KR20140106716A - 항-ｔａｔ２２６ 항체 및 면역컨쥬게이트 - Google Patents

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KR20140106716A
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antibody
seq
amino acid
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tat226
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KR1020147020073A
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웨이-칭 리앙
지에 사까나까
얀 유
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제넨테크, 인크.
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Abstract

항-TAT226 항체 및 그의 면역컨쥬게이트를 제공한다. 항-TAT226 항체 및 그의 면역컨쥬게이트를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-ＴＡＴ２２６ 항체 및 면역컨쥬게이트 {ANTI-TAT226 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES}
본원은 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨, 2006년 3월 17일 출원된 미국 특허 가출원 60/783,746을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 항-TAT226 항체 및 그의 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 항-TAT226 항체 및 그의 면역컨쥬게이트를 사용하는 방법에 관한 것이다.
암 세포의 표면에 발현되는 폴리펩티드에 결합하는 항체는 효과적인 항암 치료제인 것으로 입증되었다. 상기 항체는 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)의 활성화; 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 항체에 의한 유도; 시토킨 방출의 향상; 및 세포자멸의 유도를 포함한 다양한 메카니즘을 통해 작용한다 (예를 들어, 문헌 [Cardarelli et al. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51:15-24] 참조). 예를 들어, HERCEPTIN(등록상표) 및 RITUXAN(등록상표) (모두 제넨테크 인크. (Genentech Inc., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) 제품)는 각각 유방암과 비-호지킨 (non-Hodgkin) 림프종을 치료하기 위해 성공적으로 사용되고 있는 항체이다. HERCEPTIN(등록상표)은 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 원형-종양유전자의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유래 인간화 모노클로날 항체이다. HER2 단백질 과다발현이 25-30%의 원발 유방암에서 관찰된다. RITUXAN(등록상표)은 정상 및 악성 B 림프구의 표면에서 발견되는 CD20 항원에 대해 작용하는 유전공학처리된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 상기 두 항체는 CHO 세포에서 재조합 방식으로 생산된다. HERCEPTIN(등록상표)은 적어도 부분적으로 혈관신생을 억제함으로써 작용하는 것으로 보이고 (Izumi et al. (2002) Nature 416:279-280), RITUXAN(등록상표)은 적어도 부분적으로 세포자멸을 유도함으로써 작용하는 것으로 보인다 (Cardarelli et al. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51: 15-24).
면역컨쥬게이트 또는 "항체-약물 컨쥬게이트"는 암의 치료에서 세포독성제의 국소 전달에 유용하다 (예를 들어, 문헌 ([Syrigos et al. (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172]); 미국 특허 4,975,278 참조). 면역컨쥬게이트는 종양으로의 약물 모이어티 (moiety)의 표적화 전달을 허용하는 반면, 컨쥬게이팅되지 않은 세포독성제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (문헌 ([Baldwin et al. (Mar. 15, 1986) Lancet pp. 603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds.) pp. 475-506]) 참조). 세포 표면 폴리펩티드를 표적으로 하는 면역컨쥬게이트가 암 치료를 위해 개발되었고 계속 개발되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103] 참조).
진단 및/또는 치료 목적으로 세포 표면 폴리펩티드를 표적으로 하는 물질이 여전히 필요한 상태이다. 본원에 설명된 발명은 상기 필요성을 충족시키고, 다른 잇점을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문은 그 전문을 참고로 포함시킨다.
<발명의 개요>
본 발명은 항-TAT226 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, TAT226에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는
(1) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 11의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
다른 측면에서, TAT226에 결합하는 항체는
(a) 서열 11의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및
(b) (1) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(4) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(5) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 HVR을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2를 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 항체는 서열 6-10 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 14-18 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, HVR-H3은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 17의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, HVR-H3은 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 18의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2를 추가로 포함한다.
한 측면에서, TAT226에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는
(1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(4) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(5) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(6) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
다른 측면에서, TAT226에 결합하는 항체는
(a) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및
(b) (1) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(2) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(3) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(4) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(5) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 HVR을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1 및 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2를 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, 임의의 상기 항체는 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 및 VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크 중에서 선택되는 적어도 하나의 프레임워크를 추가로 포함한다.
한 측면에서, TAT226에 결합하는 항체가 제공되고, 여기서 항체는 서열 21-25 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 29의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 24의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열 29의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 25의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 30의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 25의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열 30의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, TAT226에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 서열 20의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 26의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열 26의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 임의의 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시태양에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵세포이다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 한 실시태양에서, 숙주 세포를 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항-TAT226 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 세포의 표면에 발현된 TAT226에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 75의 아미노산 21-115로부터의 TAT226의 구역 내의 에피토프에 결합한다. 한 실시태양에서, 세포는 암 세포이다. 한 실시태양에서, 암 세포는 난소암 세포, 뇌 종양 세포, 또는 윌름 (Wilms) 종양 세포이다.
특정 실시태양에서, 임의의 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 한 실시태양에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편 중에서 선택된 항체 단편이다. 한 실시태양에서, 항체는 인간화 항체이다. 한 실시태양에서, 항체는 인간 항체이다. 한 실시태양에서, 항체는 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6 중에서 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
한 측면에서, 생물학적 샘플을 TAT226에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 임의의 상기 항체와 접촉시키고, 항체와 TAT226 사이에 복합체가 형성되는지 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플 내에서 TAT226의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 생물학적 샘플은 난소 종양 세포, 뇌 종양 세포, 또는 윌름 종양 세포를 포함한다.
한 측면에서, 시험 세포를 임의의 상기 항체와 접촉시키고; TAT226에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 TAT226의 발현 수준을 결정하고; 시험 세포에 의한 TAT226의 발현 수준을 대조 세포에 의한 TAT226의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 대조 세포에 비해 시험 세포에 의한 TAT226의 더 높은 발현 수준은 TAT226의 발현 증가와 연관된 세포 증식 질환의 존재를 나타내는 것인, TAT226의 발현 증가와 연관된 세포 증식 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 시험 세포는 세포 증식 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터의 세포이다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 난소암 및 윌름 종양으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 방법은 시험 세포의 표면 상에서 TAT226의 발현 수준을 결정하고, 시험 세포의 표면 상에서 TAT226의 발현 수준을 대조 세포의 표면 상에서 TAT226의 발현 수준과 비교하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 면역컨쥬게이트 및 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 면역컨쥬게이트는 세포독성제에 공유 부착된 임의의 상기 항-TAT226 항체를 포함한다. 한 실시태양에서, 세포독성제는 독소, 치료제, 항생제, 방사성 동위원소, 및 뉴클레오티드 분해 효소 중에서 선택된다.
한 측면에서, 화학식 Ab-(L-D)p로 표시되는 면역컨쥬게이트를 제공하고,
여기서, (a) Ab는 임의의 상기 항-TAT226 항체이고,
(b) L은 링커이고;
(c) D는 하기 화학식 DE 또는 DF의 약물이고,
Figure pat00001
여기서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R7은 sec-부틸이고, 각각의 R8은 CH3, O-CH3, OH, 및 H 중에서 독립적으로 선택되고; R9는 H이고; R10은 아릴이고; Z는 -O- 또는 -NH-이고; R11은 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3이고; R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴이고;
(d) p는 약 1 내지 8이다.
한 실시태양에서, 항체 (Ab)는 1) 서열 11의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및
2) (i) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(iii) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(iv) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(v) 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 HVR을 포함한다.
한 실시태양에서, 항체는 서열 19의 컨센서스 서열에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 및 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 21-25 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역 및 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역 및 서열 29의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 25의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역 및 서열 30의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다.
다음 실시태양은 임의의 상기 면역컨쥬게이트를 위해 추가로 제공된다. 한 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 시험관 내 또는 생체 내 세포 사멸 활성을 갖는다. 한 실시태양에서, 링커는 항체 상의 티올기를 통해 항체에 부착된다. 한 실시태양에서, 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 한 실시태양에서, 링커는 val-cit 디펩티드를 포함한다. 한 실시태양에서, 링커는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 한 실시태양에서, p-아미노벤질 단위는 약물과 링커 내의 프로테아제 절단 부위 사이에 배치된다. 한 실시태양에서, p-아미노벤질 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)을 포함한다. 한 실시태양에서, 링커는 6-말레이미도카프로일을 포함한다. 한 실시태양에서, 6-말레이미도카프로일은 항체와 링커 내의 프로테아제 절단 부위 사이에 배치된다. 상기 실시태양은 단독으로 또는 실시태양의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다.
한 실시태양에서, 약물은 MMAE 및 MMAF 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하기 화학식으로 표시되고,
Figure pat00002
여기서, Ab는 임의의 상기 항-TAT226 항체이고, S는 황 원자이고, p는 2 내지 5이다. 한 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하기 화학식으로 표시되고,
Figure pat00003
여기서, Ab는 임의의 상기 항-TAT226 항체이고, S는 황 원자이고, p는 2 내지 5이다.
한 측면에서, 임의의 상기 면역컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 개체에게 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 난소암, 자궁암, 뇌 종양 및 윌름 종양으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 세포의 표면에서 TAT226의 발현 증가와 연관된다.
한 측면에서, 세포를 TAT226에 대한 면역컨쥬게이트의 결합을 허용하는 조건 하에 임의의 상기 면역컨쥬게이트에 노출시키는 것을 포함하는, 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 세포는 종양 세포이다. 한 실시태양에서, 종양 세포는 난소암 종양 세포, 자궁 종양 세포, 뇌 종양 세포, 또는 윌름 종양 세포이다. 한 실시태양에서, 세포는 이종이식편 (xenograft)이다. 한 실시태양에서, 노출은 시험관 내에서 일어난다. 한 실시태양에서, 노출은 생체 내에서 일어난다.
도 1은 인간, 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이 ("cyno"), 마우스 및 래트로부터의 TAT226의 정렬을 도시한 것이다. 상자내에 둘러싸인 잔기는 종 사이에 동일한 것이다. 나머지 잔기는 4개의 종 중 적어도 2개 종 사이에서 다르다. 인간, 사이노몰거스 원숭이, 마우스 및 래트로부터의 TAT226 서열 사이의 % 아미노산 동일성을 정렬 아래의 표에 나타낸다. % 동일성은 ClustalW 프로그램을 사용하여 계산하였다.
도 2는 실시예 B에 설명된 바와 같이 YWO.32 및 YWO.49로 지정된 항-TAT226 모노클로날 항체의 H1, H2, 및 H3 중쇄 초가변 구역 (HVR) 서열을 도시한 것이다. 아미노산 위치는 아래 설명된 카바트 (Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링한다.
도 3은 실시예 B에 설명된 바와 같이 YWO.32 및 YWO.49로 지정된 항-TAT226 모노클로날 항체의 L1, L2, 및 L3 경쇄 HVR 서열을 도시한 것이다. 아미노산 위치는 아래 설명된 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링한다.
도 4는 실시예 B에 설명된 바와 같이, HVR-H3 및 HVR-L3 소프트-무작위화 (soft-randomized) 라이브러리를 사용하여 YWO.49의 친화도 성숙에 의해 생성된 YWO.49와 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 HVR-H3 및 HVR-L3 서열을 도시한 것이다. 컨센서스 HVR-H3 및 HVR-L3 서열을 또한 도시한다.
도 5A 및 5B는 다음과 같은 서열 식별기호 (identifier)를 갖는, 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 예시적인 억셉터 (acceptor) 인간 가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한 것이다:
- 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 32, 33, 34, 35).
- 인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 "B", "C", 및 "D" 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 36, 37, 34, 35; 서열 36, 37, 38, 35; 및 서열 36, 37, 39, 35).
- 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 40, 41, 42, 35).
- 인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 "B", "C", 및 "D" 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 43, 44, 42, 35; 서열 43, 44, 45, 35; 및 서열 43, 44, 46, 35).
- 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 47, 48, 49, 35).
- 인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 "B", "C", 및 "D" 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 50, 51, 49, 35; 서열 50, 51, 52, 35; 및 서열 50, 51, 53, 35).
- 인간 VH 억셉터 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 54, 48, 55, 35).
- 인간 VH 억셉터 프레임워크 "B" 및 "C" 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 50, 51, 55, 35; 및 서열 50, 51, 56, 35).
- 인간 VH 억셉터 2 프레임워크 "A" 마이너스 카바트 CDR (서열 54, 48, 57, 35).
- 인간 VH 억셉터 2 프레임워크 "B", "C", 및 "D" 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 50, 51, 57, 35; 서열 50, 51, 58, 35; 및 서열 50, 51, 59, 35).
도 6A 및 6B는 다음과 같은 서열 식별기호를 갖는, 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 예시적인 억셉터 인간 가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한 것이다:
- 인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (κv1): 서열 60, 61, 62, 63
- 인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (κv2): 서열 64, 65, 66, 63
- 인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (κv3): 서열 67, 68, 69, 63
- 인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (κv4): 서열 70, 71, 72, 63
도 7은 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 서열을 도시한 것이다. 위첨자/굵은 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 8은 표시된 변형을 갖는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 서열을 도시한 것이다. 위첨자/굵은 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 9는 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 중쇄 가변 구역 (VH) 서열을 도시한 것이다. HVR을 밑줄친다.
도 10은 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 경쇄 가변 구역 (VL) 서열을 도시한 것이다. 인간화 모노클로날 항체 4D5-8 ("huMAb4D5-8") 및 "변형된" huMAb4D5-8의 VL 서열을 또한 각각 서열 31 및 서열 26에 도시한다. YWO.32 및 YWO.49는 서열 31에 비해 치환 N30S, R66G, 및 H91S를 포함하는 "변형된" huMAb4D5-8 VL (서열 26)과 동일한 VL 서열이다. HVR을 밑줄친다.
도 11은 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 중쇄 가변 구역 서열의 정렬을 도시한 것이다. HVR을 상자로 둘러싼다. YWO.49의 HVR-H3의 상응하는 잔기와 상이한 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 HVR-H3의 잔기를 음영으로 표시한다.
도 12는 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 경쇄 가변 구역 서열의 정렬을 도시한 것이다. HVR을 상자로 둘러싼다. YWO.49의 HVR-L3의 상응하는 잔기와 상이한 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 HVR-L3의 잔기를 음영으로 표시한다.
도 13은 실시예 A에 설명된 바와 같이, 다양한 조직에서 인간 TAT226 유전자 발현 수준을 그래프로 도시한 것이다.
도 14는 실시예 A에 설명된 바와 같이, 정상 난소; 정상 나팔관; 투명 세포, 점액, 및 장액 (serous) 낭선암종 하위형의 난소암; 전이 난소암; 및 다른 종류의 난소암에서 인간 TAT226 유전자 발현 수준을 그래프로 도시한 것이다.
도 15는 실시예 D에 설명된 바와 같이, 표시된 항-TAT226 항체의 부재 또는 존재 하에 0VCAR3 세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS)의 결과를 도시한 것이다.
도 16은 실시예 F에 설명된 바와 같이, OVCAR3 세포 및 난소암 샘플의 패널에 대해 수행한 5' 뉴클레아제 (TaqMan(등록상표)) 분석 및 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정할 때의 TAT226 mRNA 및 단백질 발현을 도시한 것이다.
도 17은 실시예 H에 설명된 바와 같이, OVCAR3 세포 사멸 분석에서 각종 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 시험관내 활성을 도시한 것이다.
도 18은 실시예 H에 설명된 바와 같이, HCT116#9-4 안정한 형질감염체를 사용하는 세포 사멸 분석에서 각종 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6 ADC의 시험관내 활성을 도시한 것이다.
도 19는 실시예 H에 설명된 바와 같이, 마우스 이종이식편을 사용하는 YWO.49.H6 ADC의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 20은 실시예 H에 설명된 바와 같이, 인간 환자 종양으로부터 유래된 마우스 이종이식편을 사용하는 YWO.49.H6 ADC의 생체내 활성을 도시한 것이다.
TAT226에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 항-TAT226 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트를 추가로 제공한다. 본 발명의 항체 및 면역컨쥬게이트는 예를 들어, TAT226의 변경된 발현, 예를 들어 발현 증가와 연관된 질환의 진단 또는 치료에 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 세포 증식 질환, 예를 들어 종양 또는 암의 진단 또는 치료에 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 TAT226, 예를 들어, 세포 표면에 발현된 TAT226의 검출에 유용하다.
항-TAT226 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 항-TAT226 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 항-TAT226 항체, 또는 면역컨쥬게이트를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 제형을 또한 제공한다.
I. 일반적인 기술
본원에서 설명되고 언급되는 기술 및 방법은 일반적으로 당업자가 잘 이해하고 있고, 통상적인 방법, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 방법에 의해 사용된다: [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; [the series Methods in Enzvmology (Academic Press, Inc.): Per 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
II. 정의 및 약어
A. 정의
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량% 초과, 또는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 본래 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에 계내(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 예를 들어 그의 자연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 추가로 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"정제된"은 분자가 함유된 샘플의 적어도 95 중량%, 또는 적어도 98 중량%의 농도로 분자가 샘플 내에 존재함을 의미한다.
본원에서 사용될 때 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관된) 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에서 사용될 때 구문 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하는 정도로 2개의 수치값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관되는 것임) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
본원에서 사용될 때 용어 "벡터"는 그가 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 나타내도록 의도된다. 한 종류의 벡터는 그 내부에 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 종류의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포 내에서 자동 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 단순히 "재조합 벡터"로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재한다. 플라스미드는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 때 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 표지에 컨쥬게이팅함으로써 합성 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 종류의 변형은 예를 들어 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡 (cap)" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 연결기 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)로 및 전하를 띤 연결기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형, 매달린 모이어티, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터컬레이터 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 솔라렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (chelator) (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬레이터 (alkylator)를 함유하는 것, 변형 연결기 (예를 들어, 알파 아노머 (anomeric) 핵산 등)을 갖는 것과, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당 내에 보통 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 교체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대해 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 (capping)기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 라이속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환상 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대체 연결기로 교체될 수 있다. 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결기를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜임)로 교체되는 실시태양을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용될 때 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만, 일반적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만인 짧은, 일반적으로 단일가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배제하는 의미가 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에 동등하고 충분히 적용가능하다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 비율 (%)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. 소유로서, 미국 저작국 (U.S. Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크로부터 공개적으로 입수가능하거나 소스 코드 (source code)로부터 수집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2가 사용되는 상황에서, 제시된 아미노산 서열 A의 제시된 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 동일성 % (별법으로 제시된 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y
상기 식에서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 것으로 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 %값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 문단에서 설명한 바와 같이 얻는다.
본원에서 사용되는 용어 "TAT226"은 다리 나타내지 않으면 포유동물, 예를 들어 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 TAT226을 의미한다. 이 용어는 "전장", 비프로세싱된 TAT226 및 세포 내에서의 프로세싱에 의한 임의의 형태의 TAT226를 포함한다. 이 용어는 또한 TAT226의 천연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. "성숙 형태"의 TAT226은 프로세싱을 거친 TAT226의 형태, 예를 들어 N-말단 (예를 들어, 신호 서열) 및/또는 C-말단 절단 및/또는 GPI 앵커 (anchor)의 부착에 의한 변형을 거친 TAT226의 형태이다. 한 실시태양에서, "성숙 형태"의 TAT226이 세포 표면 상에 발현된다.
"항체" (Ab)" 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 후자의 종류의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이적 항체 (목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 설명된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
용어 "항-TAT226 항체" 또는 "TAT226에 결합하는 항체"는 TAT226을 표적으로 할 때 항체가 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 TAT226에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 바람직하게는, 관련되지 않는 비-TAT226 단백질에 대한 항-TAT226 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사 면역 측정법 (RIA)으로 측정시에 TAT226에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시태양에서, TAT226에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM이다. 특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 상이한 종으로부터의 TAT226에 보존된 TAT226의 에피토프에 결합한다.
항체의 "가변 구역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 언급될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 언급될 수 있다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 크게 상이함을 의미하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 구역 (CDR) 또는 초가변 구역 (HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR 구역을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 구역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (예를 들어 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 (effector) 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
임의의 척추동물종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나에 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 일반적으로 설명되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 아래에 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 의미한다. 상기 용어는 특히 Fc 구역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 연관된 기능의 적어도 하나 및 대부분 또는 전부를 보유하는 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 실시태양에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 구역을 포함하는 항체 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 구역과 정상적으로 연관되는 적어도 하나의 생물학적 기능, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합을 보유한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체에 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암 (arm)을 포함할 수 있다.
항체를 파파인 소화시키면 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 한 실시태양에서, 이중쇄 Fv종은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv (scFv)종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 이중쇄 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커 (linker)에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO93/11161; 및 문헌 ([Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134;] 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)])에 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 돌연변이, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 모노클로날 항체는 일반적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양액에서 그의 생산을 개선시키고, 생체 내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성시키기 위해서 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해하여야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]); 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 제조할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]).
비인간 (예, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 수여자의 초가변 구역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 구역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 또는 수용 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 구역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 구역은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 구역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 본원에 개시되는 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
용어 "초가변 구역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 구역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 구역; 즉 VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3이 6개의 초가변 구역의 대부분의 다양성을 보이고, 특히 H3이 항체에 우수한 특이성을 부여할 때 특유한 역할을 수행하는 것으로 생각된다 (([Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)]). 실제로, 중쇄만으로 구성된 천연 발생 카멜리드 (camelid) 항체가 경쇄의 부재 하에 기능을 보이고, 안정하다 ([Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448]; [Sheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736]).
많은 초가변 구역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 구역 (CDR)은 서열 변동성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아 (Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 구역은 카바트 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라 (Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉 (contact)" 초가변 구역은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 상기 초가변 구역의 잔기를 아래에 나타낸다.
루프 카바트 AbM 코티아 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (카바트 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (코티아 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
초가변 구역은 다음과 같이 "연장된 초가변 구역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크 구역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 초가변 구역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서 항체 편집 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 나타낸다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 그 내부에 대한 삽입에 대응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 구역을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시태양에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 "작용제 항체"는 목적하는 폴리펩티드의 기능적 활성의 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 구역 (천연 서열 Fc 구역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 구역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 구역에 결합하는 수용체를 설명한다. 일부 실시태양에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시태양에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 (spliced) 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다.
활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성 조절에 작용하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, Ghetie 1997, Hinton 2004 참조). 생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석될 수 있다.
WO 00/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 포함된다 (또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)] 참조).
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시태양에서, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 천연 공급원, 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성의 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가, 상기 세포독성의 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관 내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
변경된 Fc 구역 아미노산 서열을 갖고 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 포함된다 (또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 참조).
용어 "Fc 구역-포함 폴리펩티드"는 Fc 구역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 면역어드헤신을 의미한다. Fc 구역의 C-말단 라이신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 폴리펩티드의 정제 동안 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 구역을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 폴리펩티드, 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 폴리펩티드의 혼합물을 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
본원의 목적을 위해 "억셉터 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유도된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유도된" 억셉터 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이미 존재하는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 이미 존재하는 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 이미 존재하는 아미노산 변화가 VH에 존재할 경우, 바람직하게는 상기 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중의 3개, 2개 또는 1개에서만 발생하고; 예를 들어, 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시태양에서, VL 억셉터 인간 프레임워크의 서열은 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 하위군이다. 한 실시태양에서, VL에 대해서, 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 kappa I이다. 한 실시태양에서, VH에 대해서, 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 다음 서열의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 50)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열 51)-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 59)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 35).
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 얻은 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 다음 서열의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 6O)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 61)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 62)-L3-FGQGTKVEIK (서열 63).
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함한 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시태양을 아래에 설명한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 분석에서 설명되는 바와 같이 목적하는 항체의 Fab 버젼 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293 : 865-881). 분석 조건을 확립하기 위해, 미세적정 플레이트 (다이넥스 (Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 (Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 목적하는 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 목적하는 Fab를 밤새 인큐베이팅하지만, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이팅할 수 있다. 그 후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이팅을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% Tween-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (scintillant) (MicroScint-20; 팩카드 (Packard))를 첨가하고, 플레이트를 Topcount 감마 계수기 (팩카드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석에서 사용하기 위해 선택한다.
다른 실시태양에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 10 이하의 응답 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml(~0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 응답 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 운동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% Tween 20을 갖는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881] 참조). 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-ls-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합율" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크.)를 사용하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
"질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 사용한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 병태 또는 질병이다. 이것은 포유동물이 문제의 질병에 걸리기 쉽게 하는 병태를 포함하는 만성 및 급성 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 질환의 비제한적인 예는 종양, 예를 들어 암종 (상피성 종양) 및 모세포종 (배아 조직-유래된 종양), 및 일부 실시태양에서, 난소암, 자궁암 (자궁내막암 포함), 뇌 종양 (예를 들어, 별아교세포종 및 신경아교종), 및 신장모세포종 (예를 들어, 윌름 종양)을 포함하는 신장암을 포함한다.
용어 "세포 증식 질환" 및 "증식 질환"은 일정 정도의 비정상적인 세포 증식과 연관된 질환을 나타낸다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 암이다.
본원에서 사용될 때 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다. 용어 "암", "암성", "세포 증식 질환", "증식 질환" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 대개 조절되지 않은 세포 성장/증식의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 신경아교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질환, 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 변형 표현)는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상 시술을 나타내고, 임상 병리학의 예방을 위해 또는 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 억제, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발생을 지연시키거나 질병 또는 질환의 진행을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체"는 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 인간이다.
"유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 의미한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다. 반드시는 아니지만 대개, 예방 용량은 질병의 보다 초기 단계에 앞서, 또는 보다 초기 단계에서 대상에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, Il31, Il25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 그의 단편, 예를 들어 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한다. 다른 세포독성제는 아래에 기재된다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 유해한 효과를 보일 수 있는 임의의 물질이다.
"화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 부툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(등록상표) 포함); CPT-11 (이로노테칸, CAMPTOSAR(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가Il (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 (chromophore) 및 관련 발색단백질 에네디와인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN(등록상표), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당체 복합체 (제이에이치에스 내쳐럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진)); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL(등록상표) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), ABRAXANE(등록상표) 크레모포르-프리 (Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스 (American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샤윰버그)), 및 TAXOTERE(등록상표) 독세탁셀 (롱-프랑 로라 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈 (GEMZAR(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN(등록상표)); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN(등록상표)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈 (XELODA(등록상표)); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체 및 2개 이상의 상기 물질의 조합물, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)을 사용한 치료의 약어)를 포함한다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 신체 전체 치료 형태로 사용되는 항호르몬제가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 그 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어 NOLVADEX(등록상표) 타목시펜), EVISTA(등록상표) 랄록시펜, 드로록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON(등록상표) 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향조절인자 (ERD); 난소를 억제하거나 기능을 차단하는 물질, 예를 들어, 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작용제, 예를 들어 LUPRON(등록상표) 및 ELIGARD(등록상표) 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신선에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테치미드, MEGASE(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR(등록상표) 보로졸, FEMARAO(등록상표) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(등록상표) 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 상기 화학치료제의 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS(등록상표) 또는 OSTAC(등록상표)), DIDROCAL (등록상표) 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA(등록상표) 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX(등록상표) 알렌드로네이트, AREDIA(등록상표) 팔미드로네이트, SKELID(등록상표) 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL(등록상표) 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 부착성 세포 증식에 연관되는 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE (등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신; LURTOTECAN(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX(등록상표) rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016으로도 알려진 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포 (예를 들어, TAT226을 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포 (예를 들어, TAT226을 발현하는 세포)의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목에서 유도된 항암약이다. 유럽 주목에서 유도된 도세탁셀 (TAXOTERE(등록상표), 롱-프랑 로러)은 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표)), 브리스톨-마이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세관의 회합을 촉진시키고, 세포의 유사분열을 억제하는 탈중합을 억제함으로써 미세관을 안정화시킨다.
용어 "세포내 대사체"는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)에 대한 세포 내부의 대사 과정 또는 반응으로부터 생성되는 화합물이다. 대사 과정 또는 반응은 효소 과정, 예를 들어 ADC의 펩티드 링커의 단백질 분해 절단, 또는 관능기, 예를 들어 히드라존, 에스테르, 또는 아미드의 가수분해일 수 있다. 세포내 대사체는 세포 내로의 도입, 확산, 섭취 또는 수송 후에 세포내 절단을 겪는 항체 및 유리 약물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "세포 내에서 절단된" 및 "세포내 절단"은 약물 모이어티 (D)와 항체 (Ab) 사이의 공유 부착, 즉 링커가 파괴되어 유리 약물을 세포 내에서 항체로부터 해리시키는, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)에 대한 세포 내의 대사 과정 또는 반응을 의미한다. 따라서, ADC의 절단된 모이어티는 세포내 대사체이다.
용어 "생체이용률"은 환자에게 투여된 약물의 소정량의 전신 이용률 (즉, 혈액/혈장 수준)을 의미한다. 생체이용률은 투여된 투여형으로부터 전신 순환계에 도달하는 약물의 시간 (속도) 및 총량 (정도)의 측정치를 나타내는 절대적인 용어이다.
용어 "세포독성 활성"은 항체-약물 컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 세포내 대사체의 세포-사멸, 세포증식 억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 1/2의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도 (몰 또는 질량)인 IC5O 값으로서 표현될 수 있다.
"알킬"은 n, 2차, 3차 또는 시클릭 탄소 원자를 포함하는 C1-C18 탄화수소이다. 그 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3이다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C8 알킬"은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 탄화수소를 의미한다. 대표적인 "C1-C8 알킬"기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 포함하고, 이로 제한되지 않으며; 분지쇄 C1-C8 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -t-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸을 을 포함하고, 이로 제한되지 않으며, 불포화 C1-C8 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1-부티닐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸펜틸, 2,3-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2,3,4-트리메틸펜틸, 3-메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 3,5-디메틸헥실, 2,4-디메틸펜틸, 2-메틸헵틸, 3-메틸헵틸, n-헵틸, 이소헵틸, n-옥틸, 및 이소옥틸을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. C1-C8 알킬기는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(0)N(R')2-NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 기로 비치환되거나 치환될 수 있다.
"알케닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는, n, 2차, 3차 또는 시클릭 탄소 원자를 포함하는 C2-C18 탄화수소이다. 그 예는 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 시클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"알키닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는, n, 2차, 3차 또는 시클릭 탄소 원자를 포함하는 C2-C18 탄화수소이다. 그 예는 아세틸렌 (-C≡CH) 및 프로파르길 (-CH2C≡CH)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"알킬렌"은 1-18개 탄소 원자의 포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알칸의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알킬렌 라디칼은 메틸렌 (-CH2-), 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"C1-C10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄, 포화 탄화수소기이다. C1-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
"알케닐렌"은 2-18개 탄소 원자의 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알켄의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알케닐렌 라디칼은 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"알키닐렌"은 2-18개 탄소 원자의 불포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미하고, 모 알킨의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도되는 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는다. 대표적인 알키닐렌 라디칼은 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파르길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"아릴"은 카르보시클릭 방향족기를 나타낸다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 카르보시클릭 방향족기 또는 헤테로시클릭 방향족기는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(0)N(R')2-NHC(O)R', -SO2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 기로 비치환되거나 치환될 수 있다.
"아릴렌"은 다음의 구조로 보여지는 바와 같이 두개의 공유 결합은 가지며 오르쏘, 메타, 또는 파라 배위로 존재할 수 있는 아릴 기이며, 여기서, 페닐 기는 비치환되거나, 또는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 4개 이하의 기로 치환될 수 있다.
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"아릴알킬"은 탄소 원자 (통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자)에 결합한 수소 원자 중의 하나가 아릴 라디칼로 대체된 아시클릭 알킬 라디칼을 의미한다. 대표적인 아릴알킬기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아릴알킬기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들어 알카닐, 알케닐 또는 알키닐기를 포함하는, 아릴알킬기의 알킬 모이어티는 탄소 원자 1 내지 6개이고, 아릴 모이어티는 탄소 원자 5 내지 14개이다.
"헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합한 수소 원자 중의 하나가 헤테로아릴 라디칼로 대체된 아시클릭 알킬 라디칼을 의미한다. 통상적인 헤테로아릴알킬 기는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 헤테로아릴알킬 기는 탄소 원자 6 내지 20개를 포함하며, 예를 들어, 알카닐, 알케닐 또는 알키닐기를 포함하는, 헤테로아릴알킬 기의 알킬 모이어티는 탄소 원자 1 내지 6개이고 헤테로아릴 모이어티는 탄소 원자 5 내지 14개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개이다. 헤테로아릴알킬 기의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7원의 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개) 또는 7 내지 10원의 비사이클 (탄소 원자 4 내지 9개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
"치환된 알킬", "치환된 아릴" 및 "치환된 아릴알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체된 알킬, 아릴, 및 아릴알킬을 각각 의미한다. 통상적인 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -S03-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3-, -P03H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2를 포함하고, 이로 제한되지 않으며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br 또는 I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H, C2-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로사이클, 보호 기 또는 전구약물 모이어티이다. 상기 언급된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌기는 또한 유사하게 치환될 수 있다.
"헤테로아릴" 및 "헤테로사이클"은 하나 이상의 고리 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소, 및 황인 고리계를 의미한다. 헤테로사이클 라디칼은 탄소 원자 1 내지 20개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7원의 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개)일 수 있거나, 또는 7 내지 10원의 비사이클 (탄소 원자 4 내지 9개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어: 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)], 특히 제1장, 제3장, 제4장, 제6장, 제7장, 및 제9장; 문헌 ["The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)], 특히 제13권, 제14권, 제16권, 제19권, 및 제28권; 및 문헌 [J. Am. Chem. Soc. (1960)82 : 5566]에 기재되어 있다.
헤테로사이클의 예는 피리딜, 디히드로피리딜, 테트라히드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 테트라히드로티오페닐, 황 산화 테트라히드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페라디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라히드로푸라닐, 비스-테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 비스-테트라히드로피라닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐릴, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 시놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카르바졸릴, 카르바졸릴, β-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥신돌릴, 벤족사졸리닐, 및 이사티노일을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
헤테로사이클에 결합하는 탄소는 예를 들어, 피리딘의 2, 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리다진의 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리미딘의 2, 4, 5, 또는 6번 위치, 피라진의 2, 3, 5, 또는 6번 위치, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 2, 3, 4, 또는 5번 위치, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 2, 4, 또는 5번 위치, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 3, 4, 또는 5번 위치, 아지리딘의 2 또는 3번 위치, 아제티딘의 2, 3, 또는 4번 위치, 퀴놀린의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치, 이소퀴놀린의 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치에 결합하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 보다 통상적으로는, 헤테로사이클에 결합하는 탄소는 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
헤테로사이클에 결합하는 질소는 예를 들어, 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 1번 위치, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 2번 위치, 모르폴린의 4번 위치, 및 카르바졸 또는 β-카르볼린의 9번 위치에 결합하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 보다 통상적으로, 헤테로사이클에 결합하는 질소는 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 및 1-피페라디닐을 포함한다.
"C3-C8 헤테로사이클"은 고리 탄소 원자 1개 내지 4개가 O, S, 및 N으로 이루어지는 군의 헤테로원자로 독립적으로 대체된 방향족 또는 비방향족 C3-C8 카르보사이클을 의미한다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예는 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. C3-C8 헤테로사이클은 비치환되거나, 또는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있다.
"C3-C8 헤테로시클로"는 헤테로사이클 기의 수소 원자 중의 하나가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 헤테로사이클 기를 의미한다. C3-C8 헤테로시클로는 비치환되거나, 또는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 6개 이하의 기로 치환될 수 있다.
"카르보사이클"은 모노사이클로서 탄소 원자 3 내지 7개 또는 비사이클로서 탄소 원자 7 내지 12개를 갖는 포화 또는 불포화 고리를 의미한다. 모노시클릭 카르보사이클은 고리 원자 3 내지 6개, 보다 통상적으로는 고리 원자 5 또는 6개를 갖는다. 비시클릭 카르보사이클은 예를 들어 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 고리 원자 7 내지 12개, 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 고리 원자 9 또는 10개를 갖는다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로펩틸, 및 시클로옥틸을 포함한다.
"C3-C8 카르보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8원의 포화 또는 불포화 비-방향족 카르보시클릭 고리이다. 대표적인 C3-C8 카르보사이클은 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로펜타디에닐, -시클로헥실, -시클로헥세닐, -1,3-시클로헥사디에닐, -1,4-시클로헥사디에닐, -시클로헵틸, -1,3-시클로헵타디에닐, -1,3,5-시클로헵타트리에닐, -시클로옥틸, 및 -시클로옥타디에닐을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. C3-C8 카르보사이클기는 비치환되거나, 또는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서, 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택됨)을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다
"C3-C8 카르보시클로"는 카르보사이클 기의 수소 원자 중의 하나가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 카르보사이클 기를 의미한다.
"링커"는 공유 결합을 포함하는 화학적 모이어티 또는 항체를 약물 모이어티에 공유 부착시키는 원자의 사슬을 의미한다. 다양한 실시태양에서, 링커는 알킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일과 같은 2가 라디칼, 알킬옥시의 반복 단위 -(CR2)nO(CR2)n- (예를 들어, 폴리에틸레녹시, PEG, 폴리메틸레녹시), 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, 제프아민™ (Jeffamine™))와 같은 모이어티; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너에 겹쳐질 수 없는 특성을 갖는 분자를 의미하고, 용어 "아키랄"은 그의 거울상 파트너에 겹쳐질 수 있는 분자를 의미한다.
용어 "입체 이성질체"는 동일한 화학적 구성을 가지나, 공간의 원자 또는 기의 배열에서 상이한 화합물을 의미한다.
"부분 입체 이성질체"는 2 이상의 키랄 중심이 있고 이들 분자가 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체를 의미한다. 부분 입체 이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 갖는다. 부분 입체 이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피과 같은 고 분해능 분석 과정 하에 분리될 수 있다.
"거울상 이성질체"는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 두개의 입체 이성질체 화합물을 의미한다.
본원에서 사용된 입체화학 정의 및 규약은 일반적으로 문헌 ([S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York]; 및 [Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc. New York])을 따른다. 많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재한다. 즉, 이들은 평면 편광의 평면을 회전하는 능력을 가진다. 광학 활성 화합물을 설명함에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들)에 대해 분자의 절대적 배위를 표시하기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)은 화합물에 의한 평면 평광 회전 표시를 나타내기 위해 사용되는데, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두사 (+) 또는 d로 표시된 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에서, 이 입체 이성질체는 이들이 서로 거울상이라는 것만 제외하고는 동일하다. 특정 입체 이성질체는 또한 거울상 이성질체로 불릴 수 있고, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상 이성질체 혼합물로 불린다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 불리는데, 이들은 화학적 반응 또는 과정에 있어, 임의의 입체선택성 또는 입체특이성도 존재하지 않은 경우가 있을 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 두개의 거울상 이성질체 종의 등몰 혼합물을 의미한다.
"이탈기"는 또다른 관능기에 의해 치환될 수 있는 관능기를 의미한다. 이러한 이탈기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예는 할로겐화물 (예, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 메탄술포닐 (메실), p-톨루엔술포닐 (토실), 트리플루오로메틸술포닐 (트리플레이트), 및 트리플루오로메틸술포네이트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
B. 약어
링커 성분:
MC = 6-말레이미도카프로일
Val-Cit 또는 "vc" = 발린-시트룰린 (프로테아제 절단가능 링커 내의 예시적인 디펩티드)
시트룰린 = 2-아미노-5-우레이도 펜탄산
PAB = p-아미노벤질옥시카르보닐 ("자가 희생적 (self immolative)" 링커 성분의 예)
Me-Val-Cit = N-메틸-발린-시트룰린 (여기서, 링커 펩티드 결합은 카텝신 B에 의한 그의 절단을 방지하기 위해 변형됨)
MC(PEG)6-OH = 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜 (항체 시스테인에 부차될 수 있음).
세포독성 약물:
MMAE = 모노-메틸 오리스타틴 (auristatin) E (MW 718)
MMAF = 약물의 C-말단에 페닐알라닌이 존재하는 오리스타틴 E의 변이체 (MMAE) (MW 731.5)
MMAF-DMAEA = DMAEA (디메틸아미노에틸아민)가 C-말단 페닐알라닌에 아미드 연결된 MMAF (MW 801.5)
MMAF-TEG = 테트라에틸렌 글리콜이 페닐알라닌에 에스테르화된 MMAF
MMAF-NtBu = MMAF의 C-말단에 아미드로서 부착된 N-t-부틸
추가의 약어는 다음과 같다: AE는 오리스타틴 E, Boc는 N-(t-부톡시카르보닐), cit는 시트룰린, dap는 돌라프로인, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, DCM은 디클로로메탄, DEA는 디에틸아민, DEAD는 디에틸아조디카르복실레이트, DEPC는 디에틸포스포릴시아니데이트, DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트, DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민, dil는 돌라이소류신, DMA는 디메틸아세트아미드, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘, DME는 에틸렌글리콜 디메틸 에테르 (또는 1,2-디메톡시에탄), DMF는 N,N-디메틸포름아미드, DMSO는 디메틸술폭사이드, doe는 돌라페닌, dov는 N,N-디메틸발린, DTNB는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), DTPA는 디에틸렌트리아민펜타아세트산, DTT는 디티오트레이톨, EDCI는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염, EEDQ는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린, ES-MS는 전자 분사 질량분석법, EtOAc는 에틸 아세테이트, Fmoc는 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐), gly는 글라이신, HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸, HPLC는 고압 액체 크로마토그래피, ile는 이소류신, lys는 라이신, MeCN(CH3CN)는 아세토니트릴, MeOH는 메탄올, Mtr는 4-아니실디페닐메틸 (또는 4-메톡시트리틸), nor는 (1S,2R)-(+)-노르에페드린, PBS는 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4), PEG는 폴리에틸렌 글리콜, Ph는 페닐, Pnp는 p-니트로페닐, MC는 6-말레이미드카프로일, phe는 L-페닐알라닌, PyBrop는 브로모 트리스-피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트, SEC는 크기 배제 크로마토그래피, Su는 숙신이미드, TFA는 트리플루오로아세트산, TLC는 박막 크로마토그래피, UV는 자외선, 및 val는 발린이다.
III. 조성물 및 그의 제조 방법
TAT226에 결합하는 항체를 제공한다. 항-TAT226 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 항체 및 면역컨쥬게이트는 예를 들어, TAT226의 변경된 발현, 예를 들어, 발현 증가와 연관된 질환의 진단 또는 치료를 위해 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 세포 증식 질환, 예를 들어 암의 진단 또는 치료를 위해 유용하다.
A. 항-TAT226 항체
TAT226 ("종양-연관 항원성 표적 no. 226")은 종양 세포를 포함하는 특정 세포 종류의 표면 상에서 프로세싱되고 발현되는 단백질이다. 특히, 인간 TAT226은 이전에 난소, 자궁, 자궁내막, 신장, 폐, 췌장, 부신, 및 간세포 종양을 포함한 특정 종류의 종양에서 과다발현되는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 US 2003/0148408 A1, US 2004/0229277 A1, 및 US 2003/0100712 A1 (TAT226을 "PRO9917"로서 칭함); 및 미국 특허 6,710,170 B2 (서열 215) 참조). TAT226에 관련된 다른 데이타베이스 엔트리 (entry) 및 개시물은 다음과 같다: NCBI 수탁 번호 AY358628_1 (인간 TAT226을 "PSCA Hlog"로 칭함); NCBI 수탁 번호 AAQ88991.1 및 "gi" no. 37182378 (인간 TAT226을 "PSCA Hlog"로 칭함); RIKEN cDNA 2700050C12; US 2003/0096961 A1 (서열 16); US 2003/0129192 A1 (서열 215); US 2003/0206918 A1 (실시예 5; 서열 215); US 2003/0232056 A1 (서열 215); US 2004/0044179 A1 (서열 16); US 2004/0044180 A1 (서열 16); US 2005/0238649 A1 (인간 TAT226을 "PSCA Hlog"로 칭함); WO 2003/025148 (서열 292); WO 2003/105758 (서열 14); 및 EP 1347046 (서열 2640).
전장 TAT226은 세포 내에서 프로세싱되어 세포 표면 상에 발현되는 단백질의 성숙 형태를 생성한다. 예를 들어, 서열 75에 도시된 전장 인간 TAT226은 단백질로부터 절단되는 것으로 예측되는 아미노산 1-20 또는 1-22로부터의 예측된 신호 펩티드 서열을 함유한다. 아미노산 116-141로부터의 C-말단은 단백질로부터 절단되는 것으로 예측되고, GPI 모이어티는 아미노산 115에서 단백질에 부착된다. 서열 75의 아미노산 21-115 또는 23-115으로부터의 인간 TAT226의 성숙 형태는 GPI 모이어티를 통해 세포 표면에 고착되는 것으로 예측된다. 원숭이 및 설치류 TAT226 (예를 들어, 서열 76-78 참조)은 인간 TAT226에 고도로 유사하고, 따라서 동등한 아미노산 위치에서 절단되고 변형되는 것으로 생각된다 (도 1 참조). 아미노산 21-115 또는 23-115로부터의 인간, 원숭이 및 설치류 TAT226의 생성되는 성숙 형태 (도 1에 도시된)는 100% 동일하다.
인간 TAT226의 다른 특징은 경험적으로 확인된 서열 75의 아미노산 45에서 예측된 N-글리코실화 (glycosylation) 부위, 및 아미노산 94-107로부터의 예측된 Ly6/u-PAR 도메인을 포함한다. 인간 TAT226은 GPI 연결을 통해 세포 표면 상에 발현되는 전립선암-특이적 종양 항원인 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA)과 약 32% 아미노산 상동성을 갖는다 (Reiter et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:1735-1740 참조). PSCA는 80%가 넘는 전립선암에서 과다발현된다 (상기 문헌). TAT226과 마찬가지로, PSCA는 신호전달 및 세포 부착과 같은 세포 기능에 관여하는 예측된 Ly6/u-PAR 도메인을 함유한다 (상기 문헌).
한 측면에서, 본 발명은 TAT226에 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 성숙 형태의 TAT226에 결합하는 항체를 제공한다. 하나의 상기 실시태양에서, 성숙 형태의 TAT226은 서열 75의 아미노산 21-115 또는 23-115로부터의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, TAT226에 대한 항체는 세포 표면 상에 발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합한다. 일부 실시태양에서, 세포 표면 상에 발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합하는 항체는 세포 성장을 억제한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 세포 표면 상에 발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합하고, 세포 증식을 억제한다. 특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 세포 표면 상에 발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합하고, 세포 사멸을 유도한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 암 세포의 표면 상에 발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 동일한 조직 기원의 정상 세포에 비해 암 세포의 표면 상에 과다발현되는 성숙 형태의 TAT226에 결합한다.
한 측면에서, 항-TAT226 항체는 모노클로날 항체이다. 한 측면에서, 항-TAT226 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. 한 측면에서, 항-TAT226 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체이다. 한 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항-TAT226 항체는 정제된다.
파지 라이브러리로부터 유래된 예시적인 모노클로날 항체를 실시예 B에 설명된 바와 같이 본원에서 제공한다. 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용되는 항원은 추정 GPI 부착 부위의 C-말단인 아미노산이 결핍되는 형태의 TAT226에 상응하는 서열 75의 아미노산 1-115의 서열을 갖는 폴리펩티드이었다. 라이브러리 스크린으로부터 생성되는 항체를 YWO.32 및 YWO.49로 지정한다. YWO.49를 친화도 성숙시켜 YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6을 생성한다. YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열의 정렬을 각각 도 11 및 12에 도시한다.
한 측면에서, TAT226에 대한 결합에 대해 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6과 경쟁하는 모노클로날 항체를 제공한다. YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 또한 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 항-TAT226 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시태양에서, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서, 항-TAT226 항체, 또는 항-TAT226 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 본원에 열거된 것과 같은 세포 증식 질환의 치료를 위한 제약 제형이다.
예시적인 항-TAT226 항체의 상세한 내용을 다음에 설명한다:
1. 항-TAT226 항체의 구체적인 실시태양
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 2 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 2 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 2 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 9 또는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 1 및 서열 4 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 4를 포함하는 HVR-H1을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 9 또는 10을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 4를 포함하는 HVR-H1을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 3을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 1을 포함하는 HVR-H1을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 2 및 서열 5 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 서열 5를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 9 또는 10을 포함하는 HVR-H3 및 서열 5를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 3을 포함하는 HVR-H3 및 서열 2를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열 2 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, HVR-H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, HVR-H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 9 또는 10을 포함한다. 한 실시태양에서, HVR-H1은 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 (b) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, TAT226 항체는 (a) 서열 1을 포함하는 HVR-H1 및 서열 2를 포함하는 HVR-H2를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 및 (b) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, HVR-H3은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, HVR-H3은 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, TAT226 항체는 서열 4를 포함하는 HVR-H1 및 서열 5를 포함하는 HVR-H2를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 2 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 3 및 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 목적하는 표적 결합 친화도를 얻기 위해 친화도 성숙된다. 일부 실시태양에서, 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산이 다음 HVR 위치 (카바트 넘버링)에서 치환된다: H98, H99, H100, H100B, L90, L92, L93, L96, 및 L97. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 임의의 하나 이상의 다음 치환이 임의의 조합으로 이루어질 수 있다:
- HVR-H3 (서열 6)에서: V98I; S99T; R100L 또는 I; G100bA, S, 또는 P.
- HVR-L3 (서열 14)에서: Q90R, K, H, 또는 N; Y92V; T93F, N, G, 또는 A; P96F; T97I 또는 A.
상기 치환의 모든 가능한 조합은 서열 11 (HVR-H3) 및 서열 19 (HVR-L3)의 컨센서스 서열에 포함된다.
항-TAT226 항체는 항체가 TAT226에 결합하는 능력을 보유하는 한 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 항-TAT226 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서 치환(들)을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, 위치 71은 A이고/이거나, 위치 73은 T이고/이거나, 위치 78은 A이다. 한 실시태양에서, 상기 항체는 huMAb4D5-8의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열, 예를 들어, 서열 50, 51, 59, 35 (각각 FR1, 2, 3, 4)을 포함한다. huMAb4D5-8은 상업적으로 HERCEPTIN(등록상표) (제넨테크 인크)으로서 공지되어 있다 (또한 미국 특허 6,407,213 및 5,821,337, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93] 참조). 하나의 상기 실시태양에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 하나의 상기 실시태양에서, 상기 항체는 huMAb4D5-8의 경쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 5A 및 5B에 도시된 것으로부터 선택되는 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-H3은 서열 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 6A 및 6B에 도시된 것으로부터 선택되는 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR-L1은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L2는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L3은 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-L3은 서열 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 7에 도시된 바와 같이 서열 50, 51, 59, 및 35의 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-H3은 서열 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이 서열 60, 61, 62, 및 63의 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR-L1은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L2는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L3은 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-L3은 서열 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 8에 도시된 바와 같이 서열 50, 51, 53, 및 35의 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-H3은 서열 6-11 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-H3은 서열 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 프레임워크 서열 및 초가변 구역을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 도 8에 도시된 바와 같이 서열 60, 61, 62, 및 74의 FR1-FR4 서열을 포함하고; HVR-L1은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L2는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고; HVR-L3은 서열 14-19 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, HVR-L3은 서열 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 서열 20-25 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 참조 서열에 비해 치환, 삽입 또는 결실을 갖지만, 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체는 TAT226에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 20-25 중에서 선택되는 서열에서 치환되거나, 삽입되거나, 결실된다. 일부 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부 구역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 20-25 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 서열 31에 도시된 인간화 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN(등록상표), 제넨테크 인크.) (또한 미국 특허 6,407,213 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93] 참조)의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
Figure pat00005
(서열 31) (HVR 잔기를 밑줄친다)
일부 실시태양에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 위치 30, 66 및 91 중 하나 이상에서 변형된다 (Asn, Arg 및 His를 각각 굵은/이탤릭체로 표시한다). 한 실시태양에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 위치 30에서 Ser, 위치 66에서 Gly, 및/또는 위치 91에서 Ser을 포함한다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 26에 도시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
Figure pat00006
(서열 26) (HVR 잔기를 밑줄친다)
huMAb4D5-8에 관하여 치환된 잔기는 상기에서 굵은/이탤릭체로 표시한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 참조 서열에 비해 치환, 부가 또는 결실을 갖지만, 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체는 TAT226에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 26-31 중에서 선택되는 서열에서 치환되거나, 삽입되거나, 결실된다. 일부 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외의 구역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 20-25 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (b) 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 참조 서열에 비해 치환, 부가 또는 결실을 갖지만, 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체는 TAT226에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시태양에서, 총 내지 10개의 아미노산이 참조 서열에서 치환되거나, 삽입되거나, 결실된다. 일부 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외의 구역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 20-25 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 26-31 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 도 2 및 4에 도시된 것으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 VH HVR 및/또는 (b) 도 3 및 4에 도시된 것으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 VL HVR을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 도 9 및 11에 도시된 것으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 도 10 및 12에 도시된 것으로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-TAT226 항체를 제공한다.
2. 항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소 소화, 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 신속한 소실을 가능하게 하고, 고형 종양에 대한 접근성을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토에 대해서는 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]) 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 상기 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시태양에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458 참조). Fv 및 sFv는 불변 구역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 단편이고, 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. SFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질의 융합체를 생성시키도록 제조될 수 있다 (문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조). 또한, 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
3. 인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입 (import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 구역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 및 공동연구자의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature, 332: 323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science, 239: 1534-1536])을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 구역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소를 위해 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체의 인간 프레임워크로서 허용된다 ([Sims et al. (1993) J. Immunol., 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196:901]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위집단의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 일반적으로 더욱 바람직하다. 이를 달성하기 위해서, 한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 구역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
4. 인간 항체
본 발명의 인간 항-TAT226 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기한 바와 같이 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-TAT226 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 ([Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984)], [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)])에 기재되어 있다.
면역화시에, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)를 생산하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험 접종시에 인간 항체를 생성시킬 것이다 (예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255 (1993)]; 및 [Bruggermann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)]) 참조).
또한, 유전자 셔플링을 사용하여 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 상기한 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 구역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라를 생성시킨다. 항원으로 선택하여, 인간 사슬이 1차 파지 디스플레이 클론에서 대응하는 비-인간 사슬의 제거시에 파괴되는 항원 결합 부위를 저장할 수 있는 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab를 단리한다. 즉, 에피토프가 인간 사슬 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 과정을 반복할 때, 인간 항체를 얻게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅 (grafting)에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
5. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시태양에서, 결합 특이성의 하나는 TAT226에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 TAT226의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 TAT226을 발현하는 세포에 세포독성제를 위치시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체는 TAT226-결합 아암 및 세포독성제, 예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는, 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일 공개된 WO93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 방법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, 즉 CH2 및 CH3 구역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시태양에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 구역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특정한 유의성을 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체 (heterodimer)의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 구역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 강제로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 참조).
3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)).
6. 다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (internalizing) (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스가 아닌)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 이량체화 도메인은 예를 들어 Fc 구역 또는 힌지 구역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 구역 및 Fc 구역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시태양에서, 다가 항체는 3 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 구역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 구역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 구역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
7. 단일-도메인 항체
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크. (Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 왈탐); 예를 들어, 미국 특허 6,248,516 B1 참조). 한 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
8. 항체 변이체
일부 실시태양에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성체가 요구되는 특성을 갖는다면 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행할 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조될 때 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 구역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 구역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단 융합체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 대개 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열을 의미한다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 효능있는 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌 중의 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)이 생성되거나 삭제되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 본래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해).
항체가 Fc 구역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 구역에 부착된 푸코스가 결핍된 성숙 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L.)에 기재되어 있다. 또한, US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. 항체의 Fc 구역에 부착된 탄수화물에 이등분 (bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등)과 미국 특허 6,602,684 (Umana 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 구역에 부착된 올리고당 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087 (Patel 등)에 보고되어 있다. 또한, 그의 Fc 구역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관하여 WO 1998/58964 (Raju, S.)와 WO 1999/22764 (Raju, S.)를 참조한다. 또한, 변경된 글리코실화가 존재하는 항원 결합 분자에 대해서는 US 2005/0123546 (Umana et al.)을 참조한다.
특정 실시태양에서, 글리코실화 변이체는 Fc 구역에 부착된 탄수화물 구조에 푸코스가 결핍되어 있는 Fc 구역을 포함한다. 상기 변이체는 개선된 ADCC 긴능을 갖는다. 임의로, Fc 구역은 ADCC를 추가로 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 구역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)의 치환을 추가로 포함한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관련된 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; 문헌 ([Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)])을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산하는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 Example 11), 및 낙아웃 (knockout) 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 낙아웃 CHO 세포 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))를 포함한다.
다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 구역을 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성의 목적하는 변경을 유도하면, 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
본래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 구역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 다음 군으로 분류할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)).
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비대전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
별법으로, 천연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류할 수 있다.
(1) 소수성: 노르뉴신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반할 것이다. 상기 치환되는 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로, 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 구역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 구역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)에 대한 융합체로서 필라멘트상 (filamentous) 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 구역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하도록 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에서 설명된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체의 Fc 구역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 구역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 구역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하여 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 구역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 구역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 선행기술의 교시 내용에 따르면, 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 야생형 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 구역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 야생형 대응 항체에 비교할 때 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 보유할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는 특정 변형이 Fc 구역에서 형성될 수 있다고 생각된다. 또한, Fc 구역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌 ([Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 5,648,260; 미국 특허 5,624,821; 및 WO94/29351)을 참고한다. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 특별히 포함된다 (또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조). 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합 및 감소된 반감기를 갖는 항체는 US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 구역의 FcRn에 대한 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 구역을 포함한다. 변경된 Fc 구역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 6,194,551 B1 및 WO99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 특별히 포함된다 (또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 참조).
한 측면에서, 본 발명은 이종이량체화를 용이하게 하고/하거나 촉진시키는, Fc 구역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내에 돌출부를, 제2 Fc 폴리펩티드 내에 "캐비티"를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 돌출부는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시키기 위해 캐비티 내에 위치할 수 있다. 상기 변형을 갖는 항체를 생성시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,731,168에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
9. 항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물에서의 안정성 때문에 제조상의 잇점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에서 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체와 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 컨쥬게이트가 제공된다. 한 실시태양에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 치사시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
B. 항체의 특정 제조 방법
1. 특정 하이브리도마-기반 방법
본 발명의 항-TAT226 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. TAT226에 대한 항체는 일반적으로 TAT226 및 어쥬번트 (adjuvant)를 피하 (sc) 또는 복강 내로 (ip) 다수회 주사하여 동물에서 유도된다. TAT226은 그 일부가 본원에서 추가로 설명되는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, TAT226은 재조합 방식으로 생성시킬 수 있다. 한 실시태양에서, 동물을 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분에 융합된 TAT226의 세포외 부분을 포함하는 TAT226의 유도체로 면역화시킨다. 한 실시태양에서, 동물을 TAT226-IgG1 융합 단백질로 면역화시킨다. 한 실시태양에서, 동물을 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐 리서치, 인크. (Ribi Immunochem. Research, Inc., 미국 몬타나주 해밀턴)) 용액 중의 TAT226의 면역원성 유도체로 면역화시키고, 용액을 여러 부위에서 피내 주사한다. 2주 후, 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하고, 혈청을 항-TAT226 역가에 대해 분석한다. 동물을 역가가 안정한 수준에 도달할 때까지 부스팅한다.
별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
특정 실시태양에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 예시적인 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 ((American Type Culture Collection))에서 유도된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 TAT226에 결합하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역 측정법 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
2. 특정 라이브러리 스크리닝 방법
본 발명의 항-TAT226 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 항체를 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 일반적으로 문헌 [Hoogenboom et al. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)]에 기재되어 있고, 특정 실시태양에서는 문헌 [Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093]에 기재되어 있다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 구역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 상기 파지 라이브러리는 목적하는 항원에 대하여 친화도 크로마토그래피에 의해 선택된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 추가의 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 더욱 풍부해질 수 있다. 본 발명의 임의의 항-TAT226 항체는 목적하는 파지 클론에 대해 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 설계한 후, 목적하는 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 설명된 적합한 불변 구역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-TAT226 항체 클론을 구성함으로써 얻을 수 있다.
특정 실시태양에서, 항체의 항원 결합 도메인은 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 구역 (CDR)을 제시하는 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 구역 (각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 하나씩)으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 (여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 이들을 각각 불변 도메인에 융합되고, 비공유 상호작용한다) 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용될 때, scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 종합적으로 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 불린다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 따로 클로닝되고, 파지 라이브러리 내에 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 이는 항원 결합 클론에 대해 탐색될 수 있다. 면역화 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 별법으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 설명된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또는 자가 항원에 대해 단일 인간 항체 공급원을 제공하기 위해, 나이브 (naive) 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 구역을 코딩하기 위해 및 시험관 내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성적으로 제조될 수 있다.
특정 실시태양에서, 필라멘트상 파지는 부 코트 단백질 pIII에 대한 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사용된다. 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편으로서 (여기서, VH 및 VL 도메인은 예를 들어 문헌 [Marks et ah, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al , Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 설명된 바와 같이 하나의 사슬은 pIII에 융합되고, 다른 사슬은 세균 숙주 세포 원형질막 공간 내로 분비되고, 여기서 Fab-코트 단백질 구조의 조립체가 야생형 코트 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 디스플레이된다) 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수집한 면역 세포로부터 얻어진다. 항-TAT226 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우, 대상을 항체 반응을 생성하도록 TAT226으로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 제작을 위해 회수한다. 바람직한 실시태양에서, 항-TAT226 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 TAT226 면역화가 TAT226에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 갖는 (기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-TAT226 항체 반응을 생성함으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 아래에서 설명된다.
항-TAT226 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축은 예를 들어, TAT226 친화도 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 TAT226에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 TAT226-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기 위해 적합한 스크리닝 과정을 사용함으로써 얻을 수 있다.
별법으로, 비면역화 공여체로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 제시를 제공하고, 또한 TAT226이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용하여 항체 라이브러리의 제작을 허용한다. 시험관 내 항체 유전자 구성을 포함하는 라이브러리를 위해, 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 줄기 세포를 대상으로부터 수집한다. 목적하는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 토끼, 늑대, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 새 종 등으로부터 얻을 수 있다.
항체 가변 유전자 세그먼트 (예를 들어 VH 및 VL 세그먼트)를 코딩하는 핵산을 목적하는 세포로부터 회수하고 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후, 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 설명된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용하여 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있다. V 유전자는 문헌 ([Orlandi et al (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 설명된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서 역방향 프라이머 및 J-세그먼트 내에 기반한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역방향 프라이머가 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991)에 설명된 바와 같이 리더 (leader) 엑손에 기반할 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)에 설명된 바와 같이 불변 구역 내에 기반할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 ([Orlandi et al. (1989)] 또는 [Sastry et al. (1989)])에 설명된 바와 같이 다의성 (degeneracy)을 프라이머 내에 포함시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]의 방법 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭하기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 (rare) 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 설명된 바와 같이 한 단부에서 태그 (tag)로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관 내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝되고 서열결정되고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되었고 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 상기 클로닝된 세그먼트 (H1 및 H2 루프의 주요 배위를 모두 포함함)는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 설명된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 갖도록 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트는 클로닝되고 서열결정되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993)에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리 (VH 및 VL 폴드 (fold)의 범위, 및 L3 및 H3 길이에 기반하는)는 상당히 구조적으로 다양한 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DN의 증폭 후, 생식세포 V-유전자 세그먼트는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관 내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇 가지 방식으로 함께 결합함으로써 제작될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어, 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 설명된 바와 같이 시험관 내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어, 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993))에 설명된 loxP 시스템에 의해 생체 내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 방안은 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-사슬 특성을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 따로 클로닝된다. 이어서, 2개의 라이브러리는 파지미드-함유 세균의 파지 감염에 의해 결합되어, 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수에 의해서만 제한된다 (약 1012 클론). 두 벡터는 생체내 재조합 신호를 함유하여, VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상으로 재조합되고, 파지 비리온 내로 동시에 패키징된다. 상기 큰 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10-8 M의 Kd -1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
별법으로, 레퍼토리들은 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후 클로닝될 수 있다. PCR 조립은 또한 VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 설명된 바와 같이 "세포내 PCR 조립"이 VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 결합시킨 후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성의)에 의해 생산된 항체는 중등도 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1)의 것일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al (1994), 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선택함으로써 시험관 내에서 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류-허용 (error-prone) 중합효소 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고된)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 해당 CDR에 이르는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위 돌연변이시키고, 보다 고친화도 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에서는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 구역에서 돌연변이를 유발하는 방법을 설명한 바 있다. 다른 효과적인 방안은 비면역화 공여체로부터 얻은 천연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 사슬 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화도가 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, TAT226은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 세포 분류에서 사용되거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 컨쥬게이팅되거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝 (panning)하기 위한 임의의 다른 당업계에 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키기 위해 적합한 조건 하에 고정된 TAT226와 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 산으로, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리로, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 과정으로 TAT226 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 단일 선택 라운드에서 20-1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지를 세균 배양액에서 성장시키고, 추가의 선택 라운드를 실행시킬 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안 해리 운동학, 및 단일 파지 상에서 다수 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지 여부를 포함한 많은 요인에 좌우된다. 빠른 해리 운동학 (및 약한 결합 친화도)를 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상에서 높은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 보유될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합에 유리하다. 느린 해리 운동학 (및 우수한 결합 친화도)를 갖는 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)]과 WO 92/09690에 설명된 바와 같이 오랜 세척 및 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 설명된 바와 같이 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 촉진될 수 있다.
상이한 친화도의, 심지어 TAT226에 대해 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체를 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 선택된 항체 (예를 들어 일부 친화도 성숙 기술에서 수행된 바와 같이)의 무작위 돌연변이는 항원에 가장 강하게 결합하고, 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. TAT226을 제한하면, 드문 고친화도의 파지가 경쟁에 의해 제거될 수 있다. 보다 고친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지는 과량의 비오티닐화 TAT226과 함께 인큐베이팅될 수 있지만, 비오티닐화 TAT226은 TAT226에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고친화도-결합 파지는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 (paramagnetic) 비드에 의해 포획될 수 있다. 상기 "평형 포획"으로 항체는 그들의 결합 친화도에 따라 선택될 수 있고, 그의 민감도는 친화도가 보다 낮은 매우 과량의 파지로부터 2배 더 높은 수준의 낮은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론의 단리를 허용한다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 운동학을 기초로 하여 식별하기 위해 조작될 수 있다.
항-TAT226 클론은 활성에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 본래 TAT226을 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 항-TAT226 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 TAT226 리간드와 TAT226 사이의 결합을 차단하지만, TAT226 리간드와 제2 단백질 사이의 결합은 차단하지 않는 항-TAT226 항체를 제공한다. 상기 항-TAT226 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 설명된 파지 라이브러리로부터 항-TAT226 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 세균 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 TAT226 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-TAT226 파지 클론을 고정된 TAT226에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 겹치고/겹치거나 공유하는 TAT226-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용출시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로, 목적하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론은 본원에 설명된 선택 과정을 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유래된 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 목적하는 중쇄 및 경쇄 코딩 구역을 특이적으로 증폭시키도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리된 후, DNA는 발현 벡터 내로 도입될 수 있고, 이어서 이는 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 달성하기 위해 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 세균에서 항체-코딩 DNA의 재조합 발현에 관한 문헌은 문헌 ([Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)])을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 구역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌]으로부터 얻을 수 있다)과 결합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. 임의의 이소형의 불변 구역, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 구역이 상기 목적에 사용될 수 있고, 상기 불변 구역은 임의의 인간 또는 동물종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예를 들어 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 다른 동물종의 불변 구역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 설명된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시태양에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 구역 DNA에 융합되어 모든 인간 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-TAT226 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어 하이브리도마 클론에서 유도된 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수 있다. 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩티드 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 연결시켜 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
3. 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입시킨다. 항체를 코딩하는 DNA를 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리하고 서열결정한다. 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 의해 결정된다. 일반적으로, 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물)에서 기원한다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 구역을 포함하여 임의의 이소형의 불변 구역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고, 상기 불변 구역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다.
a) 원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
(1) 벡터 제조
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열 결정될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 얻은 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적에 이용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라 상이한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유도된 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 일반적으로 이. 콜라이 종으로부터 유도된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 포함하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지도 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터 (Carter) 등의 미국 특허 5,648,237에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예를 들어 λGEM.TM.-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역된 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 두 종류의 프로모터, 즉 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어 하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 프로모터를 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 모두를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시태양에서, 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에, 이종 프로모터가 이용된다.
원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균 (예를 들어 다른 공지의 세균 또는 파지 프로모터)에서 기능하는 다른 프로모터도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하기 위해서 링커 또는 어댑터 (adaptor)를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위 (translocation)를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연적인 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 발현계의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 회합되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 회합을 허용한다 (Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)).
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적인 비율을 본 발명의 분비되고 적절하게 회합된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조정할 수 있는 발현계를 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 조정은 적어도 부분적으로는 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도의 동시 조정에 의해 달성된다.
번역 강도의 조정을 위한 한 가지 기술은 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons 등)에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 구역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 번역 강도로 생성됨으로써, 상기 인자를 특정 사슬의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 유발하는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 뉴클레오티드 서열의 변경은 침묵 변경이다. TIR의 변경은 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 가지 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크 (codon bank)"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치의 변화에 의해 달성될 수 있으며, 또한 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이 유발 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 그 안의 각각의 시스트론에 대한 일정 범위의 TIR 강도를 갖는 벡터의 세트가 생성된다. 상기 제한된 세트는 각각의 사슬의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에서 목적하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons 등)에 상세히 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 본 발명의 발현 벡터 구성체에 조합되도록 목적하는 개별 TIR을 선택한다.
본 발명의 항체 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어 이. 콜라이), 바실러스 (Bacilli) (예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis)), 장내세균 (Enterobacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 한 실시태양에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시태양에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 5,639,635)을 갖는 균주 33D3를 비롯한 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 들 수 있다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 비, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 상기 예는 제한적이라기보다는 예시적이다. 한정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 세균의 유도체를 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용될 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
(2) 항체 생산
숙주 세포를 상기 설명된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적절한, 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (luria broth) (LB)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어지는 군 중에서 선택된 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 특정 실시태양에서, 이. 콜라이의 성장 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 특정 실시태양에서, 이. 콜라이에 대해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 한 실시태양에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성체에 따라 다양한 다른 인듀서가 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 분쇄되면, 세포 파쇄물 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질을 예를 들어 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 특정 실시태양에서 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성체에 따라 다양한 인듀서를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 회합 및 폴딩을 개선시키기 위해, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (섀퍼론 (chaperone) 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시에 형질전환시킬 수 있다. 섀퍼론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 조지오 (Georgiou) 등의 미국 특허 6,083,715; 조지오 등의 미국 특허 6,027,888; [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]).
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어 문헌 ([Joly et al. (1998), 상기 문헌]; 조지오 등의 미국 특허 5,264,365; 조지오 등의 미국 특허 5,508,192; [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현계에서 숙주 세포로 사용된다.
(3) 항체 정제
한 실시태양에서, 본원에서 생산된 항체 단백질을 추가의 분석 및 사용을 위해 추가로 정제하여 실질적으로 균질한 제제를 수득한다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화도 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과.
한 측면에서, 고체상 상에 고정된 단백질 A가 본 발명의 항체 생성물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 구역에 고 친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 (Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 A가 고정되는 고체상은 유리 또는 실리카 표면, 또는 제어된 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼을 포함하는 컬럼일 수 있다. 일부 용도에서, 컬럼을 가능하게는 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하여 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A가 고정된 고체상에 적용하여 목적하는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 한다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 특이적으로 결합되지 않은 오염물을 제거한다. 최종적으로, 목적하는 항체를 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
b) 진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 일반적으로 다음 중 하나 이상의 비제한적인 성분을 포함한다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(1) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 목적하는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열, 또는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 구역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임 (reading frame)으로 라이게이션된다.
(2) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
(3) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커로도 지칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련될 경우 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택 처리시에도 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 일부 실시태양에서, 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시 형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).
(4) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 예를 들어, 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 구역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 구역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 특정 실시태양에서, 임의의 또는 모든 상기 서열이 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입될 수 있다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하는, 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수도 있다.
(5) 인핸서 요소 성분
고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소는 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
(6) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 구역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 구역이다. W094/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(7) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 보다 고등한 진핵 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
(8) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985)에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(9) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현계로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축할 수 있다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 편리한 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 예를 들어 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH의 용출 버퍼를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도로 사용하기 위한 항체의 제조를 위한 다양한 방법은 당업계에 널리 확립되어 있으며, 상기한 방법과 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당업자에 의해 적절한 것으로 간주된다.
C. 면역컨쥬게이트
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이팅된 본 발명의 임의의 항-TAT226 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 (상호교환가능하게 "항체-약물 컨쥬게이트", 즉 "ADC"로 언급됨)를 제공한다.
면역컨쥬게이트는 세포독성제, 즉, 암 치료시에 종양 세포를 사멸시키거나 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국소 전달을 위해 사용될 수 있다 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 4,975,278). 면역컨쥬게이트는 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달, 및 그 내부에서 세포내 축적을 허용하고, 여기서 상기 컨쥬게이팅되지 않은 약물의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 ([Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506]). 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 모두 상기 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) 상기 문헌). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용되는 독소는 세균 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 ([Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)), 및 칼리케아미신 ([Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 그의 세포독성 효과를 나타낼 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이팅될 때 불활성이거나 활성이 보다 작은 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)(등록상표) (이브리투모맙 티욱세탄, 바이오젠/아이덱 (Biogen/Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견된 CD20 항원에 대해 작용하는 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 이루어진 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트이다 (문헌 [Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 갖지만, 이를 투여하면 대부분의 환자에서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 컨쥬게이트인 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신; 와이어스 파마슈티칼스 (Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). 디술피드 링커 SPP를 통하여 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체-약물 컨쥬게이트인 칸투주맙 머탄신 (이뮤노젠, 인크. (Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 2상 시험이 진행되고 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티인 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체-약물 컨쥬게이트인 MLN-2704 (밀레니엄 팜. (Millennium Pharm.), 비지엘 바이올로직스 (BZL Biologics), 이뮤노젠, 인크.)는 현재 전립선 종양의 가능한 치료를 위해 개발되고 있다. 오리스타틴 펩티드인 오리스타틴 E (AE) 및 모노메틸오리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적임)에 컨쥬게이팅시켰고 (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784), 이는 현재 치료제 개발 중에 있다.
특정 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 항-TAT226 항체 및 화학치료제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역컨쥬게이트 생성에 유용한 화학치료제는 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 상기 참조). 효소 활성 독소 및 그의 단편도 사용될 수 있고, 본원에서 설명된다.
특정 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 항-TAT226 항체, 및 소분자 약물, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오리스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 세포독성 활성을 갖는 상기 약물의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 작은 분자 독소를 포함한다. 상기 면역컨쥬게이트의 예를 아래에서 보다 상세하게 설명한다.
1. 예시적인 면역컨쥬게이트
본 발명의 면역컨쥬게이트 (또는 "항체-약물 컨쥬게이트" ("ADC"))는 항-TAT226 항체가 선택적인 링커 (L)를 통해 하나 이상의 약물 모이어티 (D)에 컨쥬게이팅된 (즉, 공유 부착된) 하기 화학식 I의 컨쥬게이트일 수 있다.
[화학식 I]
Ab-(L-D)p
따라서, 항-TAT226 항체는 약물에 직접 또는 링커를 통해 컨쥬게이팅될 수 있다. 화학식 I에서, p는 약물당 약물 모이어티의 평균 수이고, 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티, 특정 실시태양에서 항체당 1 내지 약 8개의 약물 모이어티일 수 있다.
a) 예시적인 링커
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분으로는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")를 들 수 있다. 다양한 링커 성분이 당업계에 공지되어 있으며, 그 일부를 아래에서 설명한다.
링커는 세포에서 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커 (예를 들어, 히드라존), 프로테아제-감수성 (예를 들어, 펩티다제-감수성) 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 5,208,020)를 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 링커 성분은 항체를 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결시키는 "스트레처 (stretcher) 단위"를 포함할 수 있다. 예시적인 스트레처 단위를 아래에 제시한다 (물결선은 항체에 대한 공유 부착 부위를 나타낸다):
Figure pat00007
일부 실시태양에서, 링커 성분은 아미노산 단위를 포함할 수 있다. 하나의 상기 실시태양에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 가능하게 하여, 세포내 프로테아제, 예를 들어 리소좀 효소에 대한 노출시에 면역컨쥬게이트로부터 약물의 방출을 용이하게 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784] 참조). 예시적인 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 및 펜타펩티드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-라이신 (fk 또는 phe-lys); 또는 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글라이신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글라이신-글라이신-글라이신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 단위는 천연 발생 아미노산 잔기 및 소수 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그들의 특이성 측면에서 설계되고 최적화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 링커 성분은 항체를 약물 모이어티에 직접 또는 스트레처 단위 및/또는 아미노산 단위에 의해 연결시키는 "스페이서" 단위를 포함할 수 있다. 스페이서 단위는 "자가 희생적" 또는 "비-자가 희생적"일 수 있다. "비-자가 희생적" 스페이서 단위는 일부 또는 모든 ADC의 효소적 (예를 들어, 단백질 분해) 절단시에 스페이서 단위가 약물 모이어티에 결합된 상태로 유지되는 단위이다. 비-자가 희생적 스페이서 단위의 예는 글라이신 스페이서 단위 및 글라이신-글라이신 스페이서 단위를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 서열-특이적 효소적 절단에 감수성인 펩티드성 스페이서의 다른 조합도 고려된다. 예를 들어, 종양 세포 연관 프로테아제에 의한, 글라이신-글라이신 스페이서 단위를 포함하는 ADC의 효소적 절단은 ADC의 나머지로부터 글라이신-글라이신-약물 모이어티의 방출을 야기할 것이다. 하나의 상기 실시태양에서, 글라이신-글라이신-약물 모이어티는 이어서 종양 세포 내에서 별도의 가수분해 단계를 거치고, 이에 의해 글라이신-글라이신 스페이서 단위가 약물 모이어티로부터 방출된다.
"자가 희생적" 스페이서 단위는 별도의 가수분해 단계를 수행하지 않으면서 약물 모이어티의 방출을 가능하게 한다. 특정 실시태양에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 하나의 상기 실시태양에서, p-아미노벤질 알콜은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 벤질 알콜과 세포독성제 사이에 형성된다 (예를 들어, 문헌 [Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103] 참조). 한 실시태양에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)이다. 특정 실시태양에서, p-아미노 벤질 단위의 페닐렌 부분은 Qm으로 치환되고, 여기서 Q는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4의 정수이다. 자가 희생적 스페이서 단위의 예는 p-아미노벤질 알콜에 전기적으로 유사한 방향족 화합물 (예를 들어, US 2005/0256030 A1 참조), 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) 및 오르소- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 추가로 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시에 고리화를 겪는 스페이서, 예를 들어 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 5815); 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867)가 사용될 수 있다. 글라이신의 a-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447)도 ADC에 유용한 자가 희생적 스페이서의 예이다.
한 실시태양에서, 스페이서 단위는 아래에 제시된 분지쇄 비스(히드록시메틸)스티렌 (BHMS) 단위이고, 이것은 다수의 약물을 도입하고 방출시키기 위해 사용될 수 있다.
Figure pat00008
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4의 정수이고, n은 O 또는 1이고; p는 1 내지 약 20이다.
링커는 임의의 하나 이상의 상기 링커 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 링커는 하기 화학식 II에서 각 괄호 내에 제시된다.
[화학식 II ]
Ab-([Aa-Ww-Yy]-D)p
여기서, A는 스트레처 단위이고, a는 0 내지 1의 정수이고; W는 아미노산 단위이고; w는 0 내지 12의 정수이고; Y는 스페이서 단위이고, y는 0, 1, 또는 2이고; Ab, D, 및 p는 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같다. 상기 링커의 예시적인 실시태양은 본원에 참고로 포함되는 US 2005-0238649 A1에 기재되어 있다.
예시적인 링커 성분 및 그의 조합물은 화학식 II의 ADC와 관련하여 아래에 제시된다.
Figure pat00009
Figure pat00010
스트레처, 스페이서 및 아미노산 단위를 포함하는 링커 성분은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 US 2005-0238649 A1에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다.
b) 예시적인 약물 모이어티
(1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 3,896,111). 뒤이어, 특정 미생물도 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하기 위해 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 컨쥬게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기 적합한 메이탄신 화합물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리되거나 유전 공학 기술을 사용하여 생산할 수 있다 (Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973 참조). 또한, 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 공지된 방법에 의해 합성 방식으로 제조될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 C-19-데클로로 (미국 특허 4256746) (안사미토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 (미국 특허 4361650 및 4307016) (스트렙토마이세스 (Streptomyces) 또는 악티노마이세스 (Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조)과 같은 변형된 방향족 고리를 갖는 것; 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 (미국 특허 4,294,757) (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조), 및 다른 위치에 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 C-9-SH (미국 특허 4424219) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR) (US 4331598); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 4450254) (노카르디아 (Nocardia)로부터 제조됨); C-15-히드록시/아실옥시 (US 4364866) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조); C-15-메톡시 (미국 특허 4313946 및 4315929) (트레위아 누들를로라 (Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (미국 특허 4362663 및 4322348) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조); 및 4,5-데옥시 (US 4371533) (메이탄시놀의 삼염화티탄/LAH 환원에 의해 제조)와 같은 변형을 갖는 것을 포함한다.
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 실시태양은 하기 구조를 갖는 DM1; DM3; 및 DM4를 포함한다.
Figure pat00011
Figure pat00012
여기서, 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 대한 약물의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. SMCC에 의해 DM1에 연결된 HERCEPTIN(등록상표) (트라추주맙)은 보고된 바 있다 (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).
다른 예시적인 메이탄시노이드 항체-약물 컨쥬게이트는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서 Ab는 항체이고, p는 1 내지 약 8이다):
Figure pat00013
DM1이 BMPEO 링커를 통해 항체의 티올기에 연결된 예시적인 항체-약물 컨쥬게이트는 하기 구조 및 약어를 갖는다.
Figure pat00014
여기서, Ab는 항체이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 1, 2, 3 또는 4이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역컨쥬게이트, 그의 제조 방법, 및 이들의 치료 용도는 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 명백하게 포함되는 미국 특허 5,208,020, 5,416,064, US 2005/0276812 A1, 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트가 기재되어 있다. 컨쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대해 높은 세포독성을 보이는 것으로 밝혀졌고, 생체 내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 컨쥬게이팅된 면역컨쥬게이트를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 세포당 3x105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 컨쥬게이트는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,208,020 (그 개시 내용이 본원에 명백하게 참고로 포함됨) 참조). 항체 1분자에 컨쥬게이팅된 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타내지만, 심지어 하나의 독소/항체 분자도 네이키드 (naked) 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 그 개시 내용이 본원에 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 5,208,020 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] 및 US 2005/016993 A1에 개시된 것을 포함하여, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조를 위한, 당업계에 공지된 많은 연결기가 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 US 2005/0276812 A1, "Antibody-drug conjugates and Methods"에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 링커는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함한다. 추가의 링커가 본원에서 설명되고 예시된다.
항체와 메이탄시노이드의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 특정 실시태양에서, 디술피드 연결을 제공하기 위한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 또는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)이다.
링커는 결합 유형에 따라서 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 한 실시태양에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
(2) 오리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드성 유사체 및 유도체, 예를 들어 오리스타틴에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 5635483; 5780588). 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (미국 특허 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 오리스타틴 실시태양은 그 개시내용의 전문을 명백하게 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004]에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
펩티드성 약물 모이어티는 하기 화학식 DE 및 DF 중에서 선택될 수 있다:
Figure pat00015
Figure pat00016
여기서, DE 및 DF의 물결선은 독립적으로 각각의 위치에서 항체 또는 항체-링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나;
또는 R4 및 R5는 함께 화학식 -(CRaRb)n-의 카르보시클릭 고리를 형성하고, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보사이클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 0-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12이고, 여기서 R12는 C1-C8 알킬이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
각각의 R15는 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)nSO3-C1-C8 알킬이고;
각각의 R16은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)이고;
n은 0 내지 6의 정수이다.
한 실시태양에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, R5는 -H 또는 메틸이다. 예시적인 실시태양에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
또 다른 실시태양에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 실시태양에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 실시태양에서, R3 및 R4은 각각 이소프로필이고, R2 및 R6은e 각각 메틸이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이고, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 실시태양에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시태양에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시태양에서, R10은 -페닐이다.
예시적인 실시태양에서, Z가 -O-일 때, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
한 실시태양에서, Z가 -NH일 때, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
다른 실시태양에서, Z가 -NH일 때, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 DE의 예시적인 오리스타틴 실시태양은 MMAE이고, 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pat00017
화학식 DF의 예시적인 오리스타틴 실시태양은 MMAF이고, 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 대한 공유 부착을 나타낸다 (US 2005/0238649 및 문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124] 참조):
Figure pat00018
다른 약물 모이어티는 하기 MMAF 유도체를 포함하고, 물결선은 항체-약물 컨쥬게이트의 링커 (L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pat00019
Figure pat00020
한 측면에서, 상기 제시한 바와 같은 트리에틸렌 글리콜 에스테르 (TEG)를 포함하고 이로 제한되지 않는 친수성기가 R11에서 약물 모이어티에 부착될 수 있다. 임의의 특정 이론에 매이지 않지만, 친수성기는 약물 모이어티의 내재화 및 응집 방지를 돕는다.
오리스타틴/돌라스타틴 또는 그의 유도체를 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 실시태양은 본원에 참고로 명백하게 포함되는 US 2005-0238649 A1 및 문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124]에 기재되어 있다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 실시태양은 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서, "Ab"는 항체이고; p는 1 내지 약 8이고, "Val-Cit"는 발린-시트룰린 디펩티드이고; "S"는 황 원자이다:
Figure pat00021
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 예시적인 실시태양은 Ab-MC-PAB-MMAF 및 Ab-PAB-MMAF를 추가로 포함한다. 흥미롭게도, 단백질 분해에 의해 절단가능하지 않은 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역컨쥬게이트는 단백질 분해에 의해 절단가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역컨쥬게이트에 대응한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124] 참조). 이 경우에, 약물 방출은 세포 내에서 항체 분해에 의해 이루어지는 것으로 생각된다 (상기 문헌 참조).
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 2005-0238649 A1; 미국 특허 5635483; 미국 특허 5780588; 문헌 ([Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drag Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863] 및 [Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784])의 방법에 따라 제조될 수 있다.
특히, 화학식 DF의 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 예를 들어 MMAF 및 그의 유도체는 US 2005-0238649 A1 및 문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. DE의 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 예를 들어 MMAE 및 그의 유도체는 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 약물-링커 모이어티 MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE는 예를 들어 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784], 및 미국 특허 출원 공개 US 2005/0238649 A1에 기재된 바와 같은 통상적인 방법으로 편리하게 합성한 후, 목적하는 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다.
(3) 칼리케아미신
다른 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 컨쥬게이트를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 (American Cyanamid Company)의 특허)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드사의 미국 특허). 항체가 컨쥬게이팅될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 물질을 세포 내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 향상된다.
c) 다른 세포독성제
본 발명의 항체에 컨쥬게이팅될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
또한, 본 발명은 뉴클레오티드 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 항체 사이에 형성된 면역컨쥬게이트도 고려한다.
특정 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성 컨쥬게이팅된 항체의 생산을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 컨쥬게이트를 검출용으로 사용하는 경우에는, 컨쥬게이트는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 Tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
특정 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학치료제, WO 81/01145 참조)을 활성 약물, 예를 들어 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항-TAT226 항체를 포함할 수 있다. 상기 면역컨쥬게이트는 항체-의존 효소-매개 전구약물 요법 ("ADEPT")에서 유용하다. 본 발명의 항-TAT226 항체에 컨쥬게이팅될 수 있는 효소는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 효소는 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 본 발명의 항-TAT226 항체에 공유 결합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).
d) 약물 로딩
약물 로딩은 화학식 I의 분자에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수인 p에 의해 제시된다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D)일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 1 내지 20개의 약물 모이어티로 컨쥬게이팅된 항체의 집합체를 포함한다. 컨쥬게이팅 반응에 의한 ADC의 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광 분석, ELISA 분석, 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. 또한, ADC의 정략적 분포는 p의 측면에서 결정될 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 약물 로딩을 사용한 ADC로부터의 특정 값인 균질한 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성할 수 있다.
일부 항체-약물 컨쥬게이트에서, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 예시적인 실시태양에서와 같이 부착이 시스테인 티올인 경우, 항체는 단지 한개 또는 수개의 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는, 충분히 반응성인 티올기를 단지 한개 또는 수개 보유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 보다 큰 약물 로딩, 예를 들어 p>5는 특정 항체-약물 컨쥬게이트 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 상실을 야기할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6 또는 약 3 내지 약 5이다. 실제로, 특정 ADC에서, 항체당 약물 모이어티의 최적 비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있음이 밝혀졌다 (US 2005-0238649 A1 참조).
특정 실시태양에서, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 컨쥬게이션 반응 동안 항체에 컨쥬게이팅된다. 항체는 예를 들어 아래에서 논의되는 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올기를 포함하지 않고, 실제로 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 다리로서 존재한다. 특정 실시태양에서, 항체는 부분 또는 완전한 환원 조건 하에서 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원시켜 반응성 시스테인 티올기를 생성시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체는 변성 (denaturing) 조건에 적용되어 반응성 친핵기, 예를 들어 라이신 또는 시스테인을 드러내게 된다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비)은 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 비해 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 컨쥬게이션 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분 또는 제한 환원 조건에 의해 조절될 수 있다.
하나 초과의 친핵기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과, 이어서 약물 모이어티 시약과 반응할 경우, 생성되는 산물은 항체에 하나 이상의 약물 모이어티가 부차된 ADC 화합물의 혼합물임을 이해하여야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 분석에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개개의 ADC 분자는 질량 분광 분석에 의해 혼합에서 확인되고, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Hamblett, K. J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]; [Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004] 참조). 특정 실시태양에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 컨쥬게이션 혼합물로부터 단리될 수 있다.
e) 면역컨쥬게이트를 제조하는 특정 방법
화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. 두번째 경로를 통해 화학식 I의 ADC를 제조하기 위한 예시적인 방법은 본원에 참고로 명백하게 포함되는 US 2005-0238649 A1에 설명되어 있다.
항체 상의 친핵기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 라이신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 글리코실화된다)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리를 갖는다. 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원되도록, 항체를 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)로 처리함으로써 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 다리는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 라이신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어 아민을 티올로 전환시키는, 라이신 잔기와 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)의 반응에 의해 추가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵기와 항체 상의 친전자기, 예를 들어 알데히드 또는 케톤 카르보닐기 사이의 반응에 의해 생산할 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 항체는 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하도록 항체를 변형된다. 다른 실시태양에서, 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 한 실시태양에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 항체 내에 생성될 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 다른 실시태양에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체를 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 ([Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 상기 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모이어티 상의 친핵기는, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 가교결합제 시약, 즉 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드)를 사용하여 제조된 ADC를 고려하고, 이로 제한되지 않는다 (문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog] 참조).
다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO 94/11026 참조).
별법으로, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 재조합 DNA 분자는 컨쥬게이트의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 구역에 의해 분리되거나 또는 서로 인접해 있는 컨쥬게이트의 항체 및 세포독성 부분을 코딩하는 구역을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이팅시킬 수 있고, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환혈로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 컨쥬게이팅된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
D. 제약 제형
한 측면에서, 본 발명은 추가로 적어도 하나의 본 발명의 항-TAT226 항체 및/또는 적어도 하나의 그의 면역컨쥬게이트를 포함하는 제약 제형을 제공한다. 일부 실시태양에서, 제약 제형은 1) 항-TAT226 항체 및/또는 그의 면역컨쥬게이트, 및 2) 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 제형은 1) 항-TAT226 항체 및/또는 그의 면역컨쥬게이트, 및 임의로, 2) 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 추가의 치료제는 하기 섹션 E.2에서 설명되는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 포함하는 제약 제형은 목적하는 순도를 갖는 항체 또는 면역컨쥬게이트를 선택적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 보관을 위해 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제제의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 생체 내 투여를 위해 사용되는 제약 제형은 일반적으로 멸균된다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체 또는 면역컨쥬게이트가 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성 및 가능하게는 면역원성의 변경을 야기할 수 있다. 관련되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
E. 항-TAT226 항체 및 면역컨쥬게이트를 사용하는 방법
1. 진단 방법 및 검출 방법
한 측면에서, 본 발명의 항-TAT226 항체 및 면역컨쥬게이트는 생물학적 샘플 내에서 TAT226의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 용어 "검출하는"은 본원에서 사용될 때 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 도 13에 나열된 조직을 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 조직은 다른 조직에 비해 더 높은 수준으로 TAT226을 발현하는 정상 및/또는 암성 조직, 예를 들어, 난소, 신장, 뇌, 자궁내막, 부신, 뼈, 폐, 피부 및 연조직을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내에서 TAT226의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 방법은 생물학적 샘플을 TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-TAT226 항체와 접촉시키고, 항-TAT226 항체와 TAT226 사이에 복합체가 형성되는지 검출하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 TAT226의 발현 증가와 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 방법은 시험 세포를 항-TAT226 항체와 접촉시키고; TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포에 의한 TAT226의 발현 수준을 (정량적으로 또는 정성적으로) 결정하고; 시험 세포에 의한 TAT226의 발현 수준을 대조 세포 (예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직에서 기원하는 정상 세포 또는 상기 정상 세포와 대등한 수준으로 TAT226을 발현하는 세포)에 의한 TAT226의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서 대조 세포에 비해 시험 세포에 의한 TAT226의 더 높은 발현 수준은 TAT226의 발현 증가와 연관된 질환의 존재를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 시험 세포는 TAT226의 발현 증가와 연관된 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 얻어진다. 특정 실시태양에서, 질환은 세포 증식 질환, 예를 들어 암 또는 종양이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 세포 증식 질환은 암성 병태, 예를 들어 종양, 예를 들어, 암종 (상피성 종양) 및 모세포종 (배아 조직-유래 종양), 및 특정 실시태양에서, 난소암, 자궁암 (자궁내막암 포함), 및 신장모세포종 (예를 들어, 윌름 종양)을 포함하는 신장암을 포함한다. 난소암은 특히 난소에서 유래된 불균일한 악성 종양 집단을 포함한다. 약 90%의 악성 난소 종양은 상피에서 기원하고, 나머지는 생식세포 및 간질 종양이다. 상피성 난소 종양은 다음 조직학적 하위형으로 분류된다: 장액 선암종 (약 50%의 상피성 난소 종양을 구성함); 자궁내막양 선암종 (~20%); 점액 선암종 (~10%); 투명 세포 암종 (~5-10%); 브레너 (Brenner) (이행세포) 종양 (비교적 드문 종양임). 여성의 6번째로 흔한 암인 난소암에 대한 예후는 대체로 불량하고, 5년 생존율이 5-30%이다. 난소암의 검토를 위해, 문헌 ([Fox et al. (2002) "Pathology of epithelial ovarian cancer", in Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York)]; [Morin et al. (2001) "Ovarian Cancer", in Encyclopedic Reference of Cancer, pp.654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag, New York)])을 참조한다. 본 발명은 상기한 임의의 상피성 난소 종양 하위형, 특히 장액 선암종 하위형의 진단 또는 치료 방법을 고려한다.
특정 실시태양에서, 상기한 바와 같은 진단 또는 검출 방법은 세포 표면 상에 발현되는 TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 그의 표면 상에서 TAT226을 발현하는 세포로부터 얻은 막 제제에서 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 방법은 세포를 TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-TAT226 항체와 접촉시키고, 항-TAT226 항체와 세포 표면상의 TAT226 사이에 복합체가 형성되는지를 결정하는 것을 포함한다. 세포의 표면 상에 발현된 TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 검출하기 위한 예시적인 분석은 하기 실시예 D에서 설명되는 바와 같은 "FACS" 분석이다.
TAT226에 대한 항-TAT226 항체의 결합을 검출하기 위해 다른 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지된 항원 결합 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯, 방사 면역 측정법, ELISA (효소 연관 면역흡착 분석), "샌드위치 (sandwich)" 방사성 면역검정, 면역침전 분석, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정, 및 면역조직화학 (IHC)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 표지된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예를 들어 형광, 발색, 전자 밀집 (electron-dense), 화학발광, 및 방사성 표지), 및 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시퍼라제, 예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예를 들어 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체는 불용성 매트릭스 상에 고정된다. 고정은 용액에 유리된 상태로 남아있는 임의의 TAT226으로부터 항-TAT226 항체를 분리하는 것을 수반한다. 이것은 통상적으로 분석 절차 전에 항-TAT226 항체의 불용화에 의해, 수불용성 매트릭스 또는 표면에 대한 흡착에 의해 (Bennich 등, U.S. 3,720,760), 또는 공유 커플링 (예를 들어, 글루타르알데히드 가교결합 사용)에 의해, 또는 예를 들어 면역침전에 의해 항-TAT226 항체와 TAT226 사이의 복합체 형성 후에 항-TAT226 항체의 불용화에 의해 달성된다.
상기 진단 또는 검출을 위한 임의의 실시태양은 항-TAT226 항체 대신에 또는 항-TAT226 항체에 추가하여 본 발명의 면역컨쥬게이트를 사용하여 수행할 수 있다.
2. 치료 방법
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 예를 들어 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 생체 내 또는 시험관 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 세포를 TAT226에 대한 면역컨쥬게이트의 결합을 허용하는 조건 하에 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트에 노출시키는 것을 포함한다. "세포 성장 또는 증식을 억제하는"은 세포의 성장 또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 감소시키는 것을 의미하고, 세포 사멸의 유도를 포함한다. 특정 실시태양에서, 세포는 종양 세포이다. 특정 실시태양에서, 세포는 난소 종양 세포, 자궁 종양 세포, 뇌 종양 세포, 또는 신장 종양 세포이다. 특정 실시태양에서, 세포는 예를 들어 본원에서 예시되는 바와 같은 이종이식편이다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 세포 증식 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 특정 실시태양에서, 세포 증식 질환은 TAT226의 증가된 발현 및/또는 활성과 연관된다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 세포 증식 질환은 세포의 표면에서 TAT226의 발현 증가와 연관된다. 특정 실시태양에서, 세포 증식 질환은 종양 또는 암이다. 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트에 의해 치료되는 세포 증식 질환의 예는 암성 병태, 예를 들어 종양, 예를 들어, 암종 (상피성 종양) 및 모세포종 (배아 조직-유래 종양), 및 특정 실시태양에서, 난소암; 자궁암, 예를 들어 자궁내막암; 뇌 종양 (예를 들어, 다형성 아교모세포종으로도 언급되는 진행기 신경아교종을 포함하는 별아교세포종); 및 신장암, 예를 들어 신장모세포종 (예를 들어, 윌름 종양)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 세포 증식 질환을 치료하는 방법은 개체에게 항-TAT226 항체 및 임의로 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 아래에서 제시되는 것을 포함하는 제약 제형의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 세포 증식 질환을 치료하는 방법은 개체에게 1) 항-TAT226 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역컨쥬게이트; 및 임의로 2) 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어 아래에 제시되는 것을 포함하는 제약 제형의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트의 적어도 일부는 인간 이외의 다른 종으로부터 유래한 TAT226에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 예를 들어 TAT226을 함유하는 세포 배양액에서, 인간에서, 또는 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트가 교차-반응하는 TAT226을 갖는 다른 포유동물 (예를 들어 침팬지, 비비 (baboon), 마모셋, 사이노몰거스 원숭이 및 붉은털 원숭이, 돼지 또는 마우스)에서 TAT226에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 항-TAT226 항체 또는 면역컨쥬게이트는, 항체 또는 면역컨쥬게이트를 TAT226과 접촉시켜 TAT226 활성을 억제시킴으로써 TAT226 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, TAT226은 인간 TAT226이다.
한 실시태양에서, 항-TAT226 항체 또는 면역컨쥬게이트는 증가된 TAT226 발현 및/또는 활성과 연관된 질환으로 고통받는 개체에서 TAT226을 결합시키는 방법에 사용될 수 있고, 이 방법은 개체에 존재하는 TAT226이 결합되도록 개체에게 항체 또는 면역컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, TAT226은 인간 TAT226이고, 개체는 인간이다. 별법으로, 개체는 항-TAT226 항체가 결합하는 TAT226을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 개체는 TAT226가 도입된 (예를 들어, TAT226의 투여에 의해 또는 TAT226을 코딩하는 트랜스젠 (transgene)의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다.
항-TAT226 항체 또는 면역컨쥬게이트는 치료 목적으로 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 항-TAT226 항체 또는 면역컨쥬게이트는 수의용으로 또는 인간 질병의 동물 모델로서, 항체가 교차-반응하는 TAT226을 발현하는 비인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지, 래트 또는 마우스)에게 투여될 수 있다. 인간 질병의 동물 모델의 경우에, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 경로를 시험하는데) 유용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 적어도 하나의 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트와 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 추가의 치료제는 세포독성제, 화학치료제, 또는 성장 억제제이다. 하나의 상기 실시태양에서, 화학치료제는 백금 화합물 (예를 들어, 시스플라틴 또는 카르보플라틴); 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 또는 도세탁셀); 토포테칸; 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신 (ADRIAMYCIN(등록상표)) 또는 리포좀 독소루비신 (DOXIL(등록상표))); 겜시타빈; 시클로포스파미드; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 헥사메틸멜라민; 이포스파미드; 및 에토포시드와 같은 난소암 치료에 사용되는 물질 또는 물질의 조합물이다. 다른 상기 실시태양에서, 화학치료제는 시스플라틴, 카르보플라틴, 독소루비신, 파클리탁셀, 메토트렉세이트, 플루오로우라실 및 메드록시프로게스테론과 같은 자궁 또는 자궁내막암 치료에 사용되는 물질 또는 물질의 조합물이다. 다른 상기 실시태양에서, 화학치료제는 니트로소우레아 (예를 들어, 카르무스틴 또는 로무스틴); 세포독성제 (예를 들어, 이리노테칸 또는 테모졸아미드); 항-혈관형성제 (예를 들어, 탈리도마이드, TNP-470, 혈소판 인자 4, 인터페론 및 엔도스타틴); 분화제 (예를 들어, 레티노이드, 페닐부티레이트, 페닐아세테이트, 및 항-네오플라스톤); 항-침습제 (예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 예를 들어 마리마스타트); 신호전달 조절인자 (예를 들어, 타목시펜, 브리오스타틴, 및 O-6 벤지구아닌); 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 이리노테칸 또는 토포테칸); 및 성장 인자 억제제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제)와 같은 뇌 종양 치료에 사용되는 물질 또는 물질의 조합물이다. 다른 상기 실시태양에서, 화학치료제는 빈크리스틴, 악티노마이신 D, 아드리아마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 에토포시드 및 카르보플라틴과 같은 신장암 (예를 들어, 윌름 종양) 치료에 사용되는 물질 또는 물질의 조합물이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 소염제 및/또는 항균제와 조합될 수 있다.
상기 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제형에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하고, 개별 투여시에, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트의 투여는 추가의 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 방사선 요법과 조합될 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트 (및 임의의 추가의 치료제 또는 어쥬번트)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료용으로 필요할 경우의 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체 또는 면역컨쥬게이트는 적합하게는 특히 항체 또는 면역컨쥬게이트의 감소하는 투여량으로 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여량은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 간단한지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해서 수행될 수 있다.
결합 표적이 뇌 내에 위치할 때, 본 발명의 특정 실시태양은 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체 또는 면역컨쥬게이트를 제공한다. 물리적 방법, 지질-기반 방법, 줄기세포 기반 방법 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 당업계에 공지된 복수의 방법이 존재한다.
항체 또는 면역컨쥬게이트를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하기 위한 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽을 완전히 우회하거나, 또는 혈액-뇌 장벽에 개구부를 생성시키는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌 내로의 직접 주입 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 간질 (interstitial) 주입/전달 강화 전달 (convection-enhanced delivery) (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내에 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 및 Gliadel Wafers™, 길포드 파마슈티칼 (Guildford Pharmaceutical) 참조)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 장벽에 개구부를 생성시키는 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2002/0038086 참조), 삽투압 (예를 들어, 고장성 (hypertonic) 만니톨의 투여에 의해 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)]), 예를 들어, 브라디키닌 또는 투과제 (permeabilizer) A-7에 의한 투과 (예를 들어 미국 특허 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 혈액-뇌 장벽에 걸쳐 있는 신경세포의, 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0083299 참조)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
항체 또는 면역컨쥬게이트를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 지질-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀 내에 항체 또는 면역컨쥬게이트의 봉입 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20020025313 참조), 및 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20040131692 참조)를 사용한 항체 또는 면역컨쥬게이트의 코팅을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
항체 또는 면역컨쥬게이트를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 줄기-세포 기반 방법은 목적하는 항체 또는 면역컨쥬게이트를 발현하도록 신경 전구세포 (NPC)를 유전공학에 의해 처리한 후, 줄기 세포를 치료될 개체의 뇌에 이식하는 것을 수반한다. 문헌 [Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 advanced online publication]을 참조한다 (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전공학에 의해 처리된 NPC가 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식될 때 파킨슨병의 증상을 감소시킨다고 보고함).
항체 또는 면역컨쥬게이트를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하기 위한 수용체 및 채널-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어 미국 특허 출원 공개 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송제의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0073713 참조); 트랜스페린을 사용한 항체 또는 면역컨쥬게이트의 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조정 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0129186 참조), 및 항체 또는 면역컨쥬게이트의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 5,004,697 참조)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트는 우수한 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화, 투여량화 및 투여될 것이다. 이러한 측면에서 고려되는 인자는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체 또는 면역컨쥬게이트는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 질환을 예방하거나 치료하는데 통상적으로 사용되는 1종 이상의 물질과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체 또는 면역컨쥬게이트의 양, 질환 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 결정된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트의 적절한 투여량 (단독으로 또는 화학치료제와 같은 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 경우)은 치료될 질병의 종류, 항체 또는 면역컨쥬게이트의 종류, 질병의 심도 및 과정, 항체 또는 면역컨쥬게이트가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체 또는 면역컨쥬게이트에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 의존할 것이다. 항체 또는 면역컨쥬게이트는 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질병의 종류 및 심도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여로든 연속 주입으로든, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 O.1 mg/kg 내지 1O mg/kg)의 항체 또는 면역컨쥬게이트가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 큰 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질병 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 가지 예시적인 항체 또는 면역컨쥬게이트의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 20회, 예를 들어 약 6회 투여량의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 로딩 투여량, 이어서 1회 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여량 처방은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 로딩 투여량 후에 약 2 mg/kg의 항체를 매주 유지 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
3. 분석
본 발명의 항-TAT226 항체 및 면역컨쥬게이트는 당업계에 공지된 상이한 분석에 의해 그들의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
a) 활성 분석
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어, 세포 성장 또는 증식을 억제하는 활성 (예를 들어, "세포 사멸" 활성), 또는 프로그래밍된 세포 사멸 (세포자멸)을 포함하는 세포 사멸을 유도하는 활성을 포함할 수 있다. 또한, 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 상기 생물학적 활성을 갖는 항체 또는 면역컨쥬게이트도 제공된다.
특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트를 시험관 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 시험한다. 세포 성장 또는 증식 억제에 대한 분석은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본원에서 설명된 "세포 사멸" 분석에 의해 예시된, 세포 증식에 대한 특정 분석은 세포 생활력을 측정한다. 하나의 상기 분석은 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생활력 분석 (Luminescent Cell Viability Assay)이고, 이는 프로메가 (Promega, 미국 위스콘신주 매디슨))로부터 상업적으로 입수가능하다. 상기 분석은 대사적 활성 세포를 나타내는 존재하는 ATP의 정량에 기초하여 배양액 내의 생활성 세포의 수를 결정한다 (문헌 [Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 6602677 참조). 분석은 분석을 자동 고효율 스크리닝 (HTS)에 적용하도록 하는 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있다 ([Cree et al (1995) Anticancer Drugs 6:398-404] 참조). 분석 과정은 단일 시약 (CellTiter-Glo(등록상표) 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 수반한다. 이에 의해, 세포가 용해되고, 루시퍼라제 반응에 의한 발광 신호가 생성된다. 발광 신호는 배양액 내에 존재하는 생활성 세포의 수에 정비례하는, 존재하는 ATP의 양에 비례한다. 데이타는 발광광도계 또는 CCD 카메라 영상 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 정도는 상대 광 단위 (RLU)로서 표현된다.
세포 증식에 대한 다른 분석은 미토콘드리아 리덕타제에 의한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드의 포르마잔으로의 산화를 측정하는 비색 분석인 "MTT" 분석이다. CellTiter-Glo™ 분석과 마찬가지로, 상기 분석은 세포 배양액 내에 존재하는 대사적 활성 세포의 수를 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63], 및 [Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882] 참조).
한 측면에서, 항-TAT226 항체는 시험관 내에서 세포 사멸을 유도하는 그의 능력에 대해 시험된다. 세포 사멸 유도에 대한 분석은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 상기 분석은 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 (문헌 [Moore et al. (1995) Cytotechnology 17:1-11] 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가되는 막 통합성의 상실을 측정한다. 예시적인 PI 섭취 분석에서, 세포는 10% 열-불활성화 FBS (하이클론 (Hyclone)) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 둘베코 개질 이글 배지 (D-MEM):햄 F-12 (50:50)에서 배양된다. 따라서, 분석은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행된다. 세포를 100 x 20 mm 디쉬 내에 디쉬 당 3x106의 밀도로 접종하고, 철야 부착시킨다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로 또는 다양한 농도의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 인큐베이팅한다. 처리 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신화에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 1200 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 3 ml의 차가운 Ca2+ 결합 버퍼 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁시키고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 mm의 스트레이너 뚜겅이 있는 (strainer-capped) 12 x 75 mm 튜브 (1 ml/튜브, 처리군당 3개의 튜브) 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 넣는다. FACSCAN™ 유동 세포 측정기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))를 사용하여 샘플을 분석한다. PI 섭취에 의해 측정될 때 통계상 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 항체 또는 면역컨쥬게이트가 이와 같이 확인된다.
한 측면에서, 항-TAT226 항체 또는 면역컨쥬게이트가 시험관 내에서 세포자멸 (프로그래밍된 세포 사멸)을 유도하는 그의 능력에 대해 시험된다. 세포자멸을 유도하는 항체 또는 면역컨쥬게이트에 대한 예시적인 분석은 아넥신 결합 분석이다. 예시적인 아넥신 결합 분석에서, 상기 문단에서 설명한 바와 같이 세포를 배양하고 디쉬 내에 접종한다. 배지를 제거하고, 신선한 배지 단독으로 또는 0.001 내지 10 ㎍/ml의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 함유하는 배지로 교체한다. 3일의 인큐베이션 기간 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신화에 의해 탈착시킨다. 이어서, 세포를 원심분리하고, Ca2+ 결합 버퍼에 재현탁시키고, 상기 문단에서 설명한 바와 같이 튜브 내로 분취한다. 이어서, 튜브에 표지된 아넥신 (예를 들어 아넥신 V-FITC) (1 ㎍/ml)을 넣는다. FACSCAN™ 유동 세포 측정기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))를 사용하여 샘플을 분석한다. 대조군에 비해 통계상 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 항체 또는 면역컨쥬게이트가 이와 같이 확인된다. 세포자멸을 유도하는 항체 또는 면역컨쥬게이트에 대한 다른 예시적인 분석은 게놈 DNA의 뉴클레오좀내 (internucleosomal) 분해를 검출하기 위한 히스톤 DNA ELISA 비색 분석이다. 상기 분석은 예를 들어, 세포 사멸 검출 ELISA 키트 (로슈 (Roche, 미국 캘리포니아주 팔로 알토))를 사용하여 수행할 수 있다.
임의의 상기 시험관 내 분석에 사용하기 위한 세포는 자연적으로 TAT226을 발현하거나 TAT226을 발현하도록 유전공학으로 처리된 세포 또는 세포주를 포함한다. 상기 세포는 동일한 조직에서 기원하는 정상 세포에 비해 TAT226을 과다발현하는 종양 세포를 포함한다. 상기 세포는 또한 TAT226을 발현하는 세포주 (종양 세포주 포함), 및 정상적으로 TAT226을 발현하지 않지만 TAT226을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포주를 포함한다. 임의의 상기 시험관 내 분석에 사용하기 위해 본원에서 제공되는 예시적인 세포주는 TAT226을 발현하는 OVCAR3 인간 난소암 세포주, 및 TAT226을 코딩하는 핵산으로 형질감염된 HCT116 인간 결장암 세포주를 포함한다.
한 측면에서, 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트는 생체 내에서 세포 성장 또는 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트는 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 생체 내 모델 시스템, 예를 들어 이종이식 모델이 상기 시험을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 이종이식 시스템에서, 인간 종양 세포를 적합하게 면역손상시킨 비인간 동물, 예를 들어, 흉선이 없는 "누드" 마우스에 도입한다. 본 발명의 항체 또는 면역컨쥬게이트를 동물에게 투여한다. 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 항체 또는 면역컨쥬게이트의 능력을 측정한다. 상기 이종이식 시스템의 특정 실시태양에서, 인간 종양 세포는 인간 환자로부터의 종양 세포이다. 상기 이종이식 모델은 온코테스트 게엠베하 (Oncotest GmbH, 독일 프라이베르크))로부터 상업적으로 이용가능하다. 특정 실시태양에서, 인간 종양 세포는 인간 종양 세포주로부터의 세포, 예를 들어 본원에서 예시된 OVCAR3 세포이다. 특정 실시태양에서, 인간 종양 세포는 피하 주사에 의해 적합하게 면역손상시킨 비인간 동물 내로 또는 이식에 의해 적합한 부위, 예를 들어 유지방체 (mammary fat pad) 내로 도입된다.
b) 결합 분석 및 다른 분석
한 측면에서, 항-TAT226 항체를 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 항-TAT226 항체를 세포 표면 상에 발현되는 TAT226에 결합하는 그의 능력에 대해 시험한다. 실시예 D에 설명된 것과 같은 FACS 분석을 상기 시험을 위해 사용할 수 있다.
한 측면에서, 경쟁 분석은 TAT226에 대한 결합을 위해 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6과 경쟁하는 모노클로날 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 경쟁 항체는 YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 예시적인 경쟁 분석은 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]에 제시된 것과 같은 통상적인 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑 (mapping)하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제시되어 있다. 두 항체가 각각 서로 다른 항체의 결합을 50% 이상 차단할 경우 두 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 언급된다.
예시적인 경쟁 분석에서, TAT226에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6) 및 TAT226에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 고정된 TAT226을 인큐베이팅한다. 제2 항체는 하이브리도마 상등액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 제1 표지된 항체만을 포함하고 제2 비표지된 항체가 존재하지 않는 용액 중에서 고정된 TAT226을 인큐베이팅한다. TAT226에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션한 후, 과량의 비결합 항체를 제거하고, 고정된 TAT226과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 TAT226과 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소할 경우, 이것은 제2 항체가 TAT226에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁함을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 고정된 TAT226은 세포의 표면에 또는 그의 표면에 TAT226을 발현하는 세포로부터 수득한 막 제제에 존재한다.
한 측면에서, 정제된 항-TAT226 항체는 N-말단 서열 결정, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광 분석, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하고 이로 제한되지 않는 일련의 분석에 의해 추가로 특성화될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 항체를, 생체 내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예를 들어 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 많은 용도에 대한 바람직한 후보가 되게 하는, 모든 효과기 기능이 아니라 효과기 기능의 일부만을 보유하는 변경된 항체를 고려한다. 특정 실시태양에서, 목적하는 특성만이 유지되는 것을 보장하기 위해 항체의 Fc 활성이 측정된다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석은 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있음), 항체가 FcRn 결합능을 보유하는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 예는 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재되어 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 들 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 분석을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없는지를 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
F. 제품
본 발명의 다른 측면에서, 상기한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 제품은 용기, 및 상기 용기 상의 라벨 또는 상기 용기와 결합된 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합하여 포함하며, 멸균 주입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 (bag), 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개 (stopper)를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체 또는 그의 면역컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 제품은 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 버퍼를 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
IV. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 실시태양이 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
A. TAT226 유전자 발현의 분석
인간 TAT226 유전자 발현을 유전자 발현 정보를 보유하는 독점 데이타베이스 (GeneExpress(등록상표), 진 로직 인크. (Gene Logic Inc., 미국 매릴랜드주 개터스버그))를 사용하여 분석하였다. GeneExpress(등록상표) 데이타베이스의 그래프 분석은 마이크로어레이 프로필 뷰어 (viewer)를 사용하여 수행하였다. 도 13은 좌측에 나열된 다양한 조직에서 TAT226 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다. 그래프의 상부의 눈금은 혼성화 신호 강도에 기초한 유전자 발현 수준을 나타낸다. 점이 각각의 나열된 조직에 인접한 선의 상하부에 나타난다. 선의 상부에 나타나는 점은 정상 조직에서의 유전자 발현을 나타내고, 선의 하부에 나타나는 점은 종양 또는 질병에 걸린 조직에서의 유전자 발현을 나타낸다. 도 13은 그들의 정상 상대 조직에 비해 종양 또는 질병에 걸린 조직에서 TAT226 유전자 발현 증가 경향을 보여준다. 특히, TAT226은 정상 난소에 비해 종양성 및 질병에 걸린 난소에서 및 정상 신장에 비해 윌름 종양에서 실질적인 과다발현을 보인다. 정상 조직에 비해 종양 또는 질병에 걸린 조직에서 과다발현을 보이는 다른 조직은 자궁내막, 부신, 뼈, 폐, 피부 및 연조직을 포함한다. 또한, TAT226은 정상 뇌 조직 (예를 들어 후각뇌, 해마 및 기저핵)과 종양성 또는 질병에 걸린 뇌 조직, 예를 들어 신경아교종에서 강하게 발현된다.
또한, GeneExpress(등록상표) 데이타베이스를 정상 난소; 정상 나팔관; 투명 세포, 점액 및 장액 낭선암종 하위형의 난소암; 전이 난소암; 및 다른 종류의 난소암에서 인간 TAT226 유전자 발현을 분석하기 위해서도 사용하였다. 그 결과를 도 14에 그래프로 보고하고, 특정 조직 종류를 그래프 아래에 표시한다. 그래프의 y축 상의 눈금은 혼성화 신호 강도에 기초한 유전자 발현 수준을 나타낸다. 장액 낭선암종 및 전이 난소암은 정상 난소에 비해 TAT226의 강한 과다발현을 보였다. 투명 세포 및 점액 하위형은 정상 난소에 상당하는 발현을 보였다. 정상 나팔관은 또한 TAT226의 실질적인 발현을 보였다. 특히, 장액 하위형의 난소암은 조직학적으로 나팔관 상피에 거의 유사하고, 난소 및 나팔관은 모두 동일한 배아 조직으로부터 유래한다 (문헌 [Fox et al. (2002) "Pathology of epithelial ovarian cancer", in Ovarian Cancer ch.9 (Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York)] 참조).
B. 항-TAT226 항체의 생성
TAT226에 대한 항체는 서열 75의 아미노산 1-115 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 포함하는 재조합 "TAT226-His" 융합 단백질를 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성하였다. 파지 디스플레이 라이브러리는 Fab'-zip-파지 시스템을 사용하여 생성된 합성 (Fab')2 라이브러리였다 (문헌 [Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132] 참조). 라이브러리는 huMAb4D5-8 중쇄 가변 구역의 프레임워크 내의 중쇄 HVR의 라이브러리 (도 5A와 5B 참조, 제2 억셉터 "B", 서열 50, 51, 57, 35) 및 서열 26에 도시된 고정된 huMAb4D5-8 경쇄 가변 구역을 포함하였다. 파지 디스플레이를 사용하여 선택된 클론을 파지 ELISA를 이용하여 TAT226-His에 대해 스크리닝하였다 (예를 들어, 문헌 [Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338:299-310] 참조). 클론 YWO.32와 YWO.49를 추가의 분석을 위해 선택하였다.
YWO.49의 친화도를 개선하기 위해, 파지 디스플레이 라이브러리를 소프트-무작위화를 위해 표적화된 HVR-H3 및 HVR-L3을 사용하여 YWO.49의 배경에서 생성하였고, 여기서 지정된 HVR 내의 선택된 아미노산 잔기는 일정하게 유지되지만, 다른 것은 돌연변이 유발시켰다. 선택된 클론을 파지 ELISA에 의해 스크리닝하였다. YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6으로 지정된 친화도 성숙 항체를 추가의 분석을 위해 선택하였다. YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 VH 및 VL 구역의 뉴클레오티드 및 코딩된 폴리펩티드 서열은 도 9 및 10에 도시된 바와 같이 결정되었다. YWO.32, YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 중쇄 및 경쇄 HVR 서열을 도 2-4에 도시한다. YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6으로부터 유래된 컨센서스 HVR-H3 및 HVR-L3 서열을 또한 도 4에 도시한다. YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6은 재조합 기술을 이용하여 Fab' 단편을 적절한 불변 구역 상에 그라프팅함으로써 전장 IgG로서 "재설정되었다 (reformatted)". 이하 설명된 실험은 재설정된 항체를 사용하여 수행하였다.
C. 재조합 항원에 대한 결합 친화도의 특성화
재조합 항원에 대한 YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 및 YWO.49.H6의 결합 친화도를 BIACORE(등록상표) 3000 시스템 (비아코어, 인크. (Biacore, Inc., 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정하였다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 활성화하였다. 항-TAT226 항체를 1O mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 ㎍/ml로 희석한 후, 커플링된 항체의 약 500 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주사하였다. 이어서, 1M 에타올아민을 주사하여 비반응된 군을 차단하였다. 운동학 측정을 위해, TAT226-His의 2배 계열 희석액 (0.7 nM 내지 50O nM)을 25℃에서 0.05% Tween 20이 존재하는 PBS 중에서 25 ㎕/min의 유속으로 주사하였다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 단순 일대일 랭그뮈어 결합 모델 (BIAcore 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산하였다. 상기 실험의 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
클론 kon/105 koff/10-4 Kd (nM)
YWO.49 0.074 3.49 47.16
YWO.49.B7 0.27 <0.05 <0.18
YWO.49.C9 1.53 <0.05 <0.03
YWO.49.H2 0.22 0.05 0.23
YWO.49.H6 1.86 0.09 0.05
D. 세포 표면 TAT226에 대한 항체 결합의 특성화
OVCAR3 (인간 난소암 세포주)의 표면 상에 발현되는 TAT226에 결합하는 항-TAT226 항체의 능력을 검사하였다. 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 0VCAR3 세포에서 YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2, 또는 YWO.49.H6의 부재 및 존재 하에 수행하였다. 간단히 설명하면, 탈착시킨 세포를 5 ㎍/ml 일차 항체와 함께 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하고, 세척하고, 2차 항체 (피코에리트린에 컨쥬게이팅된 항-인간 IgG)와 함께 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. FACS는 FACScan™ 유동 세포계 (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 수행하였다.
YWO.49, YWO.49.H2, 및 YWO.H6에 대한 FACS 분석 결과를 도 15에 도시한다. 각각의 그래프의 좌측 상의 피크는 "배경" 결합, 즉, 2차 항체 자체만의 결합을 나타낸다. 각각의 그래프의 우측 상의 피크는 표시된 항-TAT226 항체의 결합을 나타낸다. YWO.49.B7은 비록 YWO.49 및 다른 친화도 성숙 항체에 대해 관찰된 Kd의 범위 내의 Kd로 재조합 항원에 결합하였지만 (BIACORE(등록상표) 분석 결과 참조, 상기 표 2), FACS에 의해서는 OVCAR3 세포에 유의하게 결합하지 않았다. YWO.49.C9의 결합은 YWO.49.H2 및 YWO.H6에 대해 관찰된 것에 상당하였다.
E. 세포 표면 항원에 대한 결합 친화도의 특성화
경쟁 분석을 이용하여 0VCAR3 세포의 표면 상에 발현된 TAT226에 대한 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6의 결합 친화도를 검사하였다. 간단히 설명하면, 표지된 (요오드화된) YWO.49.H2 또는 YWO.49.H6을 표지되지 않은 항체의 존재 하에 0VCAR3 세포에 결합시켰다. 항체의 결합 친화도는 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]에 처음으로 설명된 스캐챠드 분석 방법에 따라 결정하였다. 상기 실험의 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
클론 Kd (nM)
YWO.49.H2 0.348
YWO.49.H6 0.404
YWO.49.H2 및 YWO.49.H6의 Kd는 재조합 TAT226-His에 비해 OVCAR3 세포의 표면에 발현된 TAT226에 대해 더 높고 (표 2 및 3에서 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6에 대한 Kd 비교), 이는 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6이 OVCAR3 세포의 표면에 발현된 TAT226에 대해서보다 재조합 TAT226-His에 대해 약간 더 높은 친화도로 결합하는 것을 나타낸다.
F. TAT226 mRNA 및 단백질 발현
OVCAR3 세포에서 및 난소암 샘플의 패널에서 TAT226 mRNA 발현은 5' 뉴클레아제 (TaqMan(등록상표)) 분석 및 실시간 정량적 PCR을 이용하여 분석하였다. 도 16에서 "HF ####"으로 지정된 난소암 샘플은 동결된 조직 절편이었다. 조직 절편으로부터 RNA를 단리하고, 앰비온 (Ambion)의 Message Amp II 키트 (앰비온, 미국 텍사스주 오스틴))를 사용하여 증폭하고, cDNA로 역전사시켰다. OVCAR3 세포로부터 RNA를 단리하고, cDNA로 역전사시켰다. TAT226 cDNA를 증폭 산물에 특이적인 비-연장가능 리포터 프로브의 존재 하에 실시간 PCR에 의해 증폭하였다. 역치 사이클 또는 "Ct" (리포터 프로브의 절단으로부터 생성된 신호가 배경을 초과하는 사이클)를 결정하고, 출발 TAT226 mRNA 수준을 계산하기 위해 사용하였다. 난소암 샘플의 패널에서 TAT226 mRNA의 수준은 도 16의 막대 그래프에 도시된 바와 같이 OVCAR3 세포에서의 TAT226 mRNA의 수준에 대해 표현하였다.
OVCAR3 세포 및 상기 난소암 샘플의 패널에서 TAT226 단백질 발현을 아래와 같이 면역조직화학 (IHC)를 이용하여 분석하였다. 난소암 샘플의 조직 절편 (동결된 또는 파라핀-매몰된)을 5분 동안 아세톤/에탄올 내에서 고정시켰다. 절편을 PBS 내에 세척하고, 아비딘 및 비오틴 (벡터 래보래토리스, 인크. (Vector Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 벌링게임)으로 각각 10분 동안 차단하고, 다시 PBS 내에 세척하였다. 이어서, 절편을 10% 혈청으로 20분 동안 차단시키고, 블로팅하여 과잉의 혈청을 제거하였다. 이어서, 일차 항체 (YWO.49.H2 또는 YWO.49.H6)를 절편에 10 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 첨가하였다. 이어서, 절편을 PBS 내에 세척하였다. 비오티닐화된 2차 항-인간 항체를 절편에 30분 동안 첨가한 후, 절편을 PBS로 세척하였다. 이어서, 절편을 Vector ABC 키트 (벡터 래보래토리스, 인크.)의 시약에 30분 동안 노출시킨 후, PBS 내에 세척하였다. 이어서, 절편을 디아미노벤지딘 (피어스)에 5분 동안 노출시킨 후, PBS 내에 세척하였다. 이어서, 절편을 Mayers 헤마톡실린으로 대조염색하고, 커버슬립으로 덮고, 가시화하였다. 세포를 먼저 펠렛화하고, 동결한 후, 절편으로 하는 것을 제외하고는, 동일한 프로토콜을 사용하여 OVCAR3 세포에 대해 IHC를 수행하였다. 이어서, 절편을 상기 프로토콜에 따라 처리하였다.
그 결과를 도 16에 정성적으로 보고하고, 여기서 발현 수준을 "-", "+/-" 또는 "+"로서 분류한다. 일반적으로, TAT226 mRNA 발현 수준 및 OVCAR3 세포의 표면에서 TAT226 단백질의 발현 사이에 상관성이 있었다. IHC 실험으로 또한 항체가 세포 표면 상의 TAT226을 인식함을 확인하였다. 난소암 세포 패널에서 각 세포의 조직학을 또한 도 16에 보고하고, 여기서 약자 "adenoca."는 "선암종"을 나타낸다
G. 항-TAT226 ADC의 생산
항-TAT226 ADC는 YWO.49.H2 및 YWO.49.H6을 약물-링커 모이어티인 MC-vc-PAB-MMAE; MC-vc-PAB-MMAF 및 MC-MMAF에 컨쥬게이팅함으로써 생산하였고, 이는 상기 섹션 III.C.1.b.2에 설명된 바 있다. 컨쥬게이션에 앞서, 항체를 WO 2004/010957 A2에 기재된 방법에 따라 표준 방법을 이용하여 TCEP로 부분적으로 환원시켰다. 부분적으로 환원된 항체를 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784] 및 US 2005/0238649 A1에 기재된 방법에 따라 표준 방법을 이용하여 상기 약물-링커 모이어티에 컨쥬게이팅하였다. 간단히 설명하면, 부분적으로 환원된 항체를 모이어티의 시스테인 잔기에 대한 컨쥬게이션을 허용하도록 약물 링커 모이어티로 결합시켰다. 컨쥬게이션 반응을 켄칭하고, ADC를 정제하였다. 각각의 ADC에 대한 약물 로드 (항체 당 약물 모이어티의 평균수)를 다음과 같이 HPLC에 의해 결정하였다:
ADC 약물 로드
YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 3.8
YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 4.7
YWO.49.H2-MC-MMAF 4.9
YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE 4.4
YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF 4.4
YWO.49.H6-MC-MMAF 4.1
H. 세포 사멸 분석
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 다음 시험관 내 및 생체 내 세포 사멸 분석으로 TAT226을 발현하는 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다:
1. OVCAR3 시험관 내 세포 사멸 분석
YWO.49.H2 및 YWO.49.H6 ADC를 OVCAR3 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. OVCAR3 세포를 96-웰 플레이트 내에 20% FBS가 존재하는 RPMI 내에 접종하였다. OVCAR3 세포를 도 17에 도시된 바와 같이 3000 세포/웰의 밀도로 다양한 농도의 ADC와 함께 인큐베이팅하였다. MC-vc-PAB-MMAE에 컨쥬게이팅된 항-MUC16/CA125 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. MUC16/CA125는 공지의 난소암 항원이다 (예를 들어, 문헌 [Yin et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:27371-27375] 참조). MC-vc-PAB-MMAE에 컨쥬게이팅된 항-IL-8 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 5일 인큐베이션 후, 세포 생활력을 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생활력 분석 (프로메가)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 도 17의 y축 상의 눈금은 세포 생활력의 측정치인 루시퍼라제 발광으로부터의 상대 광 단위, 즉 "RLU"를 나타낸다.
도 17은 양성 대조군에 유사하게, YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF가 특히 약 0.01 및 0.1 ㎍/ml의 농도에서 현저한 세포 사멸 활성을 가졌음을 보여준다. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE는 또한 세포 사멸 활성을 가졌지만, YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF에서 보인 것보다 더 작은 정도였다. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF에 대한 IC50은 약 0.005 nM이고, YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE에 대한 IC50은 약 0.2 nM이었다. 유리 MMAE에 대한 IC50은 약 0.1 nM이었다. YWO.49.H2-MC-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-MMAF는 상기 분석에서 유의한 세포 사멸 활성을 나타내지 않았다. 상기 특정 분석 시스템에서, 높은 농도의 ADC (음성 대조군 ADC를 포함)에서, 세포 생활력은 실질적으로 전체적으로 높은 농도의 MMAE 및 MMAF 때문에 감소한다.
2. HCT116 형질감염된 세포를 사용하는 시험관 내 세포 사멸 분석
YWO.49.H2 및 YWO.49.H6 ADC를 인간 TAT226을 코딩하는 핵산으로 안정하게 형질감염시킨 HCT116 세포 (결장암 세포주)의 증식을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 형질감염되지 않은 HCT116 세포는 보통 OVCAR3 세포보다 유리 (컨쥬게이팅되지 않은) MMAE에 대해 약 5-6배 덜 감수성이다.
간단히 설명하면, HCT116 세포를 아래와 같이 형질감염시켰다. 에피토프-태깅된 인간 TAT226을 코딩하는 핵산을 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))에서 제작하였다. 에피토프 태그는 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 당단백질 D의 아미노산 1-53 ("gD" 태그)로 이루어졌고, 인간 TAT226의 N-말단에서 아미노산 1-22로부터의 신호 서열을 교체하였다. 재조합 벡터를 HCT116 세포 내로 Lipofectamine200 (인비트로겐)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 HCT116 세포를 10% FBS 및 0.4 mg/ml G418이 존재하는 맥코이 (McCoy)의 5a 배지 내에 배양하였다. 세포를 항-gD 항체를 사용하여 염색하고, 재조합 gD:인간 TAT226 융합 단백질을 발현하는 개별 클론을 선택하기 위해 FACS에 의해 분류하였다. 클론들 중 하나 (HCT116#9-4로 지정함)를 추가의 분석을 위해 선택하였다.
세포 사멸 분석을 수행하기 위해, HCT116#9-4 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. HCT116#9-4 세포를 도 18에 도시된 바와 같이 1000 세포/웰의 밀도에서 변하는 농도의 ADC와 함께 인큐베이팅하였다. MC-vc-PAB-MMAE에 컨쥬게이팅된 항-gp120 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 3일 인큐베이션 후, 세포 생활력을 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생활력 분석 (프로메가)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
도 18은 YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF가 특히 약 0.01 ㎍/ml 및 시험된 최고 농도 이하에서 현저한 세포 사멸 활성을 가졌음을 보여준다. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF에 대한 IC50은 약 0.05 nM이고, 유리 MMAE에 대한 IC50은 약 0.9 nM이었다. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE는 상기 특정 분석에서 음성 대조군에 비해 실질적인 세포 사멸 활성을 갖지 않았다. OVCAR3 세포 사멸 분석 (상기)에 비해 본 분석에서 YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE 및 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE의 세포 사멸 활성의 차이는 다양한 인자, 예를 들어, 세포 밀도 및/또는 약물 감수성의 차이에 기인할 수 있다.
정상적으로 TAT226 mRNA 또는 단백질을 발현하는 시험된 일부 다른 세포주에 대해, YWO.49.H2 및 YWO.49.H6 ADC는 유의한 세포 사멸 활성을 보이지 않았음이 주목된다. 이는 다양한 인자, 예를 들어, 세포 종류-특이 효과, 세포 표면 TAT226 발현 수준, 및/또는 약물 감수성의 차이에 기인할 수 있다.
3. HCT116#9-4 이종이식편을 사용한 생체내 분석
생체내 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 TAT226-발현 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 컨쥬게이팅되지 않은 및 컨쥬게이팅된 YWO.49.H6을 시험하였다. 종양은 흉선이 없는 누드 "nu-nu" 마우스에서 약 5x106 HCT116#9-4 세포를 마우스의 등쪽 옆구리 내로 피하 주사하여 유도하였다. 종양을 200 mm3의 평균 종양 부피에 도달할 때까지 성장시켰다. 이 시점을 "제0일"로 지정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 마우스에게 제0, 7, 및 16일에 3 mg/kg의 표시된 컨쥬게이팅되지 않은 항체 또는 ADC를 정맥내 주사하였다. 컨쥬게이팅되지 않은 및 컨쥬게이팅된 항-두드러기쑥 항체 (Ab)가 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 평균 종양 부피를 제3, 7, 10, 16, 및 21일에 측정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF는 상기 특정 이종이식 모델에서 항-두드러기쑥 Ab-MC-vc-PAB-MMAF에 비해 평균 종양 부피에 의해 측정할 때 유의한 종양 세포 사멸 활성을 보였다. YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE는 상기 이종이식 모델에서 항-두드러기쑥 Ab-MC-vc-PAB-MMAE에 비해 유의한 종양 세포 사멸 활성을 보이지 않았다. 그러나, 상기 이종이식 모델은 예를 들어, 이종이식 종양 미세환경에서 세포 표면 TAT226의 약물 감수성 또는 발현 수준의 차이로 인해 다양한 인자에 대해 시험관 내에서 관찰된 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE의 세포 사멸 활성을 반영하지 않을 수 있다.
4. 다른 이종이식 모델
다른 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 TAT226-발현 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 컨쥬게이팅되지 않은 및 컨쥬게이팅된 항-TAT226 항체를 시험하였다. 예를 들어, 난소 및 뇌 종양에 대한 이종이식 모델은 공공 공급처, 예를 들어 온코테스트 게엠베하 및 서던 리서치 인스티튜트 (Southern Research Institute (미국 알라바마주 버밍햄))에서 제공될 수 있다. 특히 온코테스트 모델은 면역-결핍 누드 마우스에서 환자 종양을 성장시킴으로써 개발되었다. TAT226 mRNA 및/또는 단백질을 발현하는 이종이식편이 생체 내에서 항-TAT226 항체의 세포 사멸 활성을 입증하기 위해 유용할 수 있다.
컨쥬게이팅된 YWO.49.H6을 생체 내에서 난소 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 온코테스트 모델 OVXF1023에서 시험하였다. 온코테스트 모델 OVXF1023은 전이된 분화가 잘 되지 않은 유두상 장액 선종성 난소 암종, M1기로부터 유래한다. OVXF1023 마우스를 도 20의 표시된 ADC로 처리하였다. 도 20에서, YWO.49.H6은 "H6"으로 지정하고; 항-두드러기쑥 (대조) 항체는 "RW"로 지정하고; 링커 -MC-vc-PAB-는 "vc"로 약칭한다. ADC를 도 20에 표시된 날에 표시된 농도로 투여하였다. 도 20에 나타낸 결과는 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-MMAF가 다른 ADC에 비해 종양 부피를 유의하게 감소시켰음을 나타낸다.
상기 실험을 OVXF1023을 사용하여 유사한 조건 하에, 그러나 용량 및 대조 ADC를 변화시키면서 반복하였다. 반복 실험에서, 마우스를 보다 고 용량 (5 mg/kg)의 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE 및 보다 저 용량 (5 mg/kg)의 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAF 및 YWO.49.H6-MC-MMAF로 처리하였다. 결과는 H6 ADC (및 특히 YWO.49.H6-MC-vc-PAB-MMAE)가 그들의 각각의 대조 ADC (항-gp120-MC-vc-PAB-MMAE, 6.4 mg/kg; 항-gp120-MC-vc-PAB-MMAF, 7.2 mg/kg; 및 항-gp120-MC-MMAF, 5.4 mg/kg)에 비해 감소된 종양 부피를 보였지만, H6 ADC와 그들의 각각의 대조 ADC 사이의 효능의 차이는 일부 데이타 지점에 대해 통계상 유의하지 않았음을 입증하였다 (데이타를 나타내지 않음.) 상기 결과와 제1 OVXF1023 실험으로부터 얻은 결과 사이의 차이는 H6 ADC의 용량 및 대조 항-gp120 ADC가 종양 부피를 감소시키는 예상치 않은 활성을 보였다는 관찰에 기인할 수 있다.
추가로, H6 ADC를 또한 중정도로 분화된 유두상 장액 난소 암종 (원발 종양)으로부터 유래된 다른 온코테스트 모델 OVXF899에서 시험하였다. H6 ADC는 상기 모델에서 종양 부피를 감소시키지 않았다 (데이타를 나타내지 않음). 그러나, 상기 특정 온코테스트 모델은 TAT226의 낮은 발현을 보였고, 이는 관찰된 결과에 기여할 수 있다.
I. ThioMAb
시스테인 공학처리된 항체, 즉 "thioMAb"를 생성하였고, 여기서 링커-약물 모이어티의 컨쥬게이션을 위한 추가의 부위를 제공하기 위해 YWO.49.H6의 선택된 잔기를 시스테인으로 치환하였다. 구체적으로, A118C 치환 (EU 넘버링)이 YWO.49.H6의 중쇄에서 이루어지거나, V205C 치환 (카바트 넘버링)이 YWO.49.H6의 경쇄에서 이루어졌다. 이어서, 생성되는 A118C thioMAb를 MC-MMAF에 컨쥬게이팅한 후, 생성되는 V205C thioMAb를 MC-MMAF 또는 MC-vc-PAB-MMAE에 컨쥬게이팅하였다. 모든 thioMAb는 FACS 분석에 의해서 OVCAR3 세포에 결합할 수 있었다 (데이타를 나타내지 않음.)
상기한 본 발명은 발명의 명확한 이해를 위해 예시와 실시예에 의해 일부 상세하게 설명되었지만, 상세한 설명과 청구의 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 학술 문헌의 개시내용은 그 전문을 명백하게 본원에 참고로 포함시킨다.
<110> GENENTECH, INC. 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<222> 8 <223> Xaa=Pro or Phe <220> <221> Other <222> 9 <223> Xaa=Thr, Ile, or Ala <400> 19 Gln Xaa Ser Xaa Xaa Thr Pro Xaa Xaa 5 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.32 <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Arg Ile Thr Pro Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Cys Ile Leu Cys Phe Gly Pro 95 100 105 Leu Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.49 <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Arg Ala 95 100 105 Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.49.B7 <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala 95 100 105 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.49.C9 <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Thr Leu Ala 95 100 105 Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.49.H2 <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Val Ser Leu Ala 95 100 105 Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain variable region of YWO.49.H6 <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Leu Trp Ile Ser Ile Ala 95 100 105 Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of YWO.32, YWO.49, and modified huMAb4D5-8 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of YWO.49.B7 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg 80 85 90 Ser Val Phe Thr Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of YWO.49.C9 <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys 80 85 90 Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of YWO.49.H2 <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Gly Thr Pro Phe Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain variable region of YWO.49.H6 <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 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  1. 본원에 기재된 모든 치료 방법.
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