JP2012527875A - 抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、１つ以上のエピトープ結合ドメインに連結した受容体−Ｆｃ融合体を含む抗原結合タンパク質、そのようなタンパク質を製造するための方法、およびその使用に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、１つ以上のエピトープ結合ドメインに連結した受容体−Ｆｃ融合体を含む抗原結合タンパク質、そのようなタンパク質を製造するための方法、およびその使用に関する。
受容体−Ｆｃ融合体（可溶性受容体）は、標的に結合し、中和することができるよく知られた治療用タンパク質である。現在市場に出ており、または臨床開発中である受容体−Ｆｃ融合体の例はアバタセプト、エタネルセプトおよびアタシセプトである。
アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａとして販売）はＣＴＬＡ−４、Ｂ７と結合することができる分子の細胞外ドメインに融合された免疫グロブリンから構成される融合タンパク質である。アバタセプトはＴ細胞の共刺激を阻止するので、選択的共刺激モジュレータである。これは、抗−ＴＮＦａ療法に対する応答が不十分である場合、関節リウマチの治療のために米国で認可されている。
エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）は、ほ乳動物細胞発現系で産生される可溶性組換えヒトｐ７５腫瘍壊死因子ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）およびヒトＩｇＧ１Ｆｃ部融合タンパク質であり、これは、関節リウマチ（ＲＡ）および他の炎症状態を治療する際に使用するために開発されている。
アタシセプトはサイトカインＢｌｙＳおよびＡＰＲＩＬに結合し、それらにより活性化されるＢリンパ球ＴＡＣＩ受容体の受容体部分を含む組換え融合タンパク質である。可溶性タンパク質はＴＡＣＩ受容体の細胞外ドメインのヒトＩｇＧ１のＦｃ部との融合体を含む。ＴＡＣＩ受容体は、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。アタシセプトは過剰のＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬに結合し、それらがＢ細胞に結合するのを防止し、よって、Ｂ細胞成熟度および抗体産生を制御する。これは、自己免疫疾患の治療のために開発されている。
本発明は、特に、１つまたは複数のエピトープ結合ドメインにリンクされた受容体−Ｆｃ融合体を含む抗原結合タンパク質に関する。
また、本発明は、本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチド配列、および本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、等価のポリペプチド配列に相当するコード配列を示すが、このポリヌクレオチド配列を、開始コドン、適切なシグナル配列および停止コドンと共に発現ベクターに挿入することができることは理解されるであろう。
本発明はさらに組み換え型の形質転換または形質移入した宿主細胞を提供し、この宿主細胞は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖、および軽鎖をコードした１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。
さらに、本発明は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の産生方法を提供し、この方法は、本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質をコードするベクターを含む宿主細胞を、例えば無血清培地中で培養するステップを含む。
本発明はさらに本明細書記載の抗原結合タンパク質および製薬上許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、免疫疾患、例えば自己免疫疾患、または癌、または炎症性疾患の治療におけるそのような抗原結合タンパク質またそのような抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の使用を提供する
定義
本明細書で使用される「受容体−Ｆｃ融合体」という用語は、抗体のＦｃ領域に連結された受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインを示す。受容体または細胞表面タンパク質のそのような可溶性リガンドまたは細胞外ドメインの断片は、全長タンパク質の生物学的機能を保持する、すなわち、抗原結合能力を保持する限り、この定義に含まれる。
「ドメイン」は、他のタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインは領域タンパク質の多様な機能特性の原因であり、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能を失うことなく、付加、除去または他のタンパク質に移動可能である。「単一抗体可変領域」は、抗体可変ドメインの配列特性を含む、折り畳まれたポリペプチド領域である。従って、これは完全抗体可変ドメイン、および、例えば、１つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特性を有しない配列、または切断されたまたはＮやＣ末端延長部を含む抗体可変ドメイン、並びに少なくとも全長領域の結合活性と特異性を保持している可変ドメインの折り畳まれた断片、により置換された場合、等の修飾可変ドメインを含む。
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、別の可変領域またはドメインに独立に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ，ＶＨＨ，ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の、別の可変領域または可変ドメインと共にある種のフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在できる。この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによって抗原結合が要求されていない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。本明細書で使われる場合、「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原に結合が可能な「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、他の種、例えばげっ歯類（例はWO00/29004で開示），テンジクザメおよびラクダＶＨＨｄＡｂ、等由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダＶＨＨはラクダ，ラマ，アルパカ，ヒトコブラクダ，およびグアナコ等の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは元々軽鎖の欠けた重鎖抗体を産生する。このＶＨＨ領域は、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化されてもよく、この領域も本発明による「ドメイン抗体」と考えられる。本明細書で使われる「ＶＨ」はラクダＶＨＨドメインを含む。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらの領域は、新規抗原受容体可変領域（通常、Ｖ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと省略）としても知られる。詳細は、Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)および US20050043519A参照。
用語「エピトープ結合ドメイン」は、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。これは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばヒト、ラクダまたはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、またはその天然リガンド以外のリガンドへの結合を得るためにタンパク質工学による操作が行われた非免疫グロブリン（非Ｉｇ）ドメイン、例えば、下記を含む群から選択された足場の誘導体であるドメインあってもよい：ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺ−領域（アフィボディ，ＳｐＡ），Ａ−領域（アビマー／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチン領域（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン（アドネクチン））；このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は主にＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様免疫グロブリンフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異種の配列と置換して異なる結合特性を出すことができる。異なる結合特異性有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｙとして知られている。詳細は、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照のこと。
リポカリンは細胞外タンパク質ファミリー で、ステロイド, ビリン, レチノイドおよび脂質、等の小さな疎水性の 分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なβ−シート二次構造を有し、これは別の標的抗原に結合するように操作できる。アンチカリンはサイズが１６０−１８０アミノ酸で、リポカリン由来である。詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 およびUS20070224633を参照のこと。
アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ由来の足場で、抗原結合するように操作できる。このドメインは約５８アミノ酸のらせん状束からなる。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。詳細は、Protein Eng.Des.Sel.17, 455-462 (2004) および EP1641818A1を参照のこと。
アビマーは、Ａ−ドメイン足場ファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の未変性ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａ−ドメインファミリー中の天然変異の混ぜ合わせにより生成されている。詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照のこと。
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループに挿入する操作により別の標的抗原に結合させることができる。操作したトランスフェリン足場の例には、トランスボディがある。詳細は、J. Biol.Chem 274, 24066-24073 (1999)参照。
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン由来である。アンキリンの一回の繰り返しは３３残基のチーフで、２つのα−らせんとβ−回転を含む。これらは、各繰り返し中の一つ目のα−らせんとβ−回転の残基を無秩序化することにより標的抗原に結合するよう操作できる。これらの結合面を、分子の数を増やすことにより増加させることができる（親和性成熟の方法）。詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)とJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) および US20040132028A1参照。
フィブロネクチンは、抗原に結合させるように操作できる足場である。アドネクチンは、ヒトＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮ３）における１５繰り返し単位の内の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。β−サンドイッチの一端のループは操作によりアドネクチンに特異的に目的治療標的を認識させることができる。詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 および US6818418B1参照。
ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識分子で、定常性足場タンパク質で構成され、このタンパク質の典型的例には、活性部位に挿入された制限付き可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）がある。詳細は、Expert Opin.Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)参照。
ミクロボディは、長さ２５−５０アミノ酸の自然発生のマイクロタンパク質由来で、３−４システインブリッジを含む。マイクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢ１、コノトキシンおよびノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）がある。マイクロタンパク質は、ループを有し、これをマイクロタンパク質全体の折り畳みに影響を与えないで２５アミノ酸まで含有するように操作できる。操作されたノッティンドメインの詳細については、WO2008098796参照。
他のエピトープ結合ドメインには、別の標的抗原の結合特性を操作するための足場として使われてきたタンパク質、例えばヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ），ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚタイプドメイン，Ｒａｓ−結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン），Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）がある（これらは、Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) の７章Non-Antibody ScaffoldsおよびProtein Science 15:14-27 (2006)でレビューされている）。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメイン由来であってもよい。
本発明の一実施形態では、抗原結合性部位は、少なくとも、Ｋｄ値１ｍＭで抗原に結合し、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）、例えば、方法４または４で記載されるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）法で測定してＫｄ値１０ｎＭ，１ｎＭ，５００ｐＭ，２００ｐＭ，１００ｐＭ，で各抗原に結合する。
本明細書で使われる用語「抗原結合性部位」は、抗原に特異的に結合可能なタンパク質上の部位を指し、単一ドメイン，例えばエピトープ結合ドメインであっても、抗原に結合することができる受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインの部分であってもよい。
二重特異性ＢＰＣ１８２１はＶＥＧＦＲ２及びＢ７−１の両方へ結合することを示すブリッジングＥＬＩＳＡである。 二重特異性ＢＰＣ１８２４はＩＬ−１３およびＢ７−１の両方へ結合することを示すブリッジングＥＬＩＳＡである。 二重特異性ＢＰＣ１８２５はＶＥＧＦおよびＢ７−１の両方へ結合することを示すブリッジングＥＬＩＳＡである。
本発明は、１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに結合された受容体−Ｆｃ融合体を含む抗原結合タンパク質を提供する。
そのような抗原結合タンパク質は免疫グロブリン足場を含み、すなわち、下記に連結される抗体のＦｃ部を含む：（ｉ）受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメイン、および（ｉｉ）１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体または受容体−Ｉｇ−エピトープ結合ドメイン融合体とも呼ばれる。
本発明の抗原結合タンパク質は抗体のＦｃ部を含む。このＦｃ部は、任意のアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４またはＩｇＧ４ＰＥから選択され得る。
本発明の一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、免疫グロブリン単一可変ドメインである。
いずれかの本明細書記載の抗原結合タンパク質は１つまたは複数の抗原を中和することができることは、理解されるであろう。
本発明の抗原結合タンパク質に関連して本明細書で使われる用語「中和する」およびその文法的変形体は、本発明の抗原結合タンパク質の存在下、このような抗原結合タンパク質の無い場合の標的の活性に比較して、全体的または部分的に標的の生物活性が低下することを意味する。これに限定されないが、中和が、１つまたは複数のリガンドのブロッキング、受容体を活性化するリガンドの阻害、受容体の発現低下、またはエフェクター機能への作用、によるものであってもよい。
中和のレベルはいくつかの方法、例えば、下記実施例において設定されるアッセイ法のいずれかを使用することにより、例えば、リガンドの受容体への結合の阻止を測定するアッセイ法において測定可能である。この測定法は、例えば実施例３に記載のように実施される。このアッセイでは、ＶＥＧＦＲ２の中和は、中和する抗原結合タンパク質の存在下でリガンドとその受容体間の結合の減少を評価することにより測定される。
中和を評価する他の方法で、例えば中和する抗原結合タンパク質の存在下、リガンドとその受容体間の結合低下を評価することにより測定する方法は、当業者には既知であり、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイがある。
本発明の別の態様では、少なくとも実質的に本明細書で例示されている抗原結合タンパク質と等価な中和活性を有する抗原結合タンパク質が提供される。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＶＥＧＦに対し特異性を有し、例えばＶＥＧＦに結合するエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンチカリン、またはＶＥＧＦに結合するアドネクチンに連結する受容体−Ｆｃ融合体を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＶＥＧＦＲ２に対し特異性を有し、例えばＶＥＧＦＲ２に結合するエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはＶＥＧＦＲ２に結合するアドネクチンに連結する受容体−Ｆｃ融合体を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＴＮＦαに対し特異性を有し、例えばＴＮＦαに結合するエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはＴＮＦαに結合するアドネクチンに連結する受容体−Ｆｃ融合体を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＩＬ−１３に対し特異性を有し、例えばＩＬ−１３に結合するエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはＩＬ−１３に結合するアドネクチンに連結する受容体−Ｆｃ融合体を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＨＥＲ２に対し特異性を有し、例えばＨＥＲ２に結合するエピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはＨＥＲ２に結合するアドネクチンに連結する受容体−Ｆｃ融合体を含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は唯一１つの抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明はＴＮＦαに結合することができる１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結されたＴＮＦαに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、例えば、配列番号７で設定されるエピトープ結合ドメインに連結された配列番号２１または配列番号２８で設定される受容体−Ｆｃ融合体を提供する。
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は１を超える抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明は、ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦ，ＴＮＦα，ＨＥＲ２，ＩＬ−１３から選択される１つまたは複数の抗原に結合することができる１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結されたＢ７−１に結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、例えば、ＶＥＧＦＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢ７−１に結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＶＥＧＦに結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢ７−１に結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＴＮＦαに結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢ７−１に結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＨＥＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢ７−１に結合することができる受容体−Ｆｃ融合体を提供する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ｂ７−１およびＶＥＧＦＲ２に同時に、またはＢ７−１およびＶＥＧＦに同時に、またはＢ７−１およびＴＮＦαに同時に、またはＢ７−１およびＨＥＲ２に同時に結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は１つを超える抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明は、ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦ，ＴＮＦα，ＨＥＲ２，ＩＬ−１３から選択される１つまたは複数の抗原に結合することができる１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結されたＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、例えば、ＶＥＧＦＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＶＥＧＦに結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＴＮＦαに結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＨＥＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに結合されたＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体を提供する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬならびにＶＥＧＦＲ２に同時に、またはＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬならびにＶＥＧＦに同時に、またはＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬならびにＴＮＦαに同時に、またはＢＬｙｓおよび／またはＡＰＲＩＬならびにＨＥＲ２に同時に結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は１を超える抗原に対し特異性を有し、例えば、本発明は、ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＩＬ−１３から選択される１つまたは複数の抗原に結合することができる１つまたは複数のエピトープ結合ドメインに連結されたＴＮＦαに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、例えば、ＶＥＧＦＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＴＮＦαに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＶＥＧＦに結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＴＮＦαに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体、またはＨＥＲ２に結合することができるエピトープ結合ドメインに連結されたＴＮＦαに結合することができる受容体−Ｆｃ融合体を提供する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦＲ２に同時に、またはＴＮＦαおよびＶＥＧＦに同時に、またはＴＮＦαおよびＨＥＲ２に同時に結合することができる。
本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質が、例えば実施例４に記載されたような適切なアッセイを使った化学量論的解析により測定して、同時に２つ以上の抗原に結合可能であってもよいことは理解されよう。
そのような抗原結合タンパク質の例としては、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば、抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンに連結されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号１９または配列番号２０で設定されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＶＥＧＦＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば配列番号６で設定されたアドネクチンを含む、抗原結合タンパク質が挙げられる。そのような受容体−Ｆｃ−アドネクチン融合体の例としては配列番号２３または配列番号４で設定された抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインまたは抗ＶＥＧＦアンチカリンに連結されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号１９または配列番号２０で設定されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＶＥＧＦに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１３で設定されたｄＡｂ、または配列番号９で設定されたアンチカリンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。そのような受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合体の例としては、配列番号２７または配列番号２８で設定された抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＴＮＦαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＴＮＦαアドネクチンに連結されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号１９または配列番号２０で設定されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＴＮＦαに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号７で設定されたアドネクチンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。そのような受容体−Ｆｃ−アドネクチン融合体の例としては、配列番号２５または配列番号２６で設定された抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＩＬ−１３に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインに連結されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号１９または配列番号２０で設定されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＩＬ−１３に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１４で設定されたｄＡｂを含む受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合体が挙げられる。そのような受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合体の例としては、配列番号２９または配列番号３０で設定された抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＨＥＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＨＥＲ２アフィボディに連結されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号１９または配列番号２０で設定されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＨＥＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号８で設定されたＤＡＲＰｉｎ、または配列番号１０で設定されたアフィボディを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の例としては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンに連結されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２１で設定されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＶＥＧＦＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号６で設定されたアドネクチンを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインまたは抗ＶＥＧＦアンチカリンに連結されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２１で設定されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＶＥＧＦに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１３で設定されたｄＡｂ、または配列番号９で設定されたアンチカリンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＴＮＦαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＴＮＦαアドネクチンに連結されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２１で設定されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、さらに、ＴＮＦαに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号７で設定されたアドネクチンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＩＬ−１３に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインに連結されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２１で設定されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、さらにＩＬ−１３に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１４で設定されたｄＡｂを含む受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＨＥＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＨＥＲ２アフィボディに連結されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２１で設定されたＴＮＦＲ２−Ｉｇ配列を含み、さらにＨＥＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号８で設定されたＤＡＲＰｉｎ、または配列番号１０で設定されたアフィボディを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の例としては、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンに連結されたＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２２で設定されたＴＡＣＩ−Ｉｇ配列を含み、さらにＶＥＧＦＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号６で設定されたアドネクチンを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＶＥＧＦに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＶＥＧＦ免疫グロブリン単一可変ドメインまたは抗ＶＥＧＦアンチカリンに連結されたＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２２で設定されたＴＡＣＩ−Ｉｇ配列を含み、さらにＶＥＧＦに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１３で設定されたｄＡｂまたは配列番号９で設定されたアンチカリンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＴＮＦαに対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＴＮＦαアドネクチンに連結されたＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２２で設定されたＴＡＣＩ−Ｉｇ配列を含み、さらにＴＮＦαに結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号７で設定されたアドネクチンを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合ドメイン融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＩＬ−１３に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインに連結されたＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２２で設定されたＴＡＣＩ−Ｉｇ配列を含み、さらにＩＬ−１３に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号１４で設定されたｄＡｂを含む受容体−Ｆｃ−ｄＡｂ融合体が挙げられる。
そのような抗原結合タンパク質の他の例としては、ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体のＣ末端またはＮ末端に連結された、ＨＥＲ２に対する特異性を有するエピトープ結合ドメイン、例えば抗ＨＥＲ２アフィボディに連結されたＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体、例えば、配列番号２２で設定されたＴＡＣＩ−Ｉｇ配列を含み、さらにＨＥＲ２に結合する１つまたは複数のエピトープ結合ドメイン、例えば、配列番号８で設定されたＤＡＲＰｉｎ、または配列番号１０で設定されたアフィボディを含む受容体−Ｆｃ−エピトープ結合融合体が挙げられる。
また、このような受容体−Ｆｃ−免疫グロブリン単一可変ドメイン融合体は、同じまたは異なる抗原特異性を有し、そのＣ末端またはＮ末端に結合した１つまたは複数の追加のエピトープ結合ドメインを有してもよい。
本発明の一実施形態では、本明細書記載の発明に従った、ＡＤＣＣおよび／または補体活性化またはエフェクター機能を低減するように定常領域を含む受容体−Ｆｃ−免疫グロブリン単一可変ドメイン融合体が提供される。このような一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの本来の無効化定常領域または変異ＩｇＧ１定常領域を含んでもよい。適切な修飾の例は、ＥＰ０３０７４３４に記載されている。一例では、位置２３５および２３７（ＥＵインデックスナンバリング）のアラニン残基の置換が含まれる。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ｆｃ機能、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の１つまたは両方を有する。
本発明の抗原結合タンパク質は、何らかのエフェクター機能を有しうる。例えば、免疫グロブリン足場がエフェクター機能を有する抗体由来のＦｃ領域を含む場合、例えば、免疫グロブリン足場がＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３を含む場合である。エフェクター機能のレベルは、既知の技術、例えば、ＣＨ２ドメインの変異により、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインが２３９および３３２および３３０から選択された位置に１つまたは複数の変異を有する場合、例えば、変異がＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択され、その抗体が強化されたエフェクター機能を有するようにする技術、および／または、例えば、本発明の抗原結合タンパク質のグリコシレーションプロファイルを変えてＦｃ領域のフコシル化を減少させる技術、等の技術により変えることができる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ドメイン抗体（免疫グロブリン単一可変ドメイン）であるエピトープ結合ドメインを含み、例えば、エピトープ結合ドメインがヒトＶＨまたはヒトＶＬであっても、ラクダＶＨＨまたはサメ免疫グロブリン単一可ドメイン（ＮＡＲＶ）であってもよい。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、非Ｉｇ足場、例えば下記の群から選択された非Ｉｇ足場の誘導体であるエピトープ結合ドメインを含む。ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡ由来分子例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ，ＳｐＡ），Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；ＧｒｏＥＬやＧｒｏＥＳ等の熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−タイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）；このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。
本発明の一実施形態では、４つのエピトープ結合ドメイン、例えば４つのドメイン抗体があり、２つのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよく、抗原結合タンパク質中に存在する全てのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよい。
本発明の受容体−Ｆｃ融合体は、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結してもよい。適切なリンカーの例は、長さで１アミノ酸〜１５０アミノ酸，または１アミノ酸〜１４０アミノ酸，例えば、１アミノ酸〜１３０アミノ酸，または１〜１２０アミノ酸，または１〜８０アミノ酸，または１〜５０アミノ酸，または１〜２０アミノ酸，または１〜１０アミノ酸，または５〜１８アミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。このような配列は、それ自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。適切なリンカーは、サイズが１〜２０オングストロームであってもよく、例えば、１５オングストローム未満，または１０オングストローム未満，または５オングストローム未満であってもよい。
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合ドメインは受容体−Ｆｃ融合体に直接に結合し、この足場は、１〜１５０アミノ酸、例えば、１〜５０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、例えば１〜１０アミノ酸からなるリンカーを有している。このようなリンカーは、配列番号１５〜１８、または配列番号３１〜３２または配列番号４１〜４２で示されるもののいずれか１つから選択することができ、または、これらリンカーの複合であってもよい。
本発明の抗原結合タンパク質で使用するリンカーは、単体でも他のリンカー、１つまたは複数のＧＳ残基のセット、例えば、「ＧＳＴＶＡＡＰＳ」（配列番号４１）または「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号３２）または「ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号４２）であってもよい。
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に連結している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍ」により受容体−Ｆｃ融合体に結合している。この全ての実施形態で、ｎ＝１〜１０，およびｍ＝０〜４である。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＰＡＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号４１），（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号４８），（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号４９），（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＴＶＡＡＰＳ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝１およびｍ＝１（配列番号４２），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝２およびｍ＝１（配列番号４３），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝３およびｍ＝１（配列番号４４），または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝４およびｍ＝１（配列番号４５），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝５およびｍ＝１（配列番号４６），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝６およびｍ＝１（配列番号４７），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝１およびｍ＝０（配列番号３２），（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝２およびｍ＝１０，（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝３およびｍ＝０，または（ＧＳ）ｍ（ＴＶＡＡＰＳＧＳ）ｎここでｎ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＰＡＶＰＰＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１），（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１，（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１，（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
このようなリンカーの例には、（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝１およびｍ＝１，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝１，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝１，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝１，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝２およびｍ＝０，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝３およびｍ＝０，（ＴＧＬＤＳＰ）ｎ（ＧＳ）ｍここでｎ＝４およびｍ＝０がある。
別の実施形態では、エピトープ結合ドメインおよび受容体−Ｆｃ融合体の間にはリンカーが存在しない。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＴＶＡＡＰＳ」（配列番号１６）により受容体−Ｆｃ融合体に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＴＶＡＡＰＳＧＳ」（配列番号３２）により受容体−Ｆｃ融合体に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＧＳ（配列番号３１）」により受容体−Ｆｃ融合体に結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカー「ＡＳＴＫＧＰＴ」（配列番号１７）により受容体−Ｆｃ融合体に結合する。
一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒト血清アルブミンに結合可能な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む。
また、本発明は医薬に使用するための、例えば免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患，例えば関節リウマチの治療薬製造に使用するための抗原結合タンパク質を提供する。
本発明は、免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患、例えば関節リウマチの患者を治療する方法を提供し、これは、本発明の治療量の抗原結合タンパク質の投与を含む。
本発明の抗原結合タンパク質は、免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患、例えば関節リウマチの治療のために使用することができる。
本発明に使われる免疫グロブリン足場は、従来の抗体のＦｃ部を含む。本発明の免疫グロブリン足場は、一価抗体のような従来にない抗体構造のＦｃ領域を含んでもよい。このような一価抗体は、機能的可変領域とＣＨ１領域が欠けた第２の重鎖と二量体化する重鎖を含んでもよい。この場合、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成するように第１と第２の重鎖を修飾して、２つの重鎖と１つの軽鎖を有する一価抗体ができる（このような一価抗体は、ＷＯ２００６０１５３７１に記載されている）。このような一価抗体のＦｃ領域は、受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンド，細胞外ドメインおよびエピトープ結合ドメインが連結できる本発明の免疫グロブリン足場を提供可能である。そのような一価構造では、受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインを第１の重鎖に、１つまたは複数のエピトープ結合ドメインを第２の重鎖に連結させることができる。
本発明に使われるエピトープ結合ドメインは、別の可変領域またはドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であっても、または非Ｉｇドメイン、例えば、下記の群から選択された足場の誘導体であるドメインであってもよい。ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカイン；プロテインＡ誘導分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ，ＳｐＡ），Ａドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃタイプレクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）；このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われた。一実施形態では、これはドメイン抗体であってもよく、また他の適切なドメイン、例えば、ＣＴＬＡ−４，リポカリン，ＳｐＡ，アフィボディ，アビマー，ＧｒｏＥＬ，トランスフェリン，ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインであってもよい。一実施形態では、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、アフィボディ，アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、アフィボディ，アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト，ラクダまたはサメ（ＮＡＲＶ）ドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。
エピトープ結合ドメインは、１つまたは複数の位置で受容体−Ｆｃ融合体に連結可能である。この位置には、受容体−Ｆｃ融合体のＣ末端およびＮ末端が含まれる。例えば、受容体−Ｆｃ融合体のＦｃ部に直接連結してもよく、あるいは、受容体−Ｆｃ融合体の受容体または細胞表面タンパク質部分の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインに連結してもよい。受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインが、Ｆｃ部のＮ末端に連結する場合、エピトープ−結合ドメインは、Ｆｃ部のＣ末端あるいは受容体または細胞表面タンパク質の可溶性リガンドまたは細胞外ドメインのＮ末端に直接連結してもよい。
一実施形態では、第１のエピトープ結合ドメインが受容体−Ｆｃ融合体に連結し、第２のエピトープ結合ドメインが第１のエピトープ結合ドメインに連結し、例えば、第１のエピトープ結合ドメインが受容体−Ｆｃ融合体のＣ末端に連結してもよく、そのエピトープ結合ドメインがそのＣ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインに連結でき、または例えば、第１のエピトープ結合ドメインは、受容体−Ｆｃ融合体のＮ末端に連結してもよく、その第１のエピトープ結合ドメインはそのＮ末端の位置で第２のエピトープ結合ドメインにさらに連結してもよい。エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合は、一部のドメイン抗体が足場内の特定の位置に適合することがある。
免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端が抗体定常ドメインに融合している抗原結合タンパク質の場合は、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびＦｃ部の間のペプチドリンカーは、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合するのを支援することができる。事実、免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端は、抗原結合活性に関わる相補性決定領域（ＣＤＲ）の近傍に配置される。従って、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインおよびＦｃ部の間のスペーサーとして作用し、これにより免疫グロブリン単一可変ドメインＣＤＲをより容易に抗原に近づけることができ、従って高い親和性での結合が可能となる。
免疫グロブリン単一可変ドメインがＩｇＧに結合する環境は、融合しようとする抗体鎖によって異なる：
Ｆｃ部のＣ末端で融合する場合は、各免疫グロブリン単一可変ドメインはＦｃ部のＣＨ３ドメインの近くに配置されることが期待される。これはＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ，ＩＩ，ＩＩＩおよびＦｃＲｎ）へのＦｃ結合特性に影響することは期待できない。理由は、これらの受容体が、ＣＨ２ドメイン（ＦｃγＲＩ，ＩＩおよびＩＩＩクラスの受容体の場合）またはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間のヒンジ（例えば、ＦｃＲｎ受容体の場合）と結合しているからである。このような抗原結合タンパク質の別の特徴は、両免疫グロブリン単一可変ドメインが相互に空間的に接近していることが期待され、適切なリンカーにより与えられた柔軟性があるという条件下、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインはホモ二量体でさえ形成でき、従って、Ｆｃ部の「ジップド（ｚｉｐｐｅｄ）」四次構造化を促進し、このタンパク質の安定性を高めることができる。
このような構造の考察は、エピトープ結合ドメインに結合する最も適切な位置、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの受容体−Ｆｃ融合体上の位置の選択の助けとなり得る。
免疫グロブリン単一可変ドメインの溶液中結合状態と方法の理解も有益である。インビトロでｄＡｂは単量体での存在が多く、溶液中ではホモ二量体か多量体が多いという根拠が蓄積されてきた（Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365）。これはＩｇドメインと一緒のインビボで観察された多量体発生、例えば、ベンスジョーンズタンパク質（免疫グロブリン軽鎖の二量体 (Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 p1291-1301)およびamyloid fibers (James et al. (2007) J Mol Biol. 367:603-8)、を強く想起させる。
例えば、溶液中では二量体化する傾向のドメイン抗体を受容体−Ｆｃ融合体のＮ末端よりもＦｃ部のＣ末端に結合させることが望ましいという可能性もある。理由は、Ｆｃ部のＣ末端への結合により本発明の抗原結合タンパク質との関連で、これらのｄＡｂをより容易に二量体化させると思われるためである。
本発明の抗原結合タンパク質は、単一抗原に特異的な抗原結合性部位を含んでもよく、２つ以上の抗原または単一抗原上の２つ以上のエピトープに対し特異的な抗原結合性部位を有してもよく、また、抗原結合性部位のそれぞれが同じまたは異なる抗原上の別々のエピトープに対し特異的であってもよい。
また、本発明は医薬に使用するための、例えば免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患，例えば関節リウマチの治療薬製造に使用するための抗原結合タンパク質を提供する。
特に、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患，例えば関節リウマチの治療に有用であり得る。
本発明は、免疫疾患，例えば自己免疫疾患，または癌，または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス，多発性硬化症，クローン病，乾癬，または関節炎疾患、例えば関節リウマチの患者を治療する方法を提供し、これは、本発明の治療量の抗原結合タンパク質の投与を含む。
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合体を含む本発明の抗原結合タンパク質は、関節炎疾患、例えば関節リウマチの治療に有用であり得る。
ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体を含む本発明の抗原結合タンパク質は、炎症性疾患、例えばＲＡ，クローン病，および乾癬の治療に有用であり得る。
ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合体を含む本発明の抗原結合タンパク質は、自己免疫疾患、例えばＳＬＥ，もしくはＭＳの治療，または癌，例えばＭＭ，もしくはＣＬＬの治療に有用であり得る。
本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の抗原結合タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞の形質移入により産生可能である。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞に対する複製および発現、および／または分泌を制御できる通常の制御配列の操作環境にこれらの抗原結合タンパク質に対するコード配列を置くことにより産生可能である。調節配列には、プロモータ配列，例えば、ＣＭＶプロモータ，および他の既知抗体から得られたシグナル配列が含まれる。
選択された宿主細胞は、ベクターを使って通常の技術により形質移入され、組換えまたは合成重鎖を含む本発明の形質移入した宿主細胞が作られる。この形質移入した細胞は、次に通常の技術により培養され本発明の操作された抗原結合性タンパク質が産生される。抗原結合タンパク質は適切なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡやＲＩＡ、により培養物からスクリーニングされる。同様の通常の技術を採用して、他の抗原結合タンパク質を構築することが可能である。
本方法で採用されたクローニングおよびサブクローニングステップのための適切なベクター、および、本発明の組成物の作成は当業者により選択されうる。例えば、通常のクローニングベクターのｐＵＣシリーズを使用可能である。１つのベクター、ｐＵＣ１９、は市販品で、Ａｍｅｒｓｈａｍ（バッキンガムシャー州，英国）またはＰｈａｒｍａｃｉａ（ウプサラ、スウェーデン）、等のサプライハウスから入手可能である。さらに、容易に複製可能で、多くのクローニングサイトと選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作できる、いずれのベクターもクローニングの目的に使用可能である。従って、クローニングベクターの選択は本発明における制約因子ではない。
また、発現ベクターを、異種のＤＮＡ塩基配列の発現、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、を増幅するための適切な遺伝子により特徴づけることができる。他のベクター配列には、ポリＡシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来の配列、およびβ‐グロビンプロモータ配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）が含まれる。本明細書で使える発現ベクターは、当業者にはよく知られた技術により合成してもよい。
このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン，選択遺伝子，エンハンサー，プロモータ，シグナル配列、等、は市販または天然の入手源から入手してもよく、また、選択宿主中の組換えＤＮＡの生成物の発現および／または分泌の誘導に使用される既知手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌の発現に関する技術分野で既知の多くのタイプがある他の適切な発現ベクターもこの目的に選択してもよい。
また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドを形質移入された細胞株を包含する。これらクローニングベクターのクローニングと他の操作に有用な宿主細胞もまた従来からあるものである。しかし、種々の大腸菌株由来の細胞は、本発明の抗原結合タンパク質作成におけるクローニングベクターや他のステップの複製に使うことができる。
本発明の抗原結合タンパク質の発現のための適切な宿主細胞または細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０，Ｓｐ２／０，ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４），ＣＯＳ，ＨＥＫ，繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３），および骨髄細胞、例えば、これはＣＨＯまたは骨髄細胞中で発現してもよい、が含まれる。ヒト細胞を使って、分子をグリコシレーションパターンで修飾させてもよい。あるいは、他の真核細胞株を採用してもよい。哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換，培養，増幅，スクリーニングと生成物産生および精製の方法は、当業者には既知である。例えば、前述のSambrook et alを参照。
細菌細胞は、組換えＦａｂの発現のため、または本発明の他の実施形態のために適切な宿主細胞として有用であり得る（例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)参照）。しかし、細菌細胞で発現したタンパク質は、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた形式または非グリコシル化形式になる傾向があるため，細菌細胞中で産生されたいずれの組換え抗原結合タンパク質も抗原結合能力の保持の観点でスクリーニングしなければならなくなる。細菌細胞で発現された分子が正しく折り畳まれた形式で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主となるだろう。あるいは、別の実施形態で、分子が細菌宿主中で発現され、引き続き再折り畳みされることが可能である。例えば、発現に使われる種々の大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々の枯草菌、ストレプトマイセス，他の桿菌等の株もまたこの方法に採用できる。
所望の場合は、当業者に既知の酵母細胞株もまた、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエと鱗翅類、およびウイルス発現システムと同様に、宿主細胞として入手可能である。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)、および本明細書に引用の文献を参照のこと。
ベクターが作成される一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要な形質移入方法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するために必要な培養方法、は全て従来からの技術であってもよい。典型的には，本発明の培養方法は無血清培養方法で，通常細胞を無血清懸濁液中で培養する。同様に、本発明の抗原結合タンパク質を一度産生した後、細胞培養内容物を当分野の標準的手法、例えば、硫安塩析法，アフィニティーカラム，カラムクロマトグラフイー，ゲル電気泳動法、等、により精製してもよい。このような技術は、当該分野の技術の範囲内にあり本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製に関しては、WO 99/58679 および WO 96/16990に記載されている。
抗原結合タンパク質のさらに別の発現法では、トランスジェニック動物中での発現を使用してもよい。この例は、U.S. Patent No.4,873,316に記載されている。これは、動物カゼインプロモータを使った発現システムであり、このプロモータは、遺伝子導入で哺乳動物に取り込んだ場合、雌のミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させる。
本発明のさらなる態様では、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法を提供し、この方法は本発明の抗原結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞を培養し、これにより産生された抗原結合タンパク質を回収するステップを含む。
本発明に従って、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）抗原結合性タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを含むベクターを提供するステップと；
（ｂ）哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を前記ベクターで形質転換するステップと；
（ｃ）抗原結合タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養するステップと；
（ｄ）分泌されたステップ（ｄ）の抗原結合タンパク質を回収するステップと、
を含む。
所望の方法で発現された後、抗原結合タンパク質のインビトロ活性を適切なアッセイにより調査する。現在よく使われるＥＬＩＳＡアッセイ方式を採用し、標的に対する抗原結合タンパク質の定性および定量評価を行う。さらに、他のインビトロアッセイを使って、通常のクリアランス機序にも関わらす体の中に残留している抗原結合タンパク質を評価するため実施されるヒトの臨床試験の前に中和性能を確認する。
治療の用量と持続時間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続時間に関係し、治療条件と患者の全体的健康状態に依存して当業者により調節可能である。最大の治療効果を得るためには、長期間にわたる（例えば、４〜６ヶ月間）反復投薬（例えば、週一回または２週間に一回）が、必要となる可能性があることが想定される。
本発明の治療薬の投与方法は、宿主に薬剤を送達する任意の適切なルートであってよい。本発明の抗原結合タンパク質，および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下（ｓ．ｃ．），髄腔内，腹腔内，筋肉内（ｉ．ｍ．），静脈内（ｉ．ｖ．），または鼻腔内の投与に特に有用である。
本発明の治療薬は、有効量の本発明の抗原結合タンパク質を製薬上許容可能なキャリア中の有効成分として含む医薬組成物として調製されてもよい。本発明の予防薬としては、抗原結合タンパク質を含む水性懸濁液または水溶液は、生理的ｐＨに緩衝され注射の準備ができた形としてもよい。非経口投与用組成物は、通常、本発明の抗原結合タンパク質の溶液、または製薬上許容可能なキャリア、例えば水性キャリア、に溶解したそのカクテルを含む。種々の水性キャリアは、例えば、０．９％食塩水，０．３％グリシン，等を用いてもよい。これらの溶液は、無菌状態で、通常、粒子状物質の無い状態にされる。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により無菌にされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされる、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤等のような製薬上許容可能な補助物質を含んでもよい。このような製剤処方での本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、広く変動可能で、すなわち、重量％で約０．５％未満から，通常、約１％または少なくとも約１％、そして１５〜２０％までになり、また、選択された具体的な投与方法に従って流体容量，粘性、等に基づき一次的に選択される。
従って、本発明の筋肉内注射用医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、または、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ，の本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。同様に、本発明の点滴静注用医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液，および約１〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの１ｍｌ当たりのリンゲル液中の本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。非経口投与組成物を調製する実際の方法は既知で、当業者には明らかであり、さらに詳細は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, イーストン，ペンシルベニア州、に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合タンパク質製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci. Tech. today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M. C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers, M. J."Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S."Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922, Ha, E Wang W, Wang Y. j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)、を参照のこと。この全内容は参照により本明細書に組み込まれ、具体的に参照される。
一実施形態では、医薬品として用いる場合、本発明の治療薬はユニット剤形として存在する。適切な治療有効量は当業者には容易に決定可能である。適切な用量は患者の体重により計算され、例えば、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ，例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ，例えば１〜２０ｍｇ／ｋｇ，例えば１０〜２０ｍｇ／ｋｇまたは例えば１〜１５ｍｇ／ｋｇ，例えば１０〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。本発明の有効ヒト治療条件の使用に関して、適切な用量は０．０１〜１０００ｍｇ，例えば０．１〜１０００ｍｇ，例えば０．１〜５００ｍｇ，例えば５００ｍｇ，例えば０．１〜１００ｍｇ，または０．１〜８０ｍｇ，または０．１〜６０ｍｇ，または０．１〜４０ｍｇ，または例えば１〜１００ｍｇ，または１〜５０ｍｇ，の範囲内の本発明の抗原結合タンパク質であってもよく、これらは非経口、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内投与できる。このような用量は、必要なら、医師により選択された適切な時間間隔で反復してもよい。
本明細書記載の抗原結合タンパク質は、貯蔵のための冷凍乾燥が可能で、使用に先立ち適切なキャリア中で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示され、既知技術の凍結乾燥と再構成技術を用いることができる。
当技術分野で既知のいくつかの方法を使って本発明に使われるエピトープ結合ドメインを見つけることが可能である。
用語「ライブラリ」は、ポリペプチドまたは核酸の不均一混合物を指す。ライブラリは、それぞれ単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーからなる。この点で、「ライブラリ」は「レパートリー」と同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、また、核酸のライブラリで形質転換された生命体または細胞の形、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物、等の形であってもよい。一実施例では、それぞれの生命体または細胞は１つのみまたは限られた数のライブラリメンバーを含む。都合のいいことに、核酸によってコードされたポリペプチドを発現させるために核酸が発現ベクターの中に組み込まれる。一態様では、従って、ライブラリは宿主生物の集合体の形を取ることができ、各生命体は、発現して対応するポリペプチドメンバーを産生することが可能な核酸型の単一ライブラリメンバーを含んだ１つまたは複数の発現ベクターのコピーを含む。従って、この宿主生物の集合体は多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“配列s of Proteins of Immunological Interest”, 米国保健社会福祉省）の配列中に保存された抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、またはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋの定義（Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917）によるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。これは、単一フレームワークでも、これらのフレームワークの集合体であってもよく、たとえ高頻度可変領域にのみある変異だったにしても、実質的にいかなる結合特異性の誘導も許容することが認められてきた。
本明細書で定義されたアミノ酸およびヌクレオチド配列の整合性と相同性，類似性または同一性は、一実施形態中で調製され、デフォルトのパラメーターを使ってＢＬＡＳＴ２ 配列アルゴリズムにより測定されている(Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。
ディスプレイシステム（例えば、核酸のコード化機能、および、核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイシステム）が、本明細書記載の方法中で、例えば、ｄＡｂまたは他のエピトープ結合ドメインの選択において、使われた場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことは、好都合なことが多い。これは、本明細書記載の方法や他の適切な方法を使って追加のラウンドのために、あるいは、追加のレパートリー（例えば、親和性成熟レパートリー）を調製するために、十分な量の核酸および／またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な手段を提供する。従って、一部の実施形態では、エピトープ結合ドメイン選択方法は、ディスプレイシステム（例えば、ファージディスプレイのような、核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイ）の使用を含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことをさらに含む。核酸は、任意の適切な方法、例えば、ファージ増幅，細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応、を使って増幅可能である。
一実施例では、この方法は核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたポリペプチドの物理的、化学的、および／または機能的特性にリンクしたディスプレイシステムを用いる。このようなディスプレイシステムは、複数の複写可能な遺伝子パッケージ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｃｋａｇｅ）、例えば、バクテリオファージまたは細胞（細菌）、を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリ、を含んでもよい。バクテリオファージディスプレイはディスプレイシステムの一例である。
多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム（例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステム）が記載されてきた（例えばGriffiths et al., U.S. Patent No. 6,555,313 B1（参照により本明細書に組み込まれる）；Johnson et al., U.S. Patent No. 5,733,743 （参照により本明細書に組み込まれる）； McCafferty et al., U.S. Patent No. 5,969,108 （参照により本明細書に組み込まれる）； Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892 （参照により本明細書に組み込まれる）； Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)、参照)。バクテリオファージディスプレイシステムで提示されたペプチドまたはポリペプチドは、いずれの適切なバクテリオファージ、例えば、線状ファージ（例えば、ｆｄ，Ｍ１３，Ｆ１），溶菌ファージ（例えば、Ｔ４，Ｔ７，ラムダ），またはＲＮＡファージ（例えば、ＭＳ２）、上にも提示可能である。
通常、適切なファージコートタンパク質（例えば、ｆｄ ｐＩＩＩタンパク質）との融合タンパク質としてペプチドまたはファージポリポリペプチドのレパートリーを提示するファージライブラリは、産生されるか提供される。融合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドファージコートタンパク質の先端、または所望なら内部の位置、にペプチドまたはポリペプチドを提示できる。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドは、ｐＩＩＩのアミノ末端からドメイン１まで存在可能である（ｐＩＩＩのドメイン１はＮ１とも呼ばれる）。提示されたポリペプチドは、直接ｐＩＩＩに（例えば、ｐＩＩＩのドメイン１のＮ末端）またはリンカーを使ってｐＩＩＩに融合可能である。所望なら，融合体はタグ（例えば、ｍｙｃエピトープ，Ｈｉｓタグ）をさらに含むこともできる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリは、任意の適切な方法を用いて産生可能である。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドをコードしたファージベクターライブラリやファージミドベクターを、適切な宿主細菌中に導入し、生成した細菌を培養してファージを産生する（例えば、適切なヘルパーファージを使って、または必要ならプラスミドを補完して）。ファージライブラリは、培養物から任意の適切な方法、例えば、沈降法および遠心分離法、により回収可能である。
ディスプレイシステムは任意の所望量の多様性を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むこともできる。例えば、このレパートリーは生命体、生命体のグループ、所望組織または所望細胞型、により発現された自然発生のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むことも、または、無秩序のまたは無秩序化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むこともできる。希望するなら、このポリペプチドは、共通のコアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリ中の全ポリペプチドが、プロテインＡ，プロテインＬ，プロテインＧ，フィブロネクチンドメイン，アンチカリン（アンチカリン），ＣＴＬＡ４，所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ，セルラーゼ），または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド，例えば、抗体または抗体断片（例えば、抗体可変ドメイン）から選択された足場をベースにすることも可能である。このようなレパートリーやライブラリ中のポリペプチドは、無秩序または無秩序化されたアミノ酸配列の規定領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドが所望のタイプ、例えば、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）または所望の抗体の抗原結合性断片（例えば、ヒトＶＨまたはヒトＶＬ）、である。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムはポリペプチドのレパートリーを含み、その中の各ポリペプチドは抗体可変ドメインを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはＶＨ，ＶＬまたはＦｖ（例えば、単鎖Ｆｖ）を含んでもよい。
アミノ酸配列の多様性を、任意の適切な方法を使って、ペプチドまたはポリペプチドまたは足場の任意の所望の領域に導入可能である。例えば、アミノ酸配列の多様性を、標的部位、例えば、任意の適切な変異誘発性（例えば、低忠実性ＰＣＲ，オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的変異，ＮＮＫコドンを使った多様化）または任意の他の適切な方法を使って、多様化ポリペプチドをコードした核酸ライブラリを調製することにより、抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメイン、に導入可能である。所望なら、多様化すべきポリペプチドの領域を無秩序化できる。レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して選択できる問題であり、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。レパートリー中のポリペプチドは、少なくとも三次構造（少なくとも１つのドメインを形成する）を有することができる。
選択／単離／回収
エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合体は、適切な方法を使って、レパートリーまたはライブラリ（例えば、ディスプレイシステム中の）から選択、単離、および／または回収可能である。例えば，ドメインは選択可能な特性（例えば、物理的特性，化学的特性，機能特性）に基づいて選択または単離される。適切な選択可能な特性には、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物活性，例えば，一般的リガンド（例えば、スーパー抗原）に対する結合性，標的リガンド（例えば、抗原，エピトープ，基質）に対する結合性，抗体に対する結合性（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現したエピトープ経由），および触媒能力が含まれる（例えば、Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655参照）。
一部の実施形態では、実質的に全てのドメインが共通の選択可能特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリまたはレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択および／または単離される。例えば、ドメインを、実質的に全てのドメインに共通の一般的リガンドに結合する，共通の標的リガンドに結合する，共通の抗体に結合する（または結合される），または共通の触媒能力を有するライブラリまたはレパートリーから選択することができる。この選択のタイプは、所望の生物活性を有する親のペプチドまたはポリペプチドに基づいたレパートリーまたはドメインを調製する際、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を行う場合、に特に有用である。
共通の一般的リガンドに対する結合性に基づいた選択では、元のライブラリまたはレパートリーの成分である全てまたは実質的に全てのドメイを含むドメインのコレクションまたは集合体が得られる。例えば，標的リガンドまたは一般的リガンドに結合しているドメイン、例えばプロテインＡ，プロテインＬまたは抗体は、パニングまたは適切な親和性マトリックスを使って選択、単離、および／または回収ができる。パニングは、リガンド（例えば、一般的リガンド，標的リガンド）の溶液を適切な容器（例えば、チューブ，ペトリ皿）に加え、リガンドを容器の壁表面上に沈着または被覆させることにより成し遂げられる。過剰リガンドを洗い流し、ドメインを容器に加え、この容器をペプチドまたはポリペプチドが固定化したリガンドと結合するための適切な条件下で維持する。非結合ドメインは、洗い流され、結合ドメインは、任意の適切な方法、例えば、削り取りやｐＨを下げることによって回収できる。
適切なリガンド親和性マトリックスは、通常、固体担体またはビーズ（例えば、アガロース）を含み、これに対しリガンドが共有結合的または非共有結合的に連結される。
親和性マトリックスは、ドメインがマトリックス上のリガンドに結合するための適切な条件下、バッチプロセス，カラムプロセスまたは任意の他の適切なプロセスを使って、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとインキュベートされたレパートリー）と結合させることができる。親和性マトリックスと結合しないドメインを洗い流すことができ、結合したドメインを、低ｐＨバッファー，マイルドな変性剤（例えば、尿素）、またはリガンドとの結合で競合するペプチドまたはドメインで溶出、等の任意の適切な方法で溶出し、回収する。一実施例では、ビオチン化した標的リガンドは、レパートリー中のドメインが標的リガンドに結合するために適切な条件下、レパートリーと結合する。結合ドメインは、固定化したアビジンストレプトアビジン（例えば、ビーズ上の）を使って回収される。
一部の実施形態では、一般的または標的リガンドは、抗体またはその抗体の抗原結合性断片である。ライブラリまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中で実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合断片は、特に一般的リガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの単離，選択および／または回収のためのリガンドとしての使用に適切な抗体と抗原結合性断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の適切な方法で調製できる。
ライブラリ／レパートリー
プロテアーゼエピトープ結合ドメインをコードする、および／または、これを含むライブラリは、任意の適切な方法を使って調製または入手可能である。ライブラリは、目的のドメインまたは足場（例えば、ライブラリから選択されたドメイン）に基づくドメインをコードするように設計することも、または、本明細書記載の方法を使って別のライブラリから選択することも可能である。例えば，ドメインが豊富なライブラリは、適切なポリペプチドディスプレイシステムを使って調整可能である。
所望のタイプのドメインのレパートリーをコードしたライブラリは、任意の適切な方法を使って容易に産生可能である。例えば，所望のタイプのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）をコードした核酸配列を得ることができ、それぞれが１つまたは複数の変異を含む核酸のコレクションが調製できる。例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを使って核酸を増幅することにより、化学的変異誘発により(Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) 、または細菌突然変異誘発株を使って(Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)) 調整可能である。
他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にすることができる。
選択位置を変異させる方法も当業者にはよく知られており、これには、例えば、ＰＣＲを使う場合または使わない場合の、不適正なオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば，合成抗体ライブラリは、抗原結合ループに対する変異を標的にして作られてきた。無秩序または半無秩序抗体Ｈ３およびＬ３領域を、生殖細胞系列免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントに付加して、変異フレームワーク領域を有する大ライブラリが構築されている(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra)。このような多様化は、拡張され、一部または全ての他の抗原結合ループを含むまでになっている(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra)。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にでき、例えば，２段階ＰＣＲ戦略では１回目のＰＣＲ生成物を「メガプライマー（ｍｅｇａ−ｐｒｉｍｅｒ）」として用いる(例えば、Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)参照)。標的の多様化は、例えば、ＳＯＥ ＰＣＲを使っても達成できる(例えば、Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989) 参照)。
選択位置での配列多様性は、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変え、多くのアミノ酸（例えば２０全部またはそのサブセット）をその位置に組み込むことにより得ることができる。ＩＵＰＡＣ命名法を使って説明するが、最も用途の広いコドンは、ＮＮＫであり、これはＴＡＧ停止コドンと同様に全アミノ酸をコードする。ＮＮＫコドンは、必要な多様性を導入するために使用可能である。同じ目的を有する他のコドンＮＮＮも使用でき、これは追加の停止コドンＴＧＡとＴＡＡを作り出す。このような標的化手法は、標的領域中の全配列空間を調査対象にすることができる。
一部のライブラリは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメイン（例えば、抗体またはその一部）を含む。例えば、ライブラリは既知の主鎖構造を有するドメインを含むことができる。（例えば、Tomlinson et al.,WO99/2074９参照）。ライブラリは適切なプラスミドまたはベクター中で調製できる。本明細書で使われるベクターは、異種のＤＮＡを細胞の中に導入し、それの発現および／または複製をするために使われる離散した要素を指す。任意の適切なベクターを使うことができ、これにはプラスミド（例えば、細菌性プラスミド），ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異生成のために使うことができ、または、発現ベクターライブラリの発現を促進するために使うことができる。ベクターおよびプラスミドは、通常１つまたは複数のクローニング部位（例えば、ポリリンカー）、複製開始点、および少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、ポリペプチドの転写と翻訳促進エレメント、例えば、エンハンサー，プロモータ，転写終結信号，シグナル配列，等をさらに含むことができる。これらのエレメントは、このような発現ベクターが、発現に適切な条件下維持された場合（例えば、適切な宿主細胞中で）、ポリペプチドが発現し、産生されるようにポリペプチドをコードしたクローン化挿入断片に作動可能なようにリンクされた状態に配置することが可能である。
クローニングおよび発現ベクターは、通常、１つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターに複製させる核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクター中では，この配列は、ベクターに宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製させ、複製開始点または自己複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、大抵のグラム陰性細菌に対し適切で、２ミクロンプラスミド開始点は、酵母に適切であり、また種々のウイルス開始点（例えば、ＳＶ４０，アデノウイルス）は、哺乳動物細胞中に入れるクローニングベクターに有用である。これらがコス細胞のような高レベル複製が可能な哺乳動物細胞で使われるのでなければ、通常、複製開始点は哺乳類の発現ベクターには必要でない。
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードしている。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その倍地中で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質と他の毒素、例えば、アンピシリン，ネオマイシン，メトトレキサートまたはテトラサイクリン，に耐性を付与し、栄養要求性欠如を補完し，または成長培地中で得られない重要な栄養素を補給する、タンパク質をコードしている。
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことができる。例えば、複製開始点，選択可能マーカー遺伝子，１つまたは複数の発現調節エレメント，例えば、転写調節エレメント（例えば、プロモータ，エンハンサー，ターミネーター）および／または１つまたは複数の翻訳信号，シグナル配列またはリーダー配列，等を含むことができる。発現調節エレメントおよび信号またはリーダー配列は、もしあれば、ベクターまたは他のソースから供給を受けることができる。例えば，抗体鎖をコードしたクローン化核酸の転写および／または翻訳調節配列は、直接発現に使用可能である。
プロモータは、所望の宿主細胞中の発現のために組み込んでもよい。プロモータは、構成的であっても誘導可能であってもよい。例えば，プロモータは、核酸の転写を命令するように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードした核酸に作動可能なようにリンクされてもよい。種々の適切な原核生物用プロモータ（例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータシステム，アルカリフォスファターゼ，トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータシステム，大腸菌用のｌａｃ，Ｔ３，Ｔ７プロモータ）および真核生物（例えば、シミアンウイルス４０初期または後期プロモータ，ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ，サイトメガロウイルスプロモータ，アデノウイルス後期プロモータ，ＥＧ−１ａプロモータ）宿主が入手可能である。
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持している宿主細胞の選択に用いる選択可能マーカー，および，複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードした遺伝子は、共通の選択可能マーカーであり、原核生物（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性），テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン），ｇｐｔ（ミコフェノール酸），アンピシリン，またはヒグロマイシン耐性遺伝子）で使用可能である。ジヒドロ葉還元酵素標識遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートにより選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードした遺伝子（例えば、ＬＥＵ２，ＵＲＡ３，ＨＩＳ３）は、酵母中の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター，および宿主細胞のゲノムに統合可能なベクター，例えば、レトロウイルスベクター、の使用もまた意図されている。
原核生物（例えば、大腸菌等の細菌細胞）または哺乳動物細胞中での発現に適切な発現ベクターには、例えば，ｐＥＴベクター（例えば、ｐＥＴ−１２ａ，ｐＥＴ−３６，ｐＥＴ−３７，ｐＥＴ−３９，ｐＥＴ−４０，Ｎｏｖａｇｅｎ他），ファージベクトル（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＲＩＴ２Ｔ（プロテインＡ融合ベクター，Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＣＤＭ８，ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ，ｐｃＤＮＡ３．１，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐＥＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ，ｐＦＢ，ｐＳＧ５，ｐＸＴ１ (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)),ｐＳＶＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ），ｐＥＦ−Ｂｏｓ(Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) 等、が挙げられる。種々の発現宿主，例えば、原核細胞（大腸菌），昆虫細胞（ショウジョウバエＳｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２細胞，Ｓｆ９），酵母（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳動物細胞（例えば、コス細胞）での使用に適切な発現ベクターが入手可能である。
ベクターの一部の実施例は、ポリペプチドライブラリメンバーに相当するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、一般的および／または標的リガンドによる選択は、ポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により行われる。上述のように、具体的な選択ディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイである。従って、ファージまたはファージミドベクターは使用可能である。例えば、ベクターは大腸菌複製開始点（二本鎖複製用）および、ファージ複製起点（一本鎖ＤＮＡの産生用）を有するファージミドベクターであってもよい。このようなベクターの操作および発現は、当業者にはよく知られている (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra)。簡単に述べれば、ベクターは、ファージミドおよび発現カセット上流のラックプロモータに選択性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、適切なリーダー配列，多重クローニング部位，１つまたは複数のペプチドタグ，１つまたは複数のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩを含むことができる。従って、大腸菌の種々の抑制因子および非抑制因子株を使って、また、グルコース，イソ−プロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（ｉｓｏ−ｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）またはＶＣＳＭ１３等のヘルパーファージを添加して、ベクターは、発現のないプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみ、または産物ファージ（この内の一部はポリペプチド−ｐＩＩＩ融合体で、その表面に少なくとも１つのコピーを含む）、を産生することができる。
抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および／または一般的リガンド結合部位を含んでもよい。特定の実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインＡ，プロテインＬまたはプロテインＧ等のスーパー抗原のための結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン，例えば、ヒトＶＨ（例えば、ＶＨ１ａ，ＶＨ１ｂ，ＶＨ２，ＶＨ３，ＶＨ４，ＶＨ５，ＶＨ６），ヒトＶλ（例えば、Ｖλｌ，Ｖλｌｌ，Ｖλｌｌｌ，ＶλｌＶ，ＶλＶ，ＶλＶＩまたはＶκ１）またはヒトＶＫ（例えば、Ｖκ２，Ｖκ３，Ｖκ４，Ｖκ５，Ｖκ６，Ｖκ７，Ｖκ８，Ｖκ９またはＶκ１０）に基づくものであってもよい。
またさらなる技術カテゴリーには、レパートリーの人工区分への選別が含まれ、これは遺伝子とその遺伝子産物との結びつきを利用する。例えば，所望の遺伝子産物をコードした核酸が、油中水乳剤を使って形成されたマイクロカプセル中で選択可能となる選択システムが、WO99/02671, WO00/40712 および Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードした遺伝因子がマイクロカプセル中に区分けされ、次に、転写、および／または翻訳されてそれぞれの遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をマイクロカプセル内に産生する。引き続き、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子因子が選別される。この手法によって、種々の方法で所望の活性を検出することにより目的の遺伝子産物を選択できる。
エピトープ結合ドメインの解析
ＥＬＩＳＡを含む当業者に周知の方法によって、ドメインのその特異的抗原又はエピトープに対する結合を試験することができる。一例として、結合は、モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて試験される。
ファージＥＬＩＳＡは、任意の適切な手順に従い実施することができ：例示的なプロトコルを下記に記載する。
それぞれの回の選別で生産したファージの集団を、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定するために、選択した抗原又はエピトープに対する結合によりＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。これら集団由来の、単一の感染させたバクテリアのコロニーからのファージをその後、「モノクローナル」ファージ抗体を同定するためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原又はエピトープに結合する可溶性抗体断片のスクリーニングもまた所望され、これもまた、例えばＣ−又はＮ−末端タグに対する試薬を用いたＥＬＩＳＡによって実施することができる（例えばＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２，４３３〜５５及びそこで引用された文献を参照のこと）。
ＰＣＲ産物のゲル電気泳動（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９１，上記；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９４，上記）、プロービング（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６）又はベクターＤＮＡのシークエンスにより、選択したファージモノクローナル抗体の多様性を評価することができる。
ｄＡｂの構造
ｄＡｂが、本明細書に記載したファージディスプレイ技術に用いるために選択したＶ遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは普遍的なフレームワーク領域を含み、そのため、本明細書で定義したような特定の一般的リガンドによって認識されるようになる可能性がある。普遍的なフレームワーク、一般的リガンドなどの使用については国際公開第９９／２０７４９に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列における多様性が可変ドメインの構造的ループ内に局在する場合もある。それぞれの可変ドメインとその相補対との相互作用を高めるために、ＤＮＡシャッフリング又は変異生成によって、いずれの可変ドメインのポリペプチド配列をも変化させてもよい。ＤＮＡシャッフリングは当業者に周知であり、かつ、例えばＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９〜３９１及び米国特許第６，２９７，０５３号に記載され、この両方は引用することにより本明細書に組み入れられる。突然変異生成のその他の方法もまた当業者に周知である。
ｄＡｂ構築物作成における使用のための足場
ｉ．主鎖構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバーは、ポリペプチド鎖については類似した折り畳み部分を共有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列の比較及び結晶学的な構造は予想に反して、６つの抗体の抗原結合ループのうちの５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が限られた数の主鎖構造、又は標準的な構造をとることを明らかにした（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７）。ループ長及び鍵となる残基の解析はさらに、大部分のヒト抗体に見られるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖構造の予測を可能にした（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さ及び構造においてはより多様であるが、ループ及び抗体フレームワークの鍵となる位置における特定の残基の長さ及び存在又は残基の型に依存して、短いループ長においてはＨ３領域もまた限られた数の主鎖構造を形成する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９９：１）。
ｄＡｂはＶＨドメインライブラリ及び／又はＶＬドメインライブラリなどのドメインライブラリから有利に構築される。１つの態様においては、特定のループ長及び鍵となる残基がメンバーの主鎖構造を保証するように選択されてドメインライブラリが設計されることが知られている。都合の良いことに、これらは天然に見られる、上記で議論されたような機能を果たさない可能性を最小限にするための、免疫グロブリンスーパーファミリーの実際の構造である。生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントは、抗体又はＴ細胞受容体ライブラリを構築するための、１つの好適な基礎となるフレームワークとして機能するが、その他の配列もまた役立つ。変異も低頻度で生じ得るが、機能性メンバーの少数が、その機能に影響を及ぼさない程度に変化した主鎖構造を有する可能性がある程度である。
標準的な構造の理論もまた、リガンドによってコードされる異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づく主鎖構造の予測、及び標準的な構造に影響を及ぼさない多様化のための残基の選択のために役立つ。ヒトＶκドメインにおいては、Ｌ１ループは４つの標準的な構造のうちの１つをとることができ、Ｌ２ループは単一の標準的な構造を有し、ヒトＶκドメインの９０％がＬ３ループにおける５つの標準的な構造のうちの１つをとることができることが知られている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）上記）；従って、Ｖκドメインのみにおいては、異なる種類の主鎖構造を作り出すために、異なる標準的な構造が結合することが可能である。ＶλドメインがＬ１、Ｌ２及びＬ３ループの異なる種類の標準的な構造をコードするし、Ｖκ及びＶλドメインがＨ１及びＨ２ループの複数の標準的な構造をコードする任意のＶＨドメインと対合することが可能な場合には、これら５つのループで見られる標準的な構造な組み合わせの数は非常に多くなる。このことは、様々な種類の結合特異性を生産するためには、主鎖構造の多様性の生成が必須である可能性を意味する。しかしながら、予想に反し、見いだされた単一の既知の主鎖構造に基づいて抗体ライブラリを構築することにより、実質的に全ての抗原を標的とするための十分な多様性の生成のためには主鎖構造における多様性は必要とされない。さらに驚くべきことに、単一の主鎖構造はコンセンサス構造である必要もなく、単一の天然に生じる構造を全ライブラリの基礎として用いることが可能である。従って、一つの特定の態様においては、ｄＡｂは単一の既知の主鎖構造を有する。
選択された単一の主鎖構造が、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子間ではありふれたものになってもよい。その構造をとる十分な数の天然に生じる分子が観察される場合、その構造はありふれたものとなる。従って、１つの態様においては、天然に生じる免疫グロブリンドメインのそれぞれの結合ループの異なる主鎖構造は個別に検討され、その後、異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせを有する、天然に生じる可変ドメインが選択される。何も得られかった場合には、最も近似した等価物を選択することができる。異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせは、所望の主鎖構造をコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作出することができる。一例として、選択した生殖細胞系遺伝子セグメントは、天然にしばしば発現し、特に、それらは全ての天然の生殖細胞系遺伝子セグメント中で最も頻繁に発現するものであってもよい。
ライブラリの設計においては、６つの抗原結合ループそれぞれの異なる主鎖構造の頻度を個別に検討してもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３においては、２０％から１００％の範囲で天然に生じる分子の抗原結合ループを構成する、指定された構造が選択される。典型的には、その観察される頻度は３５％を超え（すなわち３５％から１００％の間）、そして理想的には、５０％を超える、又は６５％を超えさえもする。Ｈ３ループの大部分が標準的な構造を有さないため、標準的な構造を示す、それらのループ間でありふれた主鎖構造を選択することが好ましい。ループのそれぞれにおいては、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造がされに選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループにおける、最も一般的な標準的な構造（ＣＳ）は以下の通りである：Ｈ１−ＣＳ１（発現レパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ３（４６％）、Ｌ１−ＶκのＣＳ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ１（１００％）、Ｌ３−ＶκのＣＳ１（３６％）（計算はκ：λ率が７０：３０であるとみなす。Ｈｏｏｄｅｔ ａｌ．（１９６７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４８：１３３）。標準的な構造を有するＨ３ループについては、９４番の残基から１０１番の残基である、塩橋を有する７つの残基のＣＤＲ３の長さ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）配列ｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ及びＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が最も一般的であることが見いだされた。ＥＭＢＬデータライブラリには、この構造を形成するために必要とされる長さのＨ３及び鍵となる残基を有するヒト抗体配列が少なくとも１６あり、及びタンパク質データバンク中には、抗体モデリングの基礎として使用可能な少なくとも２つの結晶学的な構造が存在する（２ｃｇｒ及び１ｔｅｔ）。最も頻繁に発現する生殖細胞系遺伝子セグメントの標準的な構造の組み合わせは、ＶＨセグメント３−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、ＶκセグメントＯ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）及びＪκセグメントＪκ１である。ＶＨセグメントＤＰ４５及びＤＰ３８もまた適している。これらのセグメントをさらに、所望の単一の主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として、組み合わせることによって使用することができる。
また別の方法としては、単離において、それぞれの結合ループの天然に生じる異なる主鎖構造に基づいて単一の主鎖構造を選択する代わりに、天然に生じる主鎖構造の組み合わせが単一の主鎖構造を選択するための基礎として使用される。抗体の場合には、例えば、任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つの抗原結合ループの天然に生じる標準的な構造の組み合わせを決定することができる。ここで、選択される構造は天然に生じる抗体においてありふれたものであってもよく、かつ、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであってもよい。従って、ヒト抗体においては、例えば、５つの抗原結合ループであるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の天然の組み合わせについて検討する場合には、最も頻繁にみられる標準的な構造の組み合わせを決定し、その後、単一の主鎖構造を選択するための基礎として、Ｈ３ループにおける最も一般的な構造と組み合わせる。
標準的な配列の多様化
選択された複数の既知の主鎖構造又は単一の既知の主鎖構造を有することから、構造的及び／又は機能的多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を多様にすることにより、ｄＡｂを構築することができる。このことは、それらがそれらの構造及び／又それらの機能において十分な多様性を有するように変異が生成され、幅のある活性を提供することができることを意味する。
所望の多様性は、典型的には、１つ以上の位置において選択した分子を多様化することにより生成される。変化させる位置は、ランダムに選ぶこともでき、又は選択してもよい。多様化はその後、非常に膨大な数の変異を生成する、在住アミノ酸を任意のアミノ酸又は、天然若しくは合成のそのアナログにより置換すること、又は限定数の変異を生成する、在住のアミノ酸を１つ以上の定義されたアミノ酸サブセットにより置換する、ランダム化によって達成できる。
それらの変異を導入する様々な方法が報告されている。分子をコードする遺伝子中にランダムな突然変異を導入するためには、変異性ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９）、化学的突然変異生成（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：９５３３）又はバクテリアの突然変異誘発遺伝子株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：３５９）を用いることができる。選択した位置に変異を導入するための方法も当該分野においては周知であり、これらにはＰＣＲの使用を介した又は介さない、ミスマッチオリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば、複数の合成抗体ライブラリが抗原結合ループに対するターゲティング突然変異によって作出された。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域が、新しい種類の結合特性を作出するためにランダム化された（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７）。変異のないフレームワーク領域を有する巨大ライブラリを生産するために、Ｈ３及びＬ３領域のランダム化又はセミランダム化が生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントに付加された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．，１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯＪ．，１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８：９７）。それらの変異は、いくつか又は全てのその他の抗原結合ループを含むように拡大された（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，国際公開第９７／０８３２０号，上記）。
ループランダム化はＨ３のみに対しては約１０１５を超える構造を作出し、その他の５つのループについても類似した数の変異を生成する可能性があるため、全ての可能な組み合わせを発現するライブラリを構築するために現在の形質転換技術を用いること、又は無細胞系を用いることさえも適してはいない。例えば、これまでに構築された最も巨大なライブラリのうちの１つにおいては、この設計のライブラリにおいて可能な多様性のただ１つの画分である、６ｘ１０１０の異なる抗体が生成された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）上記）。
１つの実施形態においては、分子の所望の機能を作出する又は変化させることに直接含まれるそれらの残基のみが多様化される。多くの分子においては、その機能は標的に結合することであり、さらに、分子の全体のパッキング又は選択した主鎖構造の維持に重要な残基を変化させることを避けるために、多様性は標的結合部位に集中させる必要がある。
１つの態様においては、抗原結合部位におけるそれらの残基のみが多様化されたｄＡｂライブラリが使用される。これらの残基は特にヒト抗体レパートリーにおいて多様であり、かつ、高品質な抗体／抗原複合体と結合することが知られている。例えば、Ｌ２においては、天然に生じる抗体の５０及び５３番目の位置が変化すると抗原と結合することが観察されることが知られている。反対に、ライブラリにおいては２つが変化したのに対し、標準的な方法では、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１、上記）によって定義された複数の７残基である、相当する相補性決定領域（ＣＤＲ１）における全ての残基を多様化させただろう。このことは、幅のある抗原結合特性を作出するためには、機能的な多様性に関する十分な改良が必要とされることを示す。
天然においては、抗体の多様性は、ナイーブ初代レパートリーを作出するための生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの体細胞組換え（いわゆる生殖細胞系及び接合多様性）、並びに生じた再構成Ｖ遺伝子の体細胞超変異の、２つの過程の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初代レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中心に集中していること、一方で体細胞超変異は初代レパートリーにおいて高度に保存される抗原結合部位の末端の領域にまで多様性を広げることが示された（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：８１３を参照のこと）。この相補性はおそらく配列間隔を検索するための効果的な方法として発展し、そして明かに抗体に特有ではあるが、その他のポリペプチドレパートリーに対しても容易に適用することができる。多様化した残基は、標的への結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における異なる（重複を含む）残基のサブセットは、必要に応じて選択の異なる段階において多様化される。
抗体レパートリーの例においては、初代「ナイーブ」レパートリーは抗原結合部位のいくつかの、しかし全てではない、残基が多様化された場合に作出される。この文脈で本明細書で使用される場合、「ナイーブ」又は「ダミー」という用語は、予め決められた標的を有しない抗体分子を意味する。これらの分子は、多様な抗原刺激に曝されていない胎児及び新生児患者の場合と同様に、免疫多様化を受けていない患者の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子に類似する。このレパートリーはその後、抗原又はエピトープの種類によって選択される。必要に応じて、さらなる多様性をその後、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟したレパートリーを改変した機能、特異性又は親和性によって選択することができる。
本明細書において記載された配列は、実質的に同一な配列、例えば少なくとも９０％同一な配列、本明細書で記載された配列と例えば少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一な配列を含むことを理解されたい。
核酸については、「実質的な同一性」という用語は、２つの核酸又はその示された配列を、最適にアライン又は比較した場合に、適切なヌクレオチドの挿入又は欠損を含めて、少なくとも約８０％のヌクレオチドが、通常は少なくとも約９０％から９５％、例えば、少なくとも約９８％から９９．５％のヌクレオチドが同一であることを示す。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列については、「同一」という用語は、適切な挿入又は欠損を含めて最適にアライン及び比較した場合の２つの核酸又はアミノ酸配列の同一性の度合いを意味する。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でＤＮＡセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。
２つの配列間の同一性のパーセンテージは、その２つの配列を最適にアライメントするために導入することが必要とされるギャップ及びそれぞれのギャップの長さを考慮した、その配列が共有している同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／全位置の数ｘ１００）。２つの配列間の配列の比較及び同一性のパーセンテージの決定は、以下の限定しない実施例に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びに４０、５０、６０、７０、又は８０のギャップウェート及び１、２、３、４、５、又は６の長さウェートを使用してＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージもまたＡＬＩＧＮｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェート残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージはＧＣＧソフトウェア中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウェートと１、２、３、４、５、又は６の長さウェートを使用して決定することができる。
一例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号３３の参照配列と１００％同一であってもよく、又は特定の整数までのヌクレオチド変異を、参照配列と比較して、含んでいてもよい。それらの変異は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、転移およびトランスバージョンを含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変異は、参照配列若しくは参照配列中の１つ以上の隣接したグループのヌクレオチド中に個別に散在して、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。ヌクレオチド変異の数は、配列番号３３中のヌクレオチドの総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ（１００で割る）とを掛け、その後、配列番号３３中の前記ヌクレオチドの総数から得られた数値を引くことによって決定する、又は：
Figure 2012527875
であり、
式中ｎｎはヌクレオチド変異の数、ｘｎは配列番号３３中のヌクレオチドの総数、及びｙは、５０％の場合には０．５０、６０％の場合には０．６０、７０％の場合には０．７０、８０％の場合には０．８０、８５％の場合には０．８５、９０％の場合には０．９０、９５％の場合には０．９５、９７％の場合には０．９７または１００％の場合には１．００であり、ならびにここでｘａ及びｙの数値がいずれの整数でもない場合には、ｘｎから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。配列番号３３のポリヌクレオチド配列の変異は、このコード配列においてナンセンス，ミスセンスまたはフレームシフト変異を生成させ、よって、このような変異後のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを変異させ得る。
同様に、別の例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号３０によってコードされる参照配列と１００％同一であってもよく、又は同一性のパーセンテージが１００％未満になるような特定の整数までのアミノ酸変異を、参照配列と比較して、含んでいてもよい。それらの変異は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、保存置換及び非保存置換を含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変異は、参照配列若しくは参照配列中の１つ以上の隣接したグループのアミノ酸中に個別に散在して、参照ポリペプチド配列のアミノ−又はカルボキシ−末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。指定された同一性のパーセンテージにおけるアミノ酸変異の数は、配列番号３０によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ（１００で割る）とを掛け、その後、配列番号３０によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の数から得られた数値を引くことによって決定する、又は：
Figure 2012527875
であり、
式中ｎａはアミノ酸変異の数、ｘａは配列番号３０によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数、及びｙは、例えば７０％の場合には０．７０、８０％の場合には０．８０、８５％の場合には０．８５などであり、並びにここでｘａ及びｙの数値がいずれの整数でもない場合には、ｘａから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。
実施例１−ＧＳリンカーを介して抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンに融合させたＣＴＬＡ４−Ｉｇの設計及び構築
ＣＴＬＡ４−Ｉｇをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（Ｎ末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＣ末端のＢａｍＨＩ部位をクローニングを容易にするために包含させた）を構築し、ＣＴ０１アドネクチンを含むほ乳動物発現ベクターにクローン化させた。このことは、アドネクチンがＧＳリンカーを介してＣＴＬＡ４−ＩｇのＣ末端に融合することを可能にした。得られた抗原結合タンパク質は、ＢＰＣ１８２１と命名した。ＢＰＣ１８２１のＤＮＡおよびタンパク質配列を、配列番号３３および２３で、それぞれ、与える。
ＢＰＣ１８２１をコードしている発現プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中に一過的にトランスフェクトした。２４時間後、細胞培養に栄養としてトリプトンを添加し、９６時間後に上清を回収した。ＢＰＣ１８２１をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて精製し、結合アッセイで試験した。
実施例２−ＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル高結合プレートを、ＰＢＳ中の０．４μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦＲ２Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３５７−ＫＤ−０５０）でコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水で２回洗った。２００μＬのブロッキング溶液（ＤＰＢＳ緩衝液中に５％ＢＳＡ）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、再び洗いの工程を行った。ＢＰＣ１８２１及び２つのネガティブコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ Ｉ５１５４および二重特異性ＩＧＦ１Ｒ−ＶＥＧＦＲ２抗原結合構築物ＢＰＣ１８０１）を、プレートにわたり、ブロッキング溶液中で連続して希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを洗った。組換えヒトＢ７−１Ｆｃキメラ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１４０−Ｂ１−１００）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＥＣＬ ビオチン化モジュールを用いて、ビオチン化した。ビオチン化Ｂ７−１をブロッキング溶液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間インキュベートし、その後洗った。Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２８８６）をブロッキング溶液中で１０００倍に希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。再度洗いの工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
図１はＥＬＩＳＡの結果を示し、そして二重特異性ＢＰＣ１８２１がＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方と結合することを確認した。ネガティブコントロール抗体はＶＥＧＦＲ２およびＢ７−１の両方に対する結合を示さない。
実施例３および４は予測上のものであることに注意されたい。これらは本発明の抗原結合タンパク質を試験することができる追加のアッセイを実施するためのガイダンスを提供する。
実施例３−ＶＥＧＦ受容体結合アッセイ
このアッセイは、ＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ Ｒ２（ＶＥＧＦ受容体）への結合および試験分子がこの相互作用をブロックする能力を測定する。ＥＬＩＳＡプレートを一晩中、ＶＥＧＦ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ Ｎｏ：３５７−ＫＤ−０５０）（０．２Ｍ炭酸ナトリウム重炭酸塩、ｐＨ９．４中、０．５μｇ／ｍｌ最終濃度）でコーティングし、洗浄し、ＰＢＳ中の２％ ＢＳＡでブロックする。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ Ｎｏ：２９３−ＶＥ−０５０）。試験分子（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡにおいて希釈）をＶＥＧＦと共に、１時間プレインキュベートし、その後、プレートに添加する（３ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ最終濃度）。ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合を、ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（０．５μｇ／ｍｌ最終濃度）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ Ｎｏ：ＢＡＦ２９３）およびペルオキシダーゼ結合型抗ビオチン二次抗体（１：５０００希釈）（Ｓｔｒａｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ：２００−０３２−０９６）を用いて検出し、等量の１Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた後、発色基質（Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質，ＫＰＬ）を用いてＯＤ４５０で可視化させる。
実施例４−受容体−Ｆｃ二重特異性抗体の化学量論性評価（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を用いる）
抗ヒトＩｇＧを、最初にアミンカップリングによってＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化する。単一の濃度の受容体−Ｆｃ融合体およびエピトープ結合ドメインのためのリガンドを通過させた後に、エピトープ結合ドメインに融合させた受容体−Ｆｃをこの表面上に捕捉することができる。この濃度は、結合表面及び観察される結合シグナルを最大のＲ−ｍａｘに達するまで飽和させるのに十分な濃度である。化学量をその後、下記の式を用いて算出することができる：
Figure 2012527875
同時に１を超える被分析物の結合について化学量を算出する場合には、飽和リガンド濃度の異なるリガンドを順番に通過させ、その後上述の通りに化学量を算出した。この試験はＢＩＡｃｏｒｅ（例えばＢｉａｃｏｒｅ３０００またはＴ１００）を利用し、典型的にはＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを用いて２５℃で行う。
実施例５−ＧＳリンカーを介して抗ＩＬ−１３ ｄＡｂまたは抗ＶＥＧＦ ｄＡｂのいずれかに融合させたＣＴＬＡ４−Ｉｇの設計および構築
抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンに融合されたＣＴＬＡ４−Ｉｇを含むＤＮＡプラスミドを、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＩＬ−１３ ｄＡｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ二重特異体を構築するためにベースプラスミドとして使用した。ベクターはベースプラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化させ、アドネクチン配列を除去することにより調製した。抗ＩＬ−１３ ｄＡｂおよび抗ＶＥＧＦ ｄＡｂをコードするＤＮＡ配列をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限し、ベクターに連結させた。得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＩＬ−１３ ｄＡｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ二重特異体を、それぞれ、ＢＰＣ１８２４およびＢＰＣ１８２５と命名し、どちら場合も、ｄＡｂは、ＣＴＬＡ４−ＩｇのＣ末端にＧＳリンカーを介して融合させた。ＢＰＣ１８２４およびＢＰＣ１８２５のＤＮＡおよびタンパク質配列を、配列番号２７，２９，３４および３５で、それぞれ、与える。
ＢＰＣ１８２４およびＢＰＣ１８２５をコードしている発現プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中に一過的にトランスフェクトした。２４時間後、各細胞培養に栄養としてトリプトンを添加し、９６時間後に上清を回収した。上清を結合アッセイで被験物質として使用した。
実施例６−ＩＬ−１３およびＢ７−１結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル高結合プレートを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３（室内材料）でコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水で２回洗った。２００μＬのブロッキング溶液（ＤＰＢＳ緩衝液中に５％ＢＳＡ）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、再び洗いの工程を行った。ＢＰＣ１８２４及び２つのネガティブコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ Ｉ５１５４およびＢＰＣ１８２５）を、プレートにわたり、ブロッキング溶液中で連続して希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを洗った。組換えヒトＢ７−１Ｆｃキメラ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１４０−Ｂ１−１００）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＥＣＬビオチン化モジュールを用いて、ビオチン化した。ビオチン化Ｂ７−１をブロッキング溶液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間インキュベートし、その後洗った。Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２８８６）をブロッキング溶液中で１０００倍に希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。再度洗いの工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を読み取った。
図２はＥＬＩＳＡの結果を示し、そして二重特異性ＢＰＣ１８２４がＩＬ−１３およびＢ７−１の両方と結合することを確認した。ネガティブコントロール抗体はＩＬ−１３およびＢ７−１の両方に対する結合を示さない。
実施例７−ＶＥＧＦおよびＢ７−１結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル高結合プレートを、ＰＢＳ中の０．４μｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ１６５（室内材料）でコーティングし、４℃で一晩保存した。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水で２回洗った。２００μＬのブロッキング溶液（ＤＰＢＳ緩衝液中に５％ＢＳＡ）をそれぞれのウェルに加え、そしてこのプレートを室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、再び洗いの工程を行った。ＢＰＣ１８２５及び２つのネガティブコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ Ｉ５１５４およびＢＰＣ１８２４）を、プレートにわたり、ブロッキング溶液中で連続して希釈した。１時間インキュベートした後、プレートを洗った。組換えヒトＢ７−１Ｆｃキメラ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１４０−Ｂ１−１００）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＥＣＬビオチン化モジュールを用いて、ビオチン化した。ビオチン化Ｂ７−１をブロッキング溶液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。プレートを１時間インキュベートし、その後洗った。Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２８８６）をブロッキング溶液中で１０００倍に希釈し、そして５０μＬをそれぞれのウェルに加えた。再度洗いの工程を行った後、５０μｌのＯＰＤ ＳｉｇｍａＦａｓｔ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、そして１５分後に、２５μＬの３Ｍ硫酸を加えることによって反応を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用し、標準的なエンドポイントプロトコールを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
図３はＥＬＩＳＡの結果を示し、そして二重特異性ＢＰＣ１８２５がＶＥＧＦおよびＢ７−１の両方と結合することを確認した。ネガティブコントロール抗体はＶＥＧＦおよびＢ７−１の両方に対する結合を示さない。
実施例８
ＳＴＧまたはＴＶＡＡＰＰＳＴＧリンカーを介してＶＥＧＦ ｄＡｂに融合させたＴＮＦα受容体−Ｆｃ融合体の設計及び構築
ヒトＴＮＦα受容体−Ｆｃ融合体（エタネルセプト）をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を構築し、別の構築物由来のＤＯＭ１５−２６−５９３抗ＶＥＧＦ ｄＡｂと共に、ほ乳動物発現ベクター（ｐＴＴ５）にクローン化させた。
受容体Ｆｃを、Ｎ末端 Ｃａｍｐａｔｈ１シグナルペプチドを提供する追加の配列と隣接させ、ＳＴＧリンカーまたはＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＧリンカーのいずれかをＣ末端にｄＡｂへの融合のために提供した。隣接配列はＡｇｅＩ制限部位およびＳａＩＩ制限部位を含み、ｄＡｂを有するベクターへのクローニングを容易にした。得られた抗原結合タンパク質を、それぞれ、ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３と命名した。ＥｔａｎＳＴＧ５９３のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ、配列番号３７および３８で、ＥｔａｎＴＶ４５９３３のＤＮＡおよびタンパク質配列を、それぞれ、配列番号３９および４０で与える。
実施例９
ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３精製ならびにＶＥＧＦおよびＴＮＦα結合分析
ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３プラスミドを独立して、トランスフェクションのために、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）において発現させた。５日後、ＥｔａｎＳＴＧ５９３およびＥｔａｎＴＶ４５９３を回収し、ＭＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、バッチ試料Ｍ４００４およびＭ４００５をそれぞれ、得た。タンパク質を、Ｆ１緩衝液（０．１Ｍ クエン酸塩 ｐＨ６，１０％ ＰＥＧ３００，５％スクロース）またはＥＴ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，４％ Ｄ−マンニトール，１％スクロース）中で製剤化した。タンパク質をさらに、サイズ排除クロマトグラフィーによりＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製し、凝集体のレベルを減少させた。
結合分析を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ ＴＭ）上で実施した。タンパク質Ａを、最初にアミンカップリングによりＧＬＭチップ上に固定した。試験する構築物を、このタンパク質Ａ表面上に捕捉させた。被分析物、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦを２５６ｎＭ，６４ｎＭ，１６ｎＭ，４ｎＭおよび１ｎＭで使用した。０ｎＭ（すなわち、緩衝液のみ）ＴＮＦαおよびＶＥＧＦを使用して、規準結合曲線を倍増させた。
ＰｒｏｔｅＯｎの新規６×６フローセルセットアップは、６つまでの構築物を同時に捕捉させることを可能にし、また、６つの濃度の被分析物を捕捉された抗体上に流すことを可能にし、全部で、１サイクルあたり３６の相互作用が発生する。
タンパク質Ａ表面を再生するために、５０ｍＭ ＮａＯＨを使用し、これにより捕捉された構築物（複数可）を除去し、別の捕捉および結合サイクルを開始させることができた。得られたデータをＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアに固有の１：１モデルにフィッティングさせた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用い、２５℃の温度で実施した。
Figure 2012527875
Figure 2012527875
Figure 2012527875
Figure 2012527875
配列番号１−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ由来のＣＴＬＡ４領域
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱ
配列番号２−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ由来のＣＴＬＡ４ Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙバージョ
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＹＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＥＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱ
配列番号３−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ由来のＦｃ領域
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４−シグナルペプチド配列例
ＭＧＶＬＬＴＱＲＴＬＬＳＬＶＬＡＬＬＦＰＳＭＡＳＭＡ
配列番号５−シグナルペプチド配列例
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ
配列番号６−抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチン
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ
配列番号７−抗ＴＮＦαアドネクチン
ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＴＨＮＡＹＮＧＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＲＥＦＴＶＰＨＰＥＶＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＤＴＩＴＶＹＡＶＴＮＨＨＭＰＬＲＩＦＧＰＩＳＩＮＨＲＴ
配列番号８−抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎ
ＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＫＤＥＹＧＬＴＰＬＹＬＡＴＡＨＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＮＧＡＤＶＮＡＶＤＡＩＧＦＴＰＬＨＬＡＡＦＩＧＨＬＥＩＡＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＧＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬ
配列番号９−抗ＶＥＧＦアンチカリン
ＤＧＧＧＩＲＲＳＭＳＧＴＷＹＬＫＡＭＴＶＤＲＥＦＰＥＭＮＬＥＳＶＴＰＭＴＬＴＬＬＫＧＨＮＬＥＡＫＶＴＭＬＩＳＧＲＣＱＥＶＫＡＶＬＧＲＴＫＥＲＫＫＹＴＡＤＧＧＫＨＶＡＹＩＩＰＳＡＶＲＤＨＶＩＦＹＳＥＧＱＬＨＧＫＰＶＲＧＶＫＬＶＧＲＤＰＫＮＮＬＥＡＬＥＤＦＥＫＡＡＧＡＲＧＬＳＴＥＳＩＬＩＰＲＱＳＥＴＣＳＰＧ
配列番号１０−抗Ｈｅｒ２アフィボディ
ＶＤＮＫＦＮＫＥＬＲＱＡＹＷＥＩＱＡＬＰＮＬＮＷＴＱＳＲＡＦＩＲＳＬＹＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１−ラクダＶＨＨ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＡＹＴＹＩＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＡＭＤＳＧＧＧＧＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＫＧＫＮＴＶＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＴＹＹＣＡＡＧＧＹＥＬＲＤＲＴＹＧＱＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１２−抗ＨＥＬサメＮＡＲＶ
ＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＡＳＹＡＬＧＳＴＣＷＹＲＫＫＳＧＥＧＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＬＧＶＡＧＧＹＣＤＹＡＬＣＳＳＲＹＡＥＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮ
配列番号１３−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ ＤＯＭ１５−２６−５９３
ＥＶＱＬＬＶＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＫＡＹＰＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＳＰＳＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＰＲＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１４＝抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ ＤＯＭ１０−５３−６１６
ＧＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＶＦＰＷＹＤＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＤＷＨＧＫＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＥＤＥＰＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１５＝Ｇ４Ｓリンカー
ＧＧＧＧＳ
配列番号１６＝リンカー
ＴＶＡＡＰＳ
配列番号１７＝リンカー
ＡＳＴＫＧＰＴ
配列番号１８＝リンカー
ＡＳＴＫＧＰＳ
配列番号１９−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙバージョン
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＹＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＥＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２１−ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＱＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２−ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合体
ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＬＳＱＥＩＨＡＥＬＲＲＦＲＲＡＭＲＳＣＰＥＥＱＹＷＤＰＬＬＧＴＣＭＳＣＫＴＩＣＮＨＱＳＱＲＴＣＡＡＦＣＲＳＬＳＣＲＫＥＱＧＫＦＹＤＨＬＬＲＤＣＩＳＣＡＳＩＣＧＱＨＰＫＱＣＡＹＦＣＥＮＫＬＲＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦＲ２ アドネクチンのタンパク質配列（ＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ
配列番号２４−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチン（ＴＶＡＡＰＳＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＴＶＡＡＰＳＧＳＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ
配列番号２５−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＴＮＦαアドネクチン（ＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＴＨＮＡＹＮＧＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＲＥＦＴＶＰＨＰＥＶＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＤＴＩＴＶＹＡＶＴＮＨＨＭＰＬＲＩＦＧＰＩＳＩＮＨＲＴ
配列番号２６−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＴＮＦαアドネクチン（ＴＶＡＡＰＳＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＴＶＡＡＰＳＧＳＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＴＨＮＡＹＮＧＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＲＥＦＴＶＰＨＰＥＶＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＤＴＩＴＶＹＡＶＴＮＨＨＭＰＬＲＩＦＧＰＩＳＩＮＨＲＴ
配列番号２７−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＥＶＱＬＬＶＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＫＡＹＰＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＳＰＳＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＰＲＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２８−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ（ＴＶＡＡＰＳＧＳリンカー）
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配列番号２９−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ（ＧＳリンカー）
ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＧＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＶＦＰＷＹＤＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＤＷＨＧＫＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＥＤＥＰＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３０−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ（ＴＶＡＡＰＳＧＳリンカー）
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配列番号３１−リンカー
ＧＳ
配列番号３２−リンカー
ＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号３３ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦＲ２アドネクチンのＤＮＡ配列（ＧＳリンカー）
ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣ
配列番号３４−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＩＬ−１３ ｄＡｂのＤＮＡ配列（ＧＳリンカー）
ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号３５−ＣＴＬＡ４−Ｉｇ−抗ＶＥＧＦ ｄＡｂのＤＮＡ配列（ＧＳリンカー）
ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号３６−ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体の別の配列
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３７
ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号３８
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＳＴＧＥＶＱＬＬＶＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＫＡＹＰＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＳＰＳＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＰＲＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３９
ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号４０
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＧＥＶＱＬＬＶＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＫＡＹＰＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＥＩＳＰＳＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＰＲＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４１
ＧＳＴＶＡＡＰＳ
配列番号４２
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４３
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４４
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４５
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４６
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４７
ＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４８
ＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＧＳ
配列番号４９
ＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＴＶＡＡＰＳＧＳ

Claims (27)

  1. １つ以上のエピトープ結合ドメインに連結した受容体−Ｆｃ融合体を含む抗原結合タンパク質。
  2. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがヒトｄＡｂである、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがラクダ科ＶＨＨ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはサメ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＮＡＲＶ）である、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  5. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインが、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）；リポカリン；プロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子；ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ型ドメイン；並びにフィブロネクチン（アドネクチン）より選択される非Ｉｇドメインから選択される足場に由来する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  6. 前記エピトープ結合ドメインがＡｆｆｉｂｏｄｙ、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）及びアドネクチンより選択される足場に由来する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
  7. 前記結合タンパク質が２以上の抗原に対する特異性を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  8. 前記受容体−Ｆｃ融合体がＣＴＬＡ−４−Ｉｇを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  9. 前記受容体−Ｆｃ融合体がＴＮＦＲ２−Ｉｇを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  10. 前記受容体−Ｆｃ融合体がＴＡＣＩ−Ｉｇを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  11. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ２に結合可能な、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  12. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＴＮＦαに結合可能な、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  13. 少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＨＥＲ２に結合可能な、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  14. 少なくとも１つの前記エピトープ結合ドメインが１〜１５０のアミノ酸を含むリンカーを介して前記受容体−Ｆｃ融合体に直接連結される、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  15. 少なくとも１つの前記エピトープ結合ドメインが１〜２０のアミノ酸を含むリンカーを介して前記受容体−Ｆｃ融合体に直接連結される、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
  16. 少なくとも１つの前記エピトープ結合ドメインが配列番号１５〜１９、配列番号３１〜３２に記載のいずれか１つ、又はそれらの任意の複合もしくは組み合わせより選択されたリンカーを介して前記受容体−Ｆｃ融合体に直接連結される、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
  17. 少なくとも１つの前記エピトープ結合ドメインがヒト血清アルブミンに結合する、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  18. 前記受容体−Ｆｃ融合体のＮ末端に結合したエピトープ結合ドメインを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  19. 前記受容体−Ｆｃ融合体のＣ末端に結合したエピトープ結合ドメインを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  20. 請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
  21. 請求項１〜２０のいずれかに記載の抗原結合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む、形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞を培養する工程及び前記抗原結合タンパク質を単離する工程を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質の生産方法。
  23. 請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  24. 医薬において使用するための請求項１〜２３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  25. 免疫疾患、例えば自己免疫疾患、または癌、または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、クローン病、乾癬、または関節炎疾患、例えば関節リウマチの治療薬の製造に使用するための、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
  26. 免疫疾患、例えば自己免疫疾患、または癌、または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、クローン病、乾癬、または関節炎疾患、例えば関節リウマチの患者を治療する方法であって、治療量の、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質を投与することを含む、方法。
  27. 免疫疾患、例えば自己免疫疾患、または癌、または炎症性疾患、例えば全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、クローン病、乾癬、または関節炎疾患、例えば関節リウマチの治療のための、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
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