KR101384633B1 - 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생강(Zingiber officinale) 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 생강 추출물 및 분획물은 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)의 증식 및 생존을 억제하는 효과가 있으므로, 생강 추출물 또는 그의 유효성분은 톡소플라즈마증을 예방 또는 치료용 조성물, 건강 기능 식품용 조성물 및 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 의약외품 조성물로 유용하다.

Description

생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물{A composition for treating or preventing toxoplasmosis comprising Zingiber officinale extract and fractions thereof}
본 발명은 생강(Zingiber officinale) 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 생강 추출물 및 이의 분획물은 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)의 증식 및 생존을 억제하는 효과가 있으므로, 생강 추출물 또는 그의 분획물은 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물, 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 유용하다.
톡소플라즈마 곤디는 AIDS 환자, 유아 또는 면역체계에 장애가 있는 성인의 중추신경계에 감염되어 톡소플라즈마증을 유발하는 주요한 원인이 되는 톡소플라즈마 곤디이다(Luft and Remington, 1992). 톡소플라즈마 곤디는 길이 8 및 직경 2인 초승달 모양의 기생 생물체로서 동물세포에 기생하며, 전형적인 동물세포보다 작다. 톡소플라즈마 곤디를 구성하는 내부 기관은 단일 원추체, 아피코플라스트, 미토콘드리아, 리보솜, 핵, 골지체, 롭트리, 밀도과립, 및 마이크로넴즈(Micronemes)이 있다(Joiner and Roos, 2002). 톡소플라즈마 곤디는 타키조이트(tachyzoites), 브라디조이트(bradyzoites) 및 스포로조이트(sporozoites)를 포함하는 세 단계의 감염기를 갖는다. 이러한 단계는 톡소플라즈마 곤디의 분열 및 증식에 필요한 생활사를 구성한다(Dubey et al., 1998). 또한 톡소플라즈마 곤디가 전염될 때는 두 단계[시스트(cyst)기 및 오시스트(ooccyst)기]를 거쳐 전파된다. 사람은 모체로부터 태아로의 톡소플라즈마 곤디 전달을 의미하는 태반 감염에 의해 감염될 수 있으며, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 조리되지 않은 음식을 먹거나 날고기등을 통해 감염될 수 있고, 토양이나 물에 존재하는 포자성 오시스트(oocysts) 또는 고양이 배설물을 통해 감염될 수 있다. 타키조이트기는 따뜻한 혈액의 동물 세포내에서 급속하게 분열 증식되어 복제되는 단계를 의미한다. 톡소플라즈마 곤디를 암세포인 C6 세포 (C6 glioma cells)에 감염시키면 세포내부에서 톡소플라즈마 곤디가 분열 증식하면서 공포(parasitephorous vacuole: PV)를 형성시키며 PVM(parasitophorous vacuole membrane) 내에서 분열증식된 톡소플라즈마 곤디는 막(membrane)을 통해 숙주세포로부터 영양분을 획득하여 PVM 안에서 분열 증식하여 분화된다. PVM(parasitophorous vacuole membrane)는 소화되지 않는 액포이며, 영양분을 제공하고, 산성화로부터 톡소플라즈마 곤디를 보호한다(Dubey et al., 1998). 최근까지 많은 연구자들은 이러한 문제가 마이코넴즈(miconemes), 롭트리(rhoptries) 및 밀도 과립을 포함하는 기관과 밀접하게 연관되어 있다고 보고하였다. 각각의 소기관은 숙주세포로의 톡소플라즈마 곤디 침투 과정에서 각각의 단계 중 서로 다른 기능을 유발하는 관련 단백질을 방출한다. 마이코넴 단백질은 숙주세포에서 톡소플라즈마 곤디의 부착과 관련되어 있고, 롭트리 단백질은 PVM 형성 단계 및 숙주세포와의 연결에서 중요한 역할을 하며, 덴스(Densse) 과립 단백질은 숙주세포로부터 영양분을 얻고 수송하는데 기여한다(Carrnthers and Sibley, 1997).
현재 톡소플라즈마증을 치료하기 위한 효과적인 백신은 없으며, 설파다이아진, 피리메타마인, 아토바규온은 항 톡소플라즈마제로 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 최근 상기 약제가 나타내는 여러 가지 독성 및 내성 등의 심각한 부작용이 우려됨에 따라, 천연물로부터의 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 추진되고 있다. 그러므로 이러한 기존의 약물들이 질병치료에 효과적으로 이용되기 위해서는 숙주에게는 독성이 없고, 감염원(톡소플라즈마 곤디)에게는 살충효과가 강해야 한다.
한편, Zingiberacea속에 속하는 식물인 생강(Zingiber official)은 전통적으로 한약으로 사용될 뿐 아니라, 전세계적으로 향신료 및 음식 첨가물로 사용되어 왔다. 전통 의약으로서 생강은 일반적인 감기, 기침, 위장 경직, 구토, 소화불량증, 설사, 두통 및 통증을 치료하는 용도로 사용되어 왔다. 그러나 생강이 톡소플라즈마증의 예방 및 치료에 효과가 있다고 보고된 바는 없다.
이에, 본 발명자들은 생강 추출물 및 이의 분획물이 톡소플라즈마 곤디에 감염된 암세포의 생존을 억제시킬 뿐만 아니라, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 숙주세포의 세포사멸과 관련된 단백질의 발현을 억제하여 감염세포를 통한 톡소의 증식을 억제하고 직접적으로 톡소플라즈마 곤디의 생존력 및 분열을 억제하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 목적은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "생강(Zingiber officinal)"이란 생강과 생강속에 속하는 열대 아시아 원산의 다년생 풀이다. 생강과는 주로 열대에 많이 나며 전세계에 약 47속 1,400여종이 있다. 생강속은 동아시아, 인도, 말레이시아에 약 50종이 분포되어 있으며 우리나라에는 생강속에 양하, 생강이 재배되고 있으며 꽃생강속에 꽃생강 재배되고 있고, 꽃양하속에 꽃양하가 남부지방 섬의 숲 토양에 자생하고 있다. 생강의 높이는 40~100cm 가량이고 근경인 뿌리줄기는 약간 납작한 원형으로 가로 뻗은 다육질이며 뿌리줄기는 덩이져서 분지되어 있으며 노란색을 띠고 향기로운 냄새가 나며 매운맛과 자극적인 기미가 있다. 잎은 어긋나고 2개로 갈라져 있으며 잎자루는 없고 긴 잎집이 줄기를 둘러싸고 있다. 잎몸은 선모양 피침형으로 길이는 15~20cm이고 너비는 약 2cm 이며 끝이 점차 뾰족해진 모양이며 기부는 좁고 반들반들하며 털이 없다. 꽃은 담황색이고 이삭화서는 조밀하고 길이 7cm 가량이며 7~9월에 꽃이 피나 재배한 것은 거의 개화하지 않는다. 결실기는 12월부터 이듬해 1월까지이다. 삭과는 3쪽으로 갈라지며 종자는 검은색이다. 우리나라에서는 주로 재배를 하여 수확한다. 생강의 말린 근경을 건강, 근경의 코르크껍질을 강피, 잎을 강엽이라고 하여 모두 약용한다.
본 발명에서, 생강 추출물은 생강을 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계: 및 상기 분쇄된 생강을 물, C1~C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 생강 추출물은 물, C1~C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 것을 포함하며 메탄올로 추출한 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.
추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 생강 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 건조 생강을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 C1~C4의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100, 바람직하게는 25-35에서, 추출 기간은 약 5시간 내지 10일, 바람직하게는 5-48 시간 동안 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 생강의 자연건조 분말을 실온에서 메탄올로 추출 후 추출액을 필터 페이퍼를 이용하여 필터하고 35 진공에서 증발 농축시켜 추출하였다.
상기 생강 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎 및 꽃뿐만 아니라 식물 조직배양물로부터 추출가능하다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 생강 추출물은 건조 생강 뿌리에 메탄올을 첨가하여 혼합하여 얻어진 혼합액을 회수한 뒤 농축한 후 동결 건조시켜서 제조하였다.
본 발명에서, 생강 추출물의 분획물은 생강 추출물을 MeOH로 현탁한 후 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 본 발명에서 구체적인 일 양태로서 용매 분획물로는 MeOH 분획물, 물 분획물, 아세토 니트릴 분획물, n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물 또는 클로로포름 분획물이 제공된다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 생강 분획물은 생강 추출물을 CHCl3-MeOH 용출을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 분획하여 수득하였다.
또한, 상기 용매 분획물을 H2O, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올 등의 극성 용매 및 에틸아세테이트, n-헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 톡소플라즈마증 예방 및 치료에 효능이 있는 활성성분을 분리하여 사용할 수도 있다.
본 발명자들은 생강, 감초 및 은행잎 추출물에 의해 신경 암세포인 C6 세포의 생존율을 확인한 결과 생강 추출물에 C6 암세포(이하 C6 세포)의 생존율을 유의적으로 감소시키는 효과가 있으며(도 1a), 생강 추출물을 30-500 /mL 농도로 6-24시간 처리하는 경우 C6 세포의 생존율을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 1b).
또한, 생강 추출물이 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 생존율(도 1c) 및 톡소플라즈마 곤디 자체 생존율을 약 50% 까지 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 1d). 또한, 생강 추출물의 독성을 측정하기 위해 정상 폐세포를 사용하여 세포독성을 측정한 결과, 30-500 /mL의 다양한 농도로 투여하고 24시간이 경과한 이후에도 생강 추출물을 투여하지 않은 대조군과 동일하게 독성을 나타내지 않았다(도 1e).
아울러, 생강 추출물의 활성분획이 C6 세포 및 톡소플라즈마 곤디의 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과, 본원에서 사용한 활성분획(도 3의 AF)이 C6 세포의 생존율을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였으며(도 3), 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 생존율을 감소시켰고(도 4a), 단독 톡소플라즈마 곤디의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였다(도 4b). 항 톡소플라즈마 곤디 제재로 알려진 설파다이아진과 비교하여 우수한 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포 및 단독 톡소플라즈마 곤디의 생존 억제 효과를 나타냈다. 또한, 활성분획의 독성을 측정하기 위해 정상 폐세포를 사용하여 세포독성을 측정한 결과, 30-240 /mL의 다양한 농도로 투여한 후 24시간 이후에도 약제를 투여하지 않은 대조군과 동일하게 독성을 나타내지 않았다(도 4c).
또한, 생강 추출물에 의한 형태학적 변화를 확인한 결과, C6 세포에서 수지상 구조를 형성시키는 한편 톡소플라즈마 곤디의 세포내 감염을 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며(도 2), 생강 추출물의 활성분획을 처리하는 경우 숙주세포내 톡소플라즈마 곤디의 PVM을 분해하고 및 핵을 응축시키는 효과가 있음을 면역화학염색을 통해 확인하였다(도 5).
또한, 세포사멸과 관련하여 생강 추출물의 활성분획이 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포내에서 톡소플라스마 곤디를 억제 또는 사멸시키므로 숙주세포의 자발적 세포사멸 단백질의 발현을 억제시키고 숙주세포 내에서 톡소플라즈마 곤디의 분열-증식을 억제시키는 것을 확인하였다(도 6). 보다 구체적으로, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 생강 분획물(AF)을 처리한 결과, 세포 사멸의 하위 단계에서 발현되는 단백질의 발현량이 감소하였다. 이는 세포 내에서 톡소플라스마 곤디에 의해 유발되어 증가된 세포 사멸의 하위 단계에서 발현되는 단백질이 생강 분획물(AF)에 의해 톡소플라스마 곤디의 생존이 억제됨으로서 결과적으로 세포 사멸의 하위 단계에서 발현되는 단백질의 발현량도 감소되었음을 나타내는 것이다. 또한, 설파다이아진을 처리한 경우와 비교해 보다 효과적으로 항톡소플라즈마 곤디 작용을 유발시킴을 알 수 있었다. 즉, 톡소플라스마 곤디 감염된 세포내에서 톡소플라스마 곤디의 생존이 억제되는바, 세포사멸 단백질의 양을 감소시키고 이로 인해 감염된 세포의 생존율을 결과적으로 증가시키는 효과를 가진다.
톡소플라즈마 곤디의 특성상, 톡소플라즈마 곤디가 세포에 침입하여 세포를 감염시키면, 톡소플라즈마 곤디의 저항력이 강해지며 더불어 감염 세포의 저항을 유발시키고 톡소플라즈마 곤디는 세포 내에서 분열 및 증식하여 방출되므로 톡소플라즈마 곤디에 감염된 세포는 회복, 재생될 수 없다. 그러나 본 발명자들은 톡소플라즈마 곤디에 감염된 세포에 생강 추출물을 처리함으로써 톡소플라즈마 곤디와 함께 감염된 세포를 선별적으로 사멸시킴으로써 체내에서 톡소플라즈마 곤디의 증식을 억제시키고 결과적으로 톡소플라즈마증을 치료할 수 있음을 밝혔다.
본 발명에서 사용되는 용어, "톡소플라즈마증"은 원충의 일종인 톡소플라즈마 곤디(Toxoplama gondii)의 감염에 의해 일어나며, 여성이 임신 중에 감염될 경우 유산과 불임을 포함하여 태아에 이상을 유발할 수 있는 인수공통전염병의 한 종류이다. 톡소플라즈마 곤디는 우리나라를 포함하여 종숙주인 고양이 또는 고양이과의 야생동물이 서식하는 곳이면 어디나 발견되며, 사람과 애완동물 및 가축을 포함한 거의 모든 포유류와 조류 및 기타 동물들이 중간숙주 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 미국의 경우 6천만명 이상의 사람이 감염되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 생강 추출물 및 이의 활성분획은 톡소플라즈 곤디 감염에 의해 유발되는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료 활성을 갖는바, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마 곤디 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 생강 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 톡소플라즈마증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 생강 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 톡소플라즈마증 예방 및 치료용 약학 조성물은, 포유동물에 투여된 후 생강 추출물 또는 이의 활성분획물의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 생강 추출물 또는 이의 활성분획물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 톡소플라즈마증 예방 및 치료용 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물,리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등 이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 항-톡소플라즈마증 효과를 보이는 생강 추출물 및 활성분획의 유효한 농도는 30-240 /mL 농도에서 처리한 경우였으며, 더욱 바람직하게는 120-240 /mL의 농도에서 처리하는 경우이다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 은행잎 추출물, 감초 추출물 등이 병용하여 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 본 발명의 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리함으로써, 톡소플라즈마증의 증상을 완화시키거나, 톡소플라즈마증을 치료하는 항생제의 부작용은 완화시키면서 톡소플라즈마 곤디의 증식 활성을 감소시키는 효과를 의미한다.
본 발명의 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물은 톡소플라즈마 곤디의 증식을 억제하는 활성이 있는 성분을 포함하는 기능성식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하여, 상기 유형의 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 식품으로는 본 발명의 생강 추출물 또는 이의 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있으나, 상기 예에 의해 제조 가능한 형태가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 추가적인 첨가제를 포함할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 바람직하게 상기 첨가할 수 있는 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼 및 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티 및 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터 및 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장 및 소스 등) 등에 본 발명의 생강 추출물 및 그 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 의약외품 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물은 톡소플라즈마증의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 생강 추출물 또는 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물, 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 또는 코팅제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 톡소플라즈마증의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 유용하게 사용할 수 있으며, 이외에도 의약외품 및 식품 등 다양한 용도로 이용될 수 있다.
도 1은 생강 추출물의 항 톡소플라즈마 곤디 효과를 나타낸 것이다.(a); C6 세포에 감초 추출물, 은행잎 추출물 및 생강 추출물을 처리한 후의 세포 생존도, (b); C6 세포에 생강 추출물을 농도별로 처리한 후의 세포 생존도, (c); 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 감초 추출물, 은행잎 추출물 및 생강 추출물을 처리한 후의 세포 생존도 (d); 생강 추출물을 처리한 톡소플라즈마 곤디의 생존도, (e) 정상세포에 생강 추출물을 처리하고 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 시험관내에서 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 형태학적 변화를 나타낸 도이다. 숙주세포는 24시간 동안 용량 의존적으로 생강 추출물에 노출되었다. (a; 생강 추출물을 처리하지 않은 C6 세포, b; 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포, c; 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 생강 추출물(120 ㎍/㎕)을 처리한 세포, d; 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 생강 추출물(240 ㎍/㎕)을 처리한 세포).
도 3은 생강 추출물에서 분획한 여러 분획물에 노출된 C6 세포의 생존율을 나타낸 도이다.
도 4는 생강 추출물에서 분획된 활성분획에 노출된 (a) 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포, (b) 톡소플라즈마 곤디의 생존율 및 (c) 정상세포에 활성분획을 처리하고 세포 독성을 확인한 결과 나타낸 도이다.
도 5는 C6 세포의 핵염색 및 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포내에 톡소플라즈마 곤디의 PVM 면역화학염색 결과를 나타낸 도이다(AF: 생강 추출물의 활성분획, SF:설파다이아진)
도 6은 생강 추출물의 활성분획 및 설파다이아진에 노출된 톡소플라즈마 곤디에 감염된 숙주세포의 세포사멸 신호 단백질의 변화를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료
우태아 혈청(FBS), 항생제-항진균제 및 트립신-EDTA는 인비트로젠 주식회사에서 구입하였다(미국, Gibco). RPMI 1640 배지, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디오헤닐테트라졸리움 브로마이드(MTT), 소 혈청 알부민(BSA), 트립신-EDTA, 0.4% 트리판 블루 용액 및 소디움 도데실 설페이트(SDS)는 시그마 화학 주식회사에서 구입하였다(미국, MO, St. Louis). ECL 웨스턴 블롯 검출 키트는 아머샴 파머시아 생명공학 주식회사에서 구입하였다(독일). 다른 모든 화학제제 및 용매는 머크 화학 주식회사(독일) 및 시그마 화학 주식회사(미국, MO, St. Louis)에서 구입하였다.
실시예 2: 추출 및 분리정제
자연건조하여 분말화한 생강(Z. officinale, 100g) 뿌리, 감초(G. glabra, 1 kg) 및 은행나무 잎(G. biloba leaves, 1kg)을 실온에서 1L 메탄올에서 추출하였다. 추출 후, 추출물은 필터 페이퍼 및 진공 펌프를 이용하여 필터하였다. 추출물은 35℃, 진공에서 증발시켰다. 생강, 감초 및 은행나무에서 추출한 추출물 중 생강추출물은 C 6 세포와 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포 및 톡소플라즈마 곤디의 높은 생존 억제 효과를 보였는바, 생강 추출물을 CHCl3-MeOH 용출을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 분획하였다. 생강 추출물에서 분획된 활성분획은 용량 및 시간 의존적으로 C 6 세포와 톡소플라즈마 곤디에 감염된 숙주세포 및 톡소플라즈마 곤디의 생존을 강력하게 억제하였다. 잔여 성분은 동결 건조하였고, 사용 전 배양 배지에 녹여 사용하였다.
톡소플라즈마 곤디의 특성상, 사람이나 동물의 체내에서의 자연적인 감염을 제외하고 실험상에서 정상세포에 톡소를 감염시켜 실험하기가 어려운바, 환경에 강하며 잘 적응하는 암세포에 톡소플라스마 곤디를 감염시켜 생강 추출물의 효과를 실험하였다.
실시예 3: 톡소플라즈마 곤디 RH 균주 및 세포 배양
톡소플라즈마 곤디 RH 균주는 남호우 교수로부터 제공받았다(대한민국, 가톨릭대학교 의과대학, 톡소플라즈마 곤디학 교실). RH 균주는 BALB/c 마우스의 복강에서 증식시킨 후 재차 채취하여 사용하였다. 래트 C6 신경교종 세포(C6 세포)는 서울대학교의 한국 세포주 은행에서 구입하여 사용하였으며, 37℃, 공기 중 5% CO2 조건에서 10% FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 μM 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI에서 배양되었다. 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포는 1에서 10의 비율로 톡소플라즈마 곤디에 감염시킨 후 사용하였다(C6 세포: 톡소플라즈마 곤디=1:10).
실시예 4: 인비트로 세포 생존도 측정
C6 세포(4X104)는 24웰 플레이트에 접종하고, 37에서 배양하였다. 24시간 후, C6 세포는 생강, 감초 및 은행나무 추출물로 처리하고, 세포증식 억제 비율은 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-dipherryl tetrazolium bromide (MTT) 분석으로 측정하였다. C6 세포의 증식률(proliferation rate:PR)은 (OD 실험군/OD 대조군) X100%에 의해 계산하였고, 흡광도는 ELISA 플레이트 리더기로 570nm에서 측정하였다. 단독의 톡소플라즈마 곤디는 96 웰 플레이트에 3X106/웰로 접종하였고, 각각의 웰은 24시간 동안 생강 추출물로 처리한 후, 생강의 항 톡소플라즈마 곤디 활성을 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 24 웰 플레이트에 C6 세포를 4X104 농도로 접종하고, 24시간 후, 각각의 웰에 4X105 개체/웰의 비율로 톡소플라즈마 곤디를 감염시켰다. 24시간 후, 생강 추출물을 각각의 웰에 서로 다른 농도로 처리하였다(30-500 ㎍/mL).
또한, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 숙주세포 및 톡소플라즈마 곤디에 활성분획 및 설파다이아진을 처리한 후, 활성분획 및 설파다이아진이 톡소플라즈마 곤디의 증식을 억제하는 효과를 비교하였다.
실시예 5: C6 세포에서 톡소플라즈마 곤디 RH 균주의 현미경 관찰
C6 세포(4X104)는 24웰 플레이트에 접종하였고, 37℃에서 24시간 배양 후, 톡소플라즈마 곤디를 4X105 트로포조이트/웰 의 비율로 감염시켰다. 24시간 후 서로 다른 농도(30-240 ㎍/mL)의 생강 추출물을 24시간 동안 투여 처리하였다. C6 세포 및 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 형태적 변화는 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다(일본, 니콘 이클립스 TE 2000-U).
실시예 6: Hoechst 33342 염색
Hoechst 33342는 세포내 핵 염색 시약으로 dsDNA에 결합하여 파란색의 형광을 방출한다. C6 세포는 웰당 5X104 농도로 24 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였고, 5X105 트로포조이트/웰의 비율로 톡소플라즈마 곤디를 감염시켰다. 다양한 농도의 활성분획을 처리한 톡소플라즈마 곤디가 감염된 C6 세포는 37℃, 5% CO2가 첨가된 습도조건에서 배양되였다. PBS로 세척 후, 세포를 5% PBS가 첨가된 포름알데히드에서 고정하였다. 세포를 PBS로 세척하고 최종 농도 20 μM로 PBS에 녹인 Hoechst 33342로 염색하고(미국, MO, St. Louis, 시그마 화학 주식회사) 30분간 암조건에서 반응시켰다. 반응 후, 세포를 PBS로 3번 세척하고, UV 형광 현미경(일본, 니콘 이클립스 TE 2000-U)을 이용하여 핵의 형태를 관찰하였다. 활성분획이 처리되지 않은 C6 세포는 AF (active fraction: 활성분획)의 효과를 확인하기 위한 대조군으로 사용되었다.
실시예 7: 면역형광 분석
톡소플라즈마 곤디를 감염시키기 전, 5X104 세포를 신선한 배지에서 24 웰 플레이트에 커버 슬립을 깔고 접종하였다. 24시간 후, 5X105 톡소플라즈마 곤디를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 24시간 배양 후, 샘플을 3% 포름 알데히드로 10분간 처리하여 고정하였고, 0.05%(v/v) 트리톤 X-100을 처리하였다. 이후, 샘플은 1X PBS 용액에 1% BSA를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 고정하였다. 마우스 항-PVM 항체는 1% BSA/PBS 조건에서 1:100의 농도로 희석하였고, 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS 세척 후, 염소 항-마우스 IgG-FITC-결합된 이차 항체는 1:100의 농도로 희석하여 형광을 보호하기 위한 덮개를 사용하여 보호하였다. 샘플은 PBS로 세척하였고, 커버 슬립은 형광현미경 분석을 위하여 마운팅 용액을 사용하였다(일본, 니콘 이클립스 TE 2000-U).
실시예 8: 웨스턴 블롯 분석
톡소플라즈마 곤디를 숙주세포에 24시간 감염 후, 활성분획을 서로 다른 농도로 처리하고 24시간 후 수확하였다. 펠렛은 RIPA 용액으로 용해시켰다(Elpis Biotech). 단백질 농도는 595nm에서 UV-측정기기를 통해 측정하였고, 1% BSA를 기준으로 단백질의 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 12% SDS-PAGE에 전기영동 하였고, 전기적 이동에 의해 니트로셀룰로스 막으로 단백질이 이동 되였다. 막은 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS에 5% 스킴밀크를 첨가하여 실온에서 1시간 고정하였고, 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS로 5분 간격으로 5번 세척하였다. 고정용액에 녹인 일차 항체와 4℃에서 하루 동안 반응시켰고, 항체의 희석배율은 실험에 의해 결정된 값으로 1:500을 사용하였다. 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS로 5분 간격으로 5번 세척 후, 막은 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 혼성화된 이차 항체를 120분간 처리하였다. 이후, 세척과정을 반복하고 단백질 밴드는 ECL 검출 시스템에 의해 확인하였다. 모든 항체는 미국의 Santa Cruz Biotechnology, Cell signaling 및 R&D system사에서 구입하였다.
실시예 9: 통계적 분석
모든 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ±S.D. 값으로 나타내었다. 통계적 분석은 SPSS 패키지(ANOVA; 버전14)를 사용하여 수행하였다. P값은 <0.05 통계적으로 유의적인 값으로 간주하였다.
실험예 1: 생강에 의한 세포 생존 억제( 도1 , 도3 및 도4 )
세포의 증식 및 성장에 미치는 생강, 감초 및 은행나무의 효과를 확인하기 위하여, C6 세포, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포 및 단독의 톡소플라즈마 곤디를 다양한 농도의 생강 추출물 및 활성분획에 노출시키고, 세포의 생장을 MTT 분석으로 측정하였다.
1-1. 생강 추출물의 C6 세포 생존도에 미치는 효과
C6 세포를 생강, 감초 및 은행나무 추출물의 30-500 ㎍/mL의 다양한 농도범위에서 24시간 동안 배양한 결과, 세포의 생존도는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 생강, 감초 및 은행나무 추출물이 세포의 분화와 증식에 억제효과가 있음을 나타내며, 이들 추출물 중, 생강은 가장 강력한 억제효과를 나타내었다(도 1a). 특히, 120 ㎍/mL농도에서부터 생강 추출물에 12시간 이상 노출된 C6 세포(도 1b)의 생존율은 50% 이하로 감소하였다.
1-2. 생강 추출물의 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포 생존도에 미치는 효과
생강 추출물에 24시간 노출된, 톡소플라스마 곤디에 감염된 C6 세포(도 1c)의 생존율은 50% 이하로 감소하였다.
1-3. 생강 추출물의 단독 톡소플라즈마 곤디 생존도에 미치는 효과
단독의 톡소플라즈마 곤디에 생강 추출물(도 1d)을 24시간 처리한 결과 120 ㎍/mL농도에서부터 톡소플라즈마 곤디의 생장율이 50% 정도로 감소하였다.
1-4. 생강 추출물의 정상 세포 생존도에 미치는 효과
생강 추출물의 세포 독성을 확인하기 위하여 정상 폐세포에 30-500 ㎍/㎖의 생강 추출물을 처리한 결과, 정상 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1e).
1-5. 활성분획의 C6 세포 생존도에 미치는 효과
C6 세포에 생강 추출물에서 분획된 11개의 분획물을 각각 30-240 ㎍/mL로 처리하고 24시간 후 C6 세포의 생존율을 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)방법에 의해 확인한 결과, 활성분획(active fraction: AF)이 가장 유의한 억제 효과를 나타내었다(도 3).
1-6. 활성분획의 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포 생존도에 미치는 효과
도 4는 활성분획 및 설파다이아진 처리 후 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포(도 4a)의 세포 생존율에 대한 억제 효과를 나타낸 결과이다. 도 4a의 결과에서 대조군은 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포이다. 실험군은 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 농도-의존적으로 활성분획을 투여한 세포이다. 톡소플라즈마 곤디의 특성상, 톡소플라즈마 곤디가 세포에 침입하여 세포를 감염시키면 톡소플라즈마 곤디의 저항력이 강해지며 더불어 감염세포의 저항을 유발시킨다. 이에 따라 톡소플라즈마 곤디는 세포내에서 분열-증식한다. 그러나 도 4a의 결과와 같이, 활성분획을 처리한 경우 대조군에 비해 감염세포의 생존율을 유의하게 억제시키며, 현재 사용되고 있는 항-톡소플라즈마 치료제인 설파다이아진에 비해서도 감염 세포의 생존율을 보다 강하게 억제시켰다. 이는 활성분획이 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에서 톡소플라즈마 곤디의 분화 및 성장을 농도와 시간 의존적으로 감소시키는 것을 보여주는 결과이다.
1-7. 활성분획의 단독 톡소플라즈마 곤디 생존도에 미치는 효과
활성분획 투여 후 단독 톡소플라즈마 곤디(도 4b)의 생존율에 대한 억제 효과를 나타낸 결과이다. 도 4b의 나타난 결과에서와 같이 톡소플라즈마 곤디에 활성분획을 처리하는 경우, 활성분획이 톡소플라즈마 곤디를 사멸시키는 효과를 직접적으로 확인할 수 있었고, 설파다이아진과 비교하여 생강 추출물의 약제학적 효능을 보다 직접적으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 활성분획이 톡소플라스마의 증식 활성을 보다 효과적으로 감소시킴을 나타내는 결과이다.
1-8. 활성분획의 정상 세포 생존도에 미치는 효과
활성분획의 세포 독성을 확인하기 위하여 정상 폐세포에 30-240 ㎍/㎖의 생강 추출물을 처리한 결과, 정상 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 4c).
실험예 2: 생강 추출물에 따른 톡소플라즈마 감염 C6 세포의 형태학적 변화(도 2)
생강 추출물의 효과를 관찰하기 위해, 생강 추출물을 처리한 후 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 항-증식 효과를 현미경으로 관찰하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 120-240 ㎍/mL의 생강 추출물을 24시간 처리 한 결과, 생강 추출물을 처리한 톡소플라즈마 감염 C6 세포는 C6 세포와 비교하여 수지상 구조의 형성을 포함한 형태적인 변화를 나타냈고, 세포수가 감소함을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 생강 추출물에 따른 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포의 면역화학염색 결과(도 5)
톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 다양한 농도의 활성분획 및 설파다이아진을 24시간동안 처리하였다. C6 세포의 PVM 변화는 마우스 항-PVM 항체를 사용하여 면역화학염색을 통해 확인하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 활성분획이 처리된 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포는 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포와 비교하여 숙주세포에서 톡소플라즈마 곤디의 분열기간 중에 형성되어 나타나는 PVM이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에서 톡소플라즈마 곤디에 의한 세포사멸 과정의 변화는 감염 비율에 따라 시간-의존적으로 초기 단계에서 세포사멸 단백질의 불활성화를 동반하는 세포사멸 과정을, 중기 단계에서는 세포사멸 단백질의 활성화를 동반하는 세포사멸 과정으로 나타난다. 톡소플라즈마 곤디에 감염된 C6 세포에 다양한 농도의 활성분획 및 설파다이아진을 24시간 동안 처리 후, 그들의 핵 변화를 Hoechst 33342를 이용한 형광염색을 통해 측정하였다. 그 결과, 활성분획 및 비교군인 설파다이아진은 숙주세포내의 톡소플라즈마 곤디의 분해뿐만 아니라 숙주세포의 핵 크로마틴을 응축시켰다. 이러한 결과는 항 톡소플라즈마 곤디의 효과를 야기하는 활성분획이 숙주세포에서 용량 의존적으로 톡소플라즈마 곤디를 감소시킴을 나타내는 중요한 증거이다.
실험예 4: 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포에서 활성분획의 세포사멸 단백질에 대한 효과 (도 6)
활성분획 및 설파다이아진을 24시간 처리 후, 세포사멸 신호 단백질을 웨스턴 블롯을 이용하여 검출하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포에서, caspase-3 활성은 설파다이아진과 비교하여 60 ㎍/mL의 농도범위에서 강력하게 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 톡소플라즈마 곤디에 의한 p53, p21 및 bax의 활성은 농도-의존적으로 활성분획에 의해 억제되었다. 이러한 결과는 활성분획이 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포에서 톡소플라즈마를 사멸시켜 감염세포 내에서 톡소플라즈마 곤디의 감염에 의해 야기되는 세포사멸단백질의 활성이 억제됨을 나타내는 것이며, 이러한 단백질의 변화는 활성분획이 톡소플라즈마 곤디의 증식을 억제하는 것을 나타내는 증거이다.
생체에서 숙주세포가 톡소플라즈마 곤디에 감염되면, IFN- STAT1 및 T-bet의 신호 전달을 통한 Th1 T 림프구의 서로 다른 분화를 유발하며, 톡소플라즈마 곤디 감염 및 항-프로토조아 내성을 증진시키는 항프로토조아 영향을 가속화한다. 톡소플라즈마 곤디에 의해 감염된 숙주세포는 초기 감염단계에서 면역반응을 포함하는 보호 체계를 촉진하며, 톡소플라즈마 곤디가 분비하는 분비물을 인지하는 방어메커니즘을 활성화시키고 세포사를 진행시킨다. 또한, 톡소플라즈마 곤디는 항-세포사멸을 유발하기 위해 감염 후 숙주세포에서 세포사멸 신호를 감소시킨다. 세포가 톡소플라즈마 곤디에 감염되면, 톡소플라즈마 곤디의 신호에 의해 숙주세포는 IL의 생산을 감소시키며, caspase-3를 불활성화 시키고, 미토콘드리아에서 시토크롬-c의 방출을 억제시킨다.
도 6에서 보는 바와 같이, p53의 발현 수준은 양성 대조군과 비교하여 활성분획 및 설파다이아진 처리 그룹에서 감소하였고, 양성대조군의 발현 수준은 대조군과 비교하여 증가하였다. p21의 발현 수준은 양성 대조군 및 대조군과 비교하여 설파다이아진을 투여한 그룹에서 증가하였고 활성분획 처리군에서는 감소하였으며, Cdk2 단백질의 발현은 활성분획과 설파다이아진 투여 그룹에서 감소하였다. 이러한 p21과 Cdk2 단백질의 서로 다른 형태의 활성 결과는 세포 주기 정지 과정에서 활성분획과 설파다이아진이 서로 다른 세내포 경로에 의해 자극되는 것을 나타내는 결과이다. 톡소플라즈마 곤디의 침투에 의해 양성대조군 C6 세포에서 caspase-3, p53 및 p21 단백질의 발현이 활성화되었다. 반면, 활성분획 및 설파다이아진 투여 그룹에서 caspase-3, p53 및 p21의 발현 수준은 농도-의존적으로 불활성화되었다. 세포사멸 신호 경로를 포함한 bax 단백질의 발현 수준은 양성 대조군과 비교하여 활성분획 및 설파다이아진을 투여한 그룹에서 감소하였다. 이러한 결과는 톡소플라즈마 곤디 감염 숙주세포의 세포사멸과정이 톡소플라즈마 침투 초기에 caspase-3 신호의 활성화에 의해 유도되나, 침입 후 숙주세포내 톡소플라즈마 곤디의 증식 기간 중에 발생되는 톡소플라즈마 곤디의 내부 신호억제 시스템에 의해 숙주세포의 세포사 진행과정이 억제되는 것을 보여주는 결과이며 활성분획이 톡소플라즈마 곤디 및 톡소플라즈마 곤디 감염 세포내에서 유도되는 항-세포사멸 과정에 대하여 톡소플라스마 곤디에 특징적인 항-톡소플라즈마 곤디 효과를 유발하여 야기되는 것을 보여주는 결과이다.
결론적으로, 이러한 결과는 톡소플라스마 곤디 감염 C6 세포내에서 일어나는 p53, p21, caspase-3, bax 및 Cdk2를 포함하는 세포사멸 신호 단백질이 생강 추출물의 활성분획에 의해 야기되는 항-톡소플라스마 효과에 의해, 톡소플라즈마 곤디 감염 C6 세포의 세포사멸로부터 숙주세포를 보호하는 효과가 있으며 숙주세포를 통한 톡소플라스마의 분열-증식을 차단하여 톡소플라즈마 곤디를 억제시키는 중요한 결과이다.

Claims (9)

  1. 생강(Zingiber officinale) 추출물의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 분획물은 클로로포름(CHCl3)-메탄올(MeOH) 용출을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 수득한 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것인 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 저급 알콜 용매는 메탄올인 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 생강의 뿌리에서 추출한 것인 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 톡소플라즈마증은 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 감염으로 인한 것인 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 생강 추출물의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 식품 조성물로서, 상기 분획물은 클로로포름-메탄올 용출을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 수득한 것인 식품 조성물.
  9. 생강 추출물의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 개선 또는 예방용 의약외품 조성물로서, 상기 분획물은 클로로포름-메탄올 용출을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 수득한 것인 의약외품 조성물.
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