KR20140097115A - 현장 진단용 바이오 코팅 압전 바이오센서 플랫폼 - Google Patents

현장 진단용 바이오 코팅 압전 바이오센서 플랫폼 Download PDF

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리사 로우리-클라인탑
수-쳉 오우
헤르만 루트너
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아비아나 몰레큘라 테크놀로지스 엘엘씨
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Abstract

임의의 압전기적으로 활성이 있는 결정체 표면 위에 아비딘(들), 특이적인 결합 파트너를 가지고 있는 기타 단백질 또는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 앵커 물질들의 강하고 안정적인, (화학 흡착이라고 여겨지는) 비공유 결합을 초래하는 직접적인 바이오 코팅 공정을 기초로 한 바이오센서 구성요소들(칩들)이 기술된다. 그에 따른 플랫폼 기술이 생물학적 분석에서 구체적으로 응용될 수 있는 다양한 바이오센서를 위해 개발될 수 있다. 앵커 물질들의 테이블 단일층들은 반응성 있는 층들을 형성하여, 생물학적 유체 시료 내의 분석물질의 포획 및 검출을 위한 비오틴화 항체와 같은 포획 시약과 결합할 준비가 되어 있다. 본원에 기술된 공정들은 임의의 수의 배치 내의 임의의 유형의 압전 물질 위에서 수행될 수 있지만, 일부 구현예들은 특정 음향판 모드 바이오센서 상에 전술한 바이오 코팅이 있는 바이오센서를 대상으로 하며, 여기서 상호맞물림형 변환기(IDT)는 결정체의 바이오 코팅된 필름의 반대쪽 위에 존재한다. 단일 장치 위의 임의의 수의 분석물질들을 검출하기 위하여 바이오 코팅 공정을 포함하는 다중 어레이 장치 또한 기술된다. 본 발명의 바이오 코팅을 도입함으로써, 고도로 조정 가능하고, 감도 높은 바이오센서 플랫폼을 잉크젯 인쇄와 같이 일반적인 제조 공정을 이용하여 신속하고 일관성 있게, 그리고 대량으로 제작할 수 있다. 본 발명의 장치는 인간 및 동물 건강을 위하여 다양한 감염을 검출하고, 다양한 표면 위에서 감염을 검출하는 신속한 POC 진단 장치로 응용된다.

Description

현장 진단용 바이오 코팅 압전 바이오센서 플랫폼{BIOCOATED PIEZOELECTRIC BIOSENSOR PLATFORM FOR POINT-OF-CARE DIAGNOSTIC USE}
본 출원은 PCT 국제특허출원으로서 2012년 8월 27일 미국을 제외한 모든 국가를 지정하는 출원인인 미국의 국내 기업 유한회사 아비아나 분자 기술(Aviana Molecular Technologies, LLC), 미국에 대해서만 지정하는 출원인인 미국 시민 리사 라우리-클레인탑(Lisa Laury-Kleintop), 타이완 시민 슈-쳉 오(Hsu-Cheng Ou) 및 미국 시민 허먼 러트너(Herman Rutner)의 이름으로 출원 중에 있으며, 본원에 전체가 참조로 통합되는, 2011년 8월 26일 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제61/527,716호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 단백질과 핵산을 포함하는 표적 분석물질을 함유하는 시험 시료를 분석하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 압전 물질(예컨대, 결정체) 표면 위에 아비딘 또는 또 다른 단백질/뉴클레오티드를 비가역적으로 결합시키는 능력이 있는 바이오 코팅을 가지고 있는 감도 높은 바이오센서로써 통합 칩을 이용한다. 그 결과로 나온 플랫폼 기술은 다양한 바이오센서의 개발에 적합하다. 더욱 구체적인 구현예에서, 바이오 코팅은 사이에 있는 코팅 없이 압전 물질 표면 위에 직접적으로 피복된다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은 상호맞물림형 변환기(interdigitated transducer, IDT)들이 바이오 코팅된 필름을 가지고 있는 측의 반대측 표면 위에 존재하여, 결정체 상에 보호 코팅 및 도파로가 필요 없게 하는 음향판 모드 바이오센서에 관한 것이다.
감도 높고 특이적이며 신속한 검출 기술을 갖춘 저렴한 비용의 대량 생산된 현장 진단(POC) 바이오센서는 전 세계의 인간 및 동물 건강에 잠재적으로 막대한 역학적 영향력을 미친다. 그 어떤 사회적 필요도 감염성 질병, 특히 보통 급속히 확산되는 급성 감염성 질병의 시기 적절한 발견과 치료만큼 적절한 장치로부터 혜택을 받지 못하여, 인간과 동물에 영향을 미친다. 적절한 POC 장치는 잠재적으로 노출된 대규모 개체 집단을 모니터링할 수 있도록 저렴한 비용으로 그리고 대량으로 제조되어야 할 것이다. 이러한 센서들은 열대 및 아열대 기후와 같은 불리한 조건에서 이용될 수 있을 정도로 견고해야 하며, 실험실에서 훈련 받지 않은 사람이 풍부한 자원의 환경과 자원이 제한된 환경 모두에서 이용하기에 간편해야 한다. 나아가, 그러한 장치들은 질병 전달자가 되지 않도록 1회용이어야 하고, 가격이 저렴해야 하며 사용 후 버릴 수 있어야 한다. 측면 유동 장치와 마찬가지로 현재의 최첨단 POC 장치는 다른 결점들 중에서도 낮은 감도 및/또는 높은 결과 변동성 때문에 이러한 필요를 충족하지 않는다. 반면, 뉴클레오티드 검출과 같은 고도로 감도 높은 진단 도구는 정교한 분리와 처리를 요구하여, 이러한 진단 장치를 현장 환경에 어렵게 만든다. 실험실 기반의 시스템은 정확하지만(감도가 높으며 특이적임), 용이하게 수송할 수 없거나 신속하지 않고, 작동하는 데 특수하게 훈련을 받은 인력을 필요로 한다. 본 발명은 임의의 수의 환경에서 POC 장치로 이용될 수 있는 고감도의 바이오센서로 이어지는 공정을 기술한다. 이들 바이오센서는 (혁신적인 것뿐만 아니라) 공지된 음향파 센서 상에 확장 가능한 바이오 코팅을 제공하여, 다양한 비 생물학적 환경에서 이용되는 센서들이 비 실험실, 예컨대, 현장, 환경에서의 POC 장치용으로 이용할 수 있게 한다.
압전결정체에서 발생된 음향파는 질량 및/또는 점도 변화 탓에 장치에 응용될 때 극히 민감하여, 이러한 질량의 적용 전과 후에 그러한 음향파의 주파수 및/또는 위상 또는 진폭의 변화를 가져오며, 이는 전자적으로 측정될 수 있고, 이러한 질량의 존재와 상관 관계를 나타낼 수 있다고 잘 알려져 있다. 따라서, 그것들은 10억 분율(ppb)의 질량 변화 또는 온도의 매우 작은 변화 또는 기체 농도의 변화를 검출할 수 있는 능력이 있는 매우 감도 높은 화학적 센서 또는 기체 센서로 이용된다. 그러나, 결정체와 같은 압전기적으로 활성이 있는 물질로 만들어진, 이들 장치들을 바이오센서로 이용하는 것은 적용된 생물학적 유체가 발생된 파동을 억제하기 때문이거나 적용된 필름을 대규모로 일관성 있게 제조하기 곤란하기 때문에 제한된 성공을 거두었으며, 그것들을 연구 실험실과 같은 자원이 풍부한, 정교한 환경으로 제한하였다.
이러한 음향파 센서를 바이오센서로 기능화하려는 시도는 지루하거나 일관성 없고, 규모를 확장하기에 곤란한 공정들로 이어졌다. 게다가, 이러한 코팅 공정들은 음향파를 전송하기 위하여 이러한 결정체들에 부착된 전기 전도성 유닛도 고려해야 하고, 특히 파동 전달을 방해해서는 안 된다. (마찬가지로, 결정체 구조는 파동 전달과 양립할 수 있어야 한다.) 나아가, 바이오 코팅 공정은 이러한 음향파를 감쇄시키거나 파괴하지 않아야 한다. 이러한 다양한 제한사항을 고려할 때, 바이오 코팅의 진행은 일관되게 비슷한 접근법, 즉, 항체 등과 같은 생체 활성이 있는 제제도 결합할 수 있는 결정체 표면에 화학 작용제를 부착시키는 접근법을 이용했다. 제1 기능성 코팅을 증착시키는 데 두 가지 방법이 흔히 이용된다. 한 방법은 (카르복시메틸-페그-티올, 5000, Laysan Bio와 같은) 헤테로 2기능성 티올 또는 유도된 이황화물 상의 황 기능기에 반응성을 나타내는 진공 스퍼터된 금으로 이루어진 박막을 도포하는 단계를 포함하고, 또 하나의 방법은 실란과 공유적인 1가 또는 2가의 규산염 결합을 형성하기 위하여 압전 센서 표면 위의 하이드록시 기를 적절한, 상업적으로 이용 가능한 헤테로 2기능성 실란, 예컨대, 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTES), 3-글리시독시프로필 트리에톡시실란(GOPS), 3-메르캅토프로필 트리에톡시실란(MPTS)과 직접적으로 기능화하는 단계를 포함한다. 또 다른 아비딘 부가 방법은 먼저 지질(Annals of Chem. Vol 69:4808-4813)과 하이드로겔을 표면 음향파 센서 상에 증착시킨 후(오스트레일리아 특허 07473551호), 아비딘을 증착시키는 단계를 포함한다.
이러한 방법들은 종종 시간이 걸리고, 코팅 공정이 복잡하다. 그것들은 헤테로 2기능성 실란 시약과의 장기적인 액상 접촉을 필요로 한다. 이러한 실란들은 단일층 또는 여러 층을 증착시키기 위하여 대개 톨루엔, 2-프로판올과 같은 비 반응성 용매 내 또는 수성 용매 내의 용액 등으로 제공된다. 그러나, 이러한 공정은 여러 가지 이유로 제어하기 곤란하다. 먼저, 트리메톡시실란과 같은 일부 실란류는 매우 반응성이 크다. 트리에톡시실란과 같은 일부 실란류는 반응성은 덜하나, 가수분해적으로는 덜 안정적이다. 또 다른 이유는, 실란류의 반응성, 실란류가 여러 가지의 연결 가능한 기를 보유한다는 점, 그리고 부가적인 실란 분자와 반응하고 연결하려는 성향 때문에, 단일층의 실란 증착을 이루는 것이 어려우며, 이는 제어하기와 균일하게 유지하기에 어려운 방식으로 코팅된 기판의 전달 특성을 바꾼다. 실란류는 반응성 있는 실라놀 또는 실란디올을 형성하여 가교 결합이 더 잘 이루어지게 되므로, 물의 존재는 미량조차도 공정 제어를 부가적으로 복잡하게 한다. 흔히 이용되는 APTES는 특히나 여러 층을 형성하는 경향이 있다. 헤테로 2기능성 실란인 GOPS는 티올, 아민 및 하이드록시 기와 주로 pH에 따라, 예컨대, 약 7의 pH에서는 티올과, 약 9의 pH에서는 아미노 기와, pH >10에서는 하이드록시 기와 선택적으로 반응성을 나타내는 에폭시 또는 옥시란 기를 보유하고 있다. 그것은 항체 상의 하나 이상의 아미노 기 또는 뉴트라비딘과 같은 고정된 아비딘 상의 대략 절반의 아미노 기와의 직접적인 콘쥬게이션에 이용될 수 있다. 그러나, 이러한 절차들은 코팅 공정을 복잡하게 하고 지연시키며, 결과적으로 얻어지는 장치의 정확도를 방해하는 부반응 가능성을 높이는 습식 화학과 공유 결합을 수반한다(GT Hermanson in Bioconjugate Techniques, 1996, page 142).
요약하자면, 압전 물질 상에 중간 및 최종 단백질 층을 증착하는 종래의 SAM 공정들은 수성 용매 또는 불활성의 비양성자성 매체 내의 여러 가지 시약들과의 항온 처리, 중간물질 헹굼, pH 변화 및 원하는 기능성 SAM 친화도 바이오센서를 완성하기 위한 결합 단백질에의 최종 노출을 포함하는 순차적인 단계들을 필요로 한다. 이러한 단계적 공정들은 몇 시간 또는 심지어 몇 일이 걸릴 수 있고, 기능적으로 변동성 있고, 비싸서, POC 바이오센서 적용을 위해 수용될 수 없는 SAM 바이오센서를 산출할 수 있다. 당해 기술 분야에서의 그러한 공정들은, 저렴한 비용으로, 공정 변화 또는 실패가 매우 바람직하지 않은, 잠재적으로 수백만 대의 1회용 바이오센서들의 확장 가능한 고성능 모드에서, 균일한 바이오센서들을 일관성 있고 가격 효율적으로 제조하기에 명백히 적합하지 않다.
본 발명은, 부분적으로는, 아비딘뿐만 아니라, 필요한 연결 가능한 기를 가지고 있는 다른 생물학적 물질(핵산, 기타 단백질)과 같은 단백질들을 직접적으로 결정체 표면 위에 직접 결합할 수 있게 하여, 균일한, 신뢰할 수 있는 바이오센서를 제작하는 안정적이고 확장 가능한 공정들로 이어지는 공정을 기술한다. 또한, 본 발명은 두 가지 유형의 센서, 즉, 체적파와 전단 수평면 음향파를 이용하는 것을 포함하여, 다수의 압전기적으로 활성이 있는 결정체 물질에 이용될 수 있다. 이러한 직접적인 코팅을 이용하여, 본 발명은 위에 언급된 여러 가지 어려움을 극복했다.
음향파 도파로를 만드는 데 이용된 압전 물질들은 잘 알려져 있으며, 리튬 니오베이트, 리튬 탄탈라이트, 석영 및 소수의 다른 것들을 포함하지만, 각각은 플랫폼 장치를 개발하는 데 있어서 고유한 장점과 단점을 제공한다. 따라서, 임의의 코팅 방법은 다른 것들 중에서도 박테리아, 바이러스, 단백질, 뉴클레오티드, 기생충, 진균, 그리고 특히 이의 개별적인 구성요소 및 병원균의 단편들과 같은 더 큰 입자성 물질들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 감염을 유발하고 그 결과의 원인이 되는 자연계의 다양하고 복잡한 작용제들을 검출하기 위한 최대한의 잠재력 있는 변화형을 제공하기 위하여, 모든 압전 물질 기판에 적용 가능한 것이 바람직하다.
압전 매체(결정체)의 센서 표면 위에 증착된 바이오 필름을 포함하는 음향파 바이오센서 시스템이 기술된다. 이러한 바이오 필름은 아비딘(또한, 리간드와 같은 기타 단백질 및 특이적인 결합 파트너를 가지고 있는 올리고 및 폴리 뉴클레오티드와 같은 핵산들도 이용될 수 있다)과 같이, 특이적인 결합 파트너가 존재하는, 생리 활성이 있는 앵커 물질의 코팅을 포함하며, 결정체 표면 위에 직접적으로 안정적인 단일층을 형성한다. 이러한 공정은 자동화 또는 반 자동화 기법을 이용하여 대규모 제조를 위한 규모 확장에 맞춰진다.
따라서, 본 발명은 압전 표면 위에 직접적으로 코팅된 아비딘 필름과 같은, 앵커층을 가지고 있는 압전 매체를 포함하는 바이오센서, 이의 제조 및 이용 방법을 대상으로 한다. 아비딘 코팅의 경우, 생물학적 시료 내의 표적 분석물질을 검출하기 위하여, 비오틴화된 포획 시약이 바이오 필름에 결합된다. 다른 앵커 물질의 경우, 이러한 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너로 유도체화되어야 한다. 표적 분석물질을 함유하는 생물학적 시료는 바이오 필름과 접촉하도록 위치된다. 포획 시약은 표적 분석물질을 특이적으로 인식하고 결합한다. 이러한 결합은 센서 표면을 가로지르는 음향파의 교란(주파수, 위상 및/또는 진폭의 변화)으로 검출된다. 그런 다음, 이러한 교란은 추가적인 분석, 즉, 표적 분석물질의 존재 및, 선택적으로는 이의 정량과 관련된 전자 신호로 변환된다.
추가적인 양태에서, 바이오센서 기체(substratum)는 값비싸고 지루한 열 진공 스퍼터링 법에 의해 종래에 이루어지던 방식이 아니라, 제어된 조건 하에서 적절한 매체 내의 각각의 염을 아무 것도 안 덮인 압전 칩 기체 표면과 접촉시켜, 규산염, 티탄산염, 지르콘산염 등의 공유적 결합을 형성하고, 그 후, 산 처리 단계에 의하여 결합된 기판층을 실리카, 티타니아, 지르코니아 등의 층으로 전환시킴으로서, 염 농도와 접촉 시간에 따라, 제어 가능한 두께의 균일한 제2의 산화물 층을 형성하는 간단한 2단계 공정에 의하여 실리카, 지르코니아, 티타니아 등의 중간 기판층으로 개질될 수 있으며, 이때, 그러한 중간 산화물층(또는 층들)은 이후에 (비오틴 기와 같은) 고정화 물질에 대한 특이적인 결합 파트너로 적절하게 개질된 (특이적인 분석물질 표적에 대한 항체와 같은) 특이적인 포획 시약과의 반응에 적합한, (아비딘과 같은) 안정적으로 결합된 앵커층으로 코팅될 수 있다.
규산염, 티탄산염, 지르콘산염 등과의 중간 코팅을 포함하는 바이오센서의 또 다른 양태에서, 최적 농도 및 pH의 코팅 용액은 알칼리에 안정적인 아비딘과 선택적으로 혼합되어 건조될 수 있으며, 이로써 염을 기체층에 결합시키고, 동시에 부분적으로 아비딘을 유리와 유사한 결합된 염 필름에 매립시킬 수 있고, 이때, 이는 산 처리 후에 결합된 염 필름을, 여전히 비오틴화된 포획 시약의 결합에 이용할 수 있는 노출된 비오틴 자리를 상당수 가지고 있는 아비딘을 안정적으로 캡슐화하는 다공성 산화물 층으로 전환시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 음향파를 이용하여 생물학적 시료 내의 하나 이상의 분석물질을 검출하도록 조정된 바이오센서의 코팅 방법을 대상으로 하며, 이때, 이러한 바이오센서는 아비딘 층과 같이, 그에 부가된 앵커층을 가지고 있는 압전 물질을 포함하고, 이러한 방법은 아비딘을 압전 물질의 한 표면 위의 일부분에 증착시키는 단계(이때, 상기 일부분은 생물학적 시료를 수용하도록 조정됨) 및 본원에 개시된 방법들에 의한 코팅을 포함하는 단계에 의하여 상기 압전 표면 일부분 상에 직접적으로 또는 간접적으로 상기 아비딘의 부가를 확고히 하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 신속한 POC 진단을 위한 시스템에서의 신규한 압전 바이오센서 장치 및 플랫폼의 용도를 더 포함한다. 따라서, 본 발명의 바이오센서는 감도 높고, 저렴하며, 쉬운 방법 및 POC 진단 도구로서 관련된 장치의 기반을 제공한다. 본 발명은 기존의 제조 시설 또는 컨베이어 벨트 상에서 신규한 급속 코팅 방법을 이용하는 간단한 제조 공정을 가능하게 하여, 임상 진단에서 가격 효율적인 현장 진단(POC) 대안으로 이용될 수 있는 신규한 1회용의, 잠재적으로 처분 가능한 바이오센서를 만들어낸다. 그러한 바이오센서는 필요한 감도를 제공할 수 있고, 필요 시 신속하게 이용될 수 있으며, 따라서 선진국과 자원이 한정된 국가에서 모두 유용하다. 특히, 이러한 POC 바이오센서들은 인간과 동물에 영향을 미치는 급성 전염성 질병의 검출, 억제 및 치료, 그리고 진단에 유용한 특이적인 생화학적 지표의 검출, 그리고 병에 걸린 환자와 건강한 환자의 모니터링과 관련된 영역에서 특히 유익할 수 있다.
압전 물질의 표면에 직접적으로 결합된 앵커 물질로 이루어진 층을 포함하는 압전 결정체를 포함하는 음향파 바이오센서 구성요소로서, 이때, 앵커 물질은, 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 나타내는, 음향파 바이오센서 구성요소.
압전 물질의 표면을, 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 나타내는 앵커 물질을 포함하는 바이오 필름으로 코팅하는 공정으로, 이때, 이러한 공정은
a. 압전 물질의 결정체 표면을 처리하여 결정체 표면의 표면 에너지를 증가시키는 단계;
b. 결정체 표면에 앵커 물질로 이루어진 층을 도포하는 단계;
c. 결정체 표면 위에 화학적으로 흡착된 앵커층을 형성하는 단계를 포함하는 공정.
압전 물질의 표면을, 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 나타내는 앵커 물질을 포함하는 바이오 필름으로 코팅하는 공정으로, 이때, 이러한 공정은
a. 압전 물질의 결정체 표면에 규산염, 지르콘산염 또는 티탄산염의 용액을 도포하고, 산과 반응시켜 각각 실리카, 지르코니아 또는 티타니아로 이루어진 중간층을 형성하는 단계;
b. 중간층에 앵커 물질로 이루어진 층을 도포하여 결정체 표면 상에 앵커층을 형성하는 단계를 포함하는 공정.
a. 압전 결정체의 표면에 직접적으로 결합된 앵커 물질로 이루어진 층을 포함하는 압전 결정체로서, 이때 층 내의 앵커 물질은 포획 시약에도 결합되고, 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루며, 생물학적 유체 내에 존재하는 분석물질을 특이적으로 인식하는, 압전 결정체;
b. 음향파 발생기로서, 발생기는 파동을 발생시키며, 이때, 포획 시약과 분석물질과의 반응이 음향파의 특성에 검출 가능한 변화를 유발하는, 음향파 발생기를 포함하는, 음향파 바이오센서.
생물학적 유체 시료 내의 분석물질의 존재 여부 또는 양을 결정하는 방법으로, 이러한 방법은
전술한 바이오센서 구성요소를 포획 시약을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 이때, 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루며, 또한, 분석물질을 특이적으로 인식하는 것인 단계;
포획 시약이 앵커 물질에 대하여 결합하도록 하여, 포획 시약층을 형성하는 단계;
결합된 포획 시약층을 생물학적 유체 시료와 접촉시키고; 압전 표면에 걸친 음향파를 발생시키고; 포획 시약층에 대한 분석물질의 결합 결과, 웨어(ware)의 진폭, 위상 또는 주파수의 임의의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
도 1: 리튬 니오베이트 결정체 위의 뉴트라비딘 코팅의 원자력 현미경( AFM ). 실시예 1에 기술된 공정을 이용한 AFM 이미지 분석 결과, 대략 3nm 내지 4nm의 뉴트라비딘 코팅이 나타났다. 패널(a)은 결합된 뉴트라비딘이 없는 칩의 실시간 토포그래피 그래프를 나타낸다. 패널(b)은 1㎛ 나노인덴트된 영역을 가지고 있는 뉴트라비딘이 코팅된 표면의 10㎛ 스캔을 나타낸다. 패널(c)은 대략 3.229nm의 깊이를 나타내는 인덴테이션 후, 칩에 결합된 아비딘의 토포그래피 그래프이다.
도 2: 부가된 항 뎅기 항체가 있는 리튬 니오베이트 결정체 위의 뉴트라비딘 코팅의 원자력 현미경. 항 뎅기 항체의 첨가로 리튬 니오베이트 칩에 결합된 뉴트라비딘. 패널(a)은 칩의 1㎛ 영역을 스캔하여 Ab 표면이 있는 뉴트라비딘에 만들어진 나노인텐트된 영역의 10㎛ 스캔을 나타낸다. 패널(b)은 패널(a)의 4.6㎛ 확대된 부분을 나타낸다. 패널(c)은 깊이가 0.269nm(또는 6~9nm 깊이)임을 나타내는 토포그래피 그래프이다.
도 3: 리튬 니오베이트 칩 표면 위의 아비딘을 확인하는 데 이용된 FITC 가 표지된 비오틴 비드 . 리튬 니오베이트 칩 표면 위에 아비딘이 없거나(a), 아비딘이 있을 때(b)의 비오틴 비드(Invitrogen)의 형광 이미지(200x)를 나타내었다. (a)에서 화살표는 결정체에 대한 비드의 비 특이적인 결합을 나타낸다. (b)에서 화살표는 결정체 위의 아비딘 코팅에 대한 비드의 결합을 나타낸다.
도 4: 아비딘 결합의 안정성. 리튬 니오베이트에 결합된 아비딘의 광학 밀도(O.D.)를 1개월의 기간에 걸쳐 확인하였다. 아비딘이 코팅된 칩을 4℃에 저장하고, 매주 시험하였다. 1주, 2주 및 4주차에 결합은 대략 동일하게 유지되었다(3주차의 감소는 타당하다고 여겨지지 않았으며, 잘못된 시약에 기인한다).
도 5: 리튬 니오베이트에 대한 아비딘 결합. 기술된 방법을 이용하여 아비딘을 리튬 니오베이트 상에 코팅된 SiO2에 결합시켰다. 패널(a)은 리튬 니오베이트 위에 코팅된 이산화규소에 결합된 아비딘의 광학 밀도(O.D.)를 나타낸다. 아비딘 유무에 따른 비오틴 HRP에 대한 490nm에서의 흡수치를 비교하였다. 그래프는 1.4의 O.D. 판독 차이로 아비딘의 양호한 결합을 나타낸다. 패널(b)은 리튬 니오베이트 위에 코팅된 이산화규소에 대한, 뉴트라비딘 대 아비딘의 결합을 비교한 것이다.
도 6: 클라미디아 트라코마티스의 기본 소체( EB )에 대한 AMT 칩 결합의 형광 현미경 이미지. 클라미디아 물질이 없는 음성 대조군(A구획)과 비교한 결합된 EB를 가지고 있는 AMT 칩의 DAPI 염색(패널(b) 화살표)과 FITC가 표지된 항-C 트라코마티스 Ab(패널(c) 화살표) 형광 이미지를 도시하였다. DAPI와 FITC 표지의 존재는 결합된 물질이 세포성이며(DAPI), 클라미디아임(FITC)을 확인시켜 주었다.
도 7: 클라미디아 및 항 클라미디아 항체에 의한 주파수 편이. 안정화된 베이스라인으로부터의 주파수 편이를 0.25㎍/ml의 비오틴화된된 항-EB LPS와 함께 105 EB을 첨가한 후, 본 발명의 절차에 따라, 아비딘으로 제조된 칩 위에 나타낸 것이다.
도 8: 뎅기 바이러스의 첨가에 의한 주파수 편이. 안정화된 베이스라인으로부터의 주파수 편이를 본 발명의 절차에 따라, 아비딘과 4㎍/ml의 항-뎅기 2형으로 제조된 칩 위에 나타낸 것이다. 베이스라인 주파수의 변화는 8㎍/ml의 뎅기 바이러스의 첨가로 일어난다.
도 9: 뉴트라비딘에만 결합된 칩에 항체를 단독으로 첨가한 경우의 주파수 편이. 비오틴화된된 항 클라미디아 트라코마티스(MOMP)의 1:200 희석액을 결합된 아비딘을 가지고 있는 칩에 첨가했을 때의 화살표 1과 화살표 2 사이의 4.5MHz의 주파수 편이를 나타낸 것이다.
도 10: 음향판 모드(APM)에 대한 이론적 모델. 본 발명에 사용된 APM의 이론적 모델(APM은 Q-TBWF로 명시됨). 감지 영역은 생물학적 시료가 압전 기판의 최상부에 위치되는 유체 챔버에 해당한다. 파동은 바닥에서 발생되고 압전 매체를 통하여 이동하여 (표면에 직접적으로 부착된 아비딘 분자를 통해) 상부 표면에 결합된 분석물질을 검출한다. IDT들은 바닥면에 있다(미도시). 추가적인 질량의 포획된 분석물질을 접할 경우, 파동의 주파수가 변할 것이다.
도 11: 통합 다중 어레이 장치의 개요도. APM 모드와 함께, 단일 지연선 구조를 가지고 있는 장치의 개략적인 설계도를 도시하였다. APM 모드에서는, 전자적 요소(예컨대, IDT)가 생물학적 및 유체 요소와 접촉하는 쪽의 반대쪽 위의 기판에 적용된다. 패널(a)은 단일 지연선 구조를 가지고 있는 장치를 상부에서 본 사시도이다. 패널(b)은 세 개의 지연선이 있을 때(다중 채널 칩)의 상부 측면에서 본 사시도이다.
정의
다음과 같은 용어들은 그것들에 부여된 하기의 의미를 나타낸다.
"앵커 물질"은 (i) ("직접적인" 결합을 위한) 압전 결정체 또는 그 위의 중간 코팅, 및 (ii) (아래에 정의된 바와 같은) "포획 시약" 모두에 결합하는 코팅 물질을 나타낸다. 이러한 용어는 비오틴에 결합하는 능력에 의해 기능적으로 정의된 단백질 패밀리의 한 구성원이고 비오틴의 특이적인 결합 파트너(예로써, 아비딘, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘)로서 작용하는 아비딘 뿐만 아니라, 포획 시약을 개질하는 데 이용될 수 있어서 포획 시약이 앵커가 코팅된 압전 물질과 결합할 수 있게 하는 특이적인 결합 파트너를 가지고 있는 올리고 및 폴리뉴클레오티드 및 단백질을 포함한다.. 또한, 예컨대, 항체 및 항체 단편(예컨대, Fc 단편) 상의 탄수화물 기에 결합하는 자연 발생적인 탄수화물 결합 레시틴도 포함된다. 입체구조를 바꿀 위험 또는 심지어는 시험의 정확도에 영향을 미치는 포획 시약을 부분적으로 변성시킬 위험 때문에 일반적으로는 포획 시약을 앵커로 이용하는 것은 바람직하지 않다. 올리고 및 폴리뉴클레오티드는 이온성 자리 또는 쌍극자 자리를 통해, 직접적으로 또는 예컨대, 이온교환법에 의해 도포된 중간의 은 코팅을 통해, 압전 물질에 결합할 수 있다. 그것들의 특이적인 결합 파트너는 상보적인 뉴클레오티드 분자이며, 그것들은 포획 시약을 개질하는 데 이용될 수 있다.
"포획 시약"은 생물학적 시료로부터 분석물질을 포획하여 분석물질을 식별 및/또는 정량하는 데 이용될 수 있는, 생물학적 시료 내의 분석물질에 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 이러한 용어는 항체, 앱타머 및 이의 단편을 제한 없이 포함한다. 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너인 연결기를 이용한 개질에 의해 또는 그러한 개질 없이(예컨대, 비오틴화 또는 상보적인 핵산에 의해) 앵커 물질에 결합할 것이다. 다시 말해서, 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너이거나 이를 포함하며, 동시에 분석물질을 특이적으로 인식한다.
압전 표면에 대한 앵커 물질의 결합에 적용된 바와 같은 "직접적인" 또는 "직접적으로"은 압전 결정체 위에 중간 코팅의 도포 없는, 압전 결정체에 대한 결합을 의미한다. 압전 표면은, 예를 들어, 플라즈마, 자외선 조사의 적용에 의해, 또는 표면 위의 금속 이온들을 대체하지만, 압전 표면 위의 표면 금속 이온 위의 중간 물질로 이루어진 추가 층을 증착시키지 않는 은 이온의 이온 교환 증착에 의해, 개질될 수 있다. 실란 처리 또는, 공유 결합을 형성하는 임의의 기타 반응, 또는 금, 은, 또는 구리층 증착으로부터 기인하는 것들과 같은 중간 코팅은 제외된다.
종래 기술에서 이전에 이용되었던 바이오 필름은 부적절하며, 저렴한 가격의 1회용 바이오센서의 제조에, 특히, 잠재적으로 대규모 군집을 스크리닝하는 데 필요한 대량에 대하여, 응용할 수 없다. 전형적인 예로는 실란(미국 특허 공개번호 제2011/0053139호) 또는 하이드로겔(미국 특허 공개 번호 제2006/0024813호)의 이용을 포함한다. 본 발명은 새로운 유형의 바이오 필름, 이를 기판에 도포하는 공정, 및 여러 가지 모드의 음향파 중 임의의 하나를 포함하는 바이오센서에서의 이러한 바이오 필름의 용도를 진단 POC 및 생의학 연구에서의 이러한 바이오센서의 응용과 함께 기술한다. 이러한 바이오 필름의 응용은 대규모 제조로 확장하기에 간단한, 안정적인 단일층의 결정체 표면 상에서 결합 파트너와 직접적으로 결합할 수 있는 코팅 단백질을 포함한다. 기본적인 바이오 필름은 여러 가지 모드의 음향파에 맞게 조정될 수 있고, 동시에 여러 가지 시험을 수행하는 다중 어레이 마이크로센서에 이용될 수 있다. 게다가, 이러한 코팅은 다른 것들 중에서도 리튬 니오베이트, 리튬 탄탈라이트 및 석영 미세 결정과 같은 수많은 압전 물질들에 적용될 수 있다. 음향파는 압전 기판을 통한 또는 압전 기판 위에서의 파동 전파 모드에 의해 기술된다. 물질 및 경계 조건에 따라 여러 가지 조합이 가능하다. 각 센서에 대한 상호맞물림형 변환기(IDT)는 전기 활성화 장을 제공하고, 입력 변환기는 결정체 컷(cut)과 변환기의 배치를 기초로 결정체 내에서 파동을 전파하는 전기 입력을 제공한다. 파동의 변화를 초래하는 결정체 상의 임의의 변화는 출력 변환기에 의해 판독되어, 분석을 위한 프로세서로 전달된다.
본 발명은 음향판 모드를 위한 새로운 적용을 추가로 기술한다.
1. 바이오 코팅법
본 발명은 음향파 센서의 제조에 사용되는 모든 유형의 음향파 및 모든 유형의 피에조 물질에 적용할 수 있는 새로운 바이오 코팅 공정을 기술한다. 일 구현예는 체적 모드에서의 이용을 포함하며, 여기서 IDT는 바이오 필름이 증착되는 곳으로부터 반대쪽의 피에조 물질 표면 위에 위치된다. 적절한 음향파는 모든 체적 모드, 음향판 모드 및 전단 수평판 모드를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 관련된 바이오 코팅은 표면 및 전단 수평 모드를 위한 음향파 도파로로 이용될 수 있으며, 이는 IDT의 구비 및 반대편의 피에조 표면 위의 바이오 코팅이라는 요건을 필요 없게 한다.
A. 직접 코팅: 이러한 코팅은 수 시간 대신 수 초 또는 수 분 내에 수행되고; 확장 가능하고, 연속적인, 인라인 방법을 이용하여 제조되고; 조작자의 개입이 최소화되어 용이하게 자동화되고; 적은 수의 거부 반응을 나타내며; 소량의 유해한 폐기물을 발생시키는 간단하고 신속한 코팅 화학을 수반한다. 이러한 코팅법은 중간 물질층 없이 압전 표면 위에 직접적으로 앵커 물질을 증착시킨다.
아비딘은 예컨대, 조류, 파충류 및 양서류 종의 난백으로부터 유래된 단백질로, 여러 가지 생화학적 반응에 이용되었다. 아비딘 패밀리는 뉴트라비딘, 스트렙트아비딘 및 아비딘을 포함하며, 모든 단백질이 높은 친화도와 특이성으로 비오틴과 결합하는 능력에 의해 기능적으로 정의된다. 아비딘은 또한 스트렙트아비딘과, 뉴트라비딘(Thermo Scientific - www.thermoscientific.com의 데글리코실화 아비딘)과 같은 개질된 아비딘 같은 세균성 아비딘을 포함할 수 있다. 그것들은 작은 올리고머의 단백질로, 각각은 네 개의(또는 두 개의) 동일한 하위 단위를 포함하고, 각 하위 단위는 비오틴에 대한 단일한 결합 자리를 보유한다. 본 발명의 바이오센서의 표면에 결합될 때, 두 개의 자리는 피에조 물질 표면을 마주보고 있으며, 따라서 비오틴 결합에 이용할 수 없다. 나머지 두 개의 자리는 피에조 물질과 마주하고 있지 않아서 비오틴 결합에 이용할 수 있다. 비오틴에 대한 아비딘의 결합 친화도는 비록 비 공유적이기는 하지만 매우 높아서, 비가역적이라고 여겨질 수 있다. 아비딘의 해리 상수(K D)는 대략 10-15M이어서, 가장 강력한 공지된 비 공유 결합 중 하나가 되게 한다. 4단량체의 형태에서, 아비딘은 크기가 66 내지 69kDa인 것으로 추정된다. 분자량의 10퍼센트는 네 개 내지 다섯 개의 만노스와 세 개의 N-아세틸글루코사민 잔기로 이루어진 탄수화물 함량에 기인한다. 아비딘의 탄수화물 모이어티는 구조와 조성에서 비슷한, 적어도 세 개의 고유한 올리고당 구조 유형을 함유한다.
d-비오틴 또는 비타민 H, 비타민 B7 및 보조효소 R로도 알려져 있는 비오틴은 아비딘의 특이적인 결합 파트너이다. 그것은 Sigma-Aldrich를 포함하는 여러 공급업체로부터 상업적으로 구매할 수 있다.
본 발명자들은 모든 압전기적으로 활성인 물질을 포함하는 압전 물질에 대한, 아비딘과 같은 앵커 물질의 직접적인 코팅이 본원에 논의된 조건 하에서 얻어질 수 있음을 발견하였다. 이러한 공정을 이용하여, 앵커 물질들은 직접적으로 압전 결정체 표면에 성공적으로 부착되며, 바람직하게는 단일층으로, 강력하고 안정적인 비 공유 결합을 형성한다. 일 구현예에서, 도 1의 패널(b)과 패널(c)에 나타난 바와 같이, 아비딘은 리튬 니오베이트 칩 상에 약 3~4나노미터의 단일층을 형성한다. 원자력 현미경(AFM)을 이용하여, 단일의, 주로 균일한 단일층은 "납작하게" 화학적으로 흡착된 아비딘으로 예상되는 것으로 확인되었다. 이러한 AFM 측정법은 PBS에서, 그 후 증류수에서의, 집중적인 두 시간의 세척을 수반하며, 그런 다음, 뉴트라비딘이 코팅된 칩이 영상화된다. 패널(a)은 칩에 결합된 뉴트라비딘이 없는 빈 칩의 실시간 토포그래피 그래프를 나타낸다. 패널(b)은 1㎛ 나노인덴트된 부분을 가지고 있는 아비딘이 코팅된 칩 위의 영역에 대한 10㎛ 스캔이다. Z값은 칩 표면 위의 아비딘 정상으로부터 최고 피크까지의 거리로 정의된다. 결정체에 결합된 아비딘에서 생성된 전형적인 인덴테이션에 대한 패널(c)의 토포그래피 그래프로부터 확인된 바와 같이, 깊이는 3.229nm였다. 인덴테이션은 깊이가 3 내지 4nm의 범위인 것으로 확인되었다. 전형적인 뉴트라비딘 크기는 대략 5.6x5x4nm이다(Biophys J. 2008 April 1; 94(7): 2706-2715. Published online 2008 January 10.1529/biophysj.107.119271, A Quantitative Determination of Size and Shape of Surface-bound DNA Using an Acoustic Wave Sensor, Tsortos, et al. PMCID: PMC2267124). 뉴트라비딘 층 깊이를 평가하기 위하여, 한 위치에서 인덴테이션을 만들어 재스캔한다. 인덴테이션 수단은 표면에 결합된 아비딘 깊이의 계산을 가능하게 한다. 단일층의 높이는 인덴테이션 정상으로부터 인덴테이션 바닥까지로 측정된다. 코팅되지 않은 칩에서, 인덴테이션은 임의의 깊이 변화를 초래하지 않는다. 두 가지의 스캔은 10마이크로미터 간격 이내에서 이루어진다.
도 2는 뉴트라비딘이 코팅된 리튬 니오베이트 결정 위로 비오틴화 항 뎅기 항체를 도입하는 것을 도시한 것이다. 아비딘을 본 발명의 방법을 이용하여 리튬 니오베이트 칩에 결합시킨 다음, 0.05% BSA-PBS 내의 비오틴화 항 뎅기 항체 4㎍/ml를 실온에서 30분 동안 적용시켰다. PBS에서의 집중적인 2시간의 세척에 이은 증류수 헹굼 후에, 칩을 증류수에 담가 AFM을 이용하여 이미지화하였다. 패널(a)은 결합된 항체가 있는 아비딘 내에 만들어진 나노인덴트된 영역의 10㎛ 스캔을 나타낸다. 패널(b)은 패널(a)의 4.6㎛ 확대된 부분이다. 패널(c)의 토포그래피 그래프에 도시된 바와 같이, 인덴테이션은 깊이가 6~9nm인 것으로 나타난다. 깊이는 9.269nm이다. 깊이는 칩 위의 아비딘 정상으로부터 '구멍'의 바닥 또는 칩 그 자체의 정상까지를 측정하였다. 항체의 규모가 14.2nm × 8.5nm × 3.8nm임을 고려할 때, 인덴테이션의 깊이는 항체가 아비딘에 결합되었음을 보여준다.
특정 이론에 얽매이지 않으며, 이러한 결합의 강도는 아래에 논의된 노출 조건 때문이며, 결정체 표면에 대한 앵커 물질(예컨대, 아비딘)의 강한 비 공유적 결합을 초래하는 것으로 여겨진다. 이러한 결합은 결정체 표면에 대해 결합을 형성하는 아르기닌, 시스테인 및 리신과 같은, 아비딘 상의 반응성 있는 아미노산의 일부 곁사슬을 통해 일어날 가능성이 있다. 압전 표면과 결합을 형성할 수 있는 기타 곁사슬은 전하를 띠지 않은 극성 아미노산 그리고 및 전하를 띤 극성 아미노산(예를 들어, 전하를 띠지 않은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신; 전하를 띤 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘) 위에 있다. 올리고 또는 폴리뉴클레오티드가 앵커 물질로서 이용될 때, 그것들은 이온성 또는 쌍극자 자리를 통해 결합하고, 일단 고정되면, 그것들은, 상보적인 올리고 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 상보적인 올리고 또는 폴리뉴클레오티드로 개질될 수 있는 포획 시약과 결합한다. 사실, 분석물질이 핵산이라면, 포획 시약은 하나의 모이어티에서 앵커 시약과 결합하고 다른 모이어티에서 분석물질과 결합하는 혼성 올리고 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
코팅 전에, 플라즈마 처리는 고도로 반응성 있는 종들의 발생을 통하여, 결정체 표면 위의 사실상 모든 유기 오염물질을 제거한다. 앵커 물질을 결정체 표면에 부착시키는 것을 도와준다고 여겨지는 두 개의 메커니즘이 있다: 플라즈마 처리는 적용된 유체/액체에 대해 더 나은 습윤을 가능하게 하는 높은 표면 에너지를 유도하여 결정체와 앵커 물질 사이에 더 나은 접촉을 가져오며, 표면 위에 아민, 카르복실 및 하이드록실과 같은 기능기를 도입하여, 결합을 통한 계면 결착을 제공한다. 메커니즘과는 관계 없이, 결정체 표면 상의 앵커 코팅은 중간 코팅 없는 일부 구현예에서, 그리고 습식 화학을 필요로 하는 공유결합이 없는 임의의 사건에서 달성된다. 이렇게 하여 형성된 결합은 물리 흡착보다는 더 완강한 형태의 부착인 화학 흡착 때문인 것으로 여겨진다.
또한, 그에 따른, 앵커 물질 위의 반응성 기와 결정체 위의 반응성 종 사이의 잠재적인 결합은 아마 전부 다지점 상호작용에 대하여 관련될 수 있다고 여겨지며, 극심한 열 조건을 제외하고는 분해하기에 어려운 DNA 가닥의 염기쌍들의 약한 결합에서도 보는 바와 같이, 각각은 약하지만, 집합적으로 작용하여 "지퍼" 또는 "벨크로" 효과에 의해 강력한 결합으로 기하급수적으로 증가된다. 시험의 정확도에 해로운 영향을 미치는 변성 및/또는 입체구조적 변화로부터 이러한 반응에 사용되는 항체들을 보호할 필요가 있기 때문에, 이러한 조건들은 바이오센서에는 적용되지 않을 것이다.
일부 구현예에서는 아비딘과 같은 앵커 물질로 센서를 코팅하기 전에 하기의 단계들이 이루어진다. 개별적인 칩들은 압전 웨이퍼로 만들어지고, 종래의 마이크로리소그래피를 이용한다. IDT는 카트리지 하우징의 저부 내부에 IDT 측면을 마운트함으로써, 코팅된 칩의 반대쪽에 고정시킬 수 있다. 결정체 표면은 먼저, 예를 들어, 대기압 플라즈마가 발생시킨 제트 스트림(Plasma Treat Co.)에 대한 노출을 포함할 수 있는 플라즈마 처리를 이용하여 표면을 세정함으로써, 모든 유기 물질들을 잘 씻어내야 한다. 대안적으로 또는 그 외에도, 자외선-오존 처리가 적용될 수 있다. 앵커층(대개 5~10초)인 아비딘은 얇고 균일한 액체 필름 또는 마이크로도트 패턴을 형성하기 위하여 분무 또는 접촉 전달에 의해 (예컨대, 잉크 제팅 또는 롤러 적용과 같이, 인쇄와 유사한 공정에 의해) 적절한 용매 내에 적용된다. 단일층을 형성하기 위하여, 필름 내 앵커 물질의 양이 계산되어야 한다. 물론 정확한 양은 앵커 물질의 선택 및 압전 물질에 대한 친화도에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 앵커 물질에 유용한 범위는 0.01mg/ml 내지 5mg/ml이며, 일부 구현예에서는 0.01 내지 2mg/ml가 실행 가능한 범위인 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서는 0.01mg/ml ~ 1.0mg/ml로 범위를 더 줄인다. 다음 단계는 가열된 공기의 흐름으로 신속하게 건조시키는 단계를 포함하며, 그 결과 제1 결합제 층으로 안정적인 아비딘 층을 생성한다. 그에 따른 센서는, 특정 분석물질을 특이적으로 인식하는 임의의 원하는 포획 시약으로 더 개질될 수 있거나, 분석물질에 이미 노출되어 결합된 포획 시약과 반응시킬 수 있다는 뜻에서 일반적이다. 이러한 일반적인 상태에서, 필요할 때까지 밀봉하여(바람직하게는 N2 분위기 내에) 보관할 수 있다.
일 구현예는 압전 물질 표면 0.5x1cm당 10㎕ 미만의 유체(약 3~10㎕의 유체/0.5cm2 및 바람직하게는 5~10㎕)가 있는 박막으로 적용된, 물 내의 0.05 내지 5mg/ml의 뉴트라비딘을 함유하는 시약 조성물을 포함한다. 비오틴화된 포획 시약은 종래의 비오틴화 시약 및 관련된 방법(Invitrogen)을 이용하여 제조한다. 치환도는 전형적으로 포획 시약당 3 내지 5개의 비오틴이며, 전형적으로 IgG이나, 핵산 또는 임의의 기타 단백질 포획 시약이 원칙적으로 이용될 수 있다. 코팅 완충액에서의 농도는 예에서 정의된 바와 같이 상이한 표적 항원을 포획하는 데 필요한 특정 요건에 대해 최적화되며, 그러한 조치는 당해 기술 분야에서 통상의 지식의 범위 내에 해당한다.
비오틴화된 포획 시약에 대한 코팅 완충액의 예는 0.01M PBS 완충액이며, 이는 1~10%의 트레할로스 또는 수크로오스와 같은 당과 5~10%의 정제된 글리세롤도 함유할 수 있다. 당과 글리세롤은 보존제 및 캡슐화 작용제로 기능한다. 아지드화 나트륨(0.01 내지 0.05%)이 항미생물제로 첨가되나, 또 다른 그러한 작용제가 대신 이용될 수 있다.
도 3은 형광 현미경으로 이미지화하였을 때, 비오틴화된 형광 라텍스 비드(FITC가 로딩됨, 1.1㎛, InVitrogen)의 특이적인 결합을 확인한 것을 나타낸다. 이러한 확인에 있어서, 0.25mg/ml의 아비딘을 위에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 리튬 니오베이트에 결합시켰다. 집중적인 PBS 및 탈이온수 세척 후에, ㎕당 10,000개의 비드를 함유하는 1㎛ 부피의 FITC가 표지된 비오틴 비드(Invitrogen)를 칩에 첨가하고, 30분 동안 실온에서 항온 처리하였다. 물로 한 번 더 세척한 후, 칩을 형광 현미경(200X)으로 이미지화하였다. 패널(a)의 화살표는 미량의 비 특이적인 결합을 나타내고(화살표 참조), 패널(b)의 화살표는 비드의 특이적인 결합을 나타낸다. 결합된 비드는 트윈(Tween) 20을 함유하는 완충액으로 조심스럽게 세척하는 것을 이용하는 여러 pN까지의 수력학 또는 유동 응력에 대해 저항성을 나타내며, 따라서 본 발명 센서의 이용이라는 목적을 위하여 그것들은 니오베이트 표면 위의 여러 고정된 아비딘에 충분히 안정적으로 결합된다.
바이오센서의 아비딘 코팅의 안정성은 놀라울 정도이며, 이는 물리 흡착보다 더 강력한 화학 흡착 공정에 기인한다. 물리 흡착 결합은 완충액과 시약에 의해 용이하게 제거되며, 특히 50℃를 넘는 상승된 온도에 저장 시 열 손상에 약하다는 점이 밝혀졌다. 따라서, 화학 흡착 공정은 특이적인 표적 개체의 포획 및 검출을 위한 포획 시약과 조합하여 이용 시, 개선된 저렴한 비용의 일반적인 바이오센서를 제공한다.
따라서, 본 발명에 기술된 바와 같은 코팅 공정은 열적으로 안정적인 앵커 물질의 단일층들을 신속하게 형성할 수 있어서, 비오틴화된 항체를 보유하고, 종래 기술의 바이오센서보다 잠재적으로 더 나은 장기적인 안정성이 있는, 간단하고 저렴한 공정을 이용하여, 보관할 수 있는 일반적인 바이오센서 칩을 제공한다. 이러한 공정을 이용하여 만들어진 아비딘 코팅 칩을 이미 원자력 현미경으로 조사하였으며, 3~4나노미터의 하나의, 주로 균일한 단일층이 관찰되었다. 도 2a 참조.
나아가, 본 발명은 조절 가능한 표면 밀도로 코팅을 형성하는 완전한 단일층들을 고려하며, 이때, 표면 밀도는 완전한 단일층 카펫으로 바이오센서 표면을 차지하는 분자들의 수로 정의된다. 분자의 파킹 영역은 분자 당 nm 제곱으로 주어진다. 따라서, 바이오센서의 총 표면적이 알려져 있을 때, 공지된 표면적의 전체 바이오센서 표면 위에 적층된 분자의 수를 결정할 수 있으며, 코팅 용액 내의 앵커 물질의 농도를 조정하여 원하는 단일층을 얻을 수 있다. 세척하는 동안 더 낮은 안정성을 나타내는 다중층에, 또는 그것들의 포획 시약을 보유하는 층에서는, 고정되거나 고정되지 않은 모노 또는 하위 단일층들이 바람직하다. 이는 특히, 계면활성제를 함유하는 세척 유체, 예컨대, 트윈 20 또는 사포닌을 이용할 때 관련이 있다.
B. 코팅된 바이오센서의 안정성: 일단 적용되면, 안정적인 앵커층은 선택적으로, 글리옥살 또는 글루타르알데히드와 같은 기타 호모 2기능성 가교제가 이용될 수 있지만, 포름알데히드 증기와 같은 가역적인 가교제를 이용한 가교결합에 의해 더 안정화된다. 가교결합은 인산 완충액(10%)에의 최대 24시간 노출 또는 일반 조직화학에서 이루어지는 것처럼 메탄올, 이소프로판올 또는 아세톤을 이용한 잠시 동안의 용매 고정으로 달성된다. 과잉 가교결합은 공급업체의 설명서에 언급된 바와 같은 제안된 시간과 농도를 따름으로써 피하게 되며, 그 결과, 아비딘 위의 2개 또는 3개의 나머지 노출된 비오틴 결합 자리는 영향을 받지 않는다. 선택적으로, 이후에 비오틴 또는 비오틴화된 포획 시약에 의해 용이하게 대체되는, 가역적으로 결합된 데스티오비오틴(Sigma)에 미리 노출시킴으로써 결합 자리가 붕괴되는 것으로부터 보호할 수 있다. 또한, 스트렙트아비딘과 같은 특정 앵커 물질은 최대 80℃ 용액 내에서 안정적이라고 밝혀진 바 있으므로(Bang's Labs), 최대 70℃의 온도에서 수 분 동안 열적 고정이 이어질 수 있다.
칩 위에 직접적으로 코팅되었을 때, 아비딘은 단일층과 비슷하고, 덜 안정적인 다중 층보다 우수한, 필요한 감도로, 임의의 비오틴화된 시약과 결합할 수 있다. 본원에 기술된 것보다 더 높은 아비딘 농도에서 형성되었거나, (참조로 통합된) US20110053139호에 기술된 바와 같이 실란층으로 형성되었을 때, 이러한 공정은 본 발명의 공정과 동일한 친화도로 아비딘과 결합하지 않기 쉬우며, 바이오센서를 사용하는 동안 씻겨 없어지는 경향이 있다. 그러나, 본 발명의 직접적인 코팅 공정은, 하나 또는 여전히 이용할 수 있는 비오틴 결합 자리 모두와 반응하는 대형의 비오틴화 항체의 결합 후에도 지속되는 코팅 안정성이 있는 특이적인 시약의 부착을 허용할 수 있는 충분한 비오틴 결합 자리를 제공한다. 이러한 특징은 세척하는 도중 또는 가온 시, 유체의 힘으로부터의 유체 역학 응력에 노출되었을 때조차도 유지된다.
도 4에 도시된 바와 같이, 상이한 유형의 아비딘이 코팅에 이용될 수 있고, 또한 매우 안정적이다. 도 4는 4℃에 1개월 이상의 기간 동안 저장된 리튬 니오베이트에 결합된 아비딘의 광학 밀도를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 칩을 제조하였다. PBS를 이용한 격렬한 세척 후, 칩을 멸균된 PBS에 잠기도록 하여 보관하고, 1개월까지 4℃에 두었다. 1주일에 1회씩, 양성 대조군(+아비딘)과 음성 대조군(-아비딘) 칩을 o-페닐 디아민 디하이드로클로라이드 정제(Simga)를 이용한 비오틴 겨자무 과산화효소 분석으로 시험하였다. 기판과 반응정지 용액(황산 2.5m)을 첨가한 후, 도 4의 O.D.를 바이오텍 시너지 HT 플레이트 리더(Bio-Tek Synergy HT Plate reader)로 판독하였다. O.D.는 칩에 대한 아비딘의 결합이 처음으로 결합되었을 때만큼 널리 퍼져 있음을 보여준다.
고정된 상태에서 일반적인 (바이오센서 구성요소라고도 알려진) 아비딘 바이오센서의 우수한 열 안정성은 냉장 보관에 쉽게 접근할 수 없는 열대 기후에 이용될 수 있는 임의의 POC 시험에서 중요하다. 따라서, 일반적인 아비딘 바이오센서는 보호 코팅을 필요로 하지 않지만, 밀폐되어야 하며, 특히 질소 분위기 내에 밀폐되어야 한다. 1회용의 사용 준비가 된 표본 처리 튜브 내부의 안정화 유리질 상태의 표적 특이적인 항체 제제의 안정화는 불안정한 효소의 실온 보관에 성공적으로 이용되었던 PAFRA TM 공정(US 5,098,893호 및 EP 0223221호)에 의해 달성된다. 예를 들어, 당과 글리세롤 같은 보존제를 함유하는 코팅 완충액이 이용될 수 있다.
C. 간접 코팅법: 결정체 표면을 직접적으로 코팅하는 것 이외에도, 본원에 기술된 공정은 결정체 표면을 코팅하기 위한 종래 기술의 사전 코팅을 (제한 없이) 포함하는 다른 물질 위에 아비딘을 코팅하는 데 이용될 수 있다. 또한, 광범위한 응용이 가능하다. 예를 들어, 현재 여러 단계로 만들어지고 있는 아비딘이 코팅된 자석 또는 라텍스 입자 또는 측면 유동 막을 직접적으로 제조하는 것이 그러하다. 규산나트륨 또는 이산화규소는 도파로로서 전단 수평 파동을 보호하기 위하여 표면을 코팅하는 데 종종 이용된다. 본 발명의 아비딘 결합 공정은 이산화규소 또는 유리질 표면에 잘 결합시키며, 그 결과, 도파로 표면 위에 중첩시킬 수 있다. 게다가, 이러한 공정은, 산을 이용하여 실리카-Nav 층으로 전환되는 비가역적인 유리질 층에서의 아비딘 포획에 이용되어, US 2011/0053139에 교시된 바와 같이 결합과 실리카 도파층을 제공한다. 다른 구현예에서, (표면에 결합하여 검게 만드는) 은, 구리, 금 또는 철과 같은, 결정체 표면 위에 코팅된 금속 이온은 본원에 개시된 공정을 위해 간접적인 코팅을 위한 기판을 제공한다. 은 또는 금의 염 또한 결합하여, 티올 및, IgG 같은 이황화 단백질, 그리고 아비딘과 결합하는 표면을 형성한다.
리튬 니오베이트 결정체를 규산나트륨 용액과 접촉시켜, 압전 물질로 이루어진 표면에 증착된 실리카(SiO2) 코팅 위에 아비딘을 코팅하였다. 그런 다음, 직접 결합에 대해 위에서 기술한 바와 같이, 아비딘을 실리카 코팅에 결합시켰다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 방법을 이용하여 아비딘은 SiO2와 결합하여 리튬 니오베이트를 코팅한다. 집중적인 PBS 세척 및 블로킹 단계 후에 비오틴 HRP가 칩에 첨가되고, 실온에서 45분 동안 항온 처리하였다. 기판을 첨가하여 20분 동안 HRP 효소의 색 변화를 유도한 다음, 정지 용액을 첨가하였다. 도 5의 패널(a)에서, 흡광도(O.D.)를 490nm에서 판독하였다. 이산화규소에 결합된 아비딘에 대한 O.D.를 왼쪽 칸에 나타내었고, 아비딘이 없는 이산화규소를 오른쪽에 나타내었다. 양성(1.6)에서 음성(0.2)을 빼면, O.D. 판독값은 여전히 1.4로, 이는 아비딘에 대하여 우수한 결합이라고 여겨진다. (도 5의 패널(b)는 아비딘의 결합을 아비딘의 결합을 뉴트라비딘과 비교한 것이다. 아비딘과 뉴트라비딘은 모두 대략 동일한 O.D.를 나타낸다. 그러나, 이 실험에서 아비딘과 뉴트라비딘은 압전 표면 위에 직접적으로 코팅되었다. 패널(b)은 음성 측정값을 뺀 후의 두 개의 양성 아비딘 측정값의 평균을 나타낸다.)
D. 코팅된 바이오센서에 대한 분석물질의 결합
일부 구현예에서, 결정체 표면 위에 결합된 아비딘은 관심 있는 분석물질에 결합하기 위하여 활성화가 필요하다. 이러한 활성화는 항체와 같은, 비오틴화된 결합제를 포함하며, 이는 관심 있는 분석물질 항원에 대해 특이적이다. 이러한 항체 또는 다른 작용제는 아비딘이 코팅된 칩에 부착시키기 전에 비오틴화된다. 항체는 아비딘 기판에 부착된 후 또는 전에 그의 분석물질인 항원과 결합할 수 있다. 분석물질 비오틴화된 항체 복합체는 센서 외부에서 형성될 수 있고, 그 후, 이러한 복합체는 센서와 접촉될 수 있으며, 항체 위의 비오틴은 아비딘이 코팅된 칩에 결합할 것이다. 두 가지 방법 중 어느 것이 선호되느냐는 분석물질과 시료 프로세싱에 달려 있다. 두 방법 모두 본 발명의 범위 내에 해당한다. 칩 표면 위의 아비딘에 결합된 특정 항체가 있는 표면 코팅을 다시 AFM을 이용하여 분석한 결과, 6 내지 9nm의 깊이를 확인할 수 있었고, 항체가 실제 아비딘 층에 결합되어 있는 것으로 나타났다(도 2 참조).
항원 특이적인 비오틴화된 포획 시약을 적용하여, 비 건조 매체 내의 결합된 비오틴화된 시약 및 과량의 유리 비오틴화된 시약으로 이루어지며, 수크로오스, 트레할로스, 글리세롤 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 당해 기술 분야에서 공지된 단백질 안정화제도 함유하는, 제2의 층을 형성한다. 여러 작용제들이 비오틴화될 수 있는데, 그것들 가운데서도 가장 흔히 사용되는 작용제는 관심 있는 분석물질을 특이적으로 인식하는, 비오틴화된 항체이다. 단백질 포획 시약은 화학적으로 또는 효소적으로 비오틴화될 수 있다. 화학적 비오틴화는 아민, 카르복시산염, 설프히드릴 및 탄수화물의 비특이적인 비오틴화를 얻기 위하여 다양한 공지된 콘쥬게이션 화학을 이용한다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS) 커플링이 단백질 내의 임의의 1차 아민의 비오틴화를 제공한다는 것도 이해된다. 효소적 비오틴화는 박테리아의 비오틴 연결효소에 의해 특성 시퀀스 내에서 특이적인 리신의 비오틴화를 초래한다. 대부분의 화학적 비오틴화 시약은 비오틴의 발레르산 곁사슬에 링커를 통해 부착된 반응성 기로 이루어진다. 효소적 비오틴화는 AviTag 또는 억셉터 펩티드(AP)라는 명칭의 15개 아미노산 펩티드에 관심 있는 단백질을 N 말단, C 말단에서, 또는 내부 고리에서 연결시킴으로써 가장 자주 이루어진다. 이러한 비오틴화 기법은 공지되어 있다.
포획 시약은 임의의 다음과 같은 것들로부터 형성된 항체 또는 앱타머 또는 기타 특이적인 리간드 또는 수용체일 수 있다: 비오틴화된 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 핵산(Pon, Richard T. (1991). "A long chain biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5'-biotinylated oligonucleotides". Tetrahedron Letters 32 (14): 1715-8), 단백질, 펩티드 및, IgA, IgG, IgM, IgE를 포함하는 항체, 효소, 효소 보조인자, 효소 억제제, 막 수용체, 키나아제, 단백질 A, 폴리 U, 폴리 A, 폴리 리신 수용체, 다당류, 킬레이트 시약, 탄수화물, 당류.
일단 결합되면, 포획 시약은 가열된 공기에 짧게 노출되어 적용된 유체로부터 물의 부분적인 제거를 가져와, 제2의 항원 특이적인 결합제 층의 시간 의존적인 형성을 기본적으로 완료할 수 있게 하는 비 건조 겔 층 내의 항체와 같이, 결합된 단백질성 결합제의 장기적인 안정성을 보장할 보호 및 안정화 겔을 형성한다. 이러한 유리와 비슷한 층들은 선택적으로 카트리지의 파우치 내부에 실리카로 이루어진 건조제 펠릿 또는 분자체의 존재 하에, 보관을 위해 선택적으로 탈수된다. 카트리지의 상부 챔버는 밀봉되어 유체 구획을 형성한다. 그런 다음, 챔버와 함께 카트리지는 플라스틱 보관 파우치 내에, 바람직하게는 N2 분위기 내에서 밀봉된다.
앵커 물질(아비딘)과 비오틴화 포획 시약 간의 결합은 제2의 포획 시약층이 칩 위에 형성되게 한다. 이용하기 전, 보호 겔층 내의 임의의 잔류하는 결합하지 않은 비오틴화된 포획 시약 및 기타 구성요소들은 분석 완충액 또는 심지어 분석 절차 도중의 표본 유체를 이용해서 간단한 물 내림(flush)으로 용이하게 제거할 수 있다. 이러한 센서들은 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 항원을 검출하는 것으로 밝혀졌다. 포획 시약이 항체일 때, (예를 들어, 그리고 제한 없이) 0.025 내지 25㎍/ml 범위의 양으로 적용될 수 있다.
E. 분석물질의 결합 및 바이오센서를 이용한 질병 발견
본 발명에 따른 바이오센서는 다양한 작용제 및 생화학적 지표를 검출하기 위하여 관심 있는 분석물질에 특이적으로 결합하는 포획제를 함유하는 적당하고 정확한 바이오 필름 코팅이 갖추어졌을 때 대량으로 용이하게 생산될 수 있다. 이러한 통합된 바이오센서가 투입될 수 있는 용도의 예로는 인간 및 동물 진단법을 포함한다. 분석물질은 올리고뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 펩티드, 병원균 단편, 분해된 병원균, 및 IgA, IgG, IgM, IgE를 포함하는 항체, 효소, 효소 보조인자, 효소 억제제, 독소, 막 수용체, 키나아제, 단백질 A, 폴리 U, 폴리 A, 폴리 리신, 다당류 및 킬레이트 시약을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 감염원이거나, 감염원에서 발견되거나, 감염원에 의해 발생되며, 검출에 사용될 수 있는 임의의 물질로 정의된다. 항원-항체 상호작용의 검출은 이전에 기술된 바 있다(미국 특허 번호 제4,236,893호, 제4,242,096호 및 제4,314,821호, 이들 전부는 참조로 본원에 명확히 통합된다). 나아가, 혈청형 또는 항원형과 같은 감염원의 표현형 변이주를 포함한, ((병원성 세균과 같은) 원핵 세포와 포유류 종양 세포를 포함하는 진핵 세포를 포함하는) 전세포; (레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 등을 포함하는) 바이러스; 진균류, 기생충 및 포자류의 검출에서의 적용은 본 발명의 범위 내에 해당한다.
F. 압전 물질의 유형
많은 압전 물질들이 제한 없이 본 발명에 이용하기에 적합하다. 또한, 표면 음향파(SAW) 또는 체적 음향파(BAW) 모드에서 표면 음향파의 전파에 특히 적합한, 다양한 결정체 배향으로 상업적으로 이용 가능한 모든 크기의 연마 웨이퍼 또한 제한 없이 포함된다. 결정체는 양쪽에서 연마되는 편이 바람직하지만, 단일 연마 물질 또한 일부 응용에 적합하다. 모든 다양한 결정체 배향은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 랑가사이트 결정체가 적합하다. 그 예로는 제한 없이 납 마그네슘 니오베이트/납 티탄산염(PMN-PT), 납 지르콘산 니오베이트/납 티탄산염(PZN-PT), 리튬 니오베이트(LiNbO3), 도펀트가 있는 리튬 니오베이트, 리튬 테트라보레이트(Li2B4O7), 리튬 탄탈라이트 및 석영이 있다. 티탄산 바륨(BaTiO3) 또한 실온 적용을 위한 압전 결정체의 무연 공급원이다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 결정체들의 예로는 다음을 포함한다: 베르리나이트(누수 saw), 오르토인산 갈륨(레일리), 포타슘 니오베이트(SAW 및 BAW 후보), 바륨 지르코니티탄산염, (미래의 saw로 가능한) 란탄 칼슘 옥소보레이트, (란타늄 갈륨 실리케이트와 같은) 랑가사이트 결정체; 페로브스카이트 구조체와 같은 세라믹(KNbO3, Ba2NaNb5O5, SrTiO3, Pb2KNb5O15, 비스무트 페라이트, NaxWO), (공명기 또는 변환기를 위한) 납 지르콘산 티탄산염, 카드뮴 설파이드(보통 광 레지스터 센서), 산화 아연(OH 기의 반응성 때문에 필름으로 적용될 수 있음), 갈륨 비소, 비스무트 및 게르마늄 산화물(광학/절연체), (피에조 필름으로) 질화 알루미늄 및 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF 필름).
또한, 다중 결정체 요소가 이용될 수 있다. 특히, 그것들은 다양한 목적을 위해 여러 방향으로 파동을 전파하기에 적당하다. 또한, 압전 필름은 샌드위치 포맷의 비 압전 물질에 결합될 수 있어서, 그러한 구조체는 본 발명으로부터 선험적으로 배제되지 않는다.
2. 음향파 센서
압전 결정체 공명기의 경우, 음향파가 결정체의 체적 내에서(즉, 체적 모드) 또는 결정체의 표면 위에서 이동하며, 몇 가지 형태에서 두 가지 모두가 발견된다. 체적 음향파("BAW")는 결정체 매체를 통과하여 이동하고, 흔히 이용되는 BAW 장치는 두께 전단 모드(TSM), 음향판 모드(APM) 및 전단 수평판 모드(SH-APM)이다. 흔히 이용되는 SAW 장치로는 전단 수평면 음향파(SH-SAW), 표면 횡단파(STW) 및 러브파(LW)를 포함한다. 바이오센서에서, 이들 파동은 감쇄되어서는 안 되고, 그렇지 않으면 그것들은 필요한 감도로 생물학적 유체 내의 분석물질을 검출하는 능력을 상실한다. 파동 유형과 무관하게, 파동을 상당히 감쇄시키지 않고 질량 변화의 커플링을 보존하는 것은 센서를 개발하는 데 있어서 중요한 문제이다. 본 발명에서는 이러한 파동 모두 전부가 고려되지만, 궁극적인 모드 선택은 유체와 접촉했을 때, 파동을 감쇄시키지 않고 생물학적 질량 변화에 대해 매우 민감할 필요가 있을 것이다. 또한, 센서의 배치 형태도 이러한 목표를 달성하는 데 있어 중요하다. 따라서, 본 발명의 센서의 구조 및 각각에 사용된 파동의 속성은 최적화의 대상이 된다.
체적 파동은 결정체 물질을 통과하여 이동하므로, 바이오센서처럼 덜 민감하리라고 생각되었다. 발생된 체적 파동으로부터 질량 결합이 더 제거되고, 질량과 파동 주파수 사이의 관련성이 상실되거나 약해질 때 감도가 소실되므로, 본 발명에 의해 제공되는 것과 같이, 체적 파동 감도는 간단하고 일관성 있는 바이오 코팅으로 보존될 필요가 있다. 따라서, 체적 파동은 본 발명에 따른 앵커 물질 코팅과 함께 이용될 수 있다.
또한, 바이오 코팅은 적용하기에 쉽고 장치마다 일관성이 있어야 하며, 그렇지 않으면 장치간 변동성 때문에, 치료가 진단에 기초를 두고, 진단 정확도는 장치 감도에 달려 있는 (그러나 특이성은 주로 포획 시약에 달려 있다) 보건 의료 환경에 사용하기 곤란할 것이다. 또한, 선택된 바이오 코팅은 포획 시약을 일관성 있고 재현성 있게 결합시켜야 하며, 그렇지 않으면 (일관되게 균일한 코팅층을 제공하지 않고, 일관된 강도로 단백질과 결합하지 않는, 실란, 하이드로겔 또는 고분자 코팅을 포함하는 종래 기술의 장치에서의 경우와 마찬가지로) 변동성 때문에 빗나가거나 부정확한 진단으로 이어질 수 있다.
표면 발생 파동은 질량 변화에 더 민감하지만, STW와 같은 종래의 SAW 장치들은 생물학적 유체 안으로 상당한 깊이까지 침투하여, 파동을 약화시키므로, 생물학적 유체에 대해서는 종종 잘못된 선택이 된다. SH-SAW는 파동이 수평적으로 분극되므로 더 우수한 바이오센서를 제공하지만, 그것들은 도파로에 의해 보호될 필요가 있다.
본 발명은 바이오센서로 표면 음향파의 다양한 유형을 이용하는 것을 둘러싼 여러 가지 문제점을 극복한다. 이는 일부 구현예에서는 기술된 음향판 모드(APM)를 이용하지만, 다른 구현예에서는 본원에 기술된 바와 같이 SH-SHEAR와 같은 대안적인 파동 형태를 이용할 수 있는 새로운 압전 바이오센서 배치를 이용함으로써 이루어진다. 그 결과가 바로 수성 유체 내의 생물학적 시료 분석을 위한 신속하고 비용 효율적 시스템이다. 일부 구현예에서, 이것은 부분적으로는 유체와 접촉하고 있는 압전 매체의 표면(또는 일부분)과 반대쪽 표면 또는 두 개(2)의 IDT 요소가 접촉하는 압전 결정체의 고립된 일부분 사이에 유체를 통과시키지 않는 배리어를 제공함으로써 달성된다. 이러한 배리어는 유체가 갇히는 누수 방지 챔버의 형태가 될 수 있다. 장치 사용 시, 유체 시료와 접촉하게 될 압전 매체의 일부분은 챔버의 한 쪽 벽을 형성한다. 그 결과가 바로 수성의 생물학적 유체 내의 표적 개체를 검출하기에 적합한 간단한 통합 바이오센서이다.
이러한 새로운 바이오센서는 본 발명에 따른 신규한 직접 코팅을 보유할 수 있거나, 위에 기술된 바와 같이 중간층 중첩과 함께 간접 코팅을 보유할 수 있는 바이오 필름 칩을 포함한다. 따라서, 본 발명의 구체적인 일 구현예는 바이오 필름 및 전용 APM 모드의 압전 바이오센서가 POC 진단 장치를 위한 플랫폼의 분석적 구성요소를 형성하며, 분석적 구성요소는 본 발명에 따라 기술되는 통합 칩이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 바이오 코팅 공정에 새로운 화학을 도입하고, 표적 개체들의 분자 검출에 이용되는 포획 시약을 측면에 배치하며 표면 위에 위치하는 IDT로부터 발생된 음향판 모드 파동을 이용하는 새로운 압전 바이오센서 배치를 얻고자 압전 센서를 개선한다. APM은 간섭 측면 파동이 IDT의 평면을 따라 레일리파처럼 이동하는 것으로부터 격리되거나 보호된다. 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은 감지 표면을 함유하는 유체 챔버의 어느 한 쪽에 위치된 절연 필름에 IDT 같은 차폐된 전기적 구성요소 및 전기적 연결을 가지고 있는 바이오센서 디자인을 도입한다. 감지 표면은, 유체 시료 내의 표적 개체들을 포획하도록 설계된 표적 특이적인 포획 시약을 포함하는, 고정화된 시약으로 이루어진 하나 이상의 층으로 특이적으로 코팅된, 절연되지 않은 영역을 함유한다. 생물학적 유체 시료의 부피는 감지 표면에 부착된 유체 구획의 치수에 의해 결정된다. 결합된 표적 개체들로부터 발생된 APM 신호의 파동 교란은 감도 높은 상업용 신호 분석장치, 예컨대, Agilent에 의해 제조된 것들 것 같은, 네트워크 분석장치에 의해 검출된다.
본 발명은 압전 바이오센서에 APM을 도입하여 상업용 또는 실험용 바이오센서에 사용되던 종래의 기술에 개선을 가하며, 그에 의해 APM은 층 유도 또는 도파로가 필요 없이 압전 표면의 반대쪽에서의 주파수 변화에 대해 높은 감도로 반응할 수 있다. 또한, 본 발명은 참조로 통합된 미국 공개 출원 번호 제2011/0136262호에 논의된 바와 같이 포획층과, 생물학적 시료 내의 감염원, 이의 단편 및 유도된 독소 또는 단백질의 신속한 검출에서 표적 사건들의 다중 분석을 위하여 마이크로채널을 이용한 다른 것들의 용도를 고려한다.
본 발명의 일부 바이오센서 구현예는 소정의 측면에서 종래의 SH-SAW를 기반으로 한 센서들과 유사할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 또한 예를 들어, (본원에 제공된 다른 물질들의 선택 중에서) 니오베이트, 석영, 실리카 또는 탄탈산염을 기초로 할 수 있는 압전 표면, 다수의 순차적으로 증착된 하부 층들을 덧씌우고, 유체 표본으로부터 표적 분자를 포획하고, 결합된 질량으로 인한 파동의 속성 변화로 결합된 표적을 검출함으로써 전형적으로 형성된 표적 특이적인 결합제층과 동일한 압전 표면 위에 위치된 입력 및 출력 IDT 세트를 이용한다. 이러한 종래 기술의 센서들을 기초로 한 본 발명의 바이오센서는 아래에 기술된 바와 같이 앵커 코팅을 도포하는 매우 간단한 방법을 이용한다.
그러나, 다른 구현예들은 결합된 표적이 위치한 피에조 표면을 따라 아무 것도 안 덮인 또는 절연되지 않은 영역을 이용함으로써 추가적인 중요한 측면에서 종래 기술에서 보고된 SAW 바이오센서들과 다르며, 음향파는 반대편에서 발생되어 결정체의 물질을 횡단한다. 표면 위의 분자들을 검출하기 위하여 레일리파를 이용하는 대신, 반대편의 액상에서 부착된 분자들을 감지하기 위하여 APM(체적 또는 판 모드 파동)이 이용된다. 레일리파와 달리, APM은 액체 내에서 작동하여 반대쪽 표면 위의 변화를 감지할 수 있다. 실험 결과에 따르면, APM은 IF 범위에서 높은 Q 인자(>1000)를 나타낸다. 더 높은 Q 인자는 더 높은 감도와 더 많은 주파수 변동을 가져온다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예는 APM 모드를 이용한다. 도 10은 본 발명에 적용하기 위한 128°YX 컷 또는 Z 컷 LiNbO3 기판 위의 레일리파와 APM에 대한 이론적인 모델을 나타낸다. 감지 영역은 유체 챔버에 해당하며, 여기서 시험의 대상이 되는 생물학적 시료는 압전 기판의 상부에 놓인다. (표면에 직접적으로 부착된 아비딘 분자를 통해) 맨 위의 표면에 결합된 분석물질을 검출하기 위하여 파동이 바닥에서 발생되어 압전 매체를 통과하여 이동하며, 포획된 분석물질의 추가 질량과 접할 때, 파동의 주파수가 변할 것이다. 따라서, 128°YX 컷 또는 Z 컷이 도 10에 기술된 바 있지만, 일상적인 실험에 의해 동일한 감도 또는 거의 동일한 감도를 제공하도록 최적화될 수 있는 다른 컷들이 본 발명에서 고려된다. 추가적인 구현예는 Andle, J.C. et al, Sensors and Actuators B 24-25 (1995) 129-133: "Selective acoustic plate mode DNA sensor"에서 기술된 바와 같이, APM에 대한 ZX 컷을 포함한다.
또 다른 구현예에서, SAW 파동은 128°YX 컷 LiNbO3 기판의 반대쪽 위의 분자 결합을 검출하는 데 이용된다. 결합된 분자 덩어리는 SAW를 간섭하고, 그것들의 반사를 바꾼다. 주파수 변화는 조화의 중심 주파수에서의 변위의 측정과 같이 여러 가지 방법으로 측정할 수 있다.
바이오센서에 대한 두 가지 구현예를 도 11의 패널(a)과 도 11의 패널(b)에 개략적으로 도시하였다. 패널(a)은 접촉점(1)을 가지고 있는 바이오센서 카트리지 또는 하우징(10)을 나타낸다. LiNbO3와 같은 APM 파동을 생산할 수 있는 압전 기판은 적절한 선택의 일부이며, 바람직한 물질은 일부 구현예에서 128°YX 컷 또는 Z 컷 리튬 니오베이트(LiNbO3)이다. 이러한 바이오칩은 인터 디지털 변환기(Inter Digital Transducer, IDT)를 기능화된 기본적인(아무것도 덮이지 않은) 결정체의 기능화된 표면의 절연된 영역에 IDT 파동 발생기(2), IDT 파동 수신기(3) 및 기타 전기적 구성요소로 더 포함한다. 절연체는 예를 들어, 공지된 고분자 절연 필름으로 이루어질 수 있다. 표적 개체 또는 분석물질을 함유하는 생물학적 유체 시료는 선택적 필터(6)로 예비적으로 여과한 후, 유입구(5)를 통해 유체 챔버(4)로 들어간다. 포획 시약(7)은 기능화된 표면의 절연되지 않은 영역에 부착된다. 항원(8)이 수용체(7)와 결합하면, 유체 챔버를 가로질러 IDT 파동 발생기(2)로부터 APM 파동의 흐름에 교란을 일으키며, 이는 반대쪽 위의 IDT 파동 수신기(3)에 의해 개질된 APM 파동(주파수에 반영된 개질)으로 검출된다. 유체 유입구 상의 유체 필터(6)는 더 큰 비표적 입자성 물질로 말미암은 잠재적인 비 특이적 결합(NSB)을 배제하기 위하여 선택적으로 필요하다. 그런 다음, 유체는 유출구(9)를 통해 챔버를 떠난다. IDT가 반대편 표면 위에 있다는 사실은, 이론적이기는 하지만 그러한 배치를 보여주는 도 10으로 설명될 수 있다.
도 11의 패널(b)은 다중 채널(분석 채널(15), 양성 대조군 채널(16) 및 참조 채널(17))을 가지고 있는 본 발명에 따른 코팅된 바이오센서를 도시한 것이다. 도 11의 요소(1~6)은 도 10의 (1~6)에 해당한다. (7)은 유출구이고, (8)은 출력 커넥터이고, (9)는 입력 커넥터이고, (10)은 결정체 기판이다.
3. 다중 어레이 장치
본 발명의 추가적인 구현예는 다양한 파동 모드와 인핸스먼트를 이용하는 단일 센서 또는 다중 센서들을 포함하는, 단일하고 처분 가능한 카트리지 시스템의 제조이다. 각각의 카트리지는 최소한도로 센서와 센서를 캡슐화하는 시스템과 취급 유체를 유체 카트리지 내에 포함한다. 센서는 판독기 시스템과의 직접적인 유선 접촉을 통해 또는 무선 모드를 통해서 이용할 수 있다.
가장 단순한 구현예에서, 각각의 센서는 압전 기판에 적용된 전자적 요소 및/또는 생물학적 요소를 포함한다. 도 11의 패널(a)은 음향판 모드(APM 모드)에 사용하기 위한 단일 지연선 구조를 가진 센서의 일 구현예를 도시한 것이다. APM 모드에서, 전자적 요소들은, 생물학적 요소들 또는 유체 요소들이 접촉하게 되는 쪽에 대해, 기판의 반대편 위에 적용된다. (SAW 또는 SH-SAW와 같은) 다른 파동 모드에서, 이들 요소들은 도파로의 첨가와 함께, 또는 도파로의 첨가 없이, 생물학적 요소들 및 유체 요소들과 동일한 기판 쪽 위에 놓일 수 있다. APM 파동을 생성할 수 있는 압전 기판은 이러한 구현예의 범위 내에 포함된다. 하나의 예는 128° YX 컷 또는 Z 컷 리튬 니오베이트(LiNbO3)인 물질이다. 다른 구현예들은 SH-SHEAR 파동을 포함한다. 도파로는 전형적으로 고분자로 이루어지지만, 조합하여 또는 단독으로, 고분자 또는 금속의 조합을 통해서도 제조될 수 있다. 지연선은 접촉점(1) 및 인터디지털변환기((2) 및 (3))을 포함한다. 무선 시스템이 회로에 신호를 보내는 데 이용된다면, 접촉점(1)은 필요하지 않을 수 있다. 인터디지털 변환기는 IDT 파동 발생기(2)와 IDT 파동 수신기(3)를 포함하는 각각의 세트와 대응쌍(또는 다중 대응쌍)으로 구현된다. 일부 구현예에서, 발생기와 수신기는 동일할 수 있다. 포함되리라고 생각되는 다른 요소들은 공지된 고분자성 절연 필름으로 이루어진, 반사기, 증폭기, 추가적인 그라운드, 흡수체 또는 절연체의 이용을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
센서의 비 전자적인 요소들을 도 11의 패널(a)에 나타내었다. 유체 카트리지는 유체 챔버(4), 유입구(5) 및 선택적인 인라인 필터(6)를 함유한다. 표적 개체 또는 분석물질을 함유하는 생물학적 유체 시료는 선택적인 인라인 필터(6)를 통한 여과 후에 유입구(5)를 통해 유체 챔버(4)로 들어간다. 유체 챔버(4)는 (SH-SAW 모드에서와 마찬가지로) 전자적인 요소들과 동일한 쪽 또는 (APM 모드 센서로 이용하기 위하여) 반대쪽 위에 있을 수 있다. 유체 챔버(4)는 미리 정의된 영역으로, 여기서 생물학적 유체 시료가 (바이오 필름 또는 기타 개질과 함께, 또는 이들 없이) 기판과 접촉하게 된다. 포획 시약(7)은 절연될 수 있거나 절연되지 않을 수 있는 유체 챔버(4)의 영역으로 정의되는, 압전 기판 표면의 영역에 부착된다. 항원(8)이 수용체(7)와 결합하면, 유체 챔버를 가로질러 IDT 파동 발생기(2)로부터 APM 파동의 흐름에 교란을 일으키며, 이는 반대쪽 위의 IDT 파동 수신기(3)에 의해 개질된 APM 파동(주파수, 진폭, 상 또는 기타 유래된 정보에 반영된 개질)으로 검출된다. 유체 유입구 상의 유체 필터(6)는 선택적이나, 더 큰 비표적 입자성 물질로 말미암은 잠재적인 비 특이적 결합 작용제(NSB)를 배제하기 위하여 필요할 수 있다. 그런 다음, 유체는 유출구(9)를 통해 챔버를 떠나 폐기물 용기로 나간다.
도 11의 패널(b)는 세 개의 지연선(활성 지연선, 양성 대조군 지연선 및 참조 지연선)이 있는 APM 모드 센서의 구현예를 병렬 배치로 도시한 것이다. 이러한 구조는, 단일의 감염성 요소 또는 조건을 진단하거나, 감염 또는 질병의 수준을 정량하거나, 밀접하게 관련된 질병들, 비슷한 징후학을 나타내는 질병들 또는 성적 접촉으로 전염된 질병 패널들과 같이 빈번하게 동시에 발생하는 감염들을 구분하기 위한, 다중 어레이의 단일하고 처분 가능한 시스템을 구성하기 위하여 추가적인 지연선 또는 다중의 센서들을 포함하도록 확장될 수 있다. 다중 지연선이 있는 센서들 또는 다중 센서들은 나란히, 엇갈리게 또는 방사상 배치로도 위치될 수 있다.
실시예 1: 뉴트라비딘 및 비오틴화 항체를 보유하는 바이오센서 칩의 코팅을 위한 수동 공정
이러한 모든 방법은 실제로 수행되었다.
a. 고정하지 않고 코팅하기: 0.5mg/ml의 아비딘 농도에서 PBS 내에 50% 글리세롤을 함유하는 용액 내에 아비딘을 잉크 제팅하여 달성되는 아비딘의 도포 전에, LiNbO3 표면을 청소하고 플라즈마 발생 장치(예컨대, Plasma Treat USA, 미국 일리노이 주 엘진)로 대기압에서 약 1~10초 동안 활성화한 다음, 약 50℃에서 열선총으로부터의 따뜻한 공기를 이용하여 짧게 건조시키거나, 약 30분 동안 실온에서 건조시켜, 아비딘을 표면에 결합시킨다. 그러면 바이오센서가 사용 또는 포장을 위한 준비가 된 것이다.
선택적으로, 뉴트라비딘의 증착 후에는 고정 단계가 이어진다.
b. 열 고정을 수반한 코팅: 실시예 1a에 기술된 바와 같이 뉴트라비딘이 잉크 제팅에 의해 도포된다. 최대 30분 동안 적외선등으로 약 30~50℃로 가열시켜 피에조 기판에 뉴트라비딘을 고정시킬 수 있다.
c. 용매 고정을 수반한 코팅: 바이오센서의 코팅된 영역은 실시예 1a에서 제조하여 열선총으로 건조시켰다. 그런 다음, 100% 이소프로판올 또는 아세톤의 용매 사이로 버블링하여 이루어진, 이러한 용매로 포화된 공기의 흐름에 약 15초 동안 노출시킨 다음, N2 기체의 흐름에 짧게 노출시켰다.
d. 증기를 이용한 코팅: 실시예 1a에서와 같이 고정된 뉴트라비딘은, 열 건조시킨 다음, 10% 포름알데히드 용액 사이로 공기를 버블링하여 이루어지며 약 15초 동안 건조된 뉴트라비딘 층을 겨냥한, 포름알데히드로 포화된 공기 흐름에 노출시킨 다음, 약 15초 동안 N2 기체에 노출시켜 고정하였다.
e. 비오틴화된 항체를 칩 위의 아비딘 코팅에 부착시키기: 특정 분석물질에 대해 선택된 항체를 상업적으로 이용할 수 있는 키트(예컨대, Innova Bioscience 또는 Fisher Scientific)를 이용하여 비오틴화한다. 비오틴이 부착된 항체는 0.05% BSA/PBS 완충액을 이용하여 원하는 농도까지 희석한다. 제조업체의 설명서에 제공된 항체의 공지된 친화도를 기초로 하여, 이러한 항체 제제를 실온에서 15~60분 동안 아비딘이 고정된 칩 상에 항온 처리한다.
실시예 2: 자동화된 코팅 공정
a. 뉴트라비딘 바이오센서를 위한 자동화된 직접 코팅 모드 :
일부 구현예의 온라인 제조는 이후에 컨베이어 벨트 위에 마운트되는 바이오센서 하우징의 아래 부분에 고정된 피에조 결정체 위에 뉴트라비딘 코팅을 증착시키는 것을 수반한다. 플라즈마 처리 후, 센서는 뉴트라비딘 잉크 제팅 단말로 이동되어, 0.5제곱 센티미터 면적 당 중량 기준 0.01 내지 5.0mg/ml; 또는 0.01 ~ 2.0mg/ml; 또는 0.01 ~ 1.0mg/ml의 뉴트라비딘을 함유하는 유체 5~10㎕로 코팅된다. 유체를 증발시키고, 뉴트라비딘을 열선총(약 50℃)으로부터의 열에 짧게 노출시켜 바이오센서 위에 고정시킨다. 그런 다음, 하우징의 상부 덮개를 부착하여 바이오센서 카트리지의 누수 방지 유체 챔버를 형성한다.
b. 비오틴화된 항체를 가지고 있는 코팅된 뉴트라비딘을 위한 자동화된 코팅 모드:
위의 실시예 2a에 기술된 바와 유사한 잉크젯 공정을 이용하여, 실온에서 0.01M PBS-0.1% BSA, pH 7.4, 1~10% 트레할로스, 1~5% 글리세롤, 0.05% 아지드화 나트륨으로 이루어진 비 건조 안정화 겔 매트릭스 내에 적절한 희석배수로 희석시킨 비오틴화된 항체를 코팅한 다음, 열선총으로부터의 따뜻한 공기로 약 1분 동안 부분적으로 증발시킨다. 바이오센서 위의 겔 코팅은 표면 위에 남겨져, 나중에 플라스틱 파우치에 보관하는 동안, 비오틴화된 항체와 고정된 뉴트라비딘의 반응을 완료한다.
c. 비오틴화된 올리고뉴클레오티드를 가지고 있는 코팅된 아비딘을 위한 자동화된 코팅 모드 :
실시예 2b의 공정이 수행되지만, 대신 비오틴화된 올리고뉴클레오티드가 겔 매트릭스에 희석된다.
d. 조립 및 포장:
a, b 또는 c단계의 코팅 공정 후, 카트리지 하우징의 윗부분이 부착되어 칩의 뒷면 상의 전자적 구성요소들로부터 완전히 분리되는 유체 챔버를 형성한다.
또한, 이러한 예의 자동화된 코팅 공정은 본 발명의 구현예에 따라 간단한 2단계의 공정을 이용하여 중간 산화물 코팅이 적용된 센서들뿐만 아니라, 종래 유형의 센서들(즉, 중간 코팅이 있는 센서들)에 대해 실현될 수 있다.
실시예 3: 바이오센서에서 검출된 클라미디아 트라코마티스
여성과 남성 모두에서 성병의 원인이 되는 절대적 세포 내 기생세균인 C. 트라코마티스로 실험을 수행하였다. 아비딘과 항체를 코팅하는 데 이용된 절차는 실시예 1에 기술하였다. 이용된 항체는 비오틴화된 C. 트라코마티스(Abcam)의 주된 외막에 대한 단일 클론 항체(MOMP)로, 0.25㎍/ml로 이용하였다. C. 트라코마티스는 Microbia로부터 획득하였고, ml당 105개의 농도로 PBS/완충액에 현탁시켰다. 비슷한 실험에서, 단일 클론 항체는 C. 트라코마티스 기본 소체 리포다당류(Medix)를 대상으로 하였다. 105개 EB의 기본 소체(EB)+비오틴화된 항-EB LPS 0.25㎍/ml의 분취를 실온에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 칩에 첨가하였다. 도 6과 도 7은 이러한 특이적인 감염성 항원들을 이용하여 수행한 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 6은 뉴트라비딘에 결합된 항체에 결합된 C. 트라코마티스 기본 소체를 보유하는 AMT 칩에 대한 형광 현미경 슬라이드의 일련의 흑백 투사도이다. A 섹션은 음성 대조군(칩은 아비딘만을 가지고 있고, 항체는 가지고 있지 않음)의 이미지를 도시한 것이고, 현시제(revealing agent)는 B 섹션의 경우 핵산 DAPI이고, C 섹션의 경우에는 FITC가 표지된 항-항트라코마티스 항체이다. 이러한 실험은 칩 위에 세포 물질이 존재함을 확인시켜 주는 것으로, 이는 항원이 고정화된 항체에 결합되어, 궁극적으로는 아비딘 앵커에 결합됨을 보여준다.
도 7은 시간의 경과에 따른 주파수의 그래프로, 항-클라미디아에 대한 클라미디아의 결합에 의한 주파수 편이를 나타낸다. 칩을 실시예 1에 기술된 바와 같이 아비딘으로 제조하고, 위에 기술된 바와 같이 카트리지에 조립하였다. 칩의 안정성을 확실히 하기 위하여 1시간의 (1x) PBS 베이스라인 측정을 2회 수행하였다. 주파수의 점진적인 경사는 유체의 온도 변화 때문이다. 그것은 30분 후에 결국 정착된다(미도시). 항체-항원 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 1시간 동안 제3 세그먼트의 칩에 첨가하였다. 제4 세그먼트는 칩을 PBS로 격렬하게 세척한 후의 판독값이다. 베이스라인 1로부터 최종 세척을 빼자 주파수 편이가 얻어졌으며, 223.66Hz의 값을 얻었고, 칩에 결합된 EB를 나타낸다.
센서는 도 11에 개략적으로 기술된 배치를 이용하였지만, 단일 채널을 보유하였고, 아크릴로 이루어진 다수의 층과 몇몇의 접착제 층 그리고 투명 시트를 이용하여 조립되어, 센서를 둘러싼 형태에 꼭 맞는 카트리지를 만들었으며, 노출부는 센서의 접촉점을 위해 바닥에, 그리고 상부, 유입구와 유출구 위에 있게 했다. 실험은 Agilent HP 8753E 신호 분석장치를 이용하여 수행하였다. 이 실험에서 베이스라인 완충액이 투여되고 이후 항체가 투여되고 최종적으로 클라미디아 항원이 투여된 사이에, 800MHz의 주파수 편이가 관찰되었다 최종 세척에도 불구하고 주파수 편이가 유지되었으며, 이는 항원이 음향판 모드 센서의 주파수 변화의 원인이 되었음을 나타낸다.
실시예 4: 바이오센서에 감지된 뎅기 바이러스
아비딘과 항체를 코팅하는 데 이용된 절차를 실시예 1에 기술하였다. 도 8은 PBS 완충액에 현탁시켰을 때, 뎅기 바이러스로 수행한 실험에 대한 주파수 편이를 도시한 것이다. 뎅기 바이러스는 뎅기열을 유발하는 플라비바이러스로, 매년 약 1억 명의 사람들에 영향을 미친다. 그것은 도시에 사는 모기인 Aedipus egyptii에 의해 전달된다. 네 가지의 혈청형이 알려져 있으나, 오직 하나의 혈청형만이 임의의 한 시점에서 감염을 유발한다. 혈청형은 수 년에 걸쳐 변할 수 있다. 2형 혈청형은 현재 알려져 있는 가장 흔한 혈청형이다. 뎅기 바이러스에 대한 실험은 0.05% BSA-PBS 내에 4㎍/ml의 2형 혈청형 항체(Feldan)에 대한 단일 클론성 외피 단백질을 이용하여, 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 과량의 항체를 제거하기 위하여 PBS 세척을 수행하였다. 뎅기 2형 항원은 Microbix로부터 획득하였다. 바이러스를 상업적으로 이용 가능한 원액의 표준 (1X) PBS/완충액(ml당 104 또는 8㎍/ml) 농도에 현탁시켰다(이것은 급성 감염 조건 하에서 인간의 바이러스 혈증의 정도와 비슷하다). 음향판 모드 센서와 파동 발생기는 실시예 3에서와 동일하였다. 베이스라인 완충액(대조군)과 항체 제제의 적용 및 부착에 이은 뎅기 바이러스 항원 적용 후의 센서 사이에서 500MHz의 주파수 편이가 관찰되었다. 최종 세척에도 불구하고 주파수 편이가 유지되었으며, 이는 항원이 음향판 모드 센서의 주파수 변화의 원인이 되었음을 나타낸다. 그 결과는 시간에 대한 피크 주파수의 그래프인 도 8에 나타나 있으며, 주파수 편이를 증명한다. 두 차례의 PBS (1x) 베이스라인 측정은 칩의 안정성을 확실히 하기 위하여 수행되었으며, 각각 1시간이었다. 뎅기 바이러스가 제3 세그먼트의 칩에 1시간 동안 첨가되었다. 제4 세그먼트는 칩을 여분의 PBS로 격렬하게 세척한 후의 판독값이다. 베이스라인 1로부터 최종 세척을 빼자 주파수 편이가 얻어졌으며, 278.62Hz의 값을 얻었고, 바이러스가 칩에 결합되었음을 나타낸다.
실시예 5: 단백질 검출
도 9는 주파수 대 시간의 그래프로서, 칩을 항체에 노출시키기 전과 후에 보여지는 주파수 편이를 묘사한다. 이러한 항체를 코팅하는 데 이용된 공정은 실시예 1에 기술하였다. 센서는 실시예 3에서와 동일하였다. 화살표 1은 아비딘만이 센서에 결합되었을 때, 센서로부터 수신된 주파수를 나타낸다. 화살표 2는 항체가 적용된 후, 센서로부터 수신된 주파수를 나타낸다. 이러한 항체는 비오틴화된 C. 트라코마티스의 기본 소체에 대한 다클론성 항체였으며, 1:200으로 희석하여 이용하였다(Abcam, Cambridge, Massachusetts-AV20387). 100MHZ의 변화가 보이는데, 칩에 항체를 첨가하여 주파수 편이가 일어난 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 나타낸다.
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당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 구현예의 여러 가지 균등물을 일상적인 실험만을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등물은 하기의 청구범위에 의해 포함되도록 한다.
본원에 인용된 모든 특허 및 기타 문헌은 전체가 참조로서 통합된다.

Claims (32)

  1. 압전 물질의 표면에 직접적으로 결합된 앵커 물질로 이루어진 층을 포함하는 압전 결정체를 포함하는 음향파 바이오센서 구성요소로서, 상기 앵커 물질은, 상기 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 상기 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 가지는, 음향파 바이오센서 구성요소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 앵커 물질은 아비딘이고, 바람직하게는, 아비딘, 뉴트라비딘, 또는 스트렙트아비딘인 바이오센서 구성요소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 앵커 물질층은 단일층인 바이오센서 구성요소.
  4. 제1항에 있어서, 상기 압전 물질은 랑가나이트 결정체, 납 마그네슘 니오베이트, 납 티탄산염, 납 지르콘산 니오베이트, 납 티탄산염, 리튬 니오베이트, 도펀트가 있는 리튬 니오베이트, 리튬 테트라보레이트, 리튬 탄탈라이트, 석영, 티탄산 바륨, 베르리나이트, 오르토인산 갈륨, 포타슘 니오베이트, 바륨 지르코니티탄산염, 란탄 칼슘 옥소보레이트, 랑가사이트 결정체, 란타늄 갈륨 실리케이트, 세라믹 페로브스카이트 구조체, 비스무트 페라이트, 납 지르콘산 티탄산염, 카드뮴 설파이드, 산화 아연, 갈륨 비소, 비스무트 및 게르마늄 산화물, 질화 알루미늄, 및 폴리비닐리덴 플루오라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오센서 구성요소.
  5. 제1항에 있어서, 상기 압전 물질은 리튬 니오베이트인 바이오센서 구성요소.
  6. 제1항에 있어서, 하우징과 유체 챔버를 더 포함하되, 앵커층을 보유하는 상기 압전 물질의 표면은 상기 챔버의 벽을 형성하는 바이오센서 구성요소.
  7. 제1항에 있어서, 상기 앵커 물질은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드인 바이오센서 구성요소.
  8. 제1항에 있어서, 음향파 발생기와 음향파 수신기를 더 포함하는 바이오센서 구성요소.
  9. 제8항에 있어서, 상기 파동 발생기는 체적(bulk) 음향파 또는 표면 음향파를 발생시키는 바이오센서 구성요소.
  10. 제9항에 있어서, 상기 체적 음향파 발생기는 두께 전단 모드, 음향판 모드 및 수평판 모드로 이루어지는 군으로부터 선택된 파동을 발생시키는 바이오센서 구성요소.
  11. 제9항에 있어서, 상기 표면 음향파 발생기는 전단 수평 표면 음향파, 표면 횡단파 및 러브파(love wave)로 이루어지는 군으로부터 선택된 파동을 발생시키는 바이오센서 구성요소.
  12. 압전 물질의 표면을, 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 나타내는 앵커 물질을 포함하는 바이오 필름으로 코팅하는 공정으로, 상기 공정은
    a. 압전 물질의 결정체 표면을 처리하여 상기 결정체 표면의 표면 에너지를 증가시키는 단계;
    b. 상기 결정체 표면에 상기 앵커 물질로 이루어진 층을 도포하는 단계;
    c. 상기 결정체 표면 상에 화학적으로 흡착된 앵커층을 형성하는 단계를 포함하는, 공정.
  13. 제12항에 있어서, 상기 처리 단계는 플라즈마 처리를 포함하는 공정.
  14. 제13항에 있어서, 상기 플라즈마 처리는 대략 5 내지 10초 동안 대기압 플라즈마 제트 스트림에 노출시키는 것을 포함하는 공정.
  15. 제12항에 있어서, 상기 압전 물질은 랑가나이트 결정체, 납 마그네슘 니오베이트, 납 티탄산염, 납 지르콘산 니오베이트, 납 티탄산염, 리튬 니오베이트, 도펀트가 있는 리튬 니오베이트, 리튬 테트라보레이트, 리튬 탄탈라이트, 석영, 티탄산 바륨, 베르리나이트, 오르토인산 갈륨, 포타슘 니오베이트, 바륨 지르코니티탄산염, 란탄 칼슘 옥소보레이트 랑가사이트 결정체, 란타늄 갈륨 실리케이트, 세라믹 페로브스카이트 구조체, 비스무트 페라이트, 납 지르콘산 티탄산염, 카드뮴 설파이드, 산화 아연, 갈륨 비소, 비스무트 및 게르마늄 산화물, 질화 알루미늄, 및 폴리비닐리덴 플루오라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 공정.
  16. 제12항에 있어서, 상기 압전 물질은 리튬 니오베이트인 공정.
  17. 제12항에 있어서, 상기 도포 단계는 표면 위에 얇고 균일한 액체 필름을 형성하기 위하여 상기 표면층 위로 상기 앵커 물질을 분무하거나 접촉 전달하는 단계를 포함하는 공정.
  18. 제17항에 있어서, 상기 얇고 균일한 액체 필름은 마이크로도트인 공정.
  19. 제12항에 있어서, 상기 앵커 물질은 아비딘이고, 바람직하게는 아비딘, 뉴트라비딘, 또는 스트렙트아비딘인 공정.
  20. 제17항에 있어서, 상기 도포 단계는 상기 앵커층을 건조시키는 단계를 더 포함하는 공정.
  21. 제12항에 있어서, 결합된 앵커 물질로 이루어진 층을, 포획 시약을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 상기 포획 시약은 생물학적 유체 내의 분석물질을 특이적으로 인식하는 성질을 가지고 있고, 상기 포획 시약이 상기 앵커 물질의 특이적인 결합 파트너를 통해 상기 앵커 물질에 결합하게 하는 공정.
  22. 압전 물질의 표면을, 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루는 포획 시약에 대하여 결합 특성을 나타내는 앵커 물질을 포함하는 바이오 필름으로 코팅하는 공정으로, 상기 공정은
    a. 압전 물질의 상기 결정체 표면에 규산염, 지르콘산염 또는 티탄산염의 용액을 도포하고, 산과 반응시켜 각각 실리카, 지르코니아 또는 티타니아로 이루어진 중간층을 형성하는 단계;
    b. 상기 중간층에 상기 앵커 물질로 이루어진 층을 도포하여 상기 결정체 표면 상에 앵커층을 형성하는 단계를 포함하는 공정.
  23. a. 압전 결정체의 표면에 직접적으로 결합된 앵커 물질로 이루어진 층을 포함하는 압전 결정체로서, 상기 층 내의 상기 앵커 물질은 포획 시약에도 결합되고, 상기 포획 시약은 상기 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 상기 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루며, 생물학적 유체 내에 존재하는 분석물질을 특이적으로 인식하는, 압전 결정체;
    b. 음향파 발생기로서, 상기 발생기는 파동을 발생시키되, 상기 포획 시약과 분석물질과의 반응이 음향파의 특성에 검출 가능한 변화를 유발하는, 음향파 발생기를 포함하는 음향파 바이오센서.
  24. 제23항에 있어서, 상기 결정체는 리튬 니오베이트인 바이오센서.
  25. 제23항에 있어서, 상기 앵커층은 단일층인 바이오센서.
  26. 제23항에 있어서, 상기 포획 시약은 전세포, 박테리아, 진핵 세포, 종양 세포, 바이러스, 진균류, 기생충, 및 포자류, 및 임의의 전술한 것들의 단편, 단백질, 핵산 및 독소로 이루어지는 군으로부터 선택된 분석물질을 특이적으로 인식하는 바이오센서.
  27. 제23항에 있어서, 상기 포획 시약은 클라미디아 트라코마티스에 대해 특이적인 바이오센서.
  28. 제23항에 있어서, 상기 포획 시약은 뎅기 바이러스에 대해 특이적인 바이오센서.
  29. 제23항에 있어서, 상기 음향파는 BAW인 바이오센서.
  30. 제23항에 있어서, 생물학적 유체 시료를 수용하기 위한 챔버를 더 포함하는 바이오센서.
  31. 제23항에 있어서, 상기 바이오 코팅된 압전 결정체 위에 복수의 채널을 포함하며, 이때, 각각의 채널은 상이한 포획 시약층을 포함하거나, 포획 시약을 포함하지 않는 대조군 채널이며, 상기 채널들은 동시에 수행되는 복수의 분석을 허용하는 바이오센서.
  32. 생물학적 유체 시료 내의 분석물질의 존재 여부 또는 양을 결정하는 방법으로, 상기 방법은
    제1항의 구성요소를, 포획 시약을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 상기 포획 시약은 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 포함하거나 앵커 물질에 대한 특이적인 결합 파트너를 이루며, 또한, 분석물질을 특이적으로 인식하는 것인, 접촉 단계;
    상기 포획 시약이 상기 앵커 물질에 대하여 결합하도록 하여, 포획 시약층을 형성하는 단계;
    상기 결합된 포획 시약층을 생물학적 유체 시료와 접촉시키고; 상기 압전 표면에 걸친 음향파를 발생시키고; 상기 포획 시약층에 대한 분석물질의 결합 결과, 웨어(ware)의 진폭, 위상 또는 주파수의 임의의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
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