KR20140042577A - 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도 - Google Patents

암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20140042577A
KR20140042577A KR1020120109507A KR20120109507A KR20140042577A KR 20140042577 A KR20140042577 A KR 20140042577A KR 1020120109507 A KR1020120109507 A KR 1020120109507A KR 20120109507 A KR20120109507 A KR 20120109507A KR 20140042577 A KR20140042577 A KR 20140042577A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mael
cancer
protein
gene
cells
Prior art date
Application number
KR1020120109507A
Other languages
English (en)
Inventor
신현진
이기호
김수현
박은란
우선랑
한철주
김상범
박선후
조응호
Original Assignee
한국원자력의학원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국원자력의학원 filed Critical 한국원자력의학원
Priority to KR1020120109507A priority Critical patent/KR20140042577A/ko
Publication of KR20140042577A publication Critical patent/KR20140042577A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 MAEL(MAELstrom) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 치료후 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법, MAEL 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물 및 MAEL 유전자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 암치료를 수행한 개체에서 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현수준을 측정하여 암의 예후를 예측할 수 있고, 암 세포의 증식, 전이 및 생존에 관여하는 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있으므로, 보다 효과적인 암의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

암의 예후 예측 및 치료를 위한 ＭＡＥＬ의 용도{Use of MAEL for the Predicting Prognosis and Treatment of Cancer}
본 발명은 암의 예후 예측 및 치료를 위한 MAEL의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 MAEL(MAELstrom) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 치료후 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법, MAEL 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물 및 MAEL 유전자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 국내 사망 원인의 1위를 차지하는 중대 질환으로 암을 정복하기 위한 수많은 연구가 있어 왔지만 아직까지 정복되지 않고 있는 난치병이다. 이러한 암의 치료에 있어서, 가장 중요한 것은 암의 조기진단으로서, 조기진단된 암의 경우 매우 높은 완치율을 나타낸다. 그러나, 암의 증상이 생리학적으로 나타나는 경우에는 대부분 암이 상당수준으로 진전된 이후인 경우가 대부분이므로, 대체로 유전자 마커를 이용하여 암을 진단하고 있는 실정이다.
한편, 이처럼 진단된 암에 대한 기존의 치료법으로는 수술, 화학 요법 및 방사선 치료 등이 있으나, 각각의 방법에 한계가 많아 최근에는 이러한 치료법들과는 개념이 다른 치료법들이 연구되고 있는데 그중에서 특히 유전자 치료법이 활발히 연구되고 있다.
유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다. 이러한 유전자 치료법을 암의 치료에 적용하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키는 방법은 짧은시간내에 암의 치료효과를 확인할 수 있다는 장점이 있는 반면, 암조직이 아닌 정상조직의 세포에 치료 단백질이 발현되어 예상하지 못한 부작용을 일으킬 가능성이 있기 때문에, 정상조직에서는 발현되지 않고, 암 조직의 세포에서만 특이적으로 발현되는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 방법에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다.
상기 방법으로 암을 치료하기 위하여는, 암조직에서 발현되어 치료의 표적이 될 수 있는 유전자를 발굴하는 과정이 선행되어야 하며, 현재 전세계적으로 암치료의 표적 유전자를 발굴하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구로부터 규명된 표적 유전자로는 최근에 규명된 ANT2(adenine nucleotide trnaslocator 2)(특허공개 제2007-101610호), PTTG1(pituitary tumor- transforming gene 1)(특허공개 제2006-96872호), KLK-5(kallikrein 5)(특허공개 제2009-81289호), EGFR(epidermal growth factor receptor)(특허공개 제2003-7640호) 등을 비롯한 다양한 유전자가 알려져 있는데, 다양한 암에 따라 서로 다른 유전자가 관여하기 때문에, 보다 다양한 유전자를 발굴하여 유전자 치료법에 적용하려는 연구가 계속되고 있다. 이처럼 치료의 표적이 되는 유전자는 암의 증상이 경감 또는 치료됨에 따라 발현수준이 대체로 저하되는 양상을 나타내므로, 상기 표적 유전자들을 암의 예후 예측용으로도 사용할 수 있다.
대체로, 상술한 암의 진단과 치료후 예후 예측은 서로 다른 유전자가 사용되고 있는데, 이는 암의 초기발생에 관여하는 유전자와 암의 증식, 전이, 유지 등에 관여하는 유전자가 서로 상이하기 때문이다. 암의 진단에 관여하는 유전자는 진단의 특성상 약물의 처리와 관련이 없기 때문에, 그의 발현수준이 약물치료와는 연관관계가 없을 수도 있는 반면, 암의 증식, 전이, 유지 등에 관여하는 유전자는 그의 발현수준이 약물치료와 밀접한 연관관계를 나타내므로, 암의 진단에 사용되는 유전자와 예후 예측에 사용되는 유전자는 대부분 상이하다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 암의 치료후 예후 예측에 사용될 수 있는 유전자를 발굴하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, MAEL(MAELstrom)이 암치료의 예후 예측에 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 MAEL(MAELstrom)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 치료후 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MAEL 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MAEL 유전자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 MAEL(MAELstrom)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 치료후 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "MAEL(MAELstrom) 유전자"란, 정소의 생식선에서 발현되는 암/정소 연관 유전자(cancer/testis associated gene, CT 유전자)의 하나인 MAEL 단백질(GenBank Accession No. AAH34310.1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미하는데, 세포내에서 발현된 MAEL 단백질은 핵주위의 전자밀도가 높은 구조체인 nuage 구조체에 위치하고, 유전적 안정성을 유지시키고 정자발생에 중요한 역할을 수행하는 리보핵단백질 복합체인 pi-RNA 복합체와 연관된 것으로 알려져 있다. 특히, 포유동물에서 MAEL 단백질은 수컷 생식선에서 레트로트랜스포손의 불활성화와 정자형성에 필수적이라고 알려져 있다. 그러나, 상기 유전자의 발현수준이 암 치료후 예후 예측에 사용됨이 보고된 적은 없으며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다. 본 발명의 목적상 암세포의 형성 및 유지에 중요한 역할을 수행하는 상기 MAEL은 암치료를 위한 표적 또는 암의 치료후 예후 예측에 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "암 마커"란, 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질인 암 진단 마커(diagnosis marker) 또는 암 치료후 예후를 예측할 수 있는 물질인 암 예후 예측용 마커(predicting cancer prognosis)를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 암 마커는 암 예후 예측용 마커가 될 수 있는데, 이는 암의 치료이전과 비교하여 암을 치료한 후에 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등이 될 수 있고, 바람직하게는 암 치료후 세포 또는 개체에서 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 수준이 감소되는 MAEL이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적상 상기 MAEL 유전자의 발현 수준을 측정하는 상기 조성물은 암의 예후 예측에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포에서만 특이적으로 과발현되므로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 암의 진단에도 사용될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 의해 예후를 예측할 수 있는 암의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 자궁경부암, 유방암, 간암 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 MAEL 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 과정 또는 방법을 의미한다.
본 발명의 용어 "mRNA 발현 수준 측정"이란, 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정 또는 방법을 의미하는데, 일반적으로는 mRNA 의 양을 측정하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 mRNA 의 양을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질 발현수준 측정"이란, 암의 진단 또는 치료후 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 대한 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)이며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인 할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머(primer)"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 하여 적절하게 변형할 수 있다.
본 발명의 용어 "프로브(probe)"란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링(labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는, 본 발명의 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암 질환의 발병 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 MAEL 단백질 또는 MAEL 폴리펩티드의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.
본 발명의 용어 "항체"란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 MAEL 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 MAEL 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, MAEL은 체세포성 암세포에서 발현되고(도 3a 및 3c), 암조직 및 다양한 암세포에서 과발현되며(도 3B, 4A 및 4C), 간암치료후 예후예측에 사용될 수 있고(도 5), Myc/Ras에 의해 유도된 암세포로의 형질전환에 필수적인 역할을 수행함을 확인하였다(도 9).
또한, MAEL이 발현되지 않은 경우에는 암세포 생존 신호경로가 불활성화되며, 역전위인자의 전사가 유도되고(도 7A), 암세포에서 자연적인 DNA 손상 및 노화가 유도됨을 확인하였다(도 8 및 9).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 암 예후 예측용 마커인 MAEL 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 확인함으로써 발병된 암의 치료후 예후를 예측하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 키트는 암 예후 예측용 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 조성물 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 정량 검출을 위한 진단 키트는 MAEL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, MAEL의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 서열과 결합할 수 있는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP 등을 포함하는 RT-PCR 키트가 될 수 있다.
한편, 본 발명의 MAEL 단백질의 수준을 측정하는 암 예후 예측용 키트는, 본 발명의 MAEL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 ELISA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 이처럼 항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 MAEL 단백질 및 그의 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 용어 "항원-항체 복합체"란, 본 발명에서 제공하는 암 예후 예측용 마커인 MAEL 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다. 예를 들면, 암이 발병된 개체를 대상으로 치료 전후의 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 MAEL 단백질의 유의한 발현량 변화를 판단하여 특정 개체에서의 암의 치료후 예후를 예측할 수 있는데, 암 치료를 수행한 개체의 시료에 본 발명의 MAEL 단백질에 대한 항체를 처리하면, MAEL 단백질과 항체가 항원-항체 복합체를 형성하게 되고, 이는 상기 기술된 ELISA, RIA, 샌드위치 분석, 웨스턴 블럿, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니, 면역 확산법, 로켓 면역 전기 영동, 조직면역염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 및 면역블럿 방법을 포함하는 키트에 의해 그 양을 측정할 수 있게 된다. 또한 상기 분석 결과를 암 치료 이전 개체의 정량 결과와 비교 분석함으로써, 본 발명의 MAEL 단백질의 발현 변화에 따른 암 예후를 예측할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 키트를 이용하여 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 (i) 암의 치료가 수행된 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 MAEL 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및, (ii) 상기 측정된 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 암 치료 이전 시료의 것보다 감소하는 경우 암이 치료 또는 개선된 것으로 판정하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 방법(DNA chip technology) 등이 될 수 있다. 또한, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 암이 발병되어 세포 또는 조직에서 MAEL이 발현되는 살아있는 유기체를 의미하는데, 바람직하게는 포유동물이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "생물학적 시료"란, MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 발현 수준을 검출할 수 있는 시료를 의미하며, 그 예로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 MAEL 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 MAEL 단백질의 발현을 억제하는 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 MAEL 유전자에 대한 siRNA, shRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "siRNA(small interfering RNA)"란, RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서(dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 MAEL 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 이러한 siRNA는 공지된 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 실험실적 환경에서 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등에 의해 제조될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 상기 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 크기를 가지는 올리고머 분자를 의미하는데, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.
본 발명의 용어 "안티센스"란, 안티센스 올리고머라고도 하고, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 상기 안티센스는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있고, mRNA의 번역을 차단 또는 저해하며, mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스는 바람직하게는 MAEL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머가 될 수 있다. 상기 안티센스는 통상적인 방법으로 개체에 투여함으로써 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제시키는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법(J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182, 1998)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
아울러, 상기 MAEL 단백질의 활성을 억제하는 물질로는 MAEL 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 등이 될 수 있다. 이때, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, MAEL 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 MAEL 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, MAEL이 발현되지 않은 경우에는 암세포 생존 신호경로가 불활성화되며, 역전위인자의 전사가 유도되고(도 7A), 암세포에서 자연적인 DNA 손상 및 노화가 유도됨을 확인하였다(도 8 및 9).
아울러, 본 발명에서 제공하는 조성물은 유효성분으로 사용되는 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 MAEL 폴리펩티드의 활성을 억제하는 항체 이외에, 암치료 활성을 나타내는 공지의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 공지의 치료제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 방사성 핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 질소 머스타드 등이 될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수,덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한 되는 것은 아니다.
상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다.투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 MAEL 유전자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 MAEL 유전자를 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법은 (i) 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 MAEL 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및, (ii) 상기 측정된 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 정상 대조군 시료의 것보다 증가하는 경우 암으로 판정하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법과 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 같이, 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 방법, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색법, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 면역형광법, 면역크로마토그래피법, FACS 분석법 또는 단백질 칩 방법 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 암 치료제 스크리닝 방법은 후보 물질의 처리에 의해 MAEL 발현이 증가되는 경우, 상기 후보 물질을 암 질환을 촉진시키는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보 물질에 의해 MAEL 발현이 감소하는 경우, 처리된 후보 물질이 암 치료제로 사용될 수 있을 것으로 판단할 수 있게 된다. 이러한 스크리닝 방법에 있어서, 그 활성 측정은 MAEL 발현 수준에 따라 용이하게 판단될 수 있다.
본 발명의 조성물은 암치료를 수행한 개체에서 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현수준을 측정하여 암의 예후를 예측할 수 있고, 암 세포의 증식, 전이 및 생존에 관여하는 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있으므로, 보다 효과적인 암의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 MAEL 이소폼이 다양한 체세포성 암세포주에서 발현됨을 나타낸다. (A): MAEL 이소폼 단백질의 구조를 나타내는 개략도이다. (B): 인간의 암세포주로부터 MAEL의 발현을 나타내는 웨스턴 블럿 분석이다. (C): HeLa 세포주에 siRNA와 플라스미드를 동시 도입하고 72시간 후에 총 단백질을 추출하였다. (D): RT-PCR 분석을 이용하여 HeLa 세포와 MDA-MB231 세포에서 MAEL 이소폼 3을 확인하였다.
도 2는 MAEL 이소폼이 증식하는 세포에서 높은 수준으로 발현됨을 나타낸다. (A): 다양한 세포주에서 MAEL mRNA의 내재적 발현은 RT-PCR에 의해 검출되었다. 다양한 세포주는 cDNA를 합성하고, 역전사 PCR을 이용하여 cDNA를 합성하였다. GAPDH RNA의 RT-PCR은 대조군으로 사용되었다. (B): 다양한 암세포주로부터 MAEL 발현의 웨스턴 블럿 분석 (C): HCC로부터 유래된 조직을 이용한 웨스턴 블럿 분석은 인간의 조직에서 MAEL의 뚜렷한 발현을 나타내었다.
도 3은 MAEL은 다양한 암세포의 생존에 필수적임을 나타낸다. (A) HeLa, MDA-MB-231, 293T, WI38, IMR90 및 HUVEC 세포의 형태를 나타낸다. 상기 세포들은 72시간 동안 siCon 및 siMAEL로 형질도입되고, 광학현미경에서 관찰되었다. (B) HeLa, MDA-MB-231, 293T, WI38, IMR90 및 HUVEC 세포의 세포수를 나타낸다. 세포는 siRNA가 도입되고 3일이 경과한 후에, trypan blue exclusion 방법으로 생존하는 세포를 계수하였다. (c) 세포에 siCon 및 siMAEL로 형질도입한 후에 웨스턴 블럿으로 분석하였다.
도 4는 MAEL 고갈은 암세포 생존 신호전달을 감소시키고, 세포자멸 및 노화를 유도함을 나타낸다. (A) 웨스턴 블럿 분석. 세포 추출물을 siRNA가 도입된 HeLa 세포 및 WI38 세포에서 수득하였다. 세포 파쇄물을 수득하고, 웨스턴 블럿 분석으로 MAEL, pERK, EGFR, pAKT 및 β-액틴의 수준을 검출하였다. (B) 본 발명자는 HeLa 세포주를 사용하였다. 세포를 단일세포로 분리하고, PBS로 세척한 다음, FITC Annexin V apoptosis detection kit(BD)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 염색하였다. (C) 웨스턴 블럿 분석. HeLa 세포에 siRNA와 플라스미드를 동시에 도입하였다.
도 5는 MAEL의 발현수준과 간암치료 후 예후 간의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 6은 MAEL은 암세포에서 유전적 완전성에 필수적임을 나타낸다. (A) HeLa, MDA-MB-231, 293T, WI38, IMR90 및 HS68 세포에 72시간 동안 siCon 또는 siMAEL을 도입하였다(D3). 세포를 고정하고 PI로 염색한 후에 DNA 량을 분석하였다. (B) HeLa 세포에 24, 36, 48 및 60시간 동안 siRNA를 도입하였다. MAEL, pChk1(ser345), PARP, pH2AX 및 β-액틴의 발현을 웨스턴 블럿 분석법으로 분석하였다. (C) HeLa 세포에 MAEL 또는 대조군 siRNA를 도입하고 3일 후에 gamma-H2AX 및 53BP1를 도입하고 면역염색하였다. DAPI(4',6'-diamidino-2-phenylindole) 염색을 이용하여 핵을 가시화하였다.
도 7은 MAEL의 고갈이 노화를 유도함을 나타낸다. (A) 노화-연관 β-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성분석결과. MRC5 세포에 siCon 및 siMAEL을 도입하였다. 세포를 고정하고 SA-β-gal를 염색하였다(좌측). SA-b-gal 활성을 나타내는 염색된 세포를 계수하고, 총 새포수에 대한 백분율로 표시하였다(우측). (B) MRC5 세포에 siRNA를 도입하였다. MAEL 및 p21의 발현을 웨스턴 블럿 분석법으로 분석하였다.
도 8은 ATM/ATR 신호전달의 저해는 MAEL 고갈에 의해 매개되는 세포자멸을 억제함을 나타낸다. (A) 증식은 크리스탈 바이올렛 분석에 의해 결정되었다. HeLa 세포 및 MDA-MB-231 세포에 siMAEL과 siATM/siATR을 도입하였다. 상기 세포를 10일동안 관찰하고, 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. (B) FACS 분석결과. HeLa 세포에 72시간 동안 siRNA를 도입하였다(D3). 상기 세포를 고정하고 PI로 염색한 후에 DNA 량을 분석하였다. (C) 웨스턴 블럿 분석결과. HeLa 세포에 siCon, siMAEL 및 siATM를 도입하였다.
도 9는 MAEL은 Myc/Ras 유도된 형질전환에 필수적임을 나타낸다. (A) MEF 형질전환체의 Colony 형질전환 분석결과. 세포(8 × 105)를 접종하고 14일이 경과한 후, 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 사진을 촬영하였다. (B) Colony 형질전환 분석 결과. 2주후에 콜로니수를 계수하였다. 실험은 중복하여 수행하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 세포 배양
인간의 자궁경부암인 HeLa 세포주, 인간배아의 신장세포인 293T 세포주, 인간의 섬유육족 세포인 HT1080 세포주, 폐의 섬유아세포인 WI38 세포주, 인간의 배아 섬유아세포인 IMR90 세포주 및 인간의 포피 섬유아세포인 HS68 세포주를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 또한, 인간의 유방암세포인 MDAMB-231 세포주는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 상기 각 세포들은 37℃ 및 5% CO2 배양조건에서 배양하였다.
실시예 1-2: 플라스미드와 siRNA 의 형질도입
MAEL을 위한 Myc 발현벡터를 상응하는 PCR 산물의 클로닝에 의해 제작하였다.
먼저, MAEL 서열은 pfu DNA 중합효소, 정방향 프라이머 5'-ATGCCGAACCGTAAGGCCAGCCG-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-AGGGAAGTTGGGCCTGTTACT-3'(서열번호 2)를 이용하여 증폭되었다. 상기 절편은 BamHI 및 NotI 좌위를 이용하여 pIRES-puro-Myc 벡터내에 클로닝하였다.
상기 MAEL을 결실시키기 위하여, shRNA를 pSuper-puro에서 발현시켰다. pSuper-puro-MAEL 플라스미드는 BglⅡ 및 HindⅢ 다중클로닝 좌위의 사이에 루프서열을 이용하여, 센스 및 안티센스 마우스 서열을 삽입함으로써 제작하였다. 상기 삽입체는 하기 두개의 어닐링 프라이머에 의해 제작되었다.
5'-gatcccccagcaatagtgtgacacccaattcaagagattgggtgtcacactattgctgtttttggaaa-3'(서열번호 3)
5'-agcttttccaaaacagcaatagtgtgacacccaatctcttgaattgggtgtcacactattgctgggg-3'(서열번호 4)
세포에 리포펙타민 RNAiMAX(13778-150, Invitrogen)를 사용하여 최종 농도가 20nM이 되도록 MAEL siRNA(1: 5'-CCAGCCGGAATGCTTACTA-3'(서열번호 5), 2: 5'-GGAACTGGCCACCTATCTA-3'(서열번호 6) 3: 5'-CAGCAATAGTGTGACACCCAA-3'(서열번호 7)) 및 음성대조군(siCon)을 도입하였다.
실시예 1-3: 면역형광분석
세포를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지가 담겨진 챔버 슬라이드에 접종하였다. 상기 세포를 얼음 및 4℃ 냉장고에서 100% 메탄올로 고정하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상온에서 1시간 동안 블로킹 용액(1% BSA in PBS)으로 처리하고, 2시간 동안 상기 블로킹 용액에서 Anti-phospho-H2AX(Ser139, millipore, #05-636) 항체를 처리하여 항원항체반응을 수행한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 상기 반응물에 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594가 결합된 이차항체(Invitrogen)를 처리하고 관찰하였는데, 이때, 핵은 DAPI(contained Mounting solution)로 염색하고, 염색된 세포는 공초점 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰하였다.
실시예 1-4: 유세포분석
세포를 수확하고, 300㎕ PBS에 현탁하였다. 상기 세포를 하루동안 4℃에서 차가운 100% 에탄올로 고정시켰다. 상기 시료를 PBS로 2회 세척하였다. 상기 세포를 15-20분동안 propidium iodide(40㎕/ml) 와 RNase(50㎍/ml)로 염색하였다. 염색후에, 세포를 FACSCalibour(Bectorn Dickeinson)로 분석하였다.
실시예 1-5: 정량적 역전사 - PCR 반응
반응에 사용될 cDNA 의 합성을 위해 RNA를 확보하였다. 암세포주의 RNA는 제조사의 방법에 따라, RNeasy mini kit(QIAGEN, #74106)를 이용하여 수득하였다. 총 RNA의 농도와 양은 Nano Drop spectrophotometer & Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 사용하여 260/280 nm에서 흡광도를 측정함에 의하여 산출하였다. 역전사는 2㎍의 총 RNA와 iScript reverse transcriptase(Bio-Rad, #170-8890)를 사용하여 수행하였다. PCR은 각각의 프라이머, 주형 cDNA 및 Maxime primer premix (intron)를 사용하였다. 적절한 증폭을 위해 GAPDH는 25회, MAEL은 31회 PCR cycle을 진행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 사용된 MAEL 및 GAPDH 프라이머의 서열은 표 1에 도시하였다.
실시예 1-6: 실시간 역전사 - PCR 반응
원자력의학원에서 확보중인 간암환자조직에서 100례의 HBV 양성 간암환자조직을 무작위로 추출하였다. 조직은 액체질소상에서 homogenizer를 이용하여 분쇄하였다. 이로부터 RNA를 제조사의 방법에 따라, RNeasy mini kit(QIAGEN, #74106)를 이용하여 수득하였다. 총 RNA의 농도와 양은 Nano Drop spectrophotometer & Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 사용하여 260/280 nm에서 흡광도를 측정함에 의하여 산출하였다. 역전사는 2㎍의 총 RNA와 iScript reverse transcriptase(Bio-Rad, #170-8890)를 사용하여 수행하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 정량적 PCR 분석은 SYBR green method(Bio-Rad, iQ SYBR Green supermix #170-8880)을 이용하여 수행하였다. 사용된 MAEL 및 18S 프라이머의 서열은 표 1에 도시하였다. 이들 반응은 3회 반복하여 수행하였다. MAEL 표적 유전자의 상대적 발현수준은 참고 유전자인 18S rRNA의 평균값으로 정규화하였다. 본 발명자들은 comparative threshold cycle(2-ΔΔC(t)) method를 사용하여 분석하였다.
PCR 프라이머
명칭 염기서열(5'->3') 서열번호
qRT-PCR
LINE1-5'UTR-s
LINE1-5'UTR-as
LINE1-ORF1-s
LINE1-ORF1-as
LINE1-ORF2-s
LINE1-ORF2-as
HER-V-LTR-s
HER-V-LTR-as
HER-V-ORF1-s
HER-V-ORF1-as
HER-V-ORF2-s
HER-V-ORF2-as
AAGGGGTGACGGTCGCACCTGGAA
TGCTGTGCTAGCAATCAGCGAGA
TCCTCGAGAAGAGCAACTCCA
GGGTTTCTGCCGAGAGATCC
ATGGCCATACTGCCCAAGGT
TGGCTTAGGATTGACTTGGCA
CAGATGCTTGAAGGCAGCAT
ACGTTGGACAATACCTGGCT
TGGGCAACCATTGTCGGGAAAC
GGCTTATTCCCTGAAACACTTGGGA
GGCTTATTCCCTGAAACACTTGGGA
TCATCAAGGCTGCAAGCAGCATAC
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
RT-PCR
MAEL-s
MAEL-as
GAPDH-s
GAPDH-as
3'UTRMAEL-s
3'UTRMAEL-as
18S-s
18S-as
TGGCCACTCTCTTTGGAATC
GCATTTCCAATTCTTCCAGC
GTCAGTGGTGGACCTGACCT
TGATGTAGCCAAATTCGTTG
cagtaacaggcccaacttcc
ggaagcagaacaatccctcaa
AAACGGCTACCACATCCAAG
CGCTCCCAAGATCCAACTAC
20
21
22
23
24
25
26
27
si-RNA
si-MAEL#1
si-MAEL#2
si-MAEL#3
si-MAEL#4
si-MAEL#5
si-m-MAEL#1
si-m-MAEL#2
si-m-MAEL#3
CCAGCCGGAATGCTTACTA
GGAACTGGCCACCTATCTA
CAGCAATAGTGTGACACCCAA
TGAACGTGGGCATAACCAA
GATAGAACCAGAGTCAACT
GCTTCCTCCCTTGTGAAAT
GGAACTGGCCACCTATTTA
CAGCAACAGTGTGACACCCAA
28
29
30
31
32
33
34
35
Sh-RNA
sh-m-MAEL#1
sh-m-MAEL#2
sh-m-MAEL#3
CCAGCCGCAATGCCTACTA
GGAACTGGCCACCTATTTA
CAGCAACAGTGTGACACCCAA
36
37
38
실시예 1-7: 역전사 - PCR 반응
총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini kit(QIAGEN, #74106)를 사용하여 세포로부터 분리하였다. cDNA는 iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad, #170-8890)를 이용하여 합성하였다. 역전사-PCR 반응은 Maxime PCR PreMix(i-StarTaq)(intron, #25167)을 사용하여 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 다음과 같다:
MAEL forward: 5'-TGGCCACTCTCTTTGGAATC-3'(서열번호 20)
MAEL reverse: 5'-GCATTTCCAATTCTTCCAGC-3' (서열번호 21)
GAPDH forward : 5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3' (서열번호 22)
GAPDH reverse : 5'-TGATGTAGCCAAATTCGTTG-3' (서열번호 23)
Real time PCR 반응은 Biorad iQ Supermic (#170-8860)을 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 MAEL의 3‘UTR에 해당하는 부분으로 다음과 같다 :
3'UTRMAEL forward: 5'-CAGTAACAGGCCCAACTTCC-3'(서열번호 24)
3'UTRMAEL reverse: 5'-GGAAGCAGAACAATCCCTCAA-3'(서열번호 25)
18s forward: 5'-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'(서열번호 26)
18s reverse: 5'-CGCTCCCAAGATCCAACTAC-3'(서열번호 27)
실시예 1-8: 웨스턴 블럿 분석
세포를 PBS로 세척하고 TNN 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40 및 protease inhibitor cocktail tablet(Roche, Indianapolis, IN, http://www. Roche-applied-science.com)]에 현탁시킨 후, 단백질의 농도를 Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Herc㎕es, CA, http://www.bio-rad.com)를 사용하여 결정하였다. 총 단백질의 일부(30-50㎍ protein/lane)를 SDS-PAGE에 적용하고, 100V로 2시간 동안 NC 막에 전이시켰다. 상기 막을 4% 탈지분유를 포함하는 TBS-T 완충액(20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 137 mmol/L NaCl 및 0.01% Tween 20)으로 상온에서 1시간 동안 블로킹시키고, 상온에서 1차 항체를 처리하여 반응시켰다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: MAEL(Abcam, #ab28661), 감마-H2AX(ser139)(Millipore #05-636), PARP(Cell Signaling, #9542), phospho-ATM(Ser1981)(Cell Signaling, #2853s), β-액틴(santa cruz, #sc-47778). 상기 막을 TBS-T로 세척한 후에, 상기 막에 고추냉이 페록시다제가 융합된 이차항체를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. TBS-T로 4시간 동안 세척한 다음, 상기 막을 chemiluminescence(Santa cruz)를 사용하여 발색반응을 수행하였다.
실시예 1-9: 노화-연관 β- 갈락토시다제 (β- gal ) 분석
MRC5 세포는 PBS로 세척하고 2% 포름알데히드-0.2% 글루타르알데히드로 고정하였다. 상기 세포를 세척하고, SA-β-gal 염색용액(1mg/ml 5-bromo-4-chloro- indolyl-β-D-galactopyranoside, 1X PBS(pH6.0), 2mM MgCl2, 5mM potassium ferricyanide, 5mM potassium ferrocyanied)으로 37℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 광학현미경 상에서 청색으로 염색된 세포를 노화된 세포로 판정하고, 슬라이드상에서 임의의 총 300개의 세포를 계수하여 SA-β-gal 양성 세포의 비율을 결정하였다.
실시예 1-10: 클론원성 분석
HeLa 세포주와 MDA-MB-231 세포주에 하룻밤동안 siRNA를 도입하였다. siRNA는 siMAEL#3로 5'-cagcaatagtgtgacacccaa-3' 염기서열을 타겟으로 제작되었다. 24시간 후에, 세포를 배양접시당 1000세포수의 비율로 60mm 배양접시에 접종하고, 10일 동안 배양하였다. 세포의 콜로니를 10분 동안 10% 포름알데히드로 고정시키고, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 30분동안 염색하였다.
실시예 1-11: 콜로니 형성 분석
MEF 세포주를 100mm 배양접시(8×105 cell/ml)에서 배양하고, 형질도입이전 3-4시간 전에 배지를 교환하였다. MEF 세포주는 각각 2㎍의 발현벡터(Myc, Ras)와 4㎍의 발현벡터(MAEL, sh-MAEL #2, sh-MAEL #3, control vector)로 각각 형질도입하기 위하여, 0.2M CaCl2 용액과 2X HBS 용액을 혼합하고 10-12분 동안 반응시켰다. 형질도입된 세포를 하룻밤동안 정치시켰다. 다음날, 배지를 제거하고, 따뜻한 PBS로 1회 세척한 다음, 신선한 배지를 가하고 2주동안 다시 배양하였다. 그런 다음, 세포를 10% 포름알데히드로 고정시킨 후에, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였으며, 관찰된 콜로니를 계수하였다.
실시예 2: 결과
실시예 2-1: 체세포성 암세포에서 MAEL 이소폼 3의 발현 확인
상술한 바와 같이, MAEL은 143 HCC 환자조직의 마이크로 어레이 데이터에서 예후인자 중의 하나로 확인되었다. HCC 암세포주를 포함하는 암세포에서 MAEL의 발현을 확인하기 위하여, HeLa-, 293T-, 및 MDA-MB-231 세포주로부터 유래된 단백질에서 MAEL 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 3b). 그러나, 예상되는 50kDa 크기의 단백질 밴드는 검출되지 않았다. 대신에, 40kDa보다 약간 더 큰 크기의 단일밴드가 검출되었다. 상기 단백질 밴드는 인간에 MAEL을 표적으로 하는 siRNA의 처리에 의하여 특이적으로 감소되었다(도 3c).
본 발명자들은 NCBI website(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 MAEL의 보고된 인간의 이소폼을 검색한 결과, 44kDa(이소폼 2) 또는 41kDa(이소폼 3)크기의 두개의 이소폼을 확인하였다. 이소폼 2는 엑손 2가 결실되어 절단된 형태이고, 전장 MAEL의 두번째 ATG에서 해독코돈이 시작되었다(도 3a). 다양한 암세포에서 발현되는 MAEL이 이소폼 2 인지 또는 이소폼 3인지를 확인하기 위하여, 특별히 설계된 프라이머를 이용한 RT PCR을 수행하였다. 상기 프라이머는 두개의 이소폼을 증폭시킬 수 있으나, 이소폼 2에서 특이적으로 결실됨에 의하여 각각의 증폭산물의 크기가 달라지도록 설계되었다. 도 3d에서 보듯이, 증폭된 산물은 이소폼 3이었다.
상기 결과는 각 이소폼용 특이적 siRNA인 이소폼 2에 특이적인 siRNA(siRNA #1) 또는 두개의 이소폼에 특이적인 siRNA(siRNA #2, #3)를 이용하여 확인되었다. 모든 siRNA는 외래성 과발현된 전장 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 효과적으로 감소시켰다. 또한, 이소폼 3을 감소시킬 수 없는 siRNA #1는 내재적인 MAEL을 감소시킬 수 없었으나, siRNA #2와 #3은 내재적인 MAEL을 감소시켰다.
따라서, 상기 결과로부터 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 다양한 세포주에서 이소폼 3의 형태로 발현됨을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 암조직 및 다양한 암세포에서 MAEL 의 과발현 확인
먼저, 암/정소 연관된 유전자인 MAEL은 정소 및 암세포주에서 발현되므로, 다양한 암세포주와 정상세포주에서 RT-PCR 분석법에 의해 MAEL의 발현여부를 확인하였다(도 2a).
사용된 세포주는 다음과 같다. 정상세포에는 포피세포 (HDF) 에서 유래한 정상세포주인 IMR90, BJ, Wi38 및 TERT 유전자 사용하여 불멸화시킨 BJ-T가 사용되었고 암세포주 및 형질전환 (transformation)세포주는 다양한 조직에서 유래한 암세포주 및 가용한 간암세포주를 대상으로 분석하였다. 자궁경부암세포주인 HeLa, Large T antigen으로 형질전환한 신장세포인 293T, 섬유육종인 HT1080, 유방암세포주인 MDA-MB-231, 폐암세포주인 H441을 사용하였고 간암세포주에는 Heb3B, HepG2, Huh7, SK-Hep1, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, SNU449, SNJ475, SNU709, SNU739, SNU878을 사용하였다. 각 세포는 10% FBS 와 1% 항생제를 첨가한 DMEM, RPMI, MEM 배지를 사용하여 (한국 세포주 은행 및 미국 세포주은행(ATCC)의 권장 배지) CO2 인큐베이터에서 37°C의 온도에 맞춰 배양하였다.
다음으로, 이러한 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 발현양상을 면역블럿 분석에 의해 암세포주에서 다시 한번 확인하였다. 즉, 상기 MAEL 이소폼 3은 정상세포주에서는 발현되지 않고 다양한 암세포주에서만 발현되었다(도 1b).
끝으로, 인간의 HCC 환자시료를 대상으로 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 확인하였다(도 2c). 도 2C에서 보듯이, MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그들의 정상 간조직과 비교하여 대부분의 HCC에서 높은 수준으로 발현되었다.
상술한 결과를 종합하면, CT 유전자(Cancer/Testis associated gene)인 MAEL이 HCC와 다양한 암세포주에서 발현되지만 정상세포주에서는 검출되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 암세포에서 MAEL 의 역할 확인
MAEL이 높은 수준으로 증식하는 암세포에서 발현됨을 발견하였기 때문에, 암세포에서 MAEL의 기능을 연구하였다. 구체적으로, MAEL의 발현이 상대적으로 높았던 세 종의 세포주-HeLa, 293T, MDA-MB-231-과 3종의 정상포피세포 -IMR90, Wi38, HS68-에 siRNA를 도입한 후에, 3일 경과 후, 세포를 관찰하였다(도 1). 그 결과, siMAEL이 암세포의 성장을 효과적으로 억제하고, 세포의 사멸이 정상세포에서 상대적으로 낮은 효율을 나타냄에 반하여 암세포에서 증가함을 발견하였다(도 3a 및 3b).
상기 결과로부터, 높은 수준으로 증식하는 암세포는 정상세포보다도 MAEL의 억제에 대해 보다 민감하게 반응함을 알 수 있었다.
실시예 2-4: 암세포 생존 신호경로에서 MAEL 의 역할 확인
먼저, MAEL의 발현이 억제된 세포에서 어떠한 생리적인 변화가 발생하는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 암세포 생존에 필수적인 주요 신호전달 경로를 확인하였다. 그 결과, ERK 및 AKT의 활성과 EGFR의 발현수준이 심각하게 저하되었다(도 4A).
다음으로, 세포자멸 분석을 PI와 annexin V 염색을 이용한 FACS를 이용하여 수행하였다. 그 결과, 중복된 양성 도트는 siMAEL로 처리된 HeLa 세포에서 크게 증가하였고, 세포자멸 마커 단백질인 절단된 PARP의 발현도 역시 증가하였다(도 4B).
끝으로, 세포자멸 효과가 MAEL 과발현에 의하여 완화되는지를 확인하고자 하였다. 그 결과, MAEL 과발현은 세포자멸과 PARP의 절단을 저해하였다(도 4C).
상술한 결과로부터 암세포에 대한 siMAEL의 효과가 다른 유전자 또는 다른 부가적 효과에 의한 것이 아니라 MAEL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 억제함에 의하여 야기된 것임을 확인하였다.
실시예 2-5: 간암환자에서 MAEL 의 발현에 의한 예후 분석
MAEL이 암조직 및 세포에서 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로 더 나아가 발현이 예후에 영향이 있는지를 조사하기 위하여, 한국원자력의학원 간암환자 조직 100례를 확보하여 MAEL의 발현여부에 따른 예후를 분석하였다. 즉, 추출한 RNA에서 합성한 cDNA에 MAEL과 18S발현을 real time PCR을 통해 CT값을 확보하여 18S 값을 기준으로 dCT값을 구한 후 MAEL의 발현정도를 높은군과 낮은군으로 분류하여 Kaplan-Meier 분석법을 사용하여 7년간의 예후를 분석하였다(도 5). 도 5는 MAEL의 발현수준과 간암치료 후 예후 간의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, MAEL의 발현수준이 높은 환자군(적색선)에서는 생존율이 낮아 예후가 현저히 낮은 수준을 나타내는 반면, MAEL의 발현수준이 낮은 환자군(흑색선)에서는 생존율이 높아 예후가 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과로부터, MAEL의 발현수준을 확인함에 의하여 간암 치료후 예후예측이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 2-6: 자연적인 DNA 손상 및 노화 유도에 미치는 MAEL 의 역할 확인
먼저, 유세포분석을 이용한 PI 염색에 의하여 세포주기 분석을 수행하였다(도 6A). 그 결과, G2/M 피크가 siMAEL로 처리된 암세포에서 증가하였으나, 정상세포에서는 아무런 효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 siMAEL가 G2기에서 세포주기가 중지된 체크포인트 활성화를 유도하는 DNA 손상에 의하여 야기되는 DNA 손상을 야기할 가능성이 존재함을 의미한다.
또한, DNA 손상 신호전달에 관련된 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 주요한 DNA 손상 체크포인트 단백질인 Chk1와 대표적인 DNA 손상 마커 단백질인 gamma-H2AX의 활성화가 MAEL이 고갈된 세포에서 증가함을 발견하였다(도 6B).
아울러, 공초점 현미경을 이용하여 면역염색을 수행한 결과, p53BP1 및 gamma-H2AX의 활성화신호가 MAEL이 고갈된 HeLa 세포에서 증가하고, 핵의 크기는 MAEL이 고갈된 세포에서 증가하여, 극심한 DNA 손상이 발생되었음을 확인하였다(도 6C).
한편, DNA 손상은 노화 뿐만 아니라 세포자멸을 유도할 수 있으므로, siMAEL을 형질전환된 MRC5 세포에 도입하고 β-gal 분석을 수행하였다. siMAEL이 처리된 MRC5 세포는 β-gal 신호가 증가하고(도 7A), DNA 손상신호 역시 증가하였다.
또한, DNA 손상에 반응하여 노화를 유도하는 반응 단백질이 p21로 알려져 있기 때문에, MAEL이 고갈된 MRC5 세포에서 상기 p21의 발현수준을 시험하였다. 상기 p21은 MAEL이 고갈된 세포에서 증가하였다(도 7B).
한편, siMAEL이 DNA 손상 및 세포자멸을 유도함을 나타내었다. siMAEL에 의한 세포사가 세포사를 유도하는 DNA 손상에 의하여 매개되는 지를 조사하기 위하여, 본 발명자는 HeLa 및 MDA-MB-231 세포에서 DNA 손상 체크포인트를 활성화시키는데 역할을 수행하는 ATM 또는 ATR과 함께 MAEL을 고갈시키고, 생존하는 세포를 클론원성 분석으로 분석하였다(도 8a). siMAEL에 의해 유도된 세포사는 siATM 및 siATR에 의해 되돌려졌는데, 이는 siMAEL에 의해 유도된 세포사가 DNA 손상 체크포인트를 유도하는 ATM 및 ATR에 의해 매개됨을 의미한다. 이러한 결과를 추가로 확인하고자, 유세포분석(FACS)과 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 8B 및 8C).
실시예 2-7: Myc / Ras 에 의해 유도된 형질전환에 미치는 MAEL 의 역할 확인
MAEL이 높은수준으로 증식하는 암세포에서 작용함을 확인하였으므로, 정상세포가 불멸화하는 암세포로 형질전환되는 동안 MAEL이 일정한 역할을 수행할 것으로 가정하고 이를 확인하고자 하였다.
암세포성 Myc, Ras 플라스미드 및 passage 4의 MEF(p53-/-) 세포를 이용하여 Transformed foci formation assay를 수행하였다. Colony formation assay는 pIRESpuro-Myc-MAEL 플라스미드를 이용하여 MAEL이 과발현된 세포가 콜로니 형성에 더욱 효율적임을 보여주었다. 그러나, shMAEL 플라스미드를 이용한 MAEL 고갈은 Myc/Ras 유도된 foci 형성을 극적으로 감소시켰다(도 9A). 콜로니수의 정량분석은 도 9에 나타내었다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Use of MAEL for the Predicting Prognosis and Treatment of Cancer <130> PA120224/KR <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgccgaacc gtaaggccag ccg 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agggaagttg ggcctgttac t 21 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatcccccag caatagtgtg acacccaatt caagagattg ggtgtcacac tattgctgtt 60 tttggaaa 68 <210> 4 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agcttttcca aaacagcaat agtgtgacac ccaatctctt gaattgggtg tcacactatt 60 gctgggg 67 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAEL siRNA 1 <400> 5 ccagccggaa tgcttacta 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAEL siRNA 2 <400> 6 ggaactggcc acctatcta 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAEL siRNA 3 <400> 7 cagcaatagt gtgacaccca a 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-5'UTR-s <400> 8 aaggggtgac ggtcgcacct ggaa 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-5'UTR-as <400> 9 tgctgtgcta gcaatcagcg aga 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-ORF1-s <400> 10 tcctcgagaa gagcaactcc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-ORF1-as <400> 11 gggtttctgc cgagagatcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-ORF2-s <400> 12 atggccatac tgcccaaggt 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LINE1-ORF2-as <400> 13 tggcttagga ttgacttggc a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-LTR-s <400> 14 cagatgcttg aaggcagcat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-LTR-as <400> 15 acgttggaca atacctggct 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-ORF1-s <400> 16 tgggcaacca ttgtcgggaa ac 22 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-ORF1-as <400> 17 ggcttattcc ctgaaacact tggga 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-ORF2-s <400> 18 ggcttattcc ctgaaacact tggga 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HER-V-ORF2-as <400> 19 tcatcaaggc tgcaagcagc atac 24 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAEL-s <400> 20 tggccactct ctttggaatc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAEL-as <400> 21 gcatttccaa ttcttccagc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH-s <400> 22 gtcagtggtg gacctgacct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDH-as <400> 23 tgatgtagcc aaattcgttg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3'UTRMAEL-s <400> 24 cagtaacagg cccaacttcc 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3'UTRMAEL-as <400> 25 ggaagcagaa caatccctca a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18S-s <400> 26 aaacggctac cacatccaag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18S-as <400> 27 cgctcccaag atccaactac 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-MAEL#1 <400> 28 ccagccggaa tgcttacta 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-MAEL#2 <400> 29 ggaactggcc acctatcta 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-MAEL#3 <400> 30 cagcaatagt gtgacaccca a 21 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-MAEL#4 <400> 31 tgaacgtggg cataaccaa 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-MAEL#5 <400> 32 gatagaacca gagtcaact 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-m-MAEL#1 <400> 33 gcttcctccc ttgtgaaat 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-m-MAEL#2 <400> 34 ggaactggcc acctattta 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-m-MAEL#3 <400> 35 cagcaacagt gtgacaccca a 21 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh-m-MAEL#1 <400> 36 ccagccgcaa tgcctacta 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh-m-MAEL#2 <400> 37 ggaactggcc acctattta 19 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh-m-MAEL#3 <400> 38 cagcaacagt gtgacaccca a 21

Claims (13)

  1. MAEL(MAELstrom)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 치료후 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 MAEL 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe) 또는 안티센스(anti-sense) 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암은 자궁경부암, 유방암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
  7. (i) 암의 치료가 수행된 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 MAEL 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및,
    (ii) 상기 측정된 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 암 치료 이전 시료의 것보다 감소하는 경우 암이 치료 또는 개선된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것인 방법.
  10. MAEL 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암 치료 또는 예방용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 물질은 MAEL 유전자에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것인 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 물질은 MAEL 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 조성물.
  13. 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 MAEL 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
KR1020120109507A 2012-09-28 2012-09-28 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도 KR20140042577A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120109507A KR20140042577A (ko) 2012-09-28 2012-09-28 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120109507A KR20140042577A (ko) 2012-09-28 2012-09-28 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140042577A true KR20140042577A (ko) 2014-04-07

Family

ID=50651720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120109507A KR20140042577A (ko) 2012-09-28 2012-09-28 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140042577A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961858A (zh) * 2021-04-19 2021-06-15 深圳市罗湖区人民医院 T-all耐药模型的构建及应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961858A (zh) * 2021-04-19 2021-06-15 深圳市罗湖区人民医院 T-all耐药模型的构建及应用
CN112961858B (zh) * 2021-04-19 2023-03-28 深圳市罗湖区人民医院 T-all耐药模型的构建及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5923233B2 (ja) 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法
KR101271964B1 (ko) 담낭암 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 담낭암의 성장, 전이 억제 및 치료 방법
Kim et al. MCT4 expression is a potential therapeutic target in colorectal cancer with peritoneal carcinomatosis
KR20090040391A (ko) Ｒｅｇ４ 또는 ｋｉａａ０１０１을 과발현하는 암의 예방 및 치료 기술
JP4851451B2 (ja) 乳癌関連遺伝子ｚｎｆｎ３ａ１
CN101528926A (zh) 过表达reg4或kiaa0101的癌症的治疗或预防
US20210087247A1 (en) Mps peptides and use thereof
Fan et al. EHMT2 promotes the development of prostate cancer by inhibiting PI3K/AKT/mTOR pathway.
KR101133243B1 (ko) 암의 진단 및 치료를 위한 ｅＩＦ３ｍ의 용도
JP6005272B2 (ja) 胃癌診断及び治療のためのａｄｃｙ３の用途
US20220403395A1 (en) Composition for inhibiting growth of cancer stem cells, containing wdr34 inhibitor, and use thereof
EP4335920A2 (en) Use of rhoa in cancer diagnosis and inhibitor screening
US20130216545A1 (en) Early Diagnosis and Novel Treatment of Cancer
KR20140042577A (ko) 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도
KR20170052454A (ko) 소라페닙 민감성 예측용 바이오마커 조성물
KR101514877B1 (ko) ＡＰＥ/Ｒｅｆ -1 및 ＪＡＧ1/Ｎｏｔｃｈ의 대장암 진단용 마커로서의 용도
JP2011520781A (ja) 治療、診断及び検査のためのｍｓ４ａ１２を伴う方法、及びｍｓ４ａ１２を標的とする剤
KR101764291B1 (ko) 신규한 암 진단용 마커 및 이를 이용한 항암제
CN106554962B (zh) 过表达gpr160的癌症的预防、诊断和治疗
US20110008370A1 (en) Novel use of flj25416 gene
WO2014034798A1 (ja) 癌の検出方法、診断薬および診断キット並びに癌治療用医薬組成物
WO2014200134A1 (ko) Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물
WO2022258834A1 (en) Use of casd1 as a biomarker of a cancer expressing the o-acetylated-gd2 ganglioside
US9233121B2 (en) Compositions and methods for the treatment of cancer
KR20120021713A (ko) Ｌ１ｃａｍ의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 담낭암 치료용 약학적 조성물 및 ｌ１ｃａｍ을 이용한 담낭암의 성장 또는 전이 억제, 진단 및 치료방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application