KR20140140402A

KR20140140402A - 포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 sa12 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20140140402A
Application number: KR1020130061228A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 장윤지
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2014-12-09
Also published as: KR101596665B1

Abstract

본 발명은 포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 SA12 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균 세균(MRSA)에도 우수한 감염능을 보이므로, 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.

Description

포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 SA12 및 이를 함유하는 조성물{Bacteriophage against Staphylococcus and composition thereof}

본 발명은 박테리오파지 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 SA12 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성균이며, 포자를 형성하지 않는 통성혐기성균으로, 주로 가축 분변, 염증 상처부위 혹은 사람의 손이 많이 닿는 조리도구 등에서 발견된다. 인간과 동물에 감염하여 수술 후 감염, 농양, 심장 내막염 및 독소 증후군 등의 심각한 질병을 유도하는 대표적인 병원성 세균이다. 포도상구균이 내는 TSST-1, EF, alpha, beta, delta 등의 독소는 심각한 식중독을 유발하기도 한다.

포도상구균을 제어하기 위해 현재까지는 항생제가 주로 사용되어 왔다. 하지만, 메티실린 저항성 포도상구균 균주(Methicillin-resistant S. aureus) 등 저항성 세균을 발생시키는 문제를 유발했다.

이러한 문제를 극복하기 위한 방안으로 박테리오파지를 항생제 대체 물질로 사용할 수 있다. 식물바이러스와 동물바이러스 발견 후, 1915년 트워트가 포도상구균의 용균현상을 관찰하였고, 1917년 파스퇴르 연구소의 헤렐르가 적리균에서도 같은 현상을 관찰하게 되면서, 이것이 세균에 감염하는 바이러스(세균바이러스)에 의한 것임을 알아내었다. 이후, 세균에 감염하는 바이러스는“세균(Bacteria)”을 “먹는다(Phage)”의 의미에서 박테리오파지(bacteriophage)로 명명하였으며 간단히 “파지”로도 불리고 있다.

파지는 크게 용균파지와 용원성파지로 분류하며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균(virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 것을 약독성(temperate) 파지로 정의한다. 약독성 파지는 숙주세균의 유전자에 파지의 유전자 정보를 넣어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않으며, 이런 상태는 숙주세균이 좋은 환경조건에 있는 한 지속하는데, 숙주세균의 환경이 악화되면, 숙주세균의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자는 용균 사이클로 바뀌어 새로운 파지를 만들어 숙주세균을 용균시킨 후, 숙주세포 밖으로 방출된다. 용균 사이클에 있는 파지의 경우, 세균 감염 약 30분 후에 100~200개의 새로운 파지를 만들어 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나와 용균시키는데, 세균의 증식속도보다 파지의 증식속도가 훨씬 높으므로 세균의 증식을 제한하는 중요한 요인이 될 수 있다.

파지는 그것이 발견된 1910년부터 1930년대에 걸쳐서 파지의 숙주특이성 문제 및 파지의 치료목적으로의 제조에 있어, 숙주세균의 내독소, 외독소 문제 등 그 당시 과학적으로 풀지 못하는 문제가 있어, 이용에 제한이 있었다. 이와 유사한 시기인 1929년 플래밍이 발견한 페니실린 및 1943년 워크스만이 발견한 스트렙토마이신은 파지와 대조적으로 항균범위가 넓어 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과를 나타냈으며, 처음에는 내성균 문제도 없었기 때문에 항생제를 이용한 화학요법제가 널리 사용되게 되고, 효과가 불확실한 파지요법은 점점 사라지게 되었다. 또한, (1) 파지의 숙주에 대한 감수성으로 인해 임상에 사용시 감염성이 다른 다양한 파지주가 필요한 점, (2) 동물의 생체 내에서는 파지의 용균작용이 일어나기 어려운 점, (3) 파지 내성균이 동일 세균집단에 존재한다는 이유 등으로 인해, 1950년대에 WHO에 의해 파지요법이 무효 선언되고, 동구권과 구 소련연방에서만이 명맥이 근근이 유지되어 왔다.

그런데, 1980년대에 들어 파지요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델실험으로 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험하였다. (Smith HW, Huggins MB, J. Gen. Microbiol, 1982, Feb;128(2); 307-18). 즉, 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 용균파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 실험군의 경우 100% 생존하였으며, 항생제 (스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 결과를 나타낸 것이다. 특히, 놀라운 것은 균을 직접 뇌 내에 주사한 경우와 파지를 근육주사 하는 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 됨으로써, 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동하여 혈액뇌관문 (blood-brain barrier)을 통과한다는 사실을 확인할 수 있었던 것이다.

그 후, 용균성 파지를 이용하여 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병을 성공적으로 예방 및 치료한 사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법 뿐만 아니라, 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데, 작용하는 리신 (lysin)을 이용하여 탄저, 폐렴구균 등에 특이적인 약제의 개발도 이루어지고 있는 실정이다.

한편, 최근 들어 항생제의 남용과 불필요한 처방으로 인해 기존 항생제로는 잘 죽지 않는 내성을 갖는 '슈퍼박테리아'가 발생하고 있다. 하지만, 항생제 개발이 내성균의 출현 속도를 따라잡지 못하고 있어, 항생제 내성균의 심각성이 큰 문제로 대두하고 있다.

따라서, 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질 또는 항생제 내성 세균 제어 방법의 개발이 요구되고 있으며, 이에 대한 연구가 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0013149호 (공개일자: 2012년 02월 14일)에는, 살모넬라 및 대장균 О157 균주를 동시에 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 상기에서 살펴본 바와 같이 심각한 질병을 유발하는 병원성 세균인 포도상구균을 제어하는 박테리오파지를 새롭게 발견하여 제공하고자 한다.

본 발명은 포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 세균사멸용 조성물에 있어서, 상기 세균은 포도상구균일 수 있다. 이때, 상기 포도상구균은 일 예로, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균일 수 있다.

또한, 본 발명의 세균사멸용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 일 예로, 액상, 고체상 및 분말상 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균 세균(MRSA)에도 우수한 감염능을 가져 박테리오파지 감염 후 30분 이내에 용균활성을 보일 뿐만 아니라, 그 용균 활성을 8시간 이상 오래 유지하는 특징을 가지므로, 좀 더 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로, 포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 항생제 내성을 갖는 포도상구균으로 인한 의료 문제의 해결에도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리오파지는 식품업, 축산업 및 어업에서 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로서 사용될 수 있을 뿐 아니라, 포도상구균이 쉽게 감염되는 조리도구 및 용기 등을 살균하는 살균제로서 사용할 수도 있다.

도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 SA12의 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명 박테리오파지 SA12의 용균활성능을 보여주는 그래프이다.
도 3은 박테리오파지 SA12의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험 결과이다 (A: 황색포도상구균 야생형, B: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, C: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).

본 발명은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물, 식품첨가제, 식품, 사료첨가제 및 사료에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 SA12는 포도상구균에 대한 감염능력이 있어 이들을 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 SA12는 포도상구균의 감염으로 인한 질병의 치료에 사용할 수 있고, 식품, 사료 등에 첨가되어 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수도 있으며, 손세정제 등으로 사용될 수도 있다.

본 발명의 박테리오파지 SA12는 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖는 복합형의 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 것으로 동정되었고, 볼티모어 분류법에 의해 이중 나선 DNA (double-stranded DNA)를 갖는 것으로 확인되어 제 1형 바이러스로 분류된다.

본 발명의 시포비리대에 속하는 박테리오파지 SA12는 사람 및 가축 등에 당뇨발, 농양, 독소 증후군 등의 질병을 일으키는 대표적인 박테리아인 포도상구균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.

한편, 본 발명은 시포비리대에 속하는 박테리오파지 SA12를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 세균 사멸용 조성물은 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 제제화의 방법 및 수단에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.

본 발명의 세균 사멸용 조성물은 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 SA12 외에, 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Tryptic Soy Broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 세균 사멸용 조성물은 액상, 반고체상, 분말상 등의 형태로 제조화될 수 있는데, 반드시 상기 3가지 제제에 한정되는 것은 아니고, 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 세균 사멸용 조성물은 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 세균 사멸용 조성물의 투여량은 투여대상에서 포도상구균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 조율 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 그 양이 조절될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 SA12는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균 세균(MRSA)에 우수한 감염능을 가져 박테리오파지 감염 후 30분 이내에 용균활성을 보일 뿐만 아니라, 그 용균활성을 8시간 이상 오래 유지하는 특징을 갖는다.

본 발명의 박테리오파지 또는 이를 포함한 세균 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 포도상구균을 사멸시킬 수 있으므로, 포도상구균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 내성을 갖는 포도상구균에 사용 시, 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 식품업, 축산업 및 어업에서, 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로써 제공될 수 있다.

한편, 본 발명은 박테리오파지 SA12를 함유하는 식품 첨가제 또는 식품을 제공한다. 상기 식품첨가제 또는 식품은 박테리오파지 SA12를 함유하기만 하면 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 대상식품은 포도상구균에 의해 오염되기 쉬운 식품이면 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 SA12를 함유하는 사료 첨가제 또는 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료첨가제 또는 사료 조성물은 박테리오파지 SA12를 함유하기만 하면 그 제형에 국한되지는 않으나, 포도상구균에 감염되기 쉬운 가축을 대상으로 하는 사료 첨가제 또는 사료이면 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 제제예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 제제예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 본 발명의 박테리오파지 SA12 분리 및 동정]

(1) 박테리오파지의 분리

포도상구균에 대한 박테리오파지를 분리하기 위해, 경기도 수원시에 위치한 서울대학교 농장에서 송아지 분변을 취하여 이로부터 박테리오파지 분리실험을 수행하였다.

상기 송아지 분변에 인산완충식염수(phosphate buffer saline), 10배 농축된 액체 배지(TSB broth)를 첨가하였고, 박테리아(황색포도상구균(S. aureus)) 배양액과 혼합하였다.

상기 박테리아와의 혼합액을 12시간 동안 37℃에서 배양하였고, 그 다음 8000 rpm의 속도로 원심분리하여, 상등액을 취한 후, 다시 0.45 μm 막필터로 여과시켰다. 그 여과액 0.1 mL와 12시간 이상 배양한 박테리아(포도상구균) 0.1 mL의 현탁액을 섞어 주었다. 이 혼합액을 낮은 농도의 아가(0.4%) 배지와 함께 섞어서 1.5% 아가 배지를 포함하는 플레이트에 부었다.

이후, 상기 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 일정시간 경과 후, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우에 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다. 이 플라그 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣어 37℃에서 배양하였는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.

그 후, 배양액을 원심분리하고, 상등액만을 취해 0.45 μm 막필터를 통해 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 박테리아를 제거하고, 여과액만을 취하였다. 이때, 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다.

상기의 과정을 통해 얻은 박테리오파지 용액을 가지고, 아가 배지 상에서 다르게 희석하고 주입하여 플라그의 재분리를 3회 수행하였고, 이와 같은 일련의 과정을 통해 순수한 박테리오파지 8개를 얻을 수 있었다.

(2) 박테리오파지 SA12 의 형태 관찰 및 분류

상기 (1)에서 획득한 박테리오파지들 중에서 메티실린 항생제에 대해 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균 세균(MRSA) 모두를 감염시켰던 파지를 선별해 내었고, 그 중에서 박테리오파지 SA12라고 명명한 파지를 가지고 전자현미경 사진을 분석하였다. 전자현미경은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 사용하였다.

관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드(grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 80kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 본 발명에서 선별한 박테리오파지 SA12의 전자현미경 사진이다.

도 1에 관찰된 박테리오파지를 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때, 파지가 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 없으므로, 복합형의 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 분류하였다.

위와 같은 방법으로 얻어진 시포비리데 속 박테리오파지 SA12를 미생물기탁기관인 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터(KACC)에 2013년 4월 25일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 97020P을 부여받았다.

[ 실시예 2: 박테리오파지 SA12 의 숙주별 감수성( susceptibility ) 확인]

숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다(Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York). 2시간 배양한 박테리아 배양액과 0.4%의 아가 배지를 섞은 후, 아가 플레이트 상에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석배수별로 희석된 박테리오파지 SA12를 떨어뜨리고, 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치 배양시켰다.

균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우 플레이트 상에 투명한 영역, 플라그(plaque)가 보이게 되며, 이는 박테리아 세포가 완전하게 용해되어 사멸된 결과를 나타낸다. 만약 감수성이 약한 경우, 뿌옇게 영역이 생기거나 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.

하기 표 1에서는 박테리오파지 SA12 (KACC 97020P)을 사용하여 메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 세균(MSSA)과 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균 세균(MRSA), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)를 대상으로 숙주 감수성을 실험한 결과를 나타내었다. 실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 SA12가 MSSA(하기 표 1에서 MRSA 1종, S. epidermidis 1종을 제외한 나머지 9종 모두 MSSA 임), Methicillin resistant Staphylococcus aureus CCARM 3089와 Staphylococcus epidermidis 균주를 폭넓게 용해시키는 세균사멸능이 있음을 확인할 수 있었다.

표 1에서 C가 의미하는 것은 무엇인지요?

숙주	파지^a
Staphylococcus aureus ATCC 6538	-
Staphylococcus aureus ATCC 23235	-
Staphylococcus aureus ATCC 25923	-
Staphylococcus aureus ATCC 29213	CC
Staphylococcus aureus ATCC 27664	-
Staphylococcus aureus KCTC 1916	CC
Staphylococcus aureus RN4220	C
Staphylococcus aureus RN4220 Δ tagO	-
Staphylococcus aureus RN4220 Δ tagO complemented	C
Methicillin resistant Staphylococcus aureus CCARM 3089	C
Staphylococcus epidermidis ATCC 35983	C

a) C는 Clear plaque (투명한 플라그)을 형성했다는 의미이고, -는 plaque을 형성하지 않은 것을 의미함.

[ 실시예 3: 박테리오파지 SA12 의 용균 활성능 ]

황색포도상구균 균주에 대한 박테리오파지 SA12 (KACC 97020P)의 용균활성능을 알아보고자 하였다. 박테리오파지 SA12의 용균 활성 확인을 위해 두 개의 시험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 대조군(●)에는 숙주균주인 황색포도상구균(ATCC 29213)을 액체배지에서 배양하며 실험하였고, 실험군(▲)에는 숙주균주인 황색포도상구균(ATCC 29213)을 액체배지에서 2시간 배양 후, 박테리오파지 SA12를 감염시켰다. 감염 직후부터 시작하여 일정 시간 간격으로 대조군과 실험군 모두의 흡광도를 측정하며 세포의 생장 및 사멸 정도를 파악하였다.

실험 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지는 기존에 약한 용균활성을 보이던 박테리오파지와 달리, 우수한 감염능을 가져 박테리오파지 감염 후 30분 이내에 용균활성을 띌 뿐만 아니라, 그 용균활성을 8시간 이상 오래 유지하는 특징을 보였다. 이와 같은 특징으로 말미암아, 본 발명의 박테리오파지 SA12는 포도상구균을 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로 활용될 수 있는 것으로 판단할 수 있었다.

도 2는 본 발명 박테리오파지 SA12의 용균활성능을 보여주는 그래프이다.

[ 실시예 4: 박테리오파지 SA12 의 숙주 수용기]

황색포도상구균에 감염하는 박테리오파지 SA12의 작용 경로를 알아보기 위해 숙주 수용기 탐색을 목표로 실험을 수행하였다. 10시간 배양한 야생균주, 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주와 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주의 세 가지 박테리아 배양액과 0.4%의 아가 배지를 각각 섞어 아가 플레이트 상에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석배수별로 희석된 박테리오파지 SA12를 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 정치배양하였다. 실험결과, 도 3에서 보듯이 야생균주는 파지에 대해 감수성을 가지므로 플레이트 상에 투명한 영역으로 플라그가 보인 반면, 테이코산 합성 유전자가 제거된 돌연변이 균주에 대해서는 플라그를 형성하지 못하는 것으로 관찰되었다. 또한, 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 균주를 숙주세균으로 하여 실험을 수행하였을 때, 박테리오파지 SA12가 세포를 완전하게 사멸시킨 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 SA12가 숙주세포를 감염시킬 때 테이코산을 수용체로 사용하는 사실을 정확히 확인할 수 있었다.

도 3은 박테리오파지 SA12의 숙주 수용기를 확인시켜주는 실험결과이다 (A: 황색포도상구균 야생형, B: 테이코산을 합성하는 유전자를 제거한 돌연변이 균주, C: 테이코산 합성 유전자를 회복시킨 재조합 균주).

[ 제제예 1 : 박테리오파지 SA12 를 포함하는 세균사멸용 조성물(미생물 제제)의 제조]

1) 액상 제제 1

박테리오파지 SA12를 포도상구균 배양액에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지의 pfu (plaque forming unit; 파지가 플라그를 형성하는 것을 수치화한 단위, 박테리아의 경우 cfu(colony forming unit)와 유사한 개념임)를 계산하고, TSB 배지에 5.0x10⁹ pfu/ml 의 양으로 준비하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.

2) 액상제제 2

상기 제제예 1의 여과액을 생리식염수 100 ml당 박테리오파지 SA12가 5.0x10¹¹pfu 이 되도록 혼합하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.

3) 반고체상 제제

상기 제제예 1의 여과액을 가축 경피투여용 크림 g 당 박테리오파지 SA12가 5.0x10⁹pfu가 되도록 혼합하여 세균사멸용 반고체상 제제를 제조하였다.

4) 분말형 제제

대두분말 10 g 당 박테리오파지 SA12가 5.0x10⁹pfu이 되도록 제제예 1의 여과액을 첨가, 혼합, 건조 및 분말화하여 세균사멸용 분말형 제제를 제조하였다.

[제제예 2: 박테리오파지 SA12를 함유하는 식품 첨가제의 제조]

표고버섯 분말 50중량%, 새우 분말 30중량%, 다시마 분말 15 중량%, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 5중량%를 혼합하여 조미료로 사용될 수 있는 식품 첨가제 300 g을 제조하였다.

[제제예 3: 박테리오파지 SA12를 함유하는 식품의 제조]

1) 우유 제조

시판 중인 S 제조의 우유 200 mL에 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.

2) 바나나 쥬스 제조

바나나를 믹서에 넣고 갈아 바나나 원액 180 mL를 준비한 후, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 바나나 쥬스 조성물을 제조하였다.

[제제예 4: 박테리오파지 SA12를 함유하는 사료 첨가제 제조]

α-토코페롤 5.0중량%, 오징어간유 0.75중량%, 효모 93.25중량%, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 혼합하여 사료 첨가제를 1 kg을 제조하였다.

[제제예 5: 박테리오파지 SA12를 함유하는 사료의 제조]

1) 산란계용 사료조성물 제조

상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0%(w/w)를 시판 산란계용 사료(디럭스 산란(제품명), 부국사료, 한국)에 첨가하여 산란계용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.

2) 넙치 양식용 사료조성물 제조

어분 58중량%, 대두박 4중량%, 콘글루텐분 3중량%, 소맥분 28.7중량%, 오징어간유 4중량%, 비타민 혼합제 1.2중량% 및 미네랄 혼합제 1중량%를 포함한 기본 사료에 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 첨가하여 넙치 양식용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.

농업생명공학연구원

KACC97020

20130425

Claims

포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 SA12 (KACC97020P).
박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세균은,
포도상구균인 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 포도상구균은,
메티실린 항생제에 감수성이 있는 포도상구균 또는 메티실린에 저항성을 갖는 포도상구균인 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
액상, 고체상 및 분말상 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
박테리오파지 SA12 (KACC97020P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.