KR20140129263A - 트리알킬 양이온성 지질 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료제의 세포에의 전달용 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 이들은 신규, 트리알킬, 양이온성 지질 및 핵산-지질 입자를 포함하고, 상기 입자는 핵산의 효율적인 캡슐화 및 캡슐화된 핵산의 생체내 세포에의 효율적인 전달을 제공한다. 본 발명의 조성물은 아주 강력하므로, 비교적 낮은 용량에서 특이적 표적 단백질의 효과적인 넉다운을 허용한다.

Description

트리알킬 양이온성 지질 및 그의 사용 방법{TRIALKYL CATIONIC LIPIDS AND METHODS OF USE THEREOF}
[관련 출원의 상호 참조]
본원은 그 전체가 참조로 본원에 편입되어 있는 미국 가출원 61/602,990(2012년 2월 24일 출원)을 우선권으로 주장한다.
[발명의 분야]
본 발명은 신규 트리알킬 양이온성 지질, 상기 트리알킬 양이온성 지질을 하나 이상 포함하는 지질 입자, 상기 지질 입자를 제조하는 방법, 및 (예컨대, 포유동물의 질환을 치료하기 위해) 상기 지질 입자를 전달 및/또는 투여하는 방법에 관한 것이다.
치료적 핵산은, 예를 들어 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 플라스미드 및 면역 자극 핵산을 포함한다. 이들 핵산은 다양한 기전을 통해 작용한다. siRNA 및 miRNA와 같은 간섭 RNA 분자들의 경우, 이들 핵산은 RNA 간섭(RNAi)이라 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향-조절할 수 있다. 세포질 내에 간섭 RNA의 도입 후, 이러한 이중-가닥 RNA 구조는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. 간섭 RNA의 센스 가닥은 RISC 복합체로부터 변위되고, 결합된 간섭 RNA의 서열과 상보적 서열을 갖는 mRNA를 인식하고 그에 결합할 수 있는 RISC 내에 주형(template)을 제공한다. 상보적 mRNA에 결합된 RISC 복합체는, mRNA를 절단하고 상기 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 단백질 합성을 인코딩하는 상응하는 mRNA의 특이적 파괴를 표적화함으로써, 특정 단백질을 하향-조절할 수 있다.
간섭 RNA 구조는 표적 단백질을 지향하는 임의의 뉴클레오타이드 서열로 합성될 수 있기 때문에, RNAi의 치료적 용도는 매우 광범위하다. 현재까지, siRNA 구조는 생체외 및 생체내 모델 모두에서 표적 단백질을 특이적으로 하향-조절하는 능력을 보여주었다. 또한, siRNA 구조는 현재 임상 연구에서 평가되고 있다.
그러나, 간섭 RNA 구조가 현재 직면하고 있는 2가지 문제점은, 첫째, 혈장 내 뉴클레아제 분해에 대한 민감성이고, 둘째, 이것이 유리 간섭 RNA 분자로서 전신 투여되는 경우, RISC에 결합할 수 있는 세포내 구획에 대한 접근 능력의 한계이다. 이러한 이중-가닥 구조는 분자 내에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 링커(linker), 예를 들어 포스포티오에이트 기의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 그러나, 이러한 화학적으로 변형된 링커는 뉴클레아제 분해에서 단지 제한된 보호를 제공하고 구조의 활성을 감소시킬 수 있다. 간섭 RNA의 세포내 전달은 담체 시스템(예를 들어 중합체, 양이온성 리포좀)의 이용에 의하거나, 또는 분자에 대한 콜레스테롤 잔기의 공유 결합에 의해 촉진될 수 있다. 그러나, siRNA와 miRNA와 같은 간섭 RNA 분자의 효능을 증가시키고 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 링커에 대한 요구를 감소시키거나 배제하기 위해서는 개선된 전달 시스템이 요구된다.
또한, 세포막을 횡단하는 간섭 RNA와 같은 치료적 핵산의 제한된 능력으로 인한 문제점(문헌[Vlassov, 등., Biochim . Biophys . Acta 1197:95-1082 (1994)] 참조), 그리고 전신 독성과 연관된 문제점, 예를 들어 보체-매개된 과민증, 변형 응고 특성 및 혈구감소증(문헌[Galbraith, 등., Antisense Nucl . Acid Drug Des. 4:201-206 (1994))은 여전히 남아있다.
효능을 개선하기 위해, 연구자들은 화학적으로 변형되거나 변형되지 않은 치료적 핵산을 전달하기 위해 지질-기반 담체 시스템을 또한 채택했다. 문헌[Zelphati, 등., F.C., J. Contr . Rel. 41:99-119 (1996)]은 음이온성(통상적인) 리포좀, pH 민감성 리포좀, 면역리포좀, 융합성 리포좀 및 양이온성 지질/안티센스 응집체의 이용에 대해 기술하고 있다. 유사하게, siRNA는 양이온성 리포좀으로 전신 투여되었고, 이들 핵산-지질 입자는 비-인간 영장류를 포함하는 포유 동물에서 표적 단백질의 개선된 하향-조절을 제공하는 것으로 보고되었다(문헌[Zimmermann 등., Nature 441: 111-114 (2006)]).
이러한 진전에도 불구하고, 일반적인 치료적 용도에 적합한 개선된 지질-치료적 핵산 조성물이 당해 분야에서 여전히 요구된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 높은 효율로 핵산을 캡슐화하고, 높은 약물:지질 비율을 가지며, 캡슐화된 핵산을 혈청 내 분해 및 제거로부터 보호하고, 전신 전달에 적합하고, 캡슐화된 핵산의 세포내 전달을 제공할 것이다. 또한, 이들 핵산-지질 입자는 충분히 내성이고, 효과적인 핵산의 투여량으로 환자를 치료하는 것이 환자에게 심각한 독성 및/또는 위험과 연관되지 않도록 적절한 치료 지수(therapeutic index)를 제공해야 한다.
본 발명은 신규 트리알킬 양이온성 (아미노) 지질 및, 핵산의 생체내 전달에 유리한 이들 지질을 포함하는 지질 입자, 뿐만 아니라 생체내 치료 용도에 적당한 핵산-지질 입자 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 조성물의 제조 방법, 뿐만 아니라 예를 들면, 다양한 질환 상태의 치료를 위해 이들 조성물을 사용하여 핵산을 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에서 개시된 모든 신규 화합물 및 중간체를 포함한다.
본원의 실시예 2에서 기재된 바와 같이, 본 발명의 트리알킬 양이온성 지질은, 더 긴 알킬 사슬을 갖는 동일한 지질과는 달리 쥣과 ApoB siRNA 분석에서 더 강력하다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 구조 식 (I)을 갖는 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염)을 제공한다:
X-A-Y-Z;
(I)
여기서:
X는 알킬아미노이고;
A는 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬이고, 여기서 상기 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬은 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;
Y는 케탈, 에스테르, 임의로 치환된 카바메이트, 에테르, 및 임의로 치환된 아마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Z는 3 개의 알킬 사슬로 이루어진 소수성 모이어티이고, 여기서 상기 각각의 알킬 사슬은 C8 내지 C11의 길이를 가지며, 여기서 상기 각각의 3 개의 알킬 사슬은 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 각각의 3 개의 알킬 사슬은 임의로 치환된다.
식 (I)의 지질에 대해, 알킬아미노 그룹의 대표적인 예는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 및 에틸메틸아미노를 포함한다.
한 번 더 식 (I)의 지질에 대해, 카바메이트 및/또는 아마이드 그룹 상에 존재하는 임의의 치환체의 대표적인 예는 포화 또는 불포화된 알킬 그룹 (예를 들면, C1-C6 알킬)이다.
한 번 더 식 (I)의 지질에 대해, 소수성 모이어티 Z의 3 개의 알킬 사슬 중 하나 이상 상에 존재할 수 있는 임의의 치환체의 대표적인 예는 하이드록실 그룹이다.
한 번 더 식 (I)의 지질에 대해, 소수성 모이어티 Z의 알킬 사슬이 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중결합을 함유하는 경우, 이때 그 알킬 사슬을 불포화된 것이라고 하는 것으로 이해될 것이다.
한 번 더 식 (I)의 지질에 대해, 의심할 여지를 없애기 위해, 하나 이상의 소수성 모이어티 Z의 알킬 사슬은 사이클로알킬 그룹 (예를 들면, 사이클로프로필)을 포함할 수 있다는 것으로 이해될 것이다.
한 번 더 식 (I)의 지질에 대해, 용어 "에스테르"는 구조 -C(=O)O- 또는 -OC(=O)-를 갖는 에스테르를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "아마이드"는 구조 -C(=O)NR- 또는 -NR(=O)C-를 갖는 아마이드를 포함한다. 용어 "카바메이트"는 구조 -OC(=O)NR- 또는 -NRC(=O)O-를 갖는 카바메이트를 포함한다.
식 (I)의 지질은, 예를 들면, 치료제 (예를 들면, siRNA와 같은 생물학적 활성 핵산 분자)를 이를 필요로 하는 포유동물 (예를 들면, 인간)에게 전달하는데 유용한 본 발명의 지질 입자를 제조하는데 유용하다.
식 (I)의 지질의 일부 구현예에서, Z는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00001
여기서, R1, R2, 및 R3 은 각각 독립적으로 C8 내지 C11 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 R1, R2, 및 R3은 각각 임의로 치환된다.
추가 측면에서, 본 발명은 상기 식 I의 양이온성 지질 중 하나 이상 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염)을 포함하는 지질 입자를 제공한다. 어떤 구현예에서, 지질 입자는 추가로, 하나 이상의 비-양이온성 지질 예컨대 중성 지질을 포함한다. 어떤 다른 구현예에서, 지질 입자는 추가로, 입자 응집을 감소 또는 억제할 수 있는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질을 포함한다. 추가 구현예에서, 지질 입자는 추가로, 하나 이상의 활성제 또는 치료제를 포함한다.
어떤 구현예에서, 지질 입자의 비-양이온성 지질 성분은 인지질, 콜레스테롤 (또는 콜레스테롤 유도체), 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 하나의 특별한 구현예에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 또는 그의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 입자의 콘쥬게이트된 지질 성분은 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG)-지질 콘쥬게이트를 포함한다. 어떤 예에서, PEG-지질 콘쥬게이트는 PEG-디아실글리세롤 (PEG-diacylglycerol, PEG-DAG) 콘쥬게이트, PEG-디알킬옥시프로필 (PEG-dialkyloxypropyl, PEG-DAA) 콘쥬게이트, 또는 그의 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 지질 콘쥬게이트는 폴리옥사졸린 (polyoxazoline, POZ)-지질 콘쥬게이트 예컨대 POZ-DAA 콘쥬게이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 활성제 또는 치료제는 핵산을 포함한다. 어떤 예에서, 핵산은 간섭 RNA 분자(예를 들면, siRNA, aiRNA, miRNA, 다이서(Dicer)-기질 dsRNA, shRNA, 또는 그의 혼합물)을 포함한다. 어떤 다른 예에서, 핵산은 단일가닥 또는 이중-가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 또는 그의 혼합물)을 포함한다.
다른 구현예에서, 활성제 또는 치료제는 지질 입자의 지질부 내에 완전히 캡슐화되고, 이로써 지질 입자 중 활성제 또는 치료제는, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의한 효소 분해를 위한 수용액 내에서 내성이 있다. 추가 구현예에서, 지질 입자는 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비독성이다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 지질 입자 (예를 들면, LNP)를 제공한다: (a) 하나 이상의 핵산(예컨대 간섭 RNA 분자); (b) 식 I의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자들의 응집을 억제하는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 지질 입자 (예를 들면, LNP)를 제공한다: (a) 하나 이상의 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol % 내지 약 85 mol %를 포함하는, 식 I의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 13 mol % 내지 약 49.5 mol %를 포함하는 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol % 내지 약 2 mol %를 포함하는, 입자들의 응집을 억제하는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질.
상기 구현예의 일 측면에서, 지질 입자 (예를 들면, LNP)은 하기를 포함한다: (a) 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 52 mol % 내지 약 62 mol %를 포함하는,식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol % 내지 약 47 mol %를 포함하는, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 mol % 내지 약 2 mol %를 포함하는,PEG-지질 콘쥬게이트. 핵산-지질 입자의 상기 구현예는 일반적으로 "1:57" 제형으로 본원에서 칭한다. 하나의 특별한 구현예에서, 1:57 제형은 4-성분 시스템이고, 이 시스템은 약 1.4 mol % PEG-지질 콘쥬게이트 (예를 들면, PEG2000-C-DMA), 약 57.1 mol % 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염, 약 7.1 mol % DPPC (또는 DSPC), 및 약 34.3 mol % 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)를 포함한다.
상기 구현예의 또 하나의 측면에서, 지질 입자 (예를 들면, LNP)은 하기를 포함한다: (a) 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 56.5 mol % 내지 약 66.5 mol %를 포함하는, 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 31.5 mol % 내지 약 42.5 mol %를 포함하는, 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 mol % 내지 약 2 mol %를 포함하는, PEG-지질 콘쥬게이트. 핵산-지질 입자의 상기 구현예는 일반적으로 "1:62" 제형이라 본원에서 칭한다. 하나의 특별한 구현예에서, 1:62 제형은 인지질이 없고 약 1.5 mol % PEG-지질 콘쥬게이트 (예를 들면, PEG2000-C-DMA), 약 61.5 mol % 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염, 및 약 36.9 mol % 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)를 포함하는 3-성분 시스템이다.
1:57 및 1:62 제형과 관련된 추가의 구현예는 PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 지질 입자 (예를 들면, LNP)를 제공한다: (a) 하나 이상의 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 2 mol % 내지 약 50 mol %를 포함하는, 식 I 또는 II 의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 90 mol %를 포함하는, 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol % 내지 약 20 mol %를 포함하는, 입자들의 응집을 억제하는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질.
상기 구현예의 일 측면에서, 지질 입자 (예를 들면, LNP)은 하기를 포함한다: (a) 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol % 내지 약 50 mol %를 포함하는, 식 I의 양이온성 지질 또는 염, 예를 들면, 그의 약제학적으로 허용가능한 염; (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 47 mol % 내지 약 69 mol %를 포함하는, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 mol % 내지 약 3 mol %를 포함하는, PEG-지질 콘쥬게이트. 지질 입자의 상기 구현예는 일반적으로 "2:40" 제형이라 본원에서 칭한다. 하나의 특별한 구현예에서, 2:40 제형은 약 2 mol % PEG-지질 콘쥬게이트 (예를 들면, PEG2000-C-DMA), 약 40 mol % 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염, 약 10 mol % DPPC (또는 DSPC), 및 약 48 mol % 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)를 포함하는 4-성분 시스템이다.
추가 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP)를 제공한다: (a) 하나 이상의 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol % 내지 약 65 mol %를 포함하는, 식 I의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol % 내지 약 45 mol %를 포함하는, 하나 이상의 비-양이온성 지질; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 10 mol %를 포함하는, 입자들의 응집을 억제하는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질.
상기 구현예의 일 측면에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol % 내지 약 60 mol %를 포함하는, 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 35 mol % 내지 약 45 mol %를 포함하는, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 10 mol %를 포함하는, PEG-지질 콘쥬게이트. 핵산-지질 입자의 상기 구현예는 일반적으로 "7:54" 제형이라 본원에서 칭한다. 어떤 예에서, 7:54 제형 중 비-양이온성 지질 혼합물은 하기를 포함한다: (i) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 10 mol %의 인지질; 및 (ii) 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol % 내지 약 35 mol %의 콜레스테롤 또는 그의 유도체. 하나의 특별한 구현예에서, 7:54 제형은 약 7 mol % PEG-지질 콘쥬게이트 (예를 들면, PEG750-C-DMA), 약 54 mol % 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염, 약 7 mol % DPPC (또는 DSPC), 및 약 32 mol % 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)를 포함하는 4-성분 시스템이다.
상기 구현예의 또 하나의 측면에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 핵산; (b) 입자에 존재하는 총 지질의 약 55 mol % 내지 약 65 mol %를 포함하는, 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염); (c) 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol % 내지 약 40 mol %를 포함하는, 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 및 (d) 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 10 mol %를 포함하는, PEG-지질 콘쥬게이트. 핵산-지질 입자의 상기 구현예는 일반적으로 "7:58" 제형이라 본원에서 칭한다. 하나의 특별한 구현예에서, 7:58 제형은 인지질이 없고 약 7 mol % PEG-지질 콘쥬게이트 (예를 들면, PEG750-C-DMA), 약 58 mol % 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염, 및 약 35 mol % 콜레스테롤 (또는 그의 유도체)를 포함하는 3-성분 시스템이다.
7:54 및 7:58 제형과 관련된 추가의 구현예는 미국 공개 특허 출원 번호 US2011/0076335 (2010년 6월 30일 출원)에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명은 또한, 지질 입자, 예컨대 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP) 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 치료제 예컨대 핵산을 세포에 도입하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 본원에서 기재된 지질 입자 (예를 들면, LNP)와 접촉시키는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 포유동물 내에 있는 것이고 포유동물은 인간이다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 핵산과 같은 하나 이상의 치료제의 생체내 전달 방법을 제공하고, 상기 방법은 포유동물에게 본원에서 기재된 지질 입자 (예를 들면, LNP)를 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 지질 입자 (예를 들면, LNP)은 하기의 투여 경로 중 하나의 의해 투여된다: 경구, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 및 진피내. 특별한 구현예에서, 지질 입자 (예를 들면, LNP)은 전신으로(예를 들면, 장의 또는 비경구 투여 경로를 통해) 투여된다. 바람직한 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물에게, 하나 이상의 치료제(예컨대 핵산)를 포함하는 치료적 유효량의 지질 입자 (예를 들면, LNP)를 투여하는 것을 포함한다. 질환 또는 장애의 비-제한적인 예는 바이러스성 감염, 간 질환 또는 장애, 및 암을 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP) 중 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)을, 단독으로 또는 지질-저하제와 함께 투여하여 간 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 지질 질환 및 장애의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 이상지질혈증 (예를 들면, 상승된 트리글리세라이드 수준 (초고트리글리세라이드혈증) 및/또는 상승된 콜레스테롤 수준 (고콜레스테롤혈증)과 같은 고지혈증), 죽상동맥경화증, 관상동맥 심장병, 관상동맥 질환, 죽상경화성 심혈관 질환 (cardiovascular disease , CVD), 지방간 질환 (간성 지방증), 비정상 지질 대사, 비정상 콜레스테롤 대사, 당뇨병 (제2형 당뇨병 포함), 비만, 심혈관 질환, 및 비정상 대사와 관련된 다른 장애들. 지질-저하제의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 스타틴, 피브레이트, 에제티마이브, 티아졸리딘디온, 니아신, 베타-차단제, 니트로글리세린, 칼슘 길항제, 및 물고기 오일.
하나의 특별한 구현예에서, 본 발명은 콜레스테롤 수준을 저하 또는 감소시키는 방법을 필요로 하는 포유동물 (예를 들면, 인간) (예를 들면, 상승된 혈액 콜레스테롤 수준을 가지고 있는 포유동물) 에 상기 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물에게 치료적 유효량의 본원에서 기재된 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP 제형)을 투여하는 것을 포함하고, 상기 입자는 대사성 질환 및 장애와 연관된 하나 이상의 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)를 포함한다. 또 하나의 특별한 구현예에서, 본 발명은 트리글리세라이드 수준을 저하 또는 감소시키는 방법을 필요로 하는 포유동물 (예를 들면, 인간) (예를 들면, 상승된 혈액 트리글리세라이드 수준을 가지고 있는 포유동물)에 상기 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물에게 치료적 유효량의 본원에서 기재된 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP 제형)을 투여하는 것을 포함하고, 상기 입자는 대사성 질환 및 장애와 연관된 하나 이상의 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)를 포함한다. 이들 방법은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 시험관내에서 또는 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)을 투여하여 생체내에서 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)는 인간과 같은 포유동물의 간 세포 (예를 들면, 헤파이토사이트)에 전달된다.
지질 입자를 사용하여 간 질환 또는 장애를 치료하는 것과 관련된 추가의 구현예는, 예를 들면, PCT 출원 번호 PCT/CA2010/000120(2010년 1월 26일 출원), 및 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0134189에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP) 중 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)를, 단독으로 또는 화학요법 약물과 함께 투여하여 세포 증식성 장애 예컨대 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 시험관 내에서 또는 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)를 투여하여 생체내에서 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)는 포유동물, 예컨대 인간의 암 세포에, 단독으로 또는 화학요법 약물과 함께 전달된다. 핵산-지질 입자 및/또는 화학요법 약물은 또한 종래의 호르몬, 면역치료, 및/또는 방사선치료 제제와 함께 공-투여될 수 있다.
지질 입자를 사용하여 세포 증식성 장애를 치료하는 것과 관련된 추가의 구현예는, 예를 들면, PCT 공개 번호 WO 09/082817, 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0149403, 및 PCT 공개 번호 WO 09/129319에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP) 중 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)을, 단독으로 또는 바이러스 병태 또는 그것과 연관된 임의의 증상을 치료 또는 개선하기 위해 사용된 종래의 제제의 투여와 의해 출혈열 또는 급성 또는 만성 감염을 야기하는 간염 (예를 들면, C형 간염 바이러스) 을 야기하는 바이러스성 감염(예컨대 아레나바이러스 (예를 들면, 라사 바이러스) 또는 필로바이러스 (예를 들면, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 등) 감염)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 시험관 내에서 또는 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 간섭 RNA를 투여하여 생체내에서 수행될 수 있다. 어떤 구현예에서, 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)는 출혈열 바이러스에 감염되거고/거나 그것에 민감한 포유동물, 예컨대 인간의 세포, 조직, 또는 기관, 예를 들면, 세망내피계의 세포 (예를 들면, 단핵구, 대식세포, 등)에 전달된다. 어떤 다른 구현예에서, 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)는 간염 바이러스에 감염되고/거나 그것에 민감한 포유동물, 예컨대 인간의 세포, 조직, 또는 기관, 예를 들면, 간의 세포 (예를 들면, 헤파토사이트)에 전달된다.
지질 입자를 사용하여 바이러스성 감염을 예방 또는 치료하는 것과 관련된 추가의 구현예는 하기 예에서 기재되어 있다: 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0218122, 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0135370, 및 PCT 출원 번호 PCT/CA2010/000444, 명칭 "Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression," (2010년 3월 19일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
식 I의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염)을 포함하는 본 발명의 지질 입자 (예를 들면, LNP)가 핵산, 예컨대 간섭 RNA의 대상체 (예를 들면, 포유동물, 예컨대 인간)에의 투여에 특히 유리하고 적당한 것은, 순환 안정적이고, 혈관외 부위에의 접근을 야기하는 약동학적 행동에 필요한 크기이고, 표적 세포 집단에 도달할 수 있기 때문이다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
I. 도입
본 발명은, 부분적으로, 핵산과 같은 활성제 또는 치료제를 지질 입자로 사용하는 경우, 포유동물의 세포 내로 생체내 전달하기 위한 이점을 제공하는 신규 양이온성 (아미노) 지질에 기초한다. 특히, 본 발명은, 핵산(예컨대, 간섭 RNA)의 개선된 활성 및 생체내 조성물의 개선된 내성을 제공함으로써, 앞서 기술한 핵산-지질 입자 조성물에 비해 치료 지수의 상당한 증가를 가져오는 본원에 기재된 하나 이상의 신규 양이온성 지질을 포함하는 핵산-지질 입자 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 siRNA와 같은 간섭 RNA의 생체외 및 생체내 전달을 위한 개선된 조성물의 제형화에 이용가능한 신규 양이온성 지질을 제공한다. 본원에서는 이러한 개선된 지질 입자 조성물이 표적 유전자의 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준을 하향 조절(예컨대, 억제)하는 데 효과적이라는 것을 보여준다. 또한, 본원에서는 이러한 개선된 지질 입자 조성물의 활성이 본 발명의 신규 양이온성 지질의 존재에 의존한다는 것을 보여준다.
본 발명의 지질 입자 및 조성물은 생체외 및 생체내 모두에서 세포들에 캡슐화된 또는 연관된(예컨대, 복합체화된) 치료제 예컨대 핵산을 전달하는 것을 포함하는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 캡슐화하거나 또는 적절한 치료제와 연관된 지질 입자와 대상체를 접촉시킴으로써 이를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 지질 입자는 본원에 기재된 신규 양이온성 지질을 하나 이상 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 지질 입자는 예를 들어 siRNA와 같은 간섭 RNA 분자를 포함하는 핵산의 전달에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 지질 입자 및 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 신규 양이온성 지질을 포함하는 지질 입자와 세포들을 접촉시킴으로써 표적 유전자 및 단백질의 생체외 및 생체내 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 이때 상기 지질 입자는 표적 유전자 발현을 감소시키는 핵산(예컨대, siRNA)을 캡슐화하거나 또는 이와 연관된다. 다르게는, 본 발명의 지질 입자 및 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 신규 양이온성 지질을 포함하는 지질 입자와 세포들을 접촉시킴으로써 원하는 단백질의 생체외 및 생체내 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있으며, 이때 상기 지질 입자는 원하는 단백질의 발현을 증대시키는 핵산(예컨대, 원하는 단백질을 인코딩하는 플라스미드)을 캡슐화하거나 또는 이와 연관된다.
본 발명의 양이온성 지질, 이를 포함하는 지질 입자 및 조성물, 및 유전자 및 단백질 발현을 조정하기 위한 이들의 활성제 또는 치료제 예컨대 핵산의 전달 용도에 대한 다양한 예시적인 구현예들을 이하에서 더 상세히 기재한다.
II . 정의
본원에 사용된 하기 용어들은 달리 명시되지 않는 한 아래 규정된 용어들과 같은 의미를 갖는다.
본원에서, 용어 "약"은 본 발명의 지질 입자 또는 제형 성분의 양과 관련하여 사용되는 경우 성분에 명시된 양의 ±5%의 값을 포함한다(예컨대, 약 10%는 9.5% 내지 10.5%의 값을 포함한다). 따라서, "약"이라는 용어는 성분에 명시된 양의 + 또는 - 1%, 2%, 3% 또는 4%의 값을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "간섭 RNA" 또는 "RNAi" 또는 "간섭 RNA 서열"은 간섭 RNA가 표적 유전자 또는 서열과 같은 세포에 존재하는 경우 (예를 들어, 간섭RNA 서열에 상보적인 mRNA의 번역의 저하 또는 억제를 매개함으로써) 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 단일 가닥 RNA(예컨대, 성숙 miRNA, ssRNAi 올리고 뉴클레오타이드, ssDNAi 올리고 뉴클레오타이드) 또는 이중 가닥 RNA(즉, siRNA, 다이서(Dicer)-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA 또는 pre-miRNA와 같은 이중(duplex) RNA)를 포함한다. 그러므로, 간섭 RNA는 표적 mRNA 서열에 상보적인 단일 가닥 RNA를 지칭하거나 또는 2개의 상보적인 가닥에 의하거나 또는 단일 자체-상보적인 가닥에 의해 형성된 이중 가닥 RNA를 지칭한다. 간섭 RNA는 표적 유전자 또는 서열에 상당한 또는 완전한 실체를 가질 수도 있고, 불일치 영역(즉, 불일치 모티프)을 가질 수도 있다. 간섭 RNA의 서열은 전체 길이 표적 유전자 또는 이들의 부분 서열(subsequence)에 상응할 수 있다. 바람직하게는, 상기 간섭 RNA 분자는 화학적으로 합성된다.
간섭 RNA는 "소형-간섭 RNA" 또는 "siRNA" 예컨대 약 15 내지 60개, 15 내지 50개 또는 15 내지 40개 (이중) 뉴클레오타이드 길이, 더 전형적으로 약 15 내지 30개, 15 내지 25개 또는 19 내지 25개 (이중) 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 20 내지 24개, 21 내지 22개 또는 21 내지 23개 (이중) 뉴클레오타이드 길이의 간섭 RNA를 포함한다(예컨대, 이중 가닥 siRNA의 각각의 상보적 서열은 15 내지 60개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 15 내지 30개, 15 내지 25개 또는 19 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 20 내지 24개, 21 내지 22개 또는 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이고, 이중 가닥 siRNA는 15 내지 60개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 15 내지 30개, 15 내지 25개 또는 19 내지 25개 염기 쌍 길이, 바람직하게는 약 18 내지 22개, 19 내지 20개 또는 19 내지 21개 염기 쌍 길이이다). siRNA 이중 가닥은 약 1 내지 4개 또는 약 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행(overhang) 및 5' 포스페이트 말단을 포함할 수 있다. siRNA의 비제한적인 예로 2개의 개별적인 가닥 분자로부터 조립되는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자(이때, 한 가닥은 센스 가닥이고 다른 하나는 상보적인 안티센스 가닥임); 단일 가닥 분자로부터 조립되는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자(이 때, 센스 및 안티센스 영역은 핵산계 또는 비-핵산계 링커에 의해 연결되어 있음); 자체-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 2차 헤어핀 구조를 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자; 및 2개 이상의 루프 구조 및 자체-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 줄기를 갖는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자(이때, 원형 폴리뉴클레오타이드를 생체내 또는 시험관내에서 처리하여 활성 이중 가닥 siRNA 분자를 생성할 수 있음)를 포함한다.
바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. siRNA는 또한 긴 dsRNA(예를 들어, 약 25개보다 긴 뉴클레오타이드 길이를 가진 dsRNA)를 E. coli RNase III 또는 다이서에 의해 절단시켜 생성될 수 있다. 상기 효소들은 상기 dsRNA를 생물학적 활성 siRNA로 가공할 수 있다.(예컨대, 문헌[Yang 등., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99:9942-9947 (2002)]; [Calegari 등., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 99:14236 (2002)]; [Byrom 등., Ambion TechNotes , 10(1):4-6 (2003)]; [Kawasaki 등., Nucleic Acids Res ., 31:981-987 (2003)]; [Knight 등., Science, 293:2269-2271 (2001)]; 및 [Robertson 등., J. Biol . Chem ., 243:82 (1968)] 참조). 바람직하게는, dsRNA는 적어도 50 내지 약 100개, 약 200개, 약 300개, 약 400개 또는 약 500개 뉴클레오타이드 길이이다. dsRNA는 1000, 1500, 2000, 5,000개 뉴클레오타이드 길이 또는 그보다 더 길 수 있다. 상기 dsRNA는 전체 유전자 전사체 또는 부분적인 유전자 전사체를 인코딩할 수 있다. 어떤 경우에는, siRNA는 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있다(예를 들면, 헤어핀 루프가 이중 가닥으로 자동으로 접혀진 서열로서 전사될 수 있다).
본원에 사용된 "불일치 모티프" 또는 "불일치 영역"이라는 용어는 표적 서열에 100% 상보성이 아닌 간섭 RNA(즉, siRNA) 서열 부분을 지칭한다. 간섭 RNA는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 불일치 영역을 가질 수 있다. 상기 불일치 영역은 연속적이거나 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 상기 불일치 모티프 또는 지역은 단일 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
"표적 유전자의 발현을 억제하는"이라는 문구는 표적 유전자의 발현을 사일런싱시키거나 감소시키거나 또는 억제하는 간섭 RNA(예컨대, siRNA) 또는 다른 치료제의 능력을 지칭한다. 유전자 사일런싱의 정도를 검사하기 위해서는, 시험 샘플(예컨대, 표적 유전자를 발현하는 배양액 중의 세포들의 샘플) 또는 시험 포유동물(예컨대, 포유류(예컨대, 인간 또는 동물) 모델(예컨대 설치류(예컨대, 마우스) 또는 비-인간 영장류(예컨대, 원숭이 모델))를, 표적 유전자의 발현을 사일런싱시키거나 감소시키거나 억제하는 간섭 RNA(예컨대, siRNA)와 접촉시킨다. 상기 시험 샘플 또는 시험 동물에서의 표적 유전자의 발현을, 간섭 RNA(예컨대, siRNA)와 접촉하지 않거나 이를 투여받지 않은 대조 샘플(예컨대, 표적 유전자를 발현하는 배양액 중의 세포들의 샘플) 또는 대조 포유동물(예컨대, 포유류(예컨대, 인간 또는 동물)) 모델(예컨대. 설치류(예컨대, 마우스) 또는 비-인간 영장류(예컨대, 원숭이) 모델))에서의 표적 유전자의 발현과 비교한다. 대조 샘플 또는 대조 포유동물에서의 표적 유전자의 발현은 100% 값이 할당될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 발현의 사일런싱, 억제 또는 감소는, 대조 샘플 또는 대조 포유동물에서의 표적 유전자의 발현 수준에 대한 시험 샘플 또는 시험 포유동물에서의 표적 유전자의 발현 수준이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 0%인 경우에 달성된다. 즉, 간섭 RNA(예컨대, siRNA)는 간섭 RNA(예컨대, siRNA)와 접촉하지 않거나 이를 투여받지 않은 대조 샘플 또는 대조 포유동물에서의 표적 유전자의 발현 수준에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 수준까지 시험 샘플 또는 시험 포유동물에서의 표적 유전자의 발현을 사일런싱시키거나 감소시키거나 또는 억제한다. 표적 유전자의 발현 수준을 결정하기에 적합한 분석법은, 비-제한적으로, 당업자에게 공지된 기술(예를 들어 도트 블랏(dot blot), 노던 블랏(Northern blot), 인시튜(in situ) 하이브리드화, ELISA, 면역침강, 효소 작용뿐만 아니라 표현형 분석)을 사용하여 단백질 또는 RNA 수준을 검사하는 것을 포함한다.
간섭 RNA와 같은 활성제 또는 치료제의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양(예를 들어, 간섭 RNA의 부재 하에 검출된 정상 발현 수준에 비해 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양)이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현 억제는 대조군에 대해 간섭 RNA에 의해 얻어진 값이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 0%인 경우에 달성된다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하기에 적합한 분석은, 예를 들면, 당업자에게 공지된 기술(예를 들어 도트 블랏, 노던 블랏, 인시튜 하이브리드화, ELISA, 면역침강, 효소 작용뿐만 아니라 표현형 분석)을 사용하여 단백질 또는 mRNA 수준을 검사하는 것을 포함한다.
간섭 RNA에 의한 면역 반응의 "감소하다(decrease)", "감소하는", "낮추다(reduce)" 및 "낮추는"이란 주어진 간섭 RNA(예컨대, 변형된 간섭 RNA) 또는 다른 치료제에 대한 면역 반응의 검출가능한 감소를 의미하는 것으로 의도된다. 변형된 간섭 RNA에 의한 면역 반응의 감소량은 비-변형된 간섭 RNA의 존재 하에서의 면역 반응의 수준에 대해 상대적으로 결정될 수 있다. 검출가능한 감소는 비-변형된 간섭 RNA의 존재 하에서의 면역 반응보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 이보다 더 낮을 수 있다. 간섭 RNA에 대한 면역 반응의 감소는 전형적으로 간섭 RNA의 투여 후 생체외 반응 세포에 의한 사이토카인 생성(예컨대, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, IL-12)의 감소에 의해 측정되거나 또는 포유동물 대상체의 혈청에서의 사이토카인 생성의 감소에 의하여 측정된다.
본원에 사용된 "반응 세포"라는 용어는 면역자극성 간섭 RNA(예컨대 비-변형된 siRNA)와 접촉되는 경우 검출가능한 면역 반응을 생성하는 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 지칭한다. 예시적인 반응 세포는, 예를 들면, 수지상 세포, 대식 세포, 말초 혈관 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 비장 세포 등을 포함한다. 검출가능한 면역 반응은, 예를 들면, 사이토카인 또는 성장 인자(예컨대 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF 및 이들의 조합물)의 생성을 포함한다. 검출가능한 면역 반응은 또한 예를 들면 테트라트리코펩티드 반복 1(IFIT1) mRNA를 가진 인터페론 유도된 단백질을 유도하는 것을 포함한다.
"실질적인 동일성"이란 엄격한 조건 하에서 기준 서열에 하이브리드화되는 서열을 지칭하거나, 또는 기준 서열의 지정된 영역에 특정 비율의 동일성을 갖는 서열을 의미한다.
"엄격한 하이브리드화 조건"이란 문구는 핵산이 전형적으로 핵산의 복합 혼합물에서 표적 서열에 하이브리드화되지만 다른 서열에는 하이브리드화되지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며 상황마다 다를 것이다. 긴 서열은 특히 고온에서 하이브리드화된다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 문헌[Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology --Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다(표적 서열은 Tm에서 과잉으로 존재하므로, 프로브의 50%는 평형상태에서 점유된다). 엄격한 조건은 또한 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특정 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 배경(background)의 적어도 2배, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10배이다.
예시적인 하이브리드화 조건은 50% 포름아마이드, 5xSSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이팅 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이팅 및 65℃에서 0.2xSSC, 0.1% SDS에서 세척과 같다. PCR의 경우, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격한 증폭에 전형적이지만, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃에서 변할 수 있다. 높은 엄격한 PCR 증폭의 경우, 약 62℃의 온도가 전형적이지만, 높은 엄격한 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃ 범위일 수 있다. 상기 높고 낮은 엄격한 증폭 모두에 전형적인 사이클 조건은 30초 내지 2분 동안 90 내지 95℃의 변성화 단계, 30초 내지 2분간 지속되는 아닐링 단계 및 1 내지 2분 동안 약 72℃의 확장 단계를 포함한다. 낮고 높은 엄격한 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 가이드라인은 예를 들면 문헌[Innis 등., PCR Protocols , A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)]에 제공되어 있다.
엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은, 그들이 인코딩한 폴리펩티드가 실질적으로 동일한 경우에 여전히 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 이는 핵산 사본이 유전자 코드에 의해 허용된 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우에 발생한다. 이러한 경우, 핵산은 전형적으로 중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화된다. 예시적인 "중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건"은 40% 포름아마이드, 1 M NaCl, 37℃에서 1% SDS의 버퍼에서의 하이브리드화 및 45℃에서 1xSSC의 세척을 포함한다. 양성 하이브리드화는 배경의 적어도 2배 이상이다. 당업자는 용이하게 대안적인 하이브리드화 및 세척 조건을 사용하여 유사한 조건의 엄격한 조건을 제공할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 하이브리드 파라미터를 결정하기 위한 추가 가이드라인은 여러 참고문헌, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등., eds]에 제공되어 있다.
2개 이상의 핵산의 맥락에서 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"은 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정할 때 지정된 영역 또는 비교창 위에서 최대 상응성을 위해 비교하고 정렬될 때 동일하거나 동일한 명시된 백분율(즉, 명시된 영역에 걸쳐 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성)의 동일한뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 나타낸다. 상기 정의는 문맥상 또한 유사하게 서열의 상보성를 나타낸다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개 뉴클레오타이드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 그에 대해 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에 부분 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트(default) 프로그램 파라미터를 사용하거나 다른 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열(reference sequence)에 대한 시험 서열에 대해 % 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 "비교창"은, 약 5 내지 약 60개, 일반적으로 약 10 내지 약 45개, 더 일반적으로 약 15 내지 약 30개로 이루어진 군 중에서 선택된 많은 연속적인 위치들 중 임의의 하나의 분절(segment)을 참조하는 것을 포함하고, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 연속적인 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들면, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)]의 유사성에 대한 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package; 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)) 내의 GAP, BESTFIT 및 TFASTA)에 의해 또는 수동 정렬 및 시각 검사(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등., eds. (1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 비-제한적인 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 문헌[Altschul 등., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul 등., J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)]에 각각 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0을 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용하여 본 발명의 핵산에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 [National Center for Biotechnology Information](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 또 다른 예는 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 일반적인 정렬 알고리즘, 예컨대 단백질 또는 뉴클레오타이드(예를 들어, RNA) 서열을 정렬하기 위한 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘이다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 최소 합 확률(P(N))이고, 이는 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는 적어도 2개의 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 중합체를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함한다. DNA는, 예를 들어, 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, 예비 축합 DNA, PCR 생성물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라(chimeric) 서열, 염색체 DNA 또는 이들 군의 유도체 및 조합물의 형태로 존재할 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, 바이러스 RNA(vRNA), 다가 RNA(mvRNA) 및 이들의 조합물의 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지의 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 연결기를 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 비제한적인 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드 및 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다. 특별히 한정하지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 내재적으로 이의 보존적 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그(ortholog), SNP 및 상보성 서열뿐만 아니라 명백히 지시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성할 수 있다(문헌[Batzer 등., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka 등., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini 등., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)]). "뉴클레오타이드"는 당 데옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 서로 연결된다. "염기"는 퓨린 및 피리미딘(이는 추가로 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체를 포함함) 및 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체(이는 비-제한적으로 아민, 알코올, 티올, 카복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성 기를 위치시키는 변형을 포함함)을 포함한다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 전구체 폴리펩티드의 생산을 위해 필요한 부분의 길이 또는 전체 길이 코딩 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 의미한다.
본원에 사용된 "유전자 생성물"은 유전자의 생성물, 예컨대 RNA 전사체 또는 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하나, 이로 제한되지 않고, 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물 군을 나타낸다. 이들은 대체로 적어도 3개의 부류로 나누어진다: (1) 지방 및 오일 뿐만 아니라, 왁스를 포함한 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함한 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".
용어 "지질 입자"는 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 관심있는 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 장기 등)에 전달하기 위해 사용할 수 있는 지질 제제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 지질 나노 입자이고, 이는 대개 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 임의로 입자들의 응집을 방지하는 공액 지질로부터 형성된다. 다른 바람직한 구현예에서, "핵산-지질 입자"는 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)과 같은 활성제 또는 치료제가 입자의 지질 부분 내에 캡슐화되어 효소적 분해로부터 보호될 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "LNP"는 지질 나노입자를 지칭한다. LNP는 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 임의로 입자들의 응집을 방지하는 공액 지질)로부터 제조된 입자를 나타내고, 여기서 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)은 지질 내에 완전히 캡슐화된다. 특정 경우에, LNP는 정맥내(i.v.) 주사 후에 연장된 혈류 수명을 보일 수 있고, 원위 부위(예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에 축적할 수 있고, 이들 원위 부위에서 표적 유전자 발현의 사일런싱을 매개할 수 있으므로 전신 용도를 위해 매우 유용하다. 핵산은, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 PCT 공보 WO 00/03683에 기재된 바와 같이, 응축제와 함께 복합체화되고 LNP 내에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 전형적으로 평균 직경이 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm 또는 150 nm이고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 핵산은 본 발명의 지질 입자 내에 존재하는 경우, 수용액 내에서 뉴클레아제 분해에 대해 저항성이다. 지질 나노입자 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 2004/0142025 및 2007/0042031에 개시되어 있다.
본원에 사용된 "지질 캡슐화된"은 완전 캡슐화, 부분 캡슐화 또는 둘 모두의 상태로 활성제 또는 치료제 예컨대 핵산(예컨대, 간섭 RNA)을 제공하는 지질 입자를 지칭할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 (예를 들어, LNP를 형성하도록) 지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다.
용어 "지질 컨쥬케이트"는 지질 입자들의 응집을 억제하는 공액 지질을 지칭한다. 이러한 지질 컨쥬게이트는 PEG-지질 컨쥬게이트, 예컨대, 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 컨쥬게이트), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 컨쥬게이트), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 컨쥬게이트된 PEG(예를 들어, 미국 특허 5,885,613 참조), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린 (POZ)-지질 컨쥬게이트, 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 컨쥬게이트) 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. POZ-지질 컨쥬게이트의 추가의 예는 PCT 공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 컨쥬게이트될 수 있거나, 링커 잔기를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 비함유 링커 잔기 및 에스테르-함유 링커 잔기를 포함하는, PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키기 위한 적합한 임의의 링커 잔기를 사용할 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 에스테르 비함유 링커 잔기(예컨대 아미드 또는 카바메이트)를 사용한다. 상기 특허 문헌의 각각의 개시내용은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다.
용어 "양친매성 지질"은 부분적으로, 지질 물질의 소수성 부분이 소수성 상으로 배향하는 반면, 친수성 부분은 수성상을 향해 배양하는 임의의 적합한 물질을 가리킨다. 친수성 특징은 탄수화물, 포스페이트, 카복실, 술페이토, 아미노, 술프히드릴, 니트로, 히드록실 및 다른 유사한 기들과 같은 극성 또는 하전된 기의 존재로부터 유래한다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클 기(들)에 의해 치환된 기를 포함하나, 이로 제한되지 않는 무극성 기의 혼입에 의해 부여할 수 있다. 양친매성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
인지질의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 인이 결여된 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 당스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤, 및 β-아실옥시산이 또한 양친매성 지질로서 지정된 군에 포함된다. 또한, 상기 기재된 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 포함하는 다른 지질과 혼합될 수 있다.
용어 "중성 지질"은 선택된 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 쯔비터이온(zwitterion) 형태로 존재하는 임의의 많은 지질 종을 지칭한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은, 예를 들어, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드, 및 디아실글리세롤을 포함한다.
용어 "비-양이온성 지질"은 임의의 양친매성 지질뿐만 아니라 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 지칭한다.
용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형기(modifying group)를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
용어 "소수성 지질"은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 임의로 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로사이클족 기(들)에 의해 치환된 기를 포함하나, 이로 제한되지 않는 무극성 기를 갖는 화합물을 지칭한다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N,N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
용어 "융해성(fusogenic)"은 세포의 막과 융합하는 지질 입자, 예컨대 LNP의 능력을 나타낸다. 상기 막은 형질막 또는 소기관, 예를 들어, 엔도솜, 핵 등을 둘러싸는 막일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "수용액"은 전체적으로 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "유기 지질 용액"은 전체적으로 또는 부분적으로 지질을 갖는 유기 용매를 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "원위 부위(distal site)"는 물리적으로 분리된 부위를 나타내고, 이는 인접한 모세혈관상에 제한되지 않고, 대신에 유기체 전체에 넓게 분포된 부위를 포함한다.
핵산-지질 입자(예컨대 LNP)와 관련하여 "혈청 안정성"은 입자가 유리 DNA 또는 RNA를 유의하게 분해시킬 혈청 또는 뉴클레아제 분석에 노출된 후 유의하게 분해되지 않음을 의미한다. 적합한 분석은, 예를 들어, 표준 혈청 분석, DNAse 분석 또는 RNAse 분석을 포함한다.
본원에 사용된 "전신 전달"은 유기체 내에서 간섭 RNA(예를 들어,siRNA)와 같은 활성제의 넓은 생물분포를 가져오는 지질 입자의 전달을 나타낸다. 일부 투여 기술은 특정 약제의 전신 전달을 일으킬 수 있지만, 다른 것은 그렇지 않다. 전신 전달은 유용한 유효량, 바람직하게는 치료적 유효량의 제제가 신체의 대부분의 부위로 노출되는 것을 의미한다. 넓은 생물분포를 얻기 위해서는 일반적으로 투여 부위에서 먼 질환 부위에 도달하기 전에 제제가 (예컨대, 첫번째 통과 장기(간, 폐 등)에 의해 또는 신속한 비특이적 세포 결합에 의해) 신속하게 분해되거나 제거되지 않도록 하는 혈액 수명이 요구된다. 지질 입자의 전신 전달은, 예를 들어, 정맥내, 피하 및 복강내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의해 달성한다.
본원에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내에서 표적 부위에 직접적인 활성제, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 전달을 지칭한다. 예를 들어, 제제는 종양 또는 표적부위(예를 들어, 감염부위)와 같은 질환 부위, 또는 표적 장기(예컨대 간, 심장, 췌장, 신장 등)에 직접 주사에 의해 국소 전달될 수 있다.
용어 "포유동물"은 임의의 포유동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 가축 등을 가리킨다.
용어 "암"은 비정상적인 세포의 억제되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 구성원을 의미한다. 상기 용어는 악성, 양성, 연부 조직 또는 고체, 및 사전 및 사후 전이성 암을 포함하는 모든 단계 및 등급의 암으로 특징지어지는지 여부와 관계없이 알려진 모든 암 및 양성 증상을 포함한다. 암의 다른 유형의 예로는 간암, 폐암, 대장암, 직장암, 항문암, 담도암, 소장암, 위암, 식도암; 담낭암, 췌장암, 부속암, 유방암, 난소암; 자궁경부암, 전립선암, 신장암(예컨대, 신장 세포 암종), 중추 신경계암, 아교모세포종, 피부암, 림프종, 융모막암종, 두경부암, 골원성 육종 및 혈액암 등이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 간암의 특정 유형의 비-제한적인 예는 간암(hepatocellular carcinoma, HCC), 2차 간암(예를 들면, 몇몇 다른 비-간암 세포 유형의 전이에 의해 발생) 및 간모세포종을 포함한다. 본원에 사용된 "종양"은 하나 이상의 암 세포를 포함한다.
용어 "MV RNA"로 약칭되는 "다가 RNA"는, 적어도 3개의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 복합체를 지칭하며, 이때 각각의 폴리큐클레오티드는 그 길이 전체 또는 일부를 따라 복합체의 다른 폴리뉴클레오타이드의 적어도 2개에 하이브리드화되고, 여기서, 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 임의로 표적 핵산 서열에 하이브리드화될 수 있는 표적 영역을 포함한다. 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 60개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 내의 표적 영역은 복합체의 다른 폴리뉴클레오타이드의 표적 영역(들)이 하이브리드화되는 표적 핵산 서열(들)과 동일하거나 상이한 표적 핵산 서열에 하이브리드화될 수 있다. 다가 RNA는, 예를 들면, 시험관내에서 (예컨대, 화학적 합성에 의해) 합성되거나 또는 예를 들면 살아있는 세포 내에서 전구체로부터 처리될 수 있다. 예를 들면, 전구체는, 살아있는 세포로 도입되고 거기서 절단되어 다가 RNA를 형성하는, 다가 RNA의 폴리뉴클레오타이드 각각을 포함하는 선형 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 용어 "다가"RNA 는 살아있는 세포 내부에서 절단되도록 의도된 전구체를 포함한다. 용어 "다가 RNA"는 또한 예를 들면 일반적으로 또는 구체적으로 국제 특허 출원 PCT/US2010/036962에 기재된 3부분(tripartite) 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함한다.
Ⅲ. 신규 양이온성 지질
본 발명은, 그 중에서도, 치료제 예컨대 핵산의 세포로의 시험관내 및/또는 생체내 전달을 위해 본원에서 기재된 지질 입자에서 유익하게 사용될 수 있는 신규 양이온성 (아미노) 지질을 제공한다. 본 발명의 신규 양이온성 지질은 본 명세서의 식 I에서 제시된 구조를 가지며, 그의 (R) 및/또는 (S) 거울상이성질체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 지질은 라세미 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 지질은 하나 이상의 부분입체이성질체의 혼합물을 포함한다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 지질은 하나의 거울상이성질체에서 풍부하고, 이로써 지질은 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 거울상이성질체 과잉을 포함한다. 어떤 다른 구현예에서, 본 발명의 지질은 하나의 부분입체이성질체에서 풍부하고, 이로써 지질은 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 부분입체이성질체 과잉을 포함한다. 어떤 추가의 구현예에서, 본 발명의 지질은 키랄적으로 순수하다 (예를 들면, 단일 광학 이성질체를 포함한다). 추가 구현예에서, 본 발명의 지질은 하나의 광학 이성질체 (예를 들면, 광학 활성 이성질체)에서 풍부하고, 이로써 지질은 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이성질체 과잉을 포함한다. 본 발명은 라세미 혼합물로서 또는 광학적으로 순수한 형태로 식 I의 양이온성 지질의 합성을 제공한다.
용어들 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 지질 및 그의 염(예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 염)을 포함하고, 이 염은 1, 2, 3, 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정가능한 아미노 헤드 그룹 (예를 들면, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 헤드 그룹)을 갖는다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자첨가되고 (즉, 양으로 하전되고) pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성이다. 본 발명의 양이온성 지질은 또한 적정가능한 양이온성 지질이라고도 할 수 있다.
용어 "염"은 임의의 음이온성 및 양이온성 착물, 예컨대 본원에서 개시된 양이온성 지질과 하나 이상의 음이온 사이에서 형성된 착물을 포함한다. 음이온의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 무기 및 유기 음이온, 예를 들면, 하이드라이드, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 옥살레이트 (예를 들면, 헤미 옥살레이트), 포스페이트, 포스포네이트, 수소 포스페이트, 디하이드로젼 포스페이트, 옥사이드, 카보네이트, 바이카보네이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트라이드, 바이설파이트, 설파이드, 설파이트, 바이설페이트, 설페이트, 티오설페이트, 수소 설페이트, 보레이트, 포르메이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 아크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 이타코네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 말레이트, 만델레이트, 티글레이트, 아스코르베이트, 살리실레이트, 폴리메타크릴레이트, 퍼클로레이트, 클로레이트, 아염소산염, 차아염소산염, 브로메이트, 하이포브로마이트, 아이오데이트, 알킬설포네이트, 아릴설포네이트, 아스세네이트, 아르세나이트, 크로메이트, 디크로메이트, 시아나이드, 시아네이트, 티오시아네이트, 하이드록사이드, 퍼옥사이드, 과망간산염, 및 그의 혼합물. 특별한 구현예에서, 본원에서 개시된 양이온성 지질의 염은 결정성 염이다. 특별한 구현예에서, "염"은 "약제학적으로 허용가능한 염"다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 의미하고, 그 염은 당해기술에서 잘 알려진 다양한 유기 및 무기 카운터 이온으로부터 유도된다. 약제학적으로 허용가능한 염은 금속 (무기) 염 및 유기 염 둘 모두를 포함하고, 이 염은 하기에서 열거된 것을 비제한적으로 포함한다: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, pg. 1418 (1985). 약제학적으로 허용가능한 염은, 단지 예로써, 하기를 포함한다: 무기산의 염(예컨대 하이드로클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 하이드로브로마이드, 및 니트레이트) 또는 유기 산의 염(예컨대, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 석시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트 또는 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트). 유사하게 약제학적으로 허용가능한 양이온은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄 (특히 2차 아민을 갖는 암모늄 염)을 포함한다. 상기에서 인용된 이유로 본 발명의 특정한 염은 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 암모늄 염을 포함한다.
용어 "알킬"은 1 내지 24 개의 탄소 원자를 함유하는, 직쇄 또는 분지된, 비환형 또는 환형, 포화된 지방족 탄화수소를 포함한다. 대표적인 포화된 직쇄 알킬은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, 등을 포함하지만, 포화된 분지된 알킬은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert -부틸, 이소펜틸, 등을 포함한다. 대표적인 포화된 환형 알킬은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 본원에서 기재된 C3 -8 사이클로알킬을 포함하지만, 불포화된 환형 알킬은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 본원에서 기재된 C3 -8 사이클로알케닐을 포함한다.
용어 "헤테로알킬,"는 상기에서 규정된 바와 같은 직쇄 또는 분지된, 비환형 또는 환형, 포화된 지방족 탄화수소를 포함하고, 이 탄화수소는 약 1 내지 약 5 개의 헤테로원자 (즉, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 헤테로원자) 예를 들면, O, N, Si, 및/또는 S를 가지며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 임의로 사원화될 수 있다. 헤테로알킬 그룹은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
용어 "환형 알킬"은 이하에서 기재된, 임의의 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐 그룹을 포함한다.
용어 "사이클로알킬"은 약 3 내지 약 8 개의 탄소 원자 (즉, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 탄소 원자)를 고리 정점(vertice)으로서 갖는, 치환된 또는 비치환된 환형 알킬 그룹을 포함한다. 바람직한 사이클로알킬 그룹은 약 3 내지 약 6 개의 탄소 원자를 고리 정점으로서 갖는 것을 포함한다. C3 -8 사이클로알킬 그룹의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 사이클로프로필, 메틸-사이클로프로필, 디메틸-사이클로프로필, 사이클로부틸, 메틸-사이클로부틸, 사이클로펜틸, 메틸-사이클로펜틸, 사이클로헥실, 메틸-사이클로헥실, 디메틸-사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸, 뿐만 아니라 다른 치환된 C3 -8 사이클로알킬 그룹.
용어 "헤테로사이클로알킬"은 상기에서 규정된 바와 같은, 치환된 또는 비치환된 환형 알킬 그룹을 포함하고, 이 그룹은 약 1 내지 약 3 헤테로원자를 O, N, Si 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 고리 멤버로서 가지며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 임의로 사원화될 수 있다. 헤테로사이클로알킬 그룹은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
용어 "사이클로알케닐"은 치환된 또는 비치환된 환형 알케닐 그룹을 포함하고, 이 그룹은 약 3 내지 약 8 개의 탄소 원자 (즉, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 탄소 원자)를 고리 정점으로서 갖는다. 바람직한 사이클로알케닐 그룹은 약 3 내지 약 6 개의 탄소 원자를 고리 정점으로서 갖는 것을 포함한다. C3 -8 사이클로알케닐 그룹의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 사이클로프로페닐, 메틸-사이클로프로페닐, 디메틸-사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헵테닐, 및 사이클로옥테닐, 뿐만 아니라 다른 치환된 C3 -8 사이클로알케닐 그룹.
용어 "헤테로사이클로알케닐"은 상기에서 규정된 바와 같은, 치환된 또는 비치환된 환형 알케닐 그룹을 포함하고, 이 그룹은 약 1 내지 약 3 헤테로원자를 O, N, Si 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 고리 멤버로서 가지며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 임의로 사원화될 수 있다. 헤테로사이클로알케닐 그룹은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다.
용어 "알콕시"는 식 알킬-O-의 그룹을 포함하고, 여기서 "알킬"은 미리 주어진 정의를 갖는다. 알콕시 그룹의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시.
용어 "알케닐"은 인접한 탄소 원자들 사이의 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는, 상기에서 규정된 알킬을 포함한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 둘 모두를 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지된 알케닐은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에틸에닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 등. 대표적인 환형 알케닐은 상기에서 기재되어 있다.
용어 "알키닐"은 인접한 탄소들 사이의 적어도 하나의 삼중결합을 추가로 함유하는, 상기에서 정의된 임의의 알킬 또는 알케닐을 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지된 알키닐은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 아세틸에닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐, 등.
용어 "아릴"는 다중불포화된, 전형적으로 방향족, 탄화수소 그룹을 포함하고, 이 그룹은 함께 융합되거나 공유결합되고 하기와 같은 하나 이상의 치환체를 임의로 보유하는 단일 고리 또는 다중 고리 (최대 3 개의 고리)일 수 있다: 예를 들면, 할로겐, 트리플루오로메틸, 아미노, 알킬, 알콕시, 알킬카보닐, 시아노, 카바모일, 알콕시카바모일, 메틸렌디옥시, 카복시, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 하이드록시, 니트로, 등. 비치환된 아릴 그룹의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 페닐, 나프틸, 및 바이페닐. 치환된 아릴 그룹의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 페닐, 클로로페닐, 트리플루오로메틸페닐, 클로로플루오로페닐, 및 아미노페닐.
용어들 "알킬티오," "알킬설포닐," "알킬설피닐," 및 "아릴설포닐"은 식 -S-Ri, -S(O)2-Ri, -S(O)-Ri 및 -S(O)2Rj, 각각을 갖는 그룹을 포함하고, 여기서 Ri는 상기에서 정의된 알킬 그룹이고 Rj는 상기에서 정의된 아릴 그룹이다.
용어들 "알케닐옥시" 및 "알키닐옥시"는 식 -O-Ri을 갖는 그룹을 포함하고, 여기서 Ri는 각각 알케닐 또는 알키닐 그룹이다.
용어들 "알케닐티오" 및 "알키닐티오"는 식 -S-Rk을 갖는 그룹을 포함하고, 여기서 Rk는 알케닐 또는 알키닐 그룹, 각각이다.
용어 "알콕시카보닐"은 식 -C(O)O-Ri을 갖는 그룹을 포함하고, 여기서 Ri는 상기에서 정의된 알킬 그룹이고 여기서 상기 총 탄소원자 수는 조합된 알킬 및 카보닐 모이어티를 의미한다.
용어 "아실"는 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 포함하고, 여기서 상기 부착점에서의 탄소는 이하에서 규정된 바와 같이 옥소 그룹으로 치환된다. 하기는 아실 그룹의 비-제한적인 예이다: -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐.
용어 "헤테로사이클"은 5- 내지 7-원 모노환형, 또는 7- 내지 10-원 바이사이클릭, 헤테로환형 고리를 포함하고, 이 고리는 포화된, 불포화된, 또는 방향족이고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 상기 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 사원화될 수 있고, 바이사이클릭 고리를 포함하고, 여기서 임의의 상기 헤테로사이클은 벤젠고리에 융합된다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 이하에서 규정된 헤테로아릴, 뿐만 아니라 모폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 등.
용어 "헤테로아릴"는 방향족 5- 내지 10-원 헤테로사이클을 포함하고, 이 사이클은 질소 (N), 산소 (O), 및 황 (S)로부터 선택된 1, 2, 이상의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로아릴은 하나 이상의 탄소 원자 상에 하기의 치환체로 치환될 수 있다: 예를 들면, 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노, 할로알킬 (예를 들면, 트리플루오로메틸), 헤테로시클릴 (예를 들면, 모폴리닐 또는 피롤리디닐), 등. 헤테로아릴의 비-제한적인 예는 피리디닐 및 푸라닐을 포함한다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 아이오도를 포함한다.
용어들 "임의로 치환된 알킬," "임의로 치환된 환형 알킬," "임의로 치환된 알케닐," "임의로 치환된 알키닐," "임의로 치환된 아실," 및 "임의로 치환된 헤테로사이클"은, 치환될 때, 적어도 하나의 수소 원자가 치환체로 치환된다는 것을 의미한다. "옥소" 치환체 (=O)의 경우에, 2 개의 수소 원자가 치환된다. 치환체의 비-제한적인 예는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx, 및 -SOnNRxRy를 포함하고, 여기서 n은 0, 1, 또는 2이고, Rx 및 Ry는 동일 또는 상이하고 독립적으로 수소, 알킬, 또는 헤테로사이클이고, 각 알킬 및 헤테로사이클 치환체는 하기 중 하나 이상으로 추가로 치환될 수 있다: 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로사이클, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx, 및 -SOnNRxRy. 용어 "임의로 치환된"은, 치환체의 목록 앞에서 사용될 때, 목록에서의 각 치환체가 본원에 기재된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 구조 식 (I)을 갖는 양이온성 지질 또는 그의 염을 제공한다:
X-A-Y-Z;
(I)
여기서:
X는 알킬아미노이고;
A는 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬이고, 여기서 상기 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬은 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;
Y는 케탈, 에스테르, 임의로 치환된 카바메이트, 에테르, 및 임의로 치환된 아마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
Z는 3 개의 알킬 사슬로 이루어진 소수성 모이어티이고, 여기서 상기 각각의 알킬 사슬은 C8 내지 C11의 길이를 가지며, 여기서 상기 3 개의 알킬 사슬은 각각 독립적으로 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 각각의 3 개의 알킬 사슬은 임의로 치환된다.
식 (I)의 지질의 일부 구현예에서, Z는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00002
여기서, R1, R2, 및 R3 은 각각 독립적으로 C8 내지 C11 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 여기서 상기 R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 포화 또는 불포화될 수 있고; 및 여기서 상기 R1, R2, 및 R3은 각각 임의로 치환된다.
특별한 구현예에서, 식 (I)의 지질은 하기의 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00003
화합물 9,
Figure pct00004
화합물 11,
Figure pct00005
화합물 13,
Figure pct00006
화합물 14,
Figure pct00007
화합물 19,
Figure pct00008
화합물 21,
Figure pct00009
화합물 22,
Figure pct00010
화합물 23,
Figure pct00011
화합물 24,
Figure pct00012
화합물 25,
Figure pct00013
화합물 26,
Figure pct00014
화합물 27,
화합물 28,
Figure pct00016
화합물 30,
Figure pct00017
화합물 31,
Figure pct00018
화합물 40,
Figure pct00019
화합물 42,
Figure pct00020
화합물 50,
Figure pct00021
화합물 53,
Figure pct00022
화합물 62,
Figure pct00023
화합물 71,
Figure pct00024
화합물 74,
Figure pct00025
화합물 76,
Figure pct00026
화합물 79,
Figure pct00027
화합물 83,
Figure pct00028
화합물 89, 및
Figure pct00029
화합물 90.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하나 이상의 음이온을 가진 염(예컨대, 결정질 염)을 형성한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 이의 옥살레이트(예컨대, 헤미옥살레이트) 염이다(이는 바람직하게는 결정질 염이다). 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 하나 이상의 음이온을 가진 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성한다.
본원에 기재된 화합물의 결정 형태, 수화물 및 용매화물이 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 화합물은 실시예에 기재된 방법을 비롯하여 공지된 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질의 합성은 보호기의 사용을 요구할 수 있다. 보호기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et . al., Wiley-Interscience, New York City, 1999]참조). 간략하게, 본 발명의 맥락에서 보호기는 작용기의 원하지 않는 반응성을 감소하거나 없애는 임의의 기이다. 보호기는 작용기에 첨가되어 특정 반응 동안 그 반응성을 차단한 다음 제거하여 원래의 작용기를 나타낼 수 있다. 어떤 경우에는, "알코올 보호기"가 사용된다. "알코올 보호기"는 알코올 작용기의 원치 않는 반응을 감소시키거나 제거하는 기이다. 보호기는 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질은, 지질이 생리학적 pH(예컨대, pH 7.4) 이하에서 양으로 하전되고 제2 의 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서 중성으로 하전되도록 하는 하나 이상의 양성자화가능하거나 또는 탈양성자화가능한 기를 갖는다. pH의 기능(function)으로서 양성자의 첨가 또는 제거가 평형 공정이고, 하전된 또는 중성 지질이 우세한 종의 성질을 나타내지만 모든 지질이 하전된 또는 중성 형태로 존재할 필요가 없음은 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 하나 이상의 양성자화가능하거나 또는 탈양성자화가능한 기를 가지거나 또는 쯔비터이온성인 지질을 본 발명에 사용하는 것을 배제하지는 않는다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 양성자화가능한 지질은 약 4 내지 약 11 범위의 양성자화가능한 pKa를 갖는다. 가장 바람직하게는 약 4 내지 약 7의 pKa이며, 이는 이러한 지질이 더 낮은 pH 제형화 단계에서는 양이온성이지만, 입자들은 약 pH 7.4의 생리학적 pH에서 거의(전부는 아님) 표면 중성화될 것이기 때문이다. 이러한 pKa가 주는 이점 중 하나는, 입자의 외부 표면과 결합된 적어도 몇몇 핵산이 생리학적 pH에서 그의 정전 상호작용을 잃게 되어 간단한 투석에 의해 제거되며, 따라서 간극(clearance)에 대한 입자의 민감성을 크게 감소시킬 수 있다는 점이다.
IV . 활성제
활성제 (예를 들면, 치료제)는 세포, 조직, 장기, 또는 대상체 상에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 포함한다. 그와 같은 효과는, 예를 들면, 생물학적, 생리적, 및/또는 미용적일 수 있다. 활성제는 하기를 비제한적으로 포함하는 임의의 유형의 분자 또는 화합물일 수 있다: 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 소분자, 및 그의 혼합물. 핵산의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 간섭 RNA 분자 (예를 들면, siRNA, 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드, 리보자임, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물. 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 비제한적인 예는, 하기를 포함한다: 항체 (예를 들면, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편; 인간화된 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, 및/또는 PrimatizedTM 항체), 사이토카인, 성장 인자, 세포사멸 인자, 분화-유도 인자, 세포-표면 수용체 및 그의 리간드, 호르몬, 및 그의 혼합물. 소분자의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 작은 유기 분자 또는 화합물 예컨대 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 종래의 제제 또는 약물.
일부 구현예에서, 활성제는 치료제, 또는 염 또는 그의 유도체이다. 치료제 유도체는 치료적 활성 자체일 수 있거나 전구약물일 수 있고, 이것은 추가 변형시 활성이 된다. 따라서, 일 구현예에서, 치료제의 유도체는 비변형된 제제와 비교하여 치료적 활성의 일부 또는 모두를 보유하고, 한편 또 하나의 구현예에서, 치료제의 유도체는, 치료적 활성이 부족하지만, 추가 변형시 활성으로 되는 전구약물이다.
A. 핵산
어떤 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP)를 생성하는 핵산과 연관된다. 일부 구현예에서, 핵산은 지질 입자에서 완전히 캡슐화된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 그 단편은 올리고뉴클레오타이드로 일반적으로 불리는 최대 60 개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 더 긴 단편은 폴리뉴클레오타이드라고 한다. 특별한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 그 길이가 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드이다. 핵산은 본 발명의 지질 입자에서 단독 투여되거나, 함께 (예를 들면, 공-투여될 수 있고), 본 발명의 지질 입자는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 소분자 예컨대 종래의 약물을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 자연 발생 염기, 당류 및 당간 (골격) 연결로 이루어진 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 단량체의 폴리머 또는 올리고머를 의미한다. 용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 유사하게 기능하는, 비-자연 발생 단량체, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리머 또는 올리고머를 또한 포함한다. 그와 같이 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드는 특성(예를 들면, 증대된 세포성 흡수, 감소된 면역원성, 및 뉴클레아제의 존재에서의 증가된 안정성)으로 인해 원상태 형태 보다 종종 바람직하다.
올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보올리고뉴클레오타이드 또는 리보올리고뉴클레오타이드로서 분류된다. 데옥시리보올리고뉴클레오타이드는 이러한 당의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유결합되어 교대, 비분지된 폴리머를 형성하는 5-탄소 당질로 분리는 데옥시리보스로 이루어진다. 리보올리고뉴클레오타이드는 유사한 반복 구조로 이루어지고 여기서 5-탄소 당질은 리보오스이다.
본 발명에 따른 핵산-지질 입자에서 존재하는 핵산은 공지된 임의 형태의 핵산을 포함한다. 본원에서 사용된 핵산은 단일가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 이중-가닥 DNA의 예는 본원에서 기재되어 있고 예를 들면 하기를 포함한다: 구조 유전자, 제어 및 종료 영역을 포함하는 유전자, 및 자가-복제 시스템 예컨대 바이러스 또는 플라스미드 DNA. 이중-가닥 RNA의 예는 본원에서 기재되어 있고 예를 들면 하기를 포함한다: siRNA 및 다른 RNAi 제제 예컨대 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 및 pre-miRNA. 단일가닥 핵산은 예를 들면 하기를 포함한다: 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 성숙한 miRNA, 및 삼중-형성 올리고뉴클레오타이드.
본 발명의 핵산은 그 길이가 다양할 수 있고 특정 형태의 핵산에 일반적으로 의존한다. 예를 들면, 특별한 구현예에서, 플라스미드 또는 유전자는 그 길이가 약 1,000 내지 약 100,000 개의 뉴클레오타이드 잔기일 수 있다. 특별한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 그 길이가 약 10 내지 약 100 개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 다양한 관련된 구현예에서, 단일가닥, 이중-가닥, 및 삼중-가닥 모두의 올리고뉴클레오타이드는, 그 길이가 약 10 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 약 50 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 20 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 (또는 그의 가닥)은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화되거나 그것에 대해 상보적이다. 용어들 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보적"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 충분한 정도의 상보성을 나타내고, 이로써 안정한 및 특이적 결합은 DNA 또는 RNA 표적 및 올리고뉴클레오타이드 사이에서 일어난다. 올리고뉴클레오타이드는 특이적으로 혼성화될 수 있는 표적 핵산 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없는 것으로 이해된다. 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 그것으로부터의 유용성 또는 발현의 손실을 초래하기 위해 표적 서열의 정상 기능을 방해할 때 특이적으로 혼성가능하고, 특이적 결합을 원하는 조건 하에서, 즉, 생체내 분석 또는 치료적 요법의 경우에 생리적 조건 하에서, 또는 시험관내 분석의 경우에, 분석이 수행되는 조건 하에서, 올리고뉴클레오타이드의 비-표적 서열에의 비-특이적 결합을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성이 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 표적으로 하거나 특이적으로 혼성화하는 유전자 또는 mRNA 서열의 영역과 비교하여 1, 2, 3, 이상의 염기 치환을 포함할 수 있다.
1. siRNA
본 발명의 핵산-지질 입자의 siRNA 성분은 관심 표적 유전자의 발현을 사일런싱할 수 있다. siRNA 듀플렉스의 각 가닥은, 그 길이가 전형적으로 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드이다. 어떤 구현예에서,상기 siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 siRNA는 일반적으로 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극이 더 적고 관심 표적 유전자에 대항하여 RNAi 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 변형된 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오타이드(예컨대 2'OMe-구아노신, 2'OMe-우리딘, 2'OMe-아데노신, 및/또는 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드)를 함유한다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에 존재할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에서 변형된다 (예를 들면, 2'OMe-변형된). 이들 구현예에서, 변형된 siRNA는 하나 이상의 변형된 (예를 들면, 2'OMe-변형된) 아데노신 및/또는 변형된 (예를 들면, 2'OMe-변형된) 시토신 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 단지 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드는 siRNA의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에서 변형된다 (예를 들면, 2'OMe-변형된). 상기 siRNA 서열은 오버행 (예를 들면, Elbashir 등, Genes Dev., 15:188 (2001) 또는 Nykanen 등, Cell , 107:309 (2001)에서 기재된 바와 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 부족할 수 있다 (즉, 블런트 말단을 갖는다).
특별한 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드(예컨대 2'OMe 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드)의 siRNA의 하나 또는 두 가닥 모두의 이중-가닥 영역으로의 선택적 혼입은 siRNA 분자에 대한 면역 반응을 감소시키거나 완전히 없앤다. 어떤 예에서, 특이적 siRNA 서열의 면역자극 특성 및 유전자 발현을 사일런싱하기 위한 그의 능력은 균형을 이루거나 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 내의 최소 및 선택적 2'OMe 변형의 도입에 의해 최적화될 수 있다. 이것은 사이토카인 유도, 독성, 및 비변형된 siRNA의 사용과 연관된 오프-타겟 효과 없이 치료적으로 생존가능 siRNA 용량에서 달성될 수 있다.
변형된 siRNA는 일반적으로 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 중 약 1% 내지 약 100% (예를 들면, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 이상의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 다른 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 변형된 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 서로를 제외하고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 이상의 뉴클레오타이드이다. 하나의 바람직한 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 변형된 뉴클레오타이드 중 어떤 것도 서로 인접하지 않는다 (예를 들면, 각 변형된 뉴클레오타이드 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비변형된 뉴클레오타이드의 갭이 있다).
일부 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 50% 미만 (예를 들면, 약 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 또는 36% 미만, 바람직하게는 약 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 또는 30% 미만)은 변형된 (예를 들면, 2'OMe) 뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 구현예의 일 측면에서, siRNA의 하나 또는 두 가닥 모두의 이중-가닥 영역 중 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드의 약 50% 미만은 선택적으로 (예를 들면, 단독) 변형된다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 50% 미만은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드는 이중-가닥 영역에 존재하는 유일한 2'OMe 뉴클레오타이드이다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 50% 미만은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 변형된 siRNA의 둘 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 이중-가닥 영역 중 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 이들 구현예의 추가 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 50% 미만은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 이중-가닥 영역 중 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 50% 미만은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 변형된 siRNA의 둘 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고 여기서 상기 이중-가닥 영역 중 2'OMe 뉴클레오타이드는 서로 인접하지 않는다.
다른 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50% (예를 들면, 약 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 25%-39%, 25%-38%, 25%-37%, 25%-36%, 26%-39%, 26%-38%, 26%-37%, 26%-36%, 27%-39%, 27%-38%, 27%-37%, 27%-36%, 28%-39%, 28%-38%, 28%-37%, 28%-36%, 29%-39%, 29%-38%, 29%-37%, 29%-36%, 30%-40%, 30%-39%, 30%-38%, 30%-37%, 30%-36%, 31%-39%, 31%-38%, 31%-37%, 31%-36%, 32%-39%, 32%-38%, 32%-37%, 32%-36%, 33%-39%, 33%-38%, 33%-37%, 33%-36%, 34%-39%, 34%-38%, 34%-37%, 34%-36%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 21%-35%, 22%-35%, 23%-35%, 24%-35%, 25%-35%, 26%-35%, 27%-35%, 28%-35%, 29%-35%, 30%-35%, 31%-35%, 32%-35%, 33%-35%, 34%-35%, 30%-34%, 31%-34%, 32%-34%, 33%-34%, 30%-33%, 31%-33%, 32%-33%, 30%-32%, 31%-32%, 25%-34%, 25%-33%, 25%-32%, 25%-31%, 26%-34%, 26%-33%, 26%-32%, 26%-31%, 27%-34%, 27%-33%, 27%-32%, 27%-31%, 28%-34%, 28%-33%, 28%-32%, 28%-31%, 29%-34%, 29%-33%, 29%-32%, 29%-31%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-34%, 20%-33%, 20%-32%, 20%-31%, 20%-30%, 21%-30%, 22%-30%, 23%-30%, 24%-30%, 25%-30%, 25%-29%, 25%-28%, 25%-27%, 25%-26%, 26%-30%, 26%-29%, 26%-28%, 26%-27%, 27%-30%, 27%-29%, 27%-28%, 28%-30%, 28%-29%, 29%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-29%, 20%-28%, 20%-27%, 20%-26%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, 또는 5%-10%)는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 구현예의 일 측면에서, siRNA의 하나 또는 두 가닥 모두의 이중-가닥 영역 중 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50%는 선택적으로 (예를 들면, 단독) 변형된다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50%는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드는 이중-가닥 영역에 존재하는 유일한 2'OMe 뉴클레오타이드이다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50%는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 변형된 siRNA의 둘 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고 여기서 상기 siRNA는 이중-가닥 영역 중 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 이들 구현예의 추가 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50%는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 siRNA의 두 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 이중-가닥 영역 중 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 이들 구현예의 또 하나의 측면에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50%는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 변형된 siRNA의 둘 가닥 모두 중 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 siRNA는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하고 여기서 상기 이중-가닥 영역 중 2'OMe 뉴클레오타이드는 서로 인접하지 않는다.
siRNA에 도입될 수 있는 변형의 추가의 범위, 백분율, 및 패턴은 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0135372에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
a) siRNA 서열의 선택
적당한 siRNA 서열은 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인될 수 있다. 전형적으로, Elbashir 등, Nature , 411:494-498 (2001) 및 Elbashir 등, EMBO J., 20:6877-6888 (2001)에서 기재된 방법은 Reynolds 등, Nature Biotech ., 22(3):326-330 (2004)에서 제시된 합리적인 설계 규칙과 결합된다.
비제한적인 예로서, 관심 표적 유전자로부터의 전사체의 AUG 시작 코돈의 뉴클레오타이드 서열 3'는 디뉴클레오타이드 서열에 대해 스캐닝될 수 있다 (예를 들면, AA, NA, CC, GG, 또는 UU, 여기서 N = C, G, 또는 U) (참고, 예를 들면, Elbashir 등, EMBO J., 20:6877-6888 (2001)). 디뉴클레오타이드 3' 바로 옆의 뉴클레오타이드 서열은 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다 (즉, 표적 서열 또는 센스 가닥 서열). 전형적으로, 디뉴클레오타이드 3' 바로 옆의 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 이상의 뉴클레오타이드 서열은 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. 일부 구현예에서, 디뉴클레오타이드 서열은 AA 또는 NA 서열 및 바로 옆의 19 개의 뉴클레오타이드 3'이거나 AA 또는 NA 디뉴클레오타이드는 잠재적인 siRNA 서열로서 확인된다. siRNA 서열은 표적 유전자의 길이를 따라 상이한 위치에서 보통 공간을 차지한다. siRNA 서열의 사일런싱 효율을 추가로 향상시키기 위해, 잠재적인 siRNA 서열은, 예를 들면, 표적 세포 또는 유기체에서 다른 코딩 서열에 대한 상동성의 영역을 함유하지 않는 부위를 확인하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들면, 약 21 개의 염기쌍의 적당한 siRNA 서열은 전형적으로 표적 세포 또는 유기체에서 코딩 서열에 대한 상동성의 16-17 개 초과의 인접 염기쌍을 가지지 않을 것이다. siRNA 서열이 RNA Pol III 프로모터로부터 발현되면, 4 개 초과의 인접 A's 또는 T's이 없는 siRNA 서열이 선택된다.
잠재적인 siRNA 서열이 확인되었으면, 상보적 서열 (즉, 안티센스 가닥 서열)이 설계될 수 있다. 잠재적인 siRNA 서열은 당해기술에서 공지된 다양한 기준을 사용하여 또한 분석될 수 있다. 예를 들면, 그의 사일런싱 효율을 형상시키기 위해, siRNA 서열은 하기의 특징 중의 하나 이상을 갖는 서열을 확인하기 위해 합리적인 설계 알고리즘에 의해 분석될 수 있다: (1) 약 25% 내지 약 60% G/C의G/C 함량; (2) 센스 가닥의 위치 15-19에 있는 적어도 3 개의 A/U; (3) 내부 반복 없음; (4) 센스 가닥의 위치 19에 있는 A; (5) 센스 가닥의 위치 3에 있는 A; (6) 센스 가닥의 위치 10에 있는 U; (7) 센스 가닥의 위치 19에서 G/C 없음; 및 (8) 센스 가닥의 위치에 13에서 G 없음. 각각의 이들 특징의 적당한 값을 할당하고 siRNA의 선택에 유용한 알고리즘을 편입하고 있는 siRNA 설계 도구는 예를 들면 하기에서 발견될 수 있다: http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html. 당해분야의 숙련가는, 전술된 특성의 하나 이상을 갖는 서열이 잠재적인 siRNA 서열로서 추가 분석 및 시험을 위해 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
추가로, 하기의 기준의 하나 이상을 갖는 잠재적인 siRNA 서열은 siRNA로서 종종 제거될 수 있다: (1) 하나의 행에서 4 이상의 동일한 염기의 스트레치를 포함하는 서열; (2) G의 호모폴리머를 포함하는 서열 (즉, 이들 폴리머의 구조적 특성으로 인해 가능한 비-특이적 효과를 감소시키는 것; (3) 삼중 염기 모티프를 포함하는 서열 (예를 들면, GGG, CCC, AAA, 또는 TTT); (4) 하나의 행에서 7 이상의 G/C의 스트레치를 포함하는 서열; 및 (5) 내부 접힌 구조를 야기하는 후보 내에 4 이상의 염기의 직접적인 반복체를 포함하는 서열. 그러나, 당해분야의 숙련가는, 전술된 특성 중 하나 이상을 갖는 서열이 잠재적인 siRNA 서열로서 추가 분석 및 시험을 위해 여전히 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 잠재적인 siRNA 서열은 하기 예에서 기재된 바와 같이 siRNA 듀플렉스 비대칭성을 기반으로 추가로 분석될 수 있다: Khvorova 등, Cell, 115:209-216 (2003); 및 Schwarz 등, Cell, 115:199-208 (2003). 다른 구현예에서, 잠재적인 siRNA 서열은 하기 예에서 기재된 바와 같이 표적 부위에서 2차 구조를 기반으로 추가로 분석될 수 있다: Luo 등, Biophys . Res . Commun ., 318:303-310 (2004). 예를 들면, 표적 부위에서 2차 구조는 염기 짝짓기 및 스템-루프의 형태로 더 적은 2차 구조가 존재하는 표적 부위에서 접근성에 유리한 siRNA 서열을 선택하기 위해 Mfold 알고리즘(http://mfold.burnet.edu.au/rna_form에서 이용가능함)을 사용하여 모델링될 수 있다.
잠재적인 siRNA 서열이 일단 확인되었다면, 서열은, 예를 들면, 시험관내 사이토카인 분석 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 임의의 면역자극 특성의 존재에 대해 분석될 수 있다. 센스 및/또는 안티센스 가닥에서의 siRNA 서열의 모티프(예컨대 GU-풍부 모티프 (예를 들면, 5'-GU-3', 5'-UGU-3', 5'-GUGU-3', 5'-UGUGU-3', 등))은, 서열이 면역자극일 수 있는지의 표시를 또한 제공할 수 있다. siRNA 분자가 일단 면역자극인 것으로 발견되면, 이때 본원에 기재된 바와 같은 면역자극 특성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 비제한적인 예로서, siRNA 서열은, 세포가 siRNA가 면역자극 또는 비-면역자극 siRNA인 지를 결정하기 위해 검출가능한 면역 반응을 생성하는 조건 하에서 포유동물 반응자(responser) 세포와 접촉될 수 있다. 포유동물 반응자 세포는 미반응 포유동물 (즉, siRNA 서열의 유전자 생성물과 미리 접촉하지 않은 포유동물)로부터 얻을 수 있다. 포유동물 반응자 세포는, 예를 들면, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 대식세포, 등일 수 있다. 검출가능한 면역 반응은 사이토카인 또는 성장 인자 예를 들면, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12, 또는 이들의 조합의 생산을 포함할 수 있다. 그 다음 면역자극인 것으로 확인된 siRNA 분자는 변형되어 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드의 적어도 하나를 변형된 뉴클레오타이드로 대체하여 면역자극 특성을 감소시킨다. 예를 들면, siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 30% 미만 (예를 들면, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)은 변형된 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 그 다음 변형된 siRNA는 그것의 면역자극 특성이 감소 또는 없어졌다는 것을 확인하기 위해 상기에서 기재된 바와 같은 포유동물 반응자 세포와 접촉될 수 있다.
면역 반응을 검출하기 위한 적당한 시험관내 분석은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: David 등의 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역분석 기술 (미국 특허 번호 4,376,110); 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 분석 (Wide 등, Kirkham 및 Hunter에서, eds., Radioimmunoassay Methods, E. 및 S. Livingstone, Edinburgh (1970)); Gordon 등의 "웨스턴 블랏" 방법 (미국 특허 번호 4,452,901); 라벨링된 리간드의 면역침전 (Brown 등, J. Biol . Chem ., 255:4980-4983 (1980)); 예를 들면 Raines 등, J. Biol . Chem ., 257:5154-5160 (1982) 에 의해 기재된 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA); 형광색소의 사용을 포함하는 면역세포화학적 기술 (Brooks 등, Clin . Exp . Immunol ., 39:477 (1980)); 및 활성의 중화 (Bowen-Pope 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:2396-2400 (1984)). 상기에서 기재된 면역분석 외에, 수많은 다른 면역분석은 하기에서 기재된 것을 포함하여 이용가능하다: 미국 특허 번호 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876. 이들 참조의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
면연 반응을 검출하기 위한 생체내 모델의 비-제한적인 예는 하기 예에서 기재된 생체내 마우스 사이토카인 유도 분석을 포함한다: Judge 등, Mol . Ther ., 13:494-505 (2006). 어떤 구현예에서, 수행될 수 있는 분석은 하기와 같다: (1) siRNA는 측면 꼬리 정맥에서 표준 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다; (2) 혈액은 투여 약 6 시간 후에 심장 천자에 의해 수집되고 사이토카인 분석을 위해 혈장으로서 처리될 수 있다; 및 (3) 사이토카인은 제조자의 설명에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 정량화될 수 있다 (예를 들면, 마우스 및 인간 IFN-α (PBL Biomedical; Piscataway, NJ); 인간 IL-6 및 TNF-α (eBioscience; San Diego, CA); 및 마우스 IL-6, TNF-α, 및 IFN-γ (BD Biosciences; San Diego, CA)).
사이토카인 및 성장 인자에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 다중 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하고 당해분야에서 공지된 방법을 사용하여 산출될 수 있다 (참고, 예를 들면, Kohler 등, Nature, 256: 495-497 (1975) 및 Harlow 및 Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)). 모노클로날 항체의 산출은 미리 기재되어 있었고 당해기술에서 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다 (Buhring 등, Hybridoma에서, Vol.. 10, 번호 1, pp. 77-78 (1991)). 일부 방법에서, 모노클로날 항체는 검출을 촉진하기 위해 (예를 들면, 분광, 광화학적, 생화학적, 전기적, 광학, 또는 화학적 수단으로 검출가능한 임의의 조성물로) 바벨링된다.
b) siRNA 분자의 생성
siRNA는, 예를 들면, 하나 이상의 단리된(isolated) 작은-간섭 RNA (siRNA) 듀플렉스, 더 긴 이중-가닥 RNA (dsRNA)로서, 또는 DNA 플라스미드에서 전사 카세트로부터 전사된 siRNA 또는 dsRNA로서 포함하는 몇 개의 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 효소적으로 또는 부분/총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 변형된 리보뉴클레오타이드는 시험관내 효소 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. 어떤 예에서, 각 가닥은 화학적으로 제조된다. RNA 분자를 합성하는 방법은 당해기술, 예를 들면, Verma 및 Eckstein (1998)에서 기재되어 있거나 본원에서 기재된 바와 같은 화학적 합성 방법에서 공지되어 있다.
RNA 모집단은 긴 전구체 RNA를 제공하기 위해 사용될 수 있거나, 선택된 표적 서열에 대한 실질적 또는 완전한 동일성을 갖는 긴 전구체 RNA는 siRNA를 만들기 위해 사용될 수 있다. RNA는 세포 또는 조직으로부터 단리될 수 있고, 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법에 따라 합성 및/또는 클로닝될 수 있다. RNA는 (세포 또는 조직으로부터 수득된, cDNA으로부터 전사된, 공제된, 선택된, 등) 혼합된 모집단일 수 있거나, 단일 표적 서열을 나타낼 수 있다. RNA는 자연 발생적 (예를 들면, 조직 또는 세포 샘플로부터 단리됨)일 수 있고, (예를 들면, T7 또는 SP6 폴리머라제 및 PCR 생성물 또는 클로닝된 cDNA를 사용하여)시험관내 합성되거나, 화학적으로 합성될 수 있다.
긴 dsRNA를 형성하기 위해, 합성 RNA에 대해, 보체는 또한 시험관내 전사되고 혼성화되어 dsRNA를 형성한다. 천연 발생 RNA 모집단이 사용되면, RNA 보체는, 예를 들면, RNA 모집단에 상응하는 cDNA를 전사시키거나, RNA 폴리머라제를 사용하여 (예를 들면, E. 콜라이 RNAe III 또는 다이서(Dicer)에 의한 소화에 대한 dsRNA를 형성하기 위해) 또한 제공될 수 있다. 그 다음 전구체 RNA는 혼성화되어 소화용 이중가닥 RNA를 형성한다. dsRNA는 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있거나 투여 전에 시험관 내에서 소화될 수 있다.
RNA를 단리하고, RNA를 합성하고, 핵산을 혼성화하고, cDNA 라이브러리를 제조 및 스크리닝하고, PCR을 수행하는 방법은 당해기술에서 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들면, Gubler 및 Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook 등, supra ; Ausubel 등, supra ), PCR 방법 (참고, 미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis 등, eds, 1990)에서와 같이). 발현 라이브러리는 또한 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서 일반적인 사용 방법을 개시하는 추가의 기본 텍스트는 하기를 포함한다: Sambrook 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds., 1994). 이들 참조의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당해기술에서 공지된 임의의 다양한 기술, 예컨대 하기에서 기재된 것들을 사용하여 합성될 수 있다: Usman 등, J. Am . Chem . Soc ., 109:7845 (1987); Scaringe 등, Nucl . Acids Res ., 18:5433 (1990); Wincott 등, Nucl. Acids Res ., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott 등, Methods Mol . Bio ., 74:59 (1997). 올리고뉴클레오타이드의 합성은 공통의 핵산 보호 및 커플링 그룹, 예컨대 5'-말단에서 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서 포스포르아미다이트을 이용한다. 비제한적인 예로서, 소규모 합성은 0.2 μmol 규모 프로토콜을 이용하여 Applied Biosystems 합성기 상에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 0.2 μmol 규모의 합성은 96-웰 플레이트 합성기 (Protogene, Palo Alto, CA) 상에서 수행될 수 있다. 그러나, 합성의 더 큰 또는 더 작은 규모는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성, RNA 탈보호 방법, 및 RNA 정제 방법을 위한 적당한 시약은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
siRNA 분자는 텐덤(tendem) 합성 기술을 통해 또한 합성될 수 있고, 여기서 두 가닥 모두는 단일 연속적 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 가닥으로서 합성되고, 이들은 siRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화되는 별개의 단편 또는 가닥을 제공하기 위해 차후에 절단되는 절단가능 링커에 의해 분리된다. 링커는 폴리뉴클레오타이드 링커 또는 비-뉴클레오타이드 링커일 수 있다. siRNA의 텐덤 합성은 다중웰/다중플레이트 합성 플랫폼 둘 모두 뿐만 아니라 배치 반응기, 합성 칼럼, 등을 이용하는 대규모 합성 플랫폼에 쉽게 적응될 수 있다. 대안적으로, siRNA 분자는 2 개의 뚜렷이 다른 올리고뉴클레오타이드으로부터 조립될 수 있고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드 센스 가닥을 포함하고 다른 하나는 siRNA의 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들면, 각 가닥은 별도로 합성되고 하이브리드화 또는 결찰(ligation)에 의해 함께 연결되고 그 다음 합성 및/또는 탈보호된다. 어떤 다른 예에서, siRNA 분자는 단일 연속적 올리고뉴클레오타이드 단편으로서 합성될 수 있고, 여기서 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역은 혼성화되어 헤어핀 2차 구조를 갖는 siRNA 듀플렉스를 형성한다.
c) siRNA 서열의 변형
어떤 측면에서, siRNA 분자는 이중-가닥 영역에서 2 개의 가닥 및 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드을 갖는 듀플렉스를 포함하고, 여기서 각 가닥은 그 길이가 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드이다. 유익하게는, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극이 더 적지만, 표적 서열의 발현을 사일런싱하는 능력을 보유한다. 바람직한 구현예에서, siRNA 분자에 도입된 화학적 변형의 정도는 siRNA의 면역자극 특성의 감소 또는 폐기 및 RNAi 활성의 체류 사이에서 절충한다. 비제한적인 예로서, 관심 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 표적 유전자 발현을 사일런싱하는 능력을 보유하면서 siRNA에 의해 산출된 면역 반응을 제거하기 위해 siRNA 듀플렉스 내에서 선택적 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드에서 최소로 변형될 수 있고 (예를 들면, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만으로 변형될 수 있다).
본 발명에서 사용하기에 적당한 변형된 뉴클레오타이드의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 2'-O-메틸 (2'OMe), 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F), 2'-데옥시, 5-C-메틸, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE), 4'-티오, 2'-아미노, 또는 2'-C-알릴 그룹을 갖는 리보뉴클레오타이드. 예를 들면, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984)에서 기재된 것과 같은 노던 형태를 갖는 변형된 뉴클레오타이드는, siRNA 분자에서 사용하기에 또한 적당하다. 그와 같은 변형된 뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 잠겨진 핵산 (LNA) 뉴클레오타이드 (예를 들면, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오타이드), 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오타이드, 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-클로로 (2'Cl) 뉴클레오타이드, 및 2'-아지도 뉴클레오타이드. 어떤 예에서, 본원에서 기재된 siRNA 분자는 하나 이상의 G-클램프 뉴클레오타이드를 포함한다. G-클램프 뉴클레오타이드는 변형된 시토신 유사체를 의미하고 여기서 상기 변형은 상기 능력을, 듀플렉스 내의 상보적 구아닌 뉴클레오타이드의 Watson-Crick 및 Hoogsteen 면(face) 모두의 수소 결합에게 부여한다 (참고, 예를 들면, Lin 등, J. Am . Chem . Soc., 120:8531-8532 (1998)). 또한, 뉴클레오타이드 염기 유사체 예를 들면, C-페닐, C-나프틸, 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카복사마이드, 및 니트로아졸 유도체 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌를 갖는 뉴클레오타이드 (참고, 예를 들면, Loakes, Nucl . Acids Res ., 29:2437-2447 (2001))는 siRNA 분자에 편입될 수 있다.
어떤 구현예에서, siRNA 분자는 하나 이상의 화학적 변형 예컨대 말단 캡 모이어티, 포스페이트 골격 변형, 등을 추가로 포함할 수 있다. 말단 캡 모이어티의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 역전된 데옥시 염기소실 잔기, 글리세릴 변형, 4',5'-메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(β-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, α-뉴클레오타이드, 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오 -펜토푸라노실 뉴클레오타이드, 비환식 3',4'-세코 뉴클레오타이드, 비환식 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 비환식 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'-3'-역전된 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-3'-역전된 무염기성 모이어티, 3'-2'-역전된 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-2'-역전된 무염기성 모이어티, 5'-5'-역전된 뉴클레오타이드 모이어티, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티, 3'-5'-역전된 데옥시 무염기성 모이어티, 5'-아미노-알킬 포스페이트, 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트, 6-아미노헥실 포스페이트, 1,2-아미노도데실 포스페이트, 하이드록시프로필 포스페이트, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포르아미데이트, 5'-포스포르아미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 5'-아미노, 3'-포스포로티오에이트, 5'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 브릿징 또는 비-브릿징 메틸포스포네이트 또는 5'-머캅토 모이어티 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,998,203; 뷰케이지 등, tetrahedron 49:1925 (1993)). 포스페이트 골격 변형의 비-제한적인 예는(즉, 변형된 뉴클레오타이드간 연결로 인한) 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모폴리노, 아미데이트, 카바메이트, 카복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 설포네이트, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 및 알킬실릴 치환 (참고, 예를 들면, Hunziker 등, Nucleic Acid Analogues : Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker 등, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). 그와 같은 화학적 변형은 siRNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 일어날 수 있다. 이들 참조의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 구현예에서, siRNA 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 하기를 갖는 3'-말단 오버행을 추가로 포함할 수 있다: 약 1 내지 약 4 개의 (예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 개의) 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드, 변형된 (예를 들면, 2'OMe) 및/또는 비변형된 우리딘 리보뉴클레오타이드, 및/또는 변형된 (예를 들면, 2'OMe) 및 비변형된 뉴클레오타이드의 임의의 다른 조합.
변형된 뉴클레오타이드의 추가 예 및 siRNA 분자에 도입될 수 있는 화학적 변형의 유형은, 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: UK 특허 번호 GB 2,397,818 B 및 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0192626, 2005/0282188, 및 2007/0135372, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본원에서 기재된 siRNA 분자는 siRNA의 하나 또는 두 가닥 모두에서 하나 이상의 비-뉴클레오타이드를 임의로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-뉴클레오타이드"는 임의의 그룹 또는 화합물을 의미하고, 이것은 당 및/또는 포스페이트 치환을 포함하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위의 부위에서 핵산 사슬에 편입될 수 있고, 나머지 염기가 그의 활성을 나타내도록 한다. 그룹 또는 화합물은 통상적으로 인식된 뉴클레오타이드 염기 예컨대 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실, 또는 티민을 함유하지 않고 따라서 1'-위치에서 염기가 없다는 점에서 무염기성이다.
다른 구현예에서, siRNA의 화학적 변형은 콘쥬게이트를 siRNA 분자에 부착시키는 것을 포함한다. 콘쥬게이트는 공유 결합 예를 들면, 생분해성 링커를 통해 siRNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3'-말단에서 부착될 수 있다. 콘쥬게이트는, 예를 들면, 카바메이트 그룹 또는 다른 연결 그룹을 통해 siRNA에 또한 부착될 수 있다 (참고, 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0074771, 2005/0043219, 및 2005/0158727). 어떤 예에서, 콘쥬게이트는 siRNA의 세포에의 전달을 촉진하는 분자이다. siRNA에 부착하는데 적당한 콘쥬게이트 분자의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 스테로이드 예컨대 콜레스테롤, 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 인간 혈청 알부민 (HSA), 지방산, 카로테노이드, 테르펜, 담즙산, 폴레이트 (예를 들면, 엽산, 폴레이트 유사체 및 그의 유도체), 당류 (예를 들면, 갈락토오스, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, 글루코오스, 만노스, 푸룩토오스, 푸코스, 등), 인지질, 펩타이드, 세포성 흡수를 매개할 수 있는 세포성 수용체의 리간드, 및 이들의 조합 (참고, 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0130186, 2004/0110296, 및 2004/0249178; 미국 특허 번호 6,753,423). 다른 예들은 하기를 포함한다: 친지질성 모이어티, 비타민, 폴리머, 펩타이드, 단백질, 핵산, 소분자, 올리고사카라이드, 탄수화물 클러스터, 삽입제, 작은 홈 결합제, 절단제, 및 가교결합제 콘쥬게이트 분자, 이들은 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0119470 및 2005/0107325에 기재되어 있다. 또 다른 예들은 하기를 포함한다: 2'-O-알킬 아민, 2'-O-알콕시알킬 아민, 폴리아민, C5-양이온성 변형된 피리미딘, 양이온성 펩타이드, 구아니디늄 그룹, 아미디니늄 그룹, 양이온성 아미노산 콘쥬게이트 분자, 이들은 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0153337에 기재되어 있다. 추가의 예들은 하기를 포함한다 소수성 그룹, 막 활성 화합물, 세포 침투 화합물, 세포 표적 신호, 상호작용 모디파이어, 및 입체 안정제 콘쥬게이트 분자, 이들은 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0167090에 기재되어 있다. 추가 예들은 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0239739에서 기재된 콘쥬게이트 분자를 포함한다. 사용된 콘쥬게이트의 유형 및 siRNA 분자에 대한 콘주게이션의 정도는 RNAi 활성을 보유하면서 siRNA의 개선된 약력학적 프로파일, 생체이용률, 및/또는 안정성에 대해 평가될 수 있다. 이와 같이, 당해분야의 숙련가는 임의의 다양한 공지된 시험관내 세포 배양물 또는 생체내 동물 모형을 사용하여 개선된 특성 및 전제 RNAi 활성을 갖는 것들을 확인하기 위해 분자에 부착된 다양한 콘쥬게이트를 갖는 siRNA 분자를 스크리닝할 수 있다. 상기-기재된 특허 문서의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
d) 표적 유전자
본원에서 기재된 핵산-지질 입자의 siRNA 성분은 관심 유전자의 번역 (즉, 발현)을 하향조절 또는 사일런싱하기 위해 사용될 수 있다. 관심 유전자는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 바이러스성 감염 및 생존과 연관된 유전자, 대사성 질환 및 장애와 연관된 유전자 (예를 들면, 간 질환 및 장애), 종양형성 또는 세포 형질전환과 연관된 유전자 (예를 들면, 암), 혈관신생 유전자, 면역모디파이어 유전자 예컨대 염증성 및 자가면역 반응과 연관될 것들, 수용체 리간드 유전자, 및 신경퇴행성 장애와 연관된 유전자.
특별한 구현예에서, 본 발명은 관심 다중 유전자의 발현을 사일런싱하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 이상의 siRNA 분자의 칵테일을 제공한다. 일부 구현예에서, siRNA 분자의 칵테일은 지질 입자 예컨대 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP)에서 완전히 캡슐화된다. siRNA 분자는 동일한 지질 입자에서 공-캡슐화될 수 있거나, 칵테일에 존재하는 각 siRNA 종은 별개의 입자에서 제형될 수 있다.
바이러스성 감염 및 생존과 연관된 유전자는 세포에서 결합, 진입 및 복제하기 위해 숙주 (예를 들면, 숙주 인자 예컨대 조직 인자 (TF)) 또는 바이러스에 의해 발현된 것을 포함한다. 만성 바이러스 질환과 연관된 바이러스 서열이 특정한 관심 중의 하나이다. 특정한 관심의 바이러스 서열은 하기의 서열을 포함한다: 필로바이러스 예컨대 에볼라 바이러스 및 마르부르그 바이러스 (참고, 예를 들면, Geisbert 등, J. Infect . Dis ., 193:1650-1657 (2006)); 아레나바이러스 예컨대 라사 바이러스, 쥬닌 바이러스, 마츄포 바이러스, 과나리토 바이러스, 및 사비아 바이러스 (Buchmeier 등, Arenaviridae: 바이러스 및 그의 복제, : Fields Virology, Knipe 등 (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001))에서; 인플루엔자 바이러스 예컨대 인플루엔자 A, B, 및 C 바이러스, (참고, 예를 들면, Steinhauer 등, Annu Rev Genet ., 36:305-332 (2002); 및 Neumann 등, J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002)); 간염 바이러스 (참고, 예를 들면, Hamasaki 등, FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota 등, EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai 등, Hepatology, 37:764 (2003); Wilson 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 100:2014 (2003); 및 Fields Virology, Knipe 등 (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) (Banerjea 등, Mol . Ther., 8:62 (2003); Song 등, J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA , 289:1494 (2003); Qin 등, Proc . Natl. Acad . Sci. USA, 100:183 (2003)); 헤르페스 바이러스 (Jia 등, J. Virol., 77:3301 (2003)); 및 인간 유두종 바이러스 (HPV) (Hall 등, J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang 등, 종양유전자, 21:6041 (2002)).
사일런싱될 수 있는 예시적인 필로바이러스 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 구조적 단백질 (예를 들면, VP30, VP35, 핵단백질 (NP), 폴리머라제 단백질 (L-pol)) 및 막-연관된 단백질 (예를 들면, VP40, 당단백질 (GP), VP24)을 인코딩하는 핵산 서열. 에볼라 바이러스에 대한 완전한 게놈 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_002549; AY769362; NC_006432; NC_004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101; AF272001; 및 AF086833. 에볼라 바이러스 VP24 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 U77385 및 AY058897. 에볼라 바이러스 L-pol 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 X67110. 에볼라 바이러스 VP40 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AY058896. 에볼라 바이러스 NP 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AY058895. 에볼라 바이러스 GP 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AY058898; Sanchez 등, Virus Res ., 29:215-240 (1993); Will 등, J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov 등, FEBS Lett ., 305:181-184 (1992); 및 미국 특허 번호 6,713,069. 추가의 에볼라 바이러스 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 L11365 및 X61274. 마르부르그 바이러스에 대한 완전한 게놈 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_001608; AY430365; AY430366; 및 AY358025. 마르부르그 바이러스 GP 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AF005734; AF005733; 및 AF005732. 마르부르그 바이러스 VP35 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AF005731 및 AF005730. 추가의 마르부르그 바이러스 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 X64406; Z29337; AF005735; 및 Z12132. 에볼라 바이러스 및 마르부르그 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0135370 및 미국 가출원 번호 61/286,741(2009년 12월 15일 출원) 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
사일런싱될 수 있는 예시적인 아레나바이러스 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 핵단백질 (NP), 당단백질 (GP), L-폴리머라제 (L), 및 Z 단백질 (Z)를 인코딩하는 핵산 서열. 라사 바이러스에 대한 완전한 게놈 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_004296 (LASV 분절 S) 및 NC_004297 (LASV 분절 L). 라사 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 가출원 번호 61/319,855(2010년 3월 31일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
사일런싱될 수 있는 예시적인 숙주 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 출혈열 바이러스의 병인에 역할을 하는 것으로 공지된 숙주 인자 예컨대 조직 인자 (TF)를 인코딩하는 핵산 서열. TF의 mRNA 서열은 유전자은행 수납 번호 NM_001993에서 제시되어 있다. 당해분야의 숙련가는, TF는 F3, 응고 인자 III, 트롬보플라스틴, 및 CD142로도 공지되어 있음을 인식할 것이다. TF 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 가출원 번호 61/319,855(2010년 3월 31일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
사일런싱될 수 있는 예시적인 인플루엔자 바이러스 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 핵단백질 (NP), 매트릭스 단백질 (M1 및 M2), 비구조적 단백질 (NS1 및 NS2), RNA 폴리머라제 (PA, PB1, PB2), 뉴라미니다제 (NA), 및 적혈구응집소 (HA)를 인코딩하는 핵산 서열. 인플루엔자 A NP 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; 및 AY818140. 인플루엔자 A PA 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 AY818132; AY790280; AY646171; AY818132;AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; 및 AY724786. 인플루엔자 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0218122, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
사일런싱될 수 있는 예시적인 간염 바이러스 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 전사 및 번역과 연루된 핵산 서열 (예를 들면, En1, En2, X, P) 및 구조적 단백질 (예를 들면, C 및 C-관련된 단백질을 포함하는 코어 단백질, S, M, 및/또는 L 단백질을 포함하는 캡시드 및 엔빌로프 단백질, 또는 그의 단편)을 인코딩하는 핵산 서열 (참고, 예를 들면, FIELDS VIROLOGY, supra). 사일런싱될 수 있는 예시적인 C형 간염 바이러스 (HCV) 핵산 서열은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 5'-미번역된 영역 (5'-UTR), 3'-미번역된 영역 (3'-UTR), 다단백질 번역 개시 코돈 영역, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 서열, 및/또는 코어 단백질, E1 단백질, E2 단백질, p7 단백질, NS2 단백질, NS3 프로테아제/헬리카제, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질, 및/또는 NS5B RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 핵산 서열. HCV 게놈 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_004102 (HCV 유전자형 1a), AJ238799 (HCV 유전자형 1b), NC_009823 (HCV 유전자형 2), NC_009824 (HCV 유전자형 3), NC_009825 (HCV 유전자형 4), NC_009826 (HCV 유전자형 5), 및 NC_009827 (HCV 유전자형 6). A형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_001489; B형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_003977; D형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_001653; E형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_001434; 및 G형 간염 바이러스 핵산 서열은 예를 들면 하기에서 제시되어 있다: 유전자은행 수납 번호 NC_001710. 바이러스성 감염 및 생존과 연관된 유전자를 인코딩하는 서열의 사일런싱은 바이러스 병태를 치료하기 위해 사용된 종래의 제제의 투여와 함께 편리하게 사용될 수 있다. 간염 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0281175, 2005/0058982, 및 2007/0149470; 미국 특허 번호 7,348,314; 및 PCT 출원 번호 PCT/CA2010/000444, 명칭 "Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression," (2010년 3월 19일 출원), 보유 변리사 문서 번호 020801-008910PC, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
대사성 질환 및 장애 (예를 들면, 간이 표적 및 간 질환 및 장애인 장애)와 연관된 유전자는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 이상지질혈증에서 발현된 유전자, 예를 들면, 아포지질단백질 B (APOB) (유전자은행 수납 번호 NM_000384), 아포지질단백질 CIII (APOC3) (유전자은행 수납 번호 NM_000040 및 NG_008949 영역: 5001..8164), 아포지질단백질 E (APOE) (유전자은행 수납 번호 NM_000041 및 NG_007084 영역: 5001..8612), 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9) (유전자은행 수납 번호 NM_174936), 디아실글리세롤 O-아실트랜스페라제 유형 1 (DGAT1) (유전자은행 수납 번호 NM_012079), 디아실글리세롤 O-아실트랜스페라제 제2형 (DGAT2) (유전자은행 수납 번호 NM_032564), 간 X 수용체 예컨대 LXRα 및 LXRβ (유전자은행 수납 번호 NM_007121), 파르네소이드 X 수용체 (FXR) (유전자은행 수납 번호 NM_005123), 스테롤-조절 인자 결합 단백질 (SREBP), 부위-1 프로테아제 (S1P), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 보조효소-A 환원효소 (HMG 보조효소-A 환원효소); 및 당뇨병에서 발현된 유전자, 예를 들면, 글루코오스 6-포스파타제 (참고, 예를 들면, Forman 등, Cell , 81:687 (1995); Seol 등, Mol . Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai 등, Cell , 85:1037-1046 (1996); Duncan 등, J. Biol . Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy 등, Genes Dev ., 9:1033-1045 (1995); Lehmann 등, J. Biol . Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski 등, Nature , 383:728-731 (1996); 및 Peet 등, Cell , 93:693-704 (1998)).
당해분야의 숙련가는, 대사성 질환 및 장애와 연관된 유전자 (예를 들면, 간이 표적 및 간 질환 및 장애인 질환 및 장애)는 간 자체에서 발현된 유전자 뿐만 아니라 및 다른 기관 및 조직에서 발현된 유전자를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 대사성 질환 및 장애와 연관된 유전자를 인코딩하는 서열의 사일런싱은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된 종래의 제제의 투여와 함께 편리하게 사용될 수 있다. APOB 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0134189, 2006/0105976, 및 2007/0135372, 및 PCT 공개 번호 WO 04/091515, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. APOC3 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: PCT 출원 번호 PCT/CA2010/000120(2010년 1월 26일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. PCSK9 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0173473, 2008/0113930, 및 2008/0306015, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. DGAT1 유전자를 표적으로 하는 예시적인 siRNA 분자는 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0185559에서 기재된 안티센스 화합물을 사용하여 설계될 수 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. DGAT2 유전자를 표적으로 하는 예시적인 siRNA 분자는 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0043524에서 기재된 안티센스 화합물을 사용하여 설계될 수 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
종양형성 또는 세포 형질전환 (예를 들면, 암 또는 다른 신조직형성)과 연관된 유전자는, 예를 들면, 하기를 포함한다: p53 우비퀴틴화, c-Jun 우비퀴틴화, 히스톤 탈아세틸화, 세포 주기 조절, 전사 조절, 및 이들의 조합과 연루된 유전자. 종양형성 또는 세포 형질전환과 연루된 유전자 서열의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 세린/트레오닌 키나제 예컨대 폴로-유사 키나아제 1 (PLK-1) (유전자은행 수납 번호 NM_005030; Barr 등, Nat . Rev . Mol . Cell Biol ., 5:429-440 (2004)) 및 사이클린-의존적 키나아제 4 (CDK4) (유전자은행 수납 번호 NM_000075); 우비퀴틴 리가제 예컨대 COP1 (RFWD2; 유전자은행 수납 번호 NM_022457 및 NM_001001740) 및 링-박스 1 (RBX1) (ROC1; 유전자은행 수납 번호 NM_014248); 티로신 키나제 예컨대 WEE1 (유전자은행 수납 번호 NM_003390 및 NM_001143976); 유사분열 키네신 예컨대 Eg5 (KSP, KIF11; 유전자은행 수납 번호 NM_004523); 전사 인자 예컨대 포크헤드 박스 M1 (FOXM1) (유전자은행 수납 번호 NM_202002, NM_021953, 및 NM_202003) 및 RAM2 (R1 또는 CDCA7L; 유전자은행 수납 번호 NM_018719, NM_001127370, 및 NM_001127371); 세포사멸세포사멸예컨대 XIAP (유전자은행 수납 번호 NM_001167); COP9 시그날로솜 서브유닛 예컨대 CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1; 유전자은행 수납 번호 NM_006837); CSN6, CSN7A, CSN7B, 및 CSN8; 및 히스톤 탈아세틸화효소 예컨대 HDAC1, HDAC2 (유전자은행 수납 번호 NM_001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, 등.
PLK-1 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0107316 및 2007/0265438; 및 PCT 공개 번호 WO 09/082817, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. Eg5 및 XIAP 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0149403, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. CSN5 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO 09/129319에서 기재된 것을 포함하고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. COP1, CSN5, RBX1, HDAC2, CDK4, WEE1, FOXM1, 및 RAM2 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 가출원 번호 61/245,143(2009년 9월 23일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
종양형성 또는 세포 형질전환과 연관된 유전자 서열의 추가 예는 하기를 포함한다: 전좌(translocation) 서열 예컨대 MLL 융합 유전자, BCR-ABL (Wilda 등, Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr 등, Blood , 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO, 및 AML1-MTG8 (Heidenreich 등, Blood, 101:3157 (2003)); 과발현된 서열 예컨대 다중약물 내성 유전자 (Nieth 등, FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu 등, Cancer Res . 63:1515 (2003)), 사이클린 (Li 등, Cancer Res ., 63:3593 (2003); Zou 등, Genes Dev., 16:2923 (2002)), 베타-카테닌 (Verma 등, Clin Cancer Res ., 9:1291 (2003)), 텔로머라제 유전자 (Kosciolek 등, Mol Cancer Ther ., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, 성장 인자 수용체 (예를 들면, EGFR/ErbB1 (유전자은행 수납 번호 NM_005228, NM_201282, NM_201283, 및 NM_201284; 또한 하기를 참조한다: Nagy 등 Exp . Cell Res ., 285:39-49 (2003)), ErbB2/HER-2 (유전자은행 수납 번호 NM_004448 및 NM_001005862), ErbB3 (유전자은행 수납 번호 NM_001982 및 NM_001005915), 및 ErbB4 (유전자은행 수납 번호 NM_005235 및 NM_001042599)), 및 돌연변이된 서열 예컨대 RAS (Tuschl 및 Borkhardt, Mol . Interventions, 2:158 (2002)). EGFR 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비-제한적인 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0149403, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. VEGFR 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 예를 들면, 하기에서 제시되어 있다: GB 2396864; 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0142895; 및 CA 2456444, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
DNA 회복 효소를 인코딩하는 서열의 사일런싱은 화학치료제의 투여와 함께 사용한다 (Collis 등, Cancer Res ., 63:1550 (2003)). 종양 이동과 연관된 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한 관심 표적 서열, 예를 들면, 인테그린, 셀렉틴, 및 메탈로프로테이나제이다. 전술된 예는 배타적이지 않다. 당해분야의 숙련가는, 종양형성 또는 세포 형질전환, 종양 성장, 또는 종양 이동을 용이하게 하거나 촉진하는 임의의 전체 또는 부분 유전자 서열이 템플레이트 서열로서 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
혈관신생 유전자는 신규 혈관의 형성을 촉진할 수 있다. 특별한 관심의 혈관신생 유전자는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (Reich 등, Mol . Vis., 9:210 (2003)), 태반 성장 인자 (PGF), VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), 등. VEGFR 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 예를 들면, 하기에서 제시되어 있다: GB 2396864; 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0142895; 및 CA 2456444, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
면역모디파이어 유전자는 하나 이상의 면역 반응을 조절하는 유전자이다. 면역모디파이어 유전자의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 성장 인자 (예를 들면, TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, 등), 인터루킨 (예를 들면, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill 등, J. Immunol., 171:691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, 등), 인터페론 (예를 들면, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 등), 및 TNF. Fas 및 Fas 리간드 유전자는 또한 관심 면역모디파이어 표적 서열이다 (Song 등, Nat. Med ., 9:347 (2003)). 조혈 및 림프 세포에서2차 신호전달 분자를 인코딩하는 유전자는 본 발명에서 또한 포함되고, 그 예는 Tec 패밀리 키나제 예컨대 Bruton's 티로신 키나제 (Btk)이다 (Heinonen 등, FEBS Lett ., 527:274 (2002)).
세포 수용체 리간드 유전자는, 수용체가 (예를 들면, 세포 증식, 종양형성, 세포 형질전환, 세포분화, 등)과 연루된 생리적 경로를 조절하기 위해 ((예를 들면, 억제하기 위해) 세포 표면 수용체 (예를 들면, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체, G-단백질 커플링된 수용체, 인슐린 수용체, EPO 수용체, 등)에 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 세포 수용체 리간드 유전자의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 사이토카인 (예를 들면, TNF-α, 인터페론 예컨대 IFN-α, IFN-β, 및 IFN-γ, 인터루킨 예컨대 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23, IL-27, 케모카인, 등), 성장 인자 (예를 들면, EGF, HB-EGF, VEGF, PEDF, SDGF, bFGF, HGF, TGF-α, TGF-β, BMP1-BMP15, PDGF, IGF, NGF, β-NGF, BDNF, NT3, NT4, GDF-9, CGF, G-CSF, GM-CSF, GDF-8, EPO, TPO, 등), 인슐린, 글루카곤, G-단백질 커플링된 수용체 리간드, 등.
트리뉴클레오타이드 반복체 (예를 들면, CAG 반복체)의 증대(expension)를 코딩하는 템플레이트는 트리뉴클레오타이드 반복체의 증대에 의해 야기된 신경퇴행성 장애, 예컨대 척수연수 근육 위축증 및 헌팅턴병에서 사일런싱 병원체 서열을 사용한다 (Caplen 등, Hum . Mol . Genet., 11:175 (2002)).
치료적 목적을 위해 임의의 상기-기재된 유전자의 발현을 사일런싱하는 유용성 외에, 본원에서 기재된 siRNA는 연구 및 개발 적용 뿐만 아니라 진단, 예방적, 예후, 임상적, 및 다른 건강관리 적용에서 또한 유용하다. 비제한적인 예로서, siRNA는, 관심 유전자가 치료 표적으로 될 잠재성을 갖는 지를 시험하는 것을 지향하는 표적 검증 연구에서 사용될 수 있다. siRNA는 잠재적인 치료적 표적으로서 유전자를 발견하는 것을 목적으로 하는 표적 확인 연구에서 또한 사용될 수 있다.
e) 예시적인 siRNA 구현예
일부 구현예에서, siRNA 분자의 각 가닥은 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드의 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 뉴클레오타이드의 길이)를 포함한다. 하나의 특별한 구현예에서, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자는 표적 서열의 발현을 시험관내 및/또는 생체내에서 사일런싱할 수 있다.
다른 구현예에서, siRNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 어떤 구현예에서, siRNA는 이중-가닥 영역 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특별한 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의약 50% 미만 (예를 들면, 미만 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA의 이중-가닥 영역 중 뉴클레오타이드의 약 1% 내지 약 50% (예를 들면, 약 5%-50%, 10%-50%, 15%-50%, 20%-50%, 25%-50%, 30%-50%, 35%-50%, 40%-50%, 45%-50%, 5%-45%, 10%-45%, 15%-45%, 20%-45%, 25%-45%, 30%-45%, 35%-45%, 40%-45%, 5%-40%, 10%-40%, 15%-40%, 20%-40%, 25%-40%, 30%-40%, 35%-40%, 5%-35%, 10%-35%, 15%-35%, 20%-35%, 25%-35%, 30%-35%, 5%-30%, 10%-30%, 15%-30%, 20%-30%, 25%-30%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-25%, 5%-20%, 10%-20%, 15%-20%, 5%-15%, 10%-15%, 또는 5%-10%)는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
추가 구현예에서, siRNA는 하기를 비제한적으로 포함하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다: 2'-O-메틸 (2'OMe) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오타이드, 잠겨진 핵산 (LNA) 뉴클레오타이드, 및 그의 혼합물. 바람직한 구현예에서, siRNA는 하기를 포함한다: 2'OMe 뉴클레오타이드 (예를 들면, 2'OMe 퓨린 및/또는 피리미딘 뉴클레오타이드) 예를 들면, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드, 또는 그의 혼합물. 하나의 특별한 구현예에서, siRNA는 하기를 포함한다: 적어도 하나의 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 또는 그의 혼합물. 어떤 예에서, siRNA는 2'OMe-시토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, siRNA는 헤어핀 루프 구조를 포함한다.
어떤 구현예에서, siRNA는 siRNA의 이중-가닥 영역 분자의 하나의 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드는 siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 중 선택적 위치에서 변형된다. 우리딘 뉴클레오타이드 변형에 대해, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 이상의 우리딘 뉴클레오타이드는 변형된 우리딘 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 모든 우리딘 뉴클레오타이드는 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드이다. 구아노신 뉴클레오타이드 변형에 대해, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 이상의 구아노신 뉴클레오타이드는 변형된 구아노신 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 모든 구아노신 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드이다.
어떤 구현예에서, siRNA 서열 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 이상의 5'-GU-3' 모티프는, 예를 들면, 5'-GU-3' 모티프를 제거하기 위해 미스매치를 도입하고/거나 변형된 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe 뉴클레오타이드를 도입하여 변형될 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 siRNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두 서열에 있을 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 서로 인접할 수 있거나, 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열보다 면역자극이 더 적다. 그와 같은 구현예에서, 감소된 면역자극 특성을 갖는 변형된 siRNA 분자는 유익하게는 표적 서열에 대항하여 RNAi 활성을 보유한다. 또 하나의 구현예에서, 변형된 siRNA 분자의 면역자극 특성 및 표적 유전자 발현을 사일런싱하는 그의 능력은 can 균형이 맞을 수 있거나 siRNA 서열 예를 들면, siRNA 듀플렉스의 이중-가닥 영역 내의 최소 및 선택적 2'OMe 변형의 도입에 의해 최적화될 수 있다. 어떤 예에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA보다 면역자극이 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 보다 더 적다. 당해분야의 숙련가에게 변형된 siRNA 분자 및 상응하는 비변형된 siRNA 분자의 면역자극 특성은 예를 들면 적절한 지질-기반 전달 시스템 (예컨대 본원에서 개시된 LNP 전달 시스템)을 사용하여 포유동물의 전신 투여 약 2 내지 약 12 시간 후 INF-α 및/또는 IL-6 수준 또는 포유동물 반응자 세포의 형질감염(transfection)을 측정하여 결정될 수 있음은 명백하다.
다른 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA의 10-배 이하인 IC50 (즉, 반-최대 억제 농도)를 갖는다 (즉, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA의 IC50의 10-배 이하인 IC50를 갖는다). 다른 구현예에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA 서열의 3-배 이하의 IC50를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 변형된 siRNA는 상응하는 비변형된 siRNA의 2-배 이하의 IC50를 갖는다. 용량-반응 곡선이 산출될 수 있고 변형된 siRNA 및 상응하는 비변형된 siRNA에 대한 IC50 값은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다는 것은 당해분야의 숙련가에게 쉽게 분명할 것이다.
또 하나의 구현예에서, 비변형된 또는 변형된 siRNA 분자는 음성 대조군에 대해 표적 서열의 발현의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 사일런싱할 수 있다 (예를 들면, 완충제 단독, 상이한 유전자를 표적으로 하는 siRNA 서열, 스크램블드 siRNA 서열, 등).
또 하나의 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 비변형된 siRNA 서열에 대해 표적 서열의 발현의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 사일런싱할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA 분자는, 예를 들면, 이중-가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 포스페이트 골격 변형을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, siRNA는, 예를 들면, 이중-가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 1, 2, 3, 4, 이상의 포스페이트 골격 변형을 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 포스페이트 골격 변형을 포함하지 않는다.
추가 구현예에서, siRNA는, 예를 들면, 이중-가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 또 추가의 구현예에서, siRNA는, 예를 들면, 이중-가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 1, 2, 3, 4, 이상의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
어떤 예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 이중-가닥 영역의 3'-말단에 있는 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다. 어떤 다른 예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 중 이중-가닥 영역의 (예를 들면, 3'-말단의 1, 2, 3, 또는 4 개의 뉴클레오타이드 내의) 3'-말단의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다.
본원에서 기재된 siRNA 분자는 이중-가닥 영역의 하나 또는 둘 모두 측 상에 1, 2, 3, 4, 이상의 뉴클레오타이드의 3' 오버행를 가질 수 있거나, 이중-가닥 영역의 하나 또는 둘 모두 측 상에 오버행이 없을 수 있다 (즉, 블런트 말단을 가질 수 있다). 어떤 구현예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 3' 오버행은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 이상의 변형된 뉴클레오타이드 예컨대 2'OMe 뉴클레오타이드 및/또는 본원에서 기재되거나 당해기술에서 공지된 임의의 다른 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
특별한 구현예에서, siRNA는 담체 시스템 예컨대 핵산-지질 입자를 사용하여 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 siRNA 분자; (b) 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염; 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들면, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤). 어떤 예에서, 핵산-지질 입자는 입자들의 응집을 예방하는 콘쥬게이트된 지질 (예를 들면, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA)을 추가로 포함할 수 있다.
2. 다이서 ( Dicer )-기질 dsRNA
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다이서-기질 dsRNA" 또는 "전구체 RNAi 분자"는 표적 유전자의 RNA 간섭을 위해 RISC 복합체에 편입된 활성 siRNA을 생산하기 위해 다이서에 의해 생체 내에서 처리된 임의의 전구체 분자를 포함하는 것으로 의도된다.
일 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 siRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 처리될 정도로 충분한 길이를 갖는다. 상기 구현예에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 하기를 포함한다: (i) 약 25 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 약 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 또는 25-30 개의 뉴클레오타이드의 길이), 바람직하게는 약 25 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는 제 1 올리고뉴클레오타이드 서열 (센스 가닥으로도 칭함), 및 (ii) 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질에서 발견된 조건 하에서 제 1 서열에 어닐링하는 제2 올리고뉴클레오타이드 서열 (안티센스 가닥로도 칭함). 제 2 올리고뉴클레오타이드 서열은 약 25 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 약 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, 또는 25-30 개의 뉴클레오타이드의 길이)를 가질 수 있고 바람직하게는 약 25 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는다. 또한, 서열, 특히 안티센스 가닥, 다이서-기질 dsRNA중 하나의 영역은 적어도 약 19 개의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 약 19 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 약 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 19-30, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드), 바람직하게는 약 19 내지 약 23 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 19, 20, 21, 22, 또는 23 개의 뉴클레오타이드)의 서열 길이를 갖는데, 이것은 RNAi 반응을 유발하기 위해 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오타이드 서열에 대해 충분히 상보적이다.
제2 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 다이서에 의해 그것의 처리를 향상시키는 몇 개의 특성을 갖는다. 상기 구현예에 따르면, dsRNA는 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이를 가지며 하기의 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (i) dsRNA는 비대칭이고, 예를 들면, 안티센스 가닥 상에 3'-오버행을 가지며; 및/또는 (ii) dsRNA는 활성 siRNA에 대한 dsRNA의 다이서 결합 및 처리의 직접적인 배향에 대한 센스 가닥 상에 변형된 3'-말단을 갖는다. 이러한 후자의 구현예에 따르면, 센스 가닥은 약 22 내지 약 28 개의 뉴클레오타이드를 포함하고 안티센스 가닥은 약 24 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 오버행을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 센스 가닥은 센스 가닥의 3'-말단에서 위치한 적당한 모디파이어에 의해 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된다. 적당한 모디파이어는 뉴클레오타이드 예컨대 데옥시리보뉴클레오타이드, 사이클로뉴클레오타이드, 등, 및 입체 장애 분자 예컨대 형광 분자 등을 포함한다. 뉴클레오타이드 모디파이어가 사용될 때, dsRNA의 길이가 변하지 않을 정도로 dsRNA 중 리보뉴클레오타이드를 대체한다. 또 하나의 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 오버행을 가지며 센스 가닥은 다이서 처리를 위해 변형된다. 또 하나의 구현예에서, 센스 가닥의 5'-말단은 포스페이트를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단은 포스페이트를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 또는 두 가닥 모두은 하나 이상의 2'-O-메틸 (2'OMe) 변형된 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 안티센스 가닥은 2'OMe 변형된 뉴클레오타이드를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 안티센스 가닥은 2'OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 3'-오버행을 함유한다. 안티센스 가닥은 또한 추가의 2'OMe 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질에서 발견된 조건 하에서 어닐링된다. 또한, 서열, 특히 안티센스 가닥, 다이서-기질 dsRNA 중 하나의 영역은 적어도 약 19 개의 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며, 여기서 이들 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 인접한 21-뉴클레오타이드 영역에 있고 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오타이드 서열에 대해 충분히 상보적이다. 게다가, 상기 구현예에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 하기의 추가의 특성 중 하나 이상을 또한 가질 수 있다: (a) 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer로부터 우향자리 이동을 갖는다 (즉, 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer와 비교할 때 분자의 우측 상에 뉴클레오타이드를 포함한다); (b) 가닥은 완전히 상보적이지 않을 수 있고(즉, 가닥은 단일 미스매치 짝짓기를 함유할 수 있고); (c) 염기 변형 예컨대 잠겨진 핵산(들)는 센스 가닥의 5'-말단에서 포함될 수 있다.
제3 구현예에서, 센스 가닥은 약 25 내지 약 28 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 25, 26, 27, 또는 28 개의 뉴클레오타이드), 여기서 센스 가닥의 3'-말단 상의 2 개의 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 센스 가닥은 5'-말단에서 포스페이트를 함유한다. 안티센스 가닥은 약 26 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오타이드)를 포함하고 1-4 개의 뉴클레오타이드의 3'-오버행을 함유한다. 3'-오버행을 포함하는 뉴클레오타이드는 2'OMe 변형된 리보뉴클레오타이드로 변형된다. 안티센스 가닥은 3'-오버행에 인접한 안티센스 가닥의 제 1 단량체에서 시작하는 교대하는 2'OMe 변형된 뉴클레오타이드, 및 3'-오버행에 인접한 제 1 단량체로부터 확장하는 15-19 개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 예를 들면, 27-뉴클레오타이드 안티센스 가닥에 대해 위치 번호 1, 2'OMe 변형으로서 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는 제 1 염기는 염기 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 및 27에 위치된다. 일 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00030
여기서 "X" = RNA, "p" = 포스페이트 그룹, "X" = 2'OMe RNA, "Y"는 임의로 2'OMe RNA 단량체인 1, 2, 3, 또는 4개의 RNA 단량체를 포함하는 오버행 도메인이고, "D" = DNA. 상부 가닥은 센스 가닥이고, 하부 가닥은 안티센스 가닥이다.
제4 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 다이서에 의한 처르를 향상시키는 몇 개의 특성을 갖는다. 상기 구현예에 따르면, dsRNA는 siRNA를 생산하기 위해 다이서에 의해 처리되기에 충분한 길이 및 하기의 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (i) dsRNA는 비대칭이고, 예를 들면, 센스 가닥 상에 3'-오버행을 가지며; 및 (ii) dsRNA는 활성 siRNA에 대한 dsRNA의 다이서 결합 및 처리의 직접적인 배향에 대한 안디센스 가닥 상에 변형된 3'-말단을 갖는다. 상기 구현예에 따르면, 센스 가닥은 약 24 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오타이드)를 포함하고 안티센스 가닥은 약 22 내지 약 28 개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28 개의 뉴클레오타이드)를 포함한다. 일 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 센스 가닥의 3'-말단 상에서 오버행을 갖는다. 또 하나의 구현예에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 3'-말단에서 위치한 적당한 모디파이어(modifier)에 의해 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된다. 적당한 모디파이어는 뉴클레오타이드(예컨대 데옥시리보뉴클레오타이드, 사이클로뉴클레오타이드, 등) 및 입체 장애 분자 (예컨대 형광 분자) 등을 포함한다. 뉴클레오타이드 모디파이어가 사용될 때, dsRNA의 길이가 변하지 않도록 dsRNA 중 리보뉴클레오타이드를 대체한다. 또 하나의 구현예에서, dsRNA는 센스 가닥의 3'-말단 상에 오버행을 가지며 안티센스 가닥은 다이서 처리를 위해 변형된다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-포스페이트를 갖는다. 센스 및 안티센스 가닥은 생물학적 조건, 예컨대 세포의 세포질에서 발견된 조건 하에서 어닐링된다. 또한, 서열, 특히 안티센스 가닥, dsRNA 중 하나의 영역은 적어도 19 개의 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며, 여기서 이들 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 인접하고 표적 유전자로부터 생산된 RNA의 뉴클레오타이드 서열에 대해 충분히 상보적이다. 게다가, 상기 구현예에 따르면, 다이서-기질 dsRNA는 하기의 추가의 특성 중 하나 이상을 또한 가질 수 있다: (a) 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer로부터 좌향자리 이동을 가지며 (즉, 안티센스 가닥은 전형적인 21-mer와 비교할 때 분자의 좌측 상에 뉴클레오타이드를 포함한다); 및 (b) 가닥은 완전히 상보적이지 않을 수 있고, 즉, 가닥은 단일 미스매치 짝짓기를 함유할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 비대칭 구조를 가지며, 센스 가닥은 25-염기쌍 길이를 가지며, 안티센스 가닥은 2 염기 3'-오버행을 갖는 27-염기쌍 길이를 갖는다. 어떤 예에서, 비대칭 구조를 갖는 이러한 dsRNA는 리보뉴클레오타이드 중 2 개 대신에 센스 가닥의 3'-말단에서 2 데옥시뉴클레오타이드를 추가로 함유한다. 어떤 다른 예에서, 비대칭 구조를 갖는 이러한 dsRNA는 안티센스 가닥의 위치 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 및 25에서 2'OMe 변형을 추가로 함유한다 (여기서 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는 제 1 염기는 위치 1이다). 어떤 추가의 예에서, 비대칭 구조를 갖는 이러한 dsRNA는 1, 2, 3, 또는 4 개의 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥 상에 3'-오버행를 추가로 함유한다 (예를 들면, 안티센스 가닥 상의 위치 26 및 27에 있는 2'OMe 뉴클레오타이드의 3'-오버행).
또 하나의 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 적어도 19 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 안티센스 가닥 siRNA 서열을 먼저 선택하여 설계될 수 있다. 일부 예에서, 안티센스 siRNA는 약 24 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드의 길이를 제공하기 위해 5'-말단 상에 약 5 내지 약 11 개의 리보뉴클레오타이드를 포함하도록 변형된다. 안티센스 가닥이 21 개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 때, 3-9, 바람직하게는 4-7, 또는 더 바람직하게는 6 개의 뉴클레오타이드는 5'-말단 상에 부가될 수 있다. 부가된 리보뉴클레오타이드는 표적 유전자 서열에 대해 상보적일 수 있지만, 표적 서열 및 안티센스 siRNA 사이의 완전 상보성이 필요한 것은 아니다. 즉, 그 결과로 생긴 안티센스 siRNA는 표적 서열과 충분히 상보적이다. 그 다음 센스 가닥은 약 22 내지 약 28 개의 뉴클레오타이드를 갖는 센스가닥을 생산한다. 센스 가닥은 생물학적 조건 하에서 안티센스 가닥을 어넝링하도록 안티센스 가닥과 실질적으로 상보적이다. 일 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 직접적인 다이서 처리에 대해 변형된 3'-말단을 함유하도록 합성된다. 또 하나의 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다. 추가 구현예에서, 센스 가닥은 다이서 결합 및 처리에 대해 변형된 3'-말단을 함유하도록 합성되고 dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다.
관련된 구현예에서, 안티센스 siRNA는 약 22 내지 약 28 개의 뉴클레오타이드의 길이를 제공하도록 5'-말단 상에 약 1 내지 약 9 개의 리보뉴클레오타이드를 포함하기 위해 변형될 수 있다. 안티센스 가닥이 21 개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 때, 1-7, 바람직하게는 2-5, 또는 더 바람직하게는 4 개의 리보뉴클레오타이드는 3'-말단 상에서 부가될 수 있다. 부가된 리보뉴클레오타이드는 임의의 서열을 가질 수 있다. 부가된 리보뉴클레오타이드는 표적 유전자 서열에 대해 상보적일 수 있지만, 표적 서열 및 안티센스 siRNA 사이의 완전 상보성이 필요한 것은 아니다. 즉, 그 결과로 생긴 안티센스 siRNA는 표적 서열과 충분히 상보적이다. 그 다음 약 24 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드를 갖는 센스 가닥이 생산된다. 센스 가닥은 생물학적 조건 하에서 안티셀스 가락을 어닐링하도록 안티센스 가닥과 실질적으로 상보적이다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 다이서 처리를 유도하도록 변형된 3'-말단을 함유하기 위해 합성된. 또 하나의 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다. 추가 구현예에서, 안티센스 가닥은 다이서 결합 및 처리를 위해 변형된 3'-말단을 함유하도록 합성되고 dsRNA의 센스 가닥은 3'-오버행을 갖는다.
적당한 다이서-기질 dsRNA 서열은 siRNA 서열을 설계, 합성, 및 변형하기 위해 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인, 합성 및 변형될 수 있다. 특별한 구현예에서, 다이서-기질 dsRNA는 담체 시스템 예컨대 핵산-지질 입자를 사용하여 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 다이서-기질 dsRNA 분자; (b) 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염; 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들면, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤). 어떤 예에서, 핵산-지질 입자는 입자들의 응집을 방지하는 콘쥬게이트된 지질을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들면, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA).
본 발명의 다이서-기질 dsRNA, 뿐만 아니라 그와 같은 dsRNA를 설계 및 합성하는 방법과 관련된 추가 구현예는 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0244858, 2005/0277610, 및 2007/0265220, 및 미국 가출원 번호 61/184,652(2009년 6월 5일 출원)에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
3. shRNA
"작은 헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런싱하기 위해 사용될 수 있는 치밀한 헤어핀 턴(trun)을 만들수 있는 짧은 RNA 서열을 포함한다. 본 발명의 shRNA는 화학적으로 합성되거나 DNA 플라스미드에서 전사 카세트로부터 전사될 수 있다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기구에 의해 siRNA로 전달되고, 그 다음 이것은 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)에 결합된다.
본 발명의 shRNA는 전형적으로 약 15-60, 15-50, 또는 15-40 (듀플렉스) 뉴클레오타이드의 길이, 더 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 (듀플렉스) 뉴클레오타이드의 길이를 가지며 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 (듀플렉스) 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다 (예를 들면, 이중-가닥 shRNA의 각 상보적 서열은 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드의 길이, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지며 이중-가닥 shRNA는 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 18-22, 19-20, 또는 19-21 염기쌍 길이를 갖는다). shRNA 듀플렉스는 안티센스 가닥 상에 약 1 내지 약 4 뉴클레오타이드 또는 약 2 내지 약 3 개의 뉴클레오타이드 및/또는 센스 가닥 상에 5'-포스페이트 말단의 3' 오버행을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA는 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 약 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, 또는 15-25 개의 뉴클레오타이드의 길이), 바람직하게는 약 19 내지 약 40 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 약 19-40, 19-35, 19-30, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드의 길이), 더 바람직하게는 약 19 내지 약 23 개의 뉴클레오타이드의 길이 (예를 들면, 19, 20, 21, 22, 또는 23 개의 뉴클레오타이드의 길이)의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 서열을 포함한다.
shRNA의 비-제한적인 예는 단일가닥 분자로부터 조립된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하고, 여기서 센스 및 안티센스 영역은 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커; 및 자가-상보적 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 2차 구조를 갖는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 연결된다. 바람직한 구현예에서, shRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 25 개의 뉴클레오타이드, 약 2 내지 약 20 개의 뉴클레오타이드, 약 4 내지 약 15 뉴클레오타이드, 약 5 내지 약 12 뉴클레오타이드, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 루프 구조에 의해 연결된다.
적당한 shRNA 서열은 siRNA 서열을 설계, 합성, 및 변형하기 위해 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인, 합성 및 변형될 수 있다. 특별한 구현예에서, shRNA는 담체 시스템 예컨대 핵산-지질 입자를 사용하여 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 shRNA 분자; (b) 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염; 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들면, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤). 어떤 예에서, 핵산-지질 입자는 입자들의 응집을 방지하는 콘쥬게이트된 지질을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들면, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA).
본 발명의 shRNA, 뿐만 아니라 그와 같은 shRNA를 설계 및 합성하는 방법과 관련된 추가의 구현예는, 미국 가출원 번호 61/184,652(2009년 6월 5일 출원)에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
4. aiRNA
siRNA와 마찬가지로, 비대칭 간섭 RNA (aiRNA)는 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)를 모집할 수 있고 안티센스 가닥의 5' 말단에 대해 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 표적 서열의 서열-특이적 절단을 매개하여 다양한 유전자의 효과적인 사일런싱으로 이어진다 (Sun 등, Nat . Biotech ., 26:1379-1382 (2008)). 전형적으로, aiRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 짧은 RNA 듀플렉스를 포함하고, 여기서 상기 듀플렉스는 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에서 오버행을 함유한다. aiRNA가 일반적으로 비대칭인 것은, 센스 가닥이 상보적 안티센스 가닥과 비교할 때 양 말단에서 더 짧기 때문이다. 일부 측면에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자에 대해서 사용된 것과 유사한 조건 하에서 설계, 합성 및 어닐링될 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열을 선택하기 위해 상기에서 기재된 방법을 사용하여 선택 및 산출될 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 다양한 길이 (예를 들면, 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17 개의 염기쌍, 더 전형적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 염기쌍)의 aiRNA 듀플렉스는 관심 mRNA를 표적으로 하기 위해 3' 및 안티센스 가닥의 5' 말단에서 오버행으로 설계될 수 있다. 어떤 예에서, aiRNA 분자의 센스 가닥은 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17 개의 뉴클레오타이드의 길이, 더 전형적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 어떤 다른 예에서, 안티 aiRNA 분자의 센스 가닥은 약 15-60, 15-50, 또는 15-40 개의 뉴클레오타이드의 길이, 더 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드의 길이, 및 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 5' 안티센스 오버행은 1, 2, 3, 4, 이상의 비표적 뉴클레오타이드 (예를 들면, "AA", "UU", "dTdT", 등)를 함유한다. 다른 구현예에서, 3' 안티센스 오버행은 1, 2, 3, 4, 이상의 비표적 뉴클레오타이드 (예를 들면, "AA", "UU", "dTdT", 등)를 함유한다. 어떤 측면에서, 본원에서 기재된 aiRNA 분자는, 예를 들면, 이중-가닥 (듀플렉스) 영역에서 및/또는 안티센스 오버행에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기에서 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드 예를 들면, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 또는 그의 혼합물을 포함한다.
어떤 구현예에서, aiRNA 분자는 siRNA의 안티센스 가닥 분자, 예를 들면, 본원에서 기재된 siRNA 분자 중의 하나에 상응하는 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 특별한 구현예에서, aiRNA는 담체 시스템 예컨대 핵산-지질 입자를 사용하여 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 aiRNA 분자; (b) 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염; 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들면, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤). 어떤 예에서, 핵산-지질 입자는 입자들의 응집을 방지하는 콘쥬게이트된 지질을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들면, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA).
적당한 aiRNA 서열은 siRNA 서열을 설계, 합성, 및 변형하기 위해 당해기술에서 공지된 임의의 수단을 사용하여 확인, 합성 및 변형될 수 있다. 본 발명의 aiRNA 분자와 관련된 추가의 구현예는 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0291131 및 PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
5. miRNA
일반적으로, 마이크로 RNA (miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 약 21-23 개의 뉴클레오타이드의 길이의 단일가닥 RNA 분자이다. miRNA는 전사되는 DNA로부터의 유전자에 의해 인코딩되지만, miRNA는 단백질 (비-코딩 RNA)로 번역되지 않고; 대신에, 각 일차 전사체 (pri-miRNA)는 pre-miRNA로 불리는 짧은 스템 -루프 구조로 처리되고 마지막으로 관능성 성숙한 miRNA로 처리된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적이고 그의 주요 기능은 유전자 발현을 조절하는 것이다. miRNA 분자의 확인은 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: Lagos-Quintana 등, Science, 294:853-858; Lau 등, Science, 294:858-862; 및 Lee 등, Science, 294:862-864.
miRNA를 인코딩하는 유전자는 처리된 성숙한 miRNA 분자보다 훨씬 더 길다. miRNA는 캡 및 poly-A 테일을 갖는 일차 전사체 또는 pri-miRNA로서 먼저 전사되고 세포 핵에서 pre-miRNA로서 공지된 짧은, ~70-뉴클레오타이드 스템-루프 구조로 처리된다. 상기 처리는 뉴클레아제 Drosha 및 이중-가닥 RNA 결합 단백질 Pasha로 이루어진 마이크로프로세서 복합체로서 공지된 단백질 복합체에 의해 동물에서 수행된다 (Denli 등, Nature, 432:231-235 (2004)). 그 다음 이들 pre-miRNA는 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)의 형성을 또한 개시하는 엔도뉴클레아제 Dicer와의 상호작용에 의해 세포질에서 성숙한 miRNA로 처리된다 (Bernstein 등, Nature, 409:363-366 (2001). DNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 miRNA를 산출하기 위해 템플레이트로서 기능할 수 있다.
다이서 RNA 분자가 형성되지만, 단지 하나는 RISC 복합체에 통합된다. 이러한 가닥은 가이드 가닥으로서 공지되어 있고 5' 말단의 안정성에 기초하여 RISC 복합체 중 촉매적 활성 RNase인 아르고노트 단백질에 의해 선택된다 (Preall 등, Curr. Biol ., 16:530-535 (2006)). 항-가이드 또는 패신져(passenger) 가닥으로서 공지된 나머지 가락은 RISC 복합체 기질로서 분해된다 (Gregory 등, Cell, 123:631-640 (2005)). 활성 RISC 복합체로의 통합 후, 그의 상보적 mRNA 분자를 갖는 miRNA 염기쌍은 표적 mRNA 분해 및/또는 번역 사일런싱을 유도한다.
포유동물 miRNA 분자는 보통 표적 mRNA 서열의 3' UTR에서 부위에 대해 상보적이다. 어떤 예에서, miRNA을 표적 mRNA로 어닐링하는 것은 단백질 번역 기계를 차단하여 단백질 번역을 억제한다. 어떤 다른 예에서, miRNA를 표적 mRNA로 어닐링하는 것은 RNA 간섭 (RNAi)와 유사한 과정을 통해 표적 mRNA의 절단 및 분해를 촉진한다. miRNA는 표적화된 mRNA에 상응하는 게놈 부위의 메틸화를 또한 표적으로 할 수 있다. 일반적으로, 단백질의 보체와 연관한 miRNA 기능은 총괄적으로 miRNP라 한다.
어떤 측면에서, 본원에서 기재된 miRNA 분자는 약 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, 또는 15-40 개의 뉴클레오타이드의 길이, 더 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드의 길이, 및 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 어떤 다른 측면에서, miRNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, miRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 상기에서 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드 예를 들면, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 또는 그의 혼합물을 포함한다.
특별한 구현예에서, miRNA는 담체 시스템 예컨대 핵산-지질 입자를 사용하여 투여된다. 바람직한 구현예에서, 핵산-지질 입자는 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 miRNA 분자; (b) 식 I의 양이온성 지질 또는 그의 염; 및 (c) 비-양이온성 지질 (예를 들면, DPPC, DSPC, DSPE, 및/또는 콜레스테롤). 어떤 예에서, 핵산-지질 입자는 입자들의 응집을 방지하는 콘쥬게이트된 지질을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들면, PEG-DAA 및/또는 POZ-DAA).
다른 구현예에서, 관심 mRNA를 표적으로 하는 miRN의 활성을 차단하는 하나 이상의 제제는 본 발명의 지질 입자 (예를 들면, 핵산-지질 입자 예컨대 LNP)를 사용하여 투여된다. 차단제의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 입체 차단 올리고뉴클레오타이드, 잠겨진 핵산 올리고뉴클레오타이드, 및 모폴리노 올리고뉴클레오타이드. 그와 같은 차단제는 표적 mRNA 상의 miRNA 또는 miRNA 결합 부위에 직접적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 miRNA 분자과 관련된 추가의 구현예는 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0291131 및 PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
6. 안티센스 올리고뉴클레오타이드
일 구현예에서, 핵산은 관심 표적 유전자 또는 서열로 지향된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 용어들 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "안티센스"는 표적화된 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 선택된 서열에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 RNA에 결합하여 상보적 RNA 가닥의 번역을 방지한다. 안티센스 DNA 올리고뉴클레오타이드는 특이적, 상보적 (코딩 또는 비-코딩) RNA를 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다. 결합이 일어나면, 이러한 DNA/RNA 하이브리드는 효소 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 용어는 또한 원하는 표적 유전자에 대해 정확하게 상보적일 수 없는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 본 발명은 비-표적 특이적-활성이 안티센스로 발견되는 예에서 이용될 수 있거나, 표적 서열과의 하나 이상의 미스매치를 함유하는 안티센스 서열은 특정 용도에 대해 가장 바람직하다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질 합성의 효과적인 및 표적화된 억제제인 것으로 실증되었고, 결과적으로, 표적화된 유전자에 의한 단백질 합성을 특이적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 합성을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능은 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 폴리갈락타우로나제 및 무스카린 제2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 그의 각 mRNA 서열로 지향된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다 (참고, 미국 특허 번호 5,739,119 및 5,759,829). 더욱이, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 내성 유전자 (MDR1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA 수용체, 및 인간 EGF로 실증되었다 (참고, Jaskulski 등, Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar 등, Cancer Commun ., 1:225-32 (1989); Peris 등, Brain Res Mol Brain Res ., 15;57:310-20 (1998); 및 미국 특허 번호 5,801,154; 5,789,573; 5,718,709 및 5,610,288). 게다가, 안티센스 구조체는 다양한 비정상 세포 증식, 예를 들면, 암을 억제하고 그것을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 또한 기재되었다 (참고, 미국 특허 번호 5,747,470; 5,591,317; 및 5,783,683). 이들 참조의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생산하는 방법은 당해기술에 공지되어 있고 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생산하기 위해 쉽게 적응될 수 있다. 주어진 표적 서열에 대해 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 선택은 선택된 표적 서열의 분석 및 2차 구조의 결정, Tm, 결합 에너지, 및 상대적 안정성을 기반으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 숙주세포에 표적 mRNA에 대한 특이적 결합을 감소 또는 억제하는 이량체, 헤어핀, 또는 다른 2차 구조를 형성하기 위해 상대적 무능을 기반으로 선택될 수 있다. mRNA의 크게 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에 또는 그 근처에 있는 영역 및 mRNA의 5' 영역에 대해 실질적으로 상보적 서열을 포함한다. 이들 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려는, 예를 들면, OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어의 v.4 (Molecular Biology Insights) 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul 등, Nucleic Acids Res ., 25:3389-402 (1997))를 사용하여 수행될 수 있다.
7. 리보자임
본 발명의 또 하나의 구현예에 따라, 핵산-지질 입자는 리보자임과 연관되어 있다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 특이적 촉매를 갖는 RNA-단백질 복합체이다 (참고, Kim 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 84:8788-92 (1987); 및 Forster 등, Cell, 49:211-20 (1987)). 예를 들면, 다수의 리보자임은 고도의 특이성 포스포에스테르 이동 반응을 가속하고, 이것은 올리고뉴클레오타이드 기질 중 몇 개의 포스포에스테르의 단 하나를 종종 절단한다 (참고, Cech 등, Cell, 27:487-96 (1981); Michel 등, J. Mol . Biol ., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek 등, Nature, 357:173-6 (1992)). 이러한 특이성은, 화학 반응 전에 리보자임의 내부 가이드 서열 ("IGS")에 대한 특이적 염기 짝짓기 상호작용을 통해 기질이 결합하는 요건에 기인했다.
적어도 6 개의 자연 발생 효소 RNA 분자의 염기성 품종이 현재 공지되어 있다. 각각은 생리적 조건 하에서 트랜스에서 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉진할 수 있다 (따라서 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다). 일반적으로, 효소 핵산은 표적 RNA에 먼저 결합하여 작용한다. 그와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하도록 작용하는 분자의 효소부에 아주 가까이 유지된 효소 핵산의 표적 결합부를 통해 일어난다. 따라서, 효소 핵산은 먼저 인식되고 그 다음 상보적 염기 짝짓기를 통해 표적 RNA에 결합하고, 올바른 부위에 일단 결합되면, 표적 RNA를 절단하기 위해 효소적으로 작용한다. 그와 같은 표적 RNA의 전략적 절단은 인코딩된 단백질의 직접적인 활성을 대한 그것의 능력을 파괴할 것이다. 효소 핵산이 결합되고 RNA 표적을 절단한 후, 또 하나의 표적을 찾기 위해 RNA로부터 방출되고 반복적으로 신규 표적에 결합하고 그것을 절단할 수 있다.
효소 핵산 분자는 예를 들면 해머헤드, 헤어핀, 간염 δ 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNaseP RNA (RNA 가이드 서열과 연관함), 또는 뉴로스포라 VS RNA 모티프에서 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 구체적인 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: Rossi 등, Nucleic Acids Res ., 20:4559-65 (1992). 헤어핀 모티프의 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: EP 0360257, Hampel 등, Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel 등, Nucleic Acids Res ., 18:299-304 (1990); 및 미국 특허 번호 5,631,359. 간염 δ 바이러스 모티프의 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: Perrotta 등, Biochemistry, 31:11843-52 (1992). RNaseP 모티프의 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: Guerrier-Takada 등, Cell, 35:849-57 (1983). 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프의 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: Saville 등, Cell, 61:685-96 (1990); Saville 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 88:8826-30 (1991); Collins 등, Biochemistry, 32:2795-9 (1993). 그룹 I 인트론의 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,987,071. 본 발명에 따라 사용된 효소 핵산 분자의 중요한 특성은, 표적 유전자 DNA 또는 RNA 영역의 하나 이상에 대해 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 가지며, RNA 절단 활성을 분자에 부여하는 기질 결합 부위 내에 또는 그 주위에 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것이다. 따라서, 리보자임 구조체는 본원에서 언급된 특이적 모티프로 제한될 필요는 없다. 이들 참조의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
임의의 폴리뉴클레오타이드 서열에 표적화된 리보자임을 생산하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 리보자임은 예를 들면, PCT 공보 번호 WO 93/23569 및 WO 94/02595에서 기재된 바와 같이 설계될 수 있고, 그것에서 기재된 바와 같이 시험관내 및/또는 생체내에서 시험되도록 합성된다. 이들 PCT 공보의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 팔(arm)의 길이를 변경하거나 혈청 리보뉴클레아제에 의해 그의 분해를 방지하는 변형 (참고, 예를 들면, PCT 공보 번호 WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162, 및 WO 94/13688; EP 92110298.4; 및 미국 특허 번호 5,334,711, 이들은 효소 RNA 분자의 당 모이어티로 만들어질 수 있는 다양한 화학적 변형을 기재하고 있고, 각각의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다), 세포에서 그의 효능을 향상시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 ?게 하고 화학적 요건을 감소시키기 위한 스템 II 염기의 제거를 갖는 리보자임을 화학적으로 합성하여 최적화될 수 있다.
8. 면역자극 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 지질 입자와 연관된 핵산은 면역자극일 수 있고, 그 핵산은 포유동물, 예컨대 인간일 수 있는 대상체에 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극 올리고뉴클레오타이드 (ISS; 단일- 또는 이중-가닥)를 포함한다. ISS는, 예를 들면, 하기를 포함한다: 헤어핀 2차 구조로 되는 어떤 회문 (참고, Yamamoto 등, J. Immunol., 148:4072-6 (1992)), 또는 CpG 모티프, 뿐만 아니라 다른 공지된 ISS 특징 (예컨대 다중-G 도메인; 참조; PCT 공개 번호 WO 96/11266, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다).
면역자극 핵산은, 면역 반응을 유발하기 위해 표적 서열에 특이적으로 결합하고 그의 발현을 필요로 하지 않을 때 비-서열 특이적인 것으로 간주된다. 따라서, 어떤 면역자극 핵산은 자연 발생 유전자 또는 mRNA의 영역에 상응하는 서열을 포함할 수 있지만, 비-서열 특이적 면역자극 핵산인 것으로 간주될 수 있다.
일 구현예에서, 면역자극 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 CpG 디뉴클레오타이드는 불메틸화 또는 메틸화될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 면역자극 핵산은 메틸화된 시토신을 갖는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산은 단일 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상기 CpG 디뉴클레오타이드 중 시토신은 메틸화된다. 대안적인 구현예에서, 핵산은 적어도 2 개의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 시토신은 메틸화된다. 추가 구현예에서, 서열에 존재하는 CpG 디뉴클레오타이드 중 각 시토신은 메틸화된다. 또 하나의 구현예에서, 핵산은 복수의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 메틸화된 시토신을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적당한 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 예는 하기에서 기재되어 있다: PCT 공보 번호 WO 02/069369, WO 01/15726, 및 WO 09/086558; 미국 특허 번호 6,406,705; 및 Raney 등, J. Pharm. Exper. Ther., 298:1185-92 (2001), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 ("PO") 골격 또는 포스포로티오에이트 ("PS") 골격, 및/또는 CpG 모티프 중 적어도 하나의 메틸화된 시토신 잔기를 갖는다.
B. 다른 활성제
어떤 구현예에서, 본 발명의 지질 입자와 연관된 활성제는 하나 이상의 치료적 단백질, 폴리펩타이드, 또는 작은 유기 분자 또는 화합물을 포함할 수 있다. 그와 같은 치료적으로 유효 제제 또는 약물의 비-제한적인 예 하기를 포함한다: 종양학 약물 (예를 들면, 화학요법 약물, 호르몬 치료제, 면역치료제, 방사선치료제, 등), 지질-저하제, 항-바이러스 약물, 항-염증성 화합물, 항우울제, 자극제, 진통제, 항생제, 산아 제한 약물, 해열제, 혈관확장제, 항혈관형성제, 세포혈관제 (cytovascular agent), 신호 전달 억제제, 심혈관 약물 (예컨대 항-부정맥제), 호르몬, 혈관수축신경, 및 스테로이드. 이들 활성제는 본 발명의 지질 입자에서 단독으로 투여되거나, 핵산, 예컨대 간섭 RNA를 포함하는 본 발명의 지질 입자와 함께 (예를 들면, 공-투여)될 수 있다.
화학요법 약물의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 백금-기반 약물 (예를 들면, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴, 등), 알킬화제 (예를 들면, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 클로르암부실, 부설판, 멜팔란, 메클로레타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아, 등), 항-대사물 (예를 들면, 5-플루오로우라실 (5-FU), 아자티오프린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 사이타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 등), 식물성 알칼로이드 (예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀, 등), 토포이소머라제 억제제 (예를 들면, 이리노테칸 (CPT-11; 캄프토sar), 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드 (VP16), 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 등), 항종양 항생제 (예를 들면, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 필리카마이신, 등), 티로신 키나제 억제제 (예를 들면, 게피티닙 (Iressa®), 선니티닙 (Sutent®; SU11248), 에를로티닙 (Tarceva®; OSI-1774), 라파티닙 (GW572016; GW2016), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006), 이마티닙 (Gleevec®; STI571), 다사티닙 (BMS-354825), 레플루노마이드 (SU101), 반데타닙 (ZactimaTM; ZD6474), 등), 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 이들의 조합.
종래의 호르몬 치료제의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 스테로이드 (예를 들면, 덱사메타존), 피나스테라이드, 방향화효소 억제제, 타목시펜, 및 고세렐린 뿐만 아니라 다른 성선자극호르몬-방출 호르몬 작용제 (GnRH).
종래의 면역치료제의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 면역증대 (예를 들면, 바실러스
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(BCG), 레바미솔, 인터루킨-2, 알파-인터페론, 등), 모노클로날 항체 (예를 들면, 항-CD20, 항-HER2, 항-CD52, 항-HLA-DR, 및 항-VEGF 모노클로날 항체), 면역독소 (예를 들면, 항-CD33 모노클로날 항체-칼리키아마이신 콘쥬게이트, 항-CD22 모노클로날 항체-슈도모나스 외독소 콘쥬게이트, 등), 및 방사선면역요법 (예를 들면, 111In, 90Y, 또는 131I에 콘쥬게이트된 항-CD20 모노클로날 항체, 등).
종래의 방사선치료 제제의 예는 방사선핵종 예컨대 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117 mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi를 비제한적으로 포함하고, 이들은 종양 항원에 대항하여 지향된 항체에 임의로 콘쥬게이트됨.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 종양학 약물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 알케란, 알로퓨리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, araC, 삼산화 비소, 벡사로텐, biCNU, 카르무스틴, CCNU, 셀레콕십, 클라드리빈, 사이클로스포린 A, 시토신 아라바이노사이드, 사이톡산, 덱스라족산, DTIC, 에스트라무스틴, 엑세메스탄, FK506, 젬투주맙-오조가마이신, 하이드레아, 하이드록시우레아, 아이다루비신, 인터페론, 레트로졸, 류스타틴, 류프롤라이드, 리트레티노인, 메가스트롤, L-PAM, 메스나, 메톡살렌, 미트라마이신, 질소 머스타드, 팔미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 리보프린 나트륨, 프레드니손, 리툭산, 스트렙토조신, STI-571, 탁소테르, 메모졸라마이드, VM-26, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 및 벨반. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 종양학 약물의 다른 예는 엘립티신 및 엘립티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론, 세포내 키나아제 억제제, 및 캄프토테신이다.
상승된 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 및/또는 글루코오스와 연관된 지질 질환 또는 장애를 치료하기 위한 지질-저하제의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 스타틴, 피브레이트, 에제티마이브, 티아졸리딘디온, 니아신, 베타-차단제, 니트로글리세린, 칼슘 길항제, 물고기 오일, 및 그의 혼합물.
항-바이러스 약물의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 아바카비르, 아시클로비르, 아사이클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 아르비돌, 아타자나비르, 아트리플라, 사이도포비르, 콤바이비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르타이드, 엔테카비르, 유입 억제제, 팜사이클로비르, 고정 투여량 조합, 포미비르센, 포삼프레나비르, 포스카르네트, 포스포네트, 융합 억제제, 강시클로비르, 이바시타빈, 이뮤노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 유형 III (예를 들면, IFN-λ 분자 예컨대 IFN-λ1, IFN-λ2, 및 IFN-λ3), 인터페론 유형 II (예를 들면, IFN-γ), 인터페론 유형 I (예를 들면, IFN-α 예컨대 페길화된 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω, 및 IFN-ζ), 인터페론, 라미부딘, 로피나비르, 로비라이드, MK-0518, 마라비록, 모록시딘, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 뉴클레오사이드 유사체, 오셀타미비르, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 역전사효소 억제제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 스타부딘, 상승작용 인핸서, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비르, 발강시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비르, 지도부딘, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 그의 입체이성질체, 그의 유도체, 그의 유사체, 및 그의 혼합물.
V. 지질 입자
어떤 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재된 양이온성 (아미노) 지질 또는 그의 염 중 하나 이상을 포함하는 지질 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 추가로, 하나 이상의 비-양이온성 지질을 포함한다. 다른 구현예에서, 지질 입자는 추가로, 입자 응집을 감소 또는 억제할 수 있는 하나 이상의 콘쥬게이트된 지질을 포함한다. 추가 구현예에서, 지질 입자는 추가로, 하나 이상의 활성제 또는 치료제 예컨대 치료적 핵산 (예를 들면, 간섭 RNA 예컨대 siRNA)을 포함한다.
지질 입자는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 지질 소포 예컨대 리포좀. 본원에서 사용된 바와 같이, 지질 소포는 수성 내부를 덮고 있는 지질-함유 막을 갖는 구조를 포함한다. 특별한 구현예에서, 본원에서 기재된 양이온성 지질의 하나 이상을 포함하는 지질 소포는 지질 소포 내에 핵산을 캡슐화하도록 사용된다. 다른 구현예에서, 지질 소포 본원에서 기재된 양이온성 지질의 하나 이상을 포함하는 지질 소포는 핵산과 합쳐져서 리포플렉스를 형성한다.
본 발명의 지질 입자는 전형적으로 활성제 또는 치료제, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자들의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성제 또는 치료제는 지질 입자의 지질부 내에 완전히 캡슐화되고, 이로써 지질 입자 중 활성제 또는 치료제는, 예를 들면, 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 효소 분해에 대해 수용액에서 내성이 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 기재된 지질 입자는 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비-독성이다. 본 발명의 지질 입자는 전형적으로 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖는다. 본 발명의 지질 입자는 또한 전형적으로 약 1:1 내지 약 100:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 2:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 20:1, 약 5:1 내지 약 15:1, 또는 약 5:1 내지 약 10:1의 지질:치료제 (예를 들면, 지질:핵산) 비 (질량/질량비)를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 혈청-안정한 핵산-지질 입자 (LNP)이고 이것은 간섭 RNA (예를 들면, siRNA, 다이서-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA), 양이온성 지질 (예를 들면, 본원에서 제시된 식 I의 하나 이상의 양이온성 지질 또는 그의 염), 비-양이온성 지질 (예를 들면, 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물), 및 입자들의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질 (예를 들면, 하나 이상의 PEG-지질 및/또는 POZ-지질 콘쥬게이트)를 포함한다. LNP는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 이상의 비변형된 및/또는 변형된 간섭 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산-지질 입자 및 그의 제조 방법는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,753,613; 5,785,992; 5,705,385; 5,976,567; 5,981,501; 6,110,745; 및 6,320,017; 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964, 각각의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명의 핵산-지질 입자에서, 핵산은 입자의 지질부 내에서 완전히 캡슐화될 수 있고, 그렇게 함으로써 핵산을 뉴클레아제 분해로부터 보호한다. 바람직한 구현예에서, 핵산을 포함하는 LNP 예컨대 간섭 RNA는 입자의 지질부 내에서 완전히 캡슐화되고, 그렇게 함으로써 핵산을 뉴클레아제 분해로부터 보호한다. 어떤 예에서, LNP 중 핵산은 37 ℃에서 적어도 약 20, 30, 45, 또는 60 분 동안 입자의 뉴클레아제에의 노출 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 어떤 다른 예에서, LNP 중 핵산은 37 ℃에서 적어도 약 30, 45, 또는 60 분 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36 시간 동안 혈청 중 입자의 인큐베이션 후에 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 구현예에서, 핵산은 입자의 지질부와 합쳐진다. 본 발명의 제형의 이점 중의 하나는, 핵산-지질 입자 조성물이 포유동물, 예컨대 인간에 대해 실질적으로 비-독성이라는 것이다.
용어 "완전히 캡슐화된"은, 핵산-지질 입자 중 핵산이 유리 DNA 또는 RNA를 유의미하게 분해하는 혈청 또는 뉴클레아제 분석에 대한 노출 후 유의미하게 분해되지 않는다는 것을 나타낸다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, 바람직하게는 입자 중 핵산의 약 25% 미만은 유리 핵산의 100%를 정상적으로 분해하는 처리에서 분해되고, 더 바람직하게는 입자 중 핵산의 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만은 분해된다. "완전히 캡슐화된"은 또한, 핵산-지질 입자가 혈청-안정하고, 즉, 생체내 투여 시 그의 성분 부분으로 빠르게 분해하지 않는다는 것을 나타낸다.
핵산에 관한 문맥에서, 완전한 캡슐화는 막-불투과성 형광 염료 배제 분석를 수행하여 결정될 수 있고, 이 분석은 핵산과 관련될 때 증대된 형광을 갖는 염료를 이용한다. 특이적 염료 예컨대 OliGreen® 및 RiboGreen® (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA)는 플라스미드 DNA, 단일가닥 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 단일- 또는 이중-가닥 리보뉴클레오타이드의 정량적 결정을 위해 이용가능하다. 캡슐화는 염료를 리포좀 제형에 부가하고, 수득한 형광을 측정하고, 이 형광을 소량의 비이온성 계면활성제의 부가 시에 관찰된 형광과 비교하여 결정된다. 리포좀 이중층의 계면활성제-매개된 파손은 캡슐화된 핵산을 방출하고, 그 핵산이 막-불투과성 염료와 상호작용하도록 한다. 핵산 캡슐화는 E = ( I o - I)/ I o 로 계산될 수 있고, 여기서 I 및 I o 는 계면활성제의 부가 전 및 후의 형광 세기를 의미한다 (참고, Wheeler 등, Gene Ther ., 6:271-281 (1999)).
다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 핵산-지질 입자를 포함하는 핵산-지질 입자 (예를 들면, LNP) 조성물을 제공한다.
일부 예에서, LNP 조성물은 입자의 지질부 내에서 완전히 캡슐화되는 핵산을 포함하고, 이로써 입자의 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)는 본원에서 캡슐화된 핵산을 갖는다.
다른 예에서, LNP 조성물은 입자의 지질부 내에서 완전히 캡슐화된 핵산을 포함하고, 이로써 투입 핵산의 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)는 입자 내에서 캡슐화된다.
본 발명의 지질 입자의 의도한 용도에 따라, 성분의 비는 변할 수 있고 특정한 제형의 전달 효율은, 예를 들면, 엔도소말 방출 파라미터 (ERP) 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명은 본원에서 기재된 복수의 지질 입자 및 항산화제를 포함하는 지질 입자 (예를 들면, LNP) 조성물을 제공한다. 어떤 예에서, 지질 입자 조성물 중 항산화제는 지질 입자에 존재하는 양이온성 지질의 분해를 감소, 방지, 및/또는 억제한다. 상기 활성제가 치료제 핵산, 예컨대 간섭 RNA (예를 들면, siRNA)인 경우에, 지질 입자 조성물 중 항산화제는, 예를 들면, 핵산과 양이온성 지질 사이의 첨가생성물의 형성을, 감소, 방지, 및/또는 억제하여 핵산 부하의 분해를 감소, 방지, 및/또는 억제한다. 항산화제 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 친수성 항산화제 예컨대 킬레이트제 (예를 들면, 금속 킬레이터 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트레이트, 등), 친지질성 항산화제 (예를 들면, 비타민 E 이성질체, 폴리페놀, 등), 그의 염; 및 그의 혼합물. 필요하면, 항산화제는 전형적으로 입자에 존재하는 양이온성 지질 및/또는 활성제의 분해를 방지, 억제 및/또는 감소시키는데 충분한 양, 예를 들면, 적어도 약 20 mM EDTA 또는 그의 염, 또는 적어도 약 100 mM 시트레이트 또는 그의 염으로 존재한다. 항산화제 예컨대 EDTA 및/또는 시트레이트는 (예를 들면, 지질 입자 형성 전, 동안 및/또는 후의) 섹션 VI에서 기재된 지질 입자 형성 과정에서 임의의 단계에서 또는 다중 단계에서 포함될 수 있다.
지질 입자에 존재하는 양이온성 지질 및/또는 활성제 (예를 들면, 치료적 핵산)의 분해를 방지하는 방법, 이들 방법에 의해 안정된 지질 입자를 포함하는 조성물, 이들 지질 입자의 제조 방법, 및 이들 지질 입자를 전달 및/또는 투여하는 방법과 관련된 추가 구현예는 국제 특허 출원 번호 PCT/CA2010/001919, 제목 "SNALP Formulations Containing Antioxidants,"(2010년 12월 1일 출원)에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
A. 양이온성 지질
본원에서 제시된 식 I의 신규 양이온성 지질 또는 그의 염의 임의의 것은 본 발명의 지질 입자 (예를 들면, LNP)에서, 단독으로 또는 1 이상 다른 양이온성 지질 종 또는 비-양이온성 지질 종과 함께, 사용될 수 있다.
본 발명의 지질 입자 내에 또한 포함될 수 있는 다른 양이온성 지질 또는 그의 염은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (γ-DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-(N,N-디메틸)-부틸-4-아민 (C2-DLinDMA), 1,2-디리놀레오일옥시-(N,N-디메틸)-부틸-4-아민 (C2-DLinDAP), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA; 로도 공지됨 "XTC2" 또는 "C2K"), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C3-DMA; "C3K"), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C4-DMA; "C4K"), 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산 (DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸피페라지노-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-MPZ), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 2,2-디올레오일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DO-K-DMA), 2,2-디스테아로일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DS-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-모폴리노-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-MA), 2,2-디리놀레일-4-트리메틸아미노-[1,3]-디옥솔란 클로라이드 (DLin-K-TMA.Cl), 2,2-디리놀레일-4,5-비스(디메틸아미노메틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-메틸피페라진-[1,3]-디옥솔란 (D-Lin-K-N-메틸피페라진), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트 (DLin-M-C3-DMA; "MC3"), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트 (DLin-M-C2-DMA; 로도 공지됨 DLin-M-K-DMA 또는 DLin-M-DMA), 1,2-디올레일카바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DO-C-DAP), 1,2-미리스트올레오일-3-디메틸아미노프로판 (DMDAP), 1,2-디올레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 (DOTAP.Cl), 1,2-디리놀레일카바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레일옥시-3-모폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-oxy부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카바밀-3-디메틸아미노프로판 (DLincarbDAP), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DODMA), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DSDMA), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), 3 -(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸록시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 디옥타데실아미도글라이실 스페르민 (DOGS), 그의 유사체, 및 그의 혼합물.
본원에서 기재된 지질 입자에 존재할 수 있는 추가의 양이온성 지질 또는 그의 염은 하기를 포함한다: 신규 양이온성 지질 예컨대 CP-LenMC3, CP-γ-LenMC3, CP-MC3, CP-DLen-C2K-DMA, CP-γDLen-C2K-DMA, CP-C2K-DMA, CP-DODMA, CP-DPetroDMA, CP-DLinDMA, CP-DLenDMA, CP-γDLenDMA, 그의 유사체, 및 이들의 조합. 본원에서 기재된 지질 입자에 존재할 수 있는추가의 양이온성 지질 또는 그의 염은 하기를 포함한다: MC3 유사체 예컨대 LenMC3, γ-LenMC3, MC3MC, MC2C, MC2MC, MC3 티오에스테르, MC3 에테르, MC4 에테르, MC3 알킨, MC3 아마이드, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan-MC5, 및 이들의 조합. 본원에서 기재된 지질 입자에 존재할 수 있는 추가의 양이온성 지질 또는 그의 염은 하기에서 기재된 신규 양이온성 지질을 포함한다: 국제 특허 출원 번호 PCT/CA2010/001029, 제목 "Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids,"(2010년 6월 30일 출원). 본원에서 기재된 지질 입자에 존재할 수 있는 추가의 양이온성 지질 또는 그의 염은 하기에서 기재된 양이온성 지질을 포함한다: 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0023673. 각각의 이들 특허 문서의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 구현예에서, 추가의 양이온성 지질은 하나 이상의 음이온과 함께 염 (바람직하게는 결정성 염)을 형성한다. 하나의 특별한 구현예에서, 추가의 양이온성 지질은 옥살레이트 (예를 들면, 헤미 옥살레이트) 그의 염이고, 이 염은 바람직하게는 결정성 염이다.
양이온성 지질 예컨대 DLinDMA 및 DLenDMA, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0083780에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
양이온성 지질 예컨대 γ-DLenDMA, C2-DLinDMA 및 C2-DLinDAP, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 하기에서 기재되어 있다: 국제 특허 출원 번호 PCT/CA2010/001029, 제목Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids,"(2010년 6월 30일 출원), 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
양이온성 지질 예컨대 DLin-K-DMA, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 PCT 공개 번호 WO 09/086558에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
양이온성 지질 예컨대 DLin-K-C2-DMA, DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA, DLin-K-MPZ, DO-K-DMA, DS-K-DMA, DLin-K-MA, DLin-K-TMA.Cl, DLin-K2-DMA, D-Lin-K-N-메틸피페라진, DLin-M-C2-DMA, DO-C-DAP, DMDAP, 및 DOTAP.Cl, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: PCT 공개 번호 WO 2010/042877, 제목Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids," (2009년 10월 9일 출원), 그의 개시내용은 편입된 본원에 참조로 그 전체가 다목적으로.
DLin-M-C3-DMA, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: 미국 가출원 번호 61/384,050(2010년 9월 17일 출원), 제목 "Novel Cationic Lipids and Methods of Use Thereof," 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
양이온성 지질 예컨대 DLin-C-DAP, DLinDAC, DLinMA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLinTMA.Cl, DLinTAP.Cl, DLinMPZ, DLinAP, DOAP, 및 DLin-EG-DMA, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 하기에서 기재되어 있다: PCT 공개 번호 WO 09/086558, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
양이온성 지질 예컨대 CLinDMA, 뿐만 아니라 추가의 양이온성 지질의 합성은 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0240554, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
수많은 다른 양이온성 지질 및 관련된 유사체의 합성은 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283,185; 5,753,613; 및 5,785,992; 및 PCT 공개 번호 WO 96/10390, 각각의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. 추가로, 양이온성 지질의 수많은 상업적 제제가 사용될 수 있고, 그 예는 LIPOFECTIN® (GIBCO/BRL 로부터 이용가능한 DOTMA 및 DOPE 포함); LIPOFECTAMINE® (GIBCO/BRL로부터 이용가능한 DOSPA 및 DOPE 포함); 및 TRANSFECTAM® (Promega Corp.로부터 이용가능한 DOGS 포함)이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol % 내지 약 90 mol %, 약 50 mol % 내지 약 85 mol %, 약 50 mol % 내지 약 80 mol %, 약 50 mol % 내지 약 75 mol %, 약 50 mol % 내지 약 70 mol %, 약 50 mol % 내지 약 65 mol %, 약 50 mol % 내지 약 60 mol %, 약 55 mol % 내지 약 65 mol %, 또는 약 55 mol % 내지 약 70 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함한다. 특별한 구현예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol %, 51 mol %, 52 mol %, 53 mol %, 54 mol %, 55 mol %, 56 mol %, 57 mol %, 58 mol %, 59 mol %, 60 mol %, 61 mol %, 62 mol %, 63 mol %, 64 mol %, 또는 65 mol % (또는 그의 임의의 분획)을 포함한다.
다른 구현예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 2 mol % 내지 약 60 mol %, 약 5 mol % 내지 약 50 mol %, 약 10 mol % 내지 약 50 mol %, 약 20 mol % 내지 약 50 mol %, 약 20 mol % 내지 약 40 mol %, 약 30 mol % 내지 약 40 mol %, 또는 약 40 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함한다.
본 발명의 지질 입자에서 사용하기에 적당한 양이온성 지질 추가의 백분율 및 범위은, 예를 들면, PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명의 지질 입자에 존재하는 양이온성 지질의 백분율은 표적 양이고 제형에 존재하는 양이온성 지질의 실제 양은 예를 들면 ± 5 mol %까지 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 1:57 지질 입자 (예를 들면, LNP) 제형에서, 양이온성 지질의 표적 양은 57.1 mol %이지만, 양이온성 지질의 실제 양은 그 표적 양의 ± 5 mol %, ± 4 mol %, ± 3 mol %, ± 2 mol %, ± 1 mol %, ± 0.75 mol %, ± 0.5 mol %, ± 0.25 mol %, 또는 ± 0.1 mol %일 수 있고, 제형의 밸런스는 다른 지질 성분으로 보충된다 (입자에 존재하는 총 지질의 최대 100 mol %를 부가함).
B. 비- 양이온성 지질
본 발명의 지질 입자에서 사용된 비-양이온성 지질 (예를 들면, LNP)은 임의의 다양한 중성 미전하의, 쯔비터이온, 또는 음이온성 지질일 수 있고, 이것은 안정한 복합체를 생산할 수 있다.
비-양이온성 지질의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 인지질, 예컨대 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린 (ESM), 세팔린, 카디올리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜글리세롤 (POPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민 (DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 라이소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 그의 혼합물. 다른 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질이 또한 사용될 수 있다. 이들 지질 중 아실 그룹은 바람직하게는 C10-C24 개의 탄소 사슬를 갖는 지방산으로부터 유도된 아실 그룹, 예를 들면, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 또는 올레오일이다.
비-양이온성 지질의 추가의 예는 스테롤 예컨대 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함한다. 콜레스테롤 유도체의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 극성 유사체 예컨대 5α-콜레스타놀, 5β-코프로스타놀, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르, 및 6-케토콜레스타놀; 비-극성 유사체 예컨대 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논, 및 콜레스테릴 데카노에이트; 및 그의 혼합물. 바람직한 구현예에서, 콜레스테롤 유도체 is 극성 유사체 예컨대 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르. 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르의 합성은 PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
일부 구현예에서, 지질 입자에 존재하는 비-양이온성 지질 (예를 들면, LNP)는 하나 이상의 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물을 포함하거나 그것으로 이루어진다. 다른 구현예에서, 지질 입자에 존재하는 비-양이온성 지질 (예를 들면, LNP)은 하나 이상의 인지질, 예를 들면, 무콜레스테롤 지질 입자 제형을 포함하거나 그것으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 지질 입자에 존재하는 비-양이온성 지질 (예를 들면, LNP)은 콜레스테롤 또는 그의 유도체, 예를 들면, 인지질이 없는 지질 입자 제형을 포함하거나 그것으로 이루어진다.
본 발명에서 사용하기에 적당한 비-양이온성 지질의 다른 예는 하기를 포함한다: 인을 함유하지 않는 지질 예를 들면, 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤라이시놀레이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴 폴리머, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화된 지방산 아마이드, 디옥타데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린, 등.
일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol % 내지 약 60 mol %, 약 20 mol % 내지 약 55 mol %, 약 20 mol % 내지 약 45 mol %, 약 20 mol % 내지 약 40 mol %, 약 25 mol % 내지 약 50 mol %, 약 25 mol % 내지 약 45 mol %, 약 30 mol % 내지 약 50 mol %, 약 30 mol % 내지 약 45 mol %, 약 30 mol % 내지 약 40 mol %, 약 35 mol % 내지 약 45 mol %, 약 37 mol % 내지 약 42 mol %, 또는 약 35 mol %, 36 mol %, 37 mol %, 38 mol %, 39 mol %, 40 mol %, 41 mol %, 42 mol %, 43 mol %, 44 mol %, 또는 45 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)을 포함한다.
지질 입자가 인지질과 콜레스테롤의 혼합물 또는 콜레스테롤 유도체를 함유하는 구현예에서, 혼합물은 입자에 존재하는 총 지질의 최대 약 40 mol %, 45 mol %, 50 mol %, 55 mol %, 또는 60 mol %를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 혼합물 중 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 2 mol % 내지 약 20 mol %, 약 2 mol % 내지 약 15 mol %, 약 2 mol % 내지 약 12 mol %, 약 4 mol % 내지 약 15 mol %, 또는 약 4 mol % 내지 약 10 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함할 수 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, 혼합물 중 인지질 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 10 mol %, 약 5 mol % 내지 약 9 mol %, 약 5 mol % 내지 약 8 mol %, 약 6 mol % 내지 약 9 mol %, 약 6 mol % 내지 약 8 mol %, 또는 약 5 mol %, 6 mol %, 7 mol %, 8 mol %, 9 mol %, 또는 10 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)을 포함한다. 비제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 1:57 지질 입자 제형은, 예를 들면, 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체와 혼합하여 인지질 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 약 7 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 포함할 수 있다. 또 하나의 비-제한적인 예로서, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 7:54 지질 입자 제형은, 예를 들면, 입자에 존재하는 총 지질의 약 32 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체와 혼합하여 인지질 예컨대 DPPC 또는 DSPC를 약 7 mol % (또는 그의 임의의 분획)로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 혼합물 중 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol % 내지 약 45 mol %, 약 25 mol % 내지 약 40 mol %, 약 30 mol % 내지 약 45 mol %, 약 30 mol % 내지 약 40 mol %, 약 27 mol % 내지 약 37 mol %, 약 25 mol % 내지 약 30 mol %, 또는 약 35 mol % 내지 약 40 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함할 수 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, 혼합물 중 콜레스테롤 성분은 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol % 내지 약 35 mol %, 약 27 mol % 내지 약 35 mol %, 약 29 mol % 내지 약 35 mol %, 약 30 mol % 내지 약 35 mol %, 약 30 mol % 내지 약 34 mol %, 약 31 mol % 내지 약 33 mol %, 또는 약 30 mol %, 31 mol %, 32 mol %, 33 mol %, 34 mol %, 또는 35 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함한다. 전형적으로, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 1:57 지질 입자 제형은, 예를 들면, 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 인지질 예컨대 DPPC 또는 DSPC와 혼합하여 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 약 34 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 포함할 수 있다. 전형적으로, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물을 포함하는 7:54 지질 입자 제형은, 예를 들면, 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 인지질 예컨대 DPPC 또는 DSPC와 혼합하여 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 약 32 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 포함할 수 있다.
지질 입자는 인지질이 없는 구현예에서, 콜레스테롤 또는 그의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 최대 약 25 mol %, 30 mol %, 35 mol %, 40 mol %, 45 mol %, 50 mol %, 55 mol %, 또는 60 mol %를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인지질이 없는 지질 입자 제형 중 콜레스테롤 또는 그의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol % 내지 약 45 mol %, 약 25 mol % 내지 약 40 mol %, 약 30 mol % 내지 약 45 mol %, 약 30 mol % 내지 약 40 mol %, 약 31 mol % 내지 약 39 mol %, 약 32 mol % 내지 약 38 mol %, 약 33 mol % 내지 약 37 mol %, 약 35 mol % 내지 약 45 mol %, 약 30 mol % 내지 약 35 mol %, 약 35 mol % 내지 약 40 mol %, 또는 약 30 mol %, 31 mol %, 32 mol %, 33 mol %, 34 mol %, 35 mol %, 36 mol %, 37 mol %, 38 mol %, 39 mol %, 또는 40 mol % (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 1:62 지질 입자 제형은 콜레스테롤을 입자에 존재하는 총 지질의 약 37 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 포함할 수 있다. 또 하나의 비-제한적인 예로서, 7:58 지질 입자 제형은 콜레스테롤를 입자에 존재하는 총 지질의 약 35 mol % (또는 그의 임의의 분획)에서 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 비-양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol % 내지 약 90 mol %, 약 10 mol % 내지 약 85 mol %, 약 20 mol % 내지 약 80 mol %, 약 10 mol % (예를 들면, 인지질 단독), 또는 약 60 mol % (예를 들면, 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체) (또는 본원의 그의 임의의 분획 또는 범위)를 포함한다.
본 발명의 지질 입자에서 사용하기에 적당한 비-양이온성 지질의 추가의 백분율 및 범위는 예를 들면, PCT 공개 번호 WO 09/127060에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명의 지질 입자에 존재하는 비-양이온성 지질의 백분율은 표적 양이고 제형에 존재하는 비-양이온성 지질의 실제 양은, 예를 들면, ± 5 mol %까지 변할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 1:57 지질 입자 (예를 들면, LNP) 제형에서, 인지질의 표적 양은 7.1 mol %이고 콜레스테롤의 표적 양은 34.3 mol %이지만, 인지질의 실제 양은 그 표적 양의 ± 2 mol %, ± 1.5 mol %, ± 1 mol %, ± 0.75 mol %, ± 0.5 mol %, ± 0.25 mol %, 또는 ± 0.1 mol %일 수 있고, 콜레스테롤의 실제 양은 그 표적 양의 ± 3 mol %, ± 2 mol %, ± 1 mol %, ± 0.75 mol %, ± 0.5 mol %, ± 0.25 mol %, 또는 ± 0.1 mol %일 수 있고, 제형의 밸런스는 다른 지질 성분으로 보충된다 (입자에 존재하는 총 지질의 최대 100 mol %를 부가함). 유사하게, 7:54 지질 입자 (예를 들면, LNP) 제형에서, 인지질의 표적 양은 6.75 mol %이고 콜레스테롤의 표적 양은 32.43 mol %이지만, 인지질의 실제 양은 그 표적 양의 ± 2 mol %, ± 1.5 mol %, ± 1 mol %, ± 0.75 mol %, ± 0.5 mol %, ± 0.25 mol %, 또는 ± 0.1 mol %일 수 있고, 콜레스테롤의 실제 양은 그 표적 양의 ± 3 mol %, ± 2 mol %, ± 1 mol %, ± 0.75 mol %, ± 0.5 mol %, ± 0.25 mol %, 또는 ± 0.1 mol %일 수 있고, 제형의 밸런스는 다른 지질 성분으로 보충된다 (입자에 존재하는 총 지질의 최대 100 mol %를 부가함).
C. 지질 콘쥬게이트
양이온성 및 비-양이온성 지질에 추가하여, 본 발명의 지질 입자 (예를 들면, LNP)는 지질 콘쥬게이트를 추가로 포함할 수 있다. 콘쥬게이트된 지질은, 입자들의 응집을 방지할 수 있다는 점에서 유용하다. 적당한 콘쥬게이트된 지질은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: PEG-지질 콘쥬게이트, POZ-지질 콘쥬게이트, ATTA-지질 콘쥬게이트, 양이온성-폴리머-지질 콘쥬게이트 (CPLs), 및 그의 혼합물. 어떤 구현예에서, 입자는 PEG-지질 콘쥬게이트 또는 ATTA-지질 콘쥬게이트를 CPL와 함께 포함한다.
바람직한 구현예에서, 지질 콘쥬게이트는 PEG-지질이다. PEG-지질의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 디알킬옥시프로필 (PEG-DAA)에 커플링된 PEG (예를 들면, PCT 공개 번호 WO 05/026372에 기재됨), 디아실글리세롤 (PEG-DAG) 커플링된 PEG (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0077829 및 2005/008689에 기재됨), 인지질 예컨대 포스파티딜에탄올아민 커플링된 PEG (PEG-PE), 세라미드에 콘쥬게이트된 PEG (예를 들면, 미국 특허 번호 5,885,613에 기재됨), 콜레스테롤 또는 그의 유도체, 및 그의 혼합물 콘쥬게이트된 PEG. 이들 특허 문서의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
본 발명에서 사용하기에 적당한 추가의 PEG-지질은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카보모일글리세라이드 (PEG-C-DOMG). PEG-C-DOMG의 합성은 PCT 공개 번호 WO 09/086558에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. 또 추가의 적당한 PEG-지질 콘쥬게이트는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 1-[8'-(1,2-디미리스토일-3-프로판옥시)-카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-ω-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) (2KPEG-DMG). 2KPEG-DMG의 합성은 미국 특허 번호 7,404,969에서 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다.
PEG는 2 개의 말단 하이드록실 그룹을 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형, 수용성 폴리머이다. PEG는 그의 분자량에 의해 분류되고; 예를 들면, PEG 2000은 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, PEG 5000은 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 Sigma Chemical Co. 및 다른 회사로부터 상업적으로 이용가능하고 비제한적으로, 하기를 포함한다: 하기의: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석시네이트 (MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 석시네이트 (MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민 (MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트 (MePEG-TRES), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카보닐 (MePEG-IM), 뿐만 아니라 말단 메톡시 그룹 대신에 말단 하이드록실 그룹을 함유하는 그와 같은 화합물 (예를 들면, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2, 등). 다른 PEG 예컨대 하기에서 기재된 것들: 미국 특허 번호 6,774,180 및 7,053,150 (예를 들면, mPEG (20 KDa) 아민)은 또한 본 발명의 PEG-지질 콘쥬게이트를 제조하는데 유용하다. 이들 특허의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. 또한, 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-아세트산 (MePEG-CH2COOH)는 예를 들면, PEG-DAA 콘쥬게이트를 포함하는 PEG-지질 콘쥬게이트를 제조하는데 특히 유용하다.
본원에서 기재된 PEG-지질 콘쥬게이트의 PEG 모이어티는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤 범위의 평균 분자량을 포함할 수 있다. 어떤 예에서, PEG 모이어티는 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤 (예를 들면, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤, 등)의 평균 분자량을 갖는다. 바람직한 구현예에서, PEG 모이어티는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 갖는다.
어떤 예에서, PEG는 알킬, 알콕시, 아실, 또는 아릴 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다. PEG는 지질에 직접적으로 콘쥬게이트될 수 있거나 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합하는데 적당한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있고, 그 예는 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티이다. 바람직한 구현예에서, 링커 모이어티는 비-에스테르 함유 링커 모이어티이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-에스테르 함유 링커 모이어티"는 카복실 에스테르 결합 (-OC(O)-)를 함유하지 않는 링커 모이어티를 의미한다. 적당한 비-에스테르 함유 링커 모이어티는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 아미도 (-C(O)NH-), 아미노 (-NR-), 카보닐 (-C(O)-), 카바메이트 (-NHC(O)O-), 우레아 (-NHC(O)NH-), 디설파이드 (-S-S-), 에테르 (-O-), 석시닐 (-(O)CCH2CH2C(O)-), 석시나미딜 (-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 디설파이드, 뿐만 아니라 이들의 조합 (예컨대 카바메이트 링커 모이어티 및 아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커). 바람직한 구현예에서, 카바메이트 링커는 PEG를 지질에 결합하도록 사용된다.
다른 구현예에서, 에스테르 함유 링커 모이어티는 PEG를 지질에 결합하도록 사용된다. 적당한 에스테르 함유 링커 모이어티는, 예를 들면, 하기를 포함한다: 카보네이트 (-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르 (-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르, 및 이들의 조합.
가변 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 그룹을 갖는 포스파티딜에탄올아민은 PEG에 콘쥬게이트되어 지질 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 그와 같은 포스파티딜에탄올아민은 상업적으로 이용가능하거나, 당해분야의 숙련가에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 단리 또는 합성될 수 있다. C10 내지 C20 범위의 탄소 사슬 길이를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산을 함유하는 포스파티딜-에탄올아민이 바람직하다. 모노- 또는 디불포화된 지방산 및 포화된 및 불포화된 지방산의 혼합물을 갖는 포스파티딜에탄올아민이 또한 사용될 수 있다. 적당한 포스파티딜에탄올아민은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 및 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE).
용어 "ATTA" 또는 "폴리아미드"은 미국 특허 번호 6,320,017 및 6,586,559에서 기재된 화합물을 비제한적으로 포함하고, 그의 개시내용은 그 전체가 다목적으로 본원에 참조로 편입되어 있다. 이들 화합물은 하기 식을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00032
(II),
여기서 R은 수소, 알킬 및 아실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; R1은 수소 및 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이거나; 임의로, R 및 R1 및 이들이 결합된 질소는 아지도 모이어티를 형성하고; R2는 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴 및 아미노산의 측쇄로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고; R3은 수소, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 머캅토, 히드라지노, 아미노 및 NR4R5,로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 여기서 R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 알킬이고; n은 4 내지 80이고; m은 2 내지 6이고; p는 1 내지 4이고; q는 0 또는 1이다. 다른 폴리아미드가 본 발명의 화합물에 사용될 수 있다는 것은 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
용어 "디아실글리세롤" 또는 "DAG"는 2 개의 지방산 아실 사슬을 갖는 화합물을 포함하고, R1 및 R2, 이 둘 모두는 독립적으로 에스테르 연결에 의해 글리세롤의 1- 및 2-위치에 결합된 2 내지 30 개의 탄소를 갖는다. 아실 그룹은 포화될 수 있거나 가변 불포화도를 갖는다. 적당한 아실 그룹은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 라우로일 (C12), 미리스토일 (C14), 팔미토일 (C16), 스테아로일 (C18), 및 아이코소일 (C20). 바람직한 구현예에서, R1 및 R2는 동일하고, 즉, R1 및 R2 둘 모두는 미리스토일 (즉, 디미리스토일)이고, R1 및 R2 둘 모두는 스테아로일 (즉, 디스테아로일), 등이다. 디아실글리세롤은 하기의 일반식을 갖는다:
Figure pct00033
(III).
용어 "디알킬옥시프로필" 또는 "DAA"는 2 개의 알킬 사슬을 갖는 화합물을 포함하고, R1 및 R2, 이 둘 모두는 독립적으로 2 내지 30 개의 탄소를 갖는다. 알킬 그룹은 포화될 수 있거나 가변 불포화도를 갖는다. 디알킬옥시프로필은 하기의 일반식을 갖는다:
Figure pct00034
(IV).
바람직한 구현예에서, PEG-지질은 하기의 식을 갖는 PEG-DAA 콘쥬게이트이다:
Figure pct00035
(V),
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 선택되고 약 10 내지 약 22 개의 탄소 원자를 갖는 장쇄 알킬 그룹이고; PEG는 폴리에틸렌글리콜이고; L은 상기에서 기재된 바와 같이 비-에스테르 함유 링커 모이어티 또는 에스테르 함유 링커 모이어티이다. 장쇄 알킬 그룹은 포화 또는 불포화될 수 있다. 적당한 알킬 그룹은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 데실 (C10), 라우릴 (C12), 미리스틸 (C14), 팔미틸 (C16), 스테아릴 (C18), 및 아이코실 (C20). 바람직한 구현예에서, R1 및 R2는 동일하고, 즉, R1 및 R2 둘 모두는 미리스틸 (즉, 디미리스틸)이고, R1 및 R2 둘 모두는 스테아릴 (즉, 디스테아릴), 등이다.
상기 화학식 V에서, PEG는 약 550 달톤 내지 약 10,000 달톤에 이르는 평균 분자량을 갖는다. 특정예의 경우, PEG의 평균 분자량은 약 750 달톤 내지 약 5,000 달톤(예를 들어, 약 1,000 달톤 내지 약 5,000 달톤, 약 1,500 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤, 약 750 달톤 내지 약 2,000 달톤 등)이다. 바람직한 구현예에서, PEG의 평균 분자량은 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤이다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴기로 임의로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 말단 히드록실기는 메톡시 또는 메틸기로 치환된다.
바람직한 구현예에서, "L"은 에스테르 비함유 링커 잔기이다. 적합한 비-에스테르 함유 링커는 아미도 링커 잔기, 아미노 링커 잔기, 카보닐 링커 잔기, 카바메이트 링커 잔기, 우레아 링커 잔기, 에테르 링커 잔기, 디술파이드 링커 잔기, 숙신아미딜 링커 잔기, 및 이들의 조합물을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 비-에스테르 함유 링커 잔기는 카바메이트 링커 잔기(즉, PEG-C-DAA 컨쥬게이트)이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 비-에스테르 함유 링커 잔기는 아미도 링커 잔기(즉, PEG-A-DAA 컨쥬게이트)이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 비-에스테르 함유 링커 잔기는 숙신아미딜 링커 잔기(즉, PEG-S-DAA 컨쥬게이트)이다.
특정 구현예에서, PEG-지질 컨쥬게이트는 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00036
(PEG-C-DMA); 및
Figure pct00037
(PEG-C-DOMG).
PEG-DAA 컨쥬게이트는 당업자에게 알려진 표준 기술 및 시약을 사용하여 합성된다. PEG-DAA 컨쥬게이트가 다양한 아미드, 아민, 에테르, 티오, 카바메이트 및 우레아 연결기를 함유할 것임을 알 것이다. 당업자는 상기 결합을 형성하기 위한 방법 및 시약이 공지되어 있고 쉽게 이용가능함을 알 것이다. 예를 들어, 문헌[March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992)]; [Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989)]; 및 [Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989)]을 참조한다. 또한, 존재하는 임의의 작용기는 PEG-DAA 컨쥬게이트 합성의 상이한 지점에서 보호 및 탈보호를 필요로 할 수 있음이 이해될 것이다. 당업자는 상기 기술이 공지되어 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌[Green and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)]을 참조한다.
바람직하게는, PEG-DAA 컨쥬게이트는 PEG-디데실옥시프로필(C10) 컨쥬게이트, PEG-디라우릴옥시프로필(C12) 컨쥬게이트, PEG-디미리스틸옥시프로필(C14) 컨쥬게이트, PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 컨쥬게이트 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 컨쥬게이트이다. 이들 구현예에서, PEG의 평균 분자량은 바람직하게는 약 750 또는 약 2,000 달톤이다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, PEG-지질 컨쥬게이트는 PEG2000-C-DMA를 포함하고, 여기서 "2000"은 PEG의 평균 분자량을 나타내고, "C"는 카바메이트 링커 잔기를 나타내고, "DMA"는 디미리스틸옥시프로필을 나타낸다. 또 다른 특히 바람직한 구현예에서, PEG-지질 컨쥬게이트는 PEG750-C-DMA를 포함하고, 여기서 "750"은 PEG의 평균 분자량을 나타내고, "C"는 카바메이트 링커 잔기를 나타내고, "DMA"는 디미리스틸옥시프로필을 나타낸다. 특정 구현예에서, PEG의 말단 히드록실기는 메틸기로 치환된다. 당업자는 다른 디알킬옥시프로필이 본 발명의 PEG-DAA 컨쥬게이트에서 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
상기한 것에 추가로, 다른 친수성 중합체가 PEG 대신 사용될 수 있음은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. PEG 대신 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 히드록시메틸셀룰로스 또는 히드록시에틸셀룰로스를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
상기한 성분에 추가로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 양이온성 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 지질 또는 CPL을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 문헌[Chen 등., Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)]; 미국 특허 6,852,334; PCT 공개 WO 00/62813 참조).
적합한 CPL은 하기 화학식 VI의 화합물을 포함한다.
A-W-Y (VI)
상기 식에서, A, W 및 Y는 하기에 기재되는 바와 같다.
화학식 VI에서, "A"는 지질 앵커(anchor)로서 작용하는 지질 잔기, 예컨대 양친매성 지질, 중성 지질 또는 소수성 지질이다. 적합한 지질의 예는 디아실글리세롤릴, 디알킬글리세롤릴, N-N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
"W"는 중합체 또는 올리고머, 예컨대 친수성 중합체 또는 올리고머이다. 바람직하게는, 친수성 중합체는 비면역원성이거나 또는 낮은 고유 면역원성을 갖는 생체적합성 중합체이다. 다르게는, 친수성 중합체는 적절한 보조제와 함께 사용되면 약한 항원성일 수 있다. 적합한 비면역원성 중합체는 PEG, 폴리아미드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산/폴리글리콜산 공중합체 및 이들의 조합물을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 중합체의 분자량은 약 250 내지 약 7,000 달톤이다.
"Y"는 다가양이온성 잔기이다. 용어 "다가양이온성 잔기"는 선택된 pH, 바람직하게는 생리학적 pH에서 양전하, 바람직하게는 적어도 2개의 양전하를 갖는 화합물, 유도체 또는 작용기를 의미한다. 적합한 다가양이온성 잔기는 염기성 아미노산 및 이들의 유도체, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 라이신 및 히스티딘; 스페르민; 스페르미딘; 양이온성 덴드리머; 폴리아민; 폴리아민 당; 및 아미노 다당류를 포함한다. 다가양이온성 잔기는 구조가 선형, 예컨대 선형 테트라라이신, 분지형 또는 덴드리머일 수 있다. 다가양이온성 잔기는 선택된 pH 값에서 약 2 내지 약 15개의 양전하, 바람직하게는 약 2 내지 약 12개의 양전하, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8개의 양전하를 갖는다. 사용되는 다가양이온성 잔기의 선택은 요구되는 입자 적용의 종류에 의해 결정할 수 있다.
다가양이온성 잔기 상의 전하는 전체 입자 잔기 주위에 분포할 수 있거나, 또는 다르게는 입자 잔기의 하나의 특정 영역에 전하 밀도의 별개의 농축부, 예를 들어 전하 스파이크(charge spike)일 수 있다. 전하 밀도가 입자 상에 분포되면, 전하 밀도는 동등하게 분포되거나 불균등하게 분포될 수 있다. 다가양이온성 잔기의 전하 분포의 모든 변동은 본 발명에 의해 포함된다.
지질 "A" 및 비면역원성 중합체 "W"는 다양한 방법에 의해, 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법이 "A" 및 "W"의 공유 결합을 위해 사용될 수 있다. 적합한 연결기는 아미드, 아민, 카르복실, 카르보네이트, 카바메이트, 에스테르 및 히드라존 연결기를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. "A" 및 " W"가 연결기를 제시하기 위해 상보성 작용기를 가져야 함은 당업자에게 자명할 것이다. 2개의 기, 즉 지질 상의 하나 및 중합체 상의 하나 사이의 반응은 목적하는 연결기를 제공할 것이다. 예를 들어, 지질이 디아실글리세롤이고, 말단 히드록실이 예를 들어 NHS 및 DCC로 활성화되어 활성 에스테르를 형성한 후, 아미노기를 함유하는 중합체와, 예컨대 폴리아미드와 반응하면(예를 들어, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 6,320,017 및 6,586,559 참조), 아미드 결합이 2개의 기 사이에 형성될 것이다.
특정의 경우에, 다가양이온성 잔기는 부착된 리간드, 예컨대 표적화 리간드 또는 칼슘 복합체화를 위한 킬레이팅 잔기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 리간드가 부착된 후에, 양이온성 잔기는 양전하를 유지한다. 특정한 경우에, 부착되는 리간드는 양전하를 갖는다. 적합한 리간드는 반응성 기능기를 갖는 화합물 또는 장치를 포함하나, 이로 제한되지 않고, 지질, 양친매성 지질, 담체 화합물, 생체친화도 화합물, 생체 재료, 생체 중합체, 생물의학적 장치, 분석적으로 검출가능한 화합물, 치료 활성 화합물, 효소, 펩티드, 단백질, 항체, 면역 자극제, 방사성 표지, 형광원, 비오틴, 약물, 합텐, DNA, RNA, 다당류, 리포솜, 비로좀, 미셀, 이뮤노글로불린, 작용기, 다른 표적화 잔기 또는 독소를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 지질 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%, 약 1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.6 몰% 내지 약 1.9 몰%, 약 0.7 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 0.8 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 0.9 몰% 내지 약 1.6 몰%, 약 0.9 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.3 몰% 내지 약 1.6 몰% 또는 약 1.4 몰% 내지 약 1.5 몰%(또는 이들의 임의의 비 또는 그 내의 범위)를 구성한다.
다른 구현예에서, 지질 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0 몰% 내지 약 20 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 20 몰%, 약 2 몰% 내지 약 20 몰%, 약 1.5 몰% 내지 약 18 몰%, 약 2 몰% 내지 약 15 몰%, 약 4 몰% 내지 약 15 몰%, 약 2 몰% 내지 약 12 몰%, 약 5 몰% 내지 약 12 몰% 또는 약 2 몰%(또는 이들의 임의의 비 또는 그 내의 범위)를 구성한다.
추가의 구현예에서, 지질 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-지질)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 4 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 9 몰%, 약 5 몰% 내지 약 8 몰%, 약 6 몰% 내지 약 9 몰%, 약 6 몰% 내지 약 8 몰% 또는 약 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰% 또는 10 몰%(또는 이들의 임의의 비 또는 그 내의 범위)를 구성한다.
본 발명의 지질 입자에 사용하기 적합한 지질 컨쥬게이트의 추가의 비 및/또는 범위는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 예를 들어 PCT 공개 WO 09/127060 및 PCT 공개 WO2010/006282에 기재되어 있다.
본 발명의 지질 입자에 존재하는 지질 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-지질)의 비는 목표량이고, 제제 내에 존재하는 지질 컨쥬게이트의 실제량은 예를 들어 ±2 몰% 정도로 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 1:57 지질 입자(예를 들어, LNP) 제제에서, 지질 컨쥬게이트의 목표량은 1.4 몰%이지만, 지질 컨쥬게이트의 실제량은 목표량의 ±0.5 몰%, ±0.4 몰%, ±0.3 몰%, ±0.2 몰%, ±0.1 몰% 또는 ±0.05 몰%일 수 있음을 이해하여야 하고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분(입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가됨)으로 이루어진다. 이와 유사하게, 7:54 지질 입자(예를 들어, LNP) 제제에서, 지질 컨쥬게이트의 목표량 6.76 몰%이지만, 지질 컨쥬게이트의 실제량은 목표량의 ±2 몰%, ±1.5 몰%, ±1 몰%, ±0.75 몰%, ±0.5 몰%, ±0.25 몰% 또는 ±0.1 몰%일 수 있고, 여기서 제제의 나머지는 다른 지질 성분(입자 내에 존재하는 총 지질의 100 몰%까지 첨가됨)으로 이루어진다.
당업자는 지질 컨쥬게이트의 농도가, 사용된 지질 컨쥬게이트 및 지질 입자가 융해성이 되는 속도에 따라 상이할 수 있음을 이해할 것이다.
지질 컨쥬게이트의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 컨쥬게이트가 지질 입자로부터 교환되는 속도 및 다시 지질 입자가 융해성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 예를 들어, PEG-DAA 컨쥬게이트가 지질 컨쥬게이트로서 사용되는 경우, 지질 입자가 융해성이 되는 속도는 예를 들어 지질 컨쥬게이트의 농도 변화, PEG의 분자량 변화 또는 PEG-DAA 컨쥬게이트 상의 알킬기의 쇄 길이 및 불포화도의 변화에 의해 상이할 수 있다. 또한, 예를 들어, pH, 온도, 이온 강도 등을 포함하는 다른 변수가, 지질 입자가 융해성이 되는 속도를 변경 및/또는 제어하기 위해 사용될 수 있다. 지질 입자가 융해성이 되는 속도를 제어하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 본원 명세서의 내용을 통해 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 지질 컨쥬게이트의 조성 및 농도를 제어함으로써 지질 입자(예를 들어, LNP) 크기를 제어할 수 있다.
VI . 지질 입자의 제조
본 발명의 지질 입자(예컨대, 활성제 또는 치료제 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)가 입자의 지질 부분 내에 포획되어 분해로부터 보호되는 LNP)는 연속적인 혼합 방법, 직접 희석 공정 및 인-라인(in-line) 희석 공정을 포함하나, 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 지질 또는 그의 염을 단독으로 또는 다른 양이온성 지질과 조합하여 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 비-양이온성 지질은 달걀 스핑고미엘린(ESM), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 14:0 PE (1,2-디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE)), 16:0 PE (1,2-디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE)), 18:0 PE (1,2-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)), 18:1 PE (1,2-디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)), 18:1 트랜스 PE (1,2-디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE)), 18:0-18:1 PE (1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE)), 16:0-18:1 PE (1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE)), 폴리에틸렌 글리콜-기반 중합체(예를 들어, PEG 2000, PEG 5000, PEG-변형된 디아실글리세롤 또는 PEG-변형된 디알킬옥시프로필), 콜레스테롤, 그의 유도체 또는 이들의 조합물이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 연속적인 혼합 방법, 예를 들어, 제1 저장기에 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)을 포함하는 수용액을 제공하고, 제2 저장기에 유기 지질 용액을 제공하고(여기서, 유기 지질 용액 내에 존재하는 지질은 유기 용매, 예를 들어, 저급 알칸올, 예컨대 에탄올에 가용화됨), 지질 소포체(vesicle) 내에 핵산을 캡슐화하는 지질 소포체(예를 들어, 리포솜)를 실질적으로 즉시 생산하기 위해 유기 지질 용액이 수용액과 혼합되도록 수용액을 유기 지질 용액과 혼합하는 것을 포함하는 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP)를 제공한다. 상기 공정 및 이 공정을 수행하기 위한 장치는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 2004/0142025에 상세히 기재되어 있다.
지질 및 완충제 용액을 혼합 환경 내로, 예컨대 혼합 챔버에 연속적으로 도입하면, 지질 용액과 완충제 용액이 연속적으로 희석되고, 이에 의해 혼합시에 실질적으로 즉시 지질 소포체를 생성한다. 본원에 사용된 어구 "지질 용액과 완충제 용액의 연속적인 희석"(및 변형 표현)은 일반적으로 지질 용액이 소포체 생성을 달성하기에 충분한 힘으로 수화 공정에서 충분히 신속하게 희석됨을 의미한다. 핵산을 포함하는 수용액을 유기 지질 용액과 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 핵산-지질 입자를 생산하기 위해 완충제 용액(즉, 수용액)의 존재 하에 연속적인 단계적인 희석을 거친다.
연속적인 혼합 방법을 이용하여 형성된 핵산-지질 입자는 일반적으로 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm 또는 80 nm 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm 또는 150 nm 미만(또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 임의로 균일한 입자 크기를 달성하기 위해 크기별로 분류된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 지질 소포체(예를 들어, 리포솜) 용액을 형성하고, 그 즉시 지질 소포체 용액을 직접 제어된 양의 희석 완충제를 함유하는 수집 용기 내로 도입하는 것을 포함하는 직접 희석 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP)를 제공한다. 바람직한 측면에서, 수집 용기는 희석을 용이하게 하기 위해 수집 용기의 내용물을 교반하도록 형성된 하나 이상의 요소를 포함한다. 한 측면에서, 수집 용기 내에 존재하는 희석 완충제의 양은 도입된 지질 소포체 용액의 부피와 실질적으로 동일하다. 비제한적인 예로서, 45% 에탄올 내의 지질 소포체 용액은 동일한 부피의 희석 완충제를 함유하는 수집 용기 내에 도입될 때 보다 작은 입자를 유리하게 생성할 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 희석 완충제를 함유하는 제3 저장기가 제2 혼합 영역에 유체 연결된 인-라인 희석 공정을 통해 생산된 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP)를 제공한다. 본 구현예에서, 제1 혼합 영역에 형성된 지질 소포체(예를 들어, 리포솜) 용액은 즉시 제2 혼합 영역 내의 희석 완충제와 직접 혼합된다. 바람직한 측면에서, 제2 혼합 영역은 지질 소포체 용액 및 희석 완충제 유동이 180°정반대의 유동으로서 만나도록 배열된 T-연결기를 포함하지만; 보다 작은 각도, 예를 들어, 약 27° 내지 약 180°(예를 들어, 약 90°)를 제공하는 연결기가 사용될 수 있다. 펌프 메카니즘은 완충제를 제어가능한 유동으로 제2 혼합 영역으로 전달한다. 한 측면에서, 제2 혼합 영역에 제공되는 희석 완충제의 유속은 제1 혼합 영역으로부터 그로 도입되는 지질 소포체 용액의 유속과 실질적으로 동일하도록 제어된다. 상기 구현예는 유리하게는 제2 혼합 영역에서 지질 소포체 용액과 혼합되는 희석 완충제의 유동, 따라서 제2 혼합 공정 내내 완충제 내의 지질 소포체 용액의 농도에 대한 보다 큰 제어를 허용한다. 상기 희석 완충제 유속의 제어는 유리하게는 감소된 농도에서 작은 입자 크기의 형성을 허용한다.
상기 공정 및 상기 직접 희석 및 인-라인 희석 공정을 수행하기 위한 장치는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 2007/0042031에 상세히 기재되어 있다.
직접 희석 및 인-라인 희석 공정을 이용하여 형성된 일반적으로 핵산-지질 입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm 또는 80 nm 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm 또는 150 nm 미만(또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위)의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집하지 않고, 임의로 균일한 입자 크기를 달성하기 위해 크기별로 분류된다.
필요한 경우, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 리포솜의 크기별 분류를 위해 이용가능한 임의의 방법에 의해 크기별로 분류될 수 있다. 크기별 분류는 목적하는 크기 범위 및 입자 크기의 비교적 좁은 분포를 달성하기 위해 수행될 수 있다.
몇몇의 기술이 입자를 요구되는 크기로 분류하기 위해 이용가능하다. 리포솜에 대해 사용되고 본 발명의 입자에 대해 동등하게 적용가능한 한 크기별 분류 방법은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 4,737,323에 기재되어 있다. 욕조 또는 프로브 초음파 처리에 의한 입자 현탁액의 초음파 처리는 크기를 크기가 약 50 nm 미만인 입자로 점진적으로 감소시킨다. 균질화는 더 큰 입자를 보다 작은 입자로 분해하기 위해 전단 에너지에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, 입자는 선택된 입자 크기, 일반적으로 약 60 내지 약 80 nm가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질화기를 통해 재순환된다. 두 방법 모두에서, 입자 크기 분포는 통상적인 레이저 빔 입자 크기 식별 또는 QELS에 의해 모니터링될 수 있다.
작은 세공의 폴리카르보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 입자의 압출도 입자 크기를 비교적 잘 규정된 크기 분포로 감소시키기 위한 효과적인 방법이다. 일반적으로, 현탁액을 목적하는 입자 크기 분포가 달성될 때까지 막을 통해 1회 이상 순환시킨다. 입자는 크기의 점차적인 감소를 달성하기 위해 연속적으로 보다 작은 세공의 막을 통해 압출될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 입자 내에 존재하는 핵산은 예를 들어 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 09/744,103에 기재된 바와 같이 예비응축된다.
다른 구현예에서, 방법은 본 발명의 조성물을 사용하여 세포의 리포펙션(lipofection)을 수행하기에 유용한 비-지질 다가양이온을 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 비-지질 다가양이온의 예는 헥사디메트린 브로마이드(상표명 폴리브렌(POLYBRENE®) 하에 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Co., 미국 위스콘신주 밀워키)로 판매됨) 또는 헥사디메트린의 다른 염을 포함한다. 다른 적합한 다가양이온은 예를 들어 폴리-L-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 폴리알릴아민 및 폴리에틸렌이민의 염을 포함한다. 이들 염의 첨가는 바람직하게는 입자가 형성된 후에 실시된다.
몇몇 구현예에서, 형성된 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP) 내의 핵산 대 지질 비(질량/질량비)는 약 0.01 내지 약 0.2, 약 0.05 내지 약 0.2, 약 0.02 내지 약 0.1, 약 0.03 내지 약 0.1 또는 약 0.01 내지 약 0.08일 것이다. 출발 물질(투입)의 비도 상기 범위 내에 해당한다. 다른 구현예에서, 입자 제제는 약 400 ㎍ 핵산/10 mg 총 지질 또는 약 0.01 내지 약 0.08, 보다 바람직하게는 약 0.04의 핵산 대 지질 질량비(1.25 mg의 총 지질/50 ㎍의 핵산에 대응함)를 이용한다. 다른 바람직한 구현예에서, 입자는 약 0.08의 핵산:지질 질량비를 갖는다.
다른 구현예에서, 형성된 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP) 내의 지질 대 핵산 비(질량/질량비)는 약 1(1:1) 내지 약 100(100:1), 약 5(5:1) 내지 약 100(100:1), 약 1(1:1) 내지 약 50(50:1), 약 2(2:1) 내지 약 50(50:1), 약 3(3:1) 내지 약 50(50:1), 약 4(4:1) 내지 약 50(50:1), 약 5(5:1) 내지 약 50(50:1), 약 1(1:1) 내지 약 25(25:1), 약 2(2:1) 내지 약 25(25:1), 약 3(3:1) 내지 약 25(25:1), 약 4(4:1) 내지 약 25(25:1), 약 5(5:1) 내지 약 25(25:1), 약 5(5:1) 내지 약 20(20:1), 약 5(5:1) 내지 약 15(15:1), 약 5(5:1) 내지 약 10(10:1) 또는 약 5(5:1), 6(6:1), 7(7:1), 8(8:1), 9(9:1), 10(10:1), 11(11:1), 12(12:1), 13(13:1), 14(14:1), 15(15:1), 16(16:1), 17(17:1), 18(18:1), 19(19:1), 20(20:1), 21(21:1), 22(22:1), 23(23:1), 24(24:1) 또는 25(25:1), 또는 그의 임의의 비율 또는 그 내의 범위일 것이다. 출발 물질(투입)의 비도 상기 범위 내에 해당한다.
앞서 논의한 바와 같이, 지질은 CPL을 추가로 포함할 수 있다. LNP-CPL(CPL-함유 LNP)의 제조를 위한 다양한 일반적인 방법이 본원에서 논의된다. 2가지 일반적인 기술은 "삽입 후" 기술, 즉 예를 들어 예비형성된 LNP 내로의 CPL의 삽입 및 CPL이 예를 들어 LNP 형성 단계 동안 지질 혼합물 내에 포함되는 "표준" 기술을 포함한다. 삽입 후 기술은 CPL을 주로 LNP 이중층 막의 외면에 갖는 LNP를 생성하는 반면, 표준 기술은 내면 및 외면 둘 모두에 CPL을 갖는 LNP를 제공한다. 방법은 인지질(콜레스테롤을 함유할 수 있는)로 제조된 소포체 및 PEG-지질(예컨대 PEG-DAA 및 PEG-DAG)을 함유하는 소포체에 특히 유용하다. LNP-CPL의 제조 방법은 예를 들어 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 5,705,385; 6,586,410; 5,981,501; 6,534,484; 및 6,852,334; 미국 특허 출원 공개 2002/0072121; 및 PCT 공개 WO 00/62813에 교시되어 있다.
VII . 키트
본 발명은 또한 키트 형태의 지질 입자(예를 들어, LNP)를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 키트는 지질 입자의 다양한 요소(예를 들어, 활성제 또는 치료제, 예컨대 입자의 핵산 및 개별 지질 성분)를 보유하기 위해 구획화된 용기를 포함한다. 바람직하게는, 키트는 본원에 제시된 방법 중의 하나에 의해 생산된 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)를 보유하는 용기(예를 들어, 바이알 또는 앰플)를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 엔도솜 막 불안정화제(예를 들어, 칼슘 이온)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 본 발명의 입자 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체 내의 현탁액으로서 또는 탈수 형태로, 이들의 재수화(동결건조될 경우) 및 투여를 위한 지시서와 함께 함유한다.
본 발명의 지질 입자는 관심있는 특정 조직, 장기 또는 종양을 우선적으로 표적화하도록 조정될 수 있다. 몇몇 예에서, 1:57 지질 입자(예컨대, LNP) 제제를 사용하여 표적 간(예컨대, 정상 간 조직)을 우선적으로 표적화할 수 있다. 다른 예에서는, 7:54 지질 입자(예컨대, LNP) 제제를 사용하여 간 종양과 같은 고체 종양 및 간 외부 종양을 우선적으로 표적화할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 이러한 간-지향 및/또는 종양-지향 지질 입자를 포함하고, 여기서 입자는 현탁액으로서 또는 탈수 형태로 용기 내에 존재한다.
특정의 다른 경우에, 지질 입자의 표면에 표적화 잔기가 부착되는 것이 입자의 표적화를 추가로 향상시키기 위해 바람직할 수 있다. 표적화 잔기(예를 들어, 항체, 단백질 등)를 지질(예컨대, 본 발명의 입자에 사용되는 것)에 부착시키는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
VIII . 지질 입자의 투여
일단 형성되면, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산, 예컨대 간섭 RNA)의 세포 내로의 도입에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 활성제 또는 치료제 예를 들어 핵산(예컨대, 간섭 RNA)을 세포 내로 도입하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 예에서, 세포는 간 세포 예를 들어 간 조직에 존재하는 헤파토사이트이다. 다른 예에서, 세포는 종양 세포 예를 들어 고체 종양에 존재하는 종양 세포이다. 상기 방법은 상기 기재된 바와 같이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 먼저 입자를 형성한 후, 입자를 활성제 또는 치료제가 세포로 전달되기에 충분한 시간 동안 세포와 접촉시킴으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 이들이 혼합되거나 접촉되는 거의 모든 세포 종류에 흡착될 수 있다. 일단 흡착되면, 입자는 세포의 일부에 의해 세포내이입되거나, 지질을 세포막과 교환하거나 또는 세포와 융합될 수 있다. 입자의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산) 부분의 전달 또는 통합은 이들 경로의 임의의 하나를 통해 발생할 수 있다. 특히, 융합이 발생할 때, 입자 막은 세포막 내에 통합되고, 입자의 내용물은 세포내 유체와 조합된다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 제약 실무에 따라 선택된 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 생리학적 염수 또는 포스페이트 완충제)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 통상적인 완충 염수(예를 들어, 135-150 mM NaCl)는 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 것이다. 다른 적합한 담체는 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등, 예를 들어 안정성 향상을 위한 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함한다. 추가의 적합한 담체는 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에 기재되어 있다. 본원에 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 어구 "약제학적으로 허용되는"은 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 불리한 반응을 생성하지 않는 분자 단위 및 조성물을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 지질 입자 형성 후에 첨가된다. 따라서, 지질 입자(예를 들어, LNP)가 형성된 후에, 입자는 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 통상적인 완충 염수 내에 희석될 수 있다.
제약 제제 내의 입자의 농도는 넓게, 즉, 약 0.05% 미만, 대체로 적어도 약 2 내지 5%로부터 약 10 내지 90 중량%까지 크게 상이할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다. 예를 들어, 농도는 처리와 관련된 유체 부하를 저하시키기 위해 감소될 수 있다. 이것은 죽상동맥경화증-연관 울혈성 심부전증 또는 중증 고혈압 환자에서 특히 바람직할 수 있다. 다르게는, 자극성 지질로 이루어진 입자는 투여 부위에서 염증을 완화하기 위해 낮은 농도로 희석될 수 있다.
본 발명의 약학제학적 조성물은 통상적인, 잘 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 생리학적 조건과 근접하게 만들기 위해 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 장성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘을 함유할 수 있다. 추가로, 입자 현탁액은 보관시 유리 라디칼 및 지질-과산화 손상에 대해 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친지성 유리 라디칼 켄처(quencher), 예컨대 알파토코페롤 및 수용성 철-특이적 킬레이터, 예컨대 페리옥사민이 적합하다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 간섭 RNA 서열(예를 들어, siRNA)을 포함하는 하나 이상의 핵산의 치료 목적의 전달을 위한 방법에서 특히 유용하다. 특히, 하나 이상의 표적 핵산 서열 또는 관심 유전자의 전사 및/또는 번역을 하향조절하거나 사일런싱시킴으로써 포유동물(예를 들어, 마우스와 같은 설치류, 또는 인간, 침팬지 또는 원숭이와 같은 영장류)의 질환 또는 장애를 생체내 또는 생체외 치료 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 비-제한적 예로서, 본 발명의 방법은 포유동물 환자의 간 및/또는 종양에 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 생체내 전달에 유용하다. 특정 구현예에서, 질환 또는 장애는 유전자의 발현 및/또는 과발현과 관련되어 있으며, 유전자의 발현 또는 과발현은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의해 감소된다. 다른 특정 구현예에서, 지질 입자의 치료 유효량이 포유동물에 투여될 수 있다. 일부 경우, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 LNP로 제제화되고, 입자들은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 다른 경우에, 세포들을 환자로부터 제거하고, 간섭 RNA를 (예를 들어, 본원에 기재된 LNP을 사용하여) 시험 관내에서 전달하고, 세포들을 환자에게 재주입시킨다.
A. 생체내 투여
생체내 치료를 위한 전신 전달, 예를 들어 신체 시스템, 예컨대 순환을 통한 치료 핵산의 먼 표적 세포로의 전달은 핵산-지질 입자, 예컨대 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 PCT 공개 WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152 및 WO 04/002453에 기재된 것을 사용하여 달성되었다. 본 발명은 또한 혈청 내의 뉴클레아제 분해로부터 핵산을 보호하고, 비-면역원성이고, 크기가 작고, 반복 투여에 적합한 완전히 캡슐화된 지질 입자를 제공한다.
생체내 투여를 위해, 투여는 당업계에 공지된 임의의 방식, 예를 들어 주사, 경구 투여, 흡입(예를 들어, 비내 또는 기관내), 경피 적용 또는 직장내 투여에 의해 실시될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 용량으로 실시될 수 있다. 약학제학적 조성물은 비경구로, 즉, 관절내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근내 투여될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 약학제학적 조성물은 볼러스(bolus) 주사에 의해 정맥내 또는 복강 내로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 5,286,634 참조). 세포내 핵산 전달은 또한 문헌[Straubringer 등., Methods Enzymol., 101:512 (1983)]; [Mannino 등., Biotechniques, 6:682 (1988)]; [Nicolau 등., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989)]; 및 [Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993)]에 논의되어 있다. 지질-기반 치료제를 투여하는 또 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 3,993,754; 4,145,410; 4,235,871; 4,224,179; 4,522,803; 및 4,588,578에 기재되어 있다. 지질 입자는 질환 부위에서의 직접 주사에 의해 또는 질환 부위로부터 먼 부위에서의 주사에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71(1994)] 참조). 상기한 참고문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)가 정맥 내로 투여되는 구현예에서, 입자의 총 주사된 용량의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%가 주사 약 8, 12, 24, 36 또는 48시간 후에 혈장 내에 존재한다. 다른 구현예에서, 지질 입자의 총 주사된 용량의 약 20%, 30%, 40% 초과 및 약 60%, 70% 또는 80%의 큰 비율이 주사 약 8, 12, 24, 36 또는 48시간 후에 혈장 내에 존재한다. 특정한 경우에, 약 10% 초과의 복수의 입자가 투여 약 1시간 후에 포유동물의 혈장 내에 존재한다. 특정 다른 예에서, 지질 입자의 존재는 입자의 투여 적어도 약 1시간 후에 검출가능하다. 특정 구현예에서, 핵산과 같은 치료제의 존재는 투여 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96시간 후에 폐, 간, 종양 세포에서 또는 염증 부위에서 검출가능하다. 다른 구현예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 투여 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96시간 후에 검출가능하다. 또 다른 구현예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 간 세포(예컨대, 헤파토사이트), 종양 세포 또는 염증 부위 세포에서 우선적으로 발생한다. 추가의 구현예에서, 투여 부위에 가까운 또는 먼 부위의 세포 또는 폐, 간 또는 종양 세포 내의 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 존재 또는 효과는 투여 약 12, 24, 48, 72 또는 96시간 후에 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 또는 28일 후에 검출가능하다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 비경구 또는 복강내 투여된다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여, 흡입을 통해(예를 들어, 비내 또는 기관내) 투여되는 에어로졸 제제(즉, 이들은 "분무될 수 있다")로 제조될 수 있다(문헌[Brigham 등., Am. J. Sci., 298:278 (1989)] 참조). 에어로졸 제제는 허용되는 압축 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 약학제학적 조성물은 비내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비내 에어로졸 스프레이를 통해 핵산 조성물을 직접 폐에 전달하는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,756,353 및 5,804,212에 기재되어 있다. 이와 유사하게, 비내 마이크로입자 수지 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용한 약물의 전달(미국 특허 5,725,871)도 제약 업계에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달이 미국 특허 5,780,045에 기재되어 있다. 상기 특허 문헌의 개시내용은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다.
예를 들어, 관절내(관절 내의), 정맥내, 근내, 피부내, 복강내 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여를 위해 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제 및 제제를 의도된 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액 및 현탁제, 가용화제, 비후제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실행시에, 조성물은 바람직하게는 예를 들어 정맥내 주입에 의해, 경구, 국소, 복강내, 방광내 또는 경막내 경로로 투여된다.
일반적으로, 정맥내 투여될 때, 지질 입자 제제는 적합한 약제학적 담체와 함께 제제화된다. 많은 약제학적으로 허용되는 담체가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 적합한 제제는 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 볼 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있고, 안정성 향상을 위해 당단백질, 예컨대 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 통상적인 완충 염수(135-150 mM NaCl)가 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 것이지만, 다른 적합한 담체도 충분할 것이다. 이들 조성물은 통상적인 리포솜성 멸균 기술, 예컨대 여과에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 근접하게 만들기 위해 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 장성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 및 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 상기 언급된 기술을 사용하여 멸균될 수 있거나, 또는 다르게는, 멸균 조건 하에 생산될 수 있다. 생성되는 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다.
특정 용도에서, 본원에 개시된 지질 입자는 경구 투여를 통해 개체에게 전달될 수 있다. 입자는 부형제와 함께 포함되고, 섭취가능한 정제, 구강정(buccal tablet), 트로키, 캡슐, 알약, 로젠지, 엘릭시르, 구강세척액, 현탁액, 경구 스프레이, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 5,641,515, 5,580,579 및 5,792,451 참조). 이들 경구 투여 형태는 또한 다음을 함유할 수 있다: 결합제, 젤라틴; 부형제, 윤활제 및/또는 향미제. 단위 투여 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기 설명된 물질에 추가로, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 투여 단위의 물리적 형태를 다른 방식으로 변형하기 위해 존재할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 제약학상 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다.
일반적으로, 이들 경구 제제는 적어도 약 0.1% 이상의 지질 입자를 함유할 수 있지만, 입자의 비율은 물론 상이할 수 있고, 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1% 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 이상일 수 있다. 따라서, 각각의 치료상 유용한 조성물 내의 입자의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 제시된 단위 용량에서 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 기한 및 다른 약리학상 고려사항과 같은 인자가 그러한 제약 제제의 제조 기술의 당업자에게 의해 고려될 것이고, 따라서, 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
경구 투여를 위해 적합한 제제는 다음으로 이루어질 수 있다: (a) 액체 용액, 예컨대 희석제(예컨대 물, 염수 또는 PEG 400)에 현탁된 유효량의 포장된 치료제 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA); (b) 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴으로서 각각 소정량의 치료제 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)을 함유하는 캡슐, 향낭(sachet) 또는 정제; (c) 적절한 액체 내의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀젼. 정제 형태는 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향미제, 염료, 붕해제 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 향미제, 예를 들어, 수크로스 내의 치료제 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA) 및 치료제를 불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 내에 포함하는 향정(pastille) 또는 수크로스 및 치료제 이외에 당업계에 공지된 담체를 함유하는 아카시아 에멀젼, 겔 등을 포함할 수 있다.
이들의 용도의 또 다른 예에서, 지질 입자는 넓은 범위의 국소 투여 형태 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 핵산-지질 입자, 예컨대 LNP를 함유하는 현탁액은 겔, 오일, 에멀젼, 국소 크림, 페이스트, 연고, 로션, 폼, 무스(mousse) 등으로서 제제화되고 투여될 수 있다.
본 발명의 지질 입자의 제약 제제를 제조할 때, 빈 입자 또는 외부 표면과 결합된 치료제, 예컨대 핵산을 갖는 입자를 감소시키거나 제거하기 위해 정제된 다량의 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 다양한 숙주에서 실행될 수 있다. 바람직한 숙주는 포유동물 종, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간 및 침팬지 및 다른 비인간 영장류), 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 설치류(예를 들어, 래트 및 마우스), 토끼 및 돼지를 포함한다.
투여된 입자의 양은 치료제(예컨대, 핵산) 대 지질의 비, 사용된 특정 치료제(예컨대, 핵산), 치료할 질환 또는 장애, 환자의 연령, 체중 및 상태, 및 임상의의 판단에 따라 결정될 것이지만, 일반적으로 약 0.01 내지 약 50 mg/kg(체중), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 mg/kg(체중) 또는 약 108-1010 입자/투여(예를 들어, 주사)일 것이다.
B. 시험관내 투여
시험관내 적용을 위해, 치료제 예컨대 핵산(예를 들어, 간섭 RNA)의 전달은 배양액에서 성장한, 식물 또는 동물 기원, 척추동물 또는 무척추동물, 및 임의의 조직 또는 종류의 임의의 세포로의 전달일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포(예컨대, 종양 세포 또는 헤파토사이트)이다.
세포 및 지질 입자 사이의 접촉은 시험관 내에서 수행될 때, 생물학상 적합한 매질에서 발생한다. 입자의 농도는 특정 용도에 따라 크게 상이하지만, 일반적으로 약 1 μ몰 내지 약 10 mmol이다. 지질 입자를 사용한 세포의 처리는 일반적으로 생리학적 온도(약 37℃)에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 약 2 내지 4시간 동안 수행한다.
바람직한 구현예의 한 군에서, 지질 입자 현탁액은 약 103 내지 약 105 세포/ml, 보다 바람직하게는 약 2 x 104 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 60-80% 융합도(confluent)의 플레이팅된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가된 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 0.2 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎍/ml이다.
세포의 조직 배양이 필요할 수 있는 정도로, 이것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994)], [Kuchler 등., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977)], 및 이들에서 인용된 참고문헌은 세포 배양에 대한 전반적인 지침을 제공한다. 배양된 세포 시스템은 종종 세포의 단층 형태일 것이지만, 세포 현탁액도 사용된다.
엔도솜 방출 파라미터(ERP) 분석을 사용하여, 본 발명의 LNP 또는 다른 지질 입자의 전달 효율을 최적화할 수 있다. ERP 분석은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 2003/0077829에 상세히 기재되어 있다. 보다 특히, ERP 분석의 목적은 결합/흡수 또는 엔도솜 막과의 융합/탈안정화에 대한 그의 상대적인 효과를 기초로 하여 LNP 또는 다른 지질 입자의 다양한 양이온성 지질 및 헬퍼(helper) 지질 성분의 효과를 구분하는 것이다. 상기 분석에 의해, LNP 또는 다른 지질 입자의 각각의 성분이 전달 효율에 영향을 주고 이에 의해 LNP 또는 다른 지질 입자를 최적화하는 정도를 정량적으로 결정할 수 있다. 대체로, ERP 분석은 리포터 단백질(예를 들어, 루시페라제, β-갈락토시다제, 초록 형광 단백질(GFP) 등)의 발현을 측정하고, 몇몇 예에서, 발현 플라스미드에 대해 최적화된 LNP 제제가 또한 간섭 RNA를 캡슐화하기 위해 적절할 것이다. 다른 예에서, ERP 분석은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 존재 또는 부재 하에 표적 서열의 전사 또는 번역의 하향조절을 측정하기 위해 조정될 수 있다. 각각의 다양한 LNP 또는 다른 지질 입자에 대한 ERP를 비교함으로써, 최적화된 시스템, 예를 들어, 세포에서 최대 흡수를 보이는 LNP 또는 다른 지질 입자를 쉽게 결정할 수 있다.
C. 지질 입자의 전달을 위한 세포
본 발명의 조성물 및 방법은 생체내 및 시험관내에서 다양한 세포 유형의 치료에 사용된다. 적합한 세포는 헤파토사이트, 세망내피세포(예컨대, 단핵구, 대식세포 등), 섬유아세포, 내피 세포, 혈소판 세포, 바이러스에 감염 및/또는 감염되기 쉬운 다른 세포 유형, 조혈 전구체(줄기) 세포, 케라틴생성세포, 골격 및 평활근 세포, 골아세포, 뉴런, 정지 림프구, 말단 분화 세포, 느리거나 비순환 일차 세포, 실질 세포, 림프 세포, 상피 세포, 골 세포 등을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시 예에서, 이러한 핵산과 같은 활성제 또는 치료제(예를 들어, 간섭 RNA)는 암 세포(예를 들면, 고형 종양의 세포), 예를 들어 간암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 항문암 세포, 담관암 세포, 소장 암 세포, 위암 세포, 식도암 세포, 담낭암 세포, 췌장암 세포, 부속 암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 전립선암 세포, 신장암 세포, 중추 신경계 암 세포, 교모세포종 종양 세포, 피부암 세포, 림프종 세포, 융모암종 종양 세포, 두경부암 세포, 골육종 종양 세포 및 혈액암 세포에 전달된다.
핵산을 캡슐화하는 LNP(예를 들어, 간섭 RNA) 같은 지질 입자의 생체내 전달은 임의의 세포 유형의 세포를 표적화하기에 적합하다. 이러한 방법 및 조성물은 다양한 척추 동물 예를 들어 개과, 고양이과, 말, 소, 양, 염소, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 및 기니아 피그), 토끼목, 돼지 및 영장류(예를 들어 원숭이, 침팬지 및 인간)의 세포에 이용될 수 있다.
D. 지질 입자의 검출
몇몇 구현예에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 대상체 내에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 시간 이상의 시간에서 검출가능하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 대상체 내에서 입자의 투여 약 8, 12, 24, 48, 60, 72 또는 96시간, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25 또는 28일 후에 검출가능하다. 입자의 존재는 대상체로부터 세포, 조직 또는 다른 생물학적 샘플 내에서 검출할 수 있다. 입자는 예를 들어 입자의 직접 검출, 치료 핵산, 예컨대 간섭 RNA(예를 들어, siRNA) 서열의 검출, 관심있는 표적 서열의 검출(즉, 관심있는 서열의 발현 또는 감소된 발현의 검출에 의한) 또는 이들의 조합에 의해 검출할 수 있다.
1. 입자의 검출
본 발명의 지질 입자, 예컨대 LNP는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 표지는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 직접 또는 간접적으로 지질 입자의 성분에 커플링될 수 있다. 매우 다양한 표지가 사용될 수 있고, 표지는 요구되는 감수성, 지질 입자 성분과의 컨쥬게이트 용이성, 안정성 요건, 및 이용가능한 기구 및 처리 규정에 따라 선택된다. 적합한 표지는 형광 표지, 예컨대 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 오레곤 그린(Oregon Green™); 로다민 및 유도체, 예컨대 텍사스 레드(Texas red), 테트라로디민 이소티오시아네이트(TRITC) 등, 디곡시게닌, 비오틴, 피코에리트린, AMCA, CyDyes™ 등; 방사성 표지, 예컨대 예컨대 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P 등; 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등; 분광 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금(colloidal gold) 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 표지는 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 검출할 수 있다.
2. 핵산의 검출
핵산(예를 들어, 간섭 RNA)은 당업자에게 잘 공지된 임의의 많은 수단에 의해 본원에서 검출되고 정량된다. 핵산의 검출은 잘 공지된 방법, 예컨대 서던(Southern) 분석, 노던 분석, 겔 전기영동, PCR, 방사성 표지, 섬광 계수, 및 친화도 크로마토그래피에 의해 진행될 수 있다. 추가의 분석적 생화학적 방법, 예컨대 분광광도법, 방사선 촬영, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC) 및 과다확산(hyperdiffusion) 크로마토그래피도 사용될 수 있다.
핵산 하이브리드화 방식의 선택은 중요하지 않다. 다양한 핵산 하이브리드화 방식이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 통상적인 방식은 샌드위치 분석 및 경쟁 또는 전치(displacement) 분석을 포함한다. 하이브리드화 기술은 예를 들어 문헌["Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985)에 일반적으로 기재되어 있다.
하이브리드화 분석의 민감도는 검출할 표적 핵산의 수를 증가시키는 핵산 증폭 시스템의 사용을 통해 향상될 수 있다. 분자 프로브로서 사용하기 위한 서열 증폭 또는 후속적인 서브클로닝을 위한 핵산 단편의 생성에 적합한 시험관내 증폭 기술은 알려져 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭 및 다른 RNA 중합효소 매개된 기술(예를 들어, NASBA™)을 비롯하여 상기 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 안내하기에 충분한 기술의 예는 문헌[Sambrook 등., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)]; 및 [Ausubel 등., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002)]; 및 미국 특허 4,683,202; [PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis 등. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990)]; [Arnheim & Levinson (October 1, 1990), C&EN 36]; [The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991)]; [Kwoh 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989)]; [Guatelli 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)]; [Lomell 등., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989)]; [Landegren 등., Science, 241:1077 (1988)]; [Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990)]; [Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989)]; [Barringer 등., Gene, 89: 117 (1990)]; 및 [Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995)]에서 볼 수 있다. 시험관 내에서 증폭된 핵산의 개선된 클로닝 방법은 미국 특허 5,426,039에 기재되어 있다. 당업계에서 설명된 다른 방법은 핵산 서열 기반 증폭(NASBA™, 캔젠(Cangene), 미국 온타리오주 미시쏘가) 및 Q-레플리카제 시스템이다. 선택된 서열이 존재하는 경우에만 PCR 또는 LCR 프라이머가 연장되거나 라이게이션되도록 설계된 이들 시스템은 돌연변이체를 확인하기 위해 직접 이용될 수 있다. 다르게는, 선택된 서열은 일반적으로 예를 들어 비특이적 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 증폭된 표적 영역은 추후 돌연변이를 나타내는 특이적 서열에 대해 프로빙될 수 있다. 상기한 참고문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다.
예를 들어 시험관 내 증폭 방법에서 프로브로서 사용하기 위한, 유전자 프로브로서 또는 억제제 성분으로서 사용하기 위한 핵산은 일반적으로 예를 들어 문헌[Needham VanDevanter 등., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)]에 기재된 바와 같이 자동화 합성기를 사용하여 문헌[Beaucage 등., Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981)]에 기재된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다. 필요한 경우, 폴리뉴클레오타이드의 정제는 일반적으로 문헌[Pearson 등., J. Chrom., 255:137 149 (1983)]에 기재된 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온 교환 HPLC에 의해 수행된다. 합성 폴리뉴클레오타이드의 서열은 문헌[Maxam and Gilbert (1980) in Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499]의 화학적 분해 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
전사 수준을 결정하기 위한 별도의 수단은 인시튜(in situ) 하이브리드화이다. 인시튜 하이브리드화 분석은 잘 공지되어 있고, 문헌[Angerer 등., Methods Enzymol, 152:649 (1987)]에 일반적으로 설명되어 있다. 인시튜 하이브리드화 분석에서, 세포는 고체 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드에 고정된다. DNA가 프로빙되어야 할 경우, 세포를 열 또는 알칼리로 변성시킨다. 이어서, 세포를 표지된 특이적 프로브의 어닐링을 허용하는 온도에서 하이브리드화 용액과 접촉시킨다. 프로브는 바람직하게는 방사성 동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.
VI . 실시예
본 발명을 구체적인 예에 의해 더 상세히 설명할 것이다. 하기 실시예는 예시의 목적으로 제공되고, 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하고자 의도되지 않는다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 얻기 위해 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 알 것이다.
일반적 방법: 달리 명시되지 않는 한, 모든 반응은 질소의 포지티브 압력 하에서 실온에서 수행하였다. 모든 시약은 상업적 출처로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 진행은 실리카 겔 60 F254(0.25 mm, 이 메르크(E. Merck)) 상에서 TLC로 모니터링하였다. 반점(spot)은 자외선 하에 검출하거나 또는 아니스알데하이드 또는 구리 설페이트 염색에 의해 검출하였다. 모든 컬럼크로마토그래피는 실리카 겔 60(40 내지 60μM)상에서 수행하였다. 실리카 겔과 조 생성물(crude product) 간의 비율은 100 내지 50:1의 범위였다. 1H NMR 스펙트럼은 300MHz의 또는 400MHz에서 기록하였고, 화학적 이동은 내부적으로 잔류 양성자 용매(7.27 ppm CHCl3)를 기준으로 하였다. 유기 용액은 40℃ 미만의 진공 하에서 농축시켰다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 예시적인, 트리알킬, 양이온성 지질의 합성을 기재한다.
화합물 9에 대한 합성 도식
Figure pct00038
화합물 2의 합성
Figure pct00039
무수 디클로로메탄 (200 mL) 중 (Z)-데크-4-엔-1-올 9 (20 g, 128.0 mmol) 및 트리에틸아민 (26.7 mL, 191.9 mmol)의 냉각된 용액 (0 ℃)에 메탄 설포닐 클로라이드 (14.9 mL, 191.9 mmol)을 서서히 부가했다. 용액을 30 분 동안 실온에서 교반하고 그 다음 디클로로메탄 (100 mL)로 희석했다. 용액을 포화된 중탄산나트륨 (3 x 150 mL)로 세정하고 그 다음 조합된 수성 세정물을 디클로로메탄 (150 mL)로 추출했다. 조합된 디클로로메탄 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 실리카 (100% 디클로로메탄)의 패드를 통해 여과하여 (Z)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 2을 황색 오일로서 얻었다 (28.5 g, 95%). Rf 0.5 (100% CH2Cl2).
화합물 3의 합성
Figure pct00040
2-메틸테트라하이드로푸란 (280 mL) 중 (Z)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 2 (28.5 g, 121.1 mmol)의 용액에 테트라부틸암모늄 브로마이드 (48.8 g, 151.4 mmol)을 부가했다. 용액을 80 ℃에서 30 분 동안 질소 하에서 교반하고, 그 다음 에테르 (150 mL)로 희석하고 물 (75 mL) 및 염수 (75 mL)로 세정했다. 에테르 용액을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 담황색 오일을 실리카 (100% 헥산)의 패드를 통해 여과하여 (Z)-1-브로모데크-4-엔 3을 무색 오일로서 얻었다 (23.0 g, 87%). Rf 0.9 (10% EtOAc-헥산).
화합물 4의 합성
Figure pct00041
무수 THF (6 mL) 중 마그네슘 조각 (1.4 g, 55.1 mmol)의 서스펜션에 질소 하에서 THF (12 mL) 중 (Z)-1-브로모데크-4-엔 3 (11.5 g, 52.5 mmol)의 용액을 서서히 부가했다. 반응 혼합물을 45 ℃에서 30 분 동안 질소 하에서 교반했다. 용액을 0 ℃로 냉각하고 THF (12 mL) 중 에틸 포르메이트 (4.1 g, 55.1 mmol)의 용액을 적가하여 5 분에 걸쳐 적가했다. 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고 그 다음 -15 ℃로 냉각하고 물 (10 mL) 그 다음 5M 염산 (15 mL)으로 서서히 켄칭했다. 마그네슘이 완전히 용해되었다면, 용액을 물 (50 mL)로 희석하고 헥산 (3 x 75 mL)로 추출했다. 조합된 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 수득된 잔여물을 에탄올 (40 mL)에서 용해시키고 물 (10 mL) 중 칼륨 하이드록사이드 (4.4 g, 78.7 mmol)의 용액을 부가했다. 반응 혼합물을 격렬하게 30 분 동안 교반하고 그 다음 진공에서 농축하여 에탄올을 제거했다. 그 다음 용액을 5M 염산 (15 mL)으로 산성으로 만들고 헥산 (3 x 75 mL)로 추출했다. 조합된 헥산 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 미가공의 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산 내지 헥산 중 2.5% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-올 4을 담황색 오일로서 얻었다 (5.6 g, 35%). Rf 0.4 (10% EtOAc-헥산).
화합물 5의 합성
Figure pct00042
무수 디클로로메탄 (50 mL) 중 6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-올 4 (5.6 g, 18.2 mmol) 및 트리에틸아민 (3.8 mL, 27.2 mmol)의 냉각된 용액 (0 ℃)에 메탄설포닐 클로라이드 (2.1 mL, 27.2 mmol)을 서서히 부가했다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반하고 그 다음 디클로로메탄 (50mL)로 희석했다. 용액을 포화된 중탄산나트륨 (3 x 25 mL)로 세정하고 그 다음 조합된 수성 세정물을 디클로로메탄 (50 mL)로 추출했다. 조합된 디클로로메탄 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 담황색 오일을 실리카 (100% DCM)의 패드를 통해 여과하여 (6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-일 메탄설포네이트 5을 미가공의 무색 오일로서 얻었다 (7.6 g). Rf 0.8 (100% CH2Cl2).
화합물 6의 합성
Figure pct00043
무수 DMF (60 mL) 중 (6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-일 메탄설포네이트 5 (7.6 g, 19.6 mmol) 및 나트륨 시아나이드 (4.8 g, 98.1 mmol)의 용액을 60 ℃로 밤새 가열했다. 완료 시, 반응 혼합물을 물 (200 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (3 x 100 mL)로 추출했다. 조합된 에틸 아세테이트 추출물을 염수 (3 x 100 mL)로 세정하고, 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산 내지 헥산 중 1% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-엔니트릴 6을 무색 오일로서 얻었다 (6.6 g, 97%). Rf 0.75 (10% EtOAc-헥산).
화합물 7의 합성
Figure pct00044
무수 디클로로메탄 (125 mL) 중 (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-엔니트릴 6 (4.0 g, 12.6 mmol)의 냉각된 용액 (-78 ℃)에 헥산 (5.6 mL, 31.5 mmol) 중 디이소부틸알루미늄 하이드라이드의1M 용액을 서서히 부가했다. 용액을 -15 ℃로 따뜻하게 하고 1 시간 동안 교반했다. 완료 시, 반응을 5% 염산 (30 mL)로 켄칭하고 수소 가스의 발전이 멈출 때까지-15 ℃에서 교반했다. 그 다음 용액을 디클로로메탄 (75 mL)로 희석하고 유기 층을 5M 염산 (100 mL)으로 세정했다. 디클로로메탄 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산 내지 헥산 중 2% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7을 무색 오일로서 얻었다 (3.9 g, 97%). Rf 0.65 (5% EtOAc-헥산).
화합물 8의 합성
Figure pct00045
테트라하이드로푸란 (5 mL) 중 마그네슘 조각 (0.6 g, 23.9 mmol)의 서스펜션에 테트라하이드로푸란 (5 mL) 중 (Z)-1-브로모데크-4-엔 3 (4.5 g, 20.5 mmol)의 용액을 서서히 부가했다. 반응 혼합물을 30 분 동안 실온에서 교반하고 그 다음 테트라하이드로푸란 (5 mL) 중 (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7의 용액을 부가했다. 용액을 15 분 동안 실온에서 교반하고 그 다음 5% 염산 (50 mL) 및 얼음 (100 mL)에 부었다. 용액을 에테르 (2 x 150 mL) 로 추출했다. 조합된 에테르 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중 1% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8을 무색 오일로서 얻었다 (4.8 g, 76%). Rf 0.45 (10% EtOAc-헥산).
화합물 9의 합성
Figure pct00046
무수 디클로로메탄 (10 mL) 중 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (0.4 g, 0.9 mmol), 4-(디메틸아미노)부탄산 하이드로클로라이드 (0.2 g, 1.3 mmol), EDCI 하이드로클로라이드 (0.25 g, 1.3 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.4 mL, 2.6 mmol)의 용액에 디메틸아미노피리딘 (5 mg)을 부가했다. 용액을 2 시간 동안 환류하고 그 다음 실온에서 2 시간 동안 교반했다. 혼합물은 진공에서 농축 건조하고 칼럼 크로마토그래피 (100% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 9을 담황색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 (m, 6H), 4.93 (m, 1H), 2.30 (m, 4H), 2.22 (s, 6H), 2.03 (m, 12H), 1.88 (m, 2H), 1.66-1.18 (m, 31H), 0.90 (m, 9H). Rf 0.3 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 11 및 13에 대한 합성 도식
Figure pct00047
화합물 10의 합성
Figure pct00048
무수 디클로로메탄 (25 mL) 중 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (2.4 g, 5.2 mmol), 6-브로모헥산산 (1.5 g, 7.8 mmol), EDCI 하이드로클로라이드 (1.5 g, 7.8 mmol), 디이소프로필에틸아민 (2.0 g, 15.6 mmol)의 용액에 디메틸아미노피리딘 (15 mg)을 부가했다. 용액을 2 시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각하고 진공에서 농축 건조했다. 반응 혼합물을 실리카겔상 칼럼 크로마토그래피 60 (2" W x 10" L; 5% EtOAc/Hex으로 용출됨)로 정제하여 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10을 무색 오일로서 얻었다 (3.1 g, 94%). Rf 0.5 (10% EtOAc-헥산).
화합물 11의 합성
Figure pct00049
테플론 밀봉된 압력 용기 중 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10 (3.1 g, 4.9 mmol)를 에탄올 (20 mL) 중 5.6 M 디메틸아민을 부가하고 반응을 70 ℃로 가열하고 밤새 교반했다. 일단 완료되면, 반응을 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에서 용해시키고 중탄산나트륨 용액 (2 x 50 mL)으로 세정했다. 에틸 아세테이트 층을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (100% EtOAc)로 정제하여 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11을 담황색 오일로서 얻었다 (2.0 g, 69%), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 (m, 6H), 4.93 (m, 1H), 2.27 (m, 10H), 2.00 (m, 12H), 1.63 (m, 6H), 1.51 (m, 6H), 1.28 (m, 25H), 0.90 (m, 9H). Rf 0.3 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 12의 합성
Figure pct00050
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 12 을, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (4.0 g, 8.7 mmol), 6-브로모-n-발레르산 (2.4 g, 13.0 mmol), EDCI 하이드로클로라이드 (2.5 g, 13.0 mmol), 디이소프로필에틸아민 (3.4 g, 26.0 mmol) 및 디메틸아미노피리딘 (10 mg). Rf 0.5 (10% EtOAc-헥산)로부터 무색 오일 (3.3 g, 61%)로서 수득했다.
화합물 13의 합성
Figure pct00051
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 13 을, 에탄올 (20 mL) 중 5.6 M 디메틸아민로부터 담황색 오일 (1.9 g, 62%)로서 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45-5.28 (m, 6H), 4.95-4.90 (m, 1H), 2.34-2.23 (m, 4H), 2.23-2.20 (s, 6H), 2.06-1.92 (m, 12H), 1.70-1.58 (m, 5H), 1.58-1.44 (m, 5H), 1.44-1.15 (m, 25H), 0.92-0.87 (m, 9H). Rf 0.4 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 14에 대한 합성 도식
Figure pct00052
화합물 14의 합성
Figure pct00053
(6Z,16Z)-12-((Z)-논-4-엔-1-일)트리코사-6,16-디엔-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 13 (200mg, 0.34mmol)를 함유하는 플라스크를 진공처리하고 질소로 (2회) 역충전하고 그 다음 Pd/C (150mg, 10% w/w)로 처리하고 차후에 EtOAc (10mL)에서 현탁했다. 그 다음 반응 플라스크를 진공처리하고 H2 (3배)로 역충전하고 혼합물을 격렬하게 교반했다 (18 시간). 그 다음 H2를 진공처리하고 플라스크를 N2으로 역충전했다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 EtOAc로 헹구고, 여과물을 농축했다. 미가공의 물질에 대해 크로마토그래피 (EtOAc)를 수행하여 12-노닐트리코산-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 14 (100mg, 50%)을 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.35 (10% CH3OH-CH2Cl2); 1H NMR (400MHz, CDCl3, δH) 4.95-4.90 (m, 1H), 2.31 (t, 2H), 2.27 (t, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.68-1.60 (m, 3H), 1.58-1.42 (m, 5H), 1.38-1.16 (m, 54H), 0.88 (t, 6H).
화합물 19 및 21에 대한 합성 도식
화합물 15의 합성
Figure pct00055
(Z)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 2의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-논-3-에닐 메탄설포네이트 15을 (Z)-논-3-엔-1-올 (20.0 g, 128.0 mmol), 트리에틸아민 (26.7 mL, 191.9 mmol) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (14.9 mL, 191.9 mmol)로부터 황색 오일(28.5 g, 92%)로서 수득했다. Rf 0.15 (30% 에틸 아세테이트-헥산).
화합물 16의 합성
Figure pct00056
(Z)-1-브로모데크-4-엔 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 15 (28.5 g, 129 mmol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (52.0 g, 161.4 mmol)로부터 (Z)-1-브로모비-3-엔 16을 무색 오일 (27.0 g, 정량적) 로서 수득했다. Rf 0.6 (10% EtOAc-헥산).
화합물 17의 합성
Figure pct00057
100 mL 동근바닥 플라스크에 마그네슘 조각 (0.6 g, 25.7 mmol) 및 교반 바를 충전했다. 플라스크를 히팅 건으로 5 분 동안 건조했다. 플라스크에 THF (5 mL) 및 요오드상 단결정립을 충전했다. THF (5 mL) 중 (Z)-1-브로모비-3-엔 (4.5 g, 22.0 mmol)의 용액을 혼합물에 서서히 부가하고 반응을 30 분 동안 질소 하에서 환류했다. 용액을 실온으로 냉각하고 THF (5 mL) 중 (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7 (4.7 g, 14.7 mmol)의 용액을 부가했다. 용액을 밤새 실온에서 교반하고 완료 시 혼합물을 5% HCl (50 mL) 및 얼음 (100 mL)에 부었다. 용액을 에테르 (2 x 150 mL)로 추출하고 조합된 에테르 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (칼럼: 2" W x 8" L; 100% 헥산 내지 헥산 중 5% 에틸 아세테이트로 용출됨)로 정제하여 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-올 17을 무색 오일로서 얻었다 (5.4 g, 82%). Rf 0.5 (10% EtOAc-헥산).
화합물 18의 합성
Figure pct00058
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-올 17 (0.35 g, 0.7 mmol), 5-브로모-n-발레르산 (0.60 g, 3.4 mmol), EDCI (0.60 g, 3.4 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.90 g, 6.7 mmol) 및 DMAP (5 mg, 촉매)로부터 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-일 5-브로모펜타노에이트 18을 무색 오일로서 수득했다 (0.9 g, 66%). Rf 0.5 (10% EtOAc-헥산).
화합물 19의 합성
Figure pct00059
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 에탄올 (10 mL) 중 5.6 M 디메틸아민 및 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-올 17 (0.35 g, 0.7 mmol)로부터 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 19을 무색 오일로서 수득했다 (0.2 g, 24%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40-5.28 (m, 6H), 4.97-4.88 (m, 1H), 2.35-2.24 (m, 4H), 2.24-2.19 (m, 6H), 2.08-1.93 (m, 12H), 1.70-1.55 (m, 3H), 1.55-1.45 (m, 5H), 1.45-1.13 (m, 25H), 0.93-0.82 (m, 9H). Rf 0.4 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 20의 합성
Figure pct00060
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-올 17 (0.35 g, 0.7 mmol), 6-브로모-n-카프로산 (0.70 g, 3.4 mmol), EDCI (0.60 g, 3.4 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.90 g, 6.7 mmol) 및 DMAP (5 mg, 촉매)로부터 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-일 6-브로모헥사노에이트 20을 무색 오일로서 수득했다 (1.4 g, 99%). Rf 0.6 (10% EtOAc-헥산).
화합물 21의 합성
Figure pct00061
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 에탄올 (15 mL) 중 5.6 M 디메틸아민로부터 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 21을 무색 오일로서 수득했다 (1.2 g, 92%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44-5.28 (m, 6H), 4.95-4.88 (m, 1H), 2.33-2.19 (m, 10H), 2.08-1.90 (m, 12H), 1.70-1.23 (m, 9H), 1.23-1.14 (m, 26H), 0.93-0.85 (m, 9H). Rf 0.15 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 22에 대한 합성 도식
Figure pct00062
화합물 22의 합성
Figure pct00063
무수 디클로로메탄 (10 mL) 중 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-올 17 (0.5 g, 1.1 mmol), 4-(디메틸아미노)부탄산 하이드로클로라이드 (0.3 g, 1.7 mmol), EDCI 하이드로클로라이드 (0.3 g, 1.7 mmol), DIPEA (0.4 g, 3.4 mmol)의 용액에 DMAP (5 mg)을 부가했다. 용액을 실온에서 밤새 질소 대기 하에서 교반했다. 혼합물은 진공에서 농축 건조하고 그 다음 DCM (150 mL)에서 취하고 포화된 중탄산나트륨으로 추출했다. 반응 혼합물을 실리카겔상 칼럼 크로마토그래피 60 (1:1 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)헤니코사-6,15-디엔-10-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 22을 무색 오일로서 얻었다 (0.4 g, 67%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40-5.28 (m, 6H), 4.97-4.90 (m, 1H), 2.36-2.25 (m, 4H), 2.25-2.19 (m, 6H), 2.07-1.95 (m, 12H), 1.85-1.73 (m, 2H), 1.58-1.45 (m, 3H), 1.45-1.10 (m, 24H), 0.93-0.85 (m, 9H). Rf 0.4 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 23, 24 및 25에 대한 합성 도식
Figure pct00064
화합물 23의 합성
Figure pct00065
무수 디에틸 에테르 (10 mL) 중 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (0.5 g, 1.1 mmol)의 용액에 -15 ℃로 냉각된 무수 디에틸 에테르 중 디포스겐 (0.2 mL, 1.8 mmol)의 용액을 서서히 부가했다. 용액을 1 시간 동안 교반하고 그 다음 N,N,N'-트리메틸-1,3-프로판디아민 (1.3 mL, 8.7 mmol)을 -15 ℃에서 부가했다. 용액을 실온으로 따뜻하게 하고, 1 시간 동안 교반하고, 그 다음 여과하여 암모늄 염 및 우레아를 제거했다. 디에틸 에테르 여과물을 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 3-(디메틸아미노)프로필(메틸)카바메이트 23을 무색 오일로서 얻었다 (0.15 g, 23%), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41-5.29 (m, 6H), 4.85-4.77 (m, 1H), 3.35-3.21 (m, 2H), 2.93-2.81 (m, 3H), 2.31-2.17 (m, 8H), 2.08-1.92 (m, 12H), 1.75-1.64 (m, 2H), 1.64-1.15 (m, 31H), 0.92-0.85 (m, 9H). Rf 0.45 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 24의 합성
Figure pct00066
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 3-(디메틸아미노)프로필(메틸)카바메이트 23의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (0.5 g, 1.1 mmol), 디포스겐 (0.2 mL, 1.8 mmol), 피리딘, 및 3-(디메틸아미노)-1-프로필아민 (0.9 g, 8.7 mmol)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 3-(디메틸아미노)프로필카바메이트 24를 무색 오일로서 수득했다 (0.1 g, 17%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44-5.28 (m, 6H), 4.81-4.72 (bs, 1H), 4.55-4.45 (bs, 1H), 3.34-3.15 (m, 3H), 2.45-2.13 (m, 7H), 2.10-1.86 (m, 12H), 1.75-1.57 (m, 3H), 1.57-1.03 (m, 30H), 0.93-0.85 (m, 9H). Rf 0.2 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 25의 합성
Figure pct00067
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 3-(디메틸아미노)프로필(메틸)카바메이트 23의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (0.5 g, 1.1 mmol), 디포스겐 (0.2 mL, 1.8 mmol) 및 N,N-디메틸에틸렌디아민 (0.8 g, 8.7 mmol)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 2-(디메틸아미노)에틸카바메이트 25을 무색 오일로서 수득했다 (0.20 g, 33%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40-5.28 (m, 6H), 5.08-5.01 (bs, 1H), 4.82-4.73 (bs, 1H), 3.30-3.18 (m, 2H), 2.44-2.35 (m, 2H), 2.30-2.20 (m, 6H), 2.07-1.91 (m, 12H), 1.65-1.11 (m, 31H), 0.93-0.85 (m, 9H). Rf 0.4 (10% MeOH-DCM).
화합물 26, 27 및 28에 대한 합성 도식
Figure pct00068
화합물 26의 합성
Figure pct00069
무수 Et2O (15mL) 중 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,15-디엔-10-올 17 (2.25g, 5.036mmol) 및 피리딘 (611 μL, 7.6 mmol)의 용액을 Et2O (15mL) 중 디포스겐 (910 μL, 7.6 mmol)의 냉각된 (0 ℃) 용액에 부가했다. 교반 (10분) 후, 반응 혼합물을 여과하고 농축하여 용매 및 잔여 포스겐 가스를 제거했다. 이러한 클로로포르메이트 (0.879g, 1.679mmol)의 3분의 1을 Et2O (5mL)에서 취하고 무수 Et2O (5mL) 중 N,N 디메틸에틸렌디아민 (367 μL, 3.4 mmol)의 냉각된 (0 ℃) 용액에 부가했다. 교반 (20 분) 후, 혼합물을 여과하고, 농축하고 크로마토그래피 (100% EtOAc)를 수행하여 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,15-디엔-10-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카바메이트 26 (603 mg, 64%)을 맑은, 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.28 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (400MHz, CDCl3, δH) 5.45-5.36 (m, 6H), 5.30 (br s, 1H), 4.89-4.78 (m, 1H), 3.32-3.21 (m, 2H), 2.42 (t, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.16-1.94 (m, 12H), 1.63-1.19 (m, 29H), 0.92 (t, 9H).
화합물 27의 합성
Figure pct00070
((6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,15-디엔-10-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카바메이트 26의 합성에서 제조된 바와 같은) 클로로포르메이트 (0.88 g, 1.7 mmol)의 냉각된 (0 ℃) 용액을 무수 Et2O (5mL)에서 용해시키고 무수 Et2O (5mL) 중 N,N 디메틸프로필디아민 (422 μL, 3.4 mmol)의 용액에 부가했다. 완료 시 (20 min), 용액을 여과하고, 농축하고 그 다음 미가공의 물질을 칼럼 크로마토그래피 (100% EtOAc)로 정제하여 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,15-디엔-10-일 (3-(디메틸아미노)프로필)카바메이트 27 (675 mg, 70%)을 맑은, 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.32 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (400MHz, CDCl3, δH) 5.44-5.33 (m, 6H), 4.86-4.78 (m, 1H), 3.32-3.21 (m, 2H), 2.36 (t, 2H), 2.24 (s, 6H), 2.14-1.97 (m, 12H), 1.69 (app. p, 2H), 1.61-1.50 (m, 3H), 1.50-1.20 (m, 27H), 0.91 (t, 9H).
화합물 28의 합성
Figure pct00071
클로로포르메이트 (0.88 g, 1.7 mmol) ((6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,15-디엔-10-일 (2-(디메틸아미노)에틸)카바메이트 26의 합성에서 제조된 바와 같은)의 냉각된 (0 ℃) 용액을 무수 Et2O (5mL)에서 용해시키고 무수 Et2O (5mL) 중 N,N,N' 트리메틸프로필디아민 (492 μL, 3.4 mmol)의 용액에 부가했다. 완료 시 (20 분), 용액을 여과하고, 농축하고 그 다음 미가공의 물질을 칼럼 크로마토그래피 (100% EtOAc)로 정제하여 (6Z,15Z)-11-((Z)-데크-4-엔-1-일)헤니코사-6,15-디엔-10-일 (3-(디메틸아미노)프로필)(메틸) 카바메이트 28 (672 mg, 68%)을 맑은, 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.44 (10% MeOH/CH2Cl2); 1H NMR (400MHz, CDCl3, δH) 5.43-5.32 (m, 6H), 4.85 (br. s, 1H), 3.38-3.27 (m, 2H), 2.95-2.87 (m, 3H), 2.28 (t, 2H), 2.24 (s, 6H), 2.14-1.96 (m, 12H), 1.72 (app. p, 2H), 1.67-1.49 (m, 3H), 1.49-1.20 (m, 26H), 0.91 (t, 9H).
화합물 30 및 31에 대한 합성 도식
Figure pct00072
화합물 29의 합성
Figure pct00073
100 mL 동근바닥 플라스크에 마그네슘 조각 (263 mg, 10.9 mmol) 및 교반바를 충전했다. 플라스크를 히팅 건으로 5 분 동안 건조하고, 질소 하에서 냉각한 후 THF (5 mL) 및 요오드의 작은 그레인을 부가했다. THF (5 mL) 중 (Z)-1-브로모데크-4-엔 3 (2 g, 9.1 mmol)의 용액을 서서히 부가했다. 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고 그 다음 에틸 글리옥살레이트 (0.375 mL, 1.82 mmol, 톨루엔 중 50% 용액)을 부가했다. 완료 시, 용액을 포화된 암모늄 클로라이드 용액 (5 mL) 로 켄칭하고 과잉 마그네슘이 용해될 때까지 교반했다. 용액을 물로 희석하고 에틸 아세테이트 (3 x 50 mL)으로 추출했다. 조합된 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산 내지 헥산 중 20% EtOAc)로 정제하여 (6Z,16Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11,12-디올 29을 무색 오일로서 얻었다 (700 mg, 48%).
화합물 30의 합성
Figure pct00074
6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 9의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11,12-디올 (0.35 g, 0.7 mmol), 4-(디메틸아미노)부탄산 하이드로클로라이드 (0.20 g, 1.1 mmol), EDCI (0.20 g, 1.1 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.3 g, 2.2 mmol) 및 DMAP (5 mg, 촉매)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 30을 무색 오일로서 수득했다 (0.10 g, 25%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.44-5.28 (m, 6H), 5.03-4.95 (m, 1H), 2.25-2.17 (m, 6H), 2.14-1.65 (m, 14H), 1.65-1.10 (m, 33H), 0.93-0.82 (m, 9H). Rf 0.2 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 31의 합성
Figure pct00075
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 9의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-11-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11,12-디올 (1.0 g, 2.1 mmol), 4-(디메틸아미노)부탄산 하이드로클로라이드 (0.50 g, 3.1 mmol), EDCI (0.60 g, 3.1 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.80 g, 6.3 mmol) 및 DMAP (5 mg, 촉매)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)-12-하이드록시도코사-6,16-디엔-11-일 3-(디메틸아미노)프로파노에이트 31을 무색 오일로서 수득했다 (0.4 g, 33%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40-5.28 (m, 6H), 5.12-5.07 (m, 1H), 4.75-4.55 (bs, 1H), 2.77-2.65 (m, 1H), 2.65-2.41 (m, 3H), 2.28-2.15 (m, 6H), 2.15-1.92 (m, 12H), 1.67-1.10 (m, 30H), 0.93-0.82 (m, 9H). Rf 0.5 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 40에 대한 합성 도식
Figure pct00076
화합물 33의 합성
Figure pct00077
2의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-논-3-엔-1-올 32 (25.0 g, 176 mmol), 트리에틸아민 (25.0 mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (27.2 mL, 352 mmol)로부터 (Z)-논-3-에닐 메탄설포네이트 33을 황색 오일로서 수득했다 (33 g, 85%). Rf 0.68 (CH2Cl2).
화합물 34의 합성
Figure pct00078
3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-논-3-에닐 메탄설포네이트 (25.7 g, 117 mmol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (52.6 g, 163mmol)로부터 (Z)-논-3-에닐 브로마이드 34을 황색 오일로서 수득했다 (20.2 g, 85%). Rf 0.73 (헥산).
화합물 35의 합성
Figure pct00079
4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-논-3-에닐 브로마이드 (15.8 g, 76.8 mmol), 마그네슘 조각 (2.0 g, 82 mmol), 에틸 포르메이트 (6.36 mL, 79.1 mmol) 및 칼륨 하이드록사이드 (3.88 g, 69.1 mmol)로부터. Rf 0.43 (10% EtOAc-헥산)으로부터 (6Z,13Z)-노나데카-6,13-디엔-10-올 35 (9.11 g, 85%)을 무색 오일로서 수득했다.
화합물 36의 합성
Figure pct00080
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,13Z)-노나데카-6,13-디엔-10-올 (9.11 g, 32.5 mmol), 트리에틸아민 (10 mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (5.0 mL, 65 mmol)로부터 (6Z,13Z)-노나데카-6,13-디엔-10-일 메탄설포네이트 36 (11.6g, 99%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.73 (CH2Cl2).
화합물 37의 합성
Figure pct00081
6의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,13Z)-노나데카-6,13-디엔-10-일 메탄설포네이트 (11.6 g, 32.3 mmol) 및 나트륨 시아나이드 (3.96 g, 80.9 mmol)으로부터 (Z)-2-((Z)-논-3-엔-1-일)운덱-5-엔니트릴 37 (7.2 g, 77%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.75 (10% EtOAc-헥산).
화합물 38
Figure pct00082
7의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-2-((Z)-논-3-엔-1-일)운덱-5-엔니트릴 (7.2 g, 24.9 mmol) 및 DIBAL (헥산 중 1M 용액으로서 49.7 mL, 49.7 mmol)로부터 (Z)-2-((Z)-논-3-엔-1-일)운덱-5-에날 38 (5.0 g, 69%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.69 (10 EtOAc-헥산).
화합물 39의 합성
Figure pct00083
8의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-2-((Z)-논-3-엔-1-일)운덱-5-에날 (1.5 g, 5.1 mmol), (Z)-논-3-에닐 브로마이드 (1.58 g, 7.7 mmol) 및 마그네슘 조각 (206 mg, 8.5 mmol)로부터 (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-올 39 (1.64 g, 76%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.46 (10% EtOAc-헥산).
화합물 40의 합성
Figure pct00084
9의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-올 (500 mg, 1.19 mmol), EDC (686 mg, 3.58 mmol), 휘니그 염기 (726 μL, 4.17mmol) 및 N,N 디메틸아미노부티르산 하이드로클로라이드 (600 mg, 3.58 mmol)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 40 (483 mg, 76%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.43 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 42에 대한 합성 도식
Figure pct00085
화합물 41의 합성
Figure pct00086
10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-올 (500mg, 1.19mmol), EDC (686 mg, 3.58mmol) 및 5-브로모발레르산 (649 mg, 3.58mmol)로부터 (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-일 5-브로모펜타노에이트 41 (655 mg, 95%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.54 (5% EtOAc-헥산).
화합물 42의 합성
Figure pct00087
11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-일 5-브로모펜타노에이트 (655 mg, 1.13mmol) 및 디메틸아민 (EtOH 중5.6M 용액으로서 25 mL)로부터 (6Z,14Z)-11-((Z)-논-3-엔-1-일)아이코사-6,14-디엔-10-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 42 (421 mg, 68%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.4 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 50에 대한 합성 도식
Figure pct00088
화합물 44의 합성
Figure pct00089
4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 브로모데칸 (9.4 mL, 45.2mmol), 마그네슘 조각 (1.18 g, 48.4mmol), 에틸 포르메이트 (3.74 mL, 46.6mmol) 및 칼륨 하이드록사이드 (2.28 g, 40.7mmol)로부터. Rf 0.36 (10% EtOAc-헥산)으로부터 헤니코산-11-올 44 (7.06 g, 99%)을 무색 오일로서 수득했다. FW 312.57, C21H44O.
화합물 45의 합성
Figure pct00090
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 헤니코산-11-올 (7.06 g, 22.6mmol), 트리에틸아민 (22mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (3.5 mL, 45mmol)로부터 헤니코산-11-일 메탄설포네이트 45 (6.87 g, 78%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.86 (CH2Cl2).
화합물 46의 합성
Figure pct00091
6의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 헤니코산-11-일 메탄설포네이트 (6.87 g, 17.6mmol) 및 나트륨 시아나이드 (4.31 g, 87.9mmol)로부터 2-데실도데칸니트릴 46 (2.25 g, 40%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.84 (10% EtOAc-헥산).
화합물 47의 합성
Figure pct00092
7의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2-데실도데칸니트릴 (2.25 g, 7.0mmol) 및 DIBAL (14 mL, 헥산 중 1M 용액으로서, 14mmol)로부터 2-데실도데칸알 47 (1.91 g, 84%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.51 (5% EtOAc-헥산).
화합물 48의 합성
Figure pct00093
8의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2-데실도데칸알 (1.91 g, 5.87mmol), (Z)-데크-4-에닐 브로마이드 (1.45 g, 7.05mmol) 및 마그네슘 조각 (183 mg, 7.54mmol)로부터 (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-올 48 (1.08 g, 40%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.26 (10% EtOAc-헥산).
화합물 49의 합성
Figure pct00094
10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-올 (1.08 g, 2.33mmol), EDC (804 mg, 4.19mmol) 및 5-브로모발레르산 (1.27 g, 6.99mmol)로부터 (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 49 (916 mg, 63%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.29 (5% EtOAc-헥산).
화합물 50의 합성
Figure pct00095
11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 (916 mg, 1.16mmol) 및 디메틸아민 (EtOH 중 5.6M 용액으로서 27 mL)로부터 (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 50 (662 mg, 80%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.51 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 53에 대한 합성 도식
Figure pct00096
화합물 51의 합성
Figure pct00097
8의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7 (3.6 g, 11.2mmol), 1-브로모데칸 (3.5 mL, 16.9mmol) 및 마그네슘 조각 (438 mg, 18.0mmol)로부터 (Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코스-16-엔-11-올 51 (3.37 g, 65%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.31 (5% EtOAc-헥산).
화합물 52의 합성
Figure pct00098
10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코스-16-엔-11-올 (3.37 g, 7.29mmol), EDC (2.51 g, 13.1mmol) 및 5-브로모발레르산 (3.96 g, 21.8mmol)로부터 (Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코스-16-엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 52 (4.69 g, 99%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.56 (5% EtOAc-헥산).
화합물 53의 합성
Figure pct00099
11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 (1.0 g, 1.6mmol) 및 디메틸아민 (EtOH 중 5.6M 용액으로서 30 mL)로부터 (Z)-12-데실도코스-6-엔-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 53 (943 mg, 99%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.50 (10% CH3OH-CH2Cl2).
실시예 2
본 실시예는, 쥣과 siRNA 활성 모델에서의 효과를, 본 발명의 단쇄 트리알킬 지질과, 긴 알킬 쇄를 가지지만 단쇄 트리알킬 지질과 구조적으로 동일한 지질에서 비교한다.
양이온성 지질을 포함하는 핵산-지질 입자 제형은 7 내지 9주 연령의 암컷 BALB/c 마우스의 간에서 ApoB 발현을 녹다운시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 마우스는 세 그룹에 0.02, 0.03 또는 0.05 ㎎/㎏으로 정맥(꼬리 정맥) 내 투여하였다. (하우스키핑(housekeeping) 유전자 GAPDH로 정규화된) ApoB 녹다운을 음성 대조군으로 PBS에 대하여 측정하였다. 각 실험은 투여 48 시간 후에 종료되었다.
양성 대조군과 비교하기 위해, 본 발명의 단쇄 트리알킬 지질의 성능을, 핵산-지질 입자에 생체내 핵산 전달을 용이하게 하는 것으로 알려진 C2K라고 하는 잠재적 양이온성 지질과 비교하였다(문헌[Nature Biotech., Vol 28(2),172 (2010)]). C2K은 다음과 같은 구조를 가지고 있다:
Figure pct00100
표 1에 나타낸 바와 같이, 0.02 mg/kg의 투여 용량에서, 본 발명의 양이온성 지질 11개 중 10개(화합물 9, 13, 14, 19, 22, 27, 40, 42, 50 및 53)은 C2K보다 더 큰 활성을 나타내었다.
본 발명의 다양한 트리알킬 양이온성 지질에 대한 ApoB 사일런싱(0.02 mg/kg siRNA).
siRNA 용량 화합물 PBS 대조군에 대한 ApoB 유전자 사일런싱
(간 ApoB:GAPD mRNA 비)
0.02 mg/kg C2K -61%
9 -73%
13 -80%
14 -69%
19 -79%
22 -79%
24 -48%
27 -68%
40 -80%
42 -77%
50 -72%
53 -78%
표 2에 나타낸 바와 같이, 별도의 실험에서, 0.03 mg/kg으로 주입된 투여량에서, 본 발명의 화합물의 양이온성 지질 7개 중 5개(화합물 11, 13, 19, 23 및 25)는 C2K보다 큰 활성을 나타내었다.
다양한 단쇄 트리알킬 양이온성 지질에 대한 ApoB 사일런싱(0.03 ㎎/㎏ siRNA)
siRNA 용량 화합물 PBS 대조군에 대한 ApoB 유전자 사일런싱
(간 ApoB:GAPD mRNA 비)
0.03 mg/kg C2K -54%
9 -49%
11 -78%
13 -84%
19 -87%
23 -80%
25 -63%
30 -30%
본 발명의 양이온성 지질의 활성을 또한 알킬 쇄가 긴 것을 제외하고는 본 발명의 지질과 구조적으로 동일한 상응하는 트리알킬 양이온성 지질과 비교하였다. 이들 장쇄 트리알킬 양이온성 지질의 구조(화합물 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60으로 확인됨)를 표 3에 나타내었다.
장쇄 트리알킬 양이온성 지질의 구조
Figure pct00101
54
Figure pct00102
55
Figure pct00103
56
Figure pct00104
57
Figure pct00105
58
Figure pct00106
59
Figure pct00107
60
화합물 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60은 그 전체가 참고로 본원에 인용된 2011년 9월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제13/235,253호에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 장쇄 지질 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60을 0.05 mg/kg(표 1에 기재된 투여량의 2.5배)으로 투여하였고, C2K에 대한 60%에 비해 +25% 내지 -69%에 이르는 ApoB 녹다운을 나타내었다(즉, 몇몇 화합물은 C2K에 대해 보통으로 개선되었음을 나타내었다).
다양한 트리리놀레일 양이온성 지질에 대한 ApoB 사일런싱(0.05 ㎎/㎏ siRNA)
siRNA 용량 화합물 PBS 대조군에 대한 ApoB 유전자 사일런싱
(간 ApoB:GAPD mRNA 비)
0.05 mg/kg C2K -60%a
54 -6%
55 -28%
56 -23%
57 +25%
58 -62%
59 -69%
60 -63%
a 4회 실험에 대한 평균 ApoB 사일런싱
일반적으로, 본 발명의 단쇄(C9 내지 C10) 트리알킬 양이온성 지질의 활성은 대응 지질인 상응하는 장쇄 트리리놀레일(C18)과 비교하는 경우에 실질적으로 개선되었다. 예를 들어, 화합물 13과 그 트리리놀레일 변이체 54와의 직접적 비교는, 화합물 13이 2.5배 더 낮게 투여되었다는 사실에도 불구하고, ApoB 녹다운에 있어서 -6%(0.05 mg/kg) 내지 -80%(0.02 mg/kg)의 개선을 보였다. 동일한 추세가 화합물 55와 11, 56과 24 및 57과 25를 비교하는 경우에 관찰되었다.
실시예 3
ApoB 쥣과 모델에서의 추가 실험은 양성 대조군으로서 다른 양이온성 지질을 사용하였다; DLin-MP-DMA. DLin-MP-DMA는 특허 출원 WO 2011/141705에 기재되어 있고 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00108
표 5에 나타낸 바와 같이, 동일한 쥣과 ApoB 모델에서, DLin-MP-DMA는 3개의 별도 실험에서 C2K보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 따라서 유효한 양성 대조군이었다:
양성 대조군으로서 C2K 및 Dlin-MP-DMA의 비교
siRNA 용량 화합물 PBS 대조군에 대한 ApoB 유전자 사일런싱 (간 ApoB:GAPD mRNA 비)
실험 1 0.03 mg/kg C2K -51%
DLin-MP-DMA -69%
실험 2 0.05 mg/kg C2K -59%
DLin-MP-DMA -65%
실험 3 0.03 mg/kg C2K -54%
DLin-MP-DMA -62%
또 다른 실험에서, 본 발명의 2개 지질(화합물 62 및 71)을 siRNA를 가진 지질 나노입자로 더 제형화하여 ApoB를 표적화하였다. 마우스를 정맥(꼬리 정맥)내 투여하고 투여 후 48시간 뒤에 희생시켰다. 간을 수집하고 균질화한 다음, (하우스키핑 유전자 GAPDH로 정규화된) ApoB 사일런싱 수준을 퀀티진(Quantigene) 분석을 통해 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내고, PBS 처리된 음성 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 이 실험에 사용된 siRNA 서열은 상이하였고 실시예 2에 사용된 것보다 덜 잠재적이었다. 따라서, 상호 실험 비교는 불가능하였다.
본 발명의 다양한 트리알킬 양이온성 지질에 대한 ApoB 사일런싱
siRNA 용량 화합물 PBS 대조군에 대한 ApoB 유전자 사일런싱
(간 ApoB:GAPD mRNA 비)
0.04 mg/kg DLin-MP-DMA -32%
화합물 62 -56%
화합물 71 -29%
화합물 71은 DLin-MP-DMA 대조군과 유사한 활성을 가졌다. 화합물 62는 상당히 큰 활성을 가졌다. 이들 및 다른 화합물의 합성은 실시예 4에 기재되어 있다.
실시예 4
본 실시예는 본 발명의 추가 화합물의 합성을 기재한다.
화합물 62에 대한 합성 도식
Figure pct00109
화합물 61의 합성
Figure pct00110
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (1.12 g, 2.43mmol), 트리에틸아민 (8mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (0.38 mL, 4.9mmol)로부터 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-일 메탄설포네이트 61 (1.18 g, 90%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.91 (CH2Cl2).
화합물 62의 합성
Figure pct00111
톨루엔 (30mL) 중 메실레이트 61 (1.09g, 2.01mmol)의 용액을 N,N-디메틸아미노부탄올 (1.34mL, 10.1mmol) 및 NaH (오일 중 60% 분산물로서 442mg, 11.1mmol)로 연속하여 처리했다. 일단 가스 방출이 멈추면 반응 혼합물을 환류 (115 ℃ 배쓰 온도)시키고 교반했다 (50 시간). 그 다음 반응 혼합물을 냉각 (실온)하고 냉수에 붓고 그 다음 EtOAc로 추출했다. 조합된 유기물을 물 및 염수로 세정하고, 건조하고 (Na2SO4), 여과하고, 농축하고 크로마토그래피 (100% EtOAc)를 통해 정제하여 4-(((6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-일)옥시)-N,N-디메틸부탄-1-아민 62 (143mg, 13%)을 담황색 오일로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41-5.30 (m, 6H), 3.46-3.35 (m, 2H), 3.19-3.14 (m, 1H), 2.34 (t, 2H), 2.24 (s, 6H), 2.10-1.93 (m, 12H), 1.60-1.09 (m, 35H), 0.90 (t, 9H). Rf 0.54 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 71에 대한 합성 도식
Figure pct00112
화합물 63의 합성
Figure pct00113
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 3,7-디메틸옥탄-1-올 (5.0 g, 31.6mmol), 트리에틸아민 (8mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (4.89 mL, 63.2mmol)로부터 3,7-디메틸옥틸 메탄설포네이트 63 (7.47 g, >99%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.69 (CH2Cl2).
화합물 64의 합성
Figure pct00114
3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 3,7-디메틸옥틸 메탄설포네이트 63 (7.47 g, 31.6 mmol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (13.2 g, 41.1 mmol)로부터 1-브로모-3,7-디메틸옥탄 64을 무색 오일로서 수득했다 (6.0 g, 86%). Rf 0.92 (헥산).
화합물 65의 합성
Figure pct00115
4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 1-브로모-3,7-디메틸옥탄 64 (10 g, 45.2 mmol), 마그네슘 조각 (1.21 g, 49.8 mmol), 에틸 포르메이트 (3.8 mL, 47.5 mmol) 및 칼륨 하이드록사이드 (3.8 g, 67.8 mmol)로부터 2,6,12,16-테트라메틸헵타데칸-9-올 65 (7.0 g, 정량적)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.38 (10% EtOAc-헥산).
화합물 66의 합성
Figure pct00116
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2,6,12,16-테트라메틸헵타데칸-9-올 65 (1.39 g, 5.14mmol), 트리에틸아민 (3mL) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (0.8 mL, 10.3mmol)로부터 2,6,12,16-테트라메틸헵타데칸-9-일 메탄설포네이트 66 (1.56 g, 87%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.8 (CH2Cl2).
화합물 67의 합성
Figure pct00117
6의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2,6,12,16-테트라메틸헵타데칸-9-일 메탄설포네이트 66 (1.56 g, 4.48 mmol) 및 나트륨 시아나이드 (0.55 g, 11.2 mmol)로부터 2-(3,7-디메틸옥틸)-5,9-디메틸데칸니트릴 67 (0.8 g, 56%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.8 (10% EtOAc-헥산).
화합물 68의 합성
Figure pct00118
7의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2-(3,7-디메틸옥틸)-5,9-디메틸데칸니트릴 67 (0.8 g, 2.49 mmol) 및 DIBAL (헥산 중 1M 용액으로서 5.74 mL, 5.74 mmol)로부터 2-(3,7-디메틸옥틸)-5,9-디메틸데칸알 68 (0.63 g, 78%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.6 (10% EtOAc-헥산).
화합물 69의 합성
Figure pct00119
8의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 2-(3,7-디메틸옥틸)-5,9-디메틸데칸알 68 (0.6 g, 1.85 mmol), 1-브로모-3,7-디메틸옥탄 64 (2.0 g, 9.0 mmol) 및 마그네슘 조각 (232 mg, 9.67 mmol)로부터 10-(3,7-디메틸옥틸)-2,6,13,17-테트라메틸옥타데칸-9-올 69 (0.53 g, 62%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.37 (10% EtOAc-헥산).
화합물 70의 합성
Figure pct00120
10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 10-(3,7-디메틸옥틸)-2,6,13,17-테트라메틸옥타데칸-9-올 69 (200mg, 0.43mmol), EDC (246 mg, 1.28mmol) 및 5-브로모발레르산 (246 mg, 1.28mmol)로부터 10-(3,7-디메틸옥틸)-2,6,13,17-테트라메틸옥타데칸-9-일 5-브로모펜타노에이트 68 (450 mg, 조물질)을 황색 오일로서 수득했다. Rf 0.49 (5% EtOAc-헥산).
화합물 71의 합성
Figure pct00121
11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 10-(3,7-디메틸옥틸)-2,6,13,17-테트라메틸옥타데칸-9-일 5-브로모펜타노에이트 68 (450 mg 조물질) 및 디메틸아민 (EtOH 중 2.0M 용액으로서 10 mL)로부터10-(3,7-디메틸옥틸)-2,6,13,17-테트라메틸옥타데칸-9-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 71 (184 mg, 72% 2 단계)을 무색 오일로서 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.95-4.87 (m, 1H), 2.33 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 2.23 (s, 6H), 1.74-1.60 (m, 4H), 1.58-0.99 (m, 37H), 0.93-0.79 (m, 27H). Rf 0.43 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 74에 대한 합성 도식
Figure pct00122
화합물 72의 합성
Figure pct00123
8의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7 (0.6 g, 1.87 mmol), 1-브로모-3,7-디메틸옥탄 64 (3.9 g, 17.5 mmol) 및 마그네슘 조각 (454 mg, 18.7 mmol)로부터 (Z)-10-((Z)-데크-4-엔-1-일)-2,6-디메틸아이코스-14-엔-9-올 72 (0.62 g, 72%)을 무색 오일로서 수득했다. Rf 0.61 (10% EtOAc-헥산).
화합물 73의 합성
Figure pct00124
10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-10-((Z)-데크-4-엔-1-일)-2,6-디메틸아이코스-14-엔-9-올 72 (620mg, 1.34mmol), EDC (500 mg, 2.6mmol) 및 5-브로모발레르산 (500 mg, 2.56mmol)로부터 (Z)-10-((Z)-데크-4-엔-1-일)-2,6-디메틸아이코스-14-엔-9-일 5-브로모펜타노에이트 73 (900 mg, 조물질)을 황색 오일로서 수득했다. Rf 0.72 (10% EtOAc-헥산).
화합물 74의 합성
Figure pct00125
11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-10-((Z)-데크-4-엔-1-일)-2,6-디메틸아이코스-14-엔-9-일 5-브로모펜타노에이트 73 (900 mg, 조물질) 및 디메틸아민 (EtOH 중2.0M 용액으로서 15 mL)로부터 (Z)-10-((Z)-데크-4-엔-1-일)-2,6-디메틸아이코스-14-엔-9-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 74 (466 mg, 58% 2 단계)을 무색 오일로서 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43-5.29 (m, 4H), 4.94-4.88 (m, 1H), 2.32 (t, 2H), 2.26 (t, 2H), 2.15 (s, 6H), 2.08-1.93 (m, 8H), 1.70-1.00 (m, 43H), 0.95-0.83 (m, 15H). Rf 0.42 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 76에 대한 합성 도식
Figure pct00126
화합물 75의 합성
Figure pct00127
5-브로모펜탄-1-올 (1.0g, 5.99mmol)의 용액을 디메틸아민 (10mL, EtOH 중 2M 용액으로서)로 밀봉된 용기에서 제조하고 가열했다 (80 ℃). 교반 (16 시간) 후 디메틸아민 및 EtOH를 감압 하에서 제거하여 5-(디메틸아미노)펜탄-1-올 하이드로브로마이드 75 (1.26g, 정량적)을 황색-오렌지 고체로서 얻었다. Rf 0.25 (10% CH3OH-CH2Cl2).
화합물 76의 합성
Figure pct00128
62의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-일 메탄설포네이트 61 (1.86 g, 3.45mmol), 5-(디메틸아미노)펜탄-1-올 하이드로브로마이드 75 (1.26g, 5.99mmol) 및 NaH (오일 중 60% 분산물로서 288 mg, 7.2mmol)로부터 5-(((6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-엔-1-일)도코사-6,16-디엔-11-일)옥시)-N,N-디메틸펜탄-1-아민 76 (864 mg, 37%)을 담황색 오일로서 수득했다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43-5.32 (m, 6H), 3.46-3.33 (m, 2H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.30-2.18 (m, 8H), 2.07-1.93 (m, 12H), 1.61-1.04 (m, 37H), 0.89 (t, 9H). Rf 0.47 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 79에 대한 합성 도식
Figure pct00129
화합물 77의 합성
Figure pct00130
무수 디클로로메탄 (125 mL) 중 (6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 8 (5 g, 10.9 mmol)의 냉각된 용액 (-15 ℃)에 질소 하에서 디에틸 아연 (헥산 중 1M, 82 mL, 81.8 mmol)을 20 분에 걸쳐 적가했다. 용액을 70 분 동안 0 ℃에서 교반하고 그 다음 디아이오도메탄 (6.6 mL, 81.8 mmol)을 주의 깊게 부가했다. 용액을 밤새 교반하고, 실온으로 따뜻해지도록 했다. 완료 시, 용액을 빙수 (350 mL)에 붓고 에틸 아세테이트 (450 mL) 로 희석했다. 그 다음 5% HCl (350 mL)을 부가하여 형성된 에멀젼이 완화되도록 했다. 유기 층을 NaHCO3 (포화 수성 500 mL), 물 (500 mL) 및 염수 (500 mL)로 세정했다. 조합된 수성 층들을 에틸 아세테이트로 역추출했다. 조합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조했다. 잔류물을 실리카겔상 칼럼 크로마토그래피 (2.헥산 중 5% 에틸 아세테이트)로 정제하여 분홍색으로 착색된 오일을 얻었다. 색상을 제거하기 위해 (I2), 정제된 생성물을 디클로로메탄 (150 mL)에서 용해시키고 Na2S2O3 (포화 수성 2 x 40mL)로 세정하여 1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필)프로필)옥탄-4-올 77을 담황색 오일로서 얻었다 (5.54 g, 96.5%).
화합물 78의 합성
Figure pct00131
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6 브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필)프로필)옥탄-4-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 (0.75 g, 1.5 mmol), 무수 디클로로메탄 (5.2ml), 6-브로모헥산산 (0.88 g, 4.5 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이마이드 하이드로클로라이드 (0.87 g, 4.5 mmol), 및 4-디메틸아미노피리딘 (5 mg)로부터1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필)프로필)옥탄-4-일 6-브로모헥사노에이트를 원유로서 수득했다. 생성물을 다음 단계에서 추가 정제없이 사용했다.
화합물 79의 합성
Figure pct00132
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필) 프로필)옥탄-4-일 6-브로모헥사노에이트 (1.0 g, 1.5 mmol) 및 에탄올 (3.5 ml) 중 2.0M 디메틸아민으로부터 오일 (0.56 g, 59%)로서 수득했다. Rf 0.50 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 83에 대한 합성 도식
Figure pct00133
화합물 80의 합성
Figure pct00134
무수 디클로로메탄 (500 mL) 중 2-옥틸도데칸-1-올 (20 g, 67.0 mmol)의 용액에 피리디늄 클로로크로메이트 (43.2 g, 200 mmol)을 부가했다. 용액을 3 시간 동안 실온에서 교반하고 그 다음 실리카의 패드를 통해 여과하고 디클로로메탄으로 용출하여 2-옥틸도데칸알 80을 무색 오일로서 얻었다 (10.5 g, 50%).
화합물 81의 합성
Figure pct00135
(6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-올 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 2-옥틸도데칸알 80 (0.5 g, 1.6 mmol), (Z)-1-브로모데세-4-엔 (0.7 g, 3.1 mmol), 마그네슘 (80 mg, 3.4 mmol), 무수 테트라하이드로푸란 (0.5 mL), 물 (2 mL), EtOH (2 mL) 및 KOH (0.2 g, 2.8 mmol)로부터 (Z)-12-옥틸도코스-6-엔-11-올 81을 무색 오일로서 수득했다 (0.67 g, 92%).
화합물 82의 합성
Figure pct00136
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6 브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-옥틸도코스-6-엔-11-올 81 (0.67 g, 1.5 mmol), 무수 디클로로메탄 (5 mL), 6-브로모헥산산 (0.80 g, 4.4 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이마이드 하이드로클로라이드 (0.85 g, 4.4 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (5 mg)로부터 (Z)-12-옥틸도코스-6-엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 82을 무색 오일로서 수득했다 (0.78 g, 85%). 생성물을 다음 단계에서 추가 정제없이 사용했다.
화합물 83의 합성
Figure pct00137
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (Z)-12-옥틸도코스-6-엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 82 (0.78 g, 1.3 mmol) 및 에탄올 (3 mL) 중 2.0M 디메틸아민으로부터(Z)-12-옥틸도코스-6-엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 83을 오일로서 수득했다 (103 mg, 14%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43-5.26 (m, 2H), 4.96-4.91 (m, 1H), 2.33 (t, 4H), 2.26 (s, 6H), 2.08-1.93 (m, 4H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.57-1.43 (m, 4H), 1.40-1.15 (m, 43H), 0.94-0.85 (m, 9H).
화합물 89에 대한 합성 도식
Figure pct00138
화합물 84의 합성
Figure pct00139
무수 디에틸 에테르 (350 mL) 중 (E)-에틸 데크-4-에노에이트 (20 g, 101 mmol)의 냉각된 용액 (0 ℃)에 리튬 알루미늄 하이드라이드 (8.9 g, 212 mmol)를 질소 하에서 부가했다. 용액을 1 시간 동안 실온에서 교반하고 그 다음 0 ℃로 냉각하고 5M NaOH (30 mL)로 서서히 켄칭하고 에틸 에테르 (100mL) 로 희석했다. 용액을 30 분 동안 교반하고 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축 건조하여 (E)-데크-4-엔-1-올 84을 오일로서 얻었다 (16.1 g, 정량적).
화합물 85의 합성
Figure pct00140
(Z)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 2의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (E)-데크-4-엔-1-올 (16.1 g, 94.7 mmol), 트리에틸아민 (15.5 mL, 111.7 mmol) 및 메탄 설포닐 클로라이드 (15.6 mL, 201.7 mmol)로부터 (E)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 85를 오렌지색 오일로서 수득했다 (32.7 g). Rf 0.65 (100% CH2Cl2).
화합물 86의 합성
Figure pct00141
(Z)-1-브로모데크-4-엔 3의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (E)-데크-4-에닐 메탄설포네이트 85 (23.5 g, 94.7 mmol), 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (40.0 g, 124.1 mmol)로부터 (E)-1-브로모데크-4-엔 86을 오일로서 수득했다 (17.9 g, 81%). Rf 0.85 (10% EtOAc-헥산).
화합물 87의 합성
Figure pct00142
(6Z,15Z)-헤니코사-6,15-디엔-11-올 4의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (E)-1-브로모데크-4-엔 86 (1.7 g, 7.8 mmol), 마그네슘 조각 (0.19 g, 7.8 mmol), (Z)-2-((Z)-데크-4-에닐)도데크-6-에날 7 (1.25 g, 3.9 mmol) 및 칼륨 하이드록사이드 (0.66 g, 11.7 mmol)로부터 (6E,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 87을 오일로서 수득했다 (1.28 g, 71%). Rf 0.43 (10% EtOAc-헥산).
화합물 88의 합성
Figure pct00143
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-브로모헥사노에이트 10의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6E,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-올 87 (1.28 g, 2.8 mmol), 및 5-브로모-n-발레르산 (1.00 g, 5.6 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이마이드 하이드로클로라이드 (1.06 g, 5.6 mmol), 디이소프로필에틸아민 (1.1 g, 83.0 mmol) 및 디메틸아미노피리딘 (10 mg)로부터 (6E,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 88을 오일로서 수득했다 (1.36 g, 78%).
화합물 89의 합성
Figure pct00144
(6Z,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 6-(디메틸아미노)헥사노에이트 11의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, (6E,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 5-브로모펜타노에이트 88 (1.36 g, 2.2 mmol), 및 에탄올 (5 mL) 중 2 M 디메틸아민으로부터(6E,16Z)-12-((Z)-데크-4-에닐)도코사-6,16-디엔-11-일 5-(디메틸아미노)펜타노에이트 89을 오일로서 수득했다 (0.45 g, 35%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45-5.28 (m, 6H), 4.96-4.91 (m, 1H), 2.34-2.25 (m, 2H), 2.06-1.90 (m, 12H), 1.68-1.61 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 5H), 1.45-1.16 (m, 28H), 0.95-0.84 (m, 9H). Rf 0.46 (10% MeOH-CH2Cl2).
화합물 90에 대한 합성 도식
Figure pct00145
화합물 89의 합성
Figure pct00146
5의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필)프로필)옥탄-4-일 메탄설포네이트 89를 무색 오일로서 수득했다.
화합물 90의 합성
Figure pct00147
62의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여, 5-((1,8-비스(2-펜틸사이클로프로필)-5-(3-(2-펜틸사이클로프로필)프로필)옥탄-4-일)옥시)-N,N-디메틸펜탄-1-아민 90 (580 mg)을 담황색 오일로서 수득했다. Rf 0.48 (10% MeOH-CH2Cl2).
상기 설명은 예시적이지만 제한적인 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 많은 구현예는 상기 설명을 읽어보면 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 설명에 대한 언급으로 결정되지 않지만, 대신에 그와 같은 청구항이 자격을 준 동등물의 전제 범위와 함께 부가된 청구항들에 대한 언급으로 결정되어야 한다. 본원에서 기재된 특허 출원, 특허들, PCT 공보, 및 유전자은행 수납 번호 및 서열을 포함하는 모든 논문 및 참조문헌의 개시내용은 본원에 참조로 다목적으로 편입되어 있다.

Claims (39)

  1. 하기 구조 식 (I)을 갖는 지질 또는 그의 염:
    X-A-Y-Z;
    (I)
    상기에서:
    X는 알킬아미노이고;
    A는 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬이고, 상기 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬은 포화 또는 불포화될 수 있고, 상기 A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고;
    Y는 케탈, 에스테르, 임의로 치환된 카바메이트, 에테르, 및 임의로 치환된 아마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    Z는 3 개의 알킬 사슬로 이루어진 소수성 모이어티이고, 여기서 상기 각각의 알킬 사슬은 C8 내지 C11의 길이를 가지며, 여기서 상기 각각의 3 개의 알킬 사슬은 독립적으로 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 각각의 3 개의 알킬 사슬은 임의로 치환된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 각각의 알킬 사슬은 C9 내지 C10의 길이를 갖는 지질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 알킬 사슬 중 적어도 하나는 이중 결합을 갖는 지질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 알킬 사슬 중 적어도 하나는 시스 이중 결합을 갖는 지질.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 알킬 사슬 중 적어도 하나는 사이클로알킬 모이어티를 포함하는 지질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 X는 디메틸아미노, 디에틸아미노 및 에틸메틸아미노로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 A는 존재하는 지질.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 Y는 에스테르 또는 케탈인 지질.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 Y는 임의로 치환된 카바메이트인 지질.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 Y는 에테르인 지질.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 Y는 임의로 치환된 아마이드인 지질.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 Z는 하기 식을 갖는 지질:
    Figure pct00148

    상기 식에서, R1, R2, 및 R3 은 각각 독립적으로 C8 내지 C11 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 포화 또는 불포화될 수 있고, 여기서 상기 각각의 R1, R2, 및 R3은 임의로 치환된다.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 지질은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질:
    Figure pct00149

    화합물 9,
    Figure pct00150

    화합물 11,
    Figure pct00151

    화합물 13,
    Figure pct00152

    화합물 14,
    Figure pct00153

    화합물 19,
    Figure pct00154

    화합물 21,
    Figure pct00155

    화합물 22,
    Figure pct00156

    화합물 23,
    Figure pct00157

    화합물 24,

    Figure pct00158

    화합물 25,
    Figure pct00159

    화합물 26,
    Figure pct00160

    화합물 27,
    Figure pct00161

    화합물 28,
    Figure pct00162

    화합물 30,

    화합물 31,
    Figure pct00164

    화합물 40,
    Figure pct00165

    화합물 42,
    Figure pct00166

    화합물 50,
    Figure pct00167

    화합물 53,
    Figure pct00168

    화합물 62,
    Figure pct00169

    화합물 71,
    Figure pct00170

    화합물 74,
    Figure pct00171

    화합물 76,
    Figure pct00172

    화합물 79,
    Figure pct00173

    화합물 83,
    Figure pct00174

    화합물 89, 및
    Figure pct00175

    화합물 90.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 하나의 항의 지질을 포함하는 지질 입자.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 입자는 추가로, 비-양이온성 지질을 포함하는 지질 입자.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 비-양이온성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 또는 인지질과 콜레스테롤의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질 입자.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoyl-phosphatidylcholine, DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 또는 그의 혼합물을 포함하는 지질 입자.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 콜레스테롤은 콜레스테롤 유도체인 지질 입자.
  19. 청구항 14 내지 청구항 18 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 입자는 추가로, 입자들의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질을 포함하는 지질 입자.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 입자들의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질은 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질 콘쥬게이트를 포함하는 지질 입자.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 PEG-지질 콘쥬게이트는 PEG-디아실글리세롤 (PEG-DAG) 콘쥬게이트, PEG-디알킬옥시프로필 (PEG-DAA) 콘쥬게이트, 또는 그의 혼합물을 포함하는 지질 입자.
  22. 청구항 14 내지 청구항 21 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 입자는 치료제를 추가로 포함하는 지질 입자.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 치료제는 핵산인 지질 입자.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 핵산은 간섭 RNA인 지질 입자.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 간섭 RNA는 작은 간섭 RNA (siRNA), 비대칭 간섭 RNA (aiRNA), microRNA (miRNA), 다이서(Dicer)-기질 dsRNA, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 그의 혼합물들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질 입자.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 간섭 RNA는 siRNA인 지질 입자.
  27. 청구항 22에 있어서, 상기 치료제는 37℃에서 30 분 동안 혈청 중 입자의 인큐베이션 후에 실질적으로 분해되지 않는 지질 입자.
  28. 청구항 22에 있어서, 상기 치료제는 입자로 완전히 캡슐화된 것인 지질 입자.
  29. 청구항 22에 있어서, 상기 입자는 약 5:1 내지 약 15:1의 지질:치료제 질량비를 갖는 지질 입자.
  30. 청구항 14 내지 청구항 29 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm의 중앙 직경을 갖는 지질 입자.
  31. 청구항 14 내지 청구항 30 중 어느 하나의 항의 지질 입자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 치료제를 세포에 도입하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 청구항 14의 지질 입자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 세포는 포유동물에 있는 것인 방법.
  34. 포유동물에게 청구항 14의 지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 치료제의 생체내 전달 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 투여는 경구, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 및 진피내로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  36. 청구항 34에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  37. 포유동물에게 치료적 유효량의 청구항 14의 지질 입자를 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 바이러스성 감염, 간 질환 또는 장애, 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  39. 청구항 37에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
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