KR20140014072A

KR20140014072A - 콜키시노이드 화합물의 미생물학적 생물전환 방법

Info

Publication number: KR20140014072A
Application number: KR1020137010179A
Authority: KR
Inventors: 크리쉬나무르씨 프라바카란; 산카라수브라마니안 카나가벨라잔; 날라사미 모하나순다람 칸나마푸람; 아이야프판 하리하란 코다카라크카란; 브히마라쥬 포리세티
Original assignee: 엘리시안 라이프 사이언스이즈 프라이빗 리미티드
Priority date: 2010-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2014-02-05
Also published as: EP2619315A2; US20140024080A1; WO2012038982A3; WO2012038982A2; US8795986B2

Abstract

본 발명은 선택적 미생물인 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하여 콜키시노이드 화합물인 티오콜키시신의 이의 글리코실화된 형태로의 생물-전환 방법에 관한 것이다. 티오콜키신(TCN)의 이의 대응하는 3-O-글리코실 유도체로의 미생물학적 생물-전환을 위한 박테리아 균주 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 뿐만 아니라 콜키신, 티오콜키신, 3-데메틸콜키신, 3-데메틸티오콜키신 및 N-데아세틸티오콜키신과 같은 다른 콜키시노이드 화합물의 이의 대응하는 글리코실화된 형태로의 미생물학적 전환을 위한 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 종의 특정 균주의 용도 및 박테리아 배양 배지로부터 전환된 화합물의 이어지는 단리가 또한 개시된다. 그람 음성 박테리아인 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) (MTCC 5578)가 트랜스-글리코실화 능력을 가진다는 것이 동정되었으며, 티오콜키신(TCN)을 티오콜키코사이드(TCS)로 전환시킨다.

Description

콜키시노이드 화합물의 미생물학적 생물전환 방법{A MICROBIAL METHOD FOR THE BIOTRANSFORMATION OF COLCHICINOID COMPOUNDS}

본 발명은 콜키신 유도체를 콜키코사이드로 전환하는 트랜스-글리코실화능을 갖는 그람 음성 박테리아 및 이의 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 콜키신 유도체 및 이들의 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 미생물의 선택적 균주를 사용한 콜키시노이드 화합물의 전환에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 콜키신, 티오콜키신 및 이의 유도체들과 같은 콜키시노이드 화합물의 방향족 고리 A의 C-3 위치에만 글리코실화된 콜키시노이드 화합물을 완전환 전환, 순도, 및 우수한 생산성으로 제공한다.

미생물이 자신의 사용을 위하여 혹은 알려져 있지 않은 이유로 화학적 화합물을 변형할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 몇 가지 화학물질들은 미생물학적으로 변형되어 더욱 약리학적으로 강력한 화합물을 제공한다. 콜키시노이드의 미생물학적 전환이 문헌에 보고되어 있다(Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1981 19(3): 465-469).

티오콜키코사이드는 GABA (A) R [감마-아미노부티르산(GABA) 타입 A 수용체] 기능의 강력한 경쟁적 길항제이다. 이는 근육 이완제이며 또한 항-염증 및 진통 성질을 나타낸다. 이는 또한 강력한 간질유도성(epileptogenic) 및 경련성(convulsant) 활성을 나타낸다.

Solet 등에 의해 보고된(Phytochemistry 33, 4, 817-820, 1993) 센텔라 아시아티카(Centella asiatica) 배양에 의한 C-2 및 C-3 위치에서의 티오콜키신의 모노글리코실화된 형태로의 생물전환은 특이적이지 않고, 따라서 최종 수율이 낮다. 상이한 미생물 균주를 사용한 몇몇의 연구자들은 또한 상기 전환의 비-선택적인 성질과 동일한 문제를 가지고 있었다. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 S. 스펙타빌리스(S. spectabilis)를 그의 연구에서 사용한 Hufford.C.D. 등(J. Pharm. Sci., 68, 10, 1239-1242,1979) 및 상이한 균주의 박테리아, 곰팡이, 및 악티노마이세스를 사용한 Bellet P. 등(GB-923421, 1959)은 콜키시노이드 화합물을 이의 3-데메틸화된 유도체로 생물전환시키기 위하여 노력하였다. 이들의 연구는 비특이적인 전환 및 낮은 생산성을 야기하였다.

최근에, Bombardelli 및 Ponzone은 이들의 특허에서 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)을 사용한 전환 작업을 행한 바 있다(US6150140 및 US6372458). 이들 연구는 그람 양성 박테리아인 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)을 사용하여 콜키시노이드 화합물을 이의 3-글리코실 형태로 전환하는 것을 보고하였다.

상기 언급한 문헌 이외에, 콜키시노이드 화합물의 전환에 관한 정보는 거의 없고 또한 불완전하다. 현재, 우리의 연구에서, 본 발명자들은 이의 전환 능력에 대하여 이전에 보고된 바 없는 전혀 새로운 균주를 발견하였다. 이러한 특정의 균주는 선충(nematode)의 소화관에서 발견되며, 다른 명백한 용도 혹은 역할이 지금까지 문헌에 언급된 바 없다.

발명의 요약:

본 발명의 주요 목적은 3-O-글루코실티오콜키시노이드 화합물의 쉽고, 특이적이고 또한 정량적인 생산을 위한 신규의 미생물학적 전환 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 콜키시노이드 화합물을 3-O-글리코실 유도체로 높은 생산성 및 순도로 전환할 수 있는 미생물 균주를 동정하는 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주의 트랜스글리코실화 기능/생물전환 능력을 개시한다. 본 발명자들은 화학식 (II)의 티오콜키신이

이의 대응하는 데메틸화된 형태인 화학식 (I)의 티오콜키코사이드로

전환될 수 있다는 것을 발견하였다.

다른 구현예에서, 상기에서 언급된 전환에 사용되는 콜키시노이드 (콜키신 또는 티오콜키신) 화합물은 하기 화학식 (II)로 나타내어 진다.

다른 구현예에서, 상기에서 언급한 전환을 위한 종(species) 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) STT-42-1의 박테리아 미생물은 토양으로부터 단리된 균주이며, 인도 찬디가르흐(Chandigarh) 소재의 마이크로비알 타입 컬쳐 콜렉션 앤드 진 뱅크(The Microbial Type Culture Collection and Gene Bank, MTCC)에 MTCC 5578로 기탁되어 있다.

또다른 구현예에서, STT-42-1 (MTCC 5578)로 지정된 균주는 새롭게 동정되었으며, 이전에 이의 생물전환 능력에 대하여 문헌에 기술된 바 없다. 이 균주는 Somvanshi 등 2006에 의해 보고된 바와 같이, 선충의 소화관으로부터 처음 단리되었다. 상기 언급된 균주는 현미경적 및 거시적 외관(콜로니 형태적 특성)에 근거하여, 화학적 계통분류학적 분류(chemotaxonomic classification) (지방산 프로파일)에 근거하여, 또한 16S rRNA 서열에 근거하여 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 종(species)에 속한다. 따라서, 본 발명은 또한 인도 찬디가르흐(Chandigarh) IMTECH (Institute of Microbial Technology - a Council of Scientific and Industrial Research organization)에 MTCC 5578로 기탁된 박테리아 균주 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) STT-42-1에 관한 것이다.

또다른 구현예에서, 상기 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) MTCC 5578의 16S rRNA 유전자 서열은 다음과 같다:

TCAGATTGAACGCTGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGAAGCTTGCTTCC

CGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACTACG

GAAACGGTGGCTAATACCGCATAATCTCTTAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATC

GGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCT

GGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG

TGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCCTAG

GGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGGGAGGAAGGCGTTGATGCTAATATCATCAACGATTGACGTTACCGA

CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATC

GGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGATTAAGTTAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAA

CCTGGGAATGGCATCTAAGACTGGTCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGC

GGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGAC

GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGAT

GTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGG

GAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG

GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCT

TTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG

GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGG

AGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAG

GGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAACTCAT

AAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG

TAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT

GGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGG

GGGGGAAGTCGTAACAAGGTAACGGTAGGGG

또다른 구현예에서, 본 발명은 발효 배양액으로부터 상기에서 정의된 화학식 (티오콜키코사이드 및 콜키코사이드의 화학식)의 원하는 글리코실화된 화합물을 추출 및 단리하는 효율적인 방법을 설명한다. 따라서, 본 발명은 또한 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 종(species)을 사용하여 상기에서 정의된 바와 같은 콜키시노이드 화합물의 전환 후, 발효 배양액으로부터 상기에서 언급된 3-O 글리코실 유도체의 단리방법에 관한 것이다. 발효 배지로부터의 추출 및 단리 공정은 다음 단계를 포함한다:

· 박테리아 세포, 및 다른 배지 성분들, 박테리아-연관 잔해 및 다른 불용성 물질이 제거된, 발효 배지로부터 여과된/정제된 배양액을 얻는 단계

· 알코올을 가하여 생성물을 액체 분획물로 회수하고 다른 원하지 않는 고체를 침전시키는 단계

· 상기 액체 분획을 마이크로여과 혹은 진공 증발에 의해 농축하고, 메틸렌 클로라이드로 반복 추출하는 단계

· 용매 분획(fraction)을 양이온 교환 수지상에 흡착시키고, 알코올로 용리하여 생성물을 얻는 단계

· 최종 단계는 결정화를 포함한다.

본 발명은 상이한 계열의 박테리아, 곰팡이 및 악티노마이세스에 속하는 200 종 이상의 미생물을 검색하는 것을 포함한다. 이들 중, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)에 속하는 1종의 박테리아 균주가 콜키시노이드 화합물을 방향족 고리의 C-3 위치에서 글리코실화된 화합물로 전환하는 높은 능력 및 특이성을 갖는다. 또한, 글리코실화된 형태로 전환시키데 있어서 낮은 순도를 갖는 조 물질의 사용은 순수한 물질의 사용에 비하여 장점을 가지고 있다.

도 1은 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) MTCC 5578 균주의 유전자 서열의 서열목록이다.

상세한 설명:

따라서, 본 발명은 콜키시노이드 화합물의 3-O-글리코실 유도체의 제조를 위한, 선택된 미생물 균주를 사용한 생물전환 방법에 관한 것이다. 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주는 그람 음성 간균이다. 이의 콜로니는 원형이고, 완전하며(entire), 볼록하고(convex), 매끄러운 표면을 가지며, 크림 같은(creamy) 연한 황색 색소를 형성한다. 단리된 균주는 높은 농도의 콜키신 및 티오콜키신에서 성장할 수 있다.

미생물의 배양 공정은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 미생물은 전형적으로 멸균된 영양 배지에 접종된다. 이노큘럼(inoculum)은 전형적으로 성장 배지를 형성하는 미리 조제된 냉동 배양액으로부터 얻어지거나 혹은 이노큘럼은 슬랜트(slant)의 패치(patch)로부터 유래된다. 선택적으로, 2번째 단계의 배양은 먼저번 단계로부터 배양액을 접종함으로써 준비된다. 이렇게 준비된 2번째 단계의 배지는 이후, 바람직하게는 초기 로그 성장 단계 후에, 전환 배지로 옮겨진 다음, 출발 기질-화학식 (II)의 화합물 또는 이의 유도체-이 상기 전환 배지에 첨가된다. 농도는 아래에서 언급한 화학식 II의 화합물의 첨가 및 화학식 I의 화합물로의 전환 후에 유기체에 의해 영향을 받는다. 반응이 종료된 후, 물질의 전환된 혼합물은 확립된 방법에 의해 혹은 본 발명에 따라 정제된다.

상기 기술된 방법은 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주인 박테리아가 콜키시노이드 화합물을 글리코실화할 수 있다는 발견에 기초한다. 천연 기원으로부터 얻어진 이러한 특정 균주는 콜키시노이드 화합물을 전환할 수 있거나 또는 다른 탄소원의 존재하에서 이러한 화합물들을 견딜 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 콜키시노이드 화합물로부터 3-O-글리코실 유도체의 제조방법은 대응하는 콜키시노이드 화합물을 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주와 함께 발효하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) STT-42-1 균주는 인도 찬디가르흐(Chandigarh) 소재의 인스티튜트 오브 마이크로비알 테크놀로지(Institute of Microbial Technology, IMTECH)의 MTCC에 MTCC 5578로 기탁되어 있다.

(예를 들어, UV, 감마선 조사와 같은) 물리적인 변이원 또는 (예를 들어, NTG, EMS와 같은) 화학적 수단 또는 분자생물학적 기술에 의한 이 균주의 돌연변이도 또한 본 발명의 제조방법에 사용될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 생물전환 방법에 사용되는 효소 또는 효소들이 또한 박테리아 바이오매스로부터 혹은 발효 성장 배지로부터 추출되어, 원하는 기질과 상기 효소 시스템을 접촉시킴으로써 생물전환에 사용될 수 있다. 또한, 상기 박테리아 시스템 혹은 효소(들) 자체는 적절한 지지 매트릭스 상에 고정될 수도 있다.

본 발명의 방법은 US6150140에 개시된 박테리아 종 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)을 사용한 콜키시노이드 화합물의 생물전환을 위해 사용되는 것과 유사한 조건하에서 수행될 수 있다.

균주 MTCC 5578은 (펩톤, 소야 펩톤(soya peptons), 효모 추출물, 트립톤, 육류 추출물(meat extract), 소고기 추출물(beef extract) 등과 같은) 유기 질소원, (글루코오즈, 프럭토오즈, 덱스트린, 글리세롤 등과 같은) 탄소원을 함유하는 전형적인 미생물 기질 중에서, 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 6-7의 pH에서 성장시킬 수 있다. 인큐베이션 온도는 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃ 범위이다.

사용되는 탄소원은 5% 내지 40%, 바람직하게는 10% 내지 80%, 더욱 바람직하게는 10% 내지 40%의 범위일 수 있으며, 질소원은 2% 내지 10%, 바람직하게는 4% 내지 6%의 범위일 수 있다.

상기 유기체는 International Journal of systemic and evolutionary microbiology (2006) 56, 629 - 633에서 Somvanshi 등에 의해 보고된 바와 같이 선충으로부터 처음 분리되었으나, 본 발명의 유기체은 이의 생물전환 능력에 대하여 문헌에 보고된 바 없다는 것을 주목하여야 한다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 콜키시노이드 화합물의 이의 글리코실화된 형태로의 시험관내(in vitro) 전환 방법을 기술한다: 약 15℃ 내지 약 45 ℃의 온도에서, 4 내지 9의 pH 수준에서, 글리코실화된 형태를 생성하기에 충분한 시간 동안, 콜키시노이드 화합물을 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주와 접촉시키는 단계; 및 상기 글리코실화된 콜키시노이드 화합물을 단리하는 단계.

상기 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주는 인도 찬디가르흐(Chandigarh), 인도 정부, 인스티튜트 오브 마이크로비알 테크놀로지(IMTECH) 카운실 오브 사이언티픽 앤드 인더스티리얼 리서치 오르가나이제이션[Institute of Microbial Technology (IMTECH) Council of Scientific and Industrial Research Organization]의 MTCC에 MTCC 5578로 기탁되고 상기한 바와 같이 STT-42-1 (MTCC 5578)로 지정된 STT-42-1이다. 티오콜키신에 대한 글리코실화는 방향족 고리의 C-3번 위치에서 발생하여, 티오콜키코사이드를 생성한다. 콜키시노이드인 티오콜키신의 농도는 0.1 g/L 내지 3.00 gm/L 이다. 상기 콜키시노이드 화합물은 콜키신, 티오콜키신 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 티오콜키신은 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하여, 당류 즉 글루코오즈, 가수분해된 전분, 글리세롤 및 다른 당류와 조합된, 펩톤, 효모 추출물, 담즙 염, 카제인, 가수분해된 카제인, 유청 단백질(whey proteins), 글루텐을 갖는 물-기반 복합 배지 중에서, 티오콜키코사이드로 전환된다. 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환은 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하여, 당류 즉 글루코오즈, 가수분해된 전분, 수용성 감자 전분, 글리세롤 및 다른 발효가능한 당류 등과 함께, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 디-암모늄 포스페이트, 칼륨, 나트륨, 마그네슘의 인산염 등의 염류를 갖는 물-기반 최소 배지 중에서 수행된다. 물-현탁된 고체 티오콜키신은, 각각의 생성물을 12 내지 36 시간 내에 얻기 위하여 글루코오즈 또는 다른 단당류의 존재하에서 배지에 첨가될 때, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 효소적 트랜스-글리코실화 기전을 사용하여 티오콜키코사이드로 전환된다. 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환을 위한 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하는 효소적 트랜스-글리코실화 반응은 티오콜키신을 메탄올, 에탄올, 및 다른 알코올 또는 다른 적절한 용매 중에 용해시키고, 글루코오즈 또는 다른 단당류의 존재하에서 배지에 가하여 각각의 생성물을 12 내지 36 시간 내에 얻음으로써 수행된다. 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환을 위한 효소적 트랜스-글리코실화 공정은 18 내지 30 시간 이내의 발효 과정 동안 글루코오즈와 함께 무균 조건하에서, 메탄올, 에탄올 등을 갖는 용액 중에서 혹은 물 중에 현탁된 고체 도즈(doses) 중에서 수행된다.

실시예 1

인도 카르나타카 주에서 상이한 장소로부터 채집된 토양 시료를 미생물 단리를 위하여 사용하였다. 기지 량의 시료를 멸균한 0.05% 트윈 20 용액 중에 현탁시키고 희석액들을 제조하였다. 상이한 희석의 현탁액들을 티오콜키신 또는 콜키신 1 g/l를 함유하는 영양 한천(Nutrient agar) 및 감자 덱스트로오즈 한천 상에 가하였다. 상기 배양접시를 24 내지 120 시간 동안 암소에서, PDA를 위하여 25℃에서 NA를 위하여 32℃에서 인큐베이션하였다. 배양접시에서 자라는 콜로니들을 다른 배양접시 또는 슬랜트(slant)에 옮기고, 생물전환을 시험하였다. 박테리아의 단리된 순수한 배양액을 리터 당 글루코오즈 10-20 g; 펩톤 5-8 g; 효모 추출물 4-8 g; 콜키신 또는 티오콜키신 0.2 g을 함유하는 배지 중에 접종하고, 24-72 시간 동안 키우고, 글루코오즈 30 g; 펩톤 10 g; 효모 추출물 5 g을 함유하고 0.5 g/L의 콜키신 또는 티오콜키신을 함유하는 신선한 배지로 옮기고, 회전진탕배양기(rotary shaker) 중에서 150 RPM으로 72 내지 120 시간 동안 29℃에서 키웠다. 상기 과정 이후, 콜키시노이드 화합물을 전환할 수 있는 가능한 단리물을 동정하였다. 약간의 전환이라도 나타낼 수 있는 유망한 단리물들을 동정하였으며, 단리물 각각을 구배 배양접시(gradient plate)에서 키워 내성(tolerance)을 체크하고, 높은 내성 능력(tolerability)을 갖는 콜로니를 0.5 내지 3.0 g/L 콜키시노이드를 함유하는 신선한 액체 배지로 옮겼다. 전환이 관찰될 때까지 4시간 마다 발효 사이클을 모니터하였으며, 이후 2시간 마다 발효액(fermentation broth) 중의 탄소 및 질소 함량뿐만 아니라 진행과정에 대하여 모니터하였다. 상기 시험의 성공적인 종료시, 단리물을 추가로 후보명단화하였으며, 확인을 위해 시험하였다. 모든 동안, 유망한 단리물을 증가하는 농도의 콜키시노이드 화합물을 함유하는 전환 배지 중에서 계속 키웠다.

실시예 2

진탕 플라스크 중에서 티오콜키코사이드의 생산

1 ml 이노큘럼(inoculum)의 하나의 WCB (Working Cell Bank) 바이알을 시드 배지(TVM-1) 100 ml을 함유하는 멸균 500 ml 플라스크에 무균적으로 옮겼다.

시드 배지 TVM-1

pH는 조절하지 않음.

배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 접종 후, 상기 플라스크를 29℃에서 인큐베이션하고, 200 RPM으로 24시간 동안 진탕하였다. OD가 10-15에 도달하는 것은 좋은 성장을 나타낸다. 상기 파라미터를 달성하였을 때 시드(seed)를 1-10% 이노큘럼(inoculum)으로 전환 배지(TCM)로 옮겼다. 전환 배지는 500 ml 원뿔형 플라스크에 100 ml 배지로 분산시켰다.

전환 배지 TCM-1

전환 배지를 29℃에서 200 rpm으로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 마다 샘플을 취하고, 티오콜키신의 전환을 TLC로 시험하였다. TLC는 샘플을 실리카겔 TLC F₂₅₄에 점적하고, 아세톤:에틸 아세테이트:물의 5:4:1 혼합액으로 전개(eluting)하여 수행하였다. 정량적 측정을 위하여, 물:메탄올 60:40 시스템을 사용한 등용매 분리(isocratic elution)로 역상 HPLC 분석을 수행하였다. 추출을 위하여, 1 ml의 샘플을 4 ml의 메탄올로 추출하고, 격렬하게 교반하였다. 샘플을 3000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하고, 상등액을 HPLC 및/또는 TLC 분석을 위하여 사용하였다.

실시예 3

슬랜트로부터 1 루프(loopful)의 이노큘럼을 시드 배지 TVM-2로 옮기고, 18 시간 동안 29℃에서 진탕기 중에서 150 RPM으로 밤새 키웠다. 우수한 성장에 도달하였을 때, 시드를 전환 배지(TVM-2)로 옮겼다.

시드 배지-TVM-2

하기 언급된 농도의 전환 배지 TVM-2를 1 리터 원뿔형 플라스크 당 100 ml로 제조하고, 15분 동안 121℃에서 멸균하였다. 시드 배지의 5% 성숙시에 시드 배지를 전환 배지 TVM-2로 옮겼다. 플라스크를 29℃에서 150 rpm으로 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시에 티오콜키신을 1 g/L로 가하였다. 완전한 전환이 달성될 때까지 4시간 마다 로그 24 시간으로부터 전환을 체크하였다.

전환 배지- TCM-2

전환 종료시 배양액을 원심분리하고, 상등액을 4℃에서 24시간 이하의 시간 동안 보관하고, 생성물을 실시예 6에 설명된 바와 같이 추출하였다.

실시예 4

10 L 발효기에서 티오콜키코사이드의 생산

1 ml 이노큘럼(inoculum)의 하나의 WCB 바이알을 시드 배지(TVM-1) 100 ml을 함유하는 멸균 500 ml 플라스크에 무균적으로 옮겼다.

시드 배지 TVM-1

배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 접종 후, 상기 플라스크를 29℃에서 인큐베이션하고, 200 RPM으로 24시간 동안 진탕하였다. OD가 10-15에 도달하는 것은 좋은 성장을 나타낸다. 상기 파라미터를 달성하였을 때 시드(seed)를 1-10% 이노큘럼(inoculum)으로 전환 배지(TCM)으로 옮겼다.

전환 배지 TCM-1

전환 배지는 7 리터의 배지를 갖는 10 리터 발효기에 제조하였다. 상기 발효기를 30℃에서 24 내지 30 시간 동안 작동시켰다. 사이클 전체적으로 DO2%를 10% 이상으로 유지시키면서, RPM을 200 내지 600의 범위로 유지시켰다. 공기공급(aeration)은 0.5 vvm 내지 최대 1 vvm 사이로 유지시켰다. 배기압력(backpressure)은 0.5 bar 내지 1.0 bar 사이로 유지시켰다. RPM, 공기공급, 배기압력을 점차 증가시켜 발효기 중의 용존 산소를 유지하였다.

4시간 마다 샘플을 취하고, 티오콜키신의 전환을 TLC로 시험하였다. TLC는 샘플을 실리카겔 TLC F254에 점적하고, 아세톤:에틸 아세테이트:물의 5:4:1 혼합액으로 전개(eluting)하여 수행하였다. 정량적 측정을 위하여, 물:메탄올 60:40 시스템을 사용한 등용매 분리(isocratic elution)로 역상 HPLC 분석을 수행하였다. 추출을 위하여, 1 ml의 샘플을 4 ml의 메탄올로 추출하고, 격렬하게 교반하였다. 샘플을 3000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 고체를 분리하고, 상등액을 HPLC 또는 TLC 분석을 위하여 사용하였다. 발효기는 전환 종료시 수확하였다.

실시예 5

22 L 발효기에서 티오콜키코사이드의 생산

시드 배지 TVM-1

배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 접종 후, 상기 플라스크를 29℃에서 인큐베이션하고, 200 RPM으로 24시간 동안 진탕하였다. OD가 10-15에 도달하는 것은 좋은 성장을 나타낸다. 상기 파라미터를 달성하였을 때 시드(seed)를 1-10% 이노큘럼(inoculum)으로 전환 배지(TCM)로 옮겼다.

전환 배지 TCM-1

전환 배지는 15 리터의 배지를 갖는 22 리터 발효기에 제조하였다. 상기 발효기를 30℃에서 24 내지 30 시간 동안 작동시켰다. 사이클 전체적으로 DO2%를 10% 이상으로 유지시키면서, RPM을 200 내지 600의 범위로 유지시켰다. 공기공급은 0.5 vvm 내지 최대 1 vvm 사이로 유지시켰다. 배기압력은 0.5 b 내지 1.0 b 사이로 유지시켰다. RPM, 공기공급, 배기압력을 점차 증가시켜 DO2%를 유지하였다.

실시예 6 티오콜키코사이드의 단리

30 시간 도달 후 혹은 전환이 종료되었을 때(95% 이상), 바이오매스(biomass)를 3000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 분리하거나 혹은 배양액을 마이크로 여과하여 맑은 상등액을 얻었다. 이후, 상기 상등액을 나노 여과 혹은 진공 증발에 의해 농축시켜 부피를 최소한으로 줄였다. 상기 감소 부피에 대하여, 적어도 5 부(portions)의 메탄올을 가하고, 잘 교반하고, 고체를 침전시키거나 혹은 용액을 원심분리하여 침전된 고체를 분리하였다. 이후, 맑은 상등액을 최소한으로 농축하고, 메틸렌 클로라이드로 반복하여 추출하였다. 실리카 겔로 정제(clarification)한 후, 현탁액을 진공 농축하고, 방치하여 결정화하였다.

¹ H- NMR ( DMSO - d ₆ ) δ ( ppm ): 1.80 (3H-17, s); 2.38 (3H-18, m); 2.24 (H, m); 2.48 (4H- 5a＼5b, 6a＼6b, m), 3.14- 3.63 (당 양성자(sugar protons), 2'＼3',4', 3H, m); 3.81 (3H,13-OMe, s), 4.28 (H-7, m), 4.32 (2H, 6', m), 4.65 (), 4.91 (g-1'H, d, 6.2 Hz), 5.07 (5'H, dd, 3.2, 4.6 Hz), 5.36, (OH, d, 3.8 Hz), 6.83 (H-4, s), 6.99 (H-8, s), 7.12 (H-12, d, 10.1 Hz), 7.25 (H-8, d, 10.1 Hz), 8.60 (NH, d, 6.8 Hz).

¹³ C NMR ( DMSO - d ₆ ): 181.7, 169.2, 157.9, 151.6, 151.5, 150.8, 141.6, 137.9, 134.5, 134.6, 128.3, 127.1, 126.9, 111.5, 100.7, 77.7, 77.3, 73.9, 70.3, 61.5, 61.2, 56.5, 51.9, 36.0, 29.7, 22.9, 14.8.

-(+)- ESI HRMS : m/z = 564.2031 (M+ H), 586.1724 [M+Na]⁺, (C₂₇H₃₃NO₁₀S에 대한 계산치 586.1723)

모든 화학적 할당치(assignments)는 TMS에 대하여 아래로(downfield) δ (ppm)으로 보고된다.

Microbial Type Culture Collection and Gene Bank

MTCC5578

20100828

<110> ELYSIAN LIFE SCIENCES PRIVATE LIMITED <120> A MICROBIAL METHOD FOR THE BIOTRANSFORMATION OF COLCHICINOID COMPOUNDS <130> PN0644 <150> 2760/CHE/2010 <151> 2010-09-22 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1491 <212> DNA <213> Providencia vermicola (MTCC 5578) <400> 1 tcagattgaa cgctgcggca ggcctaacac atgcaagtcg agcggtaaca ggggaagctt 60 gcttcccgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgtatg gggatctgcc cgatagaggg 120 ggataactac ggaaacggtg gctaataccg cataatctct taggagcaaa gcaggggaac 180 ttcggtcctt gcgctatcgg atgaacccat atgggattag ctagtaggtg gggtaatggc 240 tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300 cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 360 gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccctagggtt gtaaagtact ttcagtcggg 420 aggaaggcgt tgatgctaat atcatcaacg attgacgtta ccgacagaag aagcaccggc 480 taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540 gcgtaaagcg cacgcaggcg gttgattaag ttagatgtga aatccccggg cttaacctgg 600 gaatggcatc taagactggt cagctagagt cttgtagagg ggggtagaat tccatgtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa 720 gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgctgtaaac gatgtcgatt tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg 840 cgttaaatcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta 960 ctcttgacat ccagagaact tagcagagat gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag 1020 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080 gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga 1140 taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca 1200 cacgtgctac aatggcgtat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggaactcata 1260 aagtacgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320 taatcgtaga tcagaatgct acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380 acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440 actttgtgat tcatgactgg gggggaagtc gtaacaaggt aacggtaggg g 1491

Claims

하기 단계를 포함하는 콜키시노이드 화합물의 이의 글리코실화된 형태로의 시험관내(in vitro) 전환 방법:
a. 약 15℃ 내지 약 45 ℃의 온도에서, 4 내지 9의 pH 수준에서, 글리코실화된 형태를 생성하기에 충분한 시간 동안, 콜키시노이드 화합물을 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주와 접촉시키는 단계; 및
b. 상기 글리코실화된 콜키시노이드 화합물을 단리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola) 균주가 인도 찬디가르흐, 인도 정부, 인스티튜트 오브 마이크로비알 테크놀로지(IMTECH) 카운실 오브 사이언티픽 앤드 인더스티리얼 리서치 오르가나이제이션[Institute of Microbial Technology (IMTECH) Council of Scientific and Industrial Research Organization]의 MTCC에 MTCC 5578로 기탁되고 STT-42-1 (MTCC 5578)로 지정된 STT-42-1인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 티오콜키신에 대한 글리코실화가 방향족 고리의 C-3번 위치에서 발생하여, 티오콜키코사이드를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 콜키시노이드인 티오콜키신의 농도가 0.1 gm/L 내지 3.00 gm/L 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 콜키시노이드 화합물이 콜키신, 티오콜키신 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용한 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환이, 당류 즉 글루코오즈, 가수분해된 전분, 글리세롤 및 다른 당류와 조합된, 펩톤, 효모 추출물, 담즙 염, 카제인, 가수분해된 카제인, 유청 단백질, 글루텐을 갖는 물-기반 복합 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용한 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환이, 당류 즉 글루코오즈, 가수분해된 전분, 수용성 감자 전분, 글리세롤 및 다른 발효가능한 당류 등과 함께, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 디-암모늄 포스페이트, 칼륨, 나트륨, 마그네슘의 인산염 등의 염류를 갖는 물-기반 최소 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용한 물 현탁된 고체 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환이, 글루코오즈 또는 다른 단당류의 존재하에서 배지를 가함으로써 효소적 트랜스-글리코실화 기전에 의해 수행되어 각각의 생성물을 12 내지 36 시간 내에 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 티오콜키신을 티오콜키코사이드로 전환하는 효소적 트랜스-글리코실화 반응이 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하여 수행되고, 티오콜키신을 메탄올, 에탄올, 및/또는 다른 알코올 또는 다른 적절한 용매 중에 용해시키고, 글루코오즈 또는 다른 단당류의 존재하에서 배지에 가하여 각각의 생성물을 12 내지 36 시간 내에 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 효소적 트랜스-글리코실화 반응이 티오콜키신의 티오콜키코사이드로의 전환을 위한 프로비덴시아 베르미콜라(Providencia vermicola)를 사용하여 수행되고, 18 내지 30 시간 이내의 발효 과정 동안 글루코오즈와 함께 무균 조건하에서, 메탄올, 에탄올 등을 갖는 용액 중에서 혹은 물 중에 현탁된 고체 도즈(doses) 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.