는 고밀도 친수성 중성 다당류의 혼합물)를 통한 단리로 말초 혈액으로부터 단리되었다. "Ficoll"은 GE Healthcare Bio-Sciences, USA)의 상표명이다. 따라서, 인간과 원숭이로부터 PBMC 세포는 106 세포/mL의 농도에서, 10% 우 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 24시간 동안 배양되고, 그리고 부착된 세포 (대식세포로 분화하는 단핵구)는 전체 림프구를 내포하는 세포 상층액으로부터 분리되었다. 세포의 이들 2가지 상이한 집단은 본 발명의 A, B와 C 유도체의 상이한 농도에 노출되고, 그리고 72시간 동안 배양되었다. 노출 후, 이들 세포는 항-CD4와 동시에, 특이적인 림프구 단일클론 (항-CD3)과 단핵구/대식세포 (항-CD14)로 염색되었다. 따라서, 이들 세포는 1000G에서 3분 동안 원심분리되고 2% 우 태아 혈청을 내포하는 동일한 PBS 부피 (Ca2+와 Mg2+ 없음, Cat No. 9240, Irvine Scientific, USA)에서 세척되었다. 이러한 세척은 3회 반복되고, 그리고 이들 세포는 관련 항체의 1/1000 희석액을 내포하는 1 X PBS에서 현탁되고, 그리고 유동 세포분석에 의해 판독될 때까지 4℃에서 30분 동안 배양되었다. 배양 후, 30,000 세포는 BD-Excalibur 유동 세포분석기 (Beckton Dickinson and co., USA)에서 판독되고, 그리고 이들 집단은 분리되고 CD4 수용체 밀도가 B 유도체 없는 세포 밀도를 100%로서 가정하여, B 유도체의 상이한 농도에서 추정되었다. CD4를 하향 조절하는 것으로 이미 알려진 분자, 예를 들면, 프로스트라틴, 브리오스타틴 및 PMA (포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트, 포르볼 디에스테르) 역시 A, B와 C 유도체와의 비교 목적으로 이들 실험에서 배치되었다.
본 발명의 인게놀 Z2 유도체는 인간 (도 11)과 남부돼지꼬리원숭이 (Macaca nemestrina) 림프구 (도 9)의 표면 상에서 CD4 HIV-1 수용체의 발현을 하향 조절할 수 있는 것으로 주목된다. 유사하게, 이들 화합물은 또한, 인간 (도 12)과 남부돼지꼬리원숭이 (Macaca nemestrina) (도 10) 단핵구/대식세포 상에서 CD4를 하향 조절하였다. 이것은 비교 분자 (프로스트라틴, 브리오스타틴 및 PMA, 도 9와 10 참조)와 비교할 때, 원숭이 세포의 CD4의 하향조절에서 Z2 인게놀 유도체의 더욱 강한 놀라운 능력이다.
A, B와 C 인게놀 유도체는 감염 표적화된 세포의 표면 상에서 주요 HIV 수용체 (CD4)를 하향 조절할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 인게놀 유도체는 잠복으로부터 HIV를 활성화시키는 것 이외에, 새로운 세포 내로 바이러스 진입을 차단함으로써 바이러스 감염의 진행을 방해하는 것으로 증명되었다.
실시예 6
국제 특허 출원 WO2007000618에서 설명된, 유포르비아 티루칼리 (Euphorbia tirucalli L.)의 라텍스로부터 부탄올성 추출물의 크로마토그래피 분리로부터 발생하는 활성 분획물 (이하 인게놀 풀)로부터 인게놀을 획득하는 과정
가수분해 반응은 300 mL의 메탄올과 6 mL의 나트륨 메톡시드에서 용리된 18 g의 인게놀 풀로 수행되었다. 반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 30분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA.
반응은 1 ml의 빙초산으로 중화되었다. 차후 정제는 300 g의 실리카를 내포하는 플래시 칼럼에서 적용된 헵탄에서 에틸 아세테이트의 75% 용액에서 수행되었다. 칼럼은 동일한 용매로 균형되었다. 인게놀은 100 g의 에틸 아세테이트에서 용리되었다. 용리는 290 nm에서 UV 검출기로 모니터링되었다. 합쳐진 분획물은 증발되었다.
실시예 7
히드록실 기 5와 20을 보호하기 위한, 인게놀-5,20-아세토니드 중간물질의 제조
반응은 250 mL의 아세톤 (34.1 volEquiv)에서 용리된 실시예 6으로부터 7.34 g의 가수분해된 인게놀 (1.00 equiv; 21.1 mmol)에서 76.0 mg의 (1S)-(+)-10-캄포어 술폰산 (C2107; 0.0104 weightEquiv; 99%)으로 인게놀 아세토니드 형성을 위해 수행되었다. 반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 15분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA. 1.5시간 반응 후, 78% 5,20-인게놀 아세토니드와 9.8% 인게놀이 검출되었다. 반응은 140 μL의 트리에틸아민 (47.9 mEq; 1.01 mmol)으로 중화되었다. 5,20-인게놀 아세토니드의 정제는 35℃/30'/10 Torr에서 증발, 그 이후에 톨루엔으로부터 결정화에 의해 수행되었다.
실시예 8
인게놀 신나메이트 (Z = Z2 경우에, 화학식 III 구조의 실례 A)를 제조하기 위한 5,20-아세토니드의 에스테르화, 그 이후에 획득된 중간물질의 탈보호.
에스테르화
실시예 7에 따라 생산된 3.60 g의 5,20-인게놀 아세토니드 (1.00 equiv; 9.27 mmol)는 80 mL의 아세토니트릴 (22.2 volEquiv)에서 3.09 g의 신남산 무수물 (1.50 equiv; 13.9 mmol), 그리고 4.53 g의 탄산 세슘 (1.50 equiv; 13.9 mmol)으로 용리되었다.
반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 15분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA.
획득된 중간물질, 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-신나메이트는 이후, 추출과 정제에 종속되었다.
디클로로메탄과 물에서 합성 단계 중에서 이러한 단계의 산물의 추출이 수행되었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다. 이것은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트에서 가용화를 통한 정제가 뒤를 잇고, 그리고 이후, 80 g의 실리카를 내포하는 플래시 칼럼에서 적용되었다. 칼럼은 동일한 용매로 평형화되었다. 그 이후, 칼럼은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트 용액으로 세척되었다. 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-신나메이트 중간물질은 헵탄에서 10% 에틸 아세테이트 용액에서 용리되었다. 용리는 290 nm에서 UV 검출기를 이용한 HPLC에 의해 모니터링되었다. 합쳐진 분획물은 35℃/30'/10 mbar에서 증발되었다.
탈보호
중간 구조의 탈보호를 위해, 4.46 g의 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-신나메이트 (1.00 equiv, 8.29 mmol; 96%)는 80 mL의 메탄올 (19.9 volEquiv) + 4.60 mL의 1N 염산 (1M; 0.555 equiv; 4.60 mmol)에서 용리되었다. 이것은 톨루엔과 물로 추출이 뒤를 이었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다. 인게놀 3-신나메이트는 거의 97%의 순도에서 획득되었다.
실시예 9
인게놀 3-카프로에이트 (Z = Z2 경우에, 화학식 III 구조의 실례 B)를 제조하기 위한 5,20-아세토니드의 에스테르화, 그 이후에 획득된 중간물질의 탈보호.
에스테르화
실시예 7에 따라 생산된 3.60 g의 5,20-인게놀 아세토니드 (1.00 equiv; 9.27 mmol)는 80 mL의 아세토니트릴 (22.2 volEquiv)에서 2.98 g의 카프로산 무수물 (1.50 equiv; 13.9 mmol), 그리고 4.53 g의 탄산 세슘 (1.50 equiv; 13.9 mmol)으로 용리되었다.
반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 15분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA.
획득된 중간물질, 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-카프로에이트는 이후, 추출과 정제에 종속되었다.
디클로로메탄과 물에서 합성 단계 중에서 이러한 단계의 산물의 추출이 수행되었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다. 이것은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트에서 가용화를 통한 정제가 뒤를 잇고, 그리고 이후, 80 g의 실리카를 내포하는 플래시 칼럼에서 적용되었다. 칼럼은 동일한 용매로 평형화되었다. 그 이후, 칼럼은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트 용액으로 세척되었다. 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-카프로에이트 중간물질은 헵탄에서 10% 에틸 아세테이트 용액에서 용리되었다. 용리는 290 nm에서 UV 검출기를 이용한 HPLC에 의해 모니터링되었다. 합쳐진 분획물은 35℃/30'/10 mbar에서 증발되었다.
탈보호
중간 구조의 탈보호를 위해, 4.20 g의 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-카프로에이트 (1.00 equiv, 8.29 mmol; 96%)는 80 mL의 메탄올 (19.9 volEquiv) + 4.60 mL의 1N 염산 (1M; 0.555 equiv; 4.60 mmol)에서 용리되었다. 이것은 톨루엔과 물로 추출이 뒤를 이었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다.
인게놀 3-카프로에이트는 거의 97%의 순도에서 획득되었다.
실시예 10
인게놀 3-도데카노에이트 (Z = Z2 경우에, 화학식 III 구조의 실례 C)를 제조하기 위한 5,20-아세토니드의 에스테르화, 그 이후에 획득된 중간물질의 탈보호.
에스테르화
실시예 7에 따라 생산된 3.60 g의 5,20-인게놀 아세토니드 (1.00 equiv; 9.27 mmol)는 80 mL의 아세토니트릴 (22.2 volEquiv)에서 4.17 g의 도데칸산 (1.50 equiv; 13.9 mmol), 그리고 4.53 g의 탄산 세슘 (1.50 equiv; 13.9 mmol)으로 용리되었다.
반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 15분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA.
획득된 중간물질, 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도데카노에이트는 이후, 추출과 정제에 종속되었다.
디클로로메탄과 물에서 합성 단계 중에서 이러한 단계의 산물의 추출이 수행되었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다. 이것은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트에서 가용화를 통한 정제가 뒤를 잇고, 그리고 이후, 80 g의 실리카를 내포하는 플래시 칼럼에서 적용되었다. 칼럼은 동일한 용매로 평형화되었다. 그 이후, 칼럼은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트 용액으로 세척되었다. 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도데카노에이트 중간물질은 헵탄에서 10% 에틸 아세테이트 용액에서 용리되었다. 용리는 290 nm에서 UV 검출기를 이용한 HPLC에 의해 모니터링되었다. 합쳐진 분획물은 35℃/30'/10 mbar에서 증발되었다.
탈보호
중간 구조의 탈보호를 위해, 4.90 g의 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도데카노에이트 (1.00 equiv, 8.29 mmol; 96%)는 80 mL의 메탄올 (19.9 volEquiv) + 4.60 mL의 1N 염산 (1M; 0.555 equiv; 4.60 mmol)에서 용리되었다. 이것은 톨루엔과 물로 추출이 뒤를 이었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다.
인게놀 3-도데카노에이트 인게놀은 거의 97%의 순도에서 획득되었다.
실시예 11
인게놀 3-도덱-11-에노일 인게놀 (Z = Z2 경우에, 화학식 III 구조의 실례 D)를 제조하기 위한 5,20-아세토니드의 에스테르화, 그 이후에 획득된 중간물질의 탈보호.
에스테르화
실시예 7에 따라 생산된 3.60 g의 5,20-인게놀 아세토니드 (1.00 equiv; 9.27 mmol)는 80 mL의 아세토니트릴 (22.2 volEquiv)에서 4.13 g의 11-도데센산 (1.50 equiv; 13.9 mmol), 그리고 4.53 g의 탄산 세슘 (1.50 equiv; 13.9 mmol)으로 용리되었다.
반응은 7분 동안 1.5 mL/분에서 5-70%의 A-B 구배로, YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, 3 μm 칼럼에서 214와 290 nm에서 15분마다 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 용매: 용매 A - 물에서 0.1% TFA, 용매 B - 아세토니트릴에서 0.08% TFA.
획득된 중간물질, 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도덱-11-에노일은 이후, 추출과 정제에 종속되었다.
디클로로메탄과 물에서 합성 단계 중에서 이러한 단계의 산물의 추출이 수행되었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다. 이것은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트에서 가용화를 통한 정제가 뒤를 잇고, 그리고 이후, 80 g의 실리카를 내포하는 플래시 칼럼에서 적용되었다. 칼럼은 동일한 용매로 평형화되었다. 그 이후, 칼럼은 헵탄에서 5% 에틸 아세테이트 용액으로 세척되었다. 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도덱-11-에노일 중간물질은 헵탄에서 10% 에틸 아세테이트 용액에서 용리되었다. 용리는 290 nm에서 UV 검출기를 이용한 HPLC에 의해 모니터링되었다. 합쳐진 분획물은 35℃/30'/10 mbar에서 증발되었다.
탈보호
중간 구조의 탈보호를 위해, 4.88 g의 5,20-이소프로필리덴-인게놀-3-도덱-11-에노일 (1.00 equiv, 8.29 mmol; 96%)는 80 mL의 메탄올 (19.9 volEquiv) + 4.60 mL의 1N 염산 (1M; 0.555 equiv; 4.60 mmol)에서 용리되었다. 이것은 톨루엔과 물로 추출이 뒤를 이었다. 유기 상은 황산마그네슘에서 건조되고 35℃/30'/10 Torr에서 증발되었다.
당업자는 본문 및 제공된 실시예에 내포된 교시에 의해, 본 발명의 이점을 쉽게 평가할 수 있을 뿐만 아니라 첨부된 청구항에서 규정된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 본원에서 명시적으로 제시되지 않은 구체예에 대한 변형 및 균등한 대안을 제안할 수 있다.

Claims (20)

  1. HIV 바이러스 감염의 치료 또는 AIDS 치료에서 유용한 산물의 제조에서 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체의 용도:
    [화학식 I]
    Figure pct00013
    , 여기서 Z는 Z1 또는 Z2이고
    Figure pct00014

    Figure pct00015

    Z = Z1일 때
    X와 y는 정수이고, x는 2와 10 사이에서 변하고, 그리고 y는 2와 7 사이에서 변하고; 그리고
    Z = Z2일 때,
    A는 페닐, CH3- 또는 CH2=CH-이고,
    그리고 (B)는 -CH=CH-, [-CH2-]q 또는 [-CH2-]w이고,
    여기서 q는 1과 10, 바람직하게는 2와 6 사이에서 변하는 정수이고, 그리고 w는 1과 10, 바람직하게는 8과 10 사이에서 변하는 정수이고,
    단서로서:
    A가 페닐일 때, B는 -CH=CH-이고;
    A가 CH3-일 때, B는 [-CH2-]q이고;
    A가 CH2=CH-일 때, B는 [-CH2-]w이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체는 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 용도:
    Figure pct00016
    .
  3. 청구항 1에 있어서, Z = Z1일 때, x는 3과 5 사이에서 변하고, 그리고 y는 3과 4 사이에서 변하는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 청구항 1에 있어서, Z = Z1일 때, 인게놀 유도체는 3-(2,4,6-도데카트리에노일)-인게놀 및/또는 3-(2,4,6,8-테트라데카테트라노일)-인게놀 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 청구항 1에 있어서, Z = Z2일 때, 유도체는 A, B, C와 D 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 용도:
    A B
    Figure pct00017
    Figure pct00018

    C D
    Figure pct00019
    Figure pct00020
  6. 인체의 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화에 이용되는, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 유도체의 용도.
  7. HIV 바이러스 감염의 치료를 위한 제약학적 합동(Pharmaceutical association)에 있어서, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체, 그리고 활동적인 복제 하에 바이러스에 대항하는 최소한 하나의 항레트로바이러스 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 합동.
  8. 청구항 7에 있어서, 활동적으로 복제하는 바이러스에 대항하는 최소한 하나의 활성 항레트로바이러스 작용제는 뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제, 프로테아제 저해제, 공동-수용체 길항제, 레트로바이러스 인테그라아제 저해제, 바이러스 흡착 저해제, 특정한 바이러스 전사 저해제, 사이클린-의존성 키나아제 저해제 및 이들의 조합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 합동.
  9. 청구항 7에 있어서, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체 및 하나 또는 그 이상의 항레트로바이러스 작용제는 동일한 제형 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 제약학적 합동.
  10. HIV 바이러스 감염을 치료하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 청구항 7에 따른 합동 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 내포하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 화학식 I의 인게놀 유도체로부터, 또는 활동적으로 복제하는 바이러스에 대항하는 항레트로바이러스 작용제로부터 상이한 다른 활성 성분(들)을 더욱 내포하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 인체 내에 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스의 재활성화에서 유용하고, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. HIV 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료하기 위한 어쥬번트에 있어서, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 어쥬번트.
  14. HIV 감염을 치료하는 방법에 있어서, 이런 치료가 필요한 환자에 청구항 7에 따른 합동을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 합동의 요소의 투여는 부수적 또는 순차적인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  16. 인체 내에 바이러스 병원소에서 잠복중인 HIV 바이러스를 재활성화하기 위한 방법에 있어서, 환자에 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 7 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 환자에 대한 투여에 적합하고, 의학 요법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 제약학적 합동.
  18. 청구항 10 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 환자에 대한 투여에 적합하고, 의학 요법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  19. 청구항 13에 있어서, 환자에 대한 투여에 적합하고, 의학 요법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 어쥬번트.
  20. HIV 바이러스 감염의 치료 또는 AIDS의 예방을 보조하기 위한, 화학식 I의 하나 또는 그 이상의 인게놀 유도체의 용도.
KR1020147023480A 2012-03-02 2013-03-01 잠복중인 hiv 바이러스의 재활성화에서 인게놀 유도체 KR20140144176A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3398596A4 (en) * 2015-12-31 2019-08-28 Shanghai Xin Hao Biological Technology Company INGENOL COMPOUNDS AND THEIR USE IN THE HIV ANTI-LATENCY TREATMENT

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