KR20140095118A - Nanocomposite scaffolds having 3D porous structure for bone reconstruction - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 3차원 공극 구조를 포함하는 골 재생용 나노합성 스캐폴드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하이드록시아파타이트, 폴리카프로락톤 및 이온 개질된 탄소나노튜브를 포함하며 로보 디스펜싱법에 의해 제조된 나노합성 스캐폴드에 관한 것이다.
The present invention relates to a nanocomposite scaffold for bone regeneration comprising a three-dimensional pore structure, and more particularly to a nanocomposite scaffold for bone regeneration comprising a hydroxyapatite, polycaprolactone, and ion-modified carbon nanotubes, Nano composite scaffold.
조직공학(Tissue Engineering)이란 생명과학, 의학, 공학의 기본개념과 기술을 바탕으로 생체조직, 예컨대 뼈, 연골, 혈관, 방광, 피부 등의 대용품을 만들어 이식함으로써 생체 기능의 유지, 향상, 복원을 가능하게 하는 분야를 말한다. 지난 40여년동안 인공장기 물질의 제조, 이식, 외과적 재건술 분야에서는 기관 또는 조직의 상실 또는 기능부전을 치료하기 위하여 인공보철을 이용하는 것에 대하여 관심이 증가하였다. 자가이식 및 동종이식이 골전도 및 골유도 증식 인자를 제공하는 골이식 절차에서 가장 바람직하다고 판단되나, 공여 부위, 추가 수술(additional surgery), 질병 전염 및 비용 측면에서의 한계로 인해, 자가이식 및 동종이식에 대한 대체재의 개발 필요성이 대두되었다. Tissue Engineering is a system that is based on the basic concepts and technologies of life sciences, medicine, and engineering to create, maintain, improve, and restore vital functions by implanting and implanting biologic tissues such as bone, cartilage, blood vessels, bladder, It is the field that makes it possible. In the past 40 years, there has been increased interest in the use of artificial prosthesis to treat loss or dysfunction of organs or tissues in the manufacture, transplantation and surgical reconstruction of artificial organisms. Although autograft and allograft are considered to be most desirable in bone grafting procedures that provide bone conduction and osteoinductive growth factors, owing to donor sites, additional surgery, disease transmission, and cost limitations, The need for the development of alternative agents for allografts emerged.
일반적으로, 하이드록시아파타이트는 뼈나 치아를 이루는 무기성분, 즉 칼슘과 인으로 이루어진 무기성분의 화합물이다. 또한 인체에 존재하는 전 칼슘의 99%와 약 85%의 인이 경조직에 존재한다고 알려져 있다. 따라서 크기, 결정도, 형태에 있어서 생체 무기성분과 동일한 조성인 하이드록시아파타이트는 뼈 충진제나 뼈 이식제 등의 생체 경조직 대체 재료로서 그 특성에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다.Generally, hydroxyapatite is a compound of an inorganic component consisting of an inorganic component constituting a bone or a tooth, that is, calcium and phosphorus. It is also known that 99% and 85% of the total calcium present in the human body is present in the hard tissue. Therefore, hydroxyapatite, which is the same composition as the bio-inorganic component in size, crystallinity, and shape, has been extensively studied as a biocompatible substitute material such as bone filler and bone graft substitute.
한편, 하이드록시아파타이트는 인체와의 생체적합성, 생체활성, 골전도의 특성이 우수하며, 하이드록시아파타이트를 생체에 이식한 결과 뼈와 직접 결합한다는 사실이 보고된 바 있고, 현재 임상 실험에 응용되고 있다. 또한, 하이드록시아파타이트는 형광재료, 감습재료, 효소담체, 칼슘 강화제 등에 응용되고 있으며, 정형외과 혹은 치과용 임플란트(implant)의 표면특성을 향상시켜 뼈 생성을 개선하기 위한 코팅물질로도 널리 이용되고 있다. 특히, 생체모방용 뼈 물질로 제조된 하이드록시아파타이트는 주로 생체 활성 및 합성된 하이드록시아파타이트의 뼈 형성 능력을 결정하기 때문에 특별한 중요성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 골 이식재료 및 약물 전달물질용 하이드록시아파타이트를 제조하기 위해 활발한 연구가 이루어지고 있으며, 나노구(nanospheres), 나노캡슐(nanocapsules), 나노섬유(nanofibers) 및 나노튜브(nanotubes)와 같은 특정 형태로 개발하는 연구가 진행되고 있다.On the other hand, hydroxyapatite has excellent biocompatibility with human body, bioactivity and bone conduction characteristics, and it has been reported that hydroxyapatite is directly bound to bone as a result of transplantation into living body, have. In addition, hydroxyapatite is widely used as a coating material for improving bone properties by improving the surface characteristics of an orthopedic or dental implant, which is applied to a fluorescent material, a humidifying material, an enzyme carrier, a calcium enhancer and the like have. In particular, hydroxyapatite made from biomimetic bone material is known to have particular importance because it determines bone formation ability of bioactivity and synthesized hydroxyapatite. Therefore, active research has been conducted to produce hydroxyapatite for bone graft materials and drug delivery materials, and it has been studied to prepare hydroxyapatite for bone graft materials and drug delivery materials, such as nanospheres, nanocapsules, nanofibers and nanotubes. Research is under way.
또한, 탄소나노튜브는 생체적합성 및 생체 내분해성이고 생체분자에 의해 작용화될 수 있어서 조직공학 스캐폴드 재료로 연구되고 있다. 대한민국 특허출원 제10-2007-27248호 “탄소나노튜브 복합체 조성물, 탄소나노튜브 전도성 박막, 및 이들의 제조방법”에서는 단일 가닥 DNA가 결합된 탄소나노튜브(Carbon NanoTube: CNT)들이, 서로 다른 CNT에 결합된 단일 가닥 DNA가 금속 이온을 매개로 한 DNA-DNA 클릭 화학결합을 이룸으로써 매질 중에 분산된 CNT 복합체조성물에 대하여 개시하고 있다.In addition, carbon nanotubes are biocompatible and biodegradable and can be functionalized by biomolecules, and are being studied as tissue engineering scaffold materials. In Korean Patent Application No. 10-2007-27248 entitled " Carbon Nanotube Composite Composition, Carbon Nanotube Conductive Thin Film, and Method for Producing the Same ", carbon nanotubes (CNTs) Discloses a CNT composite composition dispersed in a medium by making a DNA-DNA click chemical bond mediated by a metal ion.
그러나, 탄소나노튜브의 골조직 성장, 콜라겐 형성 및 생체적합성에 대한 우수한 기계적 특성에도 불구하고, 탄소나노튜브는 유기 또는 무기 용매에 균일하게 분산되기 어렵다는 문제가 있어 종래에는 조직공학에 사용되지 못하는 문제가 있었다. However, carbon nanotubes are difficult to uniformly disperse in organic or inorganic solvents, despite their excellent mechanical properties for bone tissue growth, collagen formation, and biocompatibility of carbon nanotubes, there was.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 하이드록시아파타이트 및 폴리카프로락톤과 이온 개질된 탄소나노튜브를 조합하여 로보 디스펜싱법에 의해 분산시킴으로써 균질하면서도 3차원 공극 구조를 가지는 스캐폴드를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Under such circumstances, the present inventors confirmed that a scaffold having a homogeneous but three-dimensional pore structure can be produced by dispersing hydroxyapatite, polycaprolactone and ion-modified carbon nanotubes by a robo dispensing method Thus completing the present invention.
본 발명은 폴리카프로락톤, 하이드록시아파타이트 및 이온 개질된 탄소나노튜브를 포함하는 골 재생용 스캐폴드를 제공하고자 한다.
The present invention provides a scaffold for bone regeneration comprising polycaprolactone, hydroxyapatite and ion-modified carbon nanotubes.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 폴리카프로락톤, 하이드록시아파타이트 및 이온 개질된 탄소나노튜브로 이루어지는 골 재생용 스캐폴드를 제공한다.
In order to solve the above problems, the present invention provides a scaffold for bone regeneration comprising polycaprolactone, hydroxyapatite, and ion-modified carbon nanotubes.
본 발명에서 사용되는 하이드록시아파타이트는 Ca10(PO4)6(OH)2 구조를 가지며, Ca/P 몰비가 1.67로 인체뼈와 유사하다. 이와 같이 화학적, 결정학적으로 뼈나 치아 내의 무기 조직과 유사한 특성을 가진 하이드록시아파타이트로 나노 섬유막을 코팅하여 이식 주위의 뼈나 조직과의 접착력 및 안정성을 우수하게 한다.
The hydroxyapatite used in the present invention has a Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 structure and a Ca / P molar ratio of 1.67, which is similar to human bone. Thus, the nanofibers are chemically and crystallographically coated with hydroxyapatite having properties similar to those of inorganic tissues in bones and teeth, thereby enhancing adhesion and stability with bone or tissue around the implant.
본 발명에서 사용되는 “CNT”는 탄소나노튜브를 의미하는 것으로, 하나의 탄소원자가 3개의 다른 탄소원자와 sp2 결합을 이루고, 육각형 벌집무늬 구조를 갖고 있으며, 직경이 수 나노미터에서 수십 마이크로미터인 물질을 의미한다. 본 발명에서는 CNT를 생분해성 고분자에 첨가하여 CNT의 우수한 기계적 특성을 생분해성 고분자에 부가하여 인장 강도를 향상시킬 수 있다. 또한 CNT를 그대로 사용하는 경우에는 응집현상이 크고 표면의 소수성이 커서 고분자 매트릭스에 균일하게 분산하기 어렵고, CNT와 고분자 사이의 계면 상호작용이 약해 고분자/CNT 복합체의 응용이 제한적인 바, 본 발명에서는 이를 개질하여 사용하였다. As used herein, the term " CNT " means a carbon nanotube. One carbon atom forms an sp 2 bond with three other carbon atoms, has a hexagonal honeycomb structure, and has a diameter of several nanometers to tens of micrometers ≪ / RTI > In the present invention, CNTs can be added to biodegradable polymers to improve the tensile strength of CNTs by adding excellent mechanical properties to biodegradable polymers. In addition, when CNT is used as it is, the coagulation phenomenon is large and the hydrophobicity of the surface is large, so that it is difficult to uniformly disperse in the polymer matrix and the interfacial interaction between the CNT and the polymer is weak and application of the polymer / CNT complex is limited. This was modified and used.
본 발명에서 사용할 수 있는 탄소나노튜브는 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브 또는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있다.
The carbon nanotubes usable in the present invention may be single-walled carbon nanotubes, double-walled carbon nanotubes, or multi-walled carbon nanotubes, and preferably multi-walled carbon nanotubes.
본 발명에서 사용되는 “이온 개질된 탄소나노튜브(imCNT)”는 순수 CNT를 알킬화하여 알킬화된 탄소나노튜브가 양전하로 하전된 것에 음이온이 결합된 것이다. 구체적으로는 CNT 몸체는 비편재화된 양전하로 하전되어 상대 음이온[Y]- 과 이온 결합방식으로 결합되어 제조된다. The term " ion-modified carbon nanotube (imCNT) " used in the present invention refers to an anion bonded to a positively charged alkylated carbon nanotube by alkylation of pure CNT. Specifically, the CNT body is charged with a delocalized positive charge, and is manufactured by ionically bonding with a counter anion [Y] - .
본 발명의 일 실시예에 의하면 스캐폴드의 기계적 특성상에 imCNT가 긍정적인 영향을 미침을 알 수 있다. 특히 뚜렷한 효과는 벌크 샘플보다는 스캐폴드 상에서 나타나며, 벌크 상태와 비교할 때, 스캐폴드는 압축 실험을 행하는 동안 3차원 구조 때문에 인장 응력을 받으며, imCNT는 인장 응력을 견디는 중요한 역할을 한다.According to one embodiment of the present invention, imCNT has a positive influence on the mechanical characteristics of the scaffold. Particularly pronounced effects appear on the scaffold rather than in the bulk sample. Compared to the bulk state, the scaffold undergoes tensile stress due to the three-dimensional structure during the compression test, and imCNT plays an important role in enduring tensile stress.
또한, 이온 개질 덕분에 imCNT는 테트라히드로푸란, 클로로폼, 다이클로로메테인과 같은 유기 용매에 효과적으로 용해될 수 있다. 즉, imCNT는 PCL을 포함하는 혼합 용액에 균일하게 분산될 수 있다. 이는 turbidity test를 통해 확인하였으며, THF용액 내에 분산된 imCNT는 안정한 상태이며 안정한 용액 상태는 몇 달이 지난후에도 유지됨을 확인하였다.
Also, thanks to ion modification, imCNT can be effectively dissolved in organic solvents such as tetrahydrofuran, chloroform, and dichloromethane. That is, imCNT can be uniformly dispersed in a mixed solution containing PCL. This was confirmed by turbidity test, and imCNT dispersed in THF solution was stable and stable solution state was maintained after several months.
상기 음이온은 Cl-인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일례에 따른 탄소나노튜브는 양전하로 대전된 측벽과 Cl-이온을 포함하며, 상기 Cl-은 다양한 용매에서 다른 음이온과 교환 가능하다.
The anion is preferably Cl - . Accordingly, the carbon nanotube according to an embodiment of the present invention includes positively charged sidewalls and Cl - ions, and the Cl - can be exchanged with other anions in various solvents.
또한, 상기 이온 개질된 탄소나노튜브는 상기 골 재생용 스캐폴드 총 중량의 0.01wt% 에서 5.0wt%, 바람직하게는 0.1~1wt%인 것이 바람직하다.
It is preferable that the ion-modified carbon nanotube is 0.01 wt% to 5.0 wt%, preferably 0.1 wt% to 1 wt% of the total weight of the bone regeneration scaffold.
상기 중량 비율에서 CNT의 함량은 많을수록 강도 향상 측면에서 좋을 수 있으나, 너무 많으면 (1% 이상) 인산칼슘 입자에 균일하게 흡착되지 못할 수 있어 향후 나노복합체 형성 후 오히려 강도가 저하될 수 있다. 또한, 초과량은 덩어리나 응집체를 형성하는 악영향을 미친다.If the content of CNT is too large, the strength of the nanocomposite may be lowered. However, if the content of CNT is too high (1% or more), the CNT may not uniformly adsorb to the calcium phosphate particles. In addition, the excess amount adversely affects the formation of agglomerates or agglomerates.
또한, CNT 함량이 너무 적을 경우 (0.1% 미만) 효과가 미미할 수 있다. Also, if the CNT content is too small (less than 0.1%), the effect may be insignificant.
따라서, 0.2~1wt%가 바람직하며, 특히 0.2wt%의 탄소나노튜브 첨가는 종래에 비해 매우 소량이나 폴리머 매트릭스를 강화시키는 긍정적인 영향을 미치고, 폴리머 매트릭스에서 균일하게 분산되어 복합체를 강화시킨 바 있다.
Therefore, 0.2 to 1 wt% of carbon nanotubes are preferable, and addition of 0.2 wt% of carbon nanotubes has a positive effect of strengthening the polymer matrix, and is uniformly dispersed in the polymer matrix to strengthen the composite .
또한, 상기 골 재생용 스캐폴드는 로보 디스펜싱법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.In addition, it is preferable that the bone regeneration scaffold is produced by a robotic dispensing method.
로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드를 제조하기 위해 로보캐스팅 장치(Ez-ROBO)를 사용하며, PCL, PCL-HA 및 PCL-HA-imCNTs 각각의 용액을 온도조절 시린지에 저장한다. 이후, 상기 용액은 질량 유량의 조절에 따른 힘 제어 플런저의 노즐(지름 520 μm) 을 통해 분산된다.
A robocasting device (Ez-ROBO) is used to produce scaffolds by RoboDispensing, and the solutions of PCL, PCL-HA and PCL-HA-imCNTs are stored in a temperature controlled syringe. Thereafter, the solution is dispersed through a nozzle (diameter 520 [mu] m) of the force control plunger according to the adjustment of the mass flow rate.
본 발명의 일례에 따르면, 용매에 균일하게 분산된 3차원 공극 구조의 스캐폴드를 제조함에 따라 아파타이트-형성 능력 및 세포 증식 효과가 향상되어 골 재생이 효과적으로 일어나는 스캐폴드를 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, a scaffold having a three-dimensional pore structure uniformly dispersed in a solvent can be prepared, thereby providing a scaffold in which the apatite-forming ability and the cell proliferation effect are improved and the bone regeneration is effectively performed.
또한, 탄소나노튜브의 첨가에 따라 기계적 성질(항복 강도 및 탄성 계수 등)이 향상된 스캐폴드의 제공이 가능하다.
In addition, it is possible to provide scaffolds with improved mechanical properties (such as yield strength and elastic modulus) upon addition of carbon nanotubes.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 다중벽 탄소나노튜브의 용액 안정성 및 TEM 이미지이다.
도 2의 (a)는 3차원 매크로 채널 공극 스캐폴드를 형성하기 위한 로보 디스펜싱법의 개략도이며, (b)는 상이한 복합물(PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT))로 제조된 스캐폴드의 광학 이미지이다.
도 3은 스캐폴드 모폴로지를 상이한 배율로 관측한 SEM 이미지이다((a,d,g)는 PCL, (b,e,h)는 PCL-HA, (c,f,i)는 PCL-HA-imCNT).
도 4는 PCL-HA-imCNT 나노합성 스캐폴드의 고해상도 SEM 이미지이며, PCL 매트릭스에서 HA는 화살표 헤드, CNTs는 화살표로 나타냈다((a)×5000, (b)×100,000)
도 5는 (a) XRD 패턴이며, (b) 상이한 스캐폴드의 라만 스펙트럼이다.
도 6(a)는 스캐폴드 샘플의 압축 실험에서 응력-변형률 곡선, (b)는 항복점에서의 압축 항복 강도, (c)는 초기 기울기로부터 계산된 탄성계수이다. (d)는 원통형(5mm 지름 × 10mm 높이) 벌크 샘플의 압축 항복 강도 및 (e)탄성계수를 나타낸 것이다.
도 7은 SBF 침지 테스트를 진행하는 동안 1,3,7, 14일에 관측된 스캐폴드 모폴로지의 SEM 이미지이다((a) PCL, (b) PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT).
도 8은 1.5 SBF 테스트 동안 스캐폴드의 중량 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT 스캐폴드 상의 세포증식을 분석한 것이다.
도 10은 4주 동안 실험용 쥐의 생체 피하 조직에 이식된 스캐폴드의 생체 적합성을 나타낸 것이다((a) PCL, (b)PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT 스캐폴드). FIG. 1 is a TEM image and a solution stability of a multi-walled carbon nanotube according to an embodiment of the present invention.
Fig. 2 (a) is a schematic view of a robotic dispensing method for forming a three-dimensional macro channel void scaffold, and Fig. 2 (b) is a schematic view of a scaffold made of different complexes (PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT) It is an optical image of a fold.
(A, d, g) are PCL-HA, (c, f, i) are PCL-HA- imCNT).
FIG. 4 is a high-resolution SEM image of a PCL-HA-imCNT nanocomposite scaffold. HA in the PCL matrix is represented by an arrow head and CNTs by an arrow ((a) × 5000, (b) × 100,000)
Figure 5 is (a) an XRD pattern and (b) a Raman spectrum of a different scaffold.
Fig. 6 (a) is the stress-strain curve in the compression test of the scaffold sample, (b) is the compressive yield strength at the yield point, and (c) is the elastic modulus calculated from the initial slope. (d) shows the compression yield strength of a cylindrical (5 mm diameter x 10 mm height) bulk sample and (e) modulus of elasticity.
Fig. 7 is a SEM image of the scaffold morphology observed at 1, 3, 7 and 14 days during the SBF immersion test ((a) PCL, (b) PCL-HA and (c) PCL-HA-imCNT) .
Figure 8 shows the change in weight of the scaffold during a 1.5 SBF test.
Figure 9 is an analysis of cell proliferation on PCL, PCL-HA, and PCL-HA-imCNT scaffolds.
Fig. 10 shows the biocompatibility of the scaffold implanted in the subcutaneous tissues of experimental rats for 4 weeks ((a) PCL, (b) PCL-HA, and (c) PCL-HA-imCNT scaffold).
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1 : 재료 및 방법 1: Materials and Methods
이온 ion 개질된Reformed 탄소나노튜브( Carbon nanotubes ( imCNTsimCNTs )의 제조)
아르곤 분위기에서 CNT(pCNTs; 다중벽; ILJIN Nanotech, Korea)를 [bmin][Sb2F11] ([bmim] = 1-butyl-3-methylimidazolium)을 포함하는 다이클로로메테인(DCM)과 혼합하였다. 이렇게 제조된 혼합물에 테트라히드로푸란(THF)을 첨가한 후, 물에서 급냉시켰다. 여과시킨 후에는 아세톤 및 DCM으로 세척하고 진공에서 건조시켜, 공기 중에 안정한 흑색 파우더 CNT-SbF6를 제조하였다. CNT-SbF6 및 NaCl을 물-메탄올에 첨가한 후에 초음파 처리하고 물, 아세톤 및 DCM에 여과시킴으로써 Cl이 결합된 탄소나노튜브(CNT-Cl)를 제조하였다.
(DCM) containing [bmin] [Sb 2 F 11 ] ([bmim] = 1-butyl-3-methylimidazolium) with CNTs ( p CNTs; multiple walls; ILJIN Nanotech, . Tetrahydrofuran (THF) was added to the mixture thus prepared and then quenched in water. After filtration, it was washed with acetone and DCM and dried in vacuo to prepare a stable black powder CNT-SbF 6 in air. CNT-SbF 6 And NaCl were added to water-methanol, sonicated, and filtered with water, acetone and DCM to prepare Cl-bonded carbon nanotubes (CNT-Cl).
FLASH EA 1112에 의한 분석에 따르면, imCNT는 C가 90.8%, H가 0.33%, N이 0.1%의 원자퍼센트를 가지는 반면, pCNT는 C가 93.8%, H가 0.14%, N이 0.1%의 원자퍼센트를 가짐을 확인하였다.
According to analysis by FLASH EA 1112, imCNT has 90.8% of C, 0.33% of H and 0.1% of atomic percent of N, while p CNT has 93.8% of C, 0.14% of H and 0.1% of N Atomic percent.
또한, Cl-의 존재 여부는 말디토프 질량분석기(MALDI TOF-MS, Voyager-DE STR)에 의해 확인하였으며, 동위원소 m/e 피크는 34.97이 100%, 36.97이 32%임을 확인하였다.
The presence of Cl - was confirmed by a mass spectrometer (MALDI TOF-MS, Voyager-DE STR). The isotope m / e peak was 34.97 100% and 36.97 32%.
도 1은 이온 개질된 탄소나노튜브의 TEM 이미지이다. 이미지에 따르면 ~15nm의 지름을 가지며, ~5nm 쉘 두께를 가지는 중공의 튜브형 이온 개질된 탄소나노튜브임을 확인하였다.
1 is a TEM image of ion-modified carbon nanotubes. According to the image, it was confirmed that the carbon nanotube was a hollow tubular ion-modified carbon nanotube having a diameter of ~ 15 nm and a shell thickness of ~ 5 nm.
imCNTsimCNTs 를 포함하는 Containing PCLPCL -- HAHA 나노합성체의 준비 Preparation of nanocomposite
HA 나노파우더(Alfa Aesar)는 1시간 동안 900℃에서 하소되며, 그 결과 표면적이 10.2 m2 g-1이었다. 상기 표면적은 표면적 분석기(Quadrasorb SI-Kr/MP, Quantachrome)에 의해 측정하였다.The HA nanopowder (Alfa Aesar) was calcined at 900 ° C for 1 hour, resulting in a surface area of 10.2 m 2 g -1 . The surface area was measured by a surface area analyzer (Quadrasorb SI-Kr / MP, Quantachrome).
HA 나노파우더는 5분 동안 초음파 반응기(Model number LH 700S, UL SSO Hitech)의 초음파 진동하에 40 %(w/v)의 농도로 아세톤에 분산하였다.The HA nanopowder was dispersed in acetone at a concentration of 40% (w / v) under ultrasonic vibration of an ultrasonic reactor (model number LH 700S, UL SSO Hitech) for 5 minutes.
PCL-HA-imCNTs 나노합성체를 형성하기 위해, THF 용매에 가해지는 5분의 초음파 진동을 통해 imCNT를 용해시켰으며, 이에 따라 균일한 imCNTs 용액을 얻었다. THF 내 imCNTs의 안정성은 Turbiscan Lab(Leanontech, Korea)을 사용하여 분산광을 모니터링함으로써 확인하였다. In order to form a PCL-HA-imCNTs nanocomposite, imCNT was dissolved by ultrasonic vibration for 5 minutes applied to a THF solvent to obtain a uniform imCNTs solution. The stability of imCNTs in THF was confirmed by monitoring dispersed light using a Turbiscan Lab (Leanontech, Korea).
50℃에서 imCNT 용액에 PCL-HA용액을 교반하면서 첨가하였다. imCNT의 농도는 PCL-HA에 대해 0.2%로 고정하였으며, 상기 농도에서 가장 높은 인장 강도를 나타냈다.
The PCL-HA solution was added to the imCNT solution at 50 占 폚 with stirring. The concentration of imCNT was fixed to 0.2% with respect to PCL-HA, and the highest tensile strength was exhibited at this concentration.
나노합성체 용액에 대한 For nano composite solutions 로보Robo 디스펜싱법Dispensing method
로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드를 제조하기 위해 로보캐스팅 장치(Ez-ROBO)를 사용하였다. PCL, PCL-HA 및 PCL-HA-imCNTs 각각의 용액을 온도조절 시린지에 저장한 후, 상기 용액은 질량 유량의 조절에 따른 힘 제어 플런저의 노즐(지름 520 μm) 을 통해 분산된다. 분산 니들은 에탄올 배스에 살짝 담갔다. A robot casting device (Ez-ROBO) was used to produce scaffolds by the robot dispensing method. After each solution of PCL, PCL-HA and PCL-HA-imCNTs was stored in a temperature-controlled syringe, the solution was dispersed through a nozzle (diameter 520 μm) of a force-controlled plunger with controlled mass flow rate. The disperse needle was soaked in an ethanol bath.
xy면 상에 z축을 따라 각각의 레이어가 적층 구조를 형성함에 따라 공극 구조가 제조되며 z축을 따라 섬유의 적층이 이루어졌다. xy 면의 공극 크기는 500μm X 500μm 이었다. z축의 공극 크기는 섬유질 지름에 의해 결정된다. Each layer along the z axis on the xy plane forms a laminate structure, so that the pore structure is fabricated and the fibers are laminated along the z axis. The pore size on the xy plane was 500 μm × 500 μm. The pore size in the z-axis is determined by the fiber diameter.
스캐폴드는 10mm(너비) X 10mm(길이) X 5mm(높이) 또는 5 mm(너비) X 5mm(길이) X 10mm (높이) 크기일 수 있다. 건조한 후에, 증착된 섬유질의 접착을 위해 스캐폴드를 50℃로 예열하였다. The scaffold may be 10 mm wide x 10 mm long x 5 mm high or 5 mm
PCL 및 HA 용액을 포함하는 균일한 imCNT용액을 로보 디스펜싱(RD)법에 의해 스캐폴드로 더 제조하였다.A uniform imCNT solution containing PCL and HA solutions was further prepared as a scaffold by the RoboDispensing (RD) method.
도 2(a) 에 도시된 바와 같이, 스캐폴드의 3차원 구조는 노즐을 통하여 나노합성체 용액의 분사에 따르며, 적층 구조를 형성하였다. 3개의 상이한 구성을 포함하는 추가 실험/ 3차원 스캐폴드는 도 2(b)에 나타내었다. 생성된 모든 3차원 스캐폴드는 회전 가능한 형상을 가졌다. 특히 imCNT를 포함하는 것은 보다 진한 색을 나타냈다. As shown in FIG. 2 (a), the three-dimensional structure of the scaffold follows the injection of the nanosynthetic solution through the nozzle and forms a laminated structure. A further experimental / three-dimensional scaffold comprising three different configurations is shown in Figure 2 (b). All of the generated 3D scaffolds had a rotatable shape. Especially those containing imCNT, showed a darker color.
3차원 스캐폴드의 공극 구조는 표 1에 정리하였다. 표 1에 따르면, 모든 스캐폴드는 xy 면에 유사한 공극 사이즈 (섬유질간 간격; 220~230μm)를 가지며, z축을 따라(섬유질 지름; 230~240μm) 좁은 편차를 가짐을 확인하였다.
The void structure of the three-dimensional scaffold is summarized in Table 1. According to Table 1, all scaffolds have similar pore sizes (interfiber spacing: 220-230 μm) on the xy plane and narrow variations along the z axis (fibrous diameter; 230-240 μm).
실험예Experimental Example 1 : 나노합성체 1: nano composite 스캐폴드의Scaffold 구조 및 Structure and 모폴로지Morphology 관측 observation
로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 공극 구조 및 모폴로지를 다음과 같이 확인하였다.The pore structure and morphology of the scaffold by Robodispensing method were confirmed as follows.
구체적으로, 스캐폴드에 Au 코팅하여 주사전자현미경(SEM; S-3000H, Hitachi)을 통해 관찰하였다. 특히, 평균 섬유질의 지름 및 상호 연결된 공극의 크기를 관찰하였다. Specifically, the scaffold was coated with Au and observed with a scanning electron microscope (SEM; S-3000H, Hitachi). In particular, the diameter of the average fiber and the size of interconnected pores were observed.
또한, 고해상도 SEM(JSM7000F, JEOL)을 통해 스캐폴드의 나노구조를 관찰하였으며, 개질된 탄소나노튜브는 투과전자현미경(TEM, TECNAI-FE12, Philips)을 통해 관찰하였다.The nanostructure of the scaffold was observed through a high-resolution SEM (JSM7000F, JEOL), and the modified carbon nanotube was observed through a transmission electron microscope (TEM, TECNAI-FE12, Philips).
또한, 표면의 습윤성 변화를 관찰하기 위해 샘플을 박막으로 제조하여, 접촉각 측정기(Phoenix300, SEO)를 통해 대기 조건에서 물 접촉각을 측정하였다. 탈이온수 0.5ml가 박막 표면에 적가되며, 캡쳐된 이미지로부터 전진 접촉각을 측정하였다.
In order to observe the change of the wettability of the surface, the sample was made into a thin film and the contact angle of water was measured at atmospheric conditions through a contact angle meter (Phoenix 300, SEO). 0.5 ml of deionized water was added to the thin film surface, and the advancing contact angle was measured from the captured image.
그 결과 도 3을 참조하면, 관찰된 스캐폴드는 정렬된 매크로채널 공극을 포함함을 알 수 있었다. 확대시키면, PCL 스캐폴드의 표면이 부드러우며, 나노합성체 스캐폴드는 HA 때문에 거친 표면을 나타냄을 확인하였다. 표면 일부가 공극을 포함하는 것처럼 보일지라도, 폴리머 매트릭스는 미립자로 뒤덮히고 밀폐되어 있으며 이러한 공극으로 연결되어 있었다. As a result, referring to FIG. 3, it can be seen that the observed scaffold includes aligned macrochannel voids. When magnified, the surface of the PCL scaffold was smooth, and the nanocomposite scaffold showed a rough surface due to HA. Even though a portion of the surface appears to contain voids, the polymer matrix is covered with particulates and sealed and connected by such voids.
PCL-HA 및 PCL-HA-imCNT 스캐폴드의 표면 모폴로지는 유사하며, imCNT는 매트릭스 상에 낮은 농도가 함유되어 SEM으로 관찰하기 어려움을 확인하였다.
The surface morphology of PCL-HA and PCL-HA-imCNT scaffolds was similar, and imCNT was found to be difficult to observe with SEM because of the low concentration on the matrix.
또한, 나노합성체 매트릭스 내의 imCNT의 정렬 및 존재 여부를 관찰하기 위해, 스캐폴드의 표면을 고해상도 SEM으로 관찰하였다. Also, to observe the alignment and presence of imCNT in the nanosynthetic matrix, the surface of the scaffold was observed with a high resolution SEM.
도 4에 나타낸 바와 같이, HA 나노입자는 PCL 매트릭스 상에 분산되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PCL 매트릭스와 HA 나노입자 접합에서 나노튜브형 구조체를 일부 확인하였다. imCNT의 덩어리나 응결체가 없음을 확인하였으며, 매트릭스 내에서 CNT 분자가 효율적으로 분산되었음을 확인하였다.
As shown in Fig. 4, it was confirmed that the HA nanoparticles were dispersed on the PCL matrix. In addition, a nanotube structure was partially confirmed in the PCL matrix and the HA nanoparticle junction. It was confirmed that there was no lump or condensate of imCNT, and CNT molecules were efficiently dispersed in the matrix.
도 5에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 스캐폴드의 XRD 패턴 및 라만 스펙트럼을 분석하였다. XRD 패턴에서 추가적인 HA 피크를 명백하게 확인하였으나, imCNT의 피크는 나타나지 않았다. 라만 스펙트럼 역시 양 나노합성체 스캐폴드에 대한 HA의 피크가 존재하였으나, imCNT는 나타나지 않았다. 이는 상기 장치들이 감지할 수 있는 최저 농도 이하로 존재하기 때문이다. 즉, SEM 이미지에서 확인한 바와 같이 imCNT가 존재함에도 불구하고, XRD 및 라만은 imCNT첨가에 따라 뚜렷한 화학적 구조 변화나 상변화가 없음을 확인하였다.
The XRD pattern and Raman spectrum of three different scaffolds were analyzed as shown in Fig. An additional HA peak was clearly identified in the XRD pattern, but the peak of imCNT did not appear. Raman spectra also showed HA peaks for both nanocomposite scaffolds, but imCNT did not appear. This is because the devices are below the lowest detectable level. In other words, although the presence of imCNT was confirmed in the SEM image, XRD and Raman showed no significant chemical structure change or phase change according to the addition of imCNT.
박막 상에 형상된 샘플의 접촉각은 대기 조건에서 측정되었으며, 표 2에 정리하였다. 특히 나노합성체 표면을 2N NaOH에 상이한 시간만큼 노출시켰다. NaOH 처리 안한 경우에 초기 접촉각은 어떠한 나노합성체의 효과도 나타나지 않으면서 모든 샘플이 ~70~80도의 접촉각을 나타냈다. 이는 PCL의 표면효과 때문이며, 나노합성체의 얇은 층의 표면은 PCL에 의해 커버되기 때문이다.
The contact angles of the samples formed on the thin films were measured at atmospheric conditions and summarized in Table 2. Specifically, the nanocomposite surface was exposed to 2 N NaOH for different times. When NaOH was not treated, the initial contact angle showed a contact angle of ~ 70 ~ 80 degrees for all samples without any effect of the nanocomposite. This is because of the surface effect of PCL, since the surface of the thin layer of the nanocomposite is covered by PCL.
샘플을 NaOH로 처리한 경우, 접촉각은 현저하게 감소하였다. PCL 샘플의 접촉각을 12시간 처리 이후 측정한 결과 약 60도였다. 또한, 복합체 샘플을 PCL 샘플보다 훨씬 감소한 약 40~45도를 나타내었다. PCL 샘플의 접촉각 감소는 알칼리 처리에 의한 하이드록실기 및 카르복실기때문이며, 친수성 구성요소(HA 또는 HA- imCNT)를 포함하는 나노합성체는 친수성 성질의 증가에 큰 영향을 미치기 때문이다. 나노합성체 사이에 접촉각 차이는 거의 없었다.
When the sample was treated with NaOH, the contact angle was remarkably decreased. The contact angle of the PCL sample was measured after 12 hours treatment and was about 60 degrees. In addition, the composite samples showed about 40-45 degrees, much less than PCL samples. The reduction in the contact angle of the PCL sample is due to the hydroxyl groups and carboxyl groups due to the alkali treatment, and nanosynthesis containing the hydrophilic component (HA or HA-imCNT) has a significant effect on the increase in hydrophilic properties. There was little difference in contact angle between nanocomposites.
실험예Experimental Example 2 : 2 : 스캐폴드의Scaffold 기계적 특성 분석 Mechanical Characterization
로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 기계적 특성을 Instron(model 3344)을 사용하여 다음과 같이 확인하였다.The mechanical properties of the scaffold by RoboDispensing method were confirmed using Instron (model 3344) as follows.
구체적으로, 5mm (너비) X 5mm(길이) X 10mm(높이)를 가지는 샘플에 100N 로드셀, 크로스헤드 속도 1mm min-1을 사용하여 압축 하중을 실험하였다. 로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 샘플은 100℃ 몰드 내에 Carver hot pressing apparatus(Model number 38510, USA)을 통해 원통형(5mm 지름 X 10mm 높이)으로 제공될 수 있다. 각 샘플의 응력-변형률 곡선을 기록하였으며, 항복 강도는 상기 곡선으로부터 계산하였다. 또한, 탄성계수는 그래프의 초기 기울기로부터 계산하였으며, 모든 샘플은 각각의 조건에서 실험하였다.
Specifically, a sample having a 5 mm (width)
응력-변형률 곡선은 도 6(a)에 나타내었다. 모든 스캐폴드에 대해 유사한 응력-변형률 패턴이 나타났다. 항복점에 이르기까지 선형 그래프가 계속되며, 기울기가 감소하였다.The stress-strain curve is shown in Fig. 6 (a). Similar stress-strain patterns appeared for all scaffolds. The linear graph continued until the yield point, and the slope decreased.
첫번째 영역은 스캐폴드가 소성 변형이 일어나기 전의 탄성 영역을 나타냈으며, 두번째 영역에서는 응력이 증가함에 따라 압축 변형 역시 증가함을 나타냈다. 두번째 영역은 항복점을 지난 상태이며, 응력이 계속해서 증가하면 소성 변형된 스캐폴드의 공극 막힘 현상이 일어난다. 따라서, 스캐폴드가 하중을 견디고 있는 것처럼 보이더라도 지지 용량을 나타내는 것이 아니며, 스캐폴드의 붕괴 또는 파괴를 의미한다.
The first region showed the elastic region before the plastic deformation occurred in the scaffold, and the compressive deformation also increased with the increasing stress in the second region. The second area is past the yield point, and if the stress continues to increase, there will be pore clogging of the plastic deformed scaffold. Thus, even if the scaffold appears to be holding the load, it does not indicate the support capacity, which means collapse or destruction of the scaffold.
항복 강도는 도 6(b)를 통해 알 수 있다. PCL 또는 PCL-HA 나노합성체 스캐폴드의 강도와 비교하면, PCL-HA- imCNT 나노합성체 스캐폴드의 항복 강도는 현저하게 향상됐음을 알 수 있었다.
The yield strength is shown in Fig. 6 (b). Compared to the strength of the PCL or PCL-HA nanocomposite scaffold, the yield strength of the PCL-HA-imCNT nanocomposite scaffold was significantly improved.
도 6(c)는 스캐폴드의 탄성계수를 나타낸 것이다. PCL 스캐폴드와 비교하면, 양 나노합성체 스캐폴드는 현저하게 강화된 값(~20MPa vs 40-50 MPa)을 가졌다. 또한 PCL-HA- imCNT 스캐폴드는 PCL-HA 보다 높은 탄성계수를 나타냈다.
Figure 6 (c) shows the elastic modulus of the scaffold. Compared to the PCL scaffold, the two nanocomposite scaffold had a significantly enhanced value (~ 20 MPa vs. 40-50 MPa). Also, the PCL-HA-imCNT scaffold showed higher modulus of elasticity than PCL-HA.
원통형 벌크 샘플에 대해서도 압축 하중 시험을 실시하였다. A compression load test was also performed on the cylindrical bulk sample.
항복 강도 및 탄성 계수는 도 6(d.e)에 각각 나타내었다. 도 6(d,e)에 따르면, imCNT를 첨가함에 따라 현저한 강도의 향상이 있음을 알 수 있었다. 탄성 계수 또한 HA 또는 HA- imCNT의 결합에 따라 현저하게 향상되었다.
The yield strength and elastic modulus are shown in Figure 6 (de), respectively. According to Fig. 6 (d, e), it was found that the addition of imCNT significantly improved the strength. The elastic modulus was also significantly improved with binding of HA or HA-imCNT.
실험예Experimental Example 3 : 3: 스캐폴드의Scaffold 유사 체액 내 무기질 형성 분석 Analysis of mineral formation in simulated fluid
스캐폴드의 체내 무기질 형성 여부를 다음과 같이 확인하였다.The formation of minerals in the body of the scaffold was confirmed as follows.
구체적으로, 스캐폴드의 체내 아파타이트 무기질 형성을 위한 침전 반응을 빠르게 하기위해 유사 체액(1.5배 SBF; 1.5SBF) 내에 스캐폴드를 함침시켰다. 1.5SBF는 Na+ 213.0 Mm, K+ 7.5mM, Mg2 + 2.25mM, Ca2 + 3.75mM, Cl- 221.7 mM, HCO3 - 6.3Mm, HPO4 2 - 1.5Mm, SO4 2 - 0.75mM이며, pH 7.25에서 (CH2OH)3(CNH)2/HCL 완충용액을 사용하였다. Specifically, the scaffold was impregnated in a simulated body fluid (1.5-fold SBF; 1.5SBF) to accelerate the precipitation reaction for the scaffold's body apatite mineral formation. 1.5SBF is Na + 213.0 Mm, K + 7.5mM ,
각각의 샘플(크기 5mm X 5mm X 10mm)은 14일 동안 37℃의 1.5 SBF 용액 10ml에 침지시키어 저장하였다. 침지 후의 샘플은 표면 모폴로지의 변화를 관찰하기 위해 세척하였다. 침지 동안의 중량 변화 역시 측정하였다. 또한, 무기질의 구성요소 및 상(phase)은 SEM에 부착된 EDS 및 XRD를 통해 각각 관찰하였다.
Each sample (
도 7은 SBF-침지 실험을 하는 1,3,7, 및 14일에 스캐폴드의 SEM 모폴로지 변화를 나타낸 것이다. Figure 7 shows the SEM morphology change of the scaffold at 1, 3, 7, and 14 days after the SBF-immersion experiment.
도 7(a)에 따르면 14일이 될 때까지 PCL 스캐폴드 표면의 변화는 거의 없었다. According to Fig. 7 (a), there was almost no change in the PCL scaffold surface until 14 days.
반면, 초기의 PCL-HA 표면은 함침 시간에 따라 변화하였다. 3일째에는 변화가 조금 생겼으며, 7일째에는 표면 일부 상에 침전된 무기물을 관측할 수 있었다. 또한, 14일에는 상당량의 무기물이 관측되었다(도 7(b)). On the other hand, the initial PCL-HA surface changed with the impregnation time. On the third day, a little change occurred, and on the seventh day, the inorganic matter precipitated on a part of the surface could be observed. On the 14th day, a considerable amount of inorganic matter was observed (Fig. 7 (b)).
또한, 무기물화 작용은 PCL-HA-imCNT 에서도 관측되었다(도 7(c)).
The mineralization was also observed in PCL-HA-imCNT (Fig. 7 (c)).
도 8에는 침지 실험동안의 스캐폴드 중량 변화를 나타내었다. Figure 8 shows the change in scaffold weight during the immersion experiment.
PCL-HA와 PCL-HA-imCNT 스캐폴드의 중량은 3일째까지 유사하게 소량 증가하였으며, 이후 14일까지는 빠르게 증가하였다. 최종적으로 14일째에는 ~6-7%가 증가함을 확인하였다. The weight of PCL-HA and PCL-HA-imCNT scaffolds similarly increased slightly until
다만, PCL 스캐폴드에서는 1% 미만의 중량 변화가 발생하였음을 확인하였다. However, it was confirmed that a weight change of less than 1% occurred in the PCL scaffold.
따라서, PCL 스캐폴드에 비해 PCL-HA-imCNT의 무기질 형성이 뛰어나다는 것을 확인하였다.
Therefore, it was confirmed that PCL-HA-imCNT is superior in mineral formation to PCL scaffold.
실험예Experimental Example 4 : 4 : 스캐폴드의Scaffold 생체 외 세포 배양 In vitro cell culture
세포 독성 및 생장에 대한 스캐폴드의 세포 및 조직 반응을 다음과 같이 확인하였다. Cell and tissue responses of the scaffold to cytotoxicity and growth were determined as follows.
구체적으로, 전골모세포 라인(MC3T3-EA, ATCC)를 사용하였다. 세포는 소태아혈청이 추가되며 α-개질된 최소 필수 배지인 배양기에 저장하였고, 상기 배양기는 37℃, CO2 5%의 대기 하의 항생/항진균성 용액 1%를 포함하였다. Specifically, the osteoblast line (MC3T3-EA, ATCC) was used. The cells were stored in an incubator with the addition of fetal bovine serum and α-modified minimal essential medium, and the incubator contained 1% antibiotic / antifungal solution at 37 ° C and 5% CO 2 atmosphere.
상이한 구성(PCL, PCL-HA 또는 PCL-HA-imCNT)을 가지는 RD 스캐폴드는 10mm X 10mm X 5 mm로 준비하였다. 실험 전에 샘플은 70% 에탄올에서 10분 동안 살균되며 층류에서 밤새 건조시켰다. RD scaffolds with different configurations (PCL, PCL-HA or PCL-HA-imCNT) were prepared with 10 mm x 10 mm x 5 mm. Prior to the experiment, samples were sterilized in 70% ethanol for 10 minutes and dried overnight in laminar flow.
MC3T-3E1 세포는 24 웰 플레이트의 각 웰에 포함된 스캐폴드 상에 배양하였다. 스캐폴드 상에 세포가 초기에 흡착하는 것을 돕기 위해, 세포의 50μL 분취액을 6시간동안 각각의 스캐폴드에 침지시키며, 이후 150μL의 배양액을 첨가하였다. 그리고 나서, 샘플은 또 다른 분석을 위해 14일 동안 37℃에서 인큐베이터에 저장하였다. MC3T-3E1 cells were cultured on a scaffold contained in each well of a 24 well plate. To help cells initially adsorb on the scaffold, 50 [mu] L aliquots of the cells were soaked in each scaffold for 6 hours, after which 150 [mu] L of culture medium was added. The samples were then stored in an incubator at 37 < 0 > C for 14 days for another analysis.
골세포의 분화를 유도하기 위해서, 10mM의 β-글리세롤 포스페이트 및 50 μg mL-1의 L-아스코르브산을 배양지에 첨가하였다. MTS (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석키트(CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)를 사용하여 미토콘드리아 활성을 평가하였다. 각각의 그룹의 샘플은 모든 세포 테스트에 사용되며, 가정 평균 시사법에 의해 비교하였다.
To induce differentiation of bone cells, 10 mM of? -Glycerol phosphate and 50 μg mL -1 of L-ascorbic acid were added to the culture medium. MTS (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) assay kit (CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) To assess mitochondrial activity. Samples of each group were used for all cell tests and were compared by the home-averaged preview method.
도 9는 14일동안 MTS assay의 배양에 의해 측정된 세포 성장도를 나타내었다. Figure 9 shows cell growth measured by incubation of the MTS assay for 14 days.
배양 기간 동안, 세포 증식은 PCL 스캐폴드에 비해 양 나노합성체 스캐폴드에서 현저하게 높게 나타났다. PCL-HA 복합체는 PCL에 비해 현저하게 향상된 세포 증착 및 성장을 보였다. 친수성이 향상된 HA의 결합에 따라 초기 세포 증착이 용이하며, 세포 증식 또한 용이하기 때문이다.During the incubation period, cell proliferation was significantly higher in both nanocomposite scaffolds than PCL scaffolds. The PCL-HA complex showed significantly improved cell deposition and growth compared to PCL. This is because early cell deposition is facilitated by the binding of HA with improved hydrophilicity and cell proliferation is also easy.
특히, CNT를 포함하는 나노합성체는 세포 성장 속도가 빠르며, 이는 적어도 세포 증식 단계에 있어서 생체 활성적인 PCL-HA 의 세포 반응이 imCNT가 첨가됨에도 보존되었기 때문이다.
In particular, nanocomposites containing CNTs have a fast cell growth rate because at least in the cell proliferation stage, the cellular response of bioactive PCL-HA was preserved even though imCNT was added.
실험예Experimental Example 5 : 실험용 쥐의 피하 조직에 대한 5: Subcutaneous tissue of experimental rats 스캐폴드의Scaffold 생체 적합성 분석 Biocompatibility analysis
스캐폴드의 체내 조직 적합성을 실험용 쥐의 피하 조직을 사용하여 다음과 같이 실험하였다. The body tissue fitness of the scaffold was tested using the subcutaneous tissues of the experimental rats as follows.
구체적으로, 10주된 스프라귀 다우레이(Sprague Dawley) 수컷 쥐를 케타민 80 mg kg-1 및 자일라진 10mg kg-1 을 포함하는 근육주사로 마취시켰다. 쥐의 족배부분을 면도하고, 70%의 에탄올 및 포비돈 요오드로 소독하였다. 피부 절개는 실험용 쥐의 척추로부터 후측면으로 Bard-Parker No. 10 knife 수술가위를 사용하여 비절개 박리하였다. Specifically, 10-week-old Sprague Dawley male rats were anesthetized with intramuscular injection containing ketamine 80 mg kg -1 and
스캐폴드의 이식 전에, 스캐폴드(PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT)는 에틸렌 옥사이드로 소독하였다. 샘플을 절개 부위로부터 준비된 자리에 둔 후, 봉합하였다. 수술 4주 후에 실험용 쥐를 희생시킨 후, 샘플 준비를 위해 이식된 샘플 및 주위 조직을 쥐로부터 채취하였다. Prior to scaffold implantation, scaffolds (PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT) were disinfected with ethylene oxide. The sample was placed in a prepared position from the incision site and then sutured. After 4 weeks of operation, the experimental rats were sacrificed and the implanted samples and surrounding tissues were taken from the rats for sample preparation.
그 다음, 상온의 10% 중성화된 완충 용액에 샘플을 24시간 동안 함침시킨 후, 에탄올 희석액으로 탈수시켰다. 얇은 섹션을 얻기 위해, 스캐폴드를 이등분하여 파라핀에 매립시키고, 4~6 μm 두께로 절단하였으며, 슬라이드를 헤마톡실린-에오신 염색시켰다(도 10(a) PCL, (b) PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT).
The sample was then impregnated with a 10% neutralized buffer solution at room temperature for 24 hours and then dehydrated with an ethanol diluent. To obtain a thin section, the scaffolds were bifurcated and embedded in paraffin, cut to 4-6 μm thickness, and the slides were stained with hematoxylin-eosin (Fig. 10 (a) c) PCL-HA-imCNT).
도 10에서 빈 공간은 스캐폴드이며, 염색된 부분은 매크로 공극 채널의 일부이고 여기서 조직 성장이 일어난다. 스캐폴드의 일부분이 샘플 준비 과정에서 파괴된다 하더라도, 스캐폴드를 둘러싼 채널 내의 세포 및 조직 반응이 명백함은 확인할 수 있었다. In Figure 10, the empty space is the scaffold, the stained portion is part of the macropore channel and tissue growth occurs here. Even if a portion of the scaffold was destroyed during sample preparation, it was confirmed that the cellular and tissue responses in the channel surrounding the scaffold were apparent.
PCL 스캐폴드에서 섬유질 조직의 두꺼운 층은 스캐폴드 줄기 표면에 정렬되어 있다. PCL과 같은 생체폴리머 스캐폴드에서 일반적으로 관찰 가능한 많은 양의 섬유 아세포 및 일부 새로운 혈관이 형성됨을 확인하였다. In the PCL scaffold, a thick layer of fibrous tissue is aligned on the scaffold stem surface. It has been confirmed that a large amount of fibroblasts and some new blood vessels, which are generally observable in biopolymer scaffolds such as PCL, are formed.
PCL-HA 및 PCL-HA-imCNT 스캐폴드에서 스캐폴드 형상은 보다 잘 유지되었다. 또한, 공극 구조도 잘 드러남을 확인하였다. 조직 및 세포 반응은 유사하였다. 공극 채널 내에서 세포 및 조직의 성장이 있었으며, 이는 PCL과 비교하여 스캐폴드 표면을 따라 얇게 형성되었다. 보다 흥미로운 것은, 새로운 혈관 형성이 두드러지며, 혈관 사이즈가 더 크다는 것이었다. 이러한 실질적인 형성은 세포 성장에 대해 체내 환경을 효과적으로 제공함을 나타낸다. The scaffold shape was better maintained in the PCL-HA and PCL-HA-imCNT scaffolds. Also, it was confirmed that the pore structure is well exposed. Tissue and cellular responses were similar. There was growth of cells and tissues in the pore channels, which were thinly formed along the scaffold surface compared to PCL. What is more interesting is that new blood vessel formation is prominent and blood vessel size is larger. This substantial formation indicates that it effectively provides the body environment for cell growth.
PCL-HA 스캐폴드에 대한 imCNT의 첨가는 조직 반응에 악영향을 미치지 않으며, 4주의 실험 동안 뛰어난 조직 적합성을 나타내었다.
The addition of imCNT to the PCL-HA scaffold did not adversely affect the tissue response and showed excellent histocompatibility during the 4 weeks of the experiment.
Claims (6)
A scaffold for bone regeneration comprising polycaprolactone, hydroxyapatite, and ion-modified carbon nanotubes.
The scaffold for bone regeneration according to claim 1, wherein the bone regeneration scaffold is manufactured by a robotic dispensing method.
The scaffold for bone regeneration according to claim 1, wherein the ion is Cl - .
4. The scaffold for bone regeneration according to claim 3, wherein the surface of the carbon nanotube is positively charged.
The scaffold for bone regeneration according to claim 1, wherein the ion-modified carbon nanotube is 0.01 wt% to 5.0 wt% of the total weight of the scaffold for bone regeneration.
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