JP4851451B2 - 乳癌関連遺伝子znfn3a1 - Google Patents
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Description
本発明は、乳癌を検出および診断する方法、ならびに乳癌および乳癌転移を処置および予防する方法に関する。
乳癌(BRC)は遺伝的に不均一な疾患であり、女性に最も多く見られる悪性腫瘍である。全世界で毎年、推定800,000件の新たな症例が報告されている(Parkin DM. et al.,(1999) CA Cancer J Clin 49:33-64)。現在、***切除術が本疾患に対する第一の治療選択肢である。しかしながら、原発腫瘍を外科切除しても、診断時に存在した検出不可能な微小転移のために、局所または遠位部位での再発が起こり得る(Saphner T. et al.,(1996) J Clin Oncol 14, 2738-2749)。このような残存細胞または前癌細胞を死滅させるため、手術後には通常、補助療法として細胞毒性剤が投与される。
本発明は、ZNFN3A1遺伝子の発現が乳癌(BRC)細胞において特異的かつ有意に上昇するという発見に基づく。ZNFN3A1(「SMYD3」とも称される)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれSEQ ID NO:4および5に記載する。これらの配列はまた、「SMYD3」という遺伝子記号でGenbankアクセッション番号AB057595からも利用できる。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という用語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
本発明の文脈において、BRCは、細胞の被験集団(すなわち、患者由来の生体試料)におけるZNFN3A1の発現レベルを測定することにより診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば***組織から得られた細胞を含む。遺伝子発現は、血液または尿のような他の体液から測定することもできる。タンパク質レベルを測定するために、他の生体試料を使用することも可能である。例えば、診断する対象由来の血液または血清中のタンパク質レベルを、免疫測定法または他の従来の生物学的アッセイ法により測定することができる。
ZNFN3A1の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する物質は、ZNFN3A1を発現する被験細胞集団を被験物質と接触させ、次いでZNFN3A1の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することにより同定することができる。物質の存在下でのZNFN3A1の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが、当該被験物質の非存在下での発現または活性レベルと比較して低下していることは、その物質がZNFN3A1の阻害物質であり、BRCを阻害するのに有用であることを示す。
本明細書において同定されたZNFN3A1の差次的発現により、BRCの処置過程をモニターすることも可能になる。本方法において、BRCに対する処置を受ける対象から被験細胞集団が提供される。必要に応じて、処置前、処置中、および/または処置後といった様々な時点で被験細胞集団を対象から入手する。次いで、当該細胞集団におけるZNFN3A1の発現を決定し、BRC状態が判明している細胞を含む参照細胞集団と比較する。本発明の文脈において、参照細胞は、関心対象の処置に曝露されてはならない。
個体の遺伝子構成の差は、様々な薬物を代謝するそれらの相対的能力における差をもたらす。対象において代謝されて抗BRC物質として作用する物質は、対象の細胞において、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化し得る。したがって、本明細書に開示される差次的に発現したZNFN3A1は、物質が対象においてBRCの適した阻害物質であるか否かを決定するために、選択された対象由来の被験細胞集団において試験される、BRCの治療的または予防的阻害物質の推定を可能にする。
本明細書に開示した差次的に発現されるZNFN3A1を用いて、BRCを処置するための候補治療剤を同定することもできる。本発明の方法は、候補治療剤をスクリーニングし、候補治療剤がBRC状態に特徴的なZNFN3A1の発現プロファイルを非BRC状態に特徴的な遺伝子発現プロファイルへと変換させ得るかどうかを判定する段階を含む。
a) 被験化合物をZNFN3A1のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;および
c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。
a) 候補化合物をZNFN3A1を発現する細胞と接触させる段階;および
b) 候補化合物の非存在下で検出されるZNFN3A1の発現レベルと比較して、ZNFN3A1の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する段階。
ZNFN3A1遺伝子を発現する細胞には、例えば、BRCから樹立された細胞株が含まれる;このような細胞は、本発明の上記スクリーニングに用いることができる。
a) 被験化合物をZNFN3A1のポリヌクレオチドよってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
c) 被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、ZNFN3A1のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を抑制する化合物を選択する段階。
a) 候補化合物を、ZNFN3A1の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
b) レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;および
c) 候補化合物の非存在下で検出されるレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と比較して、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる候補化合物を選択する段階。
本発明はまた、被験細胞集団におけるZNFN3A1の発現を、全病期にわたる患者由来の参照細胞集団におけるZNFN3A1の発現と比較する段階を含む、BRCを有する対象の予後を評価する方法を提供する。被験細胞集団および参照細胞集団におけるZNFN3A1の遺伝子発現を比較することにより、または対象由来の被験細胞集団の経時的な遺伝子発現のパターンを比較することにより、対象の予後を評価することができる。
本発明はまた、BRC検出試薬、例えば、ZNFN3A1核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、ZNFN3A1核酸に特異的に結合するかもしくはこれを同定する核酸、またはZNFN3A1核酸によってコードされるタンパク質に結合する抗体を含む、乳癌を検出するためのキットを提供する。検出試薬は、キットの形態で共に包装され得る。例えば、検出試薬、例えば核酸または抗体(固相マトリクスに結合してあるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは個別に包装される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識は、個別の容器に包装され得る。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)もまた、キットに含まれ得る。キットのアッセイ形式は、当技術分野においていずれも公知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであり得る。
本発明はさらに、ZNFN3A1の発現(もしくはその遺伝子産物の活性)を低下させることにより、対象におけるBRCの症状を処置または軽減するための方法を提供する。適した治療用化合物を、BRCに罹患しているか、または発症するリスク(またはそれに対する感受性)を有する対象に、予防的または治療的に投与することができる。そのような対象は、標準的な臨床的方法を用いて、またはZNFN3A1の異常な発現レベルもしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することにより同定することができる。本発明の文脈において、適した治療剤には、例えば、細胞周期調節および細胞増殖の阻害物質が含まれる。
上記のように、ZNFN3A1のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、遺伝子の発現レベルを低下させることができる。BRCにおいて上方制御されるZNFN3A1に対応するアンチセンス核酸は、BRCの処置に有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、ZNFN3A1のヌクレオチド配列またはそれらに対応するmRNAと結合することにより作用し得、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはZNFN3A1によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質の機能を阻害する。本明細書で用いる「アンチセンス核酸」という用語は、標的配列に完全に相補的なヌクレオチド、およびアンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15個の連続したヌクレオチドの範囲にわたって、少なくとも70%またはそれ以上、好ましくは少なくとも80%またはそれ以上、より好ましくは少なくとも90%またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも95%またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。相同性の決定には、当技術分野において公知のアルゴリズムを使用することができる。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque, J. M, et al.,(2002) Nature, Vol. 418:435-8。
UUCG:Lee, N.S., et al.,(2002) Nature Biotechnology 20:500-5。Fruscoloni, P., et al.,(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):1639-44。
UUCAAGAGA:Dykxhoorn, D. M., et al.,(2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457-67。
ZNFN3A1-siRNAに関して(SEQ ID NO:1の標的配列に関して)
5'-aacaucuaccagcugaaggug-[b]-caccuucagcugguagauguu-3'(SEQ ID NO:2)および
5'-aacaucuaccagcugaaggug-[b]-caccuucagcugguagauguu-3'(SEQ ID NO:3)。
1.対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもついかなる標的配列も検討対象から除く。相同性検索は、NCBIのサーバー上(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にあるBLASTを用いて実施することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
または、BRCにおいて過剰発現されるZNFN3A1の遺伝子産物の活性または機能は、遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。例えば、化合物は、ZNFN3A1の遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明はまた、ZNFN3A1の核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象におけるBRCを処置または予防する方法に関する。ポリペプチドの投与により、対象において抗腫瘍免疫が誘導される。抗腫瘍免疫を誘導するため、ZNFN3A1の核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する。さらに、ZNFN3A1の核酸によってコードされるポリペプチドは、BRCおよびIDCの浸潤に対してそれぞれ抗腫瘍免疫を誘導し得る。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片は、BRCに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体(TCR)に結合させた形態、またはマクロファージ、樹状細胞(DC)、もしくはB細胞などの抗原提示細胞(APC)により提示させた形態で投与してもよい。DCは抗原提示能が強いため、APCの中でもDCを用いることが最も好ましい。
-腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
-腫瘍を認識する抗体の誘導、および
-抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
本発明の文脈において、適切な薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所(口腔内および舌下を含む)、膣内、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で、個別の用量単位に包装される。経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれるが、それらに限定されない。適切な製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。活性成分は、任意でボーラス、舐剤、またはペーストとして投与される。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、および/または湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠は、粉剤または顆粒剤のような流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、および/または分散剤と混合して、適した機械において圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがってコーティングすることができる。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形であってもよく、または使用前に水もしくは他の適した溶剤によって構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油が含まれてもよい)、および/または保存剤のような通常の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の徐放または制御放出を提供するように調製してもよい。錠剤の包装は、月に1回服用される1個の錠剤を含む場合がある。
BRCにおけるZNFN3A1発現の増強
92例の乳癌からcDNAマイクロアレイを用いて得られた包括的な遺伝子発現プロファイルデータから、腫瘍対正常組織比のカットオフを2超過とした場合に、69例の浸潤性乳管癌(IDC)のうち36例において、および11例の非浸潤性乳管癌(DCIS)のうち6例において、ZNFN3A1発現が上昇していることが明らかになった(図1a)。この上昇は、マイクロアレイに使用したcDNAを使用して半定量的RT-PCRにより、ランダムに選択した12例のIDCのうち7例において、正常乳管細胞と比較して確認された(図1b)。BRC組織におけるZNFN3A1タンパク質発現を調べるため、6例の塊状BRC組織およびそれらの対応する非癌性***組織から抽出されたタンパク質を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。6例の腫瘍組織において、ZNFN3A1の顕著な蓄積が一貫して認められた(図1c)。
ZNFN3A1 siRNAによるBRC細胞の増殖抑制
ZNFN3A1を抑制することで、BRC細胞においてアポトーシスが誘導され得るかどうかを試験するため、結腸癌細胞および肝臓癌細胞においてZNFN3A1発現を効率的に抑制したZNFN3A1 siRNA-12(WO2004/076623を参照されたい、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる)を用いて、細胞生存アッセイを行った。ZNFN3A1 siRNA発現ベクターの構築に使用したオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:1の標的配列に関して)は、以下の通りである:
psiU6BX-ZNFN3A1-12、フォワード:5'-AACATCTACCAGCTGAAGGTGTTCAAGAGACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3' (SEQ ID NO:2)、
リバース:5'-AACATCTACCAGCTGAAGGTGTCTCTTGAACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3' (SEQ ID NO:3)。
10種のBRC細胞株のウェスタンブロット分析から、10種のBRC細胞のうち、例えばBT-20、HBL-100、MDA-MB-231、MCF7、およびT47D細胞などの8種のBRC細胞において、ZNFN3A1が大量に発現されていることが明らかになった(図4a)。MDA-MB-231、MCF7、およびT47D細胞にpsiU6BX-ZNFN3A1-12、psiU6-ルシフェラーゼ、またはpsiU6(偽)をトランスフェクションし、これらを適切な濃度のG418と共に培養し、細胞計数キットにより細胞生存度を分析した。その結果、psiU6BX-ZNFN3A1-12は、3種の細胞株において、psiU6BX-ルシフェラーゼまたはpsiU6BX-偽と比較して有意な増殖阻害効果を示した(図4b)。したがって、ZNFN3A1を阻害することは、BRCを処置するための合理的な戦略であると考えられる。
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイの組み合わせによって得られた、本明細書に記載のBRCの遺伝子発現解析により、癌の予防および治療の標的として、特異的遺伝子であるZNFN3A1が同定された。この差次的に発現される遺伝子の発現に基づいて、本発明は、BRCを同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
Claims (24)
- 患者由来の生体試料におけるZNFN3A1の発現レベルを決定する段階を含む、対象における乳癌を検出するための分子診断マーカーの検出方法。
- 試料の発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%高い、請求項1記載の方法。
- 遺伝子発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、請求項1記載の方法:
(a) ZNFN3A1のmRNAを検出する段階、
(b) ZNFN3A1によってコードされるタンパク質を検出する段階、および
(c) ZNFN3A1によってコードされるタンパク質の生物活性を検出する段階。 - 患者由来の生体試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 患者由来の生体試料が乳癌細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 患者由来の生体試料が乳癌細胞由来の上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、乳癌を処置または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法:
(a) 被験化合物をZNFN3A1のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;および
(c) ポリペプチドに結合する被験化合物が乳癌を処置するための候補化合物であることが示される段階。 - 以下の段階を含む、乳癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法:
(a) 被験化合物をZNFN3A1を発現する細胞と接触させる段階;および
(b) ZNFN3A1の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出されるZNFN3A1の発現レベルと比較して低下させる被験化合物を選択する段階。 - 細胞が乳癌細胞を含む、請求項8記載の方法。
- 以下の段階を含む、乳癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法:
(a) 被験化合物をZNFN3A1のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
(b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
(c) 被験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して、段階(a)のポリペプチドの生物活性を抑制する被験化合物を選択する段階。 - 以下の段階を含む、乳癌を処置または予防するための化合物をスクリーニングする方法:
(a) 被験化合物を、ZNFN3A1の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
(b) 該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;および
(c) 該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる被験化合物を選択する段階。 - (a) ZNFN3A1、または(b) ZNFN3A1によってコードされるポリペプチドに結合する検出試薬を含む、乳癌を検出するためのキット。
- ZNFN3A1のコード配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスの、乳癌の治療用アンチセンス組成物の製造における使用。
- ZNFN3A1の発現を低下させるsiRNAの、乳癌の治療用siRNA組成物の製造における使用。
- siRNAの標的配列が、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、請求項14記載の使用。
- siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有する請求項15記載の使用であって、式中、[A]はSEQ ID NO:1の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチドループ配列であり、[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、使用。
- ZNFN3A1のタンパク質に結合する抗体またはその免疫学的活性断片の、対象における乳癌を処置するための組成物の製造における使用。
- (a) ZNFN3A1の核酸によってコードされるポリペプチド、(b) 該ポリペプチドの免疫学的活性断片、または(c) そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド含む、対象における乳癌を処置または予防するための組成物。
- ZNFN3A1によってコードされるポリペプチド、ZNFN3A1ポリヌクレオチド、またはZNFN3A1ポリヌクレオチドを含むベクターをインビトロで抗原提示細胞と接触させる段階を含む、乳癌に対する細胞傷害性T細胞を誘導する抗原提示細胞を誘導する方法。
- 抗原提示細胞が、対象に投与するためのものである請求項19記載の方法。
- ZNFN3A1のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの薬学的有効量を含む、乳癌を処置または予防するための組成物。
- siRNAの標的配列が、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、請求項21記載の組成物。
- siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有する、請求項22記載の組成物であって、式中、[A]はSEQ ID NO:1の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチドループ配列であり、[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、組成物。
- ZNFN3A1によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその免疫学的活性断片の薬学的有効量を含む、乳癌を処置または予防するための組成物。
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