KR20140014405A

KR20140014405A - 안구 질병을 치료하거나 예방하는데 사용되는 ｔｎｆ-알파 길항제 및 ｖｅｇｆ 길항제의 조합물

Info

Publication number: KR20140014405A
Application number: KR1020117031303A
Authority: KR
Inventors: 피터 아담슨; 피터 프란츠 에르틀; 볼커 게르마세브스키; 게랄드 웨인 고프; 마이클 스튜워드
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2014-02-06
Also published as: UY32665A; WO2010136492A3; EA201190273A1; CN102458471A; AR076796A1; BRPI1013807A2; JP2012528112A; AU2010251966A1; SG176202A1; TW201106963A; ZA201108586B; US20120076787A1; MX2011012691A; CA2763469A1; EP2435075A2; WO2010136492A2; IL216260A0

Abstract

본 발명은 안구의 질병을 치료하는데 사용하기 위한 TNF알파 길항제와 VEGF 길항제의 조합물에 관한 것으로, 이는 TNFα 또는 TNFα 수용체 및/또는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다.

Description

안구 질병을 치료하거나 예방하는데 사용되는 ＴＮＦ-알파 길항제 및 ＶＥＧＦ 길항제의 조합물{COMBINATION OF A TNF-ALPHA ANTAGONIST AND A VEGF ANTAGONIST FOR USE IN THE TREATMENT OR PREVENTION OF DISEASES OF THE EYE}

배경기술

선진국의 경우 시력 상실은 주요한 건강상의 문제가 되고 있다. 40세 이상의 3백만 명이 넘는 미국 시민이 실명이거나 나쁜 시력을 갖고 있으며, 이것은 연령에 따라 현저하게 증가한다. 예를 들어, 연령이 80세 이상인 사람은 미국인의 약 8%를 구성하지만 실명의 거의 70%를 차지한다. 통상적으로 연령과 관련된 안구 질환으로는 연령 관련 황반 변성(AMD), 백내장, 당뇨병성 황반 부종, 망막정맥폐쇄(RVO) 및 녹내장이 있다.

연령 관련 황반 변성(AMD)은 선진국에서 실명의 주된 원인이다. AMD의 두 주요한 임상적 제시가 존재한다. 위축성 (건조) AMD는 망막 색소 상피(RPE) 및 신경망막의 변성을 특징으로 한다. 위축성 AMD의 초기 단계는 RPE 세포 층 아래에 드루젠의 형성과 관련이 있다. 초기 위축성 AMD는 RPE가 완전히 변성되어 황반의 영역에 날카롭게 구분된 RPE 위축의 영역을 형성하는 말기 질환으로 진행될 수 있다: "지도형 위축". 이러한 형태의 질환에서, RPE의 변성은 황반의 로드(rod) 및 콘(cone)의 이차 소멸을 초래하며, 이러한 경우에 심한 연령 관련 시력 상실이 일어난다. AMD 환자의 집단은 질환의 상이한 형태 또는 추가의 합병증으로서 간주될 수 있는 것을 발생시킨다. AMD 환자의 대략 10-20%는 맥락막 혈관신생(CNV)을 발생시킨다. 이것이 일어날 때의 질환의 형태는 "습윤 AMD"로서 공지되어 있고, 이것은 가장 심한 시력 상실 중 일부와 관련될 수 있다. 습윤 AMD에서, 새로운 맥락막 혈관은 바닥복합층에서의 열공을 통해 성장하고 RPE와 신경망막 내로 그리고 RPE와 신경망막 하에서 증식한다. 현재 AMD의 매우 유행하는 위축성 형태를 치료하거나 초기 건조 AMD가 지도형 위축 또는 습윤 AMD로 진행하는 것을 예방하기 위한 어떠한 결정적인 치료 수단은 존재하지 않는다 (Petrukhin K, Expert Opin Ther Targets (2007) 11: 625-639).

당뇨병 황반 부종(DME)은 당뇨병 환자에서 읽기 시력 상실의 가장 빈번한 원인이다. 29년 이상 당뇨병을 가졌던 개체에서 DME의 유병률은 약 30%이다 (Klein R et al Ophthalmology 1984: 91; 1464-1474). DME는 증가된 수준의 IL-6, VEGF 및 다른 시토킨, 비정상적인 망막 모세관으로부터 누출되는 혈액 망막 장벽의 전반적인(generalized) 파괴 및 망막하 공간에서 발생하는 미세동맥류와 관련이 있다. 현행 DME 치료의 목적은 부종 및 누출을 감소시켜 개선된 시력을 획득하는 것이다. 양호한 혈당 제어 및 레이저 광응고술 또는 항혈관형성 치료는 당뇨병 안구의 중심 황반 영역의 추가적인 악화를 막거나 지연시키는 것이 목적이다. 코르티코스테로이드의 유리체내 주입이 또한 사용되어 왔다.

망막정맥폐쇄는 망막 정맥을 통한 혈류의 폐색 이후에 일어난다. 이것은 당뇨병, 녹내장 또는 고혈압에 기인한 밀접하게 관련된 망막 동맥에서의 응괴 형성 또는 압력 증가 때문일 수 있다. 망막 밖으로의 혈류 감소는 눈 혈관의 혈압에서의 전반적인 증가 및 안구에서 감소된 산소 수준을 초래한다. 이것은 다시 비정상적인 혈관 성장, 출혈 및 부종, 조직 손상 및 시력 상실을 초래한다. 두 주요한 형태의 RVO가 있는데, 망막정맥분지폐쇄(BRVO)와 중심 망막정맥폐쇄(CRVO)이다. 갑작스러운 흐려짐 또는 시력 상실이 RVO의 공통된 특징이다. 백내장 발생과 관련된 위험성 및 상승된 안구내 압력에도 불구하고, 안구내 코르코스테로이드를 이용하여 RVO를 치료해 왔다 (Kiernan DF et al Exp Opinion in Pharmacotherapy 2009 10(15) 2511-2525). RVO의 유병률은 ~0.2% (CRVO) 내지 ~0.7% (BRVO)의 범위이다.

포도막염은 주로 취업 연령의 사람에게 영향을 미치며 포도막(홍채, 섬모체 및 맥락막)의 염증을 포함한다. 앞포도막염은 포도막염 병증의 약 75%를 구성하는 가장 일반적인 포도막염 형태이고 주로 홍채와 섬모체에 영향을 준다. 포도막염은 자가면역 질환으로서 간주되고, 병인론은 알려져 있지 않으나 HLA-B27과의 관련성이 병증의 약 50%에 존재한다. 후포도막(즉, 맥락막)을 포함한 염증은 후포도막염으로서 알려져 있고 이차적인 망막의 포함이 일반적이다. 포도막염은 두드러지게 CD4 T-세포가 안구 구획 안으로 침윤되는 뚜렷한 염증 질환이다 (Paroli MP et al 2007 17(6) 938-942 Eur J Ophthalmology). 코르티코스테로이드는 또한 국소적으로, 안구주위로 또는 전신적으로 제공되는 치료를 위해 중요하다.

TNF-α(종양 괴사 인자-α)는 다수의 안과 염증 질환과 관련된 프로-염증 시토킨이다 (Theodossiadis et al., Am. J. Ophthalmol. (2009) 147: 825-830).

VEGF(혈관 내피 성장 인자) 및 VEGF-수용체는 맥락막 및 망막 혈관 형성 둘 모두를 자극하고 그러한 혈관의 혈관 투과성을 조절하는 것으로 공지되어 있다 (Gragoudas et al., N. Engl. J. Med (2004) 351-2805).

혈관신생 및 누출은 연령 관련 황반 변성의 습윤 형태의 뚜렷한 특징이다. 앱타머, VEGF-A 아이소형 165를 중화시키는 페갑타닙(Macugen™) 및 VEGF-A의 모든 아이소형을 차단하는 라니비주맙(Lucentis™)의 이용이 현재 승인되었다.

염증 반응은 또한 혈관신생에 있어서 현저한 병리생리적 역할을 담당한다 (Sakuri et al., Invest Ophthalmol Vis Sci (2003) 44: 5349-5354; Oh et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (1999) 40: 1891-1898;Shi et al., Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334).

TNFα 길항제와 관련된 참고문헌으로는 문헌[Olson et al., Arch Opthalmol (2007) 125: 1221-1224; Shi et al., Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334 Kociok et al., Invest Ophthalmol Vis Sci (2006) 11: 5057-5065 Markomichelakis et al. Am J Ophthalmol (2005) 139: 537-540]이 있다.

연구들에 따르면, 인플릭시맙(infliximab)의 유리체내 주입은 용량 관련된 것으로 보이는 심한 안구내 염증 반응을 유도할 수 있다. 그러한 부작용은 아달리무맙(adalimumab)에서는 나타나지 않았다 (Program 4247, Poster D913, Intravitreal TNF inhibitors in the Treatment of Refractory Diabetic Macular Edema: A Pilot Study from the Pan American Collaborative Retina Study Group and Program 4749, Poster D1087, Ocular and Systemic Safety of Intravitreal TNF Inhibitors: A Pilot Study From the Pan American Collaborative Retina Study Group, The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) May 2-6 2010. Ft. Lauderdale USA).

안과 질환의 진행을 막는데 효과적이고 광범한 그룹의 환자에게 개선된 시력을 제공하는 치료 계획에 대한 요구가 있다.

발명의 개요

본 발명은 특히 안구의 질환을 치료하는데 사용되는 TNF-α 길항제 및 VEGF 길항제의 조합물에 관한 것이다.

항-VEGF 및 항-TFN 접근법 둘 모두는 AMD를 치료하는 기초가 되며, 이러한 방식들은 기계론적으로 중복될 수 없어서, 항-VEGF 접근 요법에 성공적으로 반응하지 않은 환자가 항-TNF 치료에 반응할 수 있거나 그 반대의 경우도 가능하다.

항-VEGF 분자의 항-혈관형성 활성과 조합된 항-TNF의 항-염증 이익은 그러한 안구 질환을 치료하는데 개선된 효능을 제공할 것이다.

개개의 TNFα 길항제 및 개개의 VEGF 길항제 (즉, 분리된 TNFα 및 VEGF 길항제 분자)의 조합물의 투여가 본 발명에 의해 커버된다. 또한, TNFα 길항제 및 VEGF 길항제 둘 모두로서 작용하는 이중 표적 기능성을 지니는 (즉, TNFα 또는 TNFα 수용체에 결합하여 이들의 기능을 억제, 바람직하게는 차단할 수 있고, VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하여 이들의 기능을 억제, 바람직하게는 차단할 수 있다) 단일한 작제물의 투여가 본 발명에 의해 커버된다. 단일한 작제물은 항체 스캐폴드 또는 그러한 다른 적합한 스캐폴드를 기반으로 할 수 있다. 수용체-Fc 융합체가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다.

본 발명은 특히 항원 결합 단백질에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 TNFα/VEGF 이중 표적 단일 작제물에 관한 것이고, 여기서 TNFα 길항제 부분은 인간 항-TNFα 항체이거나 이로부터 유래된다. TNFα 항체는 아달리무맙 또는 골리무맙(golimumab)일 수 있다.

본 발명은 특히 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 단백질 스캐폴드를 포함하는 안구 질환을 치료하는데 사용되는 항원 결합 단백질에 관한 것이고, 여기서 항원 결합 단백질은 두개 이상의 항원 결합 부위를 지니는데 그 중 하나 이상은 에피토프 결합 도메인에서 비롯된 것이고 그 중 하나 이상은 쌍을 이룬(paired) V_H/V_L 도메인에서 비롯된 것이며, 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 TNFα 또는 TNFα 수용체, 예를 들어 TNFR1에 결합할 수 있고, 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 VEGF 또는 VEGF 수용체, 예를 들어 VEGFR2에 결합할 수 있다.

하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 수용체-Fc 융합체, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF 수용체-결합 도메인에 연결된 TNFα 수용체-Fc 융합체, 또는 TNFα 또는 TNFα 수용체-결합 도메인에 연결된 VEGF 수용체-Fc 융합체가 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 TNFα 길항제 부분, VEGF 길항제 부분, 및 상기 TNFα 길항제 부분을 상기 VEGF 길항제 부분에 연결시키는 링커를 포함하는 이중 표적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서 TNFα 길항제 부분은 표 1에 나열된 TNFα 길항제 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; VEGF 길항제 부분은 표 2에 나열된 VEGF 길항제 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; 링커는 1 내지 150개의 아미노산 길이의 아미노산 서열이고; 이중 표적 분자는 DMS4000 또는 DMS4031이 아니다. 링커는 또한 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PEG 기반 링커를 포함하는 비-펩티드 기반 링커일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열, 예를 들어 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 및 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 제공한다. 그러한 폴리누클레오티드는 동등한 폴리펩티드 서열에 상응하는 코딩 서열을 나타낸다. 그러나, 그러한 폴리누클레오티드 서열이 시작 코돈, 적합한 신호 서열 및 정지 코돈과 함께 발현 벡터로 클로닝될 수 있었음이 이해될 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드, 예를 들어 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터, 예를 들어 첫번째 및 두번째 벡터를 포함하는 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서, 예를 들어 혈청이 없는 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 단백질을 생산하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 첫번째 벡터는 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하고 상기 두번째 벡터는 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 전신적 전달 또는 안구로 국소적 전달하기에 적합한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 추가의 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타너셉트(etanercept), ESBA105, PEP1-5-19, PEP1-5-490, PEP1-5-493, SEQ ID NO:2의 아드넥틴, 골리무맙, 세르톨리주맙(certolizumab), ALK-6931, 및 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된, 안구 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되는 TNFα 길항제를 제공하고, 여기서 TNFα 길항제는 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), r84, 아플리버셉트(aflibercept), CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, PRS-051, MP0012, CT-322, ESBA903, EPI-0030, EPI-0010, 및 DMS1571로 구성된 군으로부터 선택된 VEGF 길항제와 조합하여 투여된다.

본 발명은 또한 베바시주맙, 라니비주맙, r84, 아플리버셉트, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, PRS-051, MP0012, CT-322, ESBA903, EPI-0030, EPI-0010, 및 DMS1571로 구성된 군으로부터 선택된, 안구 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되는 VEGF 길항제를 제공하고, 여기서 VEGF 길항제는 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타너셉트, ESBA105, PEP1-5-19, PEP1-5-490, PEP1-5-493, SEQ ID NO:2의 아드넥틴, 골리무맙, 세르톨리주맙, ALK-6931, 및 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 TNFα 길항제와 조합하여 투여된다.

본 발명은 또한 TNFα 길항제 부분, VEGF 길항제 부분, 및 상기 TNFα 길항제 부분을 상기 VEGF 길항제 부분에 연결시키는 링커를 포함하는 이중 표적 항원 결합 분자를 제공하고, 여기서,

TNFα 길항제 부분은 표 1에 나열된 TNFα 길항제 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;

VEGF 길항제 부분은 표 2에 나열된 VEGF 길항제 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며;

링커는 1 내지 150개 아미노산 길이의 아미노산 서열이고;

이중 표적 분자는 DMS4000 또는 DMS4031이 아니다.

링커는 1 내지 150개 아미노산 길이의 아미노산 서열이고;

상기 이중 표적 항원 결합 분자는 안구의 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되며, 4-6주 간격으로 유리체내 투여된다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:69, 70, 71 또는 72의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.

예방적 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 조성물 또는 이중 표적 단백질을 전신적으로 또는 환자의 안구에 국소적으로 투여하는 것을 포함하여, 안구 질환에 걸린 환자를 예방하거나 치료하는 방법이 또한 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 항-TNFα/항-VEGF mAb-dAb, DMS4000의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.

도 2는 항-TNFα/항-VEGF mAb-dAb, DMS4000의 SEC 프로파일을 도시한다.

도 3은 DMS4000의 항-VEGF 활성을 도시한다.

도 4는 DMS4000의 항-TNFα 활성을 도시한다.

도 5는 DMS4000의 (PK) 특성을 도시한다.

도 6은 ELISA의 결과를 도시하며 이특이적 BPC1821이 VEGFR2 및 B7-1 둘 모두에 결합함을 증명한다.

도 7은 ELISA의 결과를 도시하며 이특이적 BPC1825가 VEGF 및 B7-1 둘 모두에 결합함을 증명한다.

도 8은 본 발명의 이중-표적 항원 결합 분자를 작제하기 위한 기질을 묘사한다.

도 9는 PEP-DOM 작제물에 대한 BIAcore 분석을 도시한다.

도 10은 PEP-DOM 작제물에 대한 BIAcore 분석을 도시한다 (도 9의 결합 곡선의 TNF/VEGF 결합 영역의 클로즈업).

도 11은 표 10에 제시된 데이터의 그래픽 표시이다.

모든 화합물을 2㎕의 부피로 유리체내 주입에 의해 투여하였다. 검은색 막대는 7일 결과를 나타낸다. 흰색 막대는 14일 결과를 나타낸다.

도 12는 표 11에 제시된 데이터의 그래픽 표시이다.

도 13은 레이저 PC 7일 (FS 첫번째) 및 14일 (FS 두번째) 후에 적외선 (IR, 상부 왼쪽 패널), 자가형광 (AF, 하부 왼쪽 패널) 및 플루오레신 혈관조영 (FS, 큰 패널)을 도시한다 - 실시예 이미지를 도시함. 1. 비히클 치료된 안구, 2. 2㎍의 DMS1571로 치료된 안구 및 8. 30㎍의 Enbrel™으로 치료된 안구. CNV 병변이 더욱 강조되어 보이고, DMS1571을 이용한 치료에 반응한 병변보다 덜 확산됨이 주목할 만하다.

도 14는 표 12에 제시된 데이터의 그래픽 표시이다.

모든 화합물을 2㎕의 부피로 유리체내 주입에 의해 투여하였다.

도 15는 ED1 mab으로 염색된 플랫-마운티드(flat-mounted) 망막의 예시적인 현미경사진을 도시한다. 패널 1A-1B 및 패널 Enbrel 8.4는 항-VEGF(DMS1571) (1A), 단독의 비히클(1B) 또는 Enbrel (Enbrel 8.4)로 치료된 안구로부터의 망막의 플랫-마운트를 도시한다. 레이저 화상 부위과 관련된 포식세포를 ED1 (CD 68, 블랙) X20로 가시화하였다. 패널 1D는 망막의 내핵층 (INL)으로 침투한 레이저 화상 부위와 관련된 포식세포 (ED1+, 블랙)를 도시하는 망막의 냉동미세절단기 섹션(20㎛)을 도시한다. RGC, 망막의 신경절 세포층; BV, 혈관. x20.

정의

본 명세서에서 사용된 "단백질 스캐폴드"는 네개의 사슬 또는 두개의 사슬 항체일 수 있거나, 항체의 Fc 영역만을 포함할 수 있거나, 항체로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있거나, 불변 영역이 인간 또는 영장류 기원의 것일 수 있거나, 인간 및 영장류 불변 영역의 인공 키메라일 수 있는 면역글로불린 (Ig) 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 상기 단백질 스캐폴드는 예를 들어 단백질 스캐폴드가 완전한 IgG를 포함하는 경우, 하나 이상의 불변 영역 외에 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 단백질 스캐폴드는 그 밖의 단백질 도메인, 예를 들어 항원 결합 부위를 지니는 단백질 도메인, 예를 들어 에피토프 결합 도메인 또는 ScFv 도메인에 연결될 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 "수용체-Fc 융합체"는 항체의 Fc 영역에 연결된 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인을 지칭한다. 상기 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인의 단편은 이들이 전장 단백질의 생물학적 기능을 보유하는 경우, 즉 항원 결합 능력을 보유하는 경우, 이러한 정의 내에 포함된다. "도메인"은 단백질의 나머지와 별개인 삼차 구조를 지니는 폴딩된(folded) 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성의 원인이 되고, 다수의 경우에 단백질 및/또는 도메인의 잔여 기능의 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 운반될 수 있다. "항체 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이것은 완전한 항체 가변 도메인과 변형된 가변 도메인을 포함하고, 예를 들어 여기서 하나 이상의 루프(loop)는 항체 가변 도메인의 특징부가 아닌 서열, 또는 트렁케이션되거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성과 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편으로 대체되었다.

"인간화된 항체"는 비-인간 공여체 면역글로부린으로부터 유래된 CDR을 지니는 공학처리된(engineered) 항체의 유형을 지칭하며, 분자의 나머지 면역글로부린-유래된 부분들은 하나 이상의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래된다. 또한, 프레임워크 지지 잔기들은 결합 친화성을 보존하도록 변경될 수 있다 (예를 들어, Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029- 10032 (1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 적합한 인간 억셉터 항체는 공여체 항체의 누클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이터베이스, 예를 들어 케이뱃(KABAT)? 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스, 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여체 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성을 특징으로 하는 인간 항체는 (아미노산 기반) 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 공여할 수 있는 적합한 억셉터 항체가 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 억셉터 항체 중쇄 및 경쇄가 동일한 억셉터 항체로부터 비롯될 필요는 없음이 인지되어야 한다. 종래 기술은 그러한 인간화된 항체를 생산하는 여러 방식을 기술하고 있다 - 예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951 참조. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다.

"CDR"은 항원 결합 단백질의 아미노산 서열의 상보성을 결정하는 영역으로서 정의된다. 이들은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역이다. 면역글로불린의 가변 부분에는 세개의 중쇄 및 세개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 "CDR"은 세개의 모든 중쇄 CDR, 세개의 모든 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 두개의 CDR을 지칭한다.

"CDR 변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적인 변경일 수 있고 (예를 들어 10개 이하의 아미노산에 의한), 그러한 변형은 변이체가 변형되지 않은 서열의 생물학적 특징을 보유하도록 한다. 예를 들어, 변이체는 IL-18에 결합하여 이를 중화시키는 기능성 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적인 변경은 하나 내지 수 개의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 하나 내지 수 개의 아미노산의 첨가 또는 삽입, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다 (예를 들어, 10개 이하의 아미노산에 의한). CDR 변이체는 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환일 수 있고, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산을 대안적인 소수성 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다. 예를 들어, 류신은 발린 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.

용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 유전자 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 이러한 완전한 인간 항체는 저 면역원성 치료적 항체의 공급원으로서의 재-공학처리되거나 탈-면역화된 설치류 모노클로날 항체 (예를 들어, 인간화된 항체)에 대한 대안을 제공하고, 이들은 파지 디스플레이 또는 트랜스제닉 마우스 플랫폼(platform)을 이용하여 정상적으로 생성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다.

"면역글로불린 단일 가변 도메인"이라는 표현은 상이한 V 영역 또는 도메인과 별개로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인 (V_H, V_HH, V_L)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 상이한 가변 영역 또는 가변 도메인을 지니는 포맷 (예를 들어, 동종- 또는 이종-다합체)으로 존재할 수 있는데, 이 때 다른 영역 또는 도메인은 단일한 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 불필요하다 (즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합하는 경우). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하며, 상기 용어가 본 명세서에서 사용된 바와 같이 항원에 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 또한 설치류 (예를 들어, WO 00/29004호에 기재된 바와 같은), 수염 상어 및 카멜리드 V_HH dAb와 같은 다른 종들로부터의 단일한 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 V_HH는 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생산하는 낙타, 야마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종들로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 그러한 V_HH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 상기 도메인은 본 발명에 따라 여전히 "도메인 항체"로서 고려된다. 본 명세서에서 사용된 "V_H"는 카멜리드 V_HH 도메인을 포함한다. NARV는 수염 상어를 포함하는 연골 어류에서 동정된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이러한 도메인은 Novel Antigen Receptor 가변 영역 (일반적인 약어 V(NAR) 또는 NARV)으로도 알려져 있다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Mol. Immunol. (2006) 44: 656-665 and US20050043519A]을 참조한다.

용어 "에피토프 결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 별개로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 지칭하며, 이것은 도메인 항체 (dAb), 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이것은 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디(Affibody), SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앤키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머(aptamer); C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilins)); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소쿤니츠(scorpion toxinkunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴(아드넥틴(adnectin))으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있고; 이들은 자연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리되었다.

CTLA-4 (세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드(fold)를 지닌다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 제공하는 이종성 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 지니도록 공학처리된 CTLA-4 분자는 에비바디로도 알려져 있다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Journal of Immunological Methods (2001) 248 (1-2): 31-45]을 참조한다.

리포칼린은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소형 소수성 분자를 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있는 원뿔 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 지니는 강성 β-시트 이차 구조를 지닌다. 안티칼린은 160 내지 180개 아미노산의 크기이고, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Biochim Biophys Acta (2000) 1482: 337-350, US7250297B1 and US20070224633]을 참조한다.

어피바디는 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선형 다발로 구성된다. 라이브러리는 표면 잔기들의 무작위화에 의해 생성되었다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17: 455-462 and EP1641818A1]을 참조한다.

아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 고유(native) 도메인은 정의된 이황화 결합된 구조를 채용한다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타난 자연 변이의 셔플링(shuffling)에 의해 다양성이 발생한다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Nature Biotechnology (2205) 23(12): 1556-1561 and Expert Opinion on Investigational Drugs (June 2007) 16(6): 909-917]을 참조한다.

트랜스페린은 단량체 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 허용 표면 루프에서 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 공학처리된 트랜스페린 스캐폴드의 예로는 트랜스-바디가 있다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[J. Biol. Chem (1999) 274: 24066-24073]을 참조한다.

설계된 앤키린 반복 단백질 (DARPin)은 세포골격으로의 통합 막단백질의 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 앤키린으로부터 유래된다. 단일 앤키린 반복체는 두개의 α-나선 및 β-회전으로 구성된 33개 잔기의 모티프이다. 이들은 각 반복체의 첫번째 α-나선 및 β-회전에서 잔기들을 무작위화시킴에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 이들의 결합 경계면은 모듈의 수를 증가시킴에 의해 증가될 수 있다 (친화성 돌연변이 방법). 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[J. Mol. Biol. (2003) 332: 489-503; PNAS (2003) 100(4): 1700-1705; and J. Mol. Biol. (2007) 369: 1015-1028 and US20040132028A1]을 참조한다.

피브로넥틴은 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있는 스캐폴드이다. 아드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III (FN3)의 15개 반복 단위의 10번째 도메인의 자연 아미노산 서열의 백본으로 구성된다. β-샌드위치의 한 말단에 있는 세개의 루프는 아드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인지할 수 있도록 공학처리될 수 있다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. (2005) 18: 435-444, US20080139791 , WO2005056764 and US6818418B1]을 참조한다.

펩티드 앱타머는 불변 스캐폴드 단백질로 구성된 조합적 인지 분자이고, 전형적으로 활성 부위에 삽입된 강제적인 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신 (TrxA)이다. 추가의 상세한 설명을 위해, 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5: 783-797]을 참조한다.

마이크로바디(Microbody)는 3-4개의 시스테인 다리를 함유하는 25 내지 50개 아미노산 길이의 자연 발생 마이크로단백질로부터 유래되고 - 마이크로단백질의 예로는 KalataB1 및 코노톡신(conotoxin) 및 크노틴스(knottins)가 있다. 마이크로단백질은 마이크로단백질의 전반적인 폴드에 영향을 미치지 않으며 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 공학처리될 수 있는 루프를 지닌다. 추가의 상세한 설명을 위해, WO2008098796호를 참조한다.

그 밖의 에피토프 결합 도메인은, 문헌[Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) and Protein Science (2006) 15:14-27]에서 검토된 바와 같이, 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린), 인간 프로테아제 억제제의 쿤니츠(kunitz) 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소 (카리브도톡신(charybdotoxin)), C-타입 렉틴 도메인 (테트라넥틴)을 포함하는 상이한 표적 항원 결합 특성을 공학처리하기 위해 스캐폴드로서 이용되어 왔던 단백질을 포함한다. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 임의의 이러한 대안적인 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있었다.

"이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)"은 이중-특이적, 4가 면역글로불린 G (IgG)-유사 분자이다 (Wu et al. Nature Biotechnology (2007) 25: 1290-1297). DVD-Ig는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 결합 단백질로서 정의될 수 있는데, 상기 폴리펩티드 사슬은 VDI-(XI)n-VD2-C-(X2)n을 포함하고, 여기서 VDI는 첫번째 가변 도메인이고, VD2는 두번째 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, XI은 아미노산 또는 폴리펩티드 (링커)를 나타내고, X2는 Fc 융합체를 나타내며, n은 0 또는 1이다 (WO 2007024715). 본 발명과 관련해서, VDI는 TNFα 또는 TNFα 수용체에 결합하고, VD2는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하거나, 그 반대로도 가능하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "쌍을 이룬 V_H 도메인", "쌍을 이룬 V_L 도메인", 및 "쌍을 이룬 V_H/V_L 도메인(들)"은 이들의 파트너 결합 도메인과 쌍을 이룰 때에만 항원에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인을 지칭한다. 임의의 페어링에는 항상 하나의 V_H와 하나의 V_L이 존재하며, 용어 "쌍을 이룬 V_H 도메인"은 V_H 파트너를 지칭하고, 용어 "쌍을 이룬 V_L 도메인"은 V_L 파트너를 지칭하며, 용어 "쌍을 이룬 V_H/V_L 도메인(들)"은 두개의 도메인을 함께 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합 단백질"은 항체, 항체 단편, 예를 들어 도메인 항체(dAb), ScFv, FAb, FAb₂, 및 그 밖의 단백질 작제물, 예를 들어 TNFα 및/또는 VEGF에 결합할 수 있는 수용체-Fc 융합체를 지칭한다. 항원 결합 분자는 하나 이상의 Ig 가변 도메인, 예를 들어 항체, 도메인 항체, 도메인 항체의 배수체(multiple), 예를 들어 아령(dumbbell), dAb-dAb 인-라인(in-line) 융합체, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, ScFv, 디아바디, mAbdAb, DVD-Ig, 어피바디, 헤테로컨주게이트 항체, 또는 TNFα 또는 TNFα 수용체에 대한 첫번째 특이성과 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 두번째 특이성을 지니는 이특이적 항체를 포함하는 이특이적 물질을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 dAb, 즉 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 상이한 V 영역 또는 도메인과 별개로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 V_H, V_HH 또는 V_L과 같은 단일 가변 도메인이다. 항원 결합 분자는 두개의 표적에 결합할 수 있고, 즉 이들은 이중 표적 단백질일 수 있다. 항원 결합 분자는, 예를 들어 모노클로날 항체에 연결된 하나 이상의 ScFv 및/또는 하나 이상의 도메인 항체와 같은 항체 및 항원 결합 단편들의 조합물일 수 있다. 항원 결합 분자는 또한 비-Ig 도메인, 예를 들어 TNFα 및/또는 VEGF에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앤키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소쿤니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(아드넥틴)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "항원 결합 단백질"은 인간 TNFα 및/또는 VEGF를 길항시키고/거나 중화시킬 있을 것이다. 또한, 항원 결합 단백질은 TNFα 및/또는 VEGF에 결합하여 자연 리간드가 수용체와 결합하고/거나 수용체를 활성화시키는 것을 방해함으로써 TNFα 및/또는 VEGF를 차단할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "VEGF 길항제"는 VEGF의 하나 이상의 활성을 감소시키고/거나 제거할 수 있는 임의의 화합물을 포함한다. 예로서, VEGF 길항제는 VEGF에 결합하여 VEGF 활성을 직접적으로 감소시키거나 제거할 수 있거나, 이것은 하나 이상의 리간드가 수용체에 결합하는 것을 차단함에 의해 간접적으로 작용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "TNFα 길항제"는 TNFα의 하나 이상의 활성을 감소시키고/거나 제거할 수 있는 임의의 화합물을 포함한다. 예로서, TNFα 길항제는 TNFα에 결합하여 TNFα 활성을 직접적으로 감소시키거나 제거할 수 있거나, 이것은 하나 이상의 리간드가 수용체에 결합하는 것을 차단함에 의해 간접적으로 작용할 수 있다.

항원 결합 단백질에 관해 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 용어는 항원 결합 단백질이 다른(예를 들어, 관련되지 않은) 단백질에는 결합하지 않거나 무의미한 정도로 결합하면서 이의 표적 단백질(들) (예를 들어, TNFα, TNFR, BEGF, VEGFR)에 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 주어진 종에서의 (예를 들어, 인간) 표적 단백질에 대한 항체가 다른 종에서 (예를 들어, 비-인간 영장류) 표적 단백질의 그 밖의 형태와 교차-반응성일 수도 있다는 사실까지 부정하는 것은 아니다.

용어 "KD"는 평형 해리 상수를 지칭한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 부위는 Biacore™에 의해서 측정할 경우, 각각의 항원에 대해 많아야 1mM의 KD, 예를 들어 1OnM, 1nM, 50OpM, 20OpM, 10OpMD의 KD로 항원에 결합한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 부위는 Biacore™에 의해서 측정할 경우, 각각의 항원에 대해 1OnM 이하, 1nM 이하, 50OpM 이하, 20OpM 이하, 10OpM 이하의 KD로 항원에 결합한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 작제물 상의 부위를 지칭하며, 이것은 단일 도메인, 예를 들어 에피토프 결합 도메인일 수 있거나, 이것은 표준 항체 상에서 발견될 수 있는 바와 같이 쌍을 이룬 V_H/V_L 도메인일 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 단쇄 Fv (ScFv) 도메인이 항원 결합 부위를 제공할 수 있다.

용어 "mAb/dAb" 및 "dAb/mAb"는 본 발명의 항원 결합 단백질을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 상기 두 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 명세서에서 동일한 의미를 지닌다.

용어 "불변 중쇄 1"은 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인, CH₁을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

용어 "불변 경쇄"는 면역글로불린 경쇄의 불변 도메인, C_L을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 지칭한다. 라이브러리는 일원들로 구성되고, 이러한 일원 각각은 단일한 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는다. 이러한 점에서, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다.

"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 케이뱃에 의해 규정("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)된 바와 같은 서열 내에 보존된 항체의 영역에 해당하거나, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917]에 정의된 바와 같은 인간 점라인(germline) 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일한 항체 프레임워크 서열이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 안구에 사용하기에 적합한 TNFα 길항제 및/또는 VEGF 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 안구의 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되는 TNFα 길항제 및 VEGF 길항제의 조합물을 제공한다. 본 발명은 또한 VEGF 길항제와 함께 TNFα 길항제를 투여함에 의해 안구의 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. TNFα 길항제 및 VEGF 길항제는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

개개의 TNFα 길항제 및 개개의 VEGF 길항제 (즉, 분리된 TNFα 및 VEGF 길항제 분자)의 조합물의 투여는 본 발명에 의해 커버된다. 또한, 두개 이상의 항원에 결합할 수 있는 단일 분자 또는 작제물의 투여가 본 발명에 의해 커버되며, 예를 들어 TNFα 길항제 및 VEGF 길항제 둘 모두로서 작용하는 이중 표적 기능성을 지니는 (즉, TNFα 또는 TNFα에 대한 수용체에 결합하여 이의 기능을 억제, 바람직하게는 차단할 수 있고, VEGF 또는 VEGF에 대한 수용체에 결합하여 이의 기능을 억제, 바람직하게는 차단할 수 있는) 분자가 본 발명에 의해 커버된다. 예를 들어, 본 발명은 TNFα 및 VEGFR2 등에 결합할 수 있는 이중 표적 분자를 제공한다. 한 구체예에서, 이중 표적 분자는 TNF 수용체 및 VEGF 수용체에 결합할 수 있다.

본 발명의 TNFα 길항제는 TNF 수용체를 통한 신호전달을 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%만큼 억제할 수 있다. 본 발명의 VEGF 길항제는 VEGF 수용체를 통한 신호전달을 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%만큼 억제할 수 있다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 인간 항원 결합 단백질, 특히 인간 항-TNFα 항체 또는 이의 단편, 또는 인간 항-TNFR 항체 또는 이의 단편이다. 한 구체예에서, VEGF 길항제는 인간 항원 결합 단백질, 특히 인간 항-VEGF 항체 또는 이의 단편, 또는 인간 항-VEGFR 항체 또는 이의 단편이다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 TNFα/VEGF 이중 표적 단일 작제물이고, 여기서 TNFα 길항제 부분이 인간이다. 특정 구체예에서, TNF 길항제는 아달리무맙 또는 골리무맙이거나 이로부터 유래된다.

길항제는 본 명세서에 기재된 항체 스캐폴드 또는 그러한 다른 적합한 스캐폴드를 기반으로 할 수 있다. 상기 길항제는 항체 또는 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 dAb일 수 있다. 수용체-Fc 융합체는 본 발명의 일부로서 고려된다.

본 발명의 길항제는 동시에 (동시) 투여되거나, 서로 특정된 기간 내에 (순차적), 예를 들어 서로 1개월 내, 1주 내 또는 24시간 내, 예를 들어 서로 20시간 내, 15시간 내 또는 12시간 내, 또는 10시간 내, 또는 8시간 내, 또는 6시간 내, 또는 4시간 내, 또는 2시간 내, 또는 1시간 내, 또는 30분 내에 투여되는 분리된 분자들의 혼합물로서 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 길항제는 분리된 제형 또는 단일 제형, 예를 들어 둘 모두의 길항제를 함유하는 리포좀으로서 공동-투여될 수 있다.

본 발명의 범위 내에서 본 발명의 VEGF 길항제와 함께 투여될 수 있거나 본 발명의 이중 표적 분자를 생성하는데 사용될 수 있는 TNFα 길항제는 하기 표 1에 나열된 것들을 포함한다.

표 1 : TNF α 길항제

표 1에서 명칭에 의해 확인된 TNFα 길항제 이외에, 본 발명에 따른 TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 TNFα 길항제와 함께 투여될 수 있거나, 본 발명의 이중 표적 분자를 생성하는데 사용될 수 있는 VEGF 길항제는 하기 표 2에 나열된 것들을 포함한다.

표 2: VEGF 길항제

본 발명은 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 단백질 스캐폴드를 포함하는 안구의 질환을 치료하는데 사용되는 항원 결합 단백질을 제공하고, 여기서 상기 항원 결합 단백질은 두개 이상의 항원 결합 부위를 지니는데, 그 중 하나 이상은 에피토프 결합 도메인으로부터 비롯된 것이고, 그 중 하나 이상은 쌍을 이룬 V_H/V_L 도메인으로부터 비롯된 것이며, 상기 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 TNFα 또는 TNFα에 대한 수용체에 결합하고, 상기 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 VEGF 또는 VEGF에 대한 수용체에 결합한다.

상기 항원 결합 단백질은 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG와 같은 Ig 스캐폴드, 예를 들어 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 모노클로날 항체, 예를 들어 도메인 항체를 포함하고, 여기서 결합 단백질은 두개 이상의 항원 결합 부위를 지니는데, 그 중 하나 이상은 에피토프 결합 도메인에서 비롯된 것이고, 상기 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 TNFα 또는 TNFα에 대한 수용체에 결합하고, 상기 항원 결합 부위들 중의 하나 이상은 VEGF 또는 VEGF에 대한 수용체에 결합하며, 본 발명은 이의 생산 방법 및 용도, 특히 안구의 치료에서의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 또한 mAbdAb로서 지칭된다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질의 단백질 스캐폴드는 Ig 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드 또는 IgA 스캐폴드이다. IgG 스캐폴드는 항체의 모든 도메인을 포함할 수 있다 (즉, C_H1 , C_H2, C_H3, V_H, V_L, C_L). 본 발명의 항원 결합 단백질은 IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgG4PE로부터 선택된 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 두개 이상의 항원 결합 부위를 지니고, 예를 들어 첫번째 결합 부위가 항원 상의 첫번째 에피토프에 특이성을 지니고 두번째 결합 부위가 동일한 항원 상의 두번째 에피토프에 특이성을 지니는 경우, 예를 들어 이것은 두개의 결합 부위를 지닌다. 추가의 구체예에서, 4개의 항원 결합 부위, 또는 6개의 항원 결합 부위, 또는 8개의 항원 결합 부위, 또는 10개 이상의 항원 결합 부위가 존재한다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 하나를 초과하는 항원, 예를 들어 두개의 항원, 또는 세개의 항원, 또는 네개의 항원에 특이성을 지닌다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 두개 이상의 하기 화학식 I의 구조를 포함하는 하나 이상의 동종이합체를 포함하는, TNFα 또는 TNFα 수용체, 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질에 관한 것이다:

상기 식에서, X는 불변 중쇄 도메인 2 (C_H2) 및 불변 중쇄 도메인 3 (C_H3)을 포함하는 불변 항체 영역을 나타내고;

R¹, R⁴ , R⁷ 및 R⁸은 각각 에피토프 결합 도메인을 나타내고;

R²는 불변 중쇄 1 (C_H1) 및 에피토프 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 나타내고;

R³은 쌍을 이룬 V_H 및 에피토프 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 나타내고;

R⁵는 불변 경쇄(C_L) 및 에피토프 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 나타내고;

R⁶은 쌍을 이룬 V_L 및 에피토프 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인을 나타내고;

n은 0, 1, 2, 3 및 4로부터 독립적으로 선택된 정수를 나타내고;

m은 0 및 1로부터 독립적으로 선택된 정수를 나타내며,

여기서 불변 중쇄 1 (C_H1) 및 불변 경쇄 (C_L) 도메인이 결합되고;

하나 이상의 에피토프 결합 도메인이 존재하며;

상기 R³이 쌍을 이룬 V_H 도메인을 나타낼 때, 상기 R⁶은 쌍을 이룬 V_L 도메인을 나타냄으로써, 두개의 도메인이 함께 항원에 결합할 수 있다.

한 구체예에서, R⁶은 쌍을 이룬 V_L이고, R³은 쌍을 이룬 V_H이다.

추가의 구체예에서, R⁷과 R⁸ 중의 하나 또는 둘 모두는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.

또한 추가의 구체예에서, R¹과 R⁴ 중의 하나 또는 둘 모두는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.

한 구체예에서, R⁴가 존재한다.

한 구체예에서, R¹, R⁷ 및 R⁸은 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.

한 구체예에서, R¹, R⁷ 및 R⁸, 및 R⁴는 에피토프 결합 도메인을 나타낸다.

한 구체예에서, (R¹)_n, (R²)_m, (R⁴)_m 및 (R⁵)_m = 0이고, 즉, 존재하지 않고, R³은 쌍을 이룬 V_H 도메인이며, R⁶은 쌍을 이룬 V_L 도메인이고, R⁸은 V_H dAb이고, R⁷은 V_L dAb이다.

또 다른 구체예에서, (R¹)_n, (R²)_m, (R⁴)_m 및 (R⁵)_m는 0이고, 즉, 존재하지 않고, R³은 쌍을 이룬 V_H 도메인이며, R⁶은 쌍을 이룬 V_L 도메인이고, R⁸은 V_H dAb이고, (R⁷)_m = 0, 즉, 존재하지 않는다.

또 다른 구체예에서, (R²)_m 및 (R⁵)_m은 0, 즉, 존재하지 않고, R¹은 dAb이고, R⁴는 dAb이며, R³은 쌍을 이룬 V_H 도메인이고, R⁶은 쌍을 이룬 V_L 도메인이며, (R⁸)_m 및 (R⁷)_m = 0, 즉, 존재하지 않는다.

본 발명의 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 dAb이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 TNFα 또는 TNFα 수용체에 대한 첫번째 특이성과 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 두번째 특이성을 지니는 이특이적 항체이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 항원 결합 단백질은 이중 가변 도메인 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig)이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 dAb-dAb 인-라인 융합체이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있는 수용체-Fc 융합체이다. 수용체-Fc 융합체는 면역글로불린 스캐폴드를 포함하고, 즉 이들은 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인 및 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 항체의 Fc 부분을 포함한다. 그러한 수용체-Fc-에피토프 결합 도메인 융합체를 또한 수용체-Ig-에피토프 결합 도메인 융합체로서 지칭할 수 있다. Fc 부분은 임의의 아이소형, 예를 들어 IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgG4PE의 항체로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 VEGF에 특이성을 지니며, 예를 들어 이들은 VEGF에 결합하는 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 dAb, 안티칼린, 또는 VEGF에 결합하는 아드넥틴에 연결된 수용체-Fc 융합체를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 VEGFR2에 특이성을 지니며, 예를 들어 이들은 VEGFR2에 결합하는 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 dAb 또는 VEGFR2에 결합하는 아드넥틴에 연결된 수용체-Fc 융합체를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 TNFα에 특이성을 지니며, 예를 들어 이들은 TNFα에 결합하는 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 dAb 또는 TNFα에 결합하는 아드넥틴에 연결된 수용체-Fc 융합체를 포함한다..

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 TNFα 또는 TNFα 수용체, 및 VEGF 또는 VEGF 수용체 둘 모두에 특이성을 지니며, 예를 들어 이들은 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하는 에피토프 결합 도메인에 연결된 TNFα 수용체-Fc 융합체를 포함한다. 또 다른 예는 TNFα 또는 TNFα 수용체에 결합하는 에피토프 결합 도메인에 연결된 VEGF 수용체-Fc 융합체를 포함하는 항원 결합 단백질이다.

본 명세서에 기재된 어떠한 항원 결합 단백질도 하나 이상의 항원을 중화시킬 수 있을 것이고, 예를 들어 이들이 TNFα를 중화시킬 수 있고/거나 VEGF를 중화시킬 수 있을 것임을 이해할 것이다.

본 발명의 항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서의 전반에 걸쳐 사용된 용어 "중화시킨다" 및 이의 문법상의 변형은, 본 발명의 항원 결합 단백질의 존재하에, 표적의 생물학적 활성이 그러한 항원 결합 단백질의 부재하에서의 표적의 활성과 비교하여 완전히 또는 부분적으로 감소된 것을 의미한다.

중화는, 비제한적으로 리간드 결합의 차단, 수용체를 활성화시키는 리간드의 억제, 수용체의 하향 조절 또는 이펙터(effector) 기능성에 대한 영향 중의 하나 이상에 기인할 수 있다.

중화 수준은 여러 방법으로, 예를 들어 실시예 1.3에 개시된 대로 수행될 수 있는 MRC-5 세포에서의 IL-8 분비 검정으로 측정될 수 있다. 상기 검정에서 TNFα의 중화는 중화성(neutralising) 항원 결합 단백질의 존재하에 IL-8 분비의 억제를 평가함에 의해 측정된다. 중화 수준은 예를 들어 실시예 1.3에 개시된 대로 수행될 수 있는 수용체에 대한 리간드 결합의 억제를 측정하는 검정으로 또한 측정될 수 있었다. 상기 검정에서 VEGF의 중화는 중화성 항원 결합 단백질의 존재하에 리간드와 이의 수용체간에 감소된 결합을 평가함에 의해 측정된다.

예를 들어 중화성 항원 결합 단백질의 존재하에 리간드와 이의 수용체간에 감소된 결합을 평가함에 의해, 중화를 평가하는 다른 방법들이 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Biacore™ 검정을 포함한다.

본 발명의 대안적인 측면에서, 본 명세서에 예시된 항원 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동등한 중화 활성을 갖는 항원 결합 단백질이 제공된다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 TNFα 또는 TNFα 수용체에 특이성을 지니고, 예를 들어 이들은 TNFα에 결합할 수 있는 에피토프 결합 도메인을 포함하고/거나 TNFα에 결합하는 쌍을 이룬 V_H/V_L을 포함한다. 항원 결합 단백질은 TNFα에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 TNFα에 결합할 수 있는 dAb를 포함할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 VEGF 또는 VEGF 수용체에 특이성을 지닌다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 TNFα 및 VEGF에 동시에 결합할 수 있다.

본 명세서에 개시된 어떠한 항원 결합 단백질도, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같은 적합한 검정을 이용하여 화학량론적 분석에 의해 측정할 경우, 두개 이상의 항원에 동시에 결합할 수 있음을 이해할 것이다.

그러한 항원 결합 단백질의 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 TNFα 길항제, 예를 들어 항-TNFα 아드넥틴인 에피토프 결합 도메인을 지니는 VEGF 항체를 포함한다. 예로는 SEQ ID NO:20 또는 22에 기재된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:21에 기재된 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 있고, 여기서 중쇄 및 경쇄 중의 하나 또는 둘 모두는 TNFα에 결합하는 하나 이상의 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:17에 기재된 것들로부터 선택된 에피토프 결합 도메인을 추가로 포함한다.

한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 TNFα 길항제인 에피토프 결합 도메인에 연결된 항-VEGF 항체를 포함할 것이고, 여기서 항-VEGF 항체는 SEQ ID NO:20 또는 22의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:21의 경쇄 서열을 지니는 항체와 동일한 CDR을 지닌다.

그러한 항원 결합 단백질의 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 C-말단에 부착된 VEGF 길항제인 에피토프 결합 도메인을 지니는 TNFα 항체를 포함한다. 예로는 SEQ ID NO:10에 기재된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12에 기재된 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 있고, 여기서 중쇄 및 경쇄 중의 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF 수용체, 예를 들어 VEGFR2에 결합함에 의해 VEGF를 길항시킬 수 있는 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 추가로 포함한다. 그러한 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:1, 18, 19, 23 또는 44에 기재된 것들로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 작제물은 SEQ ID NO:14의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열, 또는 SEQ ID NO:15의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열, 또는 SEQ ID NO:24의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 작제물은 WO0212502, US2007/0003548, US7250165, EP01309691, 또는 WO0212500호에 개시된 항-TNFα 결합 단백질을 포함하고, 상기 문헌들 모두는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 VEGF 갈힝제인 에피토프 결합 도메인에 연결된 항-TNFα 항체를 포함할 것이고, 여기서 항-TNFα 항체는 SEQ ID NO:10의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열을 지니는 항체와 동일한 CDR을 지닌다.

그러한 항원 결합 단백질의 다른 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 항-VEGF 에피토프 결합 도메인을 갖는 항-TNFα 항체를 포함하고, 여기서 VEGF 에피토프 결합 도메인은 WO2007080392호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 VEGF dAb 서열, 특히 SEQ ID NO:117, 119, 123, 127-198, 539 및 540에 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 VEGF dAb; 또는 WO2008149146호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 VEGF dAb 서열, 특히 DOM15-26-501, DOM15-26-555, DOM15-26-558, DOM15-26-589, DOM15-26-591, DOM15-26-594 및 DOM15-26-595로서 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 VEGF dAb, 또는 WO2007066106호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 VEGF dAb 서열 중의 어느 것으로부터 선택된 VEGF dAb, 또는 WO 2008149147호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 VEGF dAb 서열 중의 어느 것으로부터 선택된 VEGF dAb 또는 WO 2008149150호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 VEGF dAb 서열 중의 어느 것으로부터 선택된 VEGF dAb이다.

WO2007080392, WO2008149146, WO2007066106, WO2008149147 및 WO 2008149150호에 있는 이러한 특정 서열 및 관련 설명은, 본 명세서에서 청구범위로 포함시키기 위한 설명을 제공하고 본 발명에 적용하기 위한 다양한 도메인 및 길항제의 예를 제공하는 것이 분명한 의도임을 본 명세서에서 명백히 기재한 바와 같이, 본원에 참조로서 포함된다.

그러한 항원 결합 작제물의 그 밖의 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 하나 이상의 항-TNFα 에피토프 결합 도메인을 지니는 항-VEGF 항체를 포함하고, 여기서 TNFα 에피토프 결합 도메인은 WO04003019호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 TNFα dAb, 특히 TAR1-5-19, TAR1-5, 및 TAR1-27로서 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 TNFα-알파 dAb이다. WO04003019호에 있는 이러한 특정 서열 및 관련 설명은, 본 명세서에서 청구범위로 포함시키기 위한 설명을 제공하고 본 발명에 적용하기 위한 다양한 도메인 및 길항제의 예를 제공하는 것이 분명한 의도임을 본 명세서에서 명백히 기재한 바와 같이, 본원에 참조로서 포함된다.

그러한 항원 결합 작제물의 그 밖의 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 하나 이상의 항-TNFR1 에피토프 결합 도메인을 지니는 항-VEGF 항체를 포함하고, 여기서 TNFR1 에피토프 결합 도메인은 WO04003019호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 TNFR1 dAb 서열, 특히 TAR2-10, 및 TAR2-5로서 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 TNFR1 dAb; 또는 WO2006038027호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)의 TNFR1 dAb 서열, 특히 SEQ ID NO:32-98, 167-179, 373-401, 431, 433-517 및 627에 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 TNFR1 dAb; 또는 WO2008149144호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)의 TNFR1 dAb 서열, 특히 DOM1h-131-511 , DOM1h-131-201 , DOM1h-131-202, DOM1h-131-203, DOM1h-131-204, DOM1h-131-205로서 기재된 dAb 중의 어느 것으로부터 선택된 TNFR1 dAb; 또는 WO2008149148호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)의 TNFR1 dAb 서열 중의 어느 것으로부터 선택된 TNFR1 dAb, 특히 DOM1h-131-206로서 기재된 dAb이다.

WO2006038027 및 WO2008149144호에 있는 이러한 특정 서열 및 관련 설명은, 본 명세서에서 청구범위로 포함시키기 위한 설명을 제공하고 본 발명에 적용하기 위한 다양한 도메인 및 길항제의 예를 제공하는 것이 분명한 의도임을 본 명세서에서 명백히 기재한 바와 같이, 본원에 참조로서 포함된다.

항원 결합 단백질의 추가의 예는 VEGFR2에 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인에 연결된 TNFR2-Ig 융합체, 예를 들어 TNFR2-Ig 융합체의 C-말단 또는 N-말단에 연결된 항-VEGFR2 아드넥틴을 포함하고, 예를 들어 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:18에 기재된 아드넥틴과 같은 VEGFR2에 결합하는 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 추가로 포함하는 SEQ ID NO:34에 기재된 TNFR2-Ig 서열을 포함한다.

그러한 항원 결합 단백질의 또 다른 예는 VEGF에 특이성을 지니는 에피토프 결합 도메인에 연결된 TNFR2-Ig 융합체, 예를 들어 TNFR2-Ig 융합체의 C-말단 또는 N-말단에 연결된 항-VEGF dAb 또는 항-VEGF 안티칼린을 포함하고, 예를 들어 수용체-Fc-에피토프 결합 도메인 융합체는 SEQ ID NO:1에 기재된 dAb 또는 SEQ ID NO:19에 기재된 안티칼린과 같은 VEGF에 결합하는 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 추가로 포함하는 SEQ ID NO:34에 기재된 TNFR2-Ig 서열을 포함한다.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기는 케이뱃 넘버링 규칙에 따라 넘버링된다. 유사하게, 실시예에서 사용된 용어 "CDR", "CDRL1 ", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1 ", "CDRH2", "CDRH3"도 케이뱃 넘버링 규칙에 따른다. 추가의 정보를 위해, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다.

그러나, 본 발명자들이 본 명세서 전반에 걸쳐 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기에 대해 케이뱃 넘버링 규칙을 사용하였으나, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기에 대한 대안적인 넘버링 규칙이 존재함이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 문헌[Chothia et al. (1989) Nature 342: 877- 883]에 개시된 바와 같은, CDR 서열에 대한 대안적인 넘버링 규칙이 존재한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기들이 CDR 서열의 일부로서 고려되고 당업자에 의해 그렇게 이해될 것임을 의미할 수 있다.

당업자에게 이용가능한 CDR 서열에 대한 그 밖의 넘버링 규칙으로는 "AbM" (University of Bath) 및 "컨택(contact)" (University College London) 방법이 있다. 케이뱃, 코티아(Chothia), AbM 및 컨택 방법 중의 둘 이상을 이용하여 최소 중복 영역을 결정함으로써 "최소 결합 단위"를 제공할 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 서브-부분을 나타낼 수 있다.

CDR 변이체를 지니는 항원 결합 단백질이 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 그러한 항원 결합 단백질은 또한 중쇄의 C-말단 및/또는 N-말단 및/또는 경쇄의 C-말단 및/또는 N-말단 및/또는 수용체-Fc 또는 수용체-Fc-dAb 융합체의 N-말단 또는 C-말단에 부착된 동일하거나 상이한 항원-특이성을 지니는 하나 이상의 추가의 에피토프 결합 도메인을 지닐 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며 이것은 항체 또는 수용체-Fc 융합체가 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 이펙터 기능성을 감소시키도록 하는 불변 영역을 포함한다. 그러한 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4 아이소형의 자연 무력화된 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예가 EP0307434호에 기재되어 있다. 일례는 위치 235 및 237에서 알라닌 잔기의 치환을 포함한다 (EU index numbering, Kabat et al, (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services).

한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 Fc 부분은 기능적으로 무력화된다. 그러한 Fc 무력화는 개선된 안전성 프로파일을 지니는 항원 결합 단백질을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 항체의 중쇄 상에 에피토프 결합 도메인을 정위시킴에 의해, 특히 중쇄의 C-말단 상에 에피토프 결합 도메인을 정위시킴에 의해 항원 결합 단백질의 CDC 기능을 감소시키는 방법을 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 예를 들어 ADCC 및 CDC 활성 중의 하나 또는 둘 모두일 수 있는 Fc 기능성을 보유할 것이다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 예를 들어, 면역글로불린 스캐폴드가 이펙터 기능을 지닌 항체로부터 유래된 Fc 영역을 함유할 때, 예를 들어 면역글로불린 스캐폴드가 IgG1으로부터의 CH2 및 CH3를 포함할 때, 일부 이펙터 기능을 지닐 수 있다. 이펙터 기능의 수준은, 예를 들어 CH2 도메인에서의 돌연변이에 의해 공지된 기술에 따라 변화될 수 있고, 예를 들어 IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 지니고, 예를 들어 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택되어 항체가 개선된 이펙터 기능을 갖도록 하고/거나 예를 들어 본 발명의 항원 결합 단백질의 글리코실화 프로파일을 변경시켜 Fc 영역의 푸코실화가 감소되게 한다.

한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 도메인 항체(dAb)인 에피토프 결합 도메인을 포함하고, 예를 들어 에피토프 결합 도메인은 인간 V_H 또는 인간 V_L, 또는 카멜리드 V_HH 또는 상어 dAb (NARV)일 수 있다.

한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 자연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앤키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소쿤니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(아드넥틴)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 에피토프 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 아드넥틴인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 아드넥틴을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 아드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 아드넥틴을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 아드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 아드넥틴을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 아드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 아드넥틴을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 CTLA-4인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 CTLA-4를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 CTLA-4를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 CTLA-4를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 CTLA-4를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 리포칼린인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 리포칼린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 리포칼린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 리포칼린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 리포칼린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SpA인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 SpA를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 SpA를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 SpA를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 SpA를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 어피바디인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 어피바디를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 어피바디를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 어피바디를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 어피바디를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 어피머(affimer)인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 어피머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 어피머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 어피머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 어피머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 GroEI인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 GroEI를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 GroEI를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 GroEI를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 GroEI를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 트랜스페린인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 트랜스페린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 트랜스페린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 트랜스페린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 트랜스페린을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 GroES인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 GroES를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 GroES를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 GroES를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 GroES를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 DARPin인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 DARPin을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 DARPin을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 DARPin을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 DARPin을 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

그 밖의 구체예에서, 항원 결합 단백질은 펩티드 앱타머인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어 IgG 스캐폴드, 예를 들어 중쇄의 N-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 중쇄의 C-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 N-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 예를 들어 경쇄의 C-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 지니는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 네개의 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 네개의 도메인 항체가 존재하며, 에피토프 결합 도메인 중의 두개는 동일한 항원에 특이성을 지닐 수 있거나, 항원 결합 단백질에 존재하는 에피토프 결합 도메인이 모두 동일한 항원에 특이성을 지닐 수 있다.

본 발명의 단백질 스캐폴드는 링커를 사용하여 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게 본 발명의 수용체-Fc 융합체는 링커를 사용하여 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있다. 또한 DVD-Ig의 VD1 및 VD2 도메인은 링커 등의 수단에 의해 함께 연결될 수 있다. 적합한 링커의 예는 1개 아미노산 내지 150개 아미노산 길이, 또는 1개 아미노산 내지 140개 아미노산, 예를 들어 1개 아미노산 내지 130개 아미노산, 또는 1 내지 120개 아미노산, 또는 1 내지 80개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산, 또는 1 내지 20개 아미노산, 또는 1 내지 10개 아미노산, 또는 5 내지 18개 아미노산의 길이일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 서열은 고유의 삼차 구조를 지닐 수 있고, 예를 들어, 본 발명의 링커는 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 링커의 크기는, 한 구체예에서, 단일 가변 도메인과 같다. 적합한 링커의 크기는 1 내지 20 옹스트롬, 예를 들어 15 옹스트롬 미만, 또는 10 옹스트롬 미만, 또는 5 옹스트롬 미만일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인 중의 하나 이상은 1 내지 150개 아미노산, 예를 들어 1 내지 20개 아미노산, 예를 들어 1 내지 10개 아미노산을 포함하는 링커를 이용하여 Ig 스캐폴드에 직접 부착된다.

상기 링커는 SEQ ID NO:3-8, SEQ ID NO:25, 또는 SEQ ID NO:66-68에 기재된 것들 중 어느 하나, 또는 그러한 링커들의 배수체로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 'TVAAPS'일 수 있거나, 'GGGGS'일 수 있거나, 그러한 링커들의 배수체일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 링커는 'STG' (SEQ ID NO:25)이다.

링커는 하나 또는 두개의 아미노산 변화를 지니는 본 명세서에 기재된 어떠한 링커일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질에 사용된 링커는 단독으로 또는 다른 링커에 추가하여, GS 잔기의 하나 이상의 세트, 예를 들어 'GSTVAAPS' 또는 'TVAAPSGS' 또는 'GSTVAAPSGS', 또는 그러한 링커들의 배수체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커는 'GSTVAAPSGS'를 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 링커는 GS(TVAAPSGS) X2 (예를 들어, 'GSTVAAPSGSTVAAPSGS' SEQ ID NO:66)를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 링커는 GS(TVAAPSGS) X3 (예를 들어, 'GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS' SEQ ID NO:67)를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 링커는 GS(TVAAPSGS) X4 (예를 들어, 'GSTVAAPSGSTVAAPSGS TVAAPSGSTVAAPSGS' SEQ ID NO:68)를 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(PAS)_n(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(GGGGS)_{n 또는 p}(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TVAAPS)_{n 또는 p}(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(GS)_m(TVAAPSGS)_{n 또는} _p'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(GS)_m(TVAAPS)_p(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인 링커 '(PAVPPP)_n(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TVSDVP)_n(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TGLDSP)_n(GS)_m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 모든 상기 구체예에서, n = 1-10이고, m = 0-4이고, p = 2-10이다.

상기 링커의 예로는 (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1) (SEQ ID NO:145), (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:146), (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:147), (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1) , (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0), (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0), (PAS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0) (SEQ ID NO:148), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0) (SEQ ID NO:149), (GGGGS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=1 및 m=1), (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=2 및 m=1), (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=3 및 m=1), (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=4 및 m=1), (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=5 및 m=1), 또는 (GS)_m(TVAAPS)_p (여기서 p=6 및 m=1)이 있다.

상기 링커의 예로는 (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:150), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:151), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0), (TVAAPS)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=1 및 m=1), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:66), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:67), 또는 (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=4 및 m=1) (SEQ ID NO:68), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=5 및 m=1) (SEQ ID NO:152), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=6 및 m=1) (SEQ ID NO:153), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=1 및 m=0) (SEQ ID NO:8), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=2 및 m=10), (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=3 및 m=0), 또는 (GS)_m(TVAAPSGS)_n (여기서 n=0)이 있다. 상기 링커의 예로는 (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=2 및 m=1), (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=3 및 m=1), (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=4 및 m=1), (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=2 및 m=0), (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=3 및 m=0), (TVAAPSGS)_p(GS)_m (여기서 p=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1) (SEQ ID NO:154), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:155), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:156), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0), (PAVPPP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1) (SEQ ID NO:157), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:158), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:159), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0), (TVSDVP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

상기 링커의 예로는 (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=1 및 m=1) (SEQ ID NO:160), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=1) (SEQ ID NO:161), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=1) (SEQ ID NO:162), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=1), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=2 및 m=0), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=3 및 m=0), (TGLDSP)_n(GS)_m (여기서 n=4 및 m=0)이 있다.

또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인과 Ig 스캐폴드 사이에 링커는 존재하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'TVAAPS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'TVAAPSGS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'GS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'ASTKGPT'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다.

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어, 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함한다.

한 구체예에서, 세개 이상의 항원 결합 부위가 존재하고, 예를 들어 네개, 다섯개, 여섯개, 여덟개 또는 열개의 항원 결합 부위가 존재하며, 항원 결합 단백질은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 8개 또는 10개의 항원에 결합할 수 있고, 예를 들어 항원 결합 단백질은 3개, 4개, 5개, 6개, 8개 또는 10개의 항원에 동시에 결합할 수 있다.

본 발명은 또한 약제에 사용되는, 예를 들어 안구의 질환 (대안적으로, 본원에서 '안구 질환'으로서 지칭함), 예를 들어 당뇨병성 황반부종(DME), 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 지도형 위축, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄(BRVO 및/또는 CRVO) 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용되는 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질을 제공한다. 한 구체예에서, 치료되는 질환은 AMD이다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 질환은 DME이다.

본 발명은 치료량의 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하여, 안구의 질환, 예를 들어 당뇨병성 황반부종, 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 지도형 위축, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄(BRVO 및/또는 CRVO) 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

안구의 질환, 예를 들어 당뇨병성 황반부종, 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 지도형 위축, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄(BRVO 및/또는 CRVO) 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증 또는 TNFα 및/또는 VEGF의 과잉 생산과 관련된 임의의 그 밖의 질환을 치료하기 위해 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용할 수 있다.

특정 구체예에서, 상기 질환은 AMD, 구체적으로 맥락막 혈관신생 AMD이다.

본 발명에 사용된 단백질 스캐폴드는 항체의 모든 도메인을 포함하는 완전한 모노클로날 항체 스캐폴드 또는 통상적인 항체의 Fc 부분을 포함하거나, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 일가 항체와 같은 비-통상적인 항체 구조 또는 비-통상적인 항체 구조의 Fc 부분을 포함할 수 있다. 그러한 일가 항체는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 중쇄의 힌지 영역이 변형되어 중쇄는 WO2007059782호에 개시된 일가 항체와 같이, 동종이합체화되지 않는다. 다른 일가 항체는 기능성 가변 영역 및 C_H1 영역이 결여된 두번째 중쇄와 이합체화된 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 첫번째 및 두번째 중쇄는 변형되어 동종이합체가 아닌 이종이합체를 형성함으로써 WO2006015371호에 개시된 일가 항체와 같은 두개의 중쇄 및 하나의 경쇄를 지닌 일가 항체를 초래할 것이다. 그러한 일가 항체는 에피토프 결합 도메인이 연결될 수 있는 본 발명의 단백질 스캐폴드를 제공할 수 있다. 그러한 일가 항체의 Fc 영역은 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드, 세포외 도메인 및 에피토프 결합 도메인이 결합할 수 있는 본 발명의 면역글로불린 스캐폴드를 제공할 수 있다. 그러한 일가 구조에서, 첫번째 중쇄에 연결된 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인 및 두번째 중쇄에 연결된 하나 이상의 에피토프 결합 도메인을 지닐 수 있다.

본 발명에 사용된 에피토프 결합 도메인은 상이한 V 영역 또는 도메인과 별개로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 이것은 도메인 항체일 수 있거나 자연 리간드 이외의 리간드에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앤키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소쿤니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(아드넥틴)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 어피바디, 아비머, GroEI, 트랜스페린, GroES 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 도메인과 같은 도메인 항체 또는 그 밖의 적합한 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 이것은 dAb, 어피바디, 앤키린 반복 단백질(DARPin) 및 아드넥틴으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이것은 어피바디, 앤키린 반복 단백질 (DARPin) 및 아드넥틴으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이것은 도메인 항체, 예를 들어 인간, 카멜리드 또는 상어 (NARV) 도메인 항체로부터 선택된 도메인 항체일 수 있다.

에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드에 하나 이상의 위치에서 연결될 수 있다. 이러한 위치는 단백질 스캐폴드의 C-말단 및 N-말단, 예를 들어 IgG의 중쇄의 C-말단 및/또는 경쇄의 C-말단, 또는 예를 들어 IgG의 중쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 N-말단을 포함한다.

한 구체예에서, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드에 연결되고, 두번째 에피토프 결합 도메인은 첫번째 에피토프 결합 도메인에 연결되며, 예를 들어 단백질 스캐폴드가 IgG 스캐폴드인 경우, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 중쇄의 C-말단에 연결될 수 있고, 상기 에피토프 결합 도메인은 그 C-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있거나, 예를 들어 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 경쇄의 C-말단에 연결될 수 있고, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 그 C-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있거나, 예를 들어 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 경쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 그 N-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있거나, 예를 들어 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 중쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 그 N-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있다.

에피토프 결합 도메인이 도메인 항체일 때, 몇몇 도메인 항체는 스캐폴드 내에서 특정 위치에 적합할 수 있다.

본 발명에 사용된 도메인 항체는 통상적인 IgG의 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 연결될 수 있다. 또한, 일부 dAb는 통상적인 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 C-말단에 연결될 수 있다.

에피토프 결합 도메인은 하나 이상의 위치에서 수용체-Fc 융합체에 연결될 수 있다. 이러한 위치로는 수용체-Fc 융합체의 C-말단 및 N-말단이 있다. 예를 들어, 이들은 수용체-Fc 융합체의 Fc 부분에 직접 연결될 수 있거나, 수용체-Fc 융합체의 수용체 또는 세포 표면 단백질 부분의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인에 연결될 수 있다. 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인이 Fc 부분의 N-말단에 연결될 때, 에피토프 결합 도메인은 Fc 부분의 C-말단 또는 수용체 또는 세포 표면 단백질의 가용성 리간드 또는 세포외 도메인의 N-말단에 직접 연결될 수 있다.

한 구체예에서, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 수용체-Fc 융합체에 연결되고 두번째 에피토프 결합 도메인은 첫번째 에피토프 결합 도메인에 연결되며, 예를 들어 첫번째 에피토프 결합 도메인은 수용체-Fc 융합체의 C-말단에 연결될 수 있고, 상기 에피토프 결합 도메인은 그 C-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 연결될 수 있거나, 예를 들어 첫번째 에피토프 결합 도메인은 수용체-Fc 융합체의 N-말단에 연결될 수 있고, 상기 첫번째 에피토프 결합 도메인은 그 N-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있다. 에피토프 결합 도메인이 도메인 항체일 때, 일부 도메인 항체는 스캐폴드 내에서 특정 위치에 적합할 수 있다.

dAb의 N-말단이 항체 불변 도메인 (C_H3 또는 C_L)에 융합된 작제물에서, 펩티드 링커는 dAb가 항원에 결합하는 것을 도울 수 있다. 실제로, dAb의 N-말단은 항원 결합 활성에 수반되는 상보성 결정 영역 (CDR)에 가깝게 위치한다. 따라서, 짧은 펩티드 링커는 에피토프 결합과 단백질 스캐폴드의 불변 도메인 사이의 스페이서로서 작용하는데, 이것은 dAb CDR이 항원에 보다 용이하게 도달하여 고 친화성으로 결합하도록 할 수 있다.

dAb가 IgG에 연결된 주위 환경은 이들이 융합된 항체 사슬에 따라 상이할 것이다. IgG 스캐폴드의 항체 경쇄의 C-말단에 융합될 때, 각각의 dAb는 항체 힌지 및 Fc 부분에 근접하게 위치할 것으로 예상된다. 그러한 dAb는 아마도 서로에게서 멀리 떨어져 위치할 것이다. 통상적인 항체에서, Fab 단편들간의 각도 및 각 Fab 단편과 Fc 부분간의 각도는 매우 현저하게 다양할 수 있다. 아마도 -mAbdAb를 지닐 때- Fab 단편들간의 각도는 광범하게 상이하지 않을 것이나, 일부 각진 제한부가 각 Fab 단편과 Fc 부분간의 각도를 지니는 것이 관찰될 수 있다.

IgG 스캐폴드의 항체 중쇄의 C-말단에 융합될 때, 각각의 dAb는 Fc 부분의 C_H3 도메인에 근접하게 위치할 것으로 예상된다. 이러한 수용체들이 C_H2 도메인 (수용체의 FcγRI, II 및 III 클래스의 경우) 또는 C_H2 및 C_H3 도메인들 사이의 힌지 (예를 들어, FcRn 수용체)와 연동되므로, 이것은 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, II, III 및 FcRn)에 대한 Fc 결합 특성에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 상기 항원 결합 단백질의 또 다른 특징은, 둘 모두의 dAb가 공간적으로 서로 근접할 것으로 예상되고, 가요성이 적합한 링커의 공급에 의해 제공된다면, 이러한 dAb는 바로 동종이합체 종을 형성할 수 있으므로, 작제물의 안정성을 향상시킬 수 있는 Fc 부분의 '지프트(zipped)' 사차 구조를 보급한다는 것이다.

상기 구조적 고려사항은 단백질 스캐폴드, 예를 들어 항체 또는 수용체-Fc 융합체 상에서 에피토프 결합 도메인, 예를 들어 dAb를 연결시키는 가장 적합한 위치의 선택에 도움이 될 수 있다.

항원의 크기, 이의 국소화 (혈액에서 또는 세포 표면 상에), 이의 사차 구조 (단량체 또는 다합체)는 다양할 수 있다. 통상적인 항체는 힌지 영역의 존재로 인해 어댑터(adaptor) 작제물로서 기능하도록 자연적으로 설계되는데, 여기서 Fab 단편의 끝에 있는 두개의 항원 결합 부위의 배향은 광범하게 다양할 수 있으므로 항원 및 그 주위의 분자적 특징에 적합할 수 있다. 대조적으로, 항체 또는 그 밖의 단백질 스캐폴드, 예를 들어 힌지 영역이 없는 항체를 포함하는 단백질 스캐폴드에 연결된 dAb는 직접 또는 간접적으로 구조적 가요성을 덜 지닐 수 있다.

용해 상태 및 dAb에서의 결합 방식을 이해하는 것이 또한 도움이 될 수 있다. 시험관내 dAB가 용액에서 단량체, 동종-이합체 또는 다합체 형태로 현저하게 존재할 수 있다는 증거가 축적되어 왔다 (Reiter et al., J Mol Biol (1999) 290: 685-698; Ewert et al., J Mol Biol (2003) 325: 531-553, Jespers et al., J Mol Biol (2004) 337: 893-903; Jespers et al., Nat Biotechnol (2004) 22: 1161-1165; Martin et al., Protein Eng. (1997) 10: 607-614; Sepulvada et al., J Mol Biol (2003) 333: 355-365). 이것은 벤스-존스(Bence-Jones) 단백질(면역글로불린 경쇄 (Epp et al., Biochemistry (1975) 14: 4943-4952; Huan et al., Biochemistry (1994) 33: 14848-14857; Huang et al., Mol immunol (1997) 34: 1291-1301 ) 및 아밀로이드 섬유 (James et al. J MoI Biol. (2007) 367: 603-8)의 이합체이다)과 같은 Ig 도메인을 이용하여 생체내 관찰된 다합체화 사건을 상당히 상기하게 한다.

예를 들어, 용액에서 이합체화되는 경향이 있는 도메인 항체가 경쇄의 C-말단 또는 수용체-Fc 융합체의 N-말단에 우선하여 Fc 부분의 C-말단에 연결되는 것이 바람직할 수 있는데, Fc의 C-말단에 연결되는 것이 본 발명의 항원-결합 단백질에 관해 그러한 dAb들이 이합체화되도록 할 수 있을 것이기 때문이다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 단일한 항원에 특이적인 항원 결합 부위를 포함할 수 있거나, 두개 이상의 항원 또는 단일 항원 상의 두개 이상의 에피토프에 특이적인 항원 결합 부위를 지닐 수 있거나, 항원 결합 부위들이 존재할 수 있는데 각각은 동일하거나 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적이다.

특히, 본 발명의 항원 결합 단백질은 TNFα 및 VEGF와 관련된 질환, 예를 들어, 안구의 질환, 예를 들어 당뇨병성 황반부종, 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 지도형 위축, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄(BRVO 및/또는 CRVO) 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증을 치료하는데 유용할 수 있다.

안구의 상기 언급된 질환들 중 어느 하나, 특히 AMD를 치료하기 위해 함께 투여될 수 있는 특정 TNFα 길항제 및 VEGF 길항제는 다음과 같다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 아달리무맙이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 D0M15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 인플릭시맙이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 에타너셉트이고 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ESBA105이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-19이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-490이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 PEP1-5-493이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:2의 아드넥틴이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 골리무맙이고맙이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 MP01 12이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 ESBA903. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 세르톨리주맙이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 ALK-6931이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 베바시주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 라니비주맙이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 r84이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 아플리버셉트이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 CT01이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 DOM15-10-11이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 DOM15-26-593이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 PRS-050이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 PRS-051이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 MP0112이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 CT-322이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 ESBA903이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 EPI-0030이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 EPI-0010이다. 한 구체예에서, TNFα 길항제는 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체이고 VEGF 길항제는 DMS1571이다.

상기 조합물 각각을 또한 본 발명의 이중 표적 분자를 생성하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 이중 표적 분자의 특정예 및 비제한적인 예는 다음과 같다: Fc 능력화된(enabled) DMS4000 (SEQ ID NO:14 및 SEQ ID NO:12), Fc 무력화된(disabled) DMS4000 (SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:12), DMS4031 (SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:12), DOM-PEP 인-라인 융합체 (SEQ ID NO:62), PEP-DOM 인-라인 융합체 (SEQ ID NO:64), SEQ ID NO:69-72로부터 선택된 중쇄 및 SEQ ID NO:12의 경쇄를 지니는 이중 표적 분자, 및 SED ID NO:72-140에 나열된 것들.

본 발명의 항원 결합 단백질은 숙주 세포를 본 발명의 항원 결합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션시킴에 의해 생산될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는, 항원 결합 단백질에 대한 이러한 코딩 서열을 숙주 세포에서의 복제 및 발현 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 제어할 수 있는 통상적인 조절 제어 서열과 작동적으로 결합하여 정위시킴에 의해 생산된다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예를 들어 CMV 프로모터, 및 그 밖의 공지된 항체로부터 유래될 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 상보적인 항원 결합 단백질 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 지니는 두번째 발현 벡터가 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 두번째 발현 벡터는 코딩 서열 및 선택가능한 마커에 관한 것을 제외하고는 첫번째와 동일하므로, 가능한 한 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현되는 것을 보장한다. 대안적으로, 항원 결합 단백질에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일한 벡터 상에, 예를 들어 동일한 벡터의 두개의 발현 카세트에 존재할 수 있다.

선택된 숙주 세포는 첫번째 및 두번째 벡터 둘 모두를 이용하여 통상적인 기술에 의해 공-트랜스펙션되어 (또는 단순히 단일한 벡터에 의해 트랜스펙션되어) 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포를 생성한다. 그 후, 트랜스펙션된 세포를 통상적인 기술에 의해 배양시켜 본 발명의 공학처리된 항원 결합 단백질을 생산한다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 연합체(assocation)를 포함하는 항원 결합 단백질을 ELISA 또는 RIA와 같은 적합한 검정에 의해 배양으로부터 스크리닝하였다. 유사한 통상적인 기술을 이용하여 다른 항원 결합 단백질을 작제할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물의 작제에 이용되는 클로닝 및 서크클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈를 이용할 수 있다. 한 벡터인, pUC19는 Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 Pharmacia (Uppsala, Sweden)와 같은 공급원으로부터 시판된다. 추가로, 용이하게 복제될 수 있고, 풍부한 클로닝 부위 및 선택가능한 유전자 (예를 들어, 항생제 내성)를 지니며, 용이하게 조작되는 임의의 벡터를 클로닝에 이용할 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한적인 인자가 아니다.

발현 벡터는 또한 이종성 DNA 서열의 발현을 증폭시키기에 적합한 유전자, 예를 들어 포유동물 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)를 특징으로 할 수 있다. 다른 벡터 서열로는 예컨대 소 성장 호르몬(BGH)으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열 (배타글로프로)이 있다. 본 명세서에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.

그러한 벡터의 성분들, 예를 들어 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 등은 상업원 또는 자연원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 사용되는 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모 및 진균류 발현에 대해 다수의 유형이 당 분야에 공지되어 있는 그 밖의 적합한 발현 벡터들이 또한 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 클로닝 및 이러한 클로닝 벡터의 그 밖의 조작에 유용한 숙주 세포가 또한 통상적이다. 그러나, 이.콜라이(E.coli)의 다양한 균주로부터의 세포를 클로닝 벡터의 복제 및 본 발명의 항원 결합 단백질의 작제 중의 다른 단계에 이용할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주로는 포유동물 세포, 예를 들어 NS0, Sp2/0, CHO (예를 들어, DG44), COS, HEK, 섬유모세포 (예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포가 있고, 예를 들어 이들은 CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포를 이용할 수 있어서, 분자가 인간 글리코실화 패턴을 지니도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵 세포주를 이용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산과 정제 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al. (상기 인용됨) 참조.

박테리아 세포는 재조합 Fab의 발현 또는 본 발명의 다른 구체예에 적합한 숙주 세포로서 유용함이 입증될 수 있다 (예를 들어, Pluckthun, A., Immunol. Rev. (1992) 130: 151-188 참조). 그러나, 단백질이 박테리아 세포에서 폴딩되지 않거나 부적절하게 폴딩된 형태 또는 비-글리코실화된 형태로 발현되는 경향으로 인해, 박테리아 세포에서 생산된 임의의 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유에 대해 선별되어야 할 것이다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절하게 폴딩된 형태로 생산되었다면, 그 박테리아 세포는 요망되는 숙주일 것이나, 대안적인 구체예에서 분자는 박테리아 숙주에서 발현된 후 후속하여 재폴딩될 수 있다. 예를 들어, 발현에 사용된 이.콜라이(E. coli)의 다양한 균주가 생물공학 분야에서 숙주 세포로서 널리 공지되어 있다. 비.서브틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스, 그 밖의 바실러스 등의 다양한 균주가 또한 본 방법에 이용될 수 있다.

요망되는 경우, 숙주 세포로서 당업자에게 공지된 효모 세포의 균주뿐 아니라 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 및 레피돕테라 및 바이러스 발현 시스템이 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering (1986) 8: 277-298, Plenum Press] 및 본 명세서에 인용된 참조문헌들을 참조한다.

벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생산하는데 요구되는 트랜스펙션 방법, 및 그러한 숙주 세포로부터 본 발명의 항원 결합 단백질을 생산하는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술일 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 배양 방법은, 보통 세포를 혈청이 없는 현탁액에서 배양시킴에 의한 혈청이 없는 배양 방법이다. 유사하게, 본 발명의 항원 결합 단백질은 일단 생산되면 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 분야의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 그러한 기술들은 당 분야의 기술 내에 있고 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들어, 변경된 항체의 제조가 WO 99/58679호 및 WO 96/16990호에 기재되어 있다.

항원 결합 단백질 발현의 또 다른 방법은 미국 특허 제4,873,316호에 기재된 바와 같은 트랜스제닉 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 동물로 트렌스제닉 방식으로 포함되는 경우에 암컷이 이의 밀크에서 요망되는 재조합 단백질을 생성하는 것을 가능케 하는 동물의 카세인 프로모터를 이용한 발현 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 한 추가 양태에서, 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은,

(a) 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 단계;

(b) 상기 벡터로 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;

(c) 상기 숙주 세포로부터 상기 배지로의 항원 결합 단백질의 분비에 도움이 되는 조건하에서 상기 단계(b)의 숙주 세포를 배양하는 단계;

(d) 상기 단계(c)의 분비된 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

(a) 항원 결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 첫번째 벡터를 제공하는 단계;

(b) 항원 결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 두번째 벡터를 제공하는 단계;

(c) 상기 첫번째 및 두번째 벡터로 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;

(d) 상기 숙주 세포로부터 상기 배지로의 항원 결합 단백질의 분비에 도움이 되는 조건하에서 상기 단계(c)의 숙주 세포를 배양하는 단계;

(e) 상기 단계(d)의 분비된 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

요망되는 방법에 의해 발현된 후, 항원 결합 단백질은 적절한 검정의 사용에 의해 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재 통상적인 ELISA 검정 포맷은 항원 결합 단백질의 이의 표적으로의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 사용된다. 추가로, 다른 시험관내 검정이 또한 통상의 청소 메커니즘에도 불구하고 신체에서의 항원 결합 단백질의 지속을 평가하기 위해 수행되는 이후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 확인하는데 사용될 수 있다.

치료 용량 및 지속기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대적 지속기관에 관한 것으로, 이는 치료되는 조건 및 환자의 일반 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복된 투여(예를 들어, 1주일에 1회 또는 2주일에 1회)가 최대 치료 효능을 달성하기 위해 필요할 수 있는 것이 예견된다.

본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주의 안구로 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 수동 투여, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 투여를 통해 유효량의 본 발명의 항원 결합 단백질 및 약제 조성물을 전달하는데 전신 투여가 충분할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질 및 약제 조성물은 또한 국소적 적용, 예를 들어, 안구 점적 또는 겔, 유리체내 주사, 전방내 또는 안구주위 투여에 의해, 즉 안구후, 안구주위, 테논낭하 또는 결막하 주사를 통하거나, 하직근(inferior rectus muscle), 상직근(superior rectus muscle) 또는 외직근(lateral rectus muscle)을 통해 안구로 더욱 국소적으로 전달될 수 있다. 국소 투여의 다른 경로는 본 발명의 항원 결합 단백질 및 약제 조성물이 적은 용량에서 더욱 용이하게 안구의 후안부에 도달하는 것을 가능케 할 수 있다. 국소적 적용은 토끼 모델에서 안구의 후방으로의 항체 단편의 침투를 가능케 하는 것으로 기재되어 있다(Williams KA et al., (2005)). 항체 단편 또는 완전한 모노클로날 항체의 유리체내 주사가 기재되어 있으며, AMD 환자는 생성물 라니비주맙 및 베바시주맙에 대해 잘 용인된다.

한 구체예에서, TNF 길항제 및 VEGF 길항제는 둘 모두 유리체내 투여된다. 한 구체예에서, VEGF 길항제는 유리체내 투여되고, TNF 길항제, 특히 ESBA105는 국소적 투여, 예를 들어, 유리체내 또는 결막하 투여가 아닌 수단에 의해 투여된다. 한 구체예에서, TNF 길항제는 유리체내 투여되고, VEGF 길항제는 국소적으로 투여된다.

항원 결합 단백질의 안구의 특정 영역, 예를 들어, 안구의 표면, 또는 누관 또는 누선으로의 전달을 표적화시키는 것이 유용할 수 있거나, 안구내 전달(안구의 전방 또는 후방, 예를 들어, 유리체액)될 수 있고, 상기 항원 결합 단백질은 안구 구조, 예를 들어, 홍채, 섬모체, 누선에 전달될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 안구내 주사, 국소 전달(예를 들어, 안구 점적), 안구주위 투여 및 서방형 제형의 사용으로부터 선택된 방법에 의해 조성물을 안구로 투여하는 것을 포함하여 상기 조성물을 안구로 직접 전달하는 방법을 추가로 제공한다.

이는 항원 결합 단백질이 안구 침투 향상제, 예를 들어, 소듐 카프레이트, 또는 점성도 향상제, 예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)와 함께, 예를 들어, 국소 전달(예를 들어, 안구 점적으로 전달)에 의해 안구로 전달되는 경우에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 안구로의 국소 전달을 위한 (a) 본 발명의 항원 결합 단백질, 및 (b) 안구 침투 향상제, 및/또는 (c) 점성도 향상제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

항원 결합 단백질 및 본 발명의 약제 조성물의 전달은 또한 유리체내 임플란트에 의해 투여될 수 있다. 안구뒤 및 안구주위 주사는 특정 23 내지 26 게이지(gauge) 바늘로 달성될 수 있고, 이는 유리체내 주사보다 덜 침습성이다. 테논낭하 주사는 후부 안구로의 침투를 도울 수 있는 장기간 동안 공막과 접촉하도록 조성물에 위치될 수 있다. 결막 바로 아래의 단백질의 주사가 토끼 모델에서 기재되어 있으며, 이는 분자가 공막을 가로질러 더욱 직접적으로 확산하여 안구의 후안부에 도달하는 것을 가능케 한다.

안주로 또는 안구 주위로 장기간에 걸쳐 물질의 방출을 가능케 하여 투여가 덜 빈번히 이루어지는 것을 가능케 하는 지속 방출 약물 전달 시스템이 또한 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 치료 조성물로 충전되거나 이로 코팅될 수 있는 미셀(micelle), 겔, 하이드로겔, 나노입자, 미세캡슐 또는 임플란트를 포함한다. 이들은 주사 또는 다른 기존에 기재된 덜 침습성인 경로 중 임의의 경로, 즉, 안구주위 또는 공막하 경로를 통해 안구의 유리체로 전달될 수 있다. 이러한 지속 방출 시스템 및 국부 전달 경로의 예는 후부 망막 및 RPE 층을 표적으로 하는 나노입자 기반 제형의 공막하 투여 또는 유리체내 투여용의 열-민감성 서방형 하이드로겔을 포함한다(Janoira KG, et al ., (2007); Birch DG (2007)). 전달 시스템 및 국부 투여 경로의 많은 다른 조합이 가능하고, 이는 본 발명의 항원 결합 단백질의 조성물, 및 약제 조성물로 고려될 수 있다.

한 특정 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 유리체내 주사에 의해 유리체내로 투여된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항원 단백질, 특히 이중 표적 작제물은 4-8주 간격, 바람직하게는 6-8주 간격으로 유리체내 투여된다. 한 특정 구체예에서, 항원 결합 단백질은 결막하 주사에 의해 투여된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 국소적으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 지속 방출 약물 전달 시스템을 통해 투여된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 유리체내 주사를 통해 투여된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 피하 주사를 통해 투여된다.

본 발명의 한 특정 구체예에서, 항원 결합 단백질은 DMS4000, 또는 SEQ ID NO:69, 70, 71 또는 72의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열로 구성된 항원 결합 단백질이며, 이는 4-8주 간격으로 유리체내 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하는 약제 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방적 작용제에서, 항원 결합 단백질을 함유하는 수성 현탁액 또는 용액은 주사 사용 준비된 형태로 생리학적 pH로 완충될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 수성 담체에 용해된 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이의 칵테일의 용액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균으로 제조될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 포함하지 않는다. 이러한 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키는데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기 약제 제형 중의 본 발명의 항원 결합 단백질의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 보통 약 1 중량% 이하로부터 15 또는 20 중량% 만큼 매우 다양할 수 있고, 이는 유체 부피, 점성도, 선택된 특정 투여 방식에 주로 기초하여 선택될 것이다.

따라서, 근내 주사용의 본 발명의 약제 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 200 mg, 예를 들어, 약 50 ng 내지 약 30 mg 이상, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게는, 유리체내 주입용의 본 발명의 약제 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거(Ringer)액, 및 링거액 ml 당 약 1 내지 약 30 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 널리 공지되어 있거나, 이는 당업자에게 명백할 것이고, 이는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원 결합 단백질 제형의 제조를 위해, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되고, 독자가 특별이 인용할 수 있는 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today, page 129-137, Vol.3 (3^rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T. J., Manning M. C, New York, NY: Plenum Press (1992); Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K et al., "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922;Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91 , 2252-2264,(2002)]을 참조하라.

한 구체예에서, 약제학적 제조물 중에 존재하는 경우 본 발명의 치료제는 단위 투여 형태로 존재한다. 적절한 치료적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있고, 예를 들어, 적합한 용량은 0.00001 내지 20mg/kg, 예를 들어, 0.0001 내지 20mg/kg, 예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg, 예를 들어, 1 내지 20mg/kg 또는, 예를 들어, 1 내지 15mg/kg, 예를 들어, 10 내지 15mg/kg의 범위일 수 있다. 인간에서 본 발명의 조성물을 이용하여 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 적합한 용량은 0.0001 내지 1000 mg, 예를 들어, 0.001 내지 1000mg, 예를 들어, 0.01 내지 500mg, 예를 들어, 500mg, 예를 들어, 0.1 내지 100mg, 또는 0.1 내지 80mg, 또는 0.1 내지 60mg, 또는 0.1 내지 40mg, 또는, 예를 들어, 1 내지 100mg, 또는 1 내지 50mg의 본 발명의 항원 결합 단백질의 범위일 수 있으며, 이는 비경구, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내, 또는 국소 투여될 수 있다. 이러한 용량은 필요시 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복될 수 있다.

치료제가, 예를 들어, 유리체내 주사에 의해 안구로 직접 투여되는 경우, 투여량은 각각의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량이 2 mg을 초과하지 않도록 되어야 하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 2 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 1.8 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 1.6 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 1.4 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 1.2 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 약 1.0 mg이다. 한 구체예에서, 하나의 인간 안구로 투여되는 단백질의 전체량은 2.0 mg 미만, 1.8 mg 미만, 1.6 mg 미만, 1.4 mg 미만, 1.2 mg 미만, 또는 1.0 mg 미만이다.

본원에 기재된 항원 결합 단백질은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 에피토프 결합 도메인을 찾는데 사용될 수 있는 당 분야에 공지된 여러 방법이 있다.

용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 일원들로 구성되고, 이러한 일원 각각은 단일한 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는다. 이러한 점에서, "라이브러리"는 "레파토리"와 동의어이다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성의 원인이다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 간단한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 유리하게는, 핵산은 이러한 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 발현 벡터로 통합된다. 따라서, 한 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 각각의 유기체는 해당하는 폴리펩티드 일원을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태로 라이브러리의 단일한 일원을 함유하는 하나 이상의 카피의 발현 벡터를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 다양한 폴리펩티드의 큰 라이브러리를 엔코딩하는 잠재성을 갖는다.

"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 케이뱃에 의해 규정("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)된 바와 같은 서열 내에 보존된 항체의 영역에 해당하거나, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917]에 정의된 바와 같은 인간 점라인(germline) 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일한 항체 프레임워크 서열이다. 과가변 영역 단독에서의 변화에도 불구하고 사실상 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진 단일한 프레임워크 또는 이러한 프레임워크의 세트일 수 있다.

본원에 정의된 바와 같은 아미노산 및 누클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 알고리듬 BLAST 2 서열을 이용하여 제조되고 결정된다(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, (1999) 174: 187-188).

디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특성을 연결짓는 디스플레이 시스템)이, 예를 들어, dAb 또는 다른 에피토프 결합 도메인의 선택에서 본원에 기재된 방법에서 사용되는 경우, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것이 종종 유리하다. 이는 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용한 추가 선택 라운드를 위해, 또는 추가 레퍼토리(예를 들어, 친화성 성숙 레퍼토리)를 제조하기 위해 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 충분한 양을 수득하는데 효과적인 방식을 제공한다. 따라서, 일부 구체예에서, 에피토프 결합 도메인을 선택하는 방법은 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산, 예를 들어, 파아지 디스플레이에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 연결짓는 디스플레이 시스템)을 이용하는 것을 포함하고, 이는 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 핵산은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 파아지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭될 수 있다.

한 예에서, 상기 방법은 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결짓는 디스플레이 시스템을 이용한다. 이러한 디스플레이 시스템은 다수의 복제가능한 유전적 패키지, 예를 들어, 박테리오파아지 또는 세포(박테리아)를 포함할 수 있다. 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예를 들어, 박테리오파아지 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다. 박테리아파아지 디스플레이는 디스플레이 시스템의 예이다.

다수의 적합한 박테리오파아지 디스플레이 시스템(예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기재되어 있다(예를 들어, Griffiths et al., U.S. Patent No. 6,555,313 B1 (참조로서 본원에 포함됨); Johnson et al., U.S. Patent No. 5,733,743 (참조로서 본원에 포함됨); McCafferty et al., U.S. Patent No. 5,969,108 (참조로서 본원에 포함됨); Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892 (참조로서 본원에 포함됨); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. (1994) 12: 433-455; Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1994) 47(2-3): 175-189; Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen (2001) 4(2): 121-133 참조). 박테리오파아지 디스플레이 시스템에 제시된 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파아지, 예를 들어, 선형 파아지(예를 들어, fd, M13, F1), 용해 파아지(예를 들어, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파아지(예를 들어, MS2)에서 제시될 수 있다.

일반적으로, 적합한 파아지 코트 단백질(예를 들어, fd pⅢ 단백질)과의 융합 단백질로서 펩티드 또는 파아지폴리펩티드의 레퍼토리를 나타내는 파아지의 라이브러리가 생성되거나 제공된다. 융합 단백질은 파아지 코트 단백질의 첨단, 또는 요망시 내부 위치에서 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 제시된 펩티드 또는 폴리펩티드는 pⅢ의 도메인 1(pⅢ의 도메인 1은 N1으로도 언급됨)에 대해 아미노 말단인 위치에 존재할 수 있다. 제시된 폴리펩티드는 pⅢ에 직접 융합(예를 들어, pⅢ의 도메인 1의 N-말단)될 수 있거나, 링커를 이용하여 pⅢ에 융합될 수 있다. 요망시, 융합체는 tag(예를 들어, myc 에피토프, His tag)를 추가로 포함할 수 있다. 파아지 코트 단백질과의 융합 단백질로서 제시되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어, 제시된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 파아지 벡터 또는 파아지미드 벡터의 라이브러리를 적합한 숙주 박테리아로 도입시키고, 생성된 박테리아를 배양하여 파아지를 생성(예를 들어, 요망시 적합한 헬퍼(helper) 파아지 또는 상보성 플라스미드를 이용함)시킴으로써 생성될 수 있다. 파아지의 라이브러리는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 침전 및 원심분리를 이용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.

디스플레이 시스템은 임의의 요망되는 양의 다양성을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 유기체, 유기체의 그룹, 요망되는 조직 또는 요망되는 세포 유형에 의해 발현된 자연 발생 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 요망시, 폴리펩티드는 공통의 코어 또는 스캐폴드를 공유할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 모든 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G, 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin), CTLA4, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소, 셀룰라제(cellulase))로부터 선택된 스캐폴드, 또는 면역글로불린 상과, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항체 가변 도메인)으로부터의 폴리펩티드를 기초로 할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 규정된 영역, 및 통상적인 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리 내의 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 요망되는 유형, 예를 들어, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소) 또는 요망되는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 인간 V_H 또는 인간 V_L)의 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 각각의 폴리펩티드가 항체 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 레터포리를 포함한다. 예를 들어, 레퍼토리 내의 각각의 폴리펩티드는 VH, VL 또는 Fv(예를 들어, 단쇄 Fv)를 함유할 수 있다.

아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 스캐폴드의 임의의 요망되는 영역으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 돌연변이유발 방법(예를 들어, 저 정확도 PCR, 올리고누클레오티드-매개 또는 부위 특이적 돌연변이유발, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 다양화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로써 표적 영역, 예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 소수성 도메인의 상보성 결정 영역으로 도입될 수 있다. 요망시, 다양화되는 폴리펩티드의 영역은 무작위화될 수 있다. 레퍼토리를 구성하는 폴리펩티드의 크기는 주로 선택의 문제이고, 균일한 폴리펩티드 크기가 필요하지는 않다. 레퍼토리 내의 폴리펩티드는 4차 이상의 구조(즉, 하나 이상의 도메인을 형성함)를 가질 수 있다.

선택/분리/회수

에피토프 결합 도메인 또는 도메인의 집단이 임의의 적합한 방법을 이용하여 레퍼토리 또는 라이브러리(예를 들어, 디스플레이 시스템 중)로부터 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 예를 들어, 도메인은 선택가능한 특징(예를 들어, 물리적 특징, 화학적 특징, 기능적 특징)을 기초로 하여 선택되거나 분리된다. 적합한 선택가능한 기능적 특징은 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 포괄 리간드(예를 들어, 초항원)로의 결합, 표적 리간드(예를 들어, 항원, 에피토프, 기질)로의 결합, 항체로의 결합(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드에서 발현된 에피토프를 통함), 및 촉매 활성을 포함한다(예를 들어, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655 참조).

일부 구체예에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 모든 도메인이 공통의 선택가능한 특징을 공유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택되고/되거나 분리된다. 예를 들어, 도메인은 실질적으로 모든 도메인이 공통의 포괄 리간드에 결합하거나, 공통의 표적 리간드에 결합하거나, 공통의 항체에 결합하거나(또는 이에 의해 결합되거나), 공통의 촉매 활성을 갖는 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택될 수 있다. 이러한 유형의 선택은, 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성 성숙을 수행하는 경우 요망되는 생물학적 활성을 갖는 모(parental) 펩티드 또는 폴리펩티드에 기초하는 도메인의 레퍼토리를 제조하는데 특히 유용하다. 공통의 포괄 리간드로의 결합을 기초한 선택은 본래의 라이브러리 또는 레퍼토리의 성분인 모든 또는 실질적으로 모든 도메인을 함유하는 도메인의 집단 또는 수집물을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 항체와 같은 표적 리간드 또는 포괄 리간드에 결합하는 도메인은 적합한 친화성 매트릭스를 이용하거나 패닝(panning)함으로써 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 패닝은 적합한 용기(예를 들어, 튜브, 페트리 접시)에 리간드(예를 들어, 포괄 리간드, 표적 리간드)의 용액을 첨가하고, 상기 리간드가 용기의 벽에 침착되거나 코팅되도록 함으로써 달성될 수 있다. 과량의 리간드는 세척될 수 있고, 도메인이 용기에 첨가될 수 있고, 용기가 펩티드 또는 폴리펩티드가 고정된 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에서 유지된다. 결합되지 않은 도메인은 세척될 수 있고, 결합된 도메인은, 예를 들어, 스크래핑(scraping) 또는 pH를 낮추는 것과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 적합한 리간드 친화성 매트릭스는 일반적으로 리간드가 공유적 또는 비공유적으로 부착되는 고체 지지체 또는 비드(예를 들어, 아가로오스)를 함유한다. 친화성 매트릭스는 매트릭스 상의 리간드로의 도메인의 결합에 적합한 조건하에서 배치(batch) 과정, 컬럼 과정 또는 임의의 다른 적합한 과정을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 프로테아제와 인큐베이션된 레퍼토리)와 조합될 수 있다. 친화성 매트릭스에 결합하지 않는 도메인은 세척될 수 있고, 결합된 도메인은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 낮은 pH 완충제, 약한 변성제(예를 들어, 우레아), 또는 리간드로의 결합에 대해 경쟁하는 펩티드 또는 도메인을 이용한 용리를 이용하여 용리되고 회수될 수 있다. 한 예에서, 비오티닐화된 표적 리간드는 레퍼토리 중의 도메인이 표적 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에서 레퍼토리와 조합된다. 결합된 도메인은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘(예를 들어, 비드 상)을 이용하여 회수된다.

일부 구체예에서, 포괄 또는 표적 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 라이브러리 또는 레퍼토리의 펩티드 또는 폴리펩티드에 실질적으로 보존된 펩티드 또는 폴리펩티드의 구조적 특징부에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 포괄 리간드로서 특히 유용하다. 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리시키고/시키거나, 선택하고/하거나, 회수하기 위한 리간드로 사용하기에 적합한 항체 및 항원 결합 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 이는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

라이브러리/레퍼토리

에피토프 결합 도메인을 엔코딩하고/하거나 함유하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조되거나 수득될 수 있다. 라이브러리는 관심 도메인 또는 스캐폴드(예를 들어, 라이브러리로부터 선택된 도메인)를 기초로 하여 도메인을 엔코딩하도록 설계될 수 있거나, 본원에 기재된 방법을 이용하여 또 다른 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 도메인에 부화된 라이브러리가 적합한 폴리펩티드 디스플레이 시스템을 이용하여 제조될 수 있다.

요망되는 유형의 도메인의 레퍼토리를 엔코딩하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 유형의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인)를 엔코딩하는 핵산 서열이 수득될 수 있고, 각각이 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 핵산의 수집물이, 예를 들어, 오류 유발(error-prone) 중합효소 연쇄반응(PCR) 시스템을 이용하여 핵산을 증폭시키거나, 화학적 돌연변이유발(Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994))에 의하거나, 박테리아 변이자 균주(Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996))를 이용함으로써 제조될 수 있다.

다른 구체예에서, 헥산의 특정 영역이 다양화에 대해 표적화될 수 있다. 선택된 위치를 돌여변이화시키는 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, PCR을 사용하거나 사용하지 않으면서 매스매치된 올리고누클레오티드 또는 축퇴(degenerate) 올리고누클레오티드의 사용을 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 루프로 돌연변이를 표적화시킴으로써 합성 항체 라이브러리가 생성되었다. 무작위 또는 반-무작위 항체 H3 및 L3 영역이 점라인 면역글로불린 V 유전자 세그먼트에 부가되어 돌여변이되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 큰 라이브러리가 생성되었다(Hoogenboom and Winter (1992) 상기; Nissim et al. (1994) 상기; Griffiths et al. (1994) 상기; DeKruif et al. (1995) 상기). 상기 다양화는 다른 항원 결합 루프 중 일부 또는 전부를 포함하도록 확대된다(Crameri et al. Nature Med. (1996) 2: 100; Riechmann et al. Bio/Technology (1995) 13: 475; Morphosys, WO 97/08320, 상기). 다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역은, 예를 들어, "메가-프라이머(mega-primer)"로서 첫번째 PCR의 생성물을 이용하는 2-단계 PCR 방법에 의해 다양화에 대해 표적화될 수 있다(예를 들어, Landt, O. et al., Gene (1990) 96: 125-128 참조). 표적화된 다양성은 또한, 예를 들어, SOE PCR에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Horton, R. M. et al., Gene (1989) 77: 61-68 참조).

선택된 위치에서의 서열 다양성은 다수의 가능한 아미노산(예를 들어, 20개 모두 또는 이의 서브셋)이 상기 위치에 통합될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특정하는 코딩 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. IUPAC 명명법을 이용하여, 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 엔코딩하는 가장 유용한 코돈은 NNK이다. 필요한 다양성을 도입시키기 위해 NNK 코돈이 사용될 수 있다. 추가적인 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 발생시키는 NNN 코돈을 포함하는 동일 말단을 달성하는 다른 코돈이 또한 사용된다. 이러한 표적화된 방법은 표적 영역 내의 충분한 서열 공간이 조사되는 것을 가능케 할 수 있다.

일부 라이브러리는 면역글로불린 상과의 일원(예를 들어, 항체 또는 이의 일부)인 도메인을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 공지된 주요-쇄 형태를 갖는 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, Tomlinson et al., WO 99/20749 참조).

라이브러리는 적합한 플라스미드 또는 벡터에서 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 벡터는 발현 및/또는 복제를 위해 이종성 DNA를 세포로 도입시키는데 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드), 바이러스 또는 박테리오파아지 벡터, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터가 간단한 클로닝 및 돌연변이유발에 사용될 수 있거나, 라이브러리의 발현을 유도하기 위해 발현 벡터가 사용될 수 있다. 벡터 및 플라스미드는 보통 하나 이상의 클로닝 부위(예를 들어, 폴리링커), 복제 기점 및 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 발현 벡터는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 유도하는 요소, 예를 들어, 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결 신호, 신호 서열 등을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 요소는 폴리펩티드를 엔코딩하는 클로닝된 삽입물에 작동가능하게 연결되도록 하는 방식으로 배열될 수 있어, 상기 발현 벡터가 발현에 적합한 조건(예를 들어, 적합한 숙주 세포 내)하에서 유지되는 경우에 폴리펩티드가 발현되고 생성된다.

클로닝 및 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 함유한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제하는 것을 가능하게 하는 서열이며, 이는 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2 마이크론 플라스미드 기점이 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점(예를 들어, SV40, 아데노바이러스)이 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 대해 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 이들이 고수준의 DNA를 복제할 수 있도록 하는 포유동물 세포, 예를 들어, COS 세포에서 사용되지 않는 한 포유동물 발현 벡터에 대해서 필요하지는 않다.

클로닝 또는 발현 벡터는 선택 마커로도 언급되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 마커는 선택 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 엔코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배지에서 생존하지 않을 것이다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린, 보체 영양요구성 결핍, 또는 성장 배지에서 이용가능하지 않는 중요한 공급 영양소에 대한 내성을 부여하는 단백질을 엔코딩한다.

적합한 발현 벡터는 다수의 요소, 예를 들어, 복제 기점, 선택 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 요소, 예를 들어, 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종료자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 선도 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 조절 요소 및 신호 또는 선도 서열은 존재하는 경우 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.

요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 프로모터가 제공될 수 있다. 프로모터는 항시성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부를 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있어, 이는 핵산의 전사를 유도한다. 원핵생물(예를 들어, E. 콜리(E. coli)에 대해 β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵생물(예를 들어, 원숭이 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, EG-1a 프로모터) 숙주에 대한 다양한 적합한 프로모터가 이용가능하다.

또한, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 갖는 숙주 세포의 선택을 위한 선택 마커, 및 복제가능한 발현 벡터의 경우 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자는 공통의 선택 마커이고, 이는 원핵생물(예를 들어, β-락타마제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵생물 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 이용한 선택을 가능케 한다. 숙주의 영양요구 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2 , URA3 , HIS3)가 효모에서 선택 마커로 종종 사용된다. 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파아지 벡터, 및 숙주 세포의 유전체로 통합가능한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 또한 고려된다.

원핵생물(예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜리) 또는 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, pET 벡터(예를 들어, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen 및 다른 벡터), 파아지 벡터(예를 들어, pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T(단백질 A 융합 벡터, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1(Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1(Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3(Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)), pSVSPORT(GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos(Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) 등을 포함한다. 다양한 발현 숙주, 예를 들어, 원핵생물 세포(E. 콜리), 곤충 세포(드로소필라 슈니더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9), 효모(P. 메탄올리카(P. methanolica), P. 파스토리스(P. pastoris), S. 세레비지에(S. cerevisiae)) 및 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포)에서 사용하기에 적합한 발현 벡터가 이용가능하다.

벡터의 일부 예는 폴리펩티드 라이브러리 일원에 상응하는 누클레오티드 서열의 발현을 가능케 하는 발현 벡터이다. 따라서, 포괄 및/또는 표적 리간드를 이용한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 일원을 발현하는 단일 클론의 별개의 증식 및 발현에 의해 수행될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 특정 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파아지 디스플레이이다. 따라서, 파아지 또는 파아지미드 벡터가 사용될 수 있고, 예를 들어, 벡터는 E. 콜리 복제 기점(이중 가닥 복제) 및 또한 파아지 복제 기점(단일 가닥 DNA의 생성)을 갖는 파아지미드 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 조작 및 발현은 당 분야에 널리 공지되어 있다(Hoogenboom and Winter (1992) 상기; Nissim et al. (1994) 상기). 간단히, 벡터는 파아지미드에서 선택성을 부여하는 β-락타마제 유전자 및 적합한 선도 서열을 함유할 수 있는 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림, 다수의 클로닝 부위, 하나 이상의 펩티드 tag, 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파아지 단백질 pⅢ를 함유할 수 있다. 따라서, E. 콜리의 다양한 억제인자 및 비-억제인자 균주를 이용하고, 글루코오스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG) 또는 헬퍼 파아지, 예를 들어, VCS M13의 첨가를 이용하여, 벡터는 발현이 없는 플라스미드로 복제할 수 있고, 대량의 폴리펩티드 라이브러리 일원만을 생성하거나 파아지를 생성할 수 있으며, 이중 일부는 표면에 폴리펩티드-pⅢ 융합체의 하나 이상의 카피를 함유한다.

항체 가변 도메인은 표적 리간드 결합 부위 및/또는 포괄 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 포괄 리간드 결합 부위는 초항원, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 단백질 G에 대한 결합 부위이다. 가변 도메인은 임의의 요망되는 가변 도메인, 예를 들어, 인간 V_H(예를 들어, V_H1a, V_H1b, V_H2, V_H3, V_H4, V_H5, V_H6), 인간 Vλ(예를 들어, VλⅠ, VλⅡ, VλⅢ, VλⅣ, VλⅤ, VλⅥ 또는 Vκ1) 또는 인간 Vκ(예를 들어, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, Vκ6, Vκ7, Vκ8, Vκ9 또는 Vκ10)를 기초로 할 수 있다.

추가 부류의 기술은 인공 구획의 레퍼토리의 선택을 포함하고, 이는 유전자와 이러한 유전자 생성물의 연관을 가능케 한다. 예를 들어, 요망되는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산이 유중수(water-in-oil) 에멀젼에 의해 형성된 미소캡슐에서 선택될 수 있는 선택 시스템이 WO99/02671, WO00/40712 및 문헌[Tawfik & Griffiths Nature Biotechnol (1998) 16(7):652-6]에 기재되어 있다. 요망되는 활성을 갖는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전 요소가 미소캡슐에 구획화된 후, 전사되고/되거나 번역되어, 미소캡슐 내에 각각의 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)이 생성된다. 요망되는 활성을 갖는 유전자 생성물을 생성하는 유전 요소는 이후에 분류된다. 이러한 방법은 다양한 수단에 의해 요망되는 활성을 검출함으로써 관심 유전자 생성물을 선택한다.

에피토프 결합 도메인의 특징

도메인의 이의 특정 항원 또는 에피토프로의 결합은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 시험될 수 있고, 이는 ELISA를 포함한다. 한 예에서, 결합은 모노클로날 파아지 ELISA를 이용하여 시험된다.

파아지 ELISA는 임의의 적합한 절차에 따라 수행될 수 있고, 예시적 프로토콜이 하기 기재된다.

각 라운드의 선택에서 생성된 파아지의 집단은 "폴리클로날" 파아지 항체를 확인하기 위해 ELISA에 의한 선택된 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이후, "모노클로날" 파아지 항체를 확인하기 위해 상기 집단으로부터의 단일 감염 박테리아 콜로니로부터의 파아지가 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 또한 요망되고, 이는 또한 시약, 예를 들어, C-말단 N-말단 tag에 대한 시약을 이용하여 ELISA에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, Winter et al. Ann. Rev. Immunology (1994) 12: 433-55 참조, 이는 본원에 참조로서 언급됨).

선택된 파아지 모노클로날 항체의 다양성은 또한 PCR생성물의 겔 전기영동 및 프로빙(Marks et al. 1991, 상기; Nissim et al. 1994 상기), (Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776), 또는 벡터 DNA의 서열분석 또는 BSTNI와 같은 프리퀀트 커터(frequent cutter)를 이용한 제한 절단 분석에 의해 평가될 수 있다.

dAb 의 구조

dAb가, 예를 들어, 본원에 기재된 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이러한 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함하여, 이들은 본원에 기재된 바와 같은 특이적 포괄 리간드에 의해 인지될 수 있다. 유니버셜 프레임워크, 포괄 리간드 등의 사용은 WO99/20749에 기재되어 있다.

V-유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열 내 변이가 가변 도메인의 구조 루프 내에 위치될 수 있다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍의 상호작용을 향상시키기 위해 DNA 셔플링(DNA shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391] 및 미국 특허 제 6,297,053호에 교시되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 포함된다. 돌연변이유발의 다른 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다.

dAb 를 작제하는데 사용하기 위한 스캐폴드

i. 주요-사슬 형태의 선택

면역글로불린 상과의 일원은 모두 이의 폴리펩티드 사슬에 대해 유사한 폴드를 공유한다. 예를 들어, 항체는 이의 일차 서열과 관련하여 매우 다양하나, 서열 및 결정 구조의 비교는 예상과 반대로 항체의 6개의 항원 결합 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주요-사슬 형태, 또는 표준(canonical) 구조를 채택하는 것을 나타내었다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. (1987) 196: 901; Chothia et al. Nature (1989) 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 대부분의 인간 항체에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주요-사슬 형태의 예측을 가능하게 한다(Chothia et al. J. Mol. Biol. (1992) 227: 799; Tomlinson et al. EMBO J. (1995) 14: 4628; Williams et al. J. Mol. Biol. (1996) 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조와 관련하여 훨씬 더 다양하나(D 세그먼트의 사용으로 인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재 또는 잔기의 유형에 따라 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주요-사슬 형태를 형성한다(Martin et al. J. Mol. Biol. (1996) 263: 800; Shirai et al. FEBS Letters (1996) 399:1).

dAb는 유리하게는 도메인의 라이브러리, 예를 들어, V_H 도메인의 라이브러리 및/또는 V_L 도메인의 라이브러리로부터 어셈블리된다. 한 양태에서, 도메인의 라이브러리는 일원의 주요 사슬 형태가 공지되는 것이 보장되도록 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 선택되도록 설계된다. 유리하게는, 이들은 이들이 상기 논의된 바와 같이 비기능성이 될 가능성을 최소화시키기 위해 자연적으로 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태이다. 점라인 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T 세포 수용체 라이브러리를 작제하기 위한 하나의 적합한 기본 프레임워크로 제공되며, 다른 서열이 또한 유용하다. 변화가 낮은 빈도로 발생할 수 있어, 적은 수의 기능적 일원이 기능에 영향을 미치지 않는 변경된 주요 사슬 형태를 가질 수 있다.

표준 구조 이론은 또한 리간드에 의해 엔코딩되는 다양한 주요-사슬 형태의 수를 평가하고, 리간드 서열에 기초하여 주요-사슬 형태를 예측하고, 표준 구조에 영향을 미치지 않는 다양화를 위한 잔기를 선택하는데 유용하다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루프는 4개의 표준 구조 중 하나를 채택할 수 있고, L2 루프는 하나의 표준 구조를 갖고, 인간 Vκ 도메인의 90%가 L3 루프에 대한 4개 또는 5개의 표준 구조 중 하나를 채택하는 것이 공지되어 있으며(Tomlinson et al. (1995) 상기); 따라서, Vκ 도메인 단독에서, 다양한 표준 구조는 조합되어 다양한 여러 주요-사슬 형태를 발생시킬 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대해 다양한 표준 구조를 엔코딩하고, Vκ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대한 여러 표준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 V_H 도메인과 쌍을 이룰 수 있는 경우, 상기 5개의 루프에 대해 관찰된 표준 구조 조합의 수는 매우 크다. 이는 주요-사슬 형태에서의 다양성의 발생이 광범위한 결합 특이성의 생성에 중요할 수 있음을 의미한다. 그러나, 공지된 단일한 주요-사슬 형태에 기초하여 항체 라이브러리를 작제함으로써, 예상과는 반대로 주요-사슬 형태에서의 다양성이 실질적으로 모든 항원을 표적화하기에 충분한 다양성을 발생시키는데 필요하지 않는 것으로 밝혀졌다. 더욱 놀라운 것은, 단일 주요-사슬 형태가 컨센서스 구조일 필요가 없으며, 전체 라이브러리에 대한 기초로서 단일한 자연 발생 형태가 사용될 수 있다. 따라서, 한 특정 양태에서, dAb는 단일한 공지된 주요-사슬 형태를 갖는다.

선택된 단일 주요-사슬형태는 당해 면역글로불린 상과 유형의 분자에서 흔한 것일 수 있다. 유의한 수의 자연 발생 분자가 어떠한 형태를 채택하는 것으로 관찰되는 경우에 이러한 형태는 흔한 것이다. 따라서, 한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각각의 결합 루프에 대한 다양한 주요-사슬 형태의 자연 발생은 별개로 고려되고, 다양한 루프에 대한 주요-사슬 형태의 요망되는 조합을 갖는 자연 발생 가변 도메인이 선택된다. 어느 것도 이용가능하지 않은 경우, 가장 근접한 동등물이 선택될 수 있다. 다양한 루프에 대한 주요-사슬 형태의 요망되는 조합은, 요망되는 주요-사슬 형태를 엔코딩하는 점라인 유전자 세그먼트를 선택함으로써 생성될 수 있다. 한 예에서, 선택된 점라인 유전자 세그먼트는 자연에서 빈번히 발현되고, 특히 이들은 가장 빈번히 발현되는 모든 자연 점라인 유전자 세그먼트일 수 있다.

라이브러리 설계에서, 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 다양한 주요-사슬 형태의 발생은 별개로 고려될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해, 자연 발생 분자의 항원 결합 루프의 20% 내지 100%에 의해 채택되는 제공된 형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 관찰된 발생은 35% 이상(즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 이상 또는 65% 이상이다. 매우 대다수의 H3 루프는 표준 구조를 갖지 않으므로, 표준 구조를 나타내는 루프 중에서 흔한 주요-사슬 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 루프 각각에 대해, 자연 레퍼토리에서 가장 흔하게 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대해 가장 흔한 것은 다음과 같다: H1 - CS 1(발현된 레퍼토리의 79%), H2 - CS 3(46%), Vκ의 L1 - CS 2(39%), L2 - CS 1(100%), Vκ의 L3 - CS 1(36%)(계산은 70:30의 κ:λ 비로 추정함, Hood et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. (1967) 48: 133). 표준 구조를 갖는 H3 루프에 대해, 잔기 94로부터 잔기 101까지의 염-다리(salt-bridge)를 갖는 7개의 잔기의 CDR3 길이(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 흔한 것으로 보인다. EMBL 데이터 라이브러리에는 16개 이상의 인간 항체 서열이 존재하며, 항체 모델링을 위한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에는 상기 형태를 형성시키기 위해 필요한 H3 길이 및 중요 잔기 및 2개 이상의 결정 구조가 있다(2cgr 및 1tet). 상기 표준 구조의 조합에서 가장 빈번히 발현되는 점라인 유전자 세그먼트는 V_H 세그먼트 3-23(DP-47), J_H 세그먼트 JH4b, Vκ 세그먼트 O2/O12(DPK9) 및 Jκ 세그먼트 Jκ1이다. V_H 세그먼트 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 요망되는 단일 주요-사슬 형태를 갖는 라이브러리를 작제하기 위한 기초로서 상기 세그먼트가 조합되어 사용될 수 있다.

대안적으로, 분리에서 결합 루프 각각에 대해 다양한 주요-사슬 형태의 자연 발생을 기초로 하여 단일한 주요-사슬 형태를 선택하는 것 대신에, 주요-사슬 형태의 조합의 자연 발생이 단일한 주요-사슬 형태를 선택하기 위한 기초로 사용된다. 항체의 경우, 예를 들어, 임의의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 항원 결합 루프에 대한 표준 구조 조합의 자연 발생이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 자연 발생 항체에서 흔한 것일 수 있고, 자연 레퍼토리에서 가장 빈번히 관찰될 수 있다. 따라서, 인간 항체에서, 예를 들어, 5개의 항원 결합 루프 H1, H2, L1, L2 및 L3의 자연 조합이 고려되는 경우, 표준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정된 후, 단일한 주요-사슬 형태를 선택하기 위한 기초로서 H3 루프에 대해 가장 흔한 형태와 조합된다.

표준 서열의 다양화

여러 공지된 주요-사슬 형태 또는 단일한 공지된 주요-사슬 형태를 선택한 후, 구조 및/또는 기능 다양성을 갖는 레퍼토리를 발생시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 dAb가 작제될 수 있다. 이는 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 가져, 다양한 활성을 제공할 수 있는 변이체가 생성되는 것을 의미한다.

요망되는 다양성은 통상적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 다양화시킴으로써 발생된다. 변경되는 위치는 무작위적으로 선택될 수 있거나, 이들은 선별될 수 있다. 이후, 변화는 존재하는 아미노산이 자연 또는 합성의 임의의 아미노산 또는 이의 유사체로 대체되는 동안의 무작위화에 의해 매우 많은 수의 변이체를 생성시키거나, 존재하는 아미노산을 규정된 서브셋의 아미노산 중 하나 이상으로 대체하여 보다 제한된 수의 변이체를 생성시킴으로써 달성될 수 있다.

이러한 다양성을 도입시키는 다양한 방법이 보고되어 있다. 분자를 엔코딩하는 유전자로 무작위 돌연변이를 도입시키기 위해 오류-유발 PCR(Hawkins et al., J. Mol. Biol. (1992) 226: 889), 화학적 돌연변이유발(Deng et al., J. Biol. Chem. (1994) 269: 9533) 또는 박테리아 변이자 균주(Low et al., J. Mol. Biol. (1996) 260: 359)가 사용될 수 있다. 선택 위치를 돌연변이시키는 방법이 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 PCR을 사용하거나 사용하지 않는 미스매치된 올리고누클레오티드 또는 축퇴 올리고누클레오티드의 사용을 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 루프에 돌연변이를 표적화시킴으로써 여러 합성 항체 라이브러리가 생성되었다. 인간 파상풍 독소 결합 Fab의 H3 영역이 무작위화되어 다양한 새로운 결합 특이성이 생성되었다(Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역이 점라인 V 유전자 세그먼트에 추가되어, 돌연변이되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 큰 라이브러리가 생성되었다(Hoogenboom & Winter J. Mol. Biol. (1992) 227: 381; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 4457; Nissim et al., EMBO J. (1994) 13: 692; Griffiths et al. EMBO J. (1994) 13: 3245; De Kruif et al, J. Mol. Biol. (1995) 248: 97). 이러한 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 확장되었다(Crameri et al. Nature Med. (1996) 2: 100; Riechmann et al. Bio/Technology (1995) 13: 475; Morphosys, WO97/08320, 상기).

루프 무작위화는 H3 단독에 대해 대략 10¹⁵개 이상의 구조 및 다른 5개의 루프에 대해 유사하게 큰 수의 변이체를 발생시킬 잠재력을 가지므로, 현재의 형질전환 기술을 이용하거나, 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키는 세포 비함유 시스템을 이용하는 것은 실행가능하지 않다. 6 x 10¹²개를 초과하는 다양한 항체로 작제되는 가장 큰 라이브러리의 일부에 대해서도, 리보솜 디스플레이와 같은 기술을 이용하여 단지 잠재적 다양성의 단편만이 상기 설계의 라이브러리에 제시될 것이다(He and Taussig, Nucleic Acid Research 1997 25(24): 5132).

한 구체예에서, 분자의 요망되는 기능을 발생시키거나 변형시키는 것과 직접적으로 관련된 잔기만이 다양화된다. 많은 분자에 대해, 기능은 표적과 결부될 것이며, 이에 따라 분자의 전체 패킹에 중요한 잔기를 변경시키는 것을 피하거나 선택된 주요-사슬 형태를 유지시키면서, 다양성이 표적 결합 부위에 집중되어야 한다.

한 양태에서, 항원 결합 부위 내의 잔기만이 변경되는 dAb의 라이브러리가 사용된다. 이러한 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 매우 다양하고, 고-분해(high-resolution) 항체/항원 복합체와 접촉하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, L2에서, 자연 발생 항체에서 위치 50 및 53이 다양하고, 항원과 접촉하는 것이 관찰되는 것으로 공지되어 있다. 대조적으로, 케이뱃 등(Kabat et al. (1991, 상기))에 의해 정의된 바와 같은 상응하는 상보성 결정 영역(CDR1) 내의 모든 잔기를 다양화시키는데 통상적인 방법이 사용되며, 일부 7개의 잔기가 라이브러리에서 다양화된 2개와 비교된다. 이는 항원 결합 특이성의 범위를 생성시키는데 필요한 기능적 다양성과 관련하여 유의한 개선을 나타낸다.

사실상, 항체 다양성은 나이브 일차 레퍼토리를 발생시키기 위한 점라인 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 체세포 재조합(소위, 점라인 및 접합부위 다양성(junctional diversity)), 및 생성된 재배열된 V 유전자의 체세포 초돌연변이의 두개의 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석은 일차 레퍼토리에서의 다양성이 항체 결합 부위의 중심에 집중되는 반면, 체세포 초돌연변이는 일차 레퍼토리에서 고도로 보존되는 항원 결합 부위의 주변의 영역으로 다양성을 확산시키는 것을 나타내었다(Tomlinson et al., J. Mol. Biol. (1996) 256: 813 참조). 이러한 상보성은 아마 서열 공간을 찾기 위한 효과적인 전략으로서 진화되었으며, 이는 비록 항체에 대해 명백히 독특하나, 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 다양화된 잔기는 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 잔기의 서브셋이다. 표적 결합 부위 내의 다양한(중첩 포함) 서브셋의 잔기가 필요시 선택 동안 다양한 단계에서 다양화된다.

항체 레퍼토리의 경우, 최초의 '나이브' 레퍼토리가 생성되며, 여기서 항원 결합 부위 내의 잔기의 일부(전부가 아님)가 다양화된다. 이러한 상황에서 본원에서 사용되는 용어 "나이브" 또는 "더미(dummy)"는 소정의 표적을 갖지 않는 항체 분자를 의미한다. 이러한 분자는 면역계가 광범위한 항원성 자극에 의해 아직 공격되지 않은 태아 및 신생아 개체의 경우에서와 같이 면역 다양화를 겪지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되는 분자와 유사하다. 이후, 다양한 항원 또는 에피토프에 대해 상기 레퍼토리가 선택된다. 필요시, 이후에 최초 레퍼토리에서 다양화된 영역 외부에 추가 다양성이 도입될 수 있다. 이러한 성숙된 레퍼토리가 변형된 기능, 특이성 또는 친화성에 대해 선택될 수 있다.

본원에 기재된 서열이 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 서열과 90% 이상 동일, 예를 들어, 91% 이상, 또는 92% 이상, 또는 93% 이상, 또는 94% 이상, 또는 95% 이상, 또는 96% 이상, 또는 97% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것이 이해될 것이다.

핵산에 대해, 용어 "실질적으로 동일한"은 최적으로 정렬되고 비교되는 경우에 두개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 누클레오티드의 약 80% 이상, 보통 약 90% 내지 95%, 또는 누클레오티드의 약 98% 내지 99.5% 이상에서 적절한 누클레오티드 삽입 또는 결실을 갖으면서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 가닥의 상보체에 대해 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 하이브리드되는 경우에 실질적 동일성이 존재한다.

누클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고 비교되는 경우에 적절한 삽입 또는 결실을 갖는 두 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 대안적으로, 가닥의 상보체에 대해 DNA 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 하이브리드되는 경우에 실질적 동일성이 존재한다.

두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수 / 전체 위치 수 × 100)이다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 예로서 기재되는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.

두 누클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 두 누클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함되는 E. 마이어스(E. Meyers) 및 W. 밀러(W. Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램에 포함된 니들먼(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:14에 의해 엔코딩되는 참조 서열에 동일, 즉 100% 동일할 수 있거나, 이는 참조 서열과 비교하여 특정 정수의 아미노산 변경을 포함할 수 있어, 동일성 %가 100% 미만일 수 있다. 이러한 변경은 하나 이상의 아미노산 결실, 보존성 및 비보존성 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 위치, 또는 참조 서열 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 그룹 내의 아미노산 사이에 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 어느 곳에서도 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 수는 SEQ ID NO:14에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체수에 각각의 동일성 퍼센트의 수치적 퍼센트(100에 의해 나누어짐)를 곱한 후, SEQ ID NO:14에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체수로부터의 생성물을 공제함으로써 결정되거나, na≤xa - (xa·y)에 의해 결정되며, 이러한 식에서 na는 아미노산 변경의 수이고, xa는 SEQ ID NO:14에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체수이고, y는, 예를 들어, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 결과는 xa로부터 이를 공제하기 전에 정수에 가장 가깝게 소수점 이하가 제거된다.

실시예

실시예 1

1.1 이중 표적 항- TNF α/항- VEGF mAbdAb ( DMS4000 )의 생성

mAb(아달리무맙) 중쇄의 C-말단으로의 dAb의 융합에 의해 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb(DMS4000으로 명명됨)를 생성시켰다. 중쇄 발현 카세트의 작제를 위해, 대안적 mAbdAb의 중쇄를 엔코딩하는 벡터 DNA를 출발점으로 취하였다. 제한효소 SalⅠ 및 HindⅢ를 이용하여 dAb 부분을 절제하였다. DOM15-26-593, 항-VEGF dAb를 PCR(SalⅠ 및 HindⅢ 말단을 코딩하는 프라이머를 이용함)로 증폭시키고, 벡터 백본으로 라이게이션시키고, 이로부터 동일 제한 부위를 이용하여 dAb를 절제하여, mAb와 dAb 사이에 'STG'(세린, 트레오닌, 글리신)의 링커를 발생시켰다.

서열이 확인된 클론(경쇄 및 중쇄에 대해 각각 SEQ ID NO:11 및 13)을 선택하고, 대규모의 DNA 제조물을 제조하고, 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO:12 및 14)의 공동-트랜스펙션에 의해 일시적 트랜스펙션 기술을 이용하여 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb를 포유동물 HEK293-6E 세포(National Research Council Canada)에서 발현시켰다.

항-TNFα/항-VEGF mAbdAb 중쇄의 서열을 항 VEGF dAb에 대해 코돈 최적화된 서열을 갖고, FC 효과기 기능을 무력화(SEQ ID NO 46 및 47에서 무력화된 DMS4000 mAbdAb 중쇄 Fc)시키기 위해 L235A 및 G237A 돌연변이(Kabat 넘버링)가 포함되도록 추가로 변형시켰다.

1.2 이중 표적 항- TNF α/항- VEGF mAbdAb ( DMS4000 )의 정제 및 SEC 분석

확립된 프로토콜에 따라 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정화된 발현 상층액으로부터 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb(DMS4000으로 명명함)를 정제하였다. 정제된 샘플의 농도를 280nm에서의 흡광도 측정으로부터의 분광광도법으로 정제된 샘플의 농도를 결정하였다. 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석(도 1)은 ~170kDa에서 영동하는 감소되지 않은 샘플을 나타내는 반면, 감소된 샘플은 경쇄 및 dAb-융합 중쇄 각각에 해당하는 ~25 및 ~60kDa에서 영동하는 2개의 밴드를 나타낸다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 위해, 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb를 미리 평형화된 Superdex-200 10/30 HR 컬럼(Akta Express FPLC system에 부착됨)에 적용시키고, 0.5ml/분으로 PBS에서 영동시켰다. SEC 프로파일은 대칭 피크로서 영영동하는 단일 종을 나타낸다(도 2).

1.3 이중 표적 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb(DMS4000)의 결합 친화성

VEGF 수용체 결합 검정.

이러한 검정은 VEGF R2(VEGF 수용체)로의 VEGF₁₆₅의 결합, 및 이러한 상호작용을 차단하는 시험 분자의 능력을 측정한다. ELISA 플레이트를 VEGF 수용체(R&D Systems, Cat No: 357-KD-050)(0.2M 탄산 중탄산 나트륨(sodium carbonate bicarbonate) pH9.4 중의 0.5μg/ml 최종 농도)로 밤새 코팅하고, 세척하고, PBS 중의 2% BSA로 블로킹시켰다. VEGF(R&D Systems, Cat No: 293-VE-050) 및 시험 분자(0.05% Tween 20™ PBS 중의 0.1%BSA 중에 희석됨)를 플레이트로의 첨가(3ng/ml VEGF 최종 농도) 전에 1시간 동안 예비 인큐베이션하였다. VEGF 수용체로의 VEGF의 결합을 비오티닐화된 항-VEGF 항체(0.5μg/ml 최종 농도)(R&D Systems, Cat No: BAF293) 및 항-비오틴 이차 항체(1:5000 희석)(Stratech, Cat No: 200-032-096)에 컨쥬게이션된 과산화효소를 이용하여 검출하고, 동등한 부피의 1M HCl을 이용하여 반응을 중지시킨 후 비색 기질(Sure Blue TMB 과산화효소 기질, KPL)을 이용하여 OD450에서 시각화시켰다.

MRC -5/ TNFα 검정

인간 TNFR1로의 인간 TNFα 결합을 방지하고, IL-8 분비를 중화시키는 시험 분자의 능력을 인간 폐 섬유모세포 MRC-5 세포를 이용하여 결정하였다. 시험 샘플의 희석 연속물을 1시간 동안 TNFα(500pg/ml)(Peprotech)와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 이를 MRC-5 세포(ATCC, Cat.# CCL-171)(5x10³ 세포/웰)의 현탁액으로 1/2로 희석시켰다. 밤새 인큐베이션한 후, 샘플을 1/10로 희석시키고, IL-8 ABI 8200 세포 검출 검정(FMAT)을 이용하여 IL-8 방출을 결정하였고, 여기서 IL-8 농도를 항-IL-8(R&D systems, Cat# 208-IL) 코팅된 폴리스티렌 비드, 비오티닐화된 항-IL-8(R&D systems, Cat# BAF208) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Alexafluor 647)(Molecular Probes, Cat#S32357)을 이용하여 결정하였다. 검정 판독은 647nm에서의 국소화된 형광 방출이었고, 공지되지 않은 IL-8 농도를 상기 검정에 포함된 IL-8 표준 곡선을 이용하여 보간(interpolate)하였다.

VEGF 및 TNFα로의 결합 친화성을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 검정 데이터를 GraphPad Prism을 이용하여 분석하였다. S자형 용량 반응 곡선을 이용하여 역가 값을 결정하고, 최적 적합 모델을 이용하여 데이터를 적합화시켰다. 상기 mAbdAb의 항-VEGF 역가(도 3)는 57pM인 것으로 계산된 반면, 대조군인 항-VEGF mAb는 366pM의 EC50 값을 발생시켰다. 항-TNFα 생물학적 검정(도 4)에서, 역가는 10pM인 반면, 항-TNFα 대조군 mAb는 22pM의 EC50을 발생시켰다. 결론적으로, 검정 데이터는 이러한 이중 표적 mAbdAb가 둘 모두의 항원(TNFα 및 VEGF)에 대해 효능이 있는 것을 나타낸다.

1.4 이중 표적 항- TNF α/항- VEGF mAbdAb ( DMS4000 )의 래트 PK

이러한 분자를 래트에서 이의 생체내 약동학 특성에 대해 시험하였다. 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb를 3마리의 래트에 정맥내 투여하고, 10일(240시간)의 기간에 걸쳐 혈청 샘플을 수집하였다. 투여 후 다양한 시점에서 잔류하는 약물의 농도를 TNFα & VEGF 둘 모두에 대한 ELISA에 의해 평가하였다. 결과는 도 5에 제시된다.

PK 파라미터는 상기 분자가 항-TNFα mAb의 생체내 약동학 특성에 필적하는 생체내 약동학 특성을 갖는 것을 입증한다. VEGF 성분에 대해 관찰된 보다 짧은 t_1/2β는 유의한 것으로 간주되지 않으며, 이는 검정 인공물일 수 있다. 추가 세부사항은 표 3에 제시되어 있다.

표 3

1.5 대안적 항- TNF α/항- VEGF mAbdAb ( DMS4031 )의 생성

대안적 항-TNFα/항-VEGF mAbdAb(DMS4031로 명명함)를 STG 링커를 이용하여 중쇄의 C-말단 상의 VEGF dAb에 연결된 동일 항-TNFα mAb(아달리무맙)를 이용하여 상기 실시예 1.1에 기재된 것과 유사한 방식으로 작제하였다. 이러한 경우에 사용된 항-VEGF dAb는 D0M15-10-11이었다. 이러한 분자를 경쇄 및 중쇄(SEQ ID NO:12 및 16)의 공동 트랜스펙션에 의해 일시적 트랜스펙션 기술을 이용하여 포유동물 HEK293-6E 세포(National Research Council Canada)에서 발현시켰다. 이러한 분자를 실시예 1.2에 기재된 것과 유사한 발현 수준의 mAbdAb를 발생시키도록 발현시켰으나, 실시예 1.3에 기재된 바와 같은 동일 VEGF 검정에서 역가에 대해 시험하는 경우, 이러한 검정에서 VEGF 수용체로의 VEGF 결합의 검출되지 않는 수준의 억제를 갖는 것이 확인되었다.

실시예 2

이중 표적 항- TNF α/항- VEGF mAbdAb 의 Biacore 분석

시험 mAbdAb를 BIAcore 분석에 적용시켜 해당 항원으로의 결합에 대해 동역학적 결합 및 해리 상수를 결정하였다. 분석을 BIAcore™ 3000 기계에서 수행하였다. 기계의 온도를 25℃로 설정하였다. HBS-EP 완충액을 영동 완충액으로 사용하였다. 기계에 대해 가장 높은 가능한 속도에서 실험 데이터를 수집하였다. 연구 등급 CM5 칩 상의 하나의 플로우 셀(flow cell)을 제조업체의 설명서에 따라 표준 아민 커플링 화학을 이용하여 단백질 A로 코팅하고, 두번째 플로우 셀을 동등하게 처리하였으나, 참조 표면을 발생시키기 위해 단백질 A 대신 완충액을 사용하였다. 이후, 단백질 A로 코팅된 플로우 셀을 mAbdAb를 포획하기 위해 사용하였다. 항원을 표 2에 상술된 바와 같은 일련의 2x 연속 희석물로 주입하였다. 여러 희석물을 이중으로 영동시켰다. 백그라운드 공제를 위해 리간드 대신 완충제 단독 주입을 이용하였다. 샘플을 기계 소프트웨어 고유의 동역학 Wizard를 이용하여 무작위 순서로 주입하였다. 10mM 글리신, pH 1.5를 주입하여 각 주기의 말단에서 표면을 재생시켰다. 둘 모두의 데이터 처리 및 동역학 적합화(fitting)를 BIAevaluation 소프트웨어 4.1을 이용하여 수행하였다. 이중 결과(동일 작업으로부터의 결과)의 평균을 나타내는 데이터가 표 4에 제시된다. DMS4031에 대해 제시된 다수의 값은 별개의 기간에서의 두개의 실험 작업을 나타낸다. 787nM의 값은 분석되는 리간드의 농도로 인해 필경 친화성이 과대평가된 것이다.

표 4

실시예 3

항원 결합 단백질의 화학량론적 평가( Biacore ™을 이용함)

본 실시예는 예측 실시예이다. 이는 본 발명의 항원 결합 단백질이 시험될 수 있는 추가 검정을 수행하기 위한 지침을 제공한다.

항-인간 IgG가 일차 아민 커플링에 의해 CM5 바이오센서 칩에 고정된다. 항원 결합 단백질이 상기 표면에 포획된 후, 단일 농도의 TNFα 또는 VEGF가 상기 표면 상을 통과하며, 상기 농도는 결합 표면을 포화시키기에 충분하고, 관찰된 결합 신호는 완전한 R-max에 도달한다. 이후, 하기 제공된 식을 이용하여 화학량론이 계산된다:

Stoich=Rmax*Mw(리간드)/Mw(분석물)*R(고정되거나 포획된 리간드)

화학량론이 동시에 하나 이상의 분석물 결합에 대해 계산되는 경우, 다양한 항원이 포화 항원 농도로 연속적으로 통과되고, 상기와 같이 화학량론이 계산된다. 상기 작업은 HBS-EP 영동 완충액을 이용하여 25℃에서 Biacore 3000에서 수행될 수 있다.

실시예 4

GS 링커를 통해 항- VEGFR2 애드넥틴(adnectin)에 융합된 CTLA4 - Ig ( BPC1821 )의 설계 및 작제

CTLA4-Ig를 엔코딩하는 코돈 최적화된 DNA 서열(N-말단에 HindⅢ 부위 및 C-말단에 BamHⅠ 부위를 클로닝을 촉진시키기 위해 포함시킴)을 작제하고, CT01 애드넥틴을 함유하는 포유동물 발현 벡터(변형된 다수의 클로닝 부위(MCS)를 갖는 National Research Council Canada로부터의 pTT 발현 벡터)에 클로닝시켰다. 이는 애드넥틴이 GS 링커를 통해 CTLA4-Ig의 C-말단에 융합되도록 한다. 생성된 항원 결합 단백질을 BPC1821로 명명하였다. BPC1821의 DNA 및 단백질 서열이 각각 SEQ ID NO:26 및 27에 제시된다.

BPC1821을 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293fectin(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 293-6E 세포(National Research Council Canada)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에 트립톤 공급물을 세포 배양물에 첨가하고, 96시간 후에 상층액을 수거하였다. BPC1821을 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하고, 결합 검정으로 시험하였다.

실시예 5

VEGFR2 및 B7-1 결합 ELISA( BPC1821 )

96-웰 고 결합 플레이트를 0.4μg/ml의 PBS 중 재조합 인간 VEGFR2 Fc 키메라(R&D Systems, 357-KD-050)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 0.05%의 Tween-20과 함께 Tris-완충 염수로 2회 세척하였다. 200μL의 블로킹 용액(DPBS 완충액 중의 5% BSA)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 이후, 또 다른 세척 단계를 수행하였다. BPC1821 및 두개의 음성 대조 항체(Sigma I5154 및 이특이적 IGF1R-VEGFR2 항원 결합 작제물 BPC1801 - 중쇄 SEQ ID NO:163 및 경쇄 SEQ ID NO:164)를 블로킹 용액 중에서 플레이트 전체에 걸쳐 연속적으로 희석시켰다. 1시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하였다. 재조합 인간 B7-1 Fc 키메라(RnD Systems, 140-B1-100)를 GE Healthcare로부터의 ECL 비오티닐화 모듈을 이용하여 비오티닐화시켰다. 라벨링을 키트 권장 수준의 1/4로 수행하였다. 비오티닐화된 B7-1을 블로킹 용액 중에서 1 μg/mL로 희석시키고, 50 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세척하였다. ExtrAvidin 과산화효소(Sigma, E2886)를 블로킹 용액 중에 1/1000로 희석시키고, 50 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 또 다른 세척 단계 후, 50 μl의 OPD SigmaFast 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 25 μl의 3M 황산을 첨가하여 15분 후에 반응을 중지시켰다. 흡광도를 기본 종점 프로토콜을 이용하여 VersaMax Tunable Microplate Reader(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 판독하였다.

도 6은 ELISA의 결과를 도시하며, 이는 이특이적 BPC1821이 VEGFR2 및 B7-1 둘 모두로의 결합을 나타내는 것을 입증한다. 음성 대조 항체는 VEGFR2 및 B7-1 둘 모두로의 결합을 나타내지 않는다. 대조군 농도를 2 μg/ml의 시작 농도로부터 희석시켰다.

실시예 6

GS 링커를 통해 항- VEGF dAb 에 융합된 CTLA4 - Ig ( BPC1825 )의 설계 및 작제

항-VEGFR2 애드넥틴에 융합된 CTLA4-Ig를 함유하는 DNA 플라스미드를 이특이적 CTLA4-Ig-항-VEGF dAb를 작제하기 위한 기본 플라스미드로 사용하였다. 애드넥틴 서열을 제거하기 위해 기본 플라스미드를 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 절단시켜 벡터를 제조하였다. 항-VEGF dAb를 엔코딩하는 DNA 서열을 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 제한 절단시키고, 벡터로 라이게이션시켰다. 생성된 이특이적 CTLA4-Ig-항-VEGF dAb를 BPC1825로 명명하였고, 여기서 dAb는 GS 링커를 통해 CTLA4-Ig의 C-말단에 융합되었다. BPC1825의 DNA 및 단백질 서열은 각각 SEQ ID NO:28 및 29에 제공된다.

BPC1825를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 293fectin(Invitrogen, 12347019)을 이용하여 HEK 293-6E 세포(National Research Council Canada)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에 트립톤 공급물을 각각의 세포 배양물에 첨가하고, 96시간 후에 상층액을 수거하였다. 상층액을 결합 검정에서 시험 품목으로 사용하였다.

실시예 7

VEGF 및 B7-1 결합 ELISA( BPC1825 )

96-웰 고 결합 플레이트를 0.4μg/ml의 PBS 중 인간 VEGF165(사내 재료)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 0.05%의 Tween-20과 함께 Tris-완충 염수로 2회 세척하였다. 200μL의 블로킹 용액(DPBS완충액 중 5% BSA)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 이후, 또 다른 세척 단계를 수행하였다. BPC1825 및 두개의 음성 대조 항체(Sigma I5154 및 BPC1824 - CTLA4-Ig-항-IL-13 dAb 융합체 - SEQ ID NO:165)를 블로킹 용액 중에서 플레이트 전체에 걸쳐 연속적으로 희석시켰다. 1시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하였다. 재조합 인간 B7-1 Fc 키메라(RnD Systems, 140-B1-100)를 GE Healthcare로부터의 ECL 비오티닐화 모듈을 이용하여 비오티닐화시켰다. 키트 권장 수준의 1/4로 라벨링을 수행하였다. 비오티닐화된 B7-1을 블로킹 용액 중에서 1 μg/mL로 희석시키고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하였다. ExtrAvidin 과산화효소(Sigma, E2886)를 블로킹 용액 중에서 1/1000로 희석시키고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 또 다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD SigmaFast 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 25μL의 3M 황산의 첨가에 의해 15분 후에 반응을 중지시켰다. 흡광도를 기본 종점 프로토콜을 이용하여 VersaMax Tunable Microplate Reader(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 판독하였다.

도 7은 ELISA의 결과를 도시하고, 이는 이특이적 BPC1825가 VEGF 및 B7-1 둘 모두로의 결합을 나타내는 것을 입증한다. 음성 대조 항체는 VEGF 및 B7-1 둘 모두로의 결합을 나타내지 않는다. Sigma I5154 IgG의 농도를 2 μg/ml의 시작 농도로부터 희석시켰다.

실시예 8

STG 또는 TVAAPPSTG 링커를 통해 VEGF dAb 에 융합된 TNFg 수용체 Fc 융합체 의 설계 및 작제

인간 TNFα 수용체 Fc 융합체(에타너셉트(etanercept))를 엔코딩하는 코돈 최적화된 DNA 서열을 작제하고, DMS4000 작제물로부터의 DOM15-26-593 항 VEGF dAb와 함께 포유동물 발현 벡터(pTT5)에 클론시켰다.

수용체 Fc는 N-말단 Campath1 신호 펩티드를 제공하기 위해 추가 서열이 측면에 존재하였고, 이는 dAb로의 융합을 위해 C-말단에 STG 링커 또는 TVAAPSTVAAPSTVAAPSTVAAPSTG 링커를 제공한다. 측면에 존재하는 서열은 dAb와 함께 벡터로의 클로닝을 촉진시키기 위해 AgeⅠ 제한 부위 및 SalⅠ 제한 부위를 포함하였다. 생성된 항원 결합 단백질을 각각 EtanSTG593 및 EtanTV4593으로 명명하였다. EtanSTG593의 DNA 및 단백질 서열은 각각 SEQ ID No:48 및 49에 제공되고, EtanTV4593의 DNA 및 단백질 서열은 각각 SEQ ID No:50 및 51에 제공된다.

실시예 9

EtanSTG593 및 EtanTV4593 정제 및 VEGF 및 TNF α 결합 분석

EtanSTG593 및 EtanTV4593 플라스미드를 트랜스펙션을 위해 293Fectin(Invitrogen)을 이용하여 HEK 293-6E 세포(National Research Council Canada)에서 독립적으로 발현시켰다. EtanSTG593 및 EtanTV4593을 5일 후에 수거하고, MAb Select Sure(GE Healthcare) 친화성 크로마토그래피로 정제하여, 배치(batch) 샘플 M4004 및 M4005를 각각 생성시켰다. 단백질을 F1 완충액(0.1 M 시트레이트 pH6, 10% PEG300, 5% 수크로오스) 또는 ET 완충액(10mM Tris pH7.4, 4% D-만니톨, 1% 수크로오스)에서 제형화시켰다. 단백질을 HiLoad Superdex S200 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 추가로 정제하여 응집 수준을 감소시켰다.

결합 분석을 ProteOn XPR36 기계(BioRad TM)에서 수행하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 GLM 칩에 고정시켰다. 시험되는 작제물을 상기 단백질 A 표면에서 포획시켰다. 분석물 TNFα 및 VEGF를 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM 및 1 nM로 사용하였다. 0 nM(즉, 완충액 단독)TNFα 및 VEGF를 참조 결합 곡선을 배가시키기 위해 사용하였다.

ProteOn의 신규한 6×6(six by six) 플로우셀 설정은 동시에 6개 이하의 작제물이 포획되는 것을 가능케 하고, 또한 분석물의 6개의 농도가 포획된 항체(들) 상에서 유동되는 것을 가능케 하여, 주기당 모두 36개의 상호작용을 발생시키는 것을 가능케 한다.

단백질 A 표면을 재생시키기 위해, 50 mM NaOH를 사용하였고, 이는 포획된 작제물(들)을 제거하며, 또 다른 포획 및 결합 주기가 시작하는 것을 가능케 한다. 수득된 데이터를 ProteOn 분석 소프트웨어 고유의 1:1 모델로 적합화시켰다. 영동을 영동 완충액으로서 HBS-EP를 이용하여, 25℃의 온도에서 수행하였다.

표 5: VEGF 결합 결과

표 6: TNF α 결합 결과

실시예 10 - 예측 실시예

10.1 이중 표적 항원 결합 단백질의 생성

이중 표적 항원 결합 작제물은 두개의 이전에 확인된 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 단편 또는 전체 모노클로날 항체 사이에 물리적 연결부를 도입시킴으로써 고안될 수 있다. 물리적 연결부는 두개의 모이어티 사이에서 유전 링커 서열을 엔코딩시킴으로써 도입될 수 있다. 길이 및 아미노산 조성과 관련하여 링커의 특성은 이특이적 작용제에서 모이어티 중 하나 또는 둘 모두의 특성에 대해 관련성을 가질 수 있다. 이특이성을 발생시키기 위해 다수의 항체 또는 항체 단편을 갖는 경우에, 선도(lead)의 최적 조합을 확인하기 위해 경험적 방법이 채택될 수 있다.

규정된 표적에 대한 mAb, FAb, ScFv, dAb 등과 같은 개별적 결합 모이어티가 역가, 효능 및 생물물리적 거동의 공지된 특성을 갖는 작용제를 전달하기 위한 문헌에 잘 기록된 다양한 생체내(예를 들어, Harlow, E and Lane, D (1998) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 시험관내(예를 들어, Barbas III, CF et al (2001) Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 기술을 이용하여 독립적으로 확인되고, 밝혀질 수 있다. 이러한 개별적 작용제로부터, 상기 개별적 작용제를 발생시키는데 필요한 분자 유전공학의 복잡성의 정도에 의해서만 제한되는 많은 상이한 이특이성 기회가 발생한다. 요망되는 분자 구조는 치료되는 질환의 특정에 의해 보통 결정된다. 예를 들어, 만성 투여를 위해, 본질적으로 긴 생체내 반감기로 전달되는 분자 포맷이 선호된다. 이는 구제 재생 경로(salvage recycling pathway)에 의해 긴 말단 반감기로 전달되는 IgG 항체의 Fc 영역의 포함에 의해 가장 용이하게 달성될 수 있다. 따라서, mAb 또는 다른 Fc-기반 이특이성 항체가 빈번히 사용되는 포맷이다.

mAb-기반 이중 표적 분자를 개발하기 위해, 하나의 잠재적인 방법은 항체 단편을 완전한 IgG에 붙이는 것이다. 분자 수준에서, 이는 mAb 사슬의 말단 중 하나에 제한 부위를 도입시키고, 항체 단편을 삽입하여, mAb 사슬이 추가적인 기능성 유닛으로 연장됨으로써 달성될 수 있다. 기능성 유닛 사이의 링커의 특성은 이특이성의 전체 특성을 최적화시키기 위해 다양화되는 것이 필요할 수 있다. 동일한 표적을 다루는 광범위한 상이한 항체 단편이 이용가능한 경우, 이들은 상기 방법을 이용하여 서로 직접적으로 비교될 수 있다. 상기 특성의 이특이성은 일반적으로 일시적으로 포유동물 세포, 통상적으로 HEK293 세포에서 발현될 것이나, 안정적인 세포주 및 대규모 제조를 위해서는 CHO 세포에서 발현될 것이다. TNF/VEGF 이특이성에 대해, 항-TNFα mAb는 상기 방식으로 항체 단편과 같은 VEGF 결합 단백질에 연결될 수 있거나, 대안적으로 항-VEGF mAb는 항-TNFα 결합 단백질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 방식으로 이용될 수 있는 TNFα 및 VEGF 길항제가 표 1 및 2에 각각 나열되어 있다. 이러한 실시에서, 모든 가능한 시약이 이용가능한 경우, 모든 잠재적인 조합이 시험될 것이다.

비 mAb-기반 이특이성은 유전 융합체로서 함께 일반적으로 유사한 방식으로 항원에 결합하는 두개의 항체 단편 또는 다른 단백질을 연결시킴으로써 이루어질 수 있다. 2개 유닛의 접합은 보통 경험적으로 결정될 수 있는 길이 및 서열 조성의 링커에 의해 이루어진다. 이러한 분자는 이의 모듈화된 단쇄 특성으로 인해 자유로운 분자 공학처리를 가능케 하고, 포유동물 세포가 아닌 시스템에서의 발현 가능성을 제공한다.

도 8은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 가능한 이중 표적 작제물의 매트릭스를 도시한다. 도 8에 제시된 다수의 가능한 이중 표적 작제물의 서열은 SEQ ID NO:73-140에 제공된다. 이러한 특이적 이중 표적 분자에서, 링커가 'ASTKGPS'(SEQ ID NO:6)인 DVD-Igs 내의 중쇄, N-말단 ScFvs(SEQ ID NO:116-118)를 갖는 DVD-Fabs 융합체, 및 N-말단 VH dAbs(SEQ ID NO:133, 134)를 갖는 융합체를 제외하고는, 구성요소 부분들을 연결시키는데 'TVAAPS' 링커(SED ID NO:4)가 사용된다. SEQ ID NO:73-140은 단지 예시이며, 당업자는 다른 링커 및 작제물이 가능한 것을 실감할 것이다.

표 7: 도 8에서 사용되는 약어

10.2 요망되는 특징에 대한 이중 표적 항원 결합 단백질의 시험

역가 /친화성: 추가 개발에 적합한 이특이적 분자의 기초 특성은 항원에 대한 동역학적 결합 친화성(보통, 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 형태, 예를 들어, BIAcore에 의해 결정됨)이며, 이는 차례로 항원 농도 및 이용가능성의 이전의 지식을 기초로 하여 치료량이 제공된 후에 최소의 약리학적으로 효과적인 농도를 예측하는데 사용될 것이다. 친화성은 또한 특정 약리학적 효과를 매개하는 화합물의 농도를 결정하는 시험관내 검정에 의해 보통 평가되는 특성인 중화 역가와 관련되는 것으로 예측될 수 있다. 이는 수용체/리간드 결합 사건의 억제 또는 다운스트림 반응 경로의 자극/억제일 수 있다. 예를 들어, TNF 길항제의 역가는 이러한 TNF 길항제가 TNF에 의해 조절되는 다른 사이토카인의 생성을 방지하는 정도에 의해 평가될 수 있다. 이의 공통의 형태는 TNF에 반응한 MRC-5 세포로부터의 IL8 분비의 감소일 것이다. VEGF 길항제에 대해, 수용체 인산화가 감소되는 정도는 항-VEGF 작용제의 억제 효능의 직접적인 결과인 반면, HUVEC 세포 증식의 감소는 상기 효과와 생물학적으로 상관 관계가 있다. 동역학 친화성과 마찬가지로, 이특이성은 둘 모두의 항원에 대한 표적 효능을 입증하는데 필요할 것이다.

생물물리학: 통상적인 mAb는 우수한 발현, 생물물리학적 및 약동학적 프로파일을 갖는 것으로 공지되어 있으므로, 임의의 개발가능한 이특이적 분자는 유사한 특징을 입증하는 것이 필요하다. 발현 수준은 일시적 및 안정적 세포 배양 동안 결정될 것이고, 통상적인 치료 항체와 동일한 정상 범위인 것이 요구될 것이다. 이특이성은 mAb와 유사한 정제 과정(예를 들어, 단백질-A 포획), 및 임상 등급 물질의 생성에 요구되는 다른 다운스트림 과정(DSP)에 순응될 필요가 있을 것이다. 정제된 단백질은 선명한 대칭 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일, 생체적합성 완충액 중의 높은(>25mg/ml) 단백질 농도에서의 안정성, 및 다양한 스트레스 조건(온도, pH, 동결-해동, 탈아미드화 조건 등)에 대한 내성을 입증하는 것이 필요할 것이다.

약동학(PK)/약역학(PD): 이특이적 항원 결합 단백질의 약동학 프로파일은 표적의 특성 및 질병 환경과 일치하는 것이 필요하다. 대부분의 경우, 항체는 이의 긴 혈청 반감기에 의해 확실히 구별되고, 이는 보통 요망되는 프로파일이다. 설치류 및 영장류 종 둘 모두에서 보통 평가되는 PK 및 이특이성의 말단 반감기(t₁ _/2β)는 동일 표적에 대한 항체 작용제의 것에 필적해야 한다(이특이성은 기본적으로 상이한 속도로 대사되는 두개의 활성의 사건에서 보다 신속히 청소되는 종을 반영하는 것으로 추정함). 이특이적 분자에 대한 PK 검정은 이상적으로는 단일 검정(가교 검정(bridging assay))에서 두 활성을 측정함으로써, 순환의 잔여 약물이 온전하고, 완전히 이기능성(예를 들어, TNF가 플레이트에 고정되고, 약물을 함유하는 샘플이 플레이트에 첨가되고, 존재하는 이특이성의 양이, 예를 들어, 항-비오틴 작용제에 의해 자체가 검출되는 비오티닐화된 VEGF의 첨가에 의해 검정됨)이라는 확신을 제공한다. 이특이성 화합물에 대한 다른 생체내 분석은 질병 모델이 존재하고, 이특이성과 숙주 종의 교차-반응성이 널리 이해되어 있는 조건하에서 상기 질병 모델을 시험하는 것을 포함할 것이다. TNF/VEGF 이특이성에 대해, 이는 염증 질환을 포함할 수 있고, 여기서 상기 염증은 증가된 혈관 누출 또는 혈관 증식 질환에 의해 악화되고, 국소 환경에서의 대식세포의 활성화는 질병 상태를 악화시킨다. 영장류에서, 이러한 모델은 또한 약물 등의 순환에서 일정 역할을 할 수 있는 활성의 특정 약역학 마커의 유도를 가능케 할 수 있다.

안전성: 이특이성 포맷의 상대적 신규성(구성요소 부분 및 표적이 선례가 있는 경우에도)은 안전성 및 내약성의 문제를 발생시킨다. 임의의 생물학적 약물과 마찬가지로, 이특이적 분자 포맷과 관련된 임의의 가상적 우려에 대한 증가된 역설과 함께 충분한 범위의 독물학 시험이 필요할 것이다. 이는 추가적인 예기치 않은 약물학 또는 증가된 면역원성에 대한 잠재성을 포함할 것이다. 후자의 가능성은 분자의 상기 양태에 대한 위험 프로파일을 작제하는데 사용될 수 있는 T-세포 에피토프를 찾기 위한 컴퓨터 모의 실험(in silico) 도구를 이용하여 처리될 수 있다.

비 mAb-기반 이특이적 포맷(예를 들어, 두개의 항체 또는 항체-유사 단편의 직접적인 융합)은 친화성, 효능 및 생물물리적 거동의 동일한 표준 중 다수의 표준에 대해 판단될 수 있으나, 일부 특정, 특히 PK는 다양한 분자 포맷에 따라 다양할 수 있다. 이러한 분자는 또한 특히 정제, DSP 및 안전성 연구와 관련하여 본질적으로 다양한 필요조건을 발생시킬 수 있는 다양한 발현 시스템(예를 들어, 원핵생물 세포)에서 생성될 수 있다.

실시예 11

TNF / VEGF dAb - dAb 인-라인( in - line ) 융합체( ILF )

하기에 TNF-VEGF 이특이성을 제조하기 위해 dAb-dAb 인-라인 융합체를 작제하는 방법이 상술된다. 그러나, 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이, 유사한 표적 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편을 기초로 하여 임의의 다른 이특이성을 발생시키기 위해 동일한 방법이 사용될 수 있다.

TNFα 및 VEGF 둘 모두를 억제하는 잠재성을 갖는 이특이성 분자를 dAb-dAb 인-라인 융합체(ILF)로의 2개의 단일 도메인 항체(dAbs)의 유전적 융합에 의해 작제하였다. 이러한 분자를 작제하기 위해, 2개의 표적에 대한 독립적으로 선택된 dAb를 파아지 디스플레이에 의해 분리시키고, 표적에 대한 높은 친화성 및 역가를 다양한 적합한 기술을 이용한 친화성 성숙의 라운드(round)들에 의해 달성하였다. ILF에 대해 선택된 최종 분자는 DOM15-26-593(항-VEGF)(SEQ ID NO:1) 및 PEP1-5-19(항-TNFα)(SEQ ID NO:35)였다.

DOM15-26-593은 약 1 nM의 인간 VEGF-A에 대한 단량체 친화성을 갖는 VH dAb이다. PEP1-5-19는 약 8nM의 인간 TNFα에 대한 단량체 친화성을 갖는 Vk dAb이다. 두개의 상이한 ILF 작제물을 제조하였고, 하나는 아미노 말단에 DOM15-26-593 dAb를 가졌고(하기에서 "DOM-PEP"로 약어화됨), 하나는 상기 위치에 PEP1-5-19 dAb를 가졌다("PEP-DOM"). ILF 내의 두개의 dAb는 VH 또는 Vk dAb의 C 말단과 자연적으로 회합된 서열로부터 유래된 짧은 링커에 의해 분리되었다. 그러므로, N-말단에 VH dAb를 갖는 ILF는 링커 "ASTKGPS"(SEQ ID N0:6 - VH로부터 CH1으로의 자연 신장)를 포하하였고, N-말단에 PEP1-5-19를 갖는 ILF는 링커 서열 "TVAAPS"(SEQ ID N0:4 - Vk로부터 Ck로의 자연 신장)를 포함하였다.

ILF를 제조하기 위해, 포유동물 일시적 발현 벡터 pTT5(NRC, Canada)를 분비 신호 및 적절한 클로닝 부위를 포함하도록 변형시켰다. 이들은 하기 표 8에 상술되어 있다. DOM-PEP 작제물을 제조하기 위해, DOM15-26-593 dAb 및 PEP1-5-19 도메인 dAb에 해당하는 개별적 단편을 하기 기재되는 바와 같은 각각의 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 링커 서열 및 제한 부위를 프라이머 서열 내에 포함시켰다.

표 8

N.B. 제한 부위가 DNA 서열에서 밑줄로 표시된다.

DOM-PEP 작제물에 대한 D0M15-26-593을 AVG18 및 AVG19를 이용하여 증폭시키고, DOM-PEP 작제물에 대한 PEP1-5-19를 AVG26 및 AVG21을 이용하여 증폭시켰다. 증폭 후, PCR 단편을 BamHⅠ 및 NheⅠ, 및 NheⅠ 및 HindⅢ로 각각 절단하고, 단편을 정제시켰다. 이후, 이들을 진핵생물 프로모터 다운스트림에 BamHⅠ-HindⅢ 단편의 삽입을 가능케 하는 다수의 클로닝 부위를 함유한 벡터 pTT5의 변형된 형태와의 3-단편 라이게이션에 첨가하였다. 라이게이션, 형질전환, 및 생성된 콜로니의 분석을 표준 기술을 이용하여 수행하였고, 누클레오티드 서열 분석은 생성된 벡터가 SEQ ID NO:61에 배열된 서열을 갖는 삽입물을 함유한 것을 입증하며, 이는 SEQ ID NO:62에 제시된 번역 생성물을 예측한다.

PEP-DOM 작제물에 대해, PEP1-5-19 dAb를 AVG22 및 AVG36으로 증폭시키고, D0M15-26-593 dAb를 AVG37 & AVG25로 증폭시켰다. 이들 단편을 BamHⅠ 및 BsiWⅠ(PEP) 및 BsiWⅠ 및 HindⅢ(DOM)로 각각 절단시켰다. DOM 단편은 불충분하게 절단된 것으로 밝혀졌고, 이는 프라이머의 5' 말단의 짧은 오버행에 기인하였다. 따라서, PCR 생성물을 AVG25 및 AVG24로 재증폭시켜 오버행을 신장시키고, 절단을 반복하고, 단편을 상기 기재된 바와 같이 절단된 PEP 삽입물 및 pTT5 벡터와 함께 3-단편 라이게이션에 첨가하였다. 라이게이션, 형질전환, 및 생성된 콜로니의 분석을 표준 기술을 이용하여 수행하였고, 누클레오티드 서열 분석은 생성된 벡터가 SEQ ID NO:63에 배열된 서열을 갖는 삽입물을 함유한 것을 입증하며, 이는 SEQ ID NO:64에 제시된 번역 생성물을 예측한다.

서열분석된 클론을 DNA maxiprep에 의한 트랜스펙션을 위해 제조하고, 표준 방법을 이용하여 HEK293-6E 세포(National Research Council Canada)로 DNA 트랜스펙션시켰다. 배지의 정화 후, 재조합 단백질을 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 의해 트랜스펙션된 세포 상층액으로부터 수거하고, 정제된 물질 완충액을 PBS로 교환하고, 정량하였다. TNFα 및 VEGF 둘 모두에 결합하는 상기 단백질의 능력을 이후 상기 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR)로 평가하였다.

dAb CDR 영역에 멀리 떨어진 VH 또는 Vk dAb에 결합하는 것으로 생각되는 다수의 모노클로날 항체(대안적으로, 단백질 A 또는 단백질 L이 사용될 수 있음)를 이용하여, DOM-PEP 및 PEP-DOM 단백질을 mAb를 통해 센서 표면 상에서 포획하고, TNF 및 VEGF 리간드를 포획된 이특이성 상에서 유동시키고, 결합 특징을 분석하였다. 분석은 화합물이 시험되는 2개의 상이한 항-Vk dAb 중 하나로 포획된 경우, TNF 리간드의 결합이 손상된 것으로 결정되었으며, 이는 상기 포획 항체가 리간드 결합을 입체적으로 방해한 것을 암시한다. 따라서, 추가 분석은 항-VH dAb 모노클로날 항체로 포획된 이특이성으로 제한시켰다.

약 1600 반응 단위(response unit, RU)의 항-VH 모노클로날을 단백질-A 표면상에서 포획시키고, 시험 화합물을 복합체 상에 통과시켰다. 실험 환경을 결합 활성의 정량적 척도가 아닌 정성적 척도를 제공하도록 설계하였고, 따라서 동역학 등의 평가는 가능하지 않았다. PEP-DOM 단백질에 대해 가장 선명한 데이터를 수득하였고, 여기서 두개의 dAb는 둘 모두 추가적인 결합 곡선에 의해 입증되는 바와 같이 리간드에 독립적이고 동시에 리간드에 결합할 수 있었다(도 9 & 10).

도 9의 곡선에서 결합 사건의 보다 면밀한 분석은 PEP-DOM 단백질로의 둘 모두의 리간드의 결합을 입증한다.

TNFα 및 VEGF 둘 모두로의 DOM-PEP 결합의 가능성이 또한 관찰된다(데이터는 제시되지 않음).

실시예 12

생체내 연구: 래트에서의 레이저-유도성 맥락막 신생혈관 생성(Laser-Induced Choroidal Neovascularisation, CNV): DMS1571(VEGF-dab) 및 Enbrel™을 별개로 시험함.

원리

이전 실험에서 수득된 결과는 항-VEGF 길항제, DMS1571(SEQ ID NO:65의 이량체로서 존재하는 DOM15-26-593 항-VEGF dAb의 Fc 포맷화된 형태)이 래트 레이저-유도성 맥락막 신생혈관 생성(CNV) 모델에서 유효함을 나타내었다. 본 실험의 목적은 래트 CNV 모델에서 상기 분자의 용량 범위를 추가로 평가하고, 또한 동일 모델에서 TNFα 길항제(Enbrel™)의 용량 범위 연구를 수행하기 위한 것이다. DMS4000을 또한 본 연구에서 시험하였다.

방법

동물

12주령의 다크 아구티(Dark Agouti, DA) 래트(Harlon Olac)를 본 연구에 사용하였다. 절차 전, 동물을 케타민(Ketamine)(37.5%, Dodge Animal Health Ltd.), 도르미터(Dormitor)(25%, Pfizer Animal Health, Kent) 및 멸균수(Pfizer Animal Health, Exton, PA)의 혼합물을 0.175 ml/100g로 복막내 주사하여 외과적으로 마취시키고, 동공을 국소적 1% 트로피카미드(Alcon Laboratories, Fort Worth, TX) 및 2.5% 페닐에프린(Akorn, Inc., Decatur, IL)의 조합물로 팽창시켰다. 모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 이용에 대한 ARVO 성명(the ARVO Statement on the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)에 따랐다.

실험 CNV

실험 CNV를 레이저 광 광응고(photocoagulation, PC)를 이용하여 브루크막(Bruch's membrane)을 파열시킴으로써 2-4개월령의 암컷 DA 래트 그룹을 일방적으로 유도시켰다. 염료 레이저 PC를 슬릿 램프 검안경에 부착된 다이오드-펌핑된 532 nm 아르곤 레이저(Novus Omni Coherent Inc., Santa Clara, CA)를 이용하여 수행하고, 핸드헬드 평요 컨택트 렌즈(handheld planoconcave contact lens)(Moorfields Eye Hospital, London, UK)를 각막에 적용시켜 시력을 중화시켰다. 8개의 병변(532 nm, 150 mW, 0.15초, 100 μm 직경)을 500μm 반경(시신경유두로부터 1-1.5 mm)으로 시신경에 집중된 유두주위 분산되고 표준화되고, 각각의 안구 내의 주요 혈관을 피하면서 제조하였다. 레이저 손상의 형태적 종점을 브루크막의 파괴와 관련된 징후인 공동화 기포(cavitation bubble)의 일시적 출현으로 확인하였다(배경 참고를 위해, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Campos, Amaral, Becerra, & Fariss, 2006 A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47(12), 5163-5170]에 기재된 일반 방법 참조). 공동화 기포를 형성시키지 않는 레이저 스폿을 연구로부터 제외시켰다.

생체내 이미징

CNV 및 관련 누출의 생체내 이미지 데이터를 병변 발생 7일 후에 공초점 고해상도 레이저검안경(Scanning Laser Ophthalmoscope, SLO) 형광 안저조영술(Fluorescein Angiography, FA)(0.3ml 5% 복강내 주사되는 플루오레세인 소듐, Moorfields Eye Hospital, London, UK로부터 구입된 FS)을 이용하여 생성시킨 후, 절차 14일 후에 두번째 이미징 세션을 수행하였다. 미처리 래트에서의 레이저 PC 후에 수득된 혈관조영상에서의 형광 염색의 강도 및 영역 변화의 시간 경과에 대한 이전의 과거 대조 연구를 기초로 하여 시점을 선택하였다. 상기 과거의 연구는 PC 4일 후에 형광 염색이 첫번째로 관찰되었고, 염색의 강도가 이후 신속히 증가하여 광응고 약 14일 후에 피크에 도달한 것을 나타내었다(방법에 관한 전반적 배경지식을 위해, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kamizuru et al., 2001; Monoclonal antibody-mediated drug targeting to choroidal neovascularization in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(11), 2664-2672; Takehana et al., 1999 Suppression of laser-induced choroidal neovascularization by oral tranilast in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(2), 459-466] 참조). 상기 연구에서 실험 CNV의 시간 경과가 형광 누출이 광응고 약 5주 후에 감소하기 시작한 것을 나타냄에 따라 추가적인 평가를 수행하지 않았다. FA 이미지에서 병변을 위치시키는 것을 돕기 위해 FS의 주사 전에 기준선 반사율(488nm 및 790nm) 및 자가형광(ex. 488nm, em. >498nm) 이미지를 제조하였다. 동맥-정맥 상을 FS 주사 직후에 기록하였다. 이후, 형광 혈관조영도를 주사 직후, 및 다시 주사 4분 후에 기록하였고, 후자의 4분 데이터 세트를 통계 분석에 사용하였다.

이미지 데이터의 평가 및 통계 분석

약물 치료의 효과를 후기-단계(FS 주사 후 4±1분) 형광 혈관조영술의 정량적 평가에 의해 평가하였다. 누출을 반사율 이미지에서 병변에 상응하는 과형광 영역의 존재로 규정하였다. 정량화 전, 분석에 사용된 모든 이미지의 증폭 및 밝기를 표준화시켰다. 후기-단계 형광 혈관조영술에서의 누출의 강도 및 영역을 누출 직경(μm)과 이러한 영역 내의 평균 픽셀 밝기 값(0 내지 1)을 곱하여 정량하였다. 언페어드 t-시험(unpaired t-test)을 사용하여 시험 그룹 사이의 결과를 비교하였다. P < 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 달리 기재하지 않는 한 평균 ± SEM으로 제시된다. 이미지 분석을 수행하기 전, 동정(identification)을 스크램블링(scrabling)시키고, 정량을 맹검 형태로 수행하였다.

래트 CNV 병변에서의 대식세포의 면역조직화학 검출

CNV 연구에서 형광 혈관조영술에 이전에 적용된 안구를 즉시 탈핵시키고, 4% p-포름알데히드에서 고정시켰다. 이후, 각각의 동물의 처리된 안구로부터 세안컵(eye-cup)을 제조하고, 4회의 나비형 절개 후 플랫-마운팅(flat-mounting)시켰다. 혈관 병변의 대식세포 함량을 ED1 mAb를 이용한 면역조직화학 염색에 의해 결정한 후, ED1 양성 세포 - ED1(CD68) mAb(catalogue number MCA341 Serotech, Kidlington, Oxford, UK)를 계수하여 정량하였다.

처리

하기 표(표 9)는 각각의 실험 그룹에 제공된 처리를 나타낸다.

각각의 경우에, 화합물을 레이저 PC 직전에 유리체내 주사로 투여하였다.

레이저-유도성 CNV 연구 결과

고배율 형광 혈관조영술을 처리된 안구에 대해 PC 7일 후 및 14일 후의 두 시점에서 수행하였다. 이미지를 실험 CNV와 관련된 맥락막 누출, 및 기재된 치료와 관련된 다른 혈관 이상에 대해 등급화시켰다. 이미지를 근적외선 반사율(IR) 및 자가형광 모드(AF) 둘 모두로 기록하였다. 형광 조영제를 주사하기 전에 망막 내의 병변의 위치를 정하기 위해 IR 이미지를 사용하였다. 모든 이미지를 RPE(망막 색소 상피)의 수준으로 기록하였다.

래트 CNV 에서의 DMS1571 ( VEGF - Dab ) 및 Enbrel ™의 효과

표 10: DMS1571

DMS1571 에 대해 7일 및 14일에 평가된 CNV 누출에 대한 평균 +/- SEM

1.0-비히클, 2.0-2μg DMS1571, 3.0-1μg DMS1571, 4.0-0.5μg DMS1571, 5.0-0.2μg DMS1571, 6.0-0.1μg DMS1571. 작용제를 레이저 손상의 유도 직전에 주사하였다. 모든 경우 그룹당 N=5 동물. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다.

도 11은 표 10에 제시된 데이터의 대표 도표이다. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다. 흑색 막대는 7일의 결과를 나타낸다. 백색 막대는 14일의 결과를 나타낸다.

표 11: Enbrel ™

시험 Enbrel ™에 대해 7일 및 14일에 평가된 CNV 누출에 대한 평균 +/- SEM

7.0-비히클, 8.0-30μg Enbrel™, 9.0-10μg Enbrel™, 10.0-3μg enbrel. 11.0-1μg Enbrel™, 12.0-0.3μg Enbrel™. 작용제를 레이저 손상의 유도 직전에 주사하였다. 모든 경우 그룹당 N=5 동물. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다.

도 12는 표 11에 제시된 데이터의 대표 도표이다. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다. 흑색 막대는 7일의 결과를 나타낸다. 백색 막대는 14일의 결과를 나타낸다.

도 13은 레이저 PC 7일 후(FS 1st) 및 14일 후(FS 2nd)의 적외선(IR, 상부 좌측 패널), 자가형광(AF, 하부 좌측 패널) 및 형광 혈관조영술(FS, 큰 패널)을 나타내며, 이는 예시적 이미지를 나타낸다. 1. 비히클 처리된 안구, 2. 2μg DMS1571로 처리된 안구 및 8. 30μg Enbrel™으로 처리된 안구. CNV 병변은 DMS1571을 이용한 치료에 대해 반응하는 병변보다 더욱 중단(punctuate)되고, 덜 확산되는 것처럼 보이는 것이 주목할 만하다. 화살표는 대조군 및 Enbrel™ 처리 동물 둘 모두에서 나타나지만, DMS1571 동물에서는 나타나지 않는 혈관신생을 나타낸다.

표 12: DMS4000

DMS4000 에 대해 7일 및 14일에 평가된 CNV 누출에 대한 평균 +/- SEM

13.0-2μg DMS4000, 14.0-비히클, 작용제를 레이저 손상의 유도 직전에 주사하였다. 모든 경우 그룹당 N=5 동물. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다.

도 14는 표 12에 제시된 데이터의 대표 도표이다. 모든 화합물을 2μl의 부피의 유리체내 주사에 의해 투여하였다.

래트 CNV 병변의 대식세포 함량에 대한 DMS1571 ( VEGF - dab ) 및 Enbrel ™의 효과

표 13 - CNV 병변에서의 ED1 양성 세포(대식세포)의 정량

* p<0.0016 vs 대조군, 각각의 경우 n=5 안구

도 15는 ED1 mab로 염색된 플랫-마운팅된 박리의 예시적 현미경사진을 나타낸다. 패널 1A-1B 및 패널 Enbrel 8.4는 항-VEGF(DMS1571)(1A), 비히클 단독(1B) 또는 Enbrel(Enbrel 8.4)로 처리된 안구로부터의 망막의 플랫-마운트를 나타낸다. ED1(CD 68, 흑색) X20으로 시각화된 레이저 화상 부위와 관련된 대식세포. 패널 1D는 망막의 내핵층(INL)으로 침투되는 레이저 화상 부위와 관련된 대식세포(ED1 +, 흑색)를 나타내는 망막의 냉동미세절단기 섹션(20μm)을 나타낸다. RGC, 망막 신경절세포층; BV, 혈관. x20.

결론

결과는 DMS1571이 CNV 질병을 현저히 약화시키는데 효과적인 것을 나타낸다. 강하고 확실한 효과가 1 μg을 초과하는 용량에서 인지되고, 0.5μg 용량은 준최대(sub-maximal) 효과를 나타내고, 0.5μg 미만의 용량에서 치료제가 효과가 없다. 실험은 30μg 용량의 Enbrel™이 또한 상기 모델에서 효과적이며, 낮은 용량은 효과가 없다. DMS1571에 의해 예시되는 VEGF 억제제, 및 Enbrel™에 의해 예시되는 TNFα의 억제제 둘 모두가 설치류 모델에서 맥락막 신생혈관 질병을 독립적으로 약화시킬 수 있다는 발견은 DMS4000에 의해 예시되는 VEGF 및 TNFα 능력 둘 모두를 포함하는 단일 치료 존재물이 맥락막 신생혈관 AMD의 치료에 유용할 수 있음을 암시한다. DMS4000(여기서 TNFα 결합 기능은 결합하는 래트 TNFalpha와 양립되지 않음)이 동등한 용량에서 래트 CNV 모델에서 DMS1571과 매우 동등하게 작용하는 것이 관찰된다.

DMS1571 처리된 안구와 Enbrel™ 처리된 안구를 비교하는 경우에 Enbrel™ 안구가 DMS1571 처리된 안구와 비교하는 경우 병변이 더욱 중단되고 덜 확산되는 것으로 보이는 독특한 패터닝을 갖는 것이 형광 혈관조영술 사진으로부터 주목할 만하다. 병변 패터닝에서의 이러한 차이는 DMS1571(VEGF 길항제) 및 Enbrel™(TNFα 길항제) 치료제의 독립적 작용 메커니즘을 강하게 암시한다. 이러한 주장은 Enbrel™ 처리된 그룹에서 현저히 적은 대식세포가 CNV 혈관 병변에 보충된다는 발견에 의해 추가로 뒷받침된다.

실시예 13: 생체내 연구: 래트에서의 레이저-유도성 맥락막 신생혈관 생성( CNV ): DMS1571 ( VEGF - dab ) 및 Enbrel ™을 조합하여 시험함.

본 실시예에서 사용된 방법은 본질적으로 실시예 12에 제공된 것과 본질적으로 동일하였다.

하기 표 14는 각각의 실험 그룹에 제공된 치료를 나타낸다.

* 비히클 - 50mM Na아세테이트 10mM TrisHCL pH7.4, 104mM NaCl, 0.025% Tween 80, 4% 만니톨, 1% 수크로오스

* DMS1571 및 Enbrel™ 둘 모두가 함께 투여되는 경우, 각각 1 μl가 투여됨.

표 15: 래트 CNV 에서의 DMS1571 ( VEGF - dab ) 및 Enbrel ™의 효과

실시예 14 - DME 모델 - 예측 실시예

본원에 기재된 항원 결합 단백질이 당뇨병성 황반부종(DME)을 치료하고/하거나 예방하는데 효과적임이 예견된다. 이는 문헌[Ishida, T. Usui and K. Yamashiro et al. (VEGF164 is proinflammatory in the diabetic retina, Invest Ophthalmol Vis Sci 44 (2003), pp. 2155-2162)]에서와 같이 DME 및 망막 혈관 누출이 고혈당증의 개시 후에 관찰되는 당뇨병성 황반부종 모델에서 확인될 수 있다.

서열

SEQUENCE LISTING <110> GLAXO GROUP LIMITED Peter ADAMSON Gerald Wayne GOUGH Peter Franz ERTL Volker GERMASCHEWSKI Michael STEWARD <120> ANTIGEN-BINDING PROTEIN <130> PB63684 WO <150> 61/181887 <151> 2009-05-28 <160> 165 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-VEGF dAb DOM15-26-593 <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TNF-alpha adnectin <400> 2 Val 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Sequence <220> <223> Linker <400> 8 Thr Val Ala Ala Pro Ser Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide sequence <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 10 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab) Heavy Chain <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 11 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab) Light Chain <400> 11 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca gggcatcaga aactacctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgcc gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccttacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaagtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab) Light Chain <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 1710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab)-DOM15-26-593 Heavy Chain (DMS4000 mAbdAb heavy chain) <400> 13 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ccggcagaag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg ggtgtccgcc atcacctgga atagcggcca catcgactac 180 gccgacagcg tggagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaggtgtcc 300 tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt gacagtctcg 360 agcgctagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc tgtgaccgtg 480 tcctggaata gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt actccctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aagtggacaa gaaagtggag 660 cccaagagct gcgataagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc 720 ggacctagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaagt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct accgcgtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc tagagagccc caggtctaca ccctgcctcc ctccagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gtctgagcct gtcccctggc aagtcgaccg gtgaggtgca gctgttggtg 1380 tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga 1440 ttcaccttta aggcttatcc gatgatgtgg gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag 1500 tgggtttcag agatttcgcc ttcgggttct tatacatact acgcagactc cgtgaagggc 1560 cggttcacca tctcccgcga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 1620 cgtgccgagg acaccgcggt atattactgt gcgaaagatc ctcggaagtt agactactgg 1680 ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 1710 <210> 14 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab)-DOM15-26-593 Heavy Chain (DMS4000 mAbdAb heavy chain) <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 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Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tyr Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Thr Gly 435 440 445 Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 290 295 300 Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 305 310 315 320 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 325 330 335 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 340 345 350 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 355 360 365 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 370 375 380 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 385 390 395 400 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 405 410 415 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tyr Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 420 425 430 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 435 440 445 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 450 455 460 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 465 470 475 480 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 485 490 495 Pro 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cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaagt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct accgcgtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc tagagagccc caggtctaca ccctgcctcc ctccagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gtctgagcct gtcccctggc aagggatcca ccgtcgccgc accaagcggg 1380 tcaacagtgg ccgctccctc cggcagcact gtggctgccc ccagcggaag cgaggtgcag 1440 ctgctggtgt ctggcggcgg actggtgcag cctggcggca gcctgagact gagctgcgcc 1500 gccagcggct tcaccttcaa ggcctacccc atgatgtggg tgcggcaggc ccctggcaag 1560 ggcctggaat gggtgtccga gatcagcccc agcggcagct acacctacta cgccgacagc 1620 gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 1680 aacagcctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccaaggaccc ccggaagctg 1740 gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagc 1779 <210> 144 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-TNF-alpha mAb (adalimumab) Fc disabled -DOM15-26-593 Heavy Chain with GS(TVAAPSGS) x4 linker <400> 144 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ccggcagaag cctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg ggtgtccgcc atcacctgga atagcggcca catcgactac 180 gccgacagcg tggagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaggtgtcc 300 tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt gacagtctcg 360 agcgctagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc tgtgaccgtg 480 tcctggaata gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt actccctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aagtggacaa gaaagtggag 660 cccaagagct gcgataagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctggccggc 720 gcccctagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaagt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct accgcgtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc tagagagccc caggtctaca ccctgcctcc ctccagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gtctgagcct gtcccctggc aagggatcca ccgtcgccgc accaagcgga 1380 tctaccgtcg cagccccttc cgggtcaaca gtggccgctc cctccggcag cactgtggct 1440 gcccccagcg gaagcgaggt gcagctgctg gtgtctggcg gcggactggt gcagcctggc 1500 ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc ggcttcacct tcaaggccta ccccatgatg 1560 tgggtgcggc aggcccctgg caagggcctg gaatgggtgt ccgagatcag ccccagcggc 1620 agctacacct actacgccga cagcgtgaag ggccggttca ccatcagccg ggacaacagc 1680 aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc ctgcgggccg aggacaccgc cgtgtactac 1740 tgcgccaagg acccccggaa gctggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 1800 agc 1803 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 145 Pro Ala Ser Gly Ser 1 5 <210> 146 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 146 Pro Asp Ala Ser Gly Ser 1 5 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 147 Pro Asp Asp Ala Ser Gly Ser 1 5 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 148 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 149 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Pro Ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Pro Ser 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 154 Pro Ala Val Pro Pro Pro Gly Ser 1 5 <210> 155 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 155 Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Pro Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 156 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 156 Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ser 20 <210> 157 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 157 Thr Val Ser Asp Val Pro Gly Ser 1 5 <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 158 Thr Val Ser Asp Val Pro Thr Val Ser Asp Val Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 159 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 159 Thr Val Ser Asp Val Pro Thr Val Ser Asp Val Pro Thr Val Ser Asp 1 5 10 15 Val Pro Gly Ser 20 <210> 160 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 160 Thr Gly Leu Asp Ser Pro Gly Ser 1 5 <210> 161 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 161 Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Leu Asp Ser Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 162 Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Leu Asp 1 5 10 15 Ser Pro Gly Ser 20 <210> 163 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPC1801 (bispecific IGF1R-VEGFR2) heavy chain <400> 163 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ile Leu Tyr Tyr Gly Arg Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser 450 455 460 Leu Leu Ile Ser Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg 465 470 475 480 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 485 490 495 Val Pro Leu Gln Pro Pro Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 500 505 510 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Asp Gly Arg Asn Gly 515 520 525 Arg Leu Leu Ser Ile Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 530 535 540 <210> 164 <211> 219 <212> PRT <213> Artifiicial Sequence <220> <223> BPC1801 (bispecific IGF1R-VEGFR2) light chain <400> 164 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Gln Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 165 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPC1824 (CTLA4-Ig-anti-IL-13 dAb fusion) <400> 165 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 20 25 30 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys 35 40 45 Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 50 55 60 Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln 65 70 75 80 Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu 85 90 95 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile 100 105 110 Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Gly Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Phe Val Phe Pro Trp Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro 385 390 395 400 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asp Trp His Gly Lys Ile 405 410 415 Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 420 425 430 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 435 440 445 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Glu Asp Glu Pro Gly Tyr 450 455 460 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 465 470 475

Claims

안구의 질환을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한, TNFα 길항제 및 VEGF 길항제를 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, TNFα 길항제 및 VEGF 길항제가 항원 결합 단백질인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, TNFα 길항제 및 VEGF 길항제가 이중 표적 단백질의 형태로 존재하는 조성물.
제 3항에 있어서, 이중 표적 단백질이 TNFα 또는 TNFα 수용체에 결합하는 하나 이상의 쌍을 이룬(paired) VH/VL 도메인, 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하는 하나 이상의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 조성물.
제 4항에 있어서, 이중 표적 분자가 DVD-Ig인 조성물.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 이중 표적 단백질이 이특이적 항체인 조성물.
제 3항에 있어서, 이중 표적 단백질이 dAb-dAb 인-라인(in-line) 융합체인 조성물.
제 3항에 있어서, 이중 표적 단백질이 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결된 수용체-Fc 융합체인 조성물.
제 2항에 있어서, TNFα 길항제가 항-TNFα 항체인 조성물.
제 2항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 조성물.
제 3항에 있어서, 이중 표적 단백질의 TNFα 길항제 부분이 항-TNF 항체이고, 이중 표적 단백질의 VEGF 길항제 부분이 항-VEGF 에피토프 결합 도메인인 조성물.
제 3항에 있어서, 이중 표적 단백질의 VEGF 길항제 부분이 항-VEGF 항체이고, 이중 표적 단백질의 TNFα 길항제 부분이 항-TNF 에피토프 결합 도메인인 조성물.
제 8항, 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 dAb인 조성물.
제 13항에 있어서, dAb가 인간 dAb인 조성물.
제 8항, 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 비-Ig 스캐폴드로부터 유래되는 조성물.
제 15항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디(Affibody), SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앤키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머(aptamer); C-타입 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilins)); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소쿤니츠(scorpion toxinkunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴(아드넥틴(adnectin))으로부터 선택되는 조성물.
제 8항 또는 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 1 내지 30개의 아미노산으로 구성되는 링커를 이용하여 항원 결합 단백질에 직접 부착되는 조성물.
제 17항에 있어서, 링커가 SEQ ID NO:3-8 및 25에 기재된 것, 또는 이의 임의의 조합물 또는 배수체(multiple)로부터 선택되는 조성물.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 항원 결합 단백질 중쇄의 N-말단에 연결된 조성물.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 항원 결합 단백질 경쇄의 N-말단에 연결된 조성물.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 항원 결합 단백질 중쇄의 C-말단에 연결된 조성물.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 항원 결합 단백질 단쇄의 C-말단에 연결된 조성물.
제 2항 내지 제 7항 또는 제 8항 내지 제 22항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:10에 기재된 중쇄에 함유된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 및 SEQ ID NO:12에 기재된 경쇄에 함유된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 조성물.
제 23항에 있어서, SEQ ID NO:14, 15, 47, 69, 70, 71 또는 72의 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열을 포함하는 조성물.
제 3항 내지 제 8항 또는 제 11항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 4-6주 간격으로 유리체내 투여되는 조성물.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 추가 활성제, 임의로 항염증제를 포함하는 조성물.
안구의 질환을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 정의된 조성물의 용도.
베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), r84, 아플리버셉트(aflibercept), CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, PRS-051, MP0012, CT-322, ESBA903, EPI-0030, EPI-0010, 및 DMS1571로 구성된 군으로부터 선택된 VEGF 길항제와 조합하여 투여되는,
안구 질환을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), ESBA105, PEP1-5-19, PEP1-5-490, PEP1-5-493, SEQ ID NO:2의 아드넥틴, 골리무맙(golimumab), 세르톨리주맙(certolizumab), ALK-6931, 및 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 TNFα 길항제.
아달리무맙, 인플릭시맙, 에타너셉트, ESBA105, PEP1-5-19, PEP1-5-490, PEP1-5-493, SEQ ID NO:2의 아드넥틴, 골리무맙, 세르톨리주맙, ALK-6931, 및 SEQ ID NO:30의 중쇄 및 SEQ ID NO:31의 경쇄로 구성된 군으로부터 선택된 TNFα 길항제와 조합하여 투여되는,
안구 질환을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한, 베바시주맙, 라니비주맙, r84, 아플리버셉트, CT01, DOM15-10-11, DOM15-26-593, PRS-050, PRS-051, MP0012, CT-322, ESBA903, EPI-0030, EPI-0010, 및 DMS1571로 구성된 군으로부터 선택된 VEGF 길항제.
TNFα 길항제가 아달리주맙이고, VEGF 길항제가 라니비주맙인, 제 28항에 따른 TNFα 길항제 또는 제 29항에 따른 VEGF 길항제.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 청구된 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 31항에 있어서, 조성물이 활성제, 임의로 항염증제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 2항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열.
제 5항, 제 6항 또는 제 9항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열.
제 34항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:11, 13, 또는 46에 기재된 서열인 폴리누클레오티드 서열.
제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포.
제 2항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 제 36항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항원 결합 단백질을 분리시키는 단계를 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 유리체내 경로를 통해 전달하기 위한 조성물.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 안구주위 경로를 통해 전달하기 위한 조성물.
제 39항에 있어서, 경공막(trans-scleral), 결막하(subconjunctival), 테논낭하(sub-tenon), 안구주위(peribulbar), 국소, 안구후(retrobulbar) 경로를 통해 전달되거나, 하직근(inferior rectus muscle), 상직근(superior rectus muscle) 또는 외직근(lateral rectus muscle)로 전달되는 조성물.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 안구의 질환이 당뇨병성 황반부종, 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증인 조성물.
예방적 또는 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 이중 표적 단백질을 환자의 안구에 전신 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함하여, 안구 질환에 걸린 환자를 예방하거나 치료하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 환자가 당뇨병성 황반부종, 낭포황반부종, 포도막염, AMD(연령 관련 황반 변성), 맥락막 혈관신생 AMD, 당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄 및 다른 황반병증 및 안구 혈관병증의 질환 또는 장애 중 하나 이상에 걸린 방법.
TNFα 길항제 부분, VEGF 길항제 부분 및 상기 TNFα 길항제 부분을 상기 VEGF 길항제 부분에 연결시키는 링커를 포함하는 이중 표적 항원 결합 분자로서,
상기 TNFα 길항제 부분이 표 1에 나열된 TNFα 길항제 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 VEGF 길항제 부분이 표 2에 나열된 VEGF 길항제 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 링커가 1 내지 150개의 아미노산 길이의 아미노산 서열이고;
상기 이중 표적 분자가 DMS4000 또는 DMS4031이 아닌, 이중 표적 항원 결합 분자.
TNFα 길항제 부분, VEGF 길항제 부분 및 상기 TNFα 길항제 부분을 상기 VEGF 길항제 부분에 연결시키는 링커를 포함하는 이중 표적 항원 결합 분자로서,
상기 TNFα 길항제 부분이 표 1에 나열된 TNFα 길항제 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 VEGF 길항제 부분이 표 2에 나열된 VEGF 길항제 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 링커가 1 내지 150개의 아미노산 길이의 아미노산 서열이고;
상기 이중 표적 항원 결합 분자가 안구의 질환을 예방하거나 치료하는데 사용되고, 4-6주 간격으로 유리체내에 투여되는, 이중 표적 항원 결합 분자.
제 44항 또는 제 45항에 있어서, 링커가 SEQ ID NO: 3-8, 25, 66-68, 및 145-162에 기재된 것, 또는 이의 임의의 조합물 또는 배수체(multiple)로부터 선택되는 조성물.
제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:62 또는 SEQ ID NO 64의 아미노산 서열로 구성되는 이중 표적 항원 결합 분자.
SEQ ID NO:69, 70, 71 또는 72의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:12의 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
제 48항에 따른 항우너 결합 단백질 및 추가 활성제, 임의로 항염증제를 포함하는 약제 조성물.
제 48항의 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열.
제 50항에 있어서, 폴리누클레오티드가 SEQ ID NO:141, 142, 143 또는 144 및 SEQ ID NO:11을 포함하는 폴리누클레오티드 서열.