KR20140060860A - Substrate with immobilized lipid bilayer comprising protein in a pattern and method for manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판 및 그의 제조방법에 관한 것이다. A protein-containing lipid bilayer is fixed in a patterned form, and a method for producing the same.
생명체 안에서 일어나는 생명현상은 대부분 생체분자들끼리의 상호작용에 의하여 진행된다. 그 중 세포 안에서 실제 대부분의 기능을 담당하는 생체분자는 단백질로서, 단백질은 효소나 등의 형태로 존재하면서 다른 단백질이나 수용체, 리간드 또는 저분자와의 상호작용을 통하여 생명현상을 수행한다. 따라서 특정 단백질 역할 및 다른 생체분자와의 상호작용 등을 밝히는 것은 생체분자의 기능을 밝히는 생명과학의 주된 연구과제이다. 이는 바로 생명현상을 다루는 보건, 의료, 제약 등의 산업에서도 중요하 연구되고 있는 분야이다. 단백질 칩은 이런 연구 분야에서 활용할 수 있는 기술로서, 이는 기판 위에 단백질을 고밀도로 집적시킨 장치로, 프로테오믹스, 신약개발, 질병 진단, 항원-항체 연구 등 많은 분야에 사용된다. 단백질 칩의 정확한 분석을 위해서는 많은 양의 단백질을 고정화할 수 있어야 함과 동시에 고정화했을 경우 단백질의 생물학적인 기능이나 구조의 보존이 가능해야 한다. Most life phenomena occurring in living organisms are carried out by interaction between biomolecules. Among them, biomolecules that are responsible for most of the functions in the cell are proteins. Proteins exist in the form of enzymes or the like and perform life phenomena through interaction with other proteins, receptors, ligands or low molecules. Therefore, identifying specific protein roles and interaction with other biomolecules is a major research task in life sciences that reveal the functions of biomolecules. This is an area that has been studied in the health, medical, and pharmaceutical industries that deal with the life phenomenon. Protein chips are technologies that can be used in such research fields. These are high-density integrated proteins on a substrate. They are used in many fields such as proteomics, development of new drugs, diagnosis of diseases, and antigen-antibody studies. For the accurate analysis of protein chips, it is necessary to be able to immobilize a large amount of proteins and, at the same time, to be able to preserve the biological functions and structures of proteins when immobilized.
그러나 단백질 칩의 문제점 중 하나는 원하지 않은 영역에 단백질의 흡착이 일어날 수 있다는 것이다. 단백질의 비선택적 영역에 대한 흡착은 크게 표면 구조에 의한 흡착, 표면 작용기에 의한 화학적 결합이 있는데 이러한 비선택적 흡착은 백그라운드 노이즈를 증가시켜 S/N (Signal to Noise)비의 감소를 가져오고, 결과적으로 칩의 감도를 떨어뜨리는 요소로 작용하게 된다.
However, one of the problems with protein chips is that protein adsorption can occur in undesired areas. The nonselective adsorption of protein on the non-selective region is largely due to adsorption by surface structure and chemical bonding by surface functional group. Such nonselective adsorption increases background noise, resulting in a decrease in signal to noise (S / N) ratio, And serves as an element for lowering the sensitivity of the chip.
따라서, 기판의 표면상에서 원하는 영역에 단백질을 효과적으로 고정하는 기술이 요구되고 있다. Thus, there is a need for a technique for effectively immobilizing proteins on a desired area on the surface of a substrate.
일 양상은 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판을 제공하는 것이다.One aspect is to provide a substrate on which a lipid bilayer comprising proteins is fixed in a patterned form.
다른 양상은 지질 이중층 및 상기 지질 이중층에 포함된 단백질을 포함하는 리포좀을 이용하여 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
Another aspect is to provide a method for producing a substrate in which a lipid bilayer comprising a protein is fixed in a patterned form using a liposome comprising a lipid bilayer and a protein contained in the lipid bilayer.
일 양상은 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판을 제공한다.
One aspect provides a substrate on which a lipid bilayer comprising a protein is immobilized in a patterned form.
본 명세서에서 사용된 용어 "지질 이중층 (lipid bilayer)"은 지질 분자의 2개 층으로부터 구성된 막을 나타낸다. 지질 이중층은 자연적으로 존재하는 막, 예를 들면, 세포막, 핵막 및 바이러스 엔벨로프와 유사한 두께를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 지질 이중층의 두께는 10nm 이하, 예를 들면, 1nm 내지 9nm, 2nm 내지 8nm, 2nm 내지 6nm, 2nm 내지 4nm 또는 2.5 nm 내지 3.5 nm의 두께를 갖는 것일 수 있다. 자연적 지질 이중층은 보통 인지질로 구성된다. 인지질은 친수성 헤드와 2개의 소수성 테일을 가지고 있다. 인지질이 물에 노출되는 경우, 그들은 자체가 2층 시트, 즉 이중층으로 배열되어 모든 테일은 시트의 중심을 향하게 된다. 이 이중층의 중심은 물을 거의 포함하지 않고 물에 용해되나 오일에 되지 않는 당 또는 염과 같은 분자를 또한 배제한다. 특정 헤드 그룹을 가진 인지질은 이중층의 표면 화학을 결정할 수 있다. 또한, 지질 테일은 예를 들면, 이중층의 상을 결정함으로써 막 특성에 영향을 미칠 수 있다. As used herein, the term "lipid bilayer" refers to a membrane composed of two layers of lipid molecules. The lipid bilayer may be of a naturally occurring membrane, for example, having a thickness similar to that of the cell membrane, nuclear membrane and viral envelope. For example, the thickness of the lipid bilayer may be 10 nm or less, for example, 1 nm to 9 nm, 2 nm to 8 nm, 2 nm to 6 nm, 2 nm to 4 nm, or 2.5 nm to 3.5 nm. Natural lipid bilayers are usually composed of phospholipids. The phospholipid has a hydrophilic head and two hydrophobic tail. When the phospholipid is exposed to water, they are themselves arranged in a two-layered sheet, i.e. a bilayer, with all the tails pointing towards the center of the sheet. The center of this bilayer also excludes molecules such as sugars or salts that are substantially free of water and soluble in water but not in oil. Phospholipids with specific head groups can determine the surface chemistry of the bilayer. In addition, the lipid tail can affect film properties, for example, by determining the phase of the bilayer.
상기 지질 이중층 (lipid bilayer)을 구성하는 "지질 분자"는 친수성 헤드와 소수성 테일을 가진 분자일 수 있다. 상기 지질 분자는 C14 내지 C50의 탄소 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 지질 분자는 인지질일 수 있다. 상기 인지질은 C16 내지 C24의 탄소 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 인지질은 인공적으로 또는 자연에서 수득할 수 있다. 상기 인지질은 디아실글리세로포스포리티드일 수 있으며, 예를 들면, 포스파티딘산, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 또는 이들의 조합일 수 있다. The "lipid molecule" constituting the lipid bilayer may be a molecule having a hydrophilic head and a hydrophobic tail. The lipid molecule may have C14 to C50 carbon atoms. The lipid molecule may be a phospholipid. The phospholipid may have C16 to C24 carbon atoms. The phospholipids can be obtained artificially or in nature. The phospholipid may be diacylglycerophosphoride and may be, for example, phosphatidic acid, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, or a combination thereof.
상기 일 양상에 따른 지질 이중층은 음전하를 띠는 것일 수 있다. 이는 지질 이중층의 순전하가 음에 해당하는 것으로, 다양한 인지질의 조합으로 이루어질 수 있으며, 예를 들면, 포스파티딜콜린과 포스파티딜세린의 조합으로 이루어질 수 있다. 인지질의 조합의 비율은 사용되는 인지질의 종류, 포함하는 단백질의 종류 및 지질 이중층에 포함될 수 있는 분자, 예를 들면 콜레스테롤의 존재 및 양에 따라 달라질 수 있다. The lipid bilayer according to this aspect may be negatively charged. This is due to the net charge of the lipid bilayer, which can be a combination of various phospholipids, for example, a combination of phosphatidylcholine and phosphatidylserine. The proportion of phospholipid combinations may vary depending on the type of phospholipid used, the type of protein involved and the presence and amount of molecules that may be included in the lipid bilayer, for example, cholesterol.
상기 일 양상에 따른 지질 이중층에 포함되는 단백질은 기판 표면에 패터닝 하고자 하는 단백질로, 예를 들면 세포 내에서 지질 이중층인 세포막에 존재하여 세포의 신호전달에 관여할 수 있는 막 단백질일 수 있다. 막 단백질은 지질막을 관통하는 막관통 단백질 또는 지질막을 관통하지 않는 막주변 단백질일 수 있다. 막 단백질은 그 구조 및 활성을 유지하기 위해서는 지질 이중층 내의 존재가 요구된다. The protein contained in the lipid bilayer according to one aspect of the present invention may be a protein to be patterned on the surface of the substrate, for example, a membrane protein existing in the lipid bilayer membrane in the cell and capable of participating in cell signal transduction. Membrane proteins may be transmembrane proteins that pass through lipid membranes or membrane surrounding proteins that do not penetrate lipid membranes. Membrane proteins are required to be present in the lipid bilayer in order to maintain their structure and activity.
상기 일 양상에 따른 기판은 지질 이중층이 고정될 수 있는 고체 지지체로, 금속 또는 비금속일 수 있다. 상기 금속은 전도체 또는 절연체일 수 있다. 상기 기판의 예로는 실리콘, 금, 유리, 세라믹, 플라스틱 또는 그 조합일 수 있다. 상기 기판에는 표면에 아미노기를 포함할 수 있으며, 상기 아미노기는 1차 아미노기, 2차 아미노기, 3차 아미노기, 4차 아미노기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 아미노기는 예를 들면 -NR'R"기이며, R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알케닐기, 치환 또는 비치환된 플루오레닐기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아릴알킬기 및 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 것이거나, R' 및 R"이 서로 지방족 고리 또는 방향족 고리를 형성할 수 있다.
The substrate according to this aspect may be a solid support on which the lipid bilayer can be fixed, metal or non-metal. The metal may be a conductor or an insulator. Examples of the substrate include silicon, gold, glass, ceramics, plastic, or a combination thereof. The substrate may include an amino group on its surface, and the amino group may include a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group, a quaternary amino group, or a combination thereof. R 'and R "are each independently selected from the group consisting of hydrogen, deuterium, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a hetero atom, O, N, S or A substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a substituted or unsubstituted alkoxy group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkenyl group, a substituted or unsubstituted fluorenyl group, A substituted or unsubstituted arylalkyl group, and a substituted or unsubstituted heteroaryl group having O, N, S, or P as a heteroatom, or R 'and R "may be bonded to each other through an aliphatic ring or an aromatic ring Can be formed.
다른 양상은 지질 이중층 및 상기 지질 이중층에 포함된 단백질을 포함하는 리포좀을, 표면에 패터닝된 아미노기를 포함하는 기판에 접촉시키는 단계를 포함하는, 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판을 제조하는 방법을 제공한다.
Another aspect is a method for preparing a lipid bilayer comprising a lipid bilayer comprising a lipid bilayer and a protein contained in the lipid bilayer, contacting the lipid bilayer with a substrate containing a patterned amino group on the surface, And a method for producing the same.
상기 방법은 지질 이중층 및 상기 지질 이중층에 포함된 단백질을 포함하는 리포좀을, 표면에 패터닝된 아미노기를 포함하는 기판에 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 지질 이중층은 인지질을 포함할 수 있으며, 상기 지질 이중층은 음전하를 띌 수 있다. 상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포 (SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포 (LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포 (multivesicular vesicle)라고 한다. 상기 일 양상에 따른 리포좀은 당해 기술분야에 공지된 리포좀 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어 유기 용매, 예를 들면 클로로포름에 용해한 다음 질소가스를 이용해 유기 용매를 제거하여 지질이 용기의 유리벽에 얇은 필름막을 형성되도록 한다. 그 다음 인산 완충용액을 첨가해 강하게 교반함으로써 제조할 수 있다. 다층구 리포좀은 팁 타입 소니케이터(tip type sonicator)를 이용하여 초음파 처리하는 경우, 단층구 리포좀이 형성될 수 있다. 형성된 리포좀은 소정 크기, 예를 들면 0.2~2 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 통과시켜 크기를 균일하게 할 수 있다. 단백질 포함 리포좀 (proteoliposome)을 형성하는 리포좀 재구성 (reconstitution)은 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 예를 들면 단백질을 계면 활성제로 분리 및 용해시킨 후 투석을 통하여 계면 활성제를 제거하므로써 지질 이중층에 단백질을 포함하는 리포좀을 제조할 수 있다. 버퍼에 분산시킨 재구성된 리포좀을 빠르게 얼렸다가 서서히 녹이는 방법 (freezing-thawing)을 반복함으로써 일정하고 안정화된 단백질 포함 리포좀을 형성할 수 있다. The method includes contacting a liposome comprising a lipid bilayer and a protein contained in the lipid bilayer with a substrate comprising a patterned amino group on the surface. The lipid bilayer may comprise a phospholipid and the lipid bilayer may be negatively charged. The liposome is comprised of one or more lipid bilayer membranes that surround the aqueous inner compartment, which can self associate. Liposomes can be specified by the membrane type and its size. Small uniamella vesicles (SUV) may have a single membrane and have diameters of 20 nm to 50 nm. Large uniamella vesicles (LUV) may have a diameter of 50 nm or greater. Oligo lamella large vesicles and multi-lamellar large vesicles can have a diameter of greater than 100 nm with multiple, generally concentric, membrane layers. Liposomes with several non-concentric membranes, the various small vesicles contained within larger vesicles, are called multivesicular vesicles. The liposome according to one aspect of the present invention may be prepared according to a liposome production method known in the art, for example, by dissolving in an organic solvent such as chloroform, removing the organic solvent using nitrogen gas, A thin film of film is formed on the wall. Followed by addition of a phosphoric acid buffer solution and vigorous stirring. When a multi-layered liposome is subjected to ultrasonic treatment using a tip type sonicator, a single layered liposome may be formed. The formed liposomes can be passed through a membrane filter of a predetermined size, for example, 0.2 to 2 mu m, to make the size uniform. Liposome reconstitution to form a protein-containing liposome (proteoliposome) can be prepared according to known methods. For example, a protein may be separated and dissolved in a surfactant, and then the surfactant may be removed by dialysis to prepare a liposome containing the protein in the lipid bilayer. The reconstituted liposomes dispersed in the buffer are rapidly frozen and then freezing-thawing is repeated to form a constant and stabilized protein-containing liposome.
상기 일 양상에 따른 기판의 표면에 패터닝된 아미노기는 1차 아미노기, 2차 아미노기, 3차 아미노기, 4차 아미노기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 아미노기는, 예를 들어, -NR'R"기이며, R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알케닐기, 치환 또는 비치환된 플루오레닐기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아릴알킬기 및 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 것이거나, R' 및 R"이 서로 지방족 고리 또는 방향족 고리를 형성하는 것일 수 있다. The amino groups patterned on the surface of the substrate according to one aspect of the present invention may include a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group, a quaternary amino group, or a combination thereof. The amino group is, for example, an -NR'R "group, and R 'and R" are each independently hydrogen, deuterium, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, A substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group having S or P, a substituted or unsubstituted alkoxy group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkenyl group, a substituted or unsubstituted fluorenyl group, A substituted or unsubstituted arylalkyl group, and a substituted or unsubstituted heteroaryl group having O, N, S, or P as a heteroatom, or R 'and R " To form an aromatic ring.
상기 접촉은 액체 매질 중의 리포좀을 기판에 분사, 또는 도포 하는 것 일 수 있다. 또는 리포좀이 존재하는 액체 매질에 기판을 침지하는 것일 수 있다. 상기 매질은 수성 매질일 수 있다. 예를 들면, 물 또는 인산환충염수 (phosphate buffered saline: PBS)와 같은 버퍼일 수 있다. 상기의 방법은 교반 또는 교반 없이 이루어질 수 있다. 기판에 포함되는 아미노기와 리포좀의 음전하간의 정전기적 인력에 의해 기판에 지질 이중층이 형성되어 고정된다. 이에 따라 기판에 패터닝된 아미노기의 위치에 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝되어 고정될 수 있다.The contacting may be spraying or applying the liposome in the liquid medium to the substrate. Or by immersing the substrate in a liquid medium in which the liposomes are present. The medium may be an aqueous medium. For example, a buffer such as water or phosphate buffered saline (PBS). The above method can be carried out without stirring or stirring. The lipid bilayer is formed and fixed on the substrate by the electrostatic attraction between the amino group contained in the substrate and the negative charge of the liposome. Accordingly, the lipid bilayer containing the protein can be patterned and fixed at the position of the amino group patterned on the substrate.
상기 방법은 기판 표면에 아미노기를 패터닝하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 아미노기는 예를 들면 마이크로 컨택 프린팅, 잉크젯 프린팅, 나노임프린팅, 스크린 프린팅 또는 이들의 조합에 의하여 기판 표면에 패터닝될 수 있다. 상기 아미노기는 아미노실란일 수 있다. 상기 아미노실란 화합물은 예를 들면, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-아미노프로필디메틸메톡시실란, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필-트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필-메틸디메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필-트리에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필-트리이소프로폭시실란 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 아미노기를 패터닝하는 단계의 일 구체예는 기판이 실리콘인 경우, 실리콘 표면에 아미노기를 패터닝하는 것은 아미노실란 화합물을 포함하는 분자에 의한 것일 수 있다. 또한 아미노기를 패터닝하는 단계의 일 구체예는 기판이 금인 경우, 금 표면에 아미노기를 패터닝하는 것은 아미노티올 화합물을 포함하는 분자에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노티올 화합물은 시스테아민, 아미노프로판티올, 아미노부탄티올, 아미노펜탄티올, 아미노헥산티올 또는 이들의 조합일 수 있다. The method may further comprise patterning the amino group on the substrate surface. The amino group may be patterned on the substrate surface by, for example, microcontact printing, inkjet printing, nanoimprinting, screen printing or a combination thereof. The amino group may be aminosilane. The aminosilane compound may be, for example, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyldimethylmethoxysilane, 3-aminopropyldimethylethoxysilane, N- Aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane, N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyl-methyldimethoxysilane, N- Silane, N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyl-triisopropoxysilane, or a combination thereof. One example of the step of patterning the amino group is when the substrate is silicon, the patterning of the amino group on the silicon surface may be by a molecule comprising an aminosilane compound. Also, one embodiment of the step of patterning the amino group, when the substrate is gold, patterning the amino group on the gold surface may be by a molecule comprising an aminothiol compound. For example, the aminothiol compound may be cysteamine, aminopropanethiol, aminobutanethiol, aminopentanethiol, aminohexanethiol, or a combination thereof.
상기 방법은 지질 이중층을 포함하는 리포좀을 상기 기판에 접촉시키는 단계를 더 포함 할 수 있다. 상기 지질 이중층을 포함하는 리포좀은 단백질을 포함하지 않을 수 있다. 상기 접촉은 상기한 바와 같다. 상기 지질 이중층은 인지질을 포함할 수 있다. 상기 인지질은 상기한 바와 같으며, 예를 들면, 양쪽성 이온인 포스파티일 콜린일 수 있다. 상기 단계에 의하여 패터닝된 단백질 포함 지질 이중층이 안정하게 유지될 수 있다. 상기 접촉은 상기 단백질을 포함하하는 리포좀을 접촉시키는 단계 후에 이루어질 수 있다.The method may further comprise contacting the substrate with a liposome comprising a lipid bilayer. The liposome comprising the lipid bilayer may not contain a protein. The contact is as described above. The lipid bilayer may comprise a phospholipid. The phospholipids are as described above, for example, phosphatidylcholine, which is an amphoteric ion. By this step, the patterned lipid bilayer containing protein can be stably maintained. The contacting may be carried out after contacting the liposome comprising the protein.
상기 일 양상에 따른 방법에서 단백질을 포함하는 지질 이중층 및 상기 지질 이중층에 포함된 단백질을 포함하는 리포좀을 기판에 접촉시키는 단계 및 단백질 불포함 리포좀을 기판에 접촉시키는 단계를 동시에 수행할 수 있다. Contacting the substrate with the liposome comprising the lipid bilayer comprising the protein and the protein contained in the lipid bilayer, and contacting the protein-free liposome with the substrate in the method according to the above aspect.
상기 일 양상에 따른 방법에서, 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판은, 패터닝된 지질 이중층의 구조를 유지시키기 위하여 통상의 기술자에 알려진 버퍼 내에 침전될 수 있으며, 예를 들면, PBS, HEPES, TRIS, MES, 인산 버퍼 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.In the method according to this aspect, the substrate on which the lipid bilayer comprising protein is immobilized in patterned form may be precipitated in a buffer known to the ordinarily skilled artisan to maintain the structure of the patterned lipid bilayer, for example, PBS, HEPES, TRIS, MES, phosphate buffer or a combination thereof may be used.
일 양상에 따른 기판에 의하면, 단백질의 구조 및 기능을 안정화시키면서, 패터닝된 형태로 기판에 고정될 수 있다.According to one aspect of the present invention, the substrate can be fixed to the substrate in a patterned form while stabilizing the structure and function of the protein.
다른 양상에 따른 기판 제조 방법에 의하면, 단백질을 포함하는 지질 이중층을 기판에 효과적으로 안정되게 패터닝 할 수 있다. 따라서, 수 마이크로미터 크기의 단백질 패터닝도 기판상에서 용이하게 수행될 수 있다. According to another aspect of the present invention, a lipid bilayer containing a protein can be stably patterned on a substrate. Therefore, protein patterning of several micrometers in size can also be easily performed on the substrate.
도 1는 음전하를 띄는 리포좀과 아미노기를 포함하여 양전하를 띄는 기판의 표면과의 정전기적 인력으로 기판 표면에 패터닝된 지질 이중층을 형성하는 원리를 나타낸 도면이다.
도 2은 단백질을 포함하는 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 기판의 제조 과정을 나타낸 도면이다.
도 3의 a는 각 40 ㎛ 간격으로 패터닝된 마이크로컨택프린팅 스탬프의 구조이며, b는 단백질 포함 리포좀을 기판에 접촉시킨 후 형광 붉은색의 텍사스 레드를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3에서 확인된 단백질 포함 리포좀의 선택적인 고정에 의하여 성공적으로 단백질이 패터닝되었는지를 확인하기 위하여 TOF-SIMS에 의하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5은 기판 표면에 단백질을 포함하는 지질 이중층이 고정되어 있는 형태를 모식화한 도면이다.
도 6은 기판 표면에 APTS 패턴을 따라서 단백질 포함 지질 이중층이 기판 위에 패터닝된 형태를 모식화한 도면이다.
도 7은 실리콘 (a) 및 금이 코팅된 기판 (b) 표면에 단백질이 패턴에 따라 형성 되었는지를 확인하기 위하여 형광 현미경 사진으로 형광 붉은색의 텍사스 레드를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8는 단백질 포함 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 금 기판을 광학이미지로 나타낸 결과 (a) 및 그를 이미징 적외선 현미경 (imaging FT-IR microscopy)을 이용하여 아미드 결합 (1627 cm-1)을 스캔한 결과 (b)를 나타낸 도면이다. FIG. 1 is a view showing the principle of forming a lipid bilayer patterned on a substrate surface by an electrostatic attraction between a liposome having negative charge and a surface of a substrate including an amino group and positively charged.
2 is a view showing a process of manufacturing a substrate in which a lipid bilayer including proteins is fixed in a patterned form.
FIG. 3 (a) is a view showing the structure of a microcontact printing stamp patterned at intervals of 40 .mu.m, and FIG. 3 (b) is a view showing a fluorescent red red Texas red after contacting a protein-containing liposome with a substrate.
FIG. 4 is a view showing the result of analysis by TOF-SIMS to confirm whether or not the protein was successfully patterned by selective fixation of the protein-containing liposome identified in FIG.
5 is a schematic view showing a state in which a lipid bilayer containing protein is immobilized on a substrate surface.
6 is a schematic diagram of a patterned pattern of a lipid bilayer containing protein on a substrate along the APTS pattern on the substrate surface.
FIG. 7 is a view showing fluorescence red-colored Texas red in a fluorescence microscope to confirm whether proteins were formed on the surface of the silicon (a) and gold-coated substrate (b) according to the pattern.
FIG. 8 shows a result (a) showing an optical image of a gold substrate immobilized with a protein-containing lipid bilayer in a patterned form and an amide bond (1627 cm -1 ) using an imaging infrared microscope (B). Fig.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 지질 1: lipid 이중층Double layer 및 지질 And lipids 이중층에On the bilayer 포함된 단백질을 포함하는 Containing an included protein 리포좀의Liposomal 제조 Produce
단백질 패턴에 사용할 리포좀을 제작하기 위하여 로돕신 단백질을 사용하였다. 로돕신 단백질을 DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) : DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (나트륨 염))을 80:20의 비율로 포함하고 있는 인지질 리포좀과 재구성에 의하여 단백질 포함 리포좀 (proteoliposome)을 형성하였다 (도 2의 a-1 내지 a-3). 로돕신 단백질, DOPC, DOPS를 물에 녹이고 천천히 4시간 교반하여 단백질 포함 리포좀을 리포좀의 자기조립에 의하여 형성시켰다.Rhodopsin protein was used to make liposomes for protein patterns. (2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine): DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L- serine To form a protein-containing liposome (a-1 to a-3 in FIG. 2) by reconstitution with a phospholipid liposome containing the liposomes. Rhodopsin protein, DOPC, and DOPS were dissolved in water and stirred slowly for 4 hours to form a protein-containing liposome by self-assembly of the liposome.
단백질을 포함하고 있는 리포좀의 구조를 확인하기 위하여, 형광체인 텍사스 레드 (Texas Red)를 포함하는 DHPE를 총 인 지질 분자 대비 0.5 %로 함께 삽입시켰다.
In order to confirm the structure of the liposome containing the protein, DHPE containing the phosphor Red (Texas Red) was added together with 0.5% of total lipid molecules.
실시예 2: 기판 표면 패터닝 단계 Example 2 : Substrate Surface Patterning Step
0.5 g의 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane: APTS)을 10 mL의 물에 녹여서 PDMS 스탬프에 APTS 용액을 떨어뜨린 후, 마이크로 컨택 프린팅 기법으로 APTS를 1 cm X 1cm의 실리콘 웨이퍼 표면에 흡착시켜서 패턴을 형성하였다 (도 2의 b-1 내지 b-3). 1 cm X 1cm의 금으로 코팅된 웨이퍼에는 0.05g의 시스테아민 (cysteamine)을 10mL의 에탄올에 녹여서 마이크로 컨택 프린팅 기법으로 시스테아민을 표면에 흡착시켜서 패턴을 형성하였다. PDMS 스탬프를 기판 표면에 4시간 동안 상온에서 올려놓음으로써 흡착을 수행하였다.
0.5 g of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) was dissolved in 10 mL of water and the APTS solution was dropped on the PDMS stamp. The APTS was immersed in a 1 cm x 1 cm silicon wafer surface To form a pattern (b-1 to b-3 in Fig. 2). In the wafer coated with 1 cm x 1 cm of gold, 0.05 g of cysteamine was dissolved in 10 mL of ethanol and the cysteamine was adsorbed on the surface by microcontact printing to form a pattern. The adsorption was carried out by placing the PDMS stamp on the substrate surface for 4 hours at room temperature.
실시예Example 3: 단백질을 포함하는 3: Protein-containing 리포좀에On liposomes 의하여 By 패터닝된Patterned 기판의 제조 Fabrication of Substrate
실시예 1에서 수득한 10 mM의 단백질 포함 리포좀이 들어있는 PBS 버퍼 용액에 APTS로 패터닝된 실리콘 웨이퍼를 상온에서 담그고, 3분 후에 리포좀이 부존재하는 PBS 버퍼용액으로 옮기고 3 분 동안 상온에서 담가 두었다. 그 결과, 단백질을 포함하는 리포좀에 의하여 패턴화된 기판을 제조하였다. 도 1는 음전하를 띄는 리포좀과 아미노기를 포함하여 양전하를 띄는 기판의 표면과의 정전기적 인력으로 기판 표면에 패터닝된 지질 이중층을 형성하는 원리를 나타낸 도면이다. a는 음전하를 띄는 리포좀, b는 표면에 아미노기를 포함하지 않는 기판, c는 표면에 아미노기를 포함하는 기판을 나타낸다. b의 양전하를 띄지 않는 기판은 실리콘 웨이퍼 기판을 에탄올, 아세톤으로 5분간 초음파 세척한 후 APTS 표면처리 없이 단백질 포함 리포좀이 들어있는 PBS 버퍼용액에 담그고 3분 후 리포좀이 부존재하는 PBS 버퍼용액에 옮기고 3분 동안 상온에 담갔다. 도1에서 나타낸 바와 같이, 음전하를 띄는 리포좀은 양전하를 띄는 기판 (c)에 한하여 패터닝된 지질 이중층을 형성하는 것을 확인하였다. A silicon wafer patterned with APTS was immersed in PBS buffer solution containing the 10 mM protein-containing liposome obtained in Example 1 at room temperature, and after 3 minutes, transferred to a PBS buffer solution in which liposome was not present, and immersed at room temperature for 3 minutes. As a result, a substrate patterned by a liposome containing protein was prepared. FIG. 1 is a view showing the principle of forming a lipid bilayer patterned on a substrate surface by an electrostatic attraction between a liposome having negative charge and a surface of a substrate including an amino group and positively charged. a is a liposome having a negative charge, b is a substrate not containing an amino group on its surface, and c is a substrate containing an amino group on its surface. b, the silicon wafer substrate was ultrasonically cleaned with ethanol and acetone for 5 minutes, immersed in PBS buffer solution containing protein-containing liposome without surface treatment for 3 minutes, transferred to a PBS buffer solution in which liposome was not present, and 3 Min at room temperature. As shown in Fig. 1, it was confirmed that a liposome having a negative charge forms a patterned lipid bilayer only on a substrate (c) having a positive charge.
얻어진 단백질을 포함하는 리포좀에 의하여 패터닝된 기판을 형광 현미경으로 관찰하였다. 관찰은 0.3 ml의 PBS 버퍼용액 중의 1cm X 1cm의 기판 위에서 이루어졌다 도 3의 a는 각 40 μm 간격으로 패터닝된 마이크로컨택프린팅 스탬프의 구조이며, b는 단백질 포함 리포좀을 기판에 접촉 시킨 후 형광 붉은색의 텍사스 레드를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 초기 패턴된 위치에서 강한 형광이 나타나는 것을 확인하였다. The substrate patterned by the liposome containing the obtained protein was observed with a fluorescence microscope. The observation was carried out on a substrate of 1 cm x 1 cm in 0.3 ml of PBS buffer solution. Fig. 3 (a) shows the structure of a microcontact printing stamp patterned at intervals of 40 [micro] m, ≪ tb > < / TABLE > As shown in Fig. 3, it was confirmed that strong fluorescence appeared at the initial patterned position.
성공적으로 단백질 포함 지질 이중층이 패터닝되어 있는지를 검증하기 위하여 비행 시간 2차 이온 질량 분석법 (time of flight-secondary ion mass spectrometry: TOF-SIMS)를 수행하였다. 도 4는 상기에서 확인된 단백질 포함 리포좀의 선택적인 고정에 의하여 성공적으로 단백질이 패터닝되었는지를 확인하기 위하여 TOF-SIMS에 의하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다. x축은 길이바 (scale bar)를 나타내고, y축은 이온 검출의 빈도에 따른 세기를 색깔로 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 인지질 분자에 포함되어 있는 PO3 -이온으로 이미징을 한 결과, 리포좀을 접촉시키지 않은 실리콘 표면의 APTS 패턴에는 PO3 -이온이 검출되지 않으나, 20 %의 포스파티딜세린 인지질과 80 %의 포스파티딜콜린으로 이루어진 리포좀과 단백질 포함 리포좀을 접촉시킨 표면에서는 모두 PO3 -이온의 패턴이 나타났다. 이는 단백질의 패터닝이 인지질 성분에 의하여 유도되고 있음을 나타내는 것이다. 한편 APTS을 구성하는 SiO2 - 이온으로 이미징 한 결과, 상기 세 경우 모두 동일한 패턴이 나타났으며, 특히 리포좀을 접촉시키지 않은 실리콘 표면의 APTS 패턴에서 선명하게 나타난 것을 보아 APTS의 패턴이 잘 형성되어 있음을 알 수 있었다. 마지막으로, APTS 뿐만 아니라 단백질에 주 성분으로 존재하는 CN- 이온의 경우, 리포좀이 접촉되지 않은 APTS만 있는 표면과 단백질이 부존재하는 리포좀을 접촉시킨 표면에도 이미지가 나타나지만, 단백질이 포함된 리포좀의 경우에서 가장 강한 세기로 나타나고, 전체적으로 고르게 분포되어 있는 바, 단백질 포함 리포좀의 패터닝이 성공적으로 형성되어 있음을 확인할 수 있었다. Time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS) was performed to verify that the lipid bilayer with protein was successfully patterned. FIG. 4 is a view showing the result of analysis by TOF-SIMS in order to confirm whether proteins are successfully patterned by selective fixation of the protein-containing liposome identified above. The x-axis represents the scale bar and the y-axis represents the intensity according to the frequency of ion detection. As shown in FIG. 4, when PO 3 - ions contained in the phospholipid molecules were imaged, no PO 3 - ion was detected in the APTS pattern of the silicon surface that was not contacted with the liposome, but phosphatidylserine phospholipid The surface of the liposome composed of 80% phosphatidylcholine and the liposome containing protein all showed a pattern of PO 3 - ion. This indicates that the patterning of the protein is induced by the phospholipid component. On the other hand, as a result of imaging with SiO 2 - ions constituting the APTS, the same pattern was observed in all three cases, and in particular, the pattern of the APTS was well formed when the APTS pattern of the silicon surface without contact with the liposome clearly appeared And it was found. Finally, in the case of CN - ion, which is a major component of protein as well as APTS, images are also seen on the surface of the APTS-only surface where the liposome is not contacted and the liposome-free surface where the protein is absent. , And it was confirmed that the patterning of the protein-containing liposome was successfully formed.
도 5는 기판 표면에 단백질을 포함하는 지질 이중층이 고정되어 있는 형태를 모식화한 도면이다. a는 단백질 포함 리포좀 (proteoliposome), b는 막단백질, c는 인지질층, d는 APTS, e는 기판을 나타낸다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 단백질을 포함하는 리포좀은 APTS로 패터닝된 위치에 지질 이중층을 형성한다. Fig. 5 is a schematic view showing a state in which a lipid bilayer containing protein is immobilized on a substrate surface. a is a protein-containing liposome (proteoliposome), b is a membrane protein, c is a phospholipid layer, d is APTS, and e is a substrate. As shown in FIG. 5, liposomes containing proteins form lipid bilayers at the locations patterned with APTS.
도 7은 실리콘 (a) 및 금 (b) 기판 표면에 단백질이 패턴에 따라 형성 되었는지를 확인하기 위하여 형광 현미경 사진으로 형광 붉은색의 텍사스 레드를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 이미징한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 실리콘 표면뿐만 아니라 금 표면에서도 성공적으로 단백질 포함 지질 이중층이 패턴닝된 형태로 고정되어 있음을 알 수 있었다. 도 8는 단백질 포함 지질 이중층이 패터닝된 형태로 고정된 금 기판을 광학이미지로 나타낸 결과 (a) 및 그를 이미징 적외선 현미경 (imaging FT-IR microscopy)을 이용하여 아미드 결합 (1627 cm-1)을 스캔한 결과 (b)를 나타낸 도면이다. x, y 축은 길이를 나타내며, 눈금 하나당 5 um를 나타낸다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 금 표면에서 단백질 포함 지질 이중층이 성공적으로 패터닝된 것을 확인 할 수 있었다.
FIG. 7 is a graph showing fluorescence red-colored Texas red obtained by fluorescence microscopy to confirm whether proteins were formed on the silicon (a) and gold (b) substrate surfaces according to a pattern. Fig. As shown in FIG. 7, it was found that the protein-containing lipid bilayer was successfully fixed in the patterned form, not only on the silicon surface but also on the gold surface. FIG. 8 shows a result (a) showing an optical image of a gold substrate immobilized with a protein-containing lipid bilayer in a patterned form and an amide bond (1627 cm -1 ) using an imaging infrared microscope (B). Fig. The x and y axes represent the length and represent 5 μm per scale. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the protein-containing lipid bilayer was successfully patterned on the gold surface.
실시예Example 4: 단백질을 포함하지 않는 4: Protein-free 리포좀을Liposomes 기판에 접촉시키는 단계 및 기판의 버퍼내의 Contacting the substrate with the substrate; 침지Immersion
단백질이 포함되어 있는 리포좀을 접촉시켜, 기판의 표면에 성공적으로 패턴닝 된 것을 확인 한 후, 기판의 표면에서 단백질 포함 지질 이중층이 고정되지 않은 부분에 단백질을 포함하지 않는 지질 이중층을 고정하기 위하여, 단백질 불포함 리포좀을 기판의 표면에 접촉하는 과정을 수행하였다 (도 2의 c-1 내지 c-3).After the liposome containing the protein was contacted and confirmed to have been successfully patterned on the surface of the substrate, in order to immobilize the lipid bilayer without protein on the surface of the substrate where the lipid bilayer with protein was not fixed, (C-1 to c-3 in Fig. 2) was performed in the same manner as in Example 1, except that the protein-free liposome was contacted to the surface of the substrate.
기판상에서 패터닝된 형태로 고정된 단백질 및 지질 이중층을 유지하기 위하여 인산 버퍼에 지질 이중층이 고정된 기판을 침지시켰다.
The substrate on which the lipid bilayer was immobilized was immersed in a phosphate buffer to maintain the protein and lipid bilayer fixed in the patterned form on the substrate.
Claims (18)
R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알케닐기, 치환 또는 비치환된 플루오레닐기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아릴알킬기 및 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 것이거나, R' 및 R"이 서로 지방족 고리 또는 방향족 고리를 형성하는 것인 기판.5. The compound according to claim 4, wherein the amino group is an -NR'R &
R 'and R "are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group having O, N, S or P as a hetero atom, A substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkenyl group, a substituted or unsubstituted fluorenyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, A substituted or unsubstituted heteroaryl group having O, N, S or P, or R 'and R "form an aliphatic ring or an aromatic ring with each other.
R' 및 R"은 각각 독립적으로 수소, 중수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 치환 또는 비치환된 알케닐기, 치환 또는 비치환된 시클로알케닐기, 치환 또는 비치환된 플루오레닐기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 아릴알킬기 및 이종원소로 O, N, S 또는 P를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 것이거나, R' 및 R"이 서로 지방족 고리 또는 방향족 고리를 형성하는 것인 방법.8. The method of claim 7, wherein the amino group is a -NR'R &
R 'and R "are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group having O, N, S or P as a hetero atom, A substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkenyl group, a substituted or unsubstituted fluorenyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted arylalkyl group, A substituted or unsubstituted heteroaryl group having O, N, S or P, or R 'and R "form an aliphatic ring or an aromatic ring with each other.
18. The method of claim 17, wherein the aminothiol compound comprises cysteamine, aminopropanethiol, aminobutanethiol, aminopentanethiol, aminohexanethiol, or a combination thereof.
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