KR20140078633A - 클로스트리듐 디피실리균 항체 - Google Patents

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Abstract

개체에서 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물과 방법이 제시된다. 조성물은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소에 대한 항체를 포함한다. 상기 방법은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 박테리아 감염으로부터 재발을 감소시키거나 또는 제거하거나 또는 예방하는데 효과적인 양으로 개체에 항체를 투여하는 것을 제시한다.

Description

클로스트리듐 디피실리균 항체{CLOSTRIDIUM DIFFICILE ANTIBODIES}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2011년 8월 22일자 제출된 미국 특허가출원 번호 61/526,031에 우선권을 주장하고, 이의 개시는 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
기술 분야
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 A에 대한 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 척추동물 개체에서 박테리아, 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile)에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물과 방법에 관한 것이다. 감염으로부터 재발을 감소시키거나, 제거하거나 또는 예방하는데 효과적인 양으로 항체를 척추동물 개체에 투여하기 위한 방법이 제시된다. 생물체에서 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제시된다.
클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile)(C. difficile)은 통상의 병원내 병원체이고, 그리고 전세계적으로 입원 환자 사이에서 이환과 사망의 주요 원인이다. Kelly et al., New Eng. J. Med., 330:257-62, 1994. 넓은 스펙트럼 항생제의 증가된 이용 및 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 현저한 독력 균주의 출현은 백신이 이러한 박테리아와 연관된 질환과 사망을 감소시키는데 적합할 수 있다는 생각을 유발하였다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)은 전통적인 항생제 옵션이 거의 없고, 그리고 재발성 질환(사례의 25%을 빈번하게 유발한다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)은 매년 미국에서만 약 20,000명의 목숨을 앗아가고 있고, 그리고 약 500,000건의 확증된 감염을 유발한다. 최근에, 더욱 많은 독소를 생산하는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 더욱 강한 독력 균주, 예를 들면, B1/NAB1/027 균주가 출현하였는데, 이것은 또한, 메트로니다졸에 대한 감소된 감수성을 가진다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 창궐은 수용소 및 부분적인 병원 폐쇄를 수반하였다. 노령 인구가 증가하고 실태적인 인구 통계가 변함에 따라서, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)은 21세기에 주요한 문제점으로 부상하고 있다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 질환의 스펙트럼 범위는 무증상 보균 내지 경미한 설사에서부터 극발성 가막성 대장염까지이다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)은 이형태성 생활주기(dimorphic lifecycle)를 갖는데, 여기서 이것은 감염성의 격렬한 포자 형태 및 대사 활성 독소-생산 영양 세포 둘 모두로서 존재한다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-연관된 질환(CDAD)은 영양 세포, 더욱 구체적으로, 2가지 독소, 장독소 독소 A 및 세포독소 독소 B의 작용에 의해 유발되는 것으로 생각된다.
클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)에 대한 백신과 요법은 현재까지, 독소(A와 B), A와 B의 톡소이드, A와 B의 재조합 단편, 그리고 영양 세포 표면 층 단백질(SLPAs)에 집중되었다.
독소 A는 다중 기능성 도메인을 보유하는 고-분자량 단백질이다. 상기 독소는 4개의 기능성 도메인으로 분해된다: Rho-유사 GTP아제를 변형하여 상피 세포에서 세포골격 조절장애(cytoskeletal dysregulation)를 유발하는 아미노-말단 글루코실트랜스페라아제, 자가촉매적 시스테인 프로테아제 도메인, 소수성 막-스패닝 서열, 그리고 고도 반복성 카복시-말단 숙주-세포 결합 도메인.
카복시 말단 도메인은 독소를 장상피 세포 상에서 숙주 세포 탄수화물 수용체에 고정시키고, 이것은 내재화 과정을 개시시켜 아미노-말단 효소 도메인을 표적 세포의 세포질로 전달한다. 효소 도메인과 글루코실트랜스페라아제 활성의 전달은 중독된 세포의 아폽토시스 세포 사멸로 인하여 설사와 염증을 유발한다.
많은 연구에서, 질환 결과에 영향을 주는데 있어서 상기 독소에 대항하는 항체의 중요성이 밝혀졌다. 또한, 여러 연구에서 혈청 항-독소A 항체 및 CDAD와 재발로부터 보호 사이에 상관관계가 밝혀졌다. 이들 연구 결과는 CDAD에 대한 독소 mAb 요법의 창출로 이어졌다.
이들 진전에도 불구하고, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 연관된 감염의 재발로부터 예방을 비롯하여, CDAD의 효과적인 치료 및/또는 예방이 여전히 요구된다. 본 발명은 독소 A에 대한 생쥐와 인간화 항체를 제시하여 이런 저런 요구를 충족시킨다.
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile)(C. difficile) 독소 A에 결합하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분을 제시한다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 단편 4에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하고, 여기서 중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDRs), CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하고, 그리고 경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함한다.
또한, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 중쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 제시되는데, 여기서 중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함한다.
본 발명은 더 나아가, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 경쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 1 x 10-11 M 이하의 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 인간화 또는 키메라일 수 있다.
한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 영역은 서열 번호: 89에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 경쇄 영역은 서열 번호: 91에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄 영역은 서열 번호: 93에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 경쇄 영역은 서열 번호: 95에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 (a) 완전 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 그리고 (e) 이황화 연결된 Fv로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 a) IgG 불변 도메인; 그리고 (b) IgA 불변 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 12, 28, 44 또는 60에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 4, 20, 36 또는 52에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 각각, 서열 번호: 28과 20에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 동일한 에피토프에 결합한다.
또한, CAN20G2로 명명된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 및 CAN20G2로 명명된 하이브리도마가 본 발명에 포함된다.
본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 생체내 독소 A 공격 실험에서, 포유류가 약 100 ng 이상의 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 노출되기 약 24시간 전에, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 약 8 mg/kg 체중 내지 약 13 mg/kg 체중 범의의 용량에서 포유류에 투여될 때, 포유류에 대한 생존 기회가 약 7일 이내에 약 80% 이상이다.
본 발명은 또한, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 시험관내 중화 검정에서 약 4 μM 내지 약 17 μM 범위의 농도에서, 약 150 ng/ml 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 약 40% 이상을 중화시킨다.
본 발명은 서열 번호: 12, 28, 44, 60, 4, 20, 36 또는 52에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산을 제시한다. 본 발명은 또한, 서열 번호: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75에 진술된 핵산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제시한다. 또한, 이들 핵산 중에서 한 가지를 포함하는 세포가 제시된다. 세포는 박테리아 세포 또는 진핵 세포, 예를 들면, 포유류 세포일 수 있다. 세포의 무제한적 실례에는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, SP2/0, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포가 포함된다.
본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 그리고 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다.
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-연관된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 정맥내, 피하, 근육내 또는 경피 투여될 수 있다. 상기 방법은 두 번째 작용제를 개체에 투여하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 가령, 두 번째 작용제는 상이한 항체 또는 이의 단편이거나, 또는 항생제, 예를 들면, 반코마이신, 메트로니다졸 또는 피닥소마이신일 수 있다.
도 1은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 A에 대한 정제된 뮤린 mAb의 반응성을 보여주는 표준화 ELISA를 도시한다.
도 2는 독소 A(ToxA) 및 독소 A 단편 4(ToxAF4)에 대한 정제된 1 μg/ml CAN19 mAb의 결합 활성을 보여주는 ELISA이다. ToxB는 독소 B이고; ToxBF4는 독소 B 단편 4이다.
도 3은 독소 A 및 독소 A 단편 4에 대한 정제된 1 μg/ml 뮤린 CAN20 mAb의 결합 활성을 보여주는 ELISA 검정이다.
도 4는 정제된 뮤린 CAN19 mAb(0.5 μg/ml)의 웨스턴 면역블롯을 도시한다. 레인 1: 독소 A; 레인 2: 톡소이드 A; 레인 4: 독소 A 단편 4; 레인 5: 독소 B; 레인 7: 독소 B 단편 4; 레인 8: PilF(음성 대조). 예상된 크기: 독소 A(308 kDa); 독소 A 단편 4(114 kDa); 독소 B(280 kDa).
도 5는 정제된 CAN20 클론(1μg/ml)의 웨스턴 블롯을 도시한다. 블롯 A는 CAN20G1로 탐침되고, 블롯 B는 CAN20G2로 탐침되고, 블롯 C는 CAN20G5로 탐침되고, 그리고 블롯 D는 Can20G8로 탐침되었다. (레인 1: 독소 A (308 kDa); 레인 2: 독소 A 단편 4 (114 kDa); 레인3: 독소 B (280 kDa); 레인4: 파상풍 톡소이드).
도 6a는 SA(스트렙타비딘) 바이오센서에 결합하는 비오틴화된 CAN20G1 항체를 보여주는 에피토프 비닝 그래프이다. 결합된 항체는 이후, 유리 독소 A 및 유리 CAN20G1과 함께 배양된다. CAN20G1-독소 A 복합체는 유리 항체와 함께 다시 한 번 배양된다. 파장에서 큰 nm 이동은 분석물의 결합을 지시하고, 이것은 CAN20G1과 유리 항체가 상이한 에피토프를 갖는다는 것을 지시할 것이다. 1, SA 바이오센서에 대한 비오틴화된 CAN20G1. 2, CAN20G1과 복합체를 형성하는 유리 완전 독소 A. 3, 비오틴화된 CAN20G1-독소 A 복합체와 결합하는 유리 CAN20G1. 4, 결합 표본 곡선. 5, 해리 단계.
도 6b는 전체 프로그램의 최종 3단계(3-5)를 보여주는 그래프이다. 파장에서 큰 nm 이동은 분석물의 결합을 지시하고, 이것은 CAN20G1과 유리 항체가 상이한 에피토프를 갖는다는 것을 지시할 것이다. 이러한 경우에, 단지 CDA1(대조로서 이용되는 Merck 항-독소 A mAb)만 파장에서 유의미한 nm 이동을 가졌는데, 이것은 CDA1이 상이한 에피토프에 결합하는 반면, CAN20G1, G2, G5, 그리고 G8이 CAN20G1과 동일한 에피토프 빈(bin)에 결합한다는 것을 증명한다.
도 7은 생쥐 생존에 대한 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 효과, 그리고 독소 A 공격에 대항하는 CAN19 mAb의 효능을 보여주는 막대그래프이다.
도 8은 생쥐 생존에 대한에 대한 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 효과, 그리고 독소 A 공격에 대항하는 CAN19와 CAN20 mAb의 효능을 보여주는 막대그래프이다.
도 9는 생쥐 생존에 대한 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 효과, 그리고 독소 A 공격에 대항하는 전체량과 절반량에서 뮤린 CAN20G2 mAb의 효능을 보여주는 막대그래프이다.
도 10은 RNA로부터 V 유전자 증폭에 이용되는 프라이머를 도시한다. 축중 염기 기호는 축중 뉴클레오티드 서열 패턴을 나타내기 위한 IUPAC(International union of pure and applied chemistry) 코드이다.
도 11은 muCAN20G2 부모 클론으로부터 VH와 VL 서열 둘 모두를 포함하는 muCAN20G2에 대한 V-유전자 서열화 결과를 도시한다.
도 12는 가장 가까운 인간 생식계열 v-영역과 함께 muCAN20G2 v-영역의 정렬을 도시한다. 이들 인간 생식계열은 인간화를 위한 수용자 프레임워크로서 이용되었다.
도 13a와 13b는 CDR-huCAN20G2 설계를 도시한다. 가장 가까운 대합 인간 프레임워크는 IGHV7-4-1*02 및 IGKV1-39*01이다. muCAN20G2의 CDR(IMGT 넘버링)은 인간 프레임워크 내로 삽입되었다. 도 13a는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 중쇄 가변 영역을 도시한다. FR1, FR2와 FR3은 IGHV7-4-1*02로부터 유래되고; FR4는 IGHJ6*01로부터 유래된다. 도 13b는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 가벼운 (카파) 사슬 가변 영역을 도시한다. FR1, FR2와 FR3은 IGKV1-39*01로부터 유래되고; FR4는 IGKJ4*01로부터 유래된다.
도 14a와 14b는 HE-huCAN20G2 설계를 도시한다. 재표면화되고 변형된 코돈은 굵게 표시된다. 뉴클레오티드 서열은 정확한 프레임을 담보하기 위해 번역되었다. 도 14a는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 중쇄 가변 영역을 도시한다. 도 14b는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 가벼운 (카파) 사슬 가변 영역을 도시한다.
도 15는 HE-huCAN20G2 중쇄를 도시한다. 재표면화되고 변형된 코돈은 굵게 표시된다. v-영역 설계 후, IgG1 불변 영역이 추가되었다. 인트론은 제거되고, 그리고 뉴클레오티드 서열은 정확한 프레임을 담보하기 위해 번역되었다.
도 16은 HE-huCAN20G2 카파 사슬을 도시한다. 재표면화되고 변형된 코돈은 굵게 표시된다. v-영역 설계 후, 카파 불변 영역이 추가되었다. 인트론은 제거되고, 그리고 뉴클레오티드 서열은 정확한 프레임을 담보하기 위해 번역되었다.
도 17은 AVA-huCAN20G2 카파 V-영역 정렬을 도시한다. 아바스틴 카파 v-영역은 IMGT 도메인 명부 및 확인된 가장 가까운 생식계열 v-영역에 맞춰 정렬되었다. IGKV1D-33-01은 AVA mAb 설계를 위한 수용자 프레임워크로서 이용되었다.
도 18은 AVA-huCAN20G2를 도시한다. 아바스틴 카파 v-영역은 IMGT 도메인 명부 및 확인된 가장 가까운 생식계열 v-영역에 맞춰 정렬되었다. 분석과 설계 후, 카파 불변 영역이 추가되었다. 전술한 바와 같이, 이들 불변 영역은 인트론을 내포한다. AVA-huCAN20G2 중쇄의 경우에, 앞서 설계되고 재표면화된 HE-huCAN20G2 중쇄가 이용되었다. FR1, FR2와 FR3은 IGKV1D-33-01로부터 유래되고; FR4는 IGKJ1-01로부터 유래된다.
도 19a와 19b는 키메라 CAN20G2를 도시한다. 뮤린 V-영역은 인간 불변 영역을 이용하여 설계되었다. 인트론은 제거되고, 그리고 뉴클레오티드 서열은 정확한 프레임을 담보하기 위해 번역되었다. 도 19a는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 중쇄를 도시한다. 도 19b는 핵산 서열과 아미노산 서열 둘 모두를 포함하는 가벼운 (카파) 사슬을 도시한다.
도 20a는 막대그래프로서 묘사된, 150 ng/ml에서 정제된 인간 CAN20G2 클론에 대한 중화 데이터를 도시한다.
도 20b는 막대그래프로서 묘사된 250 ng/ml에서 정제된 인간 CAN20G2 클론에 대한 중화 데이터를 도시한다.
도 21a는 45분 시점에서 독소 A에 결합하는 발현된 인간 Can20G2 mAb에 대한 형질감염 상층액을 스크리닝하기 위한 ELISA를 도시한다.
도 21b는 45분 시점에서 독소 A 단편 4에 결합하는 발현된 인간 Can20G2 mAb에 대한 형질감염 상층액을 스크리닝하기 위한 ELISA를 도시한다.
도 21c는 60분 시점에서 독소 A에 결합하는 발현된 인간 Can20G2 mAb에 대한 형질감염 상층액을 스크리닝하기 위한 ELISA를 도시한다.
도 21d는 60분 시점에서 독소 A 단편 4에 결합하는 발현된 인간 Can20G2 mAb에 대한 형질감염 상층액을 스크리닝하기 위한 ELISA를 도시한다.
도 22는 정제된 인간 CAN20G2 클론의 SDS-PAGE를 도시한다.
도 23은 정제된 인간 CAN20G2 클론의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. SDS-page 겔은 파상풍 톡소이드, 완전 독소 A, 독소 A 단편 4 및 BSA가 이동되었다. 겔은 니트로셀룰로오스 막에 이전되고 각각의 인간 CAN20G2 mAb(1μg/ml)로 탐침되었다. (레인 1: 독소 A; 레인 2: 독소 A 단편 4; 레인 3: 파상풍 톡소이드; 레인 4: BSA).
도 24a와 24b는 배양 후 5, 6, 7, 그리고 8일자에, 검사 항체, CDR-huCAN20G2(도 24a) 및 HE-huCAN20G2(도 24b)에 대한 건강한 공여자 T 세포 증식 반응을 도시한다. 2개 독립표본 스튜던트 t 검증을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥2.00에서 증식 반응(점선으로 표시됨)은 양성인 것으로 간주되었다. 각 공여자의 경우에, 왼쪽에서부터 오른쪽으로 막대는 각각, 5일자, 6일자, 7일자 및 8일자를 나타낸다.
도 25는 4가지 시점에서 검출된, 항체 CDR-huCAN20G2(C001)와 HE-huCAN20G2(H001)에 대한 양성 T 세포 증식 반응의 숫자를 도시한다.
도 26은 검사 항체, CDR-huCAN20G2(C001) 및 HE-huCAN20G2(H001)에 대한 건강한 공여자 T 세포 IL-2 ELISpot 반응을 도시한다. PBMC는 8-일 배양 동안 이들 두 항체로 자극에 반응한 IL-2 분비를 산정하는데 이용되었다. 2개 독립표본 스튜던트 t 검증을 이용하여 유의미한(p<0.05) SI≥2.00에서 T 세포 반응은 양성으로 기록되었다. 경계선 반응(SI≥1.90에서 유의미한 p<0.05)이 도시되었다(*).
도 27은 0.05mg/생쥐의 낮은 분량에서 조사된 HE-huCAN20G2("HE-CAN20G2"), CDR-huCAN20G2("CDR-CAN20G2") 및 CDA1(Merck/Medarex) 항-클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A(항-TcdA) mAb의 비교를 도시한다. mAb의 효능은 대조 동물(TcdA/PBS)과 비교하여 생존의 백분율로서 표시된다. *통계학적 유의성에 대한 피셔 정확 검증.
도 28은 TcdA 공격 이후에 시간의 흐름에서 생존에 대한, CDA1과 비교하여 인간화 CAN20G2 mAb, HE-huCAN20G2, CDR-huCAN20G2의 효과를 도시한다. TcdA 공격 후 시간에 관련된 생존에 대한 낮은 분량의 Ab(0.05mg)에서 mAb 또는 PBS 단독(대조)의 효과가 묘사된다. 지정된 시점(시간)에서 TcdA 공격 후 각 군에서 동물의 생존 퍼센트가 그래프에 도시된다.
도 29a와 29b는 랫트에서 인간화 항체 CDR-huCAN20G2(도 29a) 및 HE-huCAN20G2(도 29b)의 PK 연구 데이터를 도시한다.
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 박테리아 감염 또는 박테리아 보균의 예방 또는 치료를 위한 조성물과 방법을 제시한다. 조성물은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A를 인식하는 항체(또는 이의 항원-결합 부분)뿐만 아니라 생쥐 단일클론 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이들의 항원-결합 부분을 내포한다. 이들 항체(또는 이들의 항원-결합 부분)는 시험관내와 생체내에서 독소 A를 중화시키고, 및/또는 포유류 세포에 독소 A의 결합을 저해할 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-연관된 질환(CDAD)를 예방하거나 치료하기 위한 수동 면역(passive immunization)에서 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 하기 효과 중에서 한 가지 이상을 제공한다: 개체에서 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-매개된 대장염, 항생제-연관된 대장염, 가막성 대장염(PMC) 또는 기타 장 질환으로부터 보호하거나 또는 이를 치료; 개체에서 설사로부터 보호하거나 또는 이를 치료; 및/또는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-매개된 질환의 재발을 치료하거나 또는 저해. 포유류에 투여될 때, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 투여되지 않았다면, 포유류에 치명적이었을 양으로 투여된 독소 A로부터 포유류를 보호한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 본원에서 설명된 하이브리도마 클론 CAN20G2, CAN20G1, CAN20G5, CAN20G8, CAN19G1, CAN19G2 또는 CAN19G3에 의해 생산된 항체를 포함한다.
또한, 하이브리도마 클론 CAN20G2, CAN20G1, CAN20G5, CAN20G8, CAN19G1, CAN19G2 또는 CAN19G3에 의해 생산된 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 본 발명에 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5, CAN20G8, CAN19G1, CAN19G2 및 CAN19G3은 하이브리도마 클론 또는 상응하는 하이브리도마 클론에 의해 산출된 단일클론 항체를 지칭한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 독소 A의 단편 4 내에 에피토프, 예를 들면, 독소 A의 아미노산 잔기 1853-2710 사이에 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. Babcock, G.J. et al, Infection and Immunity, 74: 6339-6347 (2006). 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 독소 A의 단편 1(아미노산 잔기 1-659), 단편 2(아미노산 잔기 660-1256) 또는 단편 3(아미노산 잔기 1257-1852) 내에 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 독소 A의 아미노산 잔기 1-600, 400-600, 415-540, 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 또는 2200-2300, 2300-2400, 2400-2500, 2500-2600, 2600-2710, 또는 이들의 임의의 간격, 부분 또는 범위 내에 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체뿐만 아니라 이들의 항원-결합 부분이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소(가령, 독소 A)에 특이적으로 결합하는 항체의 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체는 비-인간 종으로부터 항체인데, 여기서 인간 항체에 더욱 유사하고 본래 결합 능력이 여전히 유지되도록, 비-항원 결합 영역(및/또는 항원-결합 영역) 내에 아미노산 서열이 변형되었다.
인간화 항체는 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 가변 영역의 서열을 인간 가변 영역으로부터 동등한 서열로 대체함으로써 산출될 수 있다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중에서 적어도 하나로부터 가변 영역의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산 서열을 단리하고, 조작하고, 그리고 발현하는 것을 포함한다. 이런 핵산의 공급원은 당업자에게 널리 알려져 있고, 예로서 독소 A에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 획득될 수 있다. 인간화 항체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 DNA는 이후, 적절한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDRs)으로 지칭되는 3개의 초가변 영역이 끼어있는 프레임워크 영역으로 구성된다. 한 구체예에서, 인간화 항체는 비-인간 종으로부터 1개, 2개 또는 모든 CDR 및 인간 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종으로부터 항체 분자이다. 본 발명의 인간화 항체는 당분야에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 가령, 일단 비-인간(가령, 뮤린) 항체가 획득되면, 가변 영역은 서열화되고, 그리고 CDR과 프레임워크 잔기의 위치가 결정될 수 있다. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242. Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol, 196:901-917. 경쇄와 중쇄 가변 영역은 선택적으로, 상응하는 불변 영역에 결찰될 수 있다. CDR-이식된 항체 분자는 CDR-이식 또는 CDR 치환에 의해 생산될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 1개, 2개, 또는 모든 CDR이 대체될 수 있다. 가령, 특정 항체의 모든 CDR은 비-인간 동물(가령, 생쥐, 예를 들면, 표 1에서 도시된 CDR)의 적어도 일부분으로부터 유래되거나 또는 이들 CDR 중에서 일부만 대체될 수도 있다. 단지, 미리 결정된 항원(가령, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A)에 항체의 결합에 필요한 CDR을 유지하는 것이 필요하다. 문헌[Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202-1207. Oi et al, 1986, BioTechniques, 4:214. U.S. Patent Nos. 5,585,089; 5,225,539; 5,693,761과 5,693,762. EP 519596. Jones et al, 1986, Nature, 321 :552-525. Verhoeyan et al, 1988, Science, 239: 1534. Beidler et al, 1988, J. Immunol, 141 :4053-4060] 참조.
또한, 본원에서 개시된 1개, 2개, 또는 모든 CDR을 내포하고, 다른 영역이 인간, 토끼, 양, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 돼지, 원숭이, 유인원, 고릴라, 침팬지, 오리, 거위, 닭, 양서류, 파충류 및 기타 동물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 적어도 하나의 상이한 종으로부터 서열에 의해 대체되는 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 본 발명에 포함된다.
키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자이다. 가령, 항체는 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 내포할 수 있다. 키메라 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci, 81 :6851-6855 (1984). 가령, 뮤린(또는 다른 종) 단일클론 항체 분자를 인코딩하는 유전자는 뮤린 Fc를 인코딩하는 영역을 제거하기 위해 제한 효소로 소화되고, 그리고 인간 Fc 불변 영역을 인코딩하는 유전자의 동등한 부분이 치환된다. 키메라 항체는 또한, 뮤린 V 영역을 인코딩하는 DNA가 인간 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 결찰될 수 있는 재조합 DNA 기술에 의해 산출될 수 있다. 문헌[Better et al., Science, 1988, 240: 1041-1043. Liu et al. PNAS, 1987 84:3439-3443. Liu et al, J. Immunol, 1987, 139:3521-3526. Sun et al. PNAS, 1987, 84:214-218. Nishimura et al, Cane. Res., 1987, 47:999-1005. Wood et al. Nature, 1985, 314:446-449. Shaw et al, J. Natl. Cancer Inst., 1988, 80: 1553-1559. International Patent Publication Nos. WO 1987002671과 WO 86/01533. European Patent Application Nos. 184, 187; 171,496; 125,023; 그리고 173,494. 미국 특허 제4,816,567호] 참조.
항체는 전장이거나 또는 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 이가 scFv(bi-scFv), 삼가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편(가령, Ward et al, Nature, 341 :544-546 (1989)), 단리된 CDR, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편 (또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법, 또는 합성 링커를 이용하여 항체 단편을 연결함으로써 생산된 단일 사슬 항체 역시 본 발명에 포함된다. 문헌[Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883] 참조.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중-특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 또는 이중-특이적 항체 또는 이들의 단편은 한 표적 폴리펩티드(가령, 독소 A)의 상이한 에피토프에 특이적이거나, 또는 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인(가령, 독소 A와 독소 B에 특이적인 항원-결합 도메인; 또는 독소 A 및 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 다른 항원에 특이적인 항원-결합 도메인; 또는 독소 A 및 다른 종류의 박테리아 또는 바이러스에 특이적인 항원-결합 도메인)을 내포할 수 있다. 한 구체예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 문헌[Tutt et al, 1991, J. Immunol. 147:60-69. Kufer et al, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244] 참조. 본 발명의 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들면, 다른 펩티드 또는 단백질에 연결되거나 또는 이것과 공동-발현될 수 있다. 가령, 항체 또는 이의 단편은 이차 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 또는 다중특이적 항체를 생산하기 위해 하나 또는 그 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 다른 항체 또는 항체 단편에 (가령, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 가령, 본 발명에는 면역글로불린의 한쪽 팔이 독소 A에 특이적이고, 그리고 면역글로불린의 다른 팔이 두 번째 치료 표적에 특이적이거나 또는 치료 모이어티, 예를 들면, 트립신 저해제에 접합되는 이중-특이적 항체가 포함된다.
IgG(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE을 비롯한 모든 항체 아이소타입은 본 발명에 포함된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 포유류(가령, 생쥐, 인간) 항체 또는 이의 항원-결합 부분일 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 또는 람다 타입일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 CDR은 비-인간 또는 인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 프레임워크는 인간, 인간화, 비-인간(가령, 인간에서 항원성을 감소시키기 위해 변형된 뮤린 프레임워크), 또는 합성 프레임워크(가령, 공통 서열)일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 및/또는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 내포한다. 중쇄 가변 영역(또는 경쇄 가변 영역)은 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역(FRs)을 내포한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 문헌[Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991. Chothia, C. et al, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987] 참조.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 또는 약 10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 독소 A에 특이적으로 결합한다.
클론 CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5, CAN20G8, CAN19G1, CAN19G2 또는 CAN19G3에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역과 가변 경쇄 영역에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 가변 중쇄 영역과 가변 경쇄 영역을 갖는 항체 역시 독소 A에 결합할 수 있다.
관련된 구체예에서, 항-독소 A 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 예로서, CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5, CAN20G8, CAN19G1, CAN19G2 또는 CA19G3의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다. 이들 클론으로부터 가변 중쇄 영역의 CDR뿐만 아니라 이들 클론으로부터 가변 경쇄 영역의 CDR은 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
표 1에서, CDR은 IMGT 넘버링된다. H: 중쇄; K: 카파 사슬.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클론 CAN20G1(서열 번호: 12), CAN20G2(서열 번호: 28), CAN20G5(서열 번호: 44), 또는 CAN20G8(서열 번호: 60)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클론 CAN20G1(서열 번호: 4), CAN20G2(서열 번호: 20), CAN20G5(서열 번호: 36), 또는 CAN20G8(서열 번호: 52)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 각각, 클론 CAN20G1(서열 번호: 12), CAN20G2(서열 번호: 28), CAN20G5(서열 번호: 44), 또는 CAN20G8(서열 번호: 60)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역, 그리고 클론 CAN20G1(서열 번호: 4), CAN20G2(서열 번호: 20), CAN20G5(서열 번호: 36), 또는 CAN20G8(서열 번호: 52)의 가변 경쇄 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 둘 모두 포함한다.
다양한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클론 CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5, 또는 CAN20G8에 의해 생산된 항체에 의해 결합된 에피토프와 겹치거나, 또는 이러한 에피토프와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 에피토프에 특이적으로 결합하고 및/또는 독소 A에 결합에 대해, 클론 CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5, 또는 CAN20G8에 의해 생산된 항체와 경쟁한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 중쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 13, 14, 15), CAN20G2(서열 번호: 29, 30, 31), CAN20G5(서열 번호: 45, 46, 47), 또는 CAN20G8(서열 번호: 61, 62, 63)에 의해 생산된 항체의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 경쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 5, 6, 7), CAN20G2(서열 번호: 21, 22, 23), CAN20G5(서열 번호: 37, 38, 39), 또는 CAN20G8(서열 번호: 53, 54, 55)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 중쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 13 - 15), CAN20G2(서열 번호: 29 - 31), CAN20G5(서열 번호: 45 - 47), 또는 CAN20G8(서열 번호: 61 - 63)에 의해 생산된 항체의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함할 수 있고, 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 경쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 5 - 7), CAN20G2(서열 번호: 21 - 23), CAN20G5(서열 번호: 37 - 39), 또는 CAN20G8(서열 번호: 53 - 55)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 중쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 13 - 15), CAN20G2(서열 번호: 29 - 31), CAN20G5(서열 번호: 45 - 47), 또는 CAN20G8(서열 번호: 61 - 63)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 3개의 CDR을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 경쇄 영역은 CAN20G1(서열 번호: 5 - 7), CAN20G2(서열 번호: 21 - 23), CAN20G5(서열 번호: 37 - 39), 또는 CAN20G8(서열 번호: 53 - 55)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 3개의 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 중쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 13 - 15), CAN20G2(서열 번호: 29 - 31), CAN20G5(서열 번호: 45 - 47), 또는 CAN20G8(서열 번호: 61 - 63)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 3개의 CDR을 포함하고, 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 경쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 5 - 7), CAN20G2(서열 번호: 21 - 23), CAN20G5(서열 번호: 37 - 39), 또는 CAN20G8(서열 번호: 53 - 55)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 중쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 13 - 15), CAN20G2(서열 번호: 29 - 31), CAN20G5(서열 번호: 45 - 47), 또는 CAN20G8(서열 번호: 61 - 63)에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역의 CDR과 상동성인 3개의 CDR을 포함하고, 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 경쇄 영역은 클론 CAN20G1(서열 번호: 5 - 7), CAN20G2(서열 번호: 21 - 23), CAN20G5(서열 번호: 37 - 39), 또는 CAN20G8(서열 번호: 53 - 55)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역의 CDR과 상동성인 3개의 CDR을 포함한다.
일정한 구체예에서, 표 1에서 CDR에 상응하는 CDR은 서열 변이를 갖는다. 가령, CDR 내에 전체 잔기 중에서 1, 2 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 잔기, 또는 20% 이하, 30% 이하, 또는 약 40% 이하가 치환되거나 결실되는 CDR이 독소 A에 결합하는 항체(또는 이의 항원-결합 부분) 내에 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클론 CAN20G1(각각, 서열 번호: 4와 서열 번호: 12), CAN20G2(각각, 서열 번호:20과 서열 번호:28), CAN20G5(각각, 서열 번호:36과 서열 번호:44), 또는 CAN20G8(각각, 서열 번호:52와 서열 번호:60)에 의해 생산된 항체의 가변 경쇄 영역과 가변 중쇄 영역과 상동성인 가변 경쇄 영역과 가변 중쇄 영역을 내포한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 펩티드이다. 이들 펩티드에는 또한, 생물학적 활성, 예를 들면, 항원의 결합을 나타내는, 펩티드의 변이체, 유사체, 오르토로그, 동족체 및 유도체가 포함될 수 있다. 이들 펩티드는 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체(예로서, 비-자연 발생 아미노산, 무관한 생물체에서만 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유류 체계로부터 변형된 아미노산 등 포함), 치환된 연쇄를 갖는 펩티드, 그리고 당분야에 공지된 다른 변형을 내포할 수 있다.
특정 아미노산이 치환되거나, 결실되거나 또는 추가되는 항체 또는 이의 항원-결합 부분 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 이들 변형은 펩티드의 생물학적 성질, 예를 들면, 결합 활성에 실질적인 영향을 주지 않는다. 가령, 항체는 항원에 대한 결합을 향상시키기 위해, 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 다른 실례에서, 선별된 소수의 수용자 프레임워크 잔기가 상응하는 공여자 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 공여자 프레임워크는 성숙 또는 생식계열 인간 항체 프레임워크 서열 또는 공통 서열일 수 있다. 표현형적으로 침묵한 아미노산 치환을 만드는 방법에 관한 보도는 Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)에서 제공된다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자에 연결될 수 있다. 가령, 항체는 하나 또는 그 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 다른 항체, 검출가능 작용제, 세포독성 작용제, 약제, 다른 분자와의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(가령, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그), 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체, 또는 단백질 정제에 유용한 리간드, 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그, 그리고 스타필로코커스 단백질 A에 기능적으로 연결될 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 상호작용 등에 의해). 한 유형의 유도체화된 단백질은 2개 또는 그 이상의 단백질(동일한 유형 또는 상이한 유형의)을 가교함으로써 생산된다. 적절한 가교제에는 적절한 스페이서(가령, m-말레이미도베니조일-N-히드록시숙신이미드 에스터)에 의해 분리된 2개의 상이한 반응성 기를 갖는 이형이중기능성인 것들 또는 동형이중기능성인 것들(가령, 디숙시니미딜 수베레이트)이 포함된다. 이런 링커는 Pierce Chemical Company, Rockford, III로부터 구입가능하다. 단백질이 유도체화(또는 표지화)될 수 있는 유용한 검출가능 작용제에는 형광 화합물, 다양한 효소, 보결 원자단, 발광 물질, 생물발광 물질, 그리고 방사성 물질이 포함된다. 무제한적의 예시적인 형광 검출가능 작용제에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 그리고 피코에리트린이 포함된다. 단백질 또는 항체는 또한, 검출가능 효소, 예를 들면, 알칼리성 포스파타아제, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈락토시다아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코오스 옥시다아제 등으로 유도체화될 수 있다. 단백질은 또한, 보결 원자단(가령, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴)으로 유도체화될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 예로서, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1% 이하의 아미노산 잔기가 치환되거나 결실되지만 독소 A에 결합이 포함되지만 이에 국한되지 않는 본질적으로 동일한 면역학적 성질을 유지하는 본원에서 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 기능적으로 활성 변이체일 수도 있다.
본 발명은 또한, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 핵산은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 생산하기 위해 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 서열 번호: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 또는 60에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
단리된 핵산은 서열 번호: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한, 서열 번호: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 또는 60에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다. 발현 벡터는 서열 번호: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상동한 핵산 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 기능적으로 활성 변이체를 인코딩하는 핵산 분자 역시 본 발명에 포함된다. 이들 핵산 분자는 중간 엄밀도, 높은 엄밀도, 또는 매우 높은 엄밀도 조건 하에 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산과 혼성화될 수 있다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 보도는 본원에 참고문헌으로 편입되는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989]에서 찾아볼 수 있다. 본원에서 언급되는 특정한 혼성화 조건은 하기와 같다: 1) 중간 엄밀도 혼성화 조건: 약 45℃에서 6XSSC, 그 이후에 60℃에서 0.2XSSC, 0.1% SDS에서 1회 또는 그 이상의 세척; 2) 높은 엄밀도 혼성화 조건: 약 45℃에서 6XSSC, 그 이후에 65℃에서 0.2XSSC, 0.1% SDS에서 1회 또는 그 이상의 세척; 그리고 3) 매우 높은 엄밀도 혼성화 조건: 0.5 M 인산나트륨, 약 65℃에서 7% SDS, 그 이후에 65℃에서 0.2XSSC, 0.1% SDS에서 1회 또는 그 이상의 세척.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산은 적절한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입되고, 그 이후에 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 단리 또는 정제될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산은 세포-없는 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 미국 특허 제4,816,567호. Queen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10033 (1989).
항-독소 항체 또는 이들의 부분은 원하는 항체의 경쇄와 중쇄(또는 이들의 부분)을 인코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 항체는 표준 기술을 이용하여 이들 배양 상층액 및/또는 세포로부터 단리되고 정제될 수 있다. 가령, 숙주 세포는 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 둘 모두를 인코딩하는 DNA로 형질전환될 수 있다. 결합에 필요하지 않은 경쇄와 중쇄 중에서 어느 한 쪽 또는 둘 모두를 인코딩하는 DNA의 일부 또는 전부, 예를 들면, 불변 영역을 제거하기 위해, 재조합 DNA 기술이 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 원핵과 진핵 세포, 예를 들면, 박테리아 세포, (가령, 대장균(E. coli)), 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 그리고 포유류 세포를 비롯한 다양한 적절한 세포에서 발현될 수 있다. 다수의 포유류 세포주는 당분야에 알려져 있는데, 여기에는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 가용한 영속화 세포주가 포함된다. 세포의 무제한적 실례에는 원숭이 신장 세포(COS, 예를 들면, COS-1, COS-7), HEK293, 아기 햄스터 신장(BHK, 예를 들면, BHK21), 중국 햄스터 난소(CHO), NSO, PerC6, BSC-1, 인간 간세포 암종 세포(가령, Hep G2), SP2/0, HeLa, Madin-Darby 소 신장(MDBK), 골수종과 림프종 세포의 부모 세포, 유도체 및/또는 조작된 변이체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 포유류 기원 또는 포유류-유사 특징의 모든 세포주가 포함된다. 조작된 변이체는 예로서, 글리칸 프로필 변형된 및/또는 특정 부위 통합 부위 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에서 설명된 핵산을 포함하는 세포를 제시한다. 세포는 하이브리도마 또는 형질감염체일 수 있다. 이들 세포의 유형은 상기에 논의된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다양한 세포에서 발현될 수 있다. 이들 세포의 유형은 상기에 논의된다.
대안으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 당분야에 널리 공지된 고형상 절차에 의해 합성될 수 있다. 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989). Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W.Pennington and B. M. Dunn), chapter 7. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 1 and Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254. M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)] 참조.
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 만들기 위한 방법을 제시한다. 가령, 비-인간 동물은 비활성화된 독소 A를 포함하는 조성물로 면역화되고, 그리고 이후, 특이적인 항체가 상기 동물로부터 단리된다. 상기 방법은 독소 A에 항체의 결합을 평가하는 것을 더욱 포함할 수 있다.
임의의 다양한 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 단백질, 특히 독소 A가 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 질환은 독소 A와 독소 B에 의해 일차적으로 매개된다. 양쪽 독소는 세포독성이고, 그리고 생쥐 내로 정맥내 또는 복강내 주입될 때 치명적이다. 독소 A는 또한, 생쥐 결찰된 장 루프 설사 모델에서 유체 축적의 유도에 의해 증명되는 바와 같이, 강력한 장독소이다. 예로서, 문헌[Babcock, G.J. et al, Infection and Immunity, 74: 6339-6347 (2006)] 및 배경을 위해 그 내에 포함된 참고문헌을 참조한다.
표 2는 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 A의 아미노산 서열을 제시한다. 하기에 제공된 서열의 변이체와 단편 역시 항체를 산출하기 위한 항원으로서 이용될 수 있다.
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Figure pct00016
Figure pct00017
표 3은 표 2의 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 제시한다.
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Figure pct00019
Figure pct00020
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한 구체예에서, 본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 만들기 위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 하기 단계를 내포한다: 비활성화된 독소 A(가령, 톡소이드 A)를 포함하는 조성물로 동물을 면역화시키고; 상기 동물로부터 비장세포를 단리하고; 이들 비장세포로부터 하이브리도마를 산출하고; 그리고 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별한다. 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988] 참조.
독소는 예로서, 포름알데히드, 글루타르알데히드, UDP-디알데히드, 과산화물, 산소로 처리에 의해 또는 돌연변이(가령, 재조합 방법을 이용)에 의해 비활성화될 수 있다. 문헌[ Relyveld et al., Methods in Enzymology, 93:24, 1983. Woodrow and Levine, eds., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990. Genth et al, Inf. and Immun., 68(3): 1094-1101, 2000] 참조. 감소된 독성을 갖는 돌연변이 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소는 재조합 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 미국 특허 제5,085,862호; 제5,221,618호; 제5,244,657호; 제5,332,583호; 제5,358,868호; 그리고 제5,433,945호. 독소 또는 톡소이드의 전장 또는 단편은 면역원으로서 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 비활성화된 독소 A가 생쥐를 복강내 또는 정맥내 면역화하는데 이용된다. 하나 또는 그 이상의 부스트(boost)가 제공되거나 제공되지 않을 수 있다. 혈장 내에 항체의 역가는 예로서, ELISA(효소-연결된 면역흡착 검정) 또는 유세포분석에 의해 모니터링될 수 있다. 충분한 역가의 항-독소 A 항체를 갖는 생쥐는 융합에 이용된다. 생쥐는 희생 및 비장의 제거 3일 전에 항원으로 부스트되거나 되지 않을 수 있다. 생쥐 비장세포는 단리되고 PEG로 생쥐 골수종 세포주에 융합된다. 결과의 하이브리도마는 이후, 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝된다. 세포는 도말되고, 그리고 이후, 선택 배지에서 배양되된다. 개별 웰로부터 상층액은 이후, 인간 항-독소 단일클론 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝된다. 항체 분비 하이브리도마는 재도말되고, 다시 한 번 스크리닝되고, 그리고 항-독소 단일클론 항체에 대해 여전히 양성이면, 제한 희석에 의해 하위클로닝될 수 있다. 가령, 본 발명의 하이브리도마 클론 CAN20G2가 하위클로닝될 수 있다. 하위클론 중에서 하나는 CAN20G2-2-1이다.
클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 항원 중에서 하나 또는 그 이상, 특히 독소 A의 면역원성을 증가시키는데 이용될 수 있는 어쥬번트에는 펩티드 또는 펩티드의 조합에 대한 면역 반응을 증가시키는 역할을 하는 임의의 화합물 또는 화합물들이 포함된다. 어쥬번트의 무제한적 실례에는 명반, 인산알루미늄, 암모늄 수산화물, MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80(Tween 80), 0.5% w/v 소르비탄 트리올리에이트(Span 85)), CpG-내포 핵산, QS21(사포닌 어쥬번트), MPL(모노포스포릴 지질 A), 3DMPL(3-O-탈아실화된 MPL), 아퀼라(Aquilla)로부터 추출물, ISCOMS(예로서, Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO90/03184; W096/11711; WO 00/48630; W098/36772; WO00/41720; WO06/134423과 WO07/026190 참조), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 마이크로입자, Quil A, 인터류킨, 프레운드, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-딥-알미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨), 그리고 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼에서 박테리아로부터 추출된 3가지 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포 벽 골격을 내포하는 RIBI(MPL+TDM+CWS)가 포함된다.
면역화된 동물은 면역원이 투여될 때 회수가능한 항체를 생산할 수 있는 임의의 동물, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 토끼, 생쥐, 랫트, 햄스터, 염소, 말, 원숭이, 비비 및 인간일 수 있다. 한 양상에서, 숙주는 유전자도입 숙주이고 인간 항체를 생산한다, 예를 들면, 인간 면역글로불린 유전자 분절을 발현하는 생쥐. 미국 특허 제8,236,311호; 제7,625,559호 및 제5,770,429호, 이들 각각의 개시는 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 문헌[Lonberg et al, Nature 368(6474): 856-859, 1994. Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994. Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93, 1995. Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N.Y. Acad. Sci., 764:536- 546, 1995] 참조.
숙주가 면역화되고 항체가 생산된 후, 이들 항체는 그들이 관심 항원에 대해 특이적인 지를 확인하고, 그리고 그들이 다른 항원과의 교차 반응성을 나타내는 지를 결정하기 위해 검정된다. 이런 검정을 수행하는 한 가지 방법은 미국 특허 공개 제2004/0126829호에서 설명된 바와 같은 혈청 스크린 검정이다. 항-독소 항체는 다양한 공지된 기술에 의해, 독소에 결합에 대해 특징화될 수 있다. 가령, ELISA에서, 마이크로역가 플레이트는 PBS에서 독소 또는 톡소이드 항원으로 코팅되고, 그리고 이후, PBS에서 희석된 무관한 단백질, 예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단된다. 독소-면역화된 생쥐의 혈장의 희석액이 각 웰에 첨가되고 배양된다. 플레이트는 세척되고, 이후 효소(가령, 알칼리성 포스파타아제)에 접합된 이차 항체와 함께 배양된다. 세척 후, 플레이트는 효소의 기질(가령, ABTS)이 전개되고, 그리고 특정 OD에서 분석된다. 다른 구체예에서, 선별된 단일클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위해, 항체는 비오틴화될 수 있고, 이것은 이후, 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 항-독소 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해, 독소와의 반응성에 대해 조사될 수 있다.
항-독소 항체의 활성을 측정하기 위해 중화 검정 역시 이용될 수 있다. 가령, 배양 중인 세포에 대한 세포 변성 효과를 저해하는 항체의 능력을 측정하기 위해 시험관내 중화 검정이 이용될 수 있다(하기 실시예 7과 12 참조). 한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 시험관내 중화 검정에서 약 1 μM 내지 약 50 μM, 약 2 μM 내지 약 40 μM, 약 3 μM 내지 약 30 μM, 약 4 μM 내지 약 20 μM, 약 4 μM 내지 약 17 μM, 약 5 μM 내지 약 15 μM, 또는 약 10 μM 범의의 농도에서, 약 150 ng/ml 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상을 중화시킨다. 생체내 검정은 또한, 독소 중화를 측정하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 생체내 독소 A 공격 실험(가령, 실시예 5, 6와 7뿐만 아니라 문헌[Babcock et al., Human Monoclonal Antibodies Directed against Toxins A and B prevent Clostridium difficile-Induced Mortality in Hamsters. Infection and Immunity (2006) 74(11):6339]에서 설명된 바와 같은 절차)에서, 포유류가 약 100 ng 이상, 또는 약 100 ng의 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 노출되기 약 24시간 전에, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 약 1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 2 mg/kg 체중 내지 약 40 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 8 mg/kg 체중 내지 약 13 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중 범위의 용량에서 포유류에 투여될 때, 포유류에 대한 생존 기회는 약 7일 이내에 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상이다.
독소에 가급적 높은 친화성으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 이후, 하위클로닝되고 더욱 특징화될 수 있다. 부모 세포의 반응성을 유지하는 (ELISA에 의해) 각 하이브리도마로부터 하나의 클론이 이후, 세포 은행을 만들고, 그리고 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.
항-독소 항체를 정제하기 위해, 배양된 하이브리도마로부터 상층액은 단백질 A-세파로오스(Pharmacia, Piscataway, N.J.)로 친화성 크로마토그래피에 앞서, 여과되고 농축될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한, 항원에 대한 결합 친화성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 항원에 대한 항체의 친화성은 임의의 적절한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예로서, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 그리고 본원에서 설명된 방법을 참조한다). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건(가령, 염 농도, pH) 하에 측정되면, 변할 수 있다. 따라서 친화성 및 기타 항원-결합 파라미터(가령, KD, Ka , Kd)의 측정은 바람직하게는, 항체와 항원의 표준화 용액, 그리고 표준화 완충액으로 이루어진다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 시험관내와 생체내 치료적, 예방적, 및/또는 진단적 유용성을 갖는다. 가령, 이들 항체는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 및 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)과 연관된 질환을 치료하고, 저해하고, 이들의 재발을 예방하고, 및/또는 진단하기 위해, 배양 중인 세포, 예를 들면, 예로서 시험관내 또는 탈체, 또는 개체, 예를 들면, 생체내 투여될 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 배양 중인 세포에서, 예를 들면, 시험관내에서 또는 탈체에서 이용될 수 있다. 가령, 세포는 배양 배지에서 시험관내 배양되고 항-독소 항체 또는 이의 단편에 의해 접촉될 수 있다. 이들 방법은 생체내 (가령, 치료적 또는 예방적) 프로토콜의 일부로서 개체 내에 존재하는 세포 상에서 수행될 수 있다. 생체내 구체예의 경우에, 접촉 단계는 개체에서 실행되고, 그리고 개체에서, 예를 들면, 장에서 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)에 의해 발현된 독소(가령, 독소 A)에 항-독소 항체 또는 이의 부분의 결합을 허용할 만큼 효과적인 조건 하에, 항-독소 항체 또는 이의 부분을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단독으로 또는 다른 치료 작용제, 예를 들면, 두 번째 단일클론 또는 다중클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 함께 투여될 수 있다. 한 실례에서, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 B에 특이적으로 결합하는 항체(단일클론 또는 다중클론) 또는 이의 항원-결합 부분과 합동된다. 다른 실례에서, 두 번째 작용제는 항생제, 예를 들면, 반코마이신, 바시트라신 또는 메트로니다졸이다. 항체는 생균제, 예를 들면, 사카로미세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)와 함께 이용될 수 있다. 항체는 또한, 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 백신, 예를 들면, 톡소이드 백신과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 본원에서 설명된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 그리고 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 이 조성물은 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코드하는 단리된 핵산, 그리고 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 생리학적으로 양립가능한 이와 유사한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 배지, 등장성 및 흡수 지연 물질, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 개체에서 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 박테리아 감염을 감소, 제거 또는 예방하는데 유효하다.
본 발명은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 질환을 저해시키는데 유효한 양으로 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에게 투여함으로써, 개체의 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 질환을 치료하는 방법을 또한 특징으로 한다. 본 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 경구, 국소, 피하, 피내(intradermal), 경피, 피부아래, 장관외, 직장, 척추, 또는 상피 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사가능한, 또는 주사에 앞서 액체 비이클에 용액 또는 현탁액으로 적합한 고체형태로 준비될 수 있다. 이 조성물은 고체형태, 유화된 형태 또는 리포좀 비이클 또는 지연 운반에 이용되는 기타 미립자 운반체들에 포집된 활성 성분으로 준비될 수 있다. 가령, 이 조성물은 오일 유액(emulsion), 유중수 유액, 수중유수(물-in-oil-in-물) 유액, 부위-특이적 유액, 장기-체류 유액, 점성 유액, 마이크로유액, 나노유액, 리포좀, 극미립자, 미소구(microsphere), 나노구(nanosphere), 나노입자 및 다양한 천연 또는 합성 폴리머, 이를 테면, 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체와 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 및 Hytrel® 공중합체와 같은 비-재흡수가능한 불투과성 폴리머, 히드로겔과 같은 팽창가능한 폴리머, 또는 콜라겐 및 재흡수가능한 봉합사를 만드는데 이용되는 것들과 같은 특정 폴리산 또는 폴리에스터와 같은 재흡수가능한 폴리머의 형태안에 있을 수 있고, 이로써 백신의 지속적 방출이 허용된다.
본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 포유류 개체에게 운반을 위한 조성물로 제형화된다. 이 조성물은 단독으로 투여되거나, 및/또는 약제학적으로 수용가능한 비이클 또는 부형제와 함께 혼합되어 투여된다. 적합한 비이클은 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올, 또는 이와 유사한 것들 및 이의 조합들이다. 또한, 비이클은 이를 테면 가습 또는 유화 물질들, pH 완충 물질들, 또는 어쥬번트와 같은 소량의 보조 물질들을 포함할 수 있다. 본 발명의 이 조성물은 보조 물질들, 이를 테면 약리학적 물질들, 사이토킨, 또는 기타 생물학적 반응 변형제들을 또한 포함할 수 있다.
더욱이, 이 조성물은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 염들은 산 추가 염들(활성 폴리펩티드의 유리 아미노 기로 형성된)을 포함하는데, 이들은 무기산 이를 테면, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기산 이를 테면 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 및 이와 유사한 것들로 형성된다. 유리 카복실기로부터 형성된 염들은 무기 염기들 이를 테면, 예를 들면, 수산화 나트륨, 수산화 칼슘, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화 철과 같은 무기염들, 그리고 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 및 이와 유사한 것들과 같은 유기 염기로부터 또한 유도될 수 있다.
이러한 투약(dosage) 형태를 제조하는 실질적은 방법은 공지되어 있거나, 또는 당업계에 숙련자들에게 명백한 것이다. 가령, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 21st edition] 참조.
조성물은 개체의 연령, 체중, 상태, 그리고 이용되는 특정 조성물 및 투여 경로에 적합한 일정 및 기간에서 단일 투여(dose) 치료 또는 다중 투여 치료로 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 이 조성물의 단일 투약이 투여된다. 투여 반도는 다수의 인자들, 다령, 증상의 심각성, 원하는 면역보호 정도, 이 조성물이 예방 목적 또는 치료 목적으로 이용되는지 등의 임의의 것에 따라 변화될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 이 조성물은 한 달에 1회, 한 달에 2회, 한달에 3회, 2주에 1회(qow), 1주에 1회(qw), 2주에 2회(biw), 주당 3회(tiw), 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회, 이틀에 한번(qod), 매일(qd), 일일 2회(qid), 또는 일일 3회(tid)로 투여된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 투여 기간 가령, 이 조성물이 투여되는 기간은 다양한 인자들, 가령, 개체 반응, 등의 임의의 것에 따라 변화될 수 있다. 가령, 이 조성물은 약 1일 내지 약 1주일, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4 개월, 약 4 개월 내지 약 6 개월, 약 6 개월 내지 약 8 개월, 약 8 개월 내지 약 1 년, 약 1 년 내지 약 2 년, 또는 약 2 년 내지 약 4 년, 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
이 조성물은 약제학적으로 수용가능한 운반체(부형제)와 복합되어 약리학적 조성물을 형성할 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 본 발명의 약학 조성물에 작용하는, 가령, 이 조성물을 안정화시키거나, 이 조성물의 흡수 또는 제거속도를 증가 또는 감소시키는 생리학적으로 수용가능한 화합물을 포함할 수 있다. 약학 수용가능한 화합물들은 가령, 탄수화물, 이를 테면 포도당, 슈크로즈, 또는 덱스트란, 항산화제, 이를 테면 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이팅 물질들, 저 분자량 단백질, 세제, 리포좀성 운반체들, 또는 부형제들 또는 다른 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 다른 생리학적으로 수용가능한 화합물들은 가습 물질들, 유화 물질들, 분산 물질들 또는 보존제들을 포함한다. 가령, 문헌[21st edition of Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. ("Remington's")] 참조.
한 측면에서, 본 발명의 용액은 이 조성물이 물에 용해된다면 약제학적으로 수용가능한 운반체, 가령, 수성 운반체에 용해된다. 수성 용액의 예로는 가령, 물, 염수, 인산염 완충된 염수, Hank의 용액, Ringer 용액, 덱스트로즈/염수, 포도당 용액 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 제형은 적절한 생리학적 상태에 요구되는 약제학적으로 수용가능한 보조 물질들, 이를 테면 완충 물질들, 삼투 조정 물질들, 가습 물질들, 세제 및이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 첨가제들은 추가 활성 성분들 이를 테면 세균성 물질들, 또는 안정화제를 또한 포함할 수 있다. 가령, 이 용액은 아세테산 나트륨, 젓산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 모노라우레이트 소르비탄 또는 트리에탄올아민 올레이트를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 고형 제형가 이용될 수 있다. 이들 제형는 가령, 알약, 테블릿, 분말 또는 캡슐로 제형화될 수 있다. 고형 조성물의 경우, 통상적인 고형 운반체들이 이용될 수 있는데, 이러한 운반체로는 가령, 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오즈, 포도당, 슈크로즈, 탄산 마그네슘, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 적합한 약학 부형제들은 가령, 전분, 셀룰로오즈, 활석, 포도당, 젖당, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아레이트 마그네슘, 스테아레이트 나트륨, 모노스테아레이트 글리세롤, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 물, 에탄올을 포함한다.
경구로 투여될 경우, 본 조성물은 소화로부터 보호될 수 있다. 이 항체 또는 이의 항원- 결합 부분에 산성 및 효소에 의한 가수분해에 저항성을 부여하는 조성물을 복합시키거나, 또는 이 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 적절한 저항성 운반체 이를 테면 리포좀 안에 포함시킴으로써 소화로부터 보호될 수 있다. 소화로부터 화합물을 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Fix, Pharm Res. 13: 1760-1764, 1996. Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996]. 미국 특허 제5,391,377호 참고.
경점막 또는 경피 투여를 위하여, 침투되는 장벽에 적합한 침투물질들이 제형안에 이용될 수 있다. 이러한 침투물질들은 당업계에 공지되어 있고, 가령, 경점막 투여의 경우, 담즙염 및 푸시딕산 유도체들을 포함한다. 또한, 침투를 용이하게 하기 위하여 세제들이 이용될 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제를 이용하여 이루어질 수 있다. 문헌[Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85-184, 1996] 참조. 국소, 경피 투여의 경우, 이 물질들은 연고, 크림, 고약, 분말 및 겔 안에 제형화된다. 경피 운반 시스템은 또한 가령, 패취를 포함할 수 있다.
본 조성물은 지속된 방출 또는 지속된 방출 기전으로 또한 투여될 수 있다. 가령, 펩티드의 지속적인 운반을 가능하게 하는 생분해가능한 미소구들 또는 캡슐 또는 다른 생분해가능한 폴리머 형태들이 본 발명의 제형에 포함될 수 있다(가령, Putney, Nat. Biotechnol. 16: 153-157, 1998 참고).
흡입을 위하여, 본 조성물은 건조 분말 에어로졸, 액체 전달 시스템, 공기 분사 분무기, 추진체 시스템 및 이와 유사한 것들을 포함하는 당업계에 공지되어 있는 임의의 시스템을 이용하여 운반될 수 있다. Patton, Biotechniques 16: 141-143, 1998. 또한 본 발명에서 이용될 수 있는 것은 폴리펩티드 거대 분자를 위한 산물 및 흡입 전달 시스템, 가령, Dura Pharmaceuticals(San Diego, Calif), Aradigrn(Hayward, Calif), Aerogen(Santa Clara, Calif), Inhale Therapeutic Systems(San Carlos, Calif), 및 이와 유사한 것들이다. 가령, 약학 제형는 에어로졸 또는 미스트(mist) 형태로 투여될 수 있다. 에어로졸 투여의 경우, 제형는 계면활성제 및 추진체와 함께 미세하게 분할된 형태로 공급될 수 있다. 또 다른 측면에서, 호흡 조직으로 제형를 운반하기 위한 장치는 제형가 증발되는 흡입기다. 기타 액체 전달 시스템은 가령, 공기 분사 분무기를 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체는 단독으로 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 약학 조성물로 전달될 수 있는데, 가령, 전신으로, 영역적으로, 또는 국소적으로; 동맥내, 수막강내(IT), 정맥내(IV), 장관외, 흉강내, 국소, 경우, 또는 국소 투여, 피하, 도관내(가령, 에어로졸에 의해) 또는 경점막(가령, 볼, 방광, 질, 자궁, 직장, 코 점막)으로 전달될 수 있다. 특정 장기에 중점을 둔 "영역적 효과(regional effect)"을 위하여, 한 가지 투여 방식은 특정 장기, 가령, 뇌 및 CNS에 집중된 동맥내 또는 수막강내(IT) 주사를 포함한다(가령, Gurun, Anesth Analg. 85: 317-323, 1997 참고). 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 뇌로 바로 투여하는 것이 바람직한 경우 가령, 경동맥내 주사가 이용될 수 있다. 장관외 투여가능한 조성물을 준비하는 실질적인 방법은 당업계 숙련자들에게 알려져 있거나 또는 자명할 것이며, 문헌[Bai, J. Neuroimmunol. 80: 65-75, 1997. Warren, J. Neurol. Sci. 152: 31-38, 1997. Tonegawa, J. Exp. Med. 186: 507-515, 1997]에서 설명된다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물 또는 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체를 포함하는 약학 제형는 지질 단층 또는 이중층, 가령, 리포좀에 혼입된다. 미국 특허 제 6,110,490호; 제6,096,716호; 제5,283,185호 및 제5,279,833호. 본 발명의 측면들은 본 발명의 물에 용해가능한 핵산, 펩티드들 또는 폴리펩티드가 단층 또는 이중층의 표면에 부착된 제형를 또한 제공한다. 가령, 펩티드들은 하이드라지드-PEG-(디스테아로일포스파티딜) 에탄올아민-함유 리포좀에 부착될 수 있다( 가령, Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6: 705-708, 1995 참고). 리포좀 또는 지질 막의 임의의 형태, 이를 테면 고유 세포, 가령 적혈구 세포의 평면 지질 막 또는 세포 막이 이용될 수 있다. 리포좀성 제형는 정맥내, 경피(가령, Vutla, J. Pharm. Sci. 85: 5-8, 1996 참고), 경점막으로 또는 경구로 투여하는 것을 포함하는 임의의 수단일 수 있다. 본 발명은 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 미셀 및/또는 리포좀에 통합된 약학 제제를 또한 제공한다(가령, Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46: 23-28, 1994; Woodle, Pharm. Res. 9: 260-265, 1992 참고). 리포좀 및 리포좀성 제형은 표준 방법에 따라 제조될 수 있고, 이 또한 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1 : 197-210, 1995. Alving, Immunol. Rev. 145: 5-31, 1995. Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980]. 미국 특허 제4,235,871호; 제4,501,728호 및 제4,837,028호.
한 측면에서, 이 조성물은 신체로부터 펩티드가 신속하게 제거되는 것으로부터 이 펩티드를 보호하는 운반체들과 함께 제조되는데, 이를 테면 임플란트, 미소포집화된 운반 시스템을 포함하는 방출 조절된 제형이다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스터, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 약제학적으로 수용가능한 운반체들로 리포좀성 현탁액이 또한 이용될 수 있다. 미국 특허 제4,522,811호.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위하여 용량 단위 형으로 경구 또는 장관외 조성물을 제형화시키는 것이 유익하다. 본 명세서에서 기술된 용량 단위 형은 치료될 개체를 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하는데; 각 단위는 요구되는 약학 운반체와 연합하여 원하는 치료 효과를 생산하기 위하여 활성 화합물의 사전결정된 양을 포함한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구들로부터 획득된 데이터를 이용하여 인간에 사용할 수 있는 용량 범위를 공식화할 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 화합물의 용량은 독성이 거의 없거나 또는 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 안에 있다. 이 용량은 이용되는 투약형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 안에서 변화될 수 있다. 다른 구체예에서, 치료요법적 유효한 투여량은 세포 배양 검정으로부터 우선 예측될 수 있다. 투여량은 세포 내양에서 결정된 IC50(이를 테면, 증상의 최대 저해의 절반을 획득하는 검사 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 획득하기 위하여 동물 모델에서 공식화된다. 문헌[Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al, Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000] 참조.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 치료요법적 또는 예방적 유효량의 예시적, 비-제한적 범위는 약 0.001 내지 약 60 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 10 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 0.75 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 9 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 2 mg/kg 체중,약 3 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 7 mg/kg 체중, 약 5 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 8 내지 약 13 mg/kg 체중, 약 8.3 내지 약 12.5 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 4.2 내지 약 6.3 mg/kg 체중, 약 1.6 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중이다.
이 조성물은 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 유효량을 포함하도록 제형화되는데, 이때 이 양은 치료될 동물 및 치료될 상태에 따라 달라진다. 한 구체예에서, 본 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 약 0.1 mg 내지 약 9 g, 약 1 mg 내지 약 8 g, 약 1 mg 내지 약 7 g, 약 5 mg 내지 약 6 g, 약 10 mg 내지 약 5 g, 약 20 mg 내지 약 1 g, 약 50 mg 내지 약 800 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 0.0 lmg 내지 약 10 g, 약 0.05 μg 내지 약 1.5 mg, 약 10 μg 내지 약 1 mg 단백질, 약 30 μg 내지 약 500 μg, 약 40 pg 내지 약 300 pg, 약 0.1 μg 내지 약 200 mg, 약 0.1 μg 내지 약 5 μg, 약 5 μg 내지 약 10 μg, 약 10 μg 내지 약 25 μg, 약 25 μg 내지 약 50 μg, 약 50 μg 내지 약 100 μg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 500 μg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg 범위의 투여량으로 투여된다. 임의의 특정 개체의 경우 특정 투여량 수준은 특정 펩티드의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설율, 약물 조합 및 치료를 받는 특정 질환의 심각성을 포함하는 다수의 인자들에 따라 달라진다.
치료적 적용에서, 본 조성물은 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 박테리아 감염의 위험에 처한 또는 활성 감염을 앓는 개체에게 이 상태 또는 질환 및/또는 이의 합병증을 최소한 부분적으로 억제 또는 예방하는데 충분한 양으로 투여된다. 항-독소 항체(가령, 단일클론 항체)는 표준 기술, 이를 테면 친화력 크로마토그래피 또는 면역침전에 의해 독소를 단리하는데 또한 이용될 수 있다. 더욱이, 항-독소 항체는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 존재에 대해여 샘플(가령, 대변 샘플)을 검사하기 위하여 독소를 탐지하는데 이용될 수 있다. 항-독소 항체는 가령, 주어진 치료 섭생의 효능을 결정하기 위한 임상적 검사 과정의 일부로써 조직에서 독소 수준을 관찰하기 위하여 진단용으로 이용될 수 있다.
본 발명은 항-독소 항체 또는 이의 항원- 결합 부분을 포함하는 키트를 또한 제공한다. 이 키트의 추가 성분들은 다음 성분 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 사용 지침; 다른 시약들, 치료제, 또는 라벨 또는 치료제에 항체를 결합시키는데 유용한 물질, 또는 투여용 항체를 제조하기 위한 기타 재료들; 약제학적으로 수용가능한 운반체들; 그리고 개체에게 투여하기 위한 장치 및 기타 재료들.
항체의 다양한 조합들이 함께 포장될 수 있다. 가령, 키트는 독소 A에 결합하는 항체와 독소 B에 결합하는 항체(가령, 단일클론 항-독소 B 항체, 또는 독소 B와 반응성의 다중클론 항혈청)를 포함할 수 있다. 이 항체는 함께 혼합될 수 있거나, 키트 내에서 별도로 포장될 수 있다.
사용 지침은 가령, CDAD 증상을 가진 환자에게 제안된 용량 및/또는 투여 방식을 포함하는 치료적 적용을 위한 지침을 포함할 수 있다. 기타 지침은 라벨 또는 치료제에 이 항체를 결합시키는 지침, 또는 가령, 반응안된 접합 성분들로부터 접합된 항체의 정제를 위한 지침을 포함할 수 있다.
이 키트는 항-독소 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 적어도 하나의 핵산 그리고 이 핵산의 발현을 위한 지침을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이 키트의 다른 가능한 성분들은 발현 벡터 및 세포를 포함한다.
본 항체, 이의 항원-결합 부분, 조성물 그리고 방법은 모든 척추동물, 가령, 인간, 생쥐, 랫트, 기니아피그, 헴스터, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 원숭이, 유인원, 고릴라, 침팬지, 토끼, 오리, 닭, 양서류, 파충류 및 기타 동물을 포함하는 포유류 및 비-포유류에 이용될 수 있다. 본 발명을 실시하기 위한 특정 측면들의 다음 예들은 오직 설명을 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로던 제한시키고자 하는 의도는 없다.
실시예들
실시예 1: 하이브리도마 융합
전통적인 하이브리도마 융합이 실행되었다. 생쥐는 Complete Freund's Adjuvant(CFA)를 이용하여 톡소이드 A로 우선 면역주사를 맞고, 28일 및 48일차에 톡소이드 A와 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA)로 2차례 후속 부스터를 맞았다. 55일차에 시험적 채혈이 실시되었고, 혈청을 검사하여 항-톡소이드 A 항체의 역가를 점검하였다. IgG 역가가 충분히 높다면 융합을 실행하였다. 그렇지 않다면, 생쥐에게 IFA와 함께 두 차례 더 부스터가 제공되었고, 두 번째 시험 채혈을 하였다. 융합은 한 번에 2마리 생쥐를 이용하여 실시되었다. 융합 3일 전 생쥐에게 PBS내 톡소이드 A를 복막(i.p)으로 최종 공격하였다.
융합 당일, 생쥐를 희생시키고, 이들의 비장을 제거하였다. 주사기 및 바늘을 이용하여 비장으로부터 비장세포들을 세척하였고, 골수종 세포와의 융합을 위하여 50ml 튜브에 수집하였다. 골수종은 융합 짝으로 이용되는 불사화 종양 세포계통이며, 구출 경로를 차단하는 독성 뉴클레오티드 유사체인 8-아자구아닌 존재하여 성장된다. 8-아자 존재하에 성장된 세포는 하이포산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT) 유전자에서 결함성 돌연변이의 발생에 의해서만 생존한다. B 세포는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1500을 이용하여 골수종 세포와 융합된다. 융합된 세포는 약물 선별과 함께 반-고형 아가로즈 상에서 혼합되고, 배양접시에 도말된다. 하이포산틴, 아미노프테린, 그리고 티미딘을 포함하는 HAT 배지가 약물 선별에 이용된다. 아미노프테린은 HGPRT에서 골수종 계통 결함에서 생존/세포 성장에 절대적으로 요구되는 뉴클레오티드 대사를 위하여 신생(de novo) 경로를 저해하는 약물이며, 24-48시간 이내에 보통 선별된다.
실시예 2: 하이브리도마 스크리닝
그 다음 단계는 성장하는 하이브리도마의 스크리닝이다. 시판되는 반고체 아가로즈로, 이는 3-D 매트릭스에서 세포가 "공모양의(ball)"세포로 성장하는데 이용된다. 이는 이들 공을 손으로(시각적 검사에 의해)으로 집어올리고, 이들 클론성 공을 적합한 배지를 포함하는 96 웰 플레이트로 옮기는데 용이하다. 이 세포들은 3-7일간 성장되며, 그 다음 상층액은 스크리닝을 위하여 제거되고, 새로운 배지로 대체된다. ELISA(또는 다른 검사)에서 양성 결합(positive binding)은 하이브리도마를 용적이 증가된 더 큰 조직 배양 용기로 이동시킴으로써, 이 하이브리도마의 성장이 지속되게 되었다. 소비된 상층액을 이용하여 뮤린 mAb들에 대하여 적합한 시판 아이소타이핑(isotyping) 키트를 이용하여 mAb들의 아이소타입이 결정되었다. 클론을 선별의 다음 단계로 이동의 판단은 ELISA 및 적어도 1/8 또는 1/16 또는 그 이상의 반응성 뿐만 아니라, IgG 분류에 일반적으로 근거하는 이의 생존을 이용하여 고유 독소 A에 대한 이의 반응성에 근거된다; 따라서 클론의 수는 선별 과정을 통하여 감소되었다. 추가 특징화를 거치는 mAb는 다음과 같다: CAN20G2, CAN20G1, CAN20G5 & CAN20G8 및 CAN19G1, CAN19G2, CAN19G3.
실시예 3: 생쥐 단일클론 항체의 ELISA 검정
전체 독소 A 및 재조합 독소 A 단편 4에 대항하는 toxA mAb들의 결합을 검사하고, 뿐만 아니라 전체 독소 B 및 독소 B 단편 4에 대하여 교차-반응성이 있는지를 결정하는데 ELISA가 이용되었다. mAb 클론은 CDA1(대조으로 이용된 Merck 항-독소 A mAb)에 비교되었다. ELISA 플레이트는 100 μg/ml의 독소 단편 4 및 400 μg/ml의 전체 독소로 피독되어, 코팅은 등몰(equimolar)로 되었다. 웰들은 1% 탈지유로 차단되고, 연속적으로 희석된 CAN19 또는 CAN20 mAb(0.1 μg/ml 내지 1 μg/ml)으로 탐침되고, 결합은 시판되는 염소 항-생쥐 IgG-HRP 항체로 탐지되었다. 음성 및 양성 대조 또한 실행되었다. 키메라 인간 mAb 13C6은 에볼라바이러스(Ebolavirus) GP에 특이적이며, 인간 CDA-1의 Fc에 대해 음성 대조으로 삼았다. 그러나, CDA-1 mAb 및 다중클론 톡소이드 A 항체(pAb)는 양성 대조으로 삼았고, CDA-1 mAb은 인간이며, 다중클론은 토끼이기 때문에, 따라서, 이들은 상이한 2차 항체를 모두 이용하여 이들과 뮤린 mAb들간에 직접적인 비교는 불가능하다. 2차 항체 대조은 뮤린 2차 항체용이다. 기질과 함께 60분간 배양 후, 플레이트는 405nm에서 판독되었다. 각 항체에 대한 역가 데이터는 도 1에 나타낸다.
결과: 도 2 및 3에서 나타낸 것과 같이, CAN19G1 및 CAN19G2 mAb들은 CDA1에 유사한 수준으로 전체 독소 A 및 독소 A 단편 4에 결합한다. CAN19 mAb들은 독소 B에 대해 교차-반응성을 거의 나타내지 않았다. CAN20 mAb들은 독소 A에 결합한다. CAN20G2 및 CAN20G5는 CDA1에 유사한 수준에서 독소 A 단편 4에 결합한다. CAN20 mAb들중 어느 것도 독소 B에 교차-반응성을 보이지 않았다.
실시예 4: 생쥐 단일클론 항체의 웨스턴 블롯
클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 단백질; 전체 독소 A, 톡소이드 A(시판용), 재조합 독소 단편 4 및 독소 B(전체, 톡소이드 및 단편 4)의 조합은 200볼트에서, 1.5시간 동안 4-12% SDS-PAGE 겔에서 이동되었다. 그 다음 겔은 45 볼트에서 45분 동안 니트로셀룰로오즈 막으로 이동되었다. 이 막은 1 x TBST에서 1% 탈지유로 4℃에서 하룻밤동안 차단되었고, 다음날, 1 x TBST로 세척되어 탈지유가 제거되었다. mAbs(1° Ab)는 1㎍/ml의 농도로 1 x TBST에서 희석되었고, 교반기상에서 실온(RT)에서 2시간 동안 이동된 산물들을 포함하는 막을 탐침시키는데 이용되었다. 그 다음 막들은 1 x TBST로 세척되어, 결합안된 1°Ab가 제거되었고, 교반기 상에서 RT, 1시간 동안 1 :4000 희석으로 항-생쥐 IgG-HRP(2° Ab)로 탐침되었다.
결과: 도 4 및 5에서 나타낸 것과 같이, 3가지 CAN19 mAb들 모두는 전체 독소 A, 톡소이드 A 및 독소 A 단편 4에 결합하는 것으로 나타났다. 이들 모두는 독소 B 또는 음성 대조에 단지 약한 교차-반응성을 보이거나 또는 교차 반응성을 보이지 않았다. CAN20G1, CAN20G2, CAN20G5 및 CAN20G8 mAb들은 모두 전체 독소 A 및 독소 A 단편 4에 강력한 결합을 나타내었다. 독소 B 또는 음성 대조에 대한 교차-반응성은 없었다.
실시예 5: 생쥐 단일클론 항체의 친화력 분석
전체 독소 A와 항-독소 A 항체 간에 상호작용의 측정에 이중층 간섭측정(Biolayer interferometry)이 이용되었다. Octet QKe 장비(ForteBio)는 스트렙타비딘(SA) 바이오센서가 구비되어있다. 40μg/ml의 비오틴화된 전체 독소 A는 SA 센서에 결합되며, 100 nM 내지 1.56 nM로 연속 희석된 독소 A mAb들은 10분간 독소-코팅된 핀에서 반응되고, 이어서 PBS에서 해리 단계가 다시 10분간 이어졌다. 그 다음 이 결과는 ForteBio Data Analysis 소프트웨어를 이용하여 분석되어 해리 상수(KD)가 결정되는데, 이 상수는 항체와 항원 간에 결합 강도, 항체 항원 복합체가 형성되는 결합 속도(on-rate), kon(1/Ms), 항체 항원 복합체들의 분리되는 해리 속도(off-rate), kdis(1/s)를 설명하는데 이용되는 척도이다. 표 4는 정제된 CAN20G 형태들 뿐만 아니라 CDA1dp 대한 친화력 데이터를 나타낸다.
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실시예 6: 생쥐 단일클론 항체의 에피토프 바이닝(binning)
Octet QKe는 이중층 간섭측정을 통하여 생체분자 상호작용을 탐지하는 1회용 광섬유 센서를 이용하는 라벨-없는 실시간 바이오센서다. 에피토프 바이닝 검정은 본 독소 A mAb들이 CDA-1과 유사한 또는 상이한 에피토프를 공유하는지를 검사하기 위하여 이미 특징화된 CDA1 항-독소 A mAb에 대항하여 실행되었다. 둘째로, 이 검정을 이용하여 독소 A mAb들 간에 단일 또는 잠재적으로 다중 에피토프 빈(bin)이 공유되는지가 확인되었다. 전통적인 샌드위치 방법이 이용되며, 이는 센서, 결합 항원에 mAb의 연결, 및 그 다음 또다른 mAb에 결합에 관련된다. 두 번째 mAb는 이의 에피토프가 고정된 mAb의 에피토프와 중첩되지 않는 경우에만 포획된 Ag에 결합할 수 있다.
결과: CAN20G1 및 PBS 대조 이상의 파장으로 강력한 nM 이동(결합 곡선에서 수직 증가)은 더 많은 결합이 일어날 수 있고, 검사 항체는 노출된 다른 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 6a 및 6b에 나타낸 것과 같이, CDA1 항체의 경우 파장의 높은 이동이 있음을 이 결과들은 나타낸다. 이것은 CDA1 및 CAN20 mAb들은 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 모든 CAN20 mAb들은 동일한 에피토프를 공유한다. CAN20G2의 경우 약간의 nm 상승이 있고, 이는 결합에서 약간의 증가를 나타내는데, 이것은 CAN20G1과 CAN20G2의 공지의, 상이한 항체 에피토프 또는 이둘 모두의 공지의 VH와 VL 사슬 간에 체세포 돌연변이 때문일 것이다.
실시예 7: 생쥐 단일클론 항체의 시험관내 중화
본원에서 설명된 시험관내 중화 검정은 List Biological Laboratories로부터 구입한 VERO(사바나 원숭이) 세포 및 독소 A를 이용하여 실행되었다. (BIAD 보고서: 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile) 독소 A 단일클론 항체 특징). xCelligence(Roche Diagnostics) 및 Bioassy 방법에 이용된 프로토콜은 아래에 요약된다.
세포 부착 단계 - xCelligence 방법. (1) 원천 플라스크내 세포는 트립신처리된다. (2) 2 mL의 트립신이 플라스크에 추가되었고, 세포를 세척하여 배지 잔량을 제거하고, 그 다음 흡출한다. (3) 3 mL의 트립신이 추가되었고, 세포들이 떨어질 때까지 약 10분간 37℃에서 배양되었다. (4) 6 mL의 검정(assay) 배지 또는 성장 배지가 플라스크에 추가되었다. (4) 1300 rpm에서 8분간 원심분리되었다. (5) 상층액이 흡출되었고, 세포는 6 mL의 검정 배지 또는 성장 배지로 재현탁되었다. (6) 세포가 카운트되고, 요구되는 세포 밀도가 산출되었다(Vero 세포의 경우, 1x 105 세포/mL, T84 세포의 경우, 8 x 105 세포/mL.) (7) 96 웰 E-플레이트에 100 μL의 검정 배지를 웰 A1 부터 H10에 추가하였고, 100μL의 T84 배지를 웰 A11부터 H12에 추가하였다. (8) xCelligence에서 배경 판독이 실행되었다. (9) 웰 A1 - H10으로부터 50μL의 검정 배지를 빼내었다. (10) 50 μL의 1.0 x 105 세포/mL 현탁액을 이들 웰에 최종 접종 밀도가 5.0 x 104 세포/mL이 되도록 추가되었다. (11) 100 μL의 T84 8xl0 5 세포/mL 세포 현탁액을 A11과 A12가 추가하였다. (12) H11 및 H12를 통하여 연속으로 2-배 하향 희석시켰다(13) H11 및 H12로부터 100μL를 빼내었다. (14) 100μL의 T84 배지를 A11 H12에 최종 용적이 200μL 이 되도록 추가되었다. (15) 세포들이 고르게 가라앉도록 20-30분 동안 실온에서 플레이트를 배양하였다. (16) 5% CO2 덧층과 함께 37℃ 배양기에 20 - 24시간 동안 플레이트를 두었다.
세포 부착 상태 - Bioassy 방법. (1) 원천 플라스크 내에 세포는 트립신처리되었다. (2) 원천 플라스크로부터 세포를 모았다. (3) 1270 RPM에서 8분 동안 세포를 원심분리하였다. (4) 상층액을 제거하였고, 검정 배지에서 세포를 재현탁하였다. (5) 모아진 모든 플라스크에 6mL의 배지가 이용되어야 한다. (6) 세포를 카운트하여, 세포 생존력과 1.0 x 105 세포/mL에서 플레이트에 요구되는 세포의 양을 결정하였다. (7) 도말되었을 때 최종 농도는 0.5 x 105 세포/mL이었다. (8) 96 웰 블랙 바닥-투명한 마이크로플레이트의 웰 B2-G11에 50 μL의 10% 검정 배지를 추가하였다. (9) 96 웰 블랙 바닥-투명한 마이크로플레이트의 웰 B2-G11에 50 μL의 세포를 덮었다. (10) 바깥 모서리 웰에는 100 μL의 따뜻한 검정 배지를 추가하였다. (11) 균질한 현탁액을 만들기 위하여 플레이트 교반기 상에서 혼합하였다. (12) 세포들이 웰에 고르게 가라앉도록 하기 위하여 20 - 30분 동안 실온에 플레이트를 두었다. (13) 37℃, 5% C02가습화된 배양지에 세포 플레이트를 20-24시간 동안 두었다.
독소 A 준비: (1) 100 μL의 멸균된 LW를 독소 A의 한 개 바이알(2.0 μg)에 추가하여, 독소 A의 제 1 비축물(20 μg/mL)이 준비되었다. (2) 표 5에 나타낸 것과 같은 제 2 비축물을 희석하였다.
Figure pct00023
샘플 준비: 효능을 검사하기 위하여, 모든 단일클론 항체의 출발 농도는 30 μg/mL이었다. 표 6에 나타낸 것과 같이 샘플이 준비되었다.
Figure pct00024
희석 플레이트 준비-xCelligence: (1) 표 7에서 나타낸 것과 같이 검정 배지 및 150 μL의 샘플을 웰에 추가하였다. (2) A 줄로부터 75 μL를 취하여 B 줄에 추가하고, 3 내지 5회 혼합시켜, 각 샘플은 세로로 2-배 하향 희석시키고, 이를 G 줄까지 반복하였다. (3) 표 5에 나타낸 것과 같이 웰에 적절한 대조을 추가하였다. (4) 75μL의 독소를 샘플 웰에 적층시켰다. 균질해질때까지 플레이트 교반기에서 교반시켰다. (5) 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
Figure pct00025
Bioassy 방법: 표 8에 나타낸 것과 같이 웰에 검정 배지를 추가하였다.
(1) 150μL의 샘플을 컬럼 2의 적절한 웰로 추가한다. 플레이트 #1에는 CDA, CAN19G1(정제된), 및 CAN19G1 상층액을 추가한다. 플레이트 #2에는 CDA, 정제된 CAN19G2, 및 CAN19G2 상층액을 추가한다. 플레이트 #3에는 CDA, 정제된 CAN19G3, 그리고 CAN19G3 상층액을 추가한다. (2) 컬럼 2로부터 75μL를 컬럼 3으로 옮겼다. 다중 채널로 혼합되었다. 컬럼 9까지 이 과정이 반복된다. (3) 컬럼 10에서 75μL를 빼내어 최종 용적이 100 μL되게 한다. (4) 75 μL의 AM과 함께 대조(75μL)를 적절한 웰에 추가하였다. (5) 75 μL의 독소 A를 샘플 웰에 적층하였다.
Figure pct00026
세포 플레이트에 샘플 추가: (1) 1 시간 배양 후, 세포 플레이트를 배양기로부터 제거하였다. (2) 세포 단층이 교란되지 않도록 다중 채널 피펫으로 세포 현탁액 50μL를 빼내었다. (3) 희석 플레이트로부터 100μL의 샘플을 세포 플레이트의 적절한 웰로 이동시켰다. (4) 균질한 용액을 위하여 플레이트 교반기 상에서 혼합하였다. 5% C02 덧층과 함께 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.
데이터 분석: xCelligence 시스템은 실시간으로 데이터를 캡쳐한다. 통상적인 생물분석 방법과 비교를 목적으로, 최종 판독 시간 데이터를 분석한다. 이를 위하여, 독소/항체를 플레이트에 추가하기에 앞서 기선으로 적절한 독소 웰을 이용하여 이 시점에서 세포 색인을 표준화시켰다. 이것은 항체의 로그 농도에 대하여 Y 축상에 기선 표준화된 세포 색인을 생성할 것이다. 우리는 CDA와 비교를 위하여 CAN19 mAb의 효능을 결정하기 위하여 데이터를 분석하였다. 중화 %는 xCelligence와 함께 다음과 같이 산출된다:
중화 % = (샘플 CI 색인/항체 대조 CI 색인) * 100
중화 %는 Bioassay 형광과 함께 다음과 같이 산출된다:
중화 %= (평균 샘플 RFU/평균 독소 RFU)/(평균 세포 RFU/평균 독소 RFU)* 100
본 실시예의 과정은 또한 CAN20 mAb에서 실행되었다.
결과: CAN19 mAb들은 CDA1보다는 중성이 덜하였다. CAN20G2는 시험관내에서 가장 강력한 mAb이었고, CDA1보다 더 강력하다. CAN20G3, G5 및 G8 또한 중성이다.
표 9는 각 CAN19 mAb에서 생성된 IC50데이터를 요약하는데, CAN19 클론들이 CDA1과 비교하여 중성이 덜함을 설명한다.
Figure pct00027
표 10은 각 CAN20 mAb에 대하여 생성된 EC50 데이터를 요약하는데, CAN20G2, CAN20G3, CAN20G5, 및 CAN20G8은 가장 중립적인 클론임을 설명한다.
Figure pct00028
실시예 8: 생쥐 생체내 독소 공격
생쥐 생체내 독소 공격 검사는 기존의 공개내용을 바탕으로 하였다(Babcock et al., Human Monoclonal Antibodies Directed against Toxins A and B prevent Clostridium difficile-Induced Mortality in Hamsters. Infection and Immunity (2006) 74(11):6339). 20-30g의 무게가 나가는 스위스 웹스터(webster) 생쥐에게 250 μg의 mAb 또는 대조을 0일 시점에 제공하였고, 휴식을 하도록 하였다. 24 시간(1일 차) 후, 이 생쥐들에게 치사 투여량의 TcdA (100 ng)를 제공하였다. 이 투여량은 보호받지 않은 상태에서 24시간 이내에 동물의 90-100%를 폐사시킨다. 이 생쥐들은 비정상적 징후들과 국소 및 전신 질환에 대하여 7일간(1일 시점에서 7일차 시점까지) 관찰되었다. 이 생쥐들은 7일차에 마취되었다. 모든 관찰은 기록되었고, 각 치료 집단에서 생존%이 결정되었다.
결과: 도 7, 8, 및 9에서 나타낸 것과 같이, CAN19 및 CAN20 mAb들은 독소 A로부터 생쥐를 보호한 것을 결과에서 나타낸다. 3가지 CAN19 mAb들 모두 효능을 보였다. 모든 CAN20 mAb들은 효과적이었다. CAN20G1, G2, G5 및 G8은 생쥐 한 마리당 0.25 mg의 투여량에서 100% 보호 효과를 나타내었다. CAN20G2는 생쥐 한 마리당 0.125 mg에서 100% 보호 효과를 나타내었다. 이 실험은 CAN20G2의 효능을 확인하기 위하여 반복되었다. 결과들은 이전 연구를 입증하였다. CAN20G2는 생쥐 한 마리당 0.25 mg의 전체 투약량에서 100% 보호 효과를 나타내었고, 생쥐 한 마리당 절반 투여량 0.125 mg 에서 90% 보호 효과를 나타내었다.
실시예 9: muCAN20G2 V 유전자 시퀀싱
CAN20G2 부모 하이브리도마 클론 세포 계통으로부터 RNeasy Mini Kit를 이용하여 RNA를 단리하였다. Qiagen OneStep RT-PCR Kit를 이용하여 RNA로부터 V 유전자의 증폭을 실행하였다. 다음과 같이 몇 가지 프라이머 세트 조합이 이용되었다: 이 하이브리도마로부터 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열 확인을 위하여, 가변 영역 유전자(V-유전자) 하위집단-특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 이용된다. 5'mVK-Lead-l, 3'KappaConstRT, 5'mVH-Lead-2, 5'mVH-Lead-2A, alc 3'mIG1-2CRT를 포함한다. 공지의 그리고 내생성 비정상적카파 경쇄 V-유전자 mRNA(P3X63 골수종에서 발견되는)(Yuan, X. et al, J. Immunol. Methods, 294: 199-207 (2004))로부터 잠재적 오염을 배제하기 위하여, 비-하위집단 특정 프라이머 세트, 5'mVK-Lead-lA, 5'mVK-Lead-lA, 5'mVK-Lead-3, 5'mVK-Lead-3A, 5'mVH-IGHVl-Lead, 5'mVH- Lead-1, 5'mVH-Lead-3, 5'mVH-Lead-4, 및 5'mVH-Lead-5를 이용하여 RT-PCR이 또한 실행되었다. 프라이머 목록 및 이들의 서열은 도 10을 참고한다. PCR 증폭 반응의 결과는 분석용 아가로즈 겔에서 PCR 생성물을 검사하여 결정되었으며, 대략 500bp에서 가시화된 밴드는 클로닝을 위하여 겔 분리되었다. 추출된 DNA는 TOPO TA Cloning 매뉴얼에서 저용융 아가로즈 방법을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터 안으로 직접적으로 TA 클론되었다. 각 CAN20G 클론 반응의 5개 콜로니는 M13 전방 및 M13 역 프라이머를 이용하여 두 방향 모두로 서열화되었다. DNAStar Lasergene 소프트웨어를 이용하여 서열 데이터가 분석되었다. 생성된 재배열된 V-유전자 서열은 IMGT/V-Quest 참고 목록 세트와 NCBI 면역글로불린 블라스트(blast) 조사와 비교되었다(도 11).
실시예 10: muCAN20G2 의 인간화
CAN20G2 mAb의 3가지 인간화 IgG/k 버전 뿐만 아니라 키메라 IgGl/k가 생성되었다. 인간화 버전의 경우, 수용자 프레임워크의 식별을 돕기 위하여 인간 생식계열 대립유전자과의 최대 동일성 배열(IMGT 및 NCBI 웹사이트로부터)을 이용하였다. 6개의 CDR 모두 삽입되었다. 표면 노출 또는 폴딩 또는 사슬간 접촉에 관련으로 인하여 다른 잔기들은 변화되거나 유지되었다. 뮤린 mAb 서열(CAN20G2)의 CDR들은 가장 근접한 인간 대립유전자의 생식계열 CDR들과 매우 잘 대합된다. 이는 전체 프레임워크보다는 CDR 대합(matching)이 생식계열 서열의 다양한 용도에 수용자 프레임워크로 이용된 "초인간화(superhumanization)" 방법을 닮는다. Tan et al., J. Immunol. 2002, 169: 1119-1125의 경우, 이 저자는 CDR 서열을 이용하여 Chothia 분류 체계에 근거하여 CDR들의 소위 정통적 분류를 대합시키는 시도를 하였다. 그러나, 특정 CDR들은 생식계열 인코드된, 그리고 특정 프레임워크에서 발견되는 경향이 있는 특정 전통적 구조이기 때문에, 수용자 프레임워크를 선택하는 "초인간화" 방법은 모든 경우에서 상이한 후보 수용자 프레임워크를 선택하지 못한다. 이는 실증적이며 다중mAb 특이적에 대해 검사가 남아있다. 이는 부분적으로 동일성에 대한 프레임워크의 직선적 배열은 비교를 위하여 CDR들을 포함하기 때문이기도 하다. 표 11은 CAN20G2의 각 인간화 구조의 아미노산 수준에서 인간화 비율을 나타낸다.
Figure pct00029
도 12는 muCAN20G2 v-영역과 가장 근접한 인간 생식계열 v-영역과의 배열을 나타낸다. 이 인간 생식계열들은 인간화를 위한 수용자 프레임워크로 이용되었다.
오직 CDR 접목된(Grafted)-CDR-huCAN20G2. VH 및 Vk에 대한 최고의 대합 생식계열 대립유전자은 CDR들의 접목을 위한 수용자 프레임워크로 이용되었다. 수용자 프레임워크에 다른 변화는 만들지 않았다. 도 13a 및 13b는 우리가 이용한 CDR-huCAN20G2 설계를 보여준다. 가장 근접한 대합 인간 프레임워크는 IGHV7-4-1 *02 및 IGKV 1-39*01이다. muCAN20G2의 CDR(IMGT 넘버링)들을 인간 프레임워크로 삽입시켰다. 중쇄 CDR3은 pcDNA3002Neo로의 클로닝을 위하여 변형된 HpaI 제한 부위를 포함하였다. 정확한 해독 및 트래피킹(trafficking)을 위하여 5' Kozak 및 HAVT20 선도 서열이 추가되었다.
HE-huCAN20G2 "인간 공작된" 이 인간화 버전은 Studnicka et al (1994)가 CD5에 대한 뮤린 mAb를 인간화시키는데 이용한 "인간 공작화(human engineering)" 전략과 대부분 유사한 전략을 이용하여 만들었다. 기본적으로 CAN20G2 VH 및 Vk에 대한 가장 근접한 인간 생식계열 대립유전자이 각각 확인되었고, 수용자 프레임워크로 사용하기 위하여 설계되었다. CAN20G2 VH 는 인간 IgVH7-4-l *02 대립유전자과 76% 동일성을 보유한다. CDR들은 CAN20G2 mAb 서열에 대합되도록 접목 또는 변형되었다. HE-hCAN20G2 항체는 도 14, 15, 및 16에 나타낸다. 범례에 설명된 것과 같이 일부 잔기들은 변형 또는 유지되었다. 이 경우, 아바스틴/베바시쿠마브(Avastin/Bevacizumab)로부터 결정 구조를 취하였다. 아바스틴은 맥관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)를 인지하고 이를 차단시키는 인간화 단일클론 항체이며 진행된 결장직장암의 치료를 위하여 시판된다. 아바스틴은 CAN20G2 VH와 동일한 인간 생식계열 유전자와 최대 동일성을 보유하는 것으로 밝혀졌고, 이의 가변 영역 구조의 결정 구조가 측정되었다.
AVA-huCAN20G2 "아바스틴화된(Avastinized)" - 아바스틴 VH 및 VK/JK 대립유전자의 해독을 각 인간화 CAN20G2 VH 및 VK 면역글로불린 가변 영역과 배열한 것은 도 17에 나타낸다. 많은 mAb들은 결정 구조 데이터와 함께 다른 mAb들에서 발견되는 VH 및 VL 천연 서열 쌍에 이용되도록 인간화되었다. 이 경우에, 우리는 버전 1 - HE(아바스틴 VH와 높은 동일성을 보유하는)와 동일한 VH를 이용하였고, 아바스틴 Vk는 경쇄 수용자 프레임워크로 이용하였다. 이로써 우리 설계에서 공지의 쇄간 구조체와 변형을 활용할 수 있었다(도 18).
키메라-huCAN20G2 키메라 버젼: 키메라 CAN20G2는 대조으로 설계되었다. CDR 밖의 특정 잔기들이 초가변 영역의 구조에 관련된다. 인간화 공정 동안, 일부 잔기가 변형될 수 있다. 정통적 구조내 서열 변이들이 파라토프(paratope)의 형태를 조절할 수 있기 때문에, 친화력/기능/중화의 상실/획득이 인간화 공정 또는 인간 Fc 영역때문인지를 결정하는 것이 필수적이다. CAN20G2 뮤린 v-영역은 인간 IgG1 및 인간 카파 불변 영역 상에 설계되었다. 이 구조체는 Kozak, HAVT20 선도 및 이중 중단 서열을 포함한다(도 19a 및 19b).
실시예 11: 인간화 항체의 SDS Page 및 웨스턴 블롯 분석
각 huCAN20G2 mAb를 대량 획득하기 위하여 HEK293F 세포에서 대규모 형질감염(300ml)이 실행되었다. 총 3x108 세포에 300 μg의 huCAN20G2 플라스미드 DNA를 형질감염시켰다. 상층액은 형질감염 후 3일차와 7일차에 원심분리(3000 rpm, 15분, RT)에 의해 수거되었다. 형질감염된 상층액은 0.22 μm 필터를 통하여 여과되었다. 여과된 상층액은 단백질 G 컬럼에서(HiTRAP HP, GE Healthcare) AktaPurifier FPLC를 이용하여 정제되었다. 용리된 단백질은 D-PBS로 완충액 교환되고, 이 농도는 BCA 검정에 의해 결정되었다. 300 ml 배양물로부터 30-45mg 범위가 정제되었다. 정제된 단백질은 이 크기 확인을 위하여 SDS-page 상에서 이동되었다(도 22). 정제된 mAb는 mAb들의 결합 특징들을 확인하기 위하여 전체 독소 A 및 독소 A 단편 4로 막을 탐침시키는데 또한 이용되었다(도 23).
실시예 12: 인간화된 항체의 시험관내 중화 검정
CT-26 세포를 이용하여 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소의 시험관내 중화 검정을 실시하여 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 대한 인간화된 mAb 클론의 정화 능력을 검사하였다. CT-26 세포들은 96 웰 플레이트에 2.5-3xl04 세포/1OOul/웰의 농도로 접종되었고, 플레이트는 37℃에서 4-5 시간 동안 C02 배양기에서 배양되었다. 오직 배지(세포 없음)만을 포함하는 2개의 빈 웰이 플레이트에 또한 포함되었다.
독소 및 독소/Ab 혼합물들이 튜브에서 준비되었고, RPMI 배지를 이용하여 원하는 농도로 희석되었다. 튜브는 1시간 동안 실온에서 배양되도록 방치되었다. 이 배지는 플레이트의 웰로부터 제거되고, 배지 단독, 독소 단독 또는 독소/Ab 혼합물을 포함하는 각 튜브는 이의 지정된 웰로 이동되었다. 37℃, 5% C02 .에서 48시간 동안 배양되도록 플레이트를 두었다. WST-1 탐지 시약이 각 웰에 추가되었고(웰에서 10 μL의 시약/100 μL 용적) 37℃ 및 5% C02에서 1시간동안 배양되었다. 플레이트는 1분간 교반시키고, 450 nm에서 판독되었다.
세포 생존능은 다음과 같이 세포 대조에 근거하여 결정되었다:
세포 생존능 % = 검사의 평균 OD/세포 대조의 평균 OD x 100.
독소 중화는 하기와 같이 다음 식에 의해 산출된다:
중화 % = (샘플 OD - 독소 대조 OD)/(세포 대조 OD - 독소 대조 OD)* 100
결과: 도 20a 및 20b에 나타낸 것과 같이, 키메라 CAN20G2 및 HE-CAN20G2는 모든 mAb 농도에서 가장 중성이었다. HE-CAN20G2는 독소 A 농도에서 대부분의 mAb 동도에서 더 중성이다. Medarex CDA IgG 및 hCDR mAb들은 유사한 적당한 중화 능력을 보여주었고, AVA-CAN20G2는 매우 적은 중화 능력을 보여준다.
실시예 13: 인간화 항체의 친화력 검정
이중층 간섭측정을 이용하여 전체 독소 A와 인간화 CAN20G2 항체 사이의 상호작용을 측정하였다. Octet QKe 기구는 스트렙타비딘(SA) 바이오센서를 갖추고 있었다. 40 μg/ml의 비오틴화된 전체 독소 A는 SA 센서에 연결되었고, 100n 내지 1.56nM 범위로 희석된 인간화 버전은 10분 동안 독소와 연합되도록 하고, 그 다음 10분간 PBS에서 해리 단계를 거쳤다. ForteBio Data Analysis 소프트웨어를 이용하여 결과가 분석되어 KD(nM)가 결정되는데, 이 상수는 항체와 항원 간에 결합 강도, 항체 항원 복합체가 형성되는 속도, kon(1/Ms), 항체 항원 복합체들의 분리되는 속도, kdis(1/s)를 설명하는데 이용되는 척도이다.
결과: 두 실험의 결과를 평균하고, muCAN20G2 및 chCAN20G2는 3배 이내에 있는데, 이는 친화력의 상실이 없음을 나타낸다(표 10). 대조적으로, AVA-CAN20G2는 친화력의 거의 완전한 로그 상실을 보여주었다. CDR-huCAN20G2는 AVA 인간화 버전의 것과 근접한 친화력 상실을 보여주었다. HE-huCAN20G2 버전의 결합 친화력은 다른 모든 인간화 버전보다 약간 더 높았지만, 수용가능한 3배 범위내에 있어, 키메라 CAN20G2와 비교하였을 때 친화력 상실이 없거나 또는 거의 없음을 보여준다. 우리는 뮤린 IgG2a 불변 영역을 인간 불변 영역으로 교환시키는 효과를 예측할 수 없기 때문에 이것이 최상의 비교자이며, 이 비교는 이를 고려해야 한다고 믿는다. 3배 범위 비교는 ForteBio 전문가들에 따르면, 무의미한 변화로 간주된다.
Figure pct00030
실시예 14: 인간화 항체의 ELISA 검사
huCAN20G2 mAb의 발현을 검사하기 위하여 HEK293F 세포에서 중간 규모(150ml)의 형질감염이 실행되었다. 총 1.5x108 세포에 150 μg의 DNA를 형질감염시켰다. 상층액은 형질감염 후 3일차와 7일차에 원심분리(3000 rpm, 15분, RT)에 의해 수거되었다. 형질감염된 상층액은 0.22 μm 필터를 통하여 여과되었다. 중간 규모 형질감염으로부터 여과된 상층액은 정제에 앞서 ELISA로 스크리닝되었다. ELISA가 실행되어 전체 독소 A 및 독소 A 단편 4에 대한 인간 mAb 클론의 결합이 검사되었다. 인간 mAb 클론은 CDA1 및 키메라 CAN20G2와 비교되었다. ELISA 플레이트는 100 μg/ml의 독소 A 단편 4 및 400 μg/ml의 전체 독소 A로 코팅되어, 코팅은 등몰(equimolar)로 되었다. 코팅은 연속적으로 희석된 mAb(0.128 ng/ml 내지 10 μg/ml)로 탐침되었고, 항-인간 IgG-HRP 항체와의 결합이 탐지되었다. 기질과 60 분 배양 이후 405nm에서 플레이트를 판독하였다.
결과: 도 21a 내지 도 21d에 나타낸 것과 같이, mAb CAN20G2의 3가지 인간화 버전 모두, 또한 키메라 버전은 ELISA에서 유사한 강도로 전체 독소 A에 결합한다. 대조적으로, 부모 CAN20G2가 정하고 결합하는 TcdA 도메인인, 재조합 독소 A 단편 4에 인간화 mAb들의 결합에는 명백한 차이가 있다. 이것은 단편 4에 대한 이의 결합이 시험관내 및 생체내 보호와 관련있다는 상관관계를 나타낼 수 있고, CAN20G2 효능의 대용물로써 도메인 4 검정의 개발이 허용될 수 있다. 키메라 및 HE mAb들은 유사하게 결합하는 것으로 보이며, CDR mAb는 더 적은 정도로 결합하며, AVA mAb는 독소 A 단편 4에 결합하지 않는 것으로 보인다.
실시예 15: Tcd A로 생체내 공격
시험관내 데이터에 근거하여, CAN20G2의 CDR 및 HE 인간화 버전은 생체내에서 검사되었으며, 생쥐 치사 독소 공격 모델에서 키메라 버전과 비교되었다(상기 실시예 8에서 기재된 것과 같이). 20-30g의 무게가 나가는 스위스 웹스터(webster) 생쥐에게 250 μg의 mAb 또는 대조을 0일 시점에 제공하였고, 휴식을 하도록 하였다. 24 시간 후, 이 생쥐들에게 치사 투여량의 TcdA(100 ng)를 제공하였다. 이 투여량은 보호받지 않은 상태에서 24시간 이내에 동물의 100%를 폐사시킨다. 생쥐는 임상적 징후, 이상 및 국소 및 전신 질환에 대해 4일간 관찰되었다. 모든 관찰은 기록되었고, 표 13에 요약된 결과는 HE 및 CDR 버전을 포함하는 검사된 모든 항체는 독소 A를 중화시키는데 유효하며, 독소 A 공격으로부터 보호한다는 것을 보여준다.
Figure pct00031
실시예 16: 인간화 항체의 면역원성 분석
CDR-huCAN20G2 및 HE-huCAN20G2의 면역원성을 결정하기 위하여, 이들은 T 세포 활성화를 측정하기 위한 두 개의 표식(증식 및 IL-2 생산)을 이용하여 EpiScreen™(Antitope Ltd) 시간 과정 T 세포 검정에서 검사되었다. 특이적으로, HLA(인간 백혈구 항원) 알로타입(allotypes)을 나타내는 21명의 건강한 공여자 코호트로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 준비하였다. CD8+-고갈된 PBMC를 이용하여 벌크 배양을 확립하였다. 항체 추가 이후 다양한 시간대별로 [3H] -티미딘의 통합에 의한 CD4+ T 세포 증식이 측정되었다. 증식 분석과 나란하게 ELISpot 검정을 이용하여 IL-2 분비 또한 측정되었다.
방법
공여자 PBMC들의 준비 및 선별
건강한 지역사회 공여자 연막(buffy coats)(채혈후 24시간이내의 혈액으로부터)으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 단리되었다. PBMC들은 Lymphoprep(Axis-shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리에 의해 연막으로부터 단리되었고, CD8+ T 세포는 CD8+ RosetteSep™(StemCell Technologies Inc, London, UK)를 이용하여 고갈되었다. 공여자들은 HLA SSP-PCR 기반된 조직-유형별 키트(Biotest, Solihull, UK)를 이용하여 HLA-DR 단상형을 확인함으로써 특징화되었다. 대조 항원(Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), [Pierce (Perbio), Cramlington, UK]) 뿐만 아니라 인플루엔자 A 및 엡스타인 바르 바이러스로부터 유래된 펩티드 T 세포 반응이 또한 측정되었다. 그 다음 PBMC들은 필요할 때까지 액화 질소에 냉동 보관되었다.
항체의 준비
2가지 검사 항체는 사용직전에 AIM-V® 배양 배지(Invitrogen, Paisley, UK)로 희석되었고, 최종 검정 농도는 0.3mM이었다. KLH는 재생성 대조로 이용되었고, 물에서 1Omg/ml 스톡 용액으로 -20℃에서 보관되었다. 이 연구를 위하여, KLH 분취량은 사용직전에 해동시켜 AIM-V®에 400μg/ml로 희석시켰다(최종 농도 100μg/ml). 파이토헤마글루티닌(PHA, Sigma, Poole, UK)은 ELISpot에서 양성 대조로 이용되며, 그리고 1 mg/ml 스톡은 -20℃에서 보관되었고, 세포 배양물에서 2.5㎍/ml의 최종 농도로 희석되었다.
세포 생존력 평가
7일자에, 벌크 배양(증식 검정을 위하여 이미 확립된)은 부드럽게 재현탁되었고, 모든 공여자로부터 각 샘플 10ml을 빼내고, 10ml 트립판 블루와 혼합하였다. 이들 샘플은 Countess® Automated Cell Counter 기구(Invitrogen)로 트립판 블루 염료 배제를 이용하여 생존능에 대해 평가되었다.
EpiScreen™ 시간 과정 T 세포 증식 검정
각 공여자로부터 PBMC를 해동시키고, 카운트하고, 생존력을 평가하였다. 세포는 실온 AIM-V® 배양 배지에서 소생되었고, 세척되었고, AIM-V®에서 4-6x10 6 PBMC/ml로 재현탁되었다. 각 공여자의 경우, 벌크 배양이 확립되었는데, 1 ml 증식 세포 스톡이 24 웰 플레이트의 적정 웰에 추가되었다. 0.5ml의 배양 배지 및 0.5ml의 각 희석된 항체는 PBMC에 추가되어, 0.3μM의 최종 농도를 만들었다. 각 공여자의 경우, 재생성 대조(100μg/ml KLH와 함께 배양된 세포들), 양성 대조(2㎍/ml PHA과 함께 배양된 세포들) 그리고 오직-배양 배지만을 포함하는 웰이 또한 포함되었다. 배양물은 5% C02와 함께 37℃에서 총 8일간 배양되었다. 5, 6, 7 및 8일 차에, 각 웰의 세포는 부드럽게 재현탁되었고, 3 x 100μl 분량은 밑 둥근 96 웰 플레이트의 각 웰에 옮겨졌다. 배양물은 100μl AIM-VR 배양 배지에서 0.75μCi [3H]-티미딘(Perkin ElmerR, Beaconsfield, UK)로 펄스되었고, 추가 18시간 동안 배양된 후, 필터 매트(Perkin ElmerR)에서 Skatron Micro 96S - 10056 세포 수확기를 이용하여 수확하였다. 각 웰의 분당 카운트는 1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter(Perkin ElmerR) 상에서 파라룩스 저배경 카운트로 섬광 카운트되는 Meltilex™(Perkin ElmerR)에 의해 결정되었다.
EpiScreen™ IL-2 ELISpot 검정
IL-2 ELISpot 검정에는 증식 검정에 이용된 것과 상동성 공여자들이 또한 이용되었다. 상기에서 설명된 것과 같이 세포들이 해동되었고, 재생되었다. ELISpot 플레이트(Millipore, Watford, UK)를 사전-적시고, PBS에서 100μl/웰의 IL-2 포획 항체(R&D Systems, Abingdon, UK)로 하룻밤 코팅시켰다. 플레이트들은 PBS에서 3회 체석되었고, 차단 완충액(1% BSA/PBS)에서 하룻밤 동안 배양되었고, AIM-V® 배지로 세척되었다. 각 공여자의 세포 밀도는 AIM-V® 배양 배지에서 4-6x106 PBMC/ml으로 조정되었고, 100μl의 세포가 각 웰에 추가되었다. 50μl의 샘플 및 대조이 적절한 웰로 추가되었고, 뿐만 아니라 50ml의 AIMV는 200ml/웰의 최종 용적으로 추가되었다. 항체는 6통의 배양물에서 검사되었고, 각 공여자의 경우, 음성 대조(AIM-V® 배지 단독), 세포없는 대조 그리고 미토겐양성 대조(PHA 2㎍/ml - ELISpot 기능 및 세포 생존력에 대한 내부 검사물질로 이용됨)들이 또한 각 플레이트에 포함되었다. 8일의 배양 기간 후, ELISpot 플레이트는 PBS/1% BSA에서 100μl의 여과된, 비오틴화된 탐지 항체(R&D Systems)의 추가 전, dH20 및 PBS(x3)에 순차적으로 세척함으로써 발달되었다. 1.5시간 동안 37℃에서 배양 후, 플레이트들은 PBS(x3)에서 더 세척되고, PBS/1% BSA에서 100μl의 여과된 스트렙타비딘-AP(R&D Systems)는 1.5시간동안 추가되었다(실온에서 배양). 스트렙타비딘-AP는 버리고, 플레이트는 PBS(x4)에서 세척되었다. 100μl BCIP/NBT 기질(R&D Systems)이 각 웰에 추가되었고, 실온에서 30분 동안 배양되었다. 웰과 웰의 후면을 dH20로 3회 세척함으로써 스팟 발달이 중지되었다. 건조된 플레이트들은 Immunoscan® Analyser상에서 스캔되었고, 웰당 스팟(spw)은 ImmunoscanR Version 4 소프트웨어를 이용하여 측정되었다.
EpiScreen™ 데이터 분석
증식 및 IL-2 ELISpot 검정을 위하여, 2 또는 그 이상의 자극 지수(SI≥2.00)의 경험측상의 임계치는 이미 확립되었고, 이로 인하여 이 임계치 이상으로 반응을 유도하는 샘플들은 양성으로 간주된다(경계선 SIs ≥ 1.90 또한 눈에 뛴다). 방대한 검정 개발 및 기존 연구들은 이것이 최저 신호대 잡음 임계치이며, 다수의 허위 양성 반응의 탐지없이 또는 미묘한 면역원성 사건의 생략없이 최대 감도를 허용한다는 것을 보여주었다. 증식(n=3) 및 IL-2 ELISpot 데이터(n=6) 세트 둘 모두의 경우, 다음과 같이 통계학상 그리고 경험측상 임계치에 의해 양성 반응이 정의되었다:
1. 2개의 독립 표본 스튜던트 t-검정을 이용하여 배지 대조 웰에 대하여 검사 웰의 cpm 또는 spw를 비교함으로써 반응의 유의성(p<0.05).
2. 2 또는 그 이상의 자극 지수(SI≥2.00), 이때 SI = 검사 웰의 평균(cpm 또는 spw)/기선(cpm 또는 spw). 이 방식으로 나타낸 데이터는 SI≥2.00, p<0.05임을 나타낸다.
또한, 검정내(intra-assay) 변화는 중복 배양물로부터 가공안된 데이터의 변화 계수 및 표준 편차(SD)를 산출함으로써 평가되었다.
결과 및 토론
T 세포가 활성화된 후 IL-2 생산 및 증식간에 일반적으로 양호한 상관관계가 있지만, 증식 및 IL-2 ELISpot 검정은 독립적으로 해석되었다. KLH를 재생성 대조으로 이용하여 검정간(Inter-assay) 가변성이 평가되었고, KLH에 대한 양성 T 세포 반응의 빈도는 두 가지 별도 EpiScreen™ 검정에서 비교되었다. 이들 결과에서 KLH-특정 T 세포 반응에 대한 검정간 가변성은 수용가능한 범위 안에 있으며, 기존 연구와 일관되었다(≤10 %).
세포 생존력의 평가
PBMC 생존력에서 항체 및 완충액의 임의의 총체적 효과의 초기 평가는 EpiScreen™ 시간 일정 검정에서 이용된 10개의 공여자에 대해 실행되었다. 항체와 함께 배양된 후 7일차에 PBMC의 트립판 블루 염료 배제를 이용하여 세포 생존력이 산출되었다. 2가지 검사 항체 및 완충액 제형은 세포의 생존력에 유의미적으로 영향을 주지 않았음이 명백한데, 그 이유는 배지 단독 배양물로부터 PBMC가 이들 샘플 및 KLH 처리된 세포의 것과 유사한 평균 생존력(93-97% 사이)을 보유하였기 때문이다.
EpiScreen™ 시간 일정 증식 검정
도 24 및 표 12는 이들 항체에 의해 유도된 CD4+ T 세포 반응의 EpiScreen™ 시간 일정 T 세포 증식 검정에서 획득된 결과들을 보여준다. 검사 항체는 둘다 증식 검정에서 하나 또는 그 이상의 공여자에서 SI≥2.00(p<0.05)로 양성 증식 반응을 유도하였다. 경계선 반응 SI≥1.90(p<0.05) 또한 눈에 띈다. 양성 증식 반응은 공여자 코호트의 5% 내지 24% 범위이었다(표 14).
Figure pct00032
표 14에서, 전체 시간 일정(5-8일 동안), 양성 T 세포 증식 반응(SI≥2.00, 유의미성 p<0.05)은 "P"로 나타내었고, 양성 T 세포 IL-2 ELISpot 반응(SI≥2.00, 유의미성 p<0.05)은 "E"로 나타내었다. 경계선 반응(유의미성 p<0.05, SI≥1.90)은 (*)로 나타내었다. 공여자 7(
Figure pct00033
)에 대한 증식 검정 8일자에 데이터는 획득되지 않았다. 제형 완충액은 공여자 1-10에서만 검사되었고, 공여자 11-21는 이 완충액으로 검사되지 않았다(회색 상자). N/A는 이용가능한 데이터가 없음을 나타낸다.
항체 CDR-HuCAN20G2는 가장 빈번한 T 세포 증식 반응과 연관되었는데 이는 연구 코호트의 24%(5개 공여자)에서 양성 반응을 유도하였다. 대조적으로, 항체 HE-HuCAN20G2는 더 적은 T 세포 증식 반응을 유도하였는데, 단지 코호드의 5%만 양성으로 반응하였다. 이들 결과는 T 세포 증식 반응의 빈도가 항체 CDR-HuCAN20G2에 대해서는 높지만, HE-HuCAN20G2에 대해서는 낮음을 보여주었다. 완충액 대조에 대한 T 세포 증식 반응은 탐지되지 않았다.
T 세포 증식 반응의 크기 분석에서 비록 항체 CDR-HuCAN20G2가 높은 반응 빈도를 나타내었지만, 반응의 크기는 낮았다(평균 SI 2.13). 항체 HE-HuCAN20G2의 경우, 반응하는 공여자 수가 적기 때문에, T 세포 반응 크기에 대해 결론을 내릴 수 없다(표 15). 따라서, 이들 항체의 전반적인 면역원성 잠재성은 연구 코호트에서 양성 T 세포 증식 반응의 빈도(%)에 근거하여 결정되었는데, CDR-HuCAN20G2는 HE- HuCAN20G2보다 더 면역원성이다.
Figure pct00034
평균 SI는 전체 시간 일정(5-8일자) 동안 관찰된 모든 양성 공여자 반응의 평균으로부터 산출되었다. 데이터는 경계선 증식 반응(SI≥1.90, p<0.05)을 포함한다.
T 세포 반응의 역학
증식성 반응의 전반적인 타이밍은 T 세포 반응의 잠재성 유형(순수 또는 소환)에 대해 정보를 제공할 수 있다. 5일자에 탐지된 최대 T 세포 증식은 기존 T 세포 전구물질 빈도가 높다는 것을 나타내고, 반면 나중 일자들의 경우 최대 증식은 낮게 존재하는 T 세포 전구물질 빈도를 나타낸다. 높은 면역원성 잠재력은 시간 일정의 초기 단계 동안 T 세포 자극과 일치할 것이다. 도 25는 4일 시간 일정의 각 날짜에서 샘플에서 발생되는 양성 증식 반응의 수를 요약한다. 항체 CDR-HuCAN20G2에 대한 T 세포 반응은 주로 7일자와 8일자에 관찰되었으며, 이는 상기 항체의 경우 존재하는 T 세포 전구물질의 수가 적음을 암시한다. 항체 HE-HuCAN20G2는 한 공여자에서 반응을 유도하였고, 이것은 6, 7 및 8일차에 관찰되었다. 그러나, 오직 하나의 반응 공여자가 탐지되었기 때문에, 항체 HE-HUCAN20G2에 대한 T 세포 전구물질의 수에 대한 결론을 내리기는 곤란하다.
EpiScreen™ IL-2 ELISpot 검정
도 26 및 표 12는 2개의 검사 항체로 자극 후 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비를 측정하는 IL-2 ELISpot 검정에서 획득된 반응을 나타낸다. 증식 검정과 유사하게, SI≥2.00을 만든 공여자에서 양성 반응이 기록되었는데, 검사 spw와 배경(처리안된 배지 대조) 사이에 유의적인 차이가 관찰되었다(p<0.05). 경계선 반응 SI≥1.90(p<0.05) 또한 분명하다. 모든 샘플들은 하나 또는 그 이상의 공여자에서 양성 IL-2 ELISpot 반응을 유도하였고, 이들은 2개의 독립 표본 스튜던트 t-검사를 이용하면 모두 유의미적이었다(p<0.05). 8일 이후 대부분의 웰에 카운트 하기에는 너무 많은 스팟이 포함되어(데이터 나타내지 않음) 비록 ELISpot 데이터에 대한 SI 값이 준비되지는 않았지만 모든 PHA 웰은 스팟 존재에 대하여 양성이었다.
두가지 검사 항체의 경우, IL-2 ELISpot 검정의 전반적 결과는 증식 검정에서 획득된 결과들과 상동성이었고, 두 항체는 모두 동일한 빈도의 T 세포 반응을 유도하였다(표 16). 증식 검정에서와 같이, 항체 CDR-HuCAN20G2은 연구 코호트에서 가장 빈번한 T 세포 반응을 유도하였고, 공여자의 24%가 양성적으로 반응한 반면(SI≥2.00, p<0.05), 항체 HE-HuCAN20G2는 연구 코호트의 5%에서 T 세포 반응을 유도하였다. 두 항체 모두에 대한 양성(경계선 SI≥1.90을 포함, p<0.05) T 세포 반응의 평균 크기 평가는 낮았다(CDR-HuCAN20G2에 대한 평균 양성 SI 2.39).
HE-HuCAN20G2에 대한 T 세포 반응의 빈도는 낮았고, 이로써 T 세포 반응의 강도(크기) 및 면역원성 사이에 임의의 직접 상관 관계는 불가능하다. 검사 항체의 면역원성의 상대적 위험 평가(IL-2 ELISpot 검정에서 양성 반응 빈도에 근거하여)에서 CDR-HuCAN20G2가 HE-HuCAN20G2보다 좀더 면역원성임이 나타났다.
Figure pct00035
상기 데이터는 경계선 반응(SI≥1.90, p<0.05)을 포함한다. N/A는 데이터 없음을 지시한다.
결과의 해석
증식과 IL-2 ELISpot 검정 데이터는 양성 T 세포 반응이 일정한 비율의 공여자에서 검사 항체 둘 모두에 대해 검출된다는 것을 증명한다. 증식과 IL-2 ELISpot 검정 사이에 전체 상관관계는 높았고(KLH의 경우에 94%, 표 14), 따라서 이전 연구에서처럼, 반응 공여자는 IL-2 ELISpot와 증식 검정 둘 모두에서 각 샘플에 양성 반응을 나타내는 것들로 정의되었다. 표 14는 증식과 IL-2 ELISpot 검정 둘 모두에서 항체에 대한 양성 반응의 요약을 보여준다. 증식과 IL-2 ELISpot 검정으로부터 획득된 데이터의 비교는 조사된 항체가 검정 간에 양성 T 세포 반응의 상동한 빈도를 유도한다는 것을 증명하였다. 모든 공여자는 IL-2 ELISpot 검정에서 PHA에 대한 양성 T 세포 반응을 유발하였는데, 이것은 탈체 배양에서 세포가 기능성이라는 것을 지시하였다(데이터 제시되지 않음). 이들 두 검정으로부터 합동된 데이터세트의 분석은 반응의 전체 빈도와 크기가 증식과 ELISpot 검정 둘 모두에서, 항체 CDR-HuCAN20G2의 경우에 24%의 반응 공여자로 높고 항체 HE-HuCAN20G2의 경우에 5%의 반응 공여자로 낮다는 것을 드러냈다.
결론
증식과 IL-2 ELISpot 검정 사이에 전체 상관관계는 높았고, 반응 공여자는 양쪽 검정에서 각 샘플에 대한 양성 반응을 나타내는 것들로서 정의되었다. 이들 두 검정으로부터 합동된 데이터세트의 분석은 전체 반응이 양쪽 검정에서, 항체 CDR-HuCAN20G2의 경우에 24%의 반응 공여자로 높고 항체 HE-HuCAN20G2의 경우에 5%의 반응 공여자로 낮다는 것을 드러낸다. 일정한 범위의 생물학으로 이전 EpiScreen™ T 세포 검정은 검정에서 공여자 T 세포 반응의 백분율과 임상에서 관찰된 면역원성의 수준 사이에 명확한 상관관계를 보였는데, 여기서 >10% 양성 반응을 유도하는 단백질 치료제는 임상에서 면역원성의 위험과 연관된다. 현재의 연구 결과는 EpiScreen™ 검정에서 조사된 다른 단백질 치료제와 비교하여, 항체 CDR-huCAN20G2가 임상적 면역원성의 위험을 갖는 것으로 간주될 것이라는 것을 증명하였다. 대조적으로, 항체 HE-huCAN20G2는 임상적 면역원성의 낮은 위험을 갖는 것으로 간주될 것이다.
실시예 17: 독소 A 공격에 대항하는 인간화 CAN20G2 mAb의 생체내 효능
2가지 인간화 CAN20G2 항-TcdA mAb, HE-CAN20G2와 CDR-CAN20G2의 생체내 보호 효능은 낮은 분량의 항체를 조사함으로써 생쥐 치사 독소 공격 모델(상기 실시예 8에서 언급된 바와 같음)에서 평가되었다. 20-30g 체중의 스웨스 웹스터(Webster) 생쥐는 0일자에 50 ug의 mAb 또는 대조가 제공되고 휴식하도록 허용되었다. 24시간 후, 이들 생쥐는 치사량의 TcdA(100 ng)가 제공되었다. 이러한 분량은 보호되지 않은 상태에서 동물의 90-100%를 24시간 내에 폐사시킨다. 이들 생쥐는 임상적 증상, 비정상 및 국소와 전신 질환에 대해 14일의 기간 동안 관찰되었다. 모든 관찰 결과는 기록되고, 그리고 생존 %가 각 치료 군에 대해 측정되었다.
결과
도 27과 28에서 도시된 바와 같이, 양쪽 인간화 CAN20G2 mAb는 독소 A 생체내 공격으로부터 보호에 유효하였다. HE-CAN20G2는 CDA1 및 CDR-CAN20G2와 비교하여 더욱 우수한 생체내 보호를 제공하였다. 0.05 mg/생쥐의 낮은 분량에서, HE-CAN20G2 수용자 생쥐는 TcdA 치명적 공격에 대하여, CDA1(80%) 및 CDR-CAN20G2(70%)로 치료된 것들에 비하여 더욱 높은 생존율(90%)을 가졌다.
실시예 18: 인간화 항체의 약동학적 분석
약동학적 연구는 햄스터 모델과 랫트 모델에서 CDR-huCAN20G2 및 HE-huCAN20G2에 대해 수행되었다. 햄스터 연구에서, Golden Syrian 햄스터는 50 mg/kg의 CDR-huCAN20G2가 복강내 주입되었다. 혈액 샘플은 주입 후 2시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간, 240시간 및 336시간 시점에 수집되었다. 대조 샘플은 주입 5일 전에 검사 샘플 및 상이한 시점에서 파수꾼 군으로부터 회수되었다. 혈액 샘플은 혈청을 획득하기 위해 8000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 랫트 연구에서, 두 군의 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트는 정맥내 투약을 위한 대퇴 정맥 카테터(FVC) 및 혈액 수집을 위한 경정맥 카테터(JVC)가 장치되었다. 2가지 항체, CDR-huCAN20G2 및 HE-huCAN20G2가 단일 IV 볼러스를 통해 10 mg/kg 분량 수준에서 랫트의 각 군에 주입되고, 그 이후에 0.5 mL 식염수 관류가 수행되었다. 혈액 샘플은 투약 전, 투약후 0.083, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288과 312시간 시점에 JVC로부터 수집되었다. 전혈(300 μL) 샘플은 혈청을 분리하기 위해, 2200 x g에서 10분 동안 원심분리되었다.
혈청 내에서 항체 농도는 ELISA에 의해 측정되었다. 96-웰 ELISA 플레이트는 염소 항-인간 IgG로 하룻밤 동안 코팅되고, 친화성 정제되고, 그리고 1 μg/mL에서 원숭이 혈청이 흡착되었다(Novus Biologicals). 플레이트는 PBS-T로 세척되고 차단 완충액으로 차단되었다. 항체 참고 표준은 0.098 - 100 ng/mL의 범위에서 표준 곡선을 산출하기 위해 1% 혼주된 미경험 햄스터 혈청에서 희석되었다. 희석되 검사 샘플과 표준은 실온에서 1.5시간 동안 배양되었다. 플레이트는 세척되고, HRP-염소 항-인간 IgG와 함께 배양되고, 친화성 정제되고, 원숭이 혈청이 흡수되고(Novus Biologicals), TMB 페록시다아제 기질 시스템(R&D systems)으로 전개되고, TMB 페록시다아제 중단 용액(R&D system)으로 중단되었다. 플레이트는 450 nm에서 SpectraMax 플레이트 판독기에서 판독되었다. 상이한 시점에서 각 동물에서 항체 농도는 표준 곡선을 이용하여 계산되었다.
결과: 햄스터 PK 연구의 경우에, 비구획 약동학적 분석이 Windows용 SAS 버전 9.2를 이용하여 수행되고, 그리고 데이터가 표 17에 도시된다. 지시된 바와 같이, CDR-huCAN20G2는 50 mg/kg 투여량에서 약 6일의 말단 반감기를 보였는데, 이것은 장래 효능 연구에서 항체 존속을 담보하였다.
쥐 PK 연구의 경우에, 비구획 약동학적 분석이 Watson, 버전 7.2.0.02를 이용하여 수행되고, 그리고 데이터가 표 18 및 도 29a와 도 29b에 도시된다. 지시된 바와 같이, 이들 두 단일클론 항체의 PK 프로필은 매우 유사하다. 노출의 필적하는 수준이 나타났고, 그리고 대사가 동일한 비율에 가까웠다.
Figure pct00036
Figure pct00037
본 발명의 특정 양상이 설명되고 예시되었지만, 이런 양상은 본 발명을 단지 예시하는 것으로 간주되고 첨부된 청구항에 따라서 해석되는 본 발명을 한정하는 것으로 간주되지 않는다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물과 특허 출원은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 명시적으로 및 개별적으로 순전히 참고문헌으로 편입되는 것으로 지시되는 것처럼 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다. 비록 전술한 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례에 의해 상당히 상세하게 설명되긴 했지만, 첨부된 청구항의 기술적 사상 또는 범위를 벗어나지 않는 일정한 개변이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (26)

  1. 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역(CDRs), CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하고, 그리고 경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile)(C. difficile) 독소 A에 결합하고 중쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 경쇄 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2와 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고, 그리고 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 해리 상수(KD)는 약 1 x 10-11 M 이하인 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 인간화 또는 키메라인 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 청구항 1에 있어서, 중쇄 영역은 서열 번호: 89에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 경쇄 영역은 서열 번호: 91에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 청구항 1에 있어서, 중쇄 영역은 서열 번호: 93에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 경쇄 영역은 서열 번호: 95에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 (a) 완전 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 그리고 (e) 이황화 연결된 Fv로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 a) IgG 불변 도메인; 그리고 (b) IgA 불변 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 청구항 1에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 단편 4에 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  11. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 12, 28, 44 또는 60에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  12. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 결합하고 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 4, 20, 36 또는 52에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  13. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 각각, 서열 번호: 28과 20에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  14. CAN20G2로 명명된 하이브리도마에 의해 생산된 항체.
  15. CAN20G2로 명명된 하이브리도마.
  16. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 생체내 독소 A 공격 실험에서, 포유류가 약 100 ng 이상의 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A에 노출되기 약 24시간 전에, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 약 8 mg/kg 체중 내지 약 13 mg/kg 체중 범의의 용량에서 포유류에 투여될 때, 포유류에 대한 생존 기회가 약 7일 이내에 약 80% 이상인 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  17. 청구항 17에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 영역과 경쇄 영역을 포함하되,
    중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2, CDR3을 포함하고,
    경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  18. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 시험관내 중화 검정에서 약 4 μM 내지 약 17 μM 범위의 농도에서, 약 150 ng/ml 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile) 독소 A의 약 40% 이상을 중화시키는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  19. 청구항 18에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 영역과 경쇄 영역을 포함하되,
    중쇄 영역은 각각, 서열 번호: 29, 30과 31에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2, CDR3을 포함하고,
    경쇄 영역은 각각, 서열 번호: 21, 22와 23에 진술된 아미노산 서열에 약 80% 내지 약 100% 상동한 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR, CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  20. 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 그리고 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  21. 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)-연관된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법으로서, 청구항 1의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 효과량을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 정맥내, 피하, 근육내 또는 경피 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 두 번째 작용제를 개체에 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 두 번째 작용제는 상이한 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 두 번째 작용제는 항생제인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 항생제는 반코마이신, 메트로니다졸, 또는 피닥소마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
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