KR20130139153A - 인간 혈액 중 항-베타 아밀로이드 항체의 측정 - Google Patents

인간 혈액 중 항-베타 아밀로이드 항체의 측정

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KR20130139153A
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노먼 렐킨
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백스터 인터내셔널 인코포레이티드
박스터 헬쓰케어 에스에이
코넬 유니버시티
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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 개선된 면역친화성 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 치료에 반응을 보일 가능성이 높은 후보자를 식별하는 방법을 제공한다.

Description

인간 혈액 중 항-베타 아밀로이드 항체의 측정{MEASUREMENT OF ANTI-BETA AMYLOID ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD}
아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)의 잘못 접힘(misfolding)과 응집은 알츠하이머병(AD)의 발병에 있어서 핵심적이다. 인간 면역글로불린 G(IgG) 레퍼토리는 예방 접종 또는 수동 면역의 부재 시 발생하는 Aβ 펩타이드에 대한 내인성 항체를 포함한다. 내인성 항-Aβ 항체 활성은 다양한 연령의 정상적인 성인 및 AD 환자의 혈액에서 검출되었다(Weksler et al., Exp Gerontol ., 37:943-948 (2002); Hyman et al., Ann Neurol ., 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging ., 25:1023-1032 (2004); Nath et al., Neuromolecular Med ., 3:29-39 (2003); Sohn et al., Frontiers in Bioscience ., 14:3879-3883 (2009)). 면역글로불린 정맥 주사(intravenous immunoglobulin; IVIG)로서 알려진 인간 혈장-유래 항체 제조물은 상승된 수준의 내인성 항-아밀로이드 항체를 포함하는 것으로 보고되었으며, AD에 대한 잠재적인 치료로서 연구 중에 있다(Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry., 75:1472-1474 (2004); Hyman et al., Ann Neurol ., 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging ., 25:1023-1032 (2004)).
발표된 연구는 AD 환자 대 노령의 정상 대조군에서 항-Aβ 항체의 상대적인 역가의 광범위하게 이질적인 추정치를 제공한다. 표준 ELISA 방법에 의한 온전한 혈장 표본의 초기 연구는 Aβ 단량체에 대하여 내인성 항체의 더 낮은 역가가 나이가 통일된 정신 이상이 아닌 대조군(aged-matched non-demented control)보다 AD 환자에 대한 것으로 생각하였다(Weksler et al., Exp Gerontol., 37:943-948 (2002)). 이후의 연구는, 낮은 pH에서 G 단백질 컬럼으로부터 용리된 혈장 면역글로불린에 대하여 실행된 ELISA에 기초하여(
Figure pct00001
et al., J Biol Chem ., 261:10240-10247 (1986)) AD 환자에서 순환하는 항-Aβ 단량체 항체의 동일 또는 증가된 역가를 보고하였다(Mruthinti et al., Neurobiol Aging, 25:1023-1032 (2004)). 이러한 방법에 의하여 획득된 더 높은 역가는 전체 혈장의 분석에서 검출되지 않고 G 단백질 정제 동안 산성화에 의해 항원으로부터 유리될 때 측정가능한 결합된 항-아밀로이드 항체의 집단의 존재를 반영하는 것으로 가정하였다. 그러나 쥐 모델에서 낮은 pH로 다중클론 IgG의 노출은 항체의 부분적인 변성을 초래하고, 겉보기 항-Aβ 항체 역가에서 커다란 인공적인 증가를 일으킨다(Li et al., BMC Neurosci., 8:22 (2007)). 그러므로 G 단백질 크로마토그래피 및 산 용리에 의해 인간 혈장으로부터 분리된 IgG를 이용하는 분석은 항-아밀로이드 활성의 인공적으로 상승된 측정값을 초래할 수 있다.
내인성 항-Aβ 항체 활성의 측정은 Aβ의 응집된 형태 상의 선형뿐만 아니라 입체형태의 네오-에피토프를 인식하는 다수 부류의 인간 항체의 존재에 의해 더 복잡해진다. 지금까지의 보고는 Aβ 피브릴(O'Nuallain et al., J Immunol ., 176:7071-7078 (2006)), Aβ 올리고머(Moir et al., J Biol Chem ., 280:17458-17463 (2005); Relkin et al., Alzheimer's and Dementia , 3:S196, X (2008); O'Nuallain et al., Biochemistry , 47:12254-12256 (2008)) 및 Aβ 단량체 상의 입체형태의 에피토프(Baumketner A et al., Prot Sci ., 15:420-428 (2006))에 대한 내인성 인간 항체를 확인하였다. Aβ에 대한 아밀로이드 결합 항체의 기타 다른 유형 및 심지어 촉매 항체가 보고되었다(Taguchi H et al., J Biol Chem ., 284:4714-4722 (2008)). 종래의 ELISA는 다양한 항체 유형이 존재하고 교차 반응성 및 다가(polyvalency)와 같은 현상을 고려하지 못하면, 전체 항-아밀로이드 활성을 과소평가 또는 과대평가할 수 있다.
외래 및 자기 항원 모두에 대한 다가 항체는 인간의 자연적 항체 레퍼토리의 일환이다(Djoumerska et al., Scand J of Immunol ., 61: 357-363 (2005)). 대부분의 다가 항체는 생식 계열 초가변 영역을 가지고, 1가의 친화력이 성숙된 항체와 비교하여 다가 항체의 항원에 대하여 더 낮은 친화력을 보이며, 보다 유연한 항원-결합 부위를 가진다. 이는 병원체에 대한 방어 기작으로서의 역할을 하는 것으로 생각된다. 일부 다가 항체의 흥미로운 특징은 온화한 파괴 처리, 예컨대 약 4 이하의 pH 또는 파괴제(disruptive agent)에의 노출에 의해 1가 항체로부터 생성될 수 있다는 것이다(Bouvet et al., J Autoimmun., 16:163-172 (2001); Dimitrov et al., Molec Immunol , 44:1854-1863 (2007)).
항-Aβ 항체 분석의 노이즈에 대한 민감도 및 신호를 증가시키는 방법이 기술되어 있으며, 이는 방사선 면역 침강 분석법(Brettschneider et al., Biol Psychiatry., 57:813-816 (2005)), 연령 및 AD의 함수로서 혈장에서의 내인성 인간 항-Aβ 항체를 특성화하는데 최근 사용되는 신규한 펩타이드 마이크로어레이(Britshgi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 106:12145-12150 (2009))를 포함한다. 후자의 접근법은 ELISA와 비교하여 노이즈에 대하여 개선된 신호 비율을 산출하였지만, 항-Aβ 항체 측정에 있어서 기타 다른 혈장 단백질 및 거대 분자의 영향 때문에 전체 혈장의 사용은 문제가 있을 수 있다.
내인성 항-Aβ 항체 수준의 측정을 혼동시킬 수 있는 이들 및 다른 요인은IVIG(intravenous immunoglobulin preparation, 면역글로불린 정맥 주사 제조물)에 의한 AD 치료의 연구에 대하여 중요한 영향을 가진다. IVIG는 먼저 상대적으로 낮은 수준으로 항-Aβ 단량체 항체를 포함하는 것이 보고되었다(Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry ., 75:1472-1474 (2004)). 보고된 소량의 항-Aβ 항체는 AD 환자에서 항-아밀로이드 효과를 발휘하는 IVIG에 대한 잠재성에 의문을 갖게 한다. 그럼에도 불구하고, AD 환자에서 IVIG의 인간 임상시험은 혈장 및 뇌척수액에서 긍정적인 임상 결과뿐만 아니라 Aβ의 변형된 수준을 초래하였다(Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry ., 75:1472-1474 (2004); Relkin et al., Neurobiol. of Aging, 30:1728-1736 (2009)). 내인성 항-아밀로이드 항체 활성이 AD에서 IVIG를 시험하는 것에 대한 원래의 근거를 제공하였지만, 이것이 이러한 질환에서 IVIG 작용의 주요한 기전인지 또는 유일한 기전인지 여부는 확실하게 알려져 있지 않다. 진정한 내인성 항-아밀로이드 항체가 생물학적으로 의미있는 효과를 발휘하기에 충분한 수준으로 인간 혈장에 존재하는지 여부에 대한 의문은 아직 답변되지 않았다.
따라서, AD 및 기타 다른 아밀로이드 연관 장애의 발병 및 치료에서 내인성 항체의 가능한 역할을 보다 잘 이해하기 위하여 인간 혈장에서 항-아밀로이드 활성을 분석하는 개선된 방법이 필요하다. 본 발명은 아밀로이드 특이적 항체의 검출 및 정량화와 연관되고, 결과적으로 아밀로이드의 검출과 연관된 문제점을 다루는 개선된 검출 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은 보다 정확한 아밀로이드 단백질과 관련된 질환의 진단, 아밀로이드 관련 치료에 대한 환자 선택, 및 기타 다른 아밀로이드 관련 적용을 제공한다.
본 발명은 인간 혈장 중 내인성 항-아밀로이드 항체 및 면역글로불린 정맥 주사 제조물을 제조하고 분석하는 개선된 방법을 제공한다. 이러한 신규 방법은, 인간 혈장이 더 낮은 결합활성으로 Aβ에 결합하는 다가 항체뿐만 아니라 Aβ 및 이의 응집체에 대하여 보통 내지 높은 결합활성을 가지는 내인성 항-아밀로이드 항체를 포함하는 것을 나타낸다.
하나의 양태에서, 본 발명은 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 헐청)이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 단계 (a) 전에 친황성(thiophilic) 크로마토그래피를 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 단계 (b) 후에 친황성 크로마토그래피를 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 친황성 크로마토그래피는 생물학적 샘플로부터 비면역글로불린 물질을 제거하여 면역글로불린이 풍부한 제조물을 생성하는데 사용된다.
제2 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및 (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 헐청)이다. 일부 실시형태에서, 아밀로이드 항원과 항-아밀로이드 항체 사이에 형성되는 복합체는 복합체의 존재 또는 수준을 검출하기 전에 카오트로픽 염을 포함하는 용액으로 세척된다.
제3 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항-아밀로이드 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 면역글로불린 제조물(immunoglobulin preparation)의 투여를 포함하는 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
본원에 기술된 양태의 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 해당 샘플에 존재하는 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애를 진단하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병, 또는 상기 질환이 발생할 가능성을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애를 진단하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애를 진단하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애에 대한 예후를 제공하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제8 양태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애에 대한 예후를 제공하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제9 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료, 예를 들어 AD에 대한 공지된 치료법 또는 예방 전략에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 개체에서 IVIG와 같은 면역글로불린 제조물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애를 진단하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료, 예를 들어 AD에 대한 공지된 치료법 또는 예방 전략에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 개체에서 IVIG와 같은 면역글로불린 제조물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 알츠하이머병의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, 당업자는 아밀로이드 연관 장애를 진단하는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
도 1은 인간 혈장 중 IgG가 빈 ELISA 웰뿐만 아니라 Aβ에 상당하게 결합함을 나타냄. Aβ 및 블랭크 플레이트(blank plate)에 대한 상대적인 결합은 개체에 걸쳐서 가변적이다. 인간 혈장 샘플(n=23)은 블랭크 웰이 있는 플레이트 및 Aβ 단량체 펩타이드를 보유하는 플레이트를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. 결과로 얻은 흡광도(A450nm)는 각각의 개체에 대하여 히스토그램(블랭크 웰, 검정색; Aβ, 회색)으로서 플롯팅되어 있다.
도 2는 빈 웰에 대한 결합이 IgG 분자의 항원 결합 영역(Fab)을 통하여 일어남을 나타냄. 5명 개체의 수집된 IgG로부터 분리된 상업적으로 이용가능한 Fab, Fab2' 및 Fc 절편은 표준 ELISA 방법론에 의해 블랭크 플레이트 및 아밀로이드 보유 플레이트에 결합되었다. 결합된 Fab 및 Fab2' 절편은 항-인간 카파 2차 항체를 사용하여 검출되고; Fc 절편은 분자의 Fc 부분에 대하여 특이적인 항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 블랭크 플레이트에 대한 결합은 Fc 영역보다 IgG 분자의 Fab 및 Fab2'영역을 통하여 명백하게 매개된다.
도 3은 IVIG에서 항-Aβ 항체의 교차 반응성이 항-Aβ 항체의 결합 특성에 대한 티로글로불린의 영향에 의해 예시된 것을 나타냄(a=Aβ 플레이트, b=티로글로불린 경쟁이 있는 Aβ 플레이트, c=티로글로불린 플레이트, d=티로글로불린 경쟁이 있는 티로글로불린 플레이트). ELISA 측정은, 티로글로불린(삼각형) 또는 Aβ 단량체 펩타이드(원)를 보유하는 플레이트 상에서 40㎍/㎖ 티로글로불린의 첨가와 함께 및 첨가 없이 1㎎/㎖에서 시작하여, IVIG의 3배 계열 희석물을 사용하여 이루어졌다. 티로글로불린의 이러한 수준은 티로글로불린 플레이트에 대한 IVIG 중 항-티로글로불린 항체의 결합을 완전히 제거하고 대략 50%로 Aβ 플레이트에의 결합을 감소시킨다.
도 4는 Aβ42 올리고머를 보유하는 ELISA 플레이트에 결합된 IVIG 항체의 결합활성이 빈 ELISA 웰에 결합된 것보다 더 큼을 나타냄. 결합활성을 측정하기 위하여, IVIG는 Aβ42 올리고머를 보유하는 ELISA 플레이트 또는 어떠한 항원도 보유하지 않은 블랭크 플레이트에 결합되었다. 그 다음 4중으로 된 웰을 나타낸 바와 같이 카오트로픽 염인 티오사이안산암모늄의 농도를 증가시키면서 항온처리하였고, 결합된 인간 항체의 양은 표준 ELISA 방법에 의해 결정하였다. 나타낸 결과는 두 번의 독립된 측정의 평균 및 표준 편차이다. Aβ 올리고머에 대한 항체 결합은 빈 웰에 결합하는 것보다 리간드에 대한 결합활성이 더 크다.
도 5는 4M 티오시아네이트 처리가 Aβ42 올리고머를 포함하는 웰에 대한 결합 대 빈 웰에 대한 결합의 비율을 개선시킴을 나타냄. 표준 ELISA 실험이 나타내어져 있으며, 여기에서 속이 찬 삼각형은 Aβ42 올리고머 플레이트에 대한 결합을 나타내고 속이 찬 원은 블랭크 플레이트에 대한 결합을 나타낸다. 속이 빈 부호는 동일한 결합 실험 후에 4M 티오시아네이트와 함께 항온처리한 것을 나타낸다. Aβ42 올리고머 대 대조군 개체로부터의 정제된 인간 IgG(1㎎/㎖)를 사용하여 결합한 블랭크 플레이트의 비율은 실질적으로 대략 3(4M 티오시아네이트 처리가 없을 때)으로부터 7 내지 10(4M 티오시아네이트 처리 후)까지 증가한다. 따라서, 카오트로픽제를 이용한 처리는, 빈 ELISA 웰에 결합하는 낮은 결합활성의 항체와 독립적으로 정제된 인간 IgG의 혼합물 중 더 높은 결합활성의 항-Aβ 올리고머 항체의 측정을 가능하게 한다.
도 6은 β 머캅토에탄올로 환원되고 동일한 질량으로 로딩된 단백질 샘플의 쿠마시로 염색된 10% SDS:NuPAGE 겔이 친황성 흡착제 상의 크로마토그래피에 의해 정제된 IgG를 나타내고 혈장 단백질을 염색하는 것이 거의 완전히 없음을 나타냄. 레인 (a)는 IVIG, (b)는 G 단백질 상의 크로마토그래피에 의해 정제된 IgG, (c)는 친황성 흡착제 상의 크로마토그래피에 의해 정제된 IgG, (d)는 원래 혈장 샘플이다. 또한 분자량 마커(M)와 이들의 크기가 kD으로 나타내어져 있다.
도 7은 Aβ 올리고머 SPR 센서에 대하여 친황성 또는 G 단백질 크로마토그래피에 의해 혈장으로부터 분리된 전체 혈장 및 항체의 결합을 나타냄. SPR 센소그램은 Aβ 올리고머 센서를 사용하여 시간의 함수로서 임의의 반응 단위(y-축)를 나타냄. 샘플 주입은 0초에서 시작하여 125초에 종료하였고; SPR 버퍼 플로우(buffer flow)는 센서의 스트리핑 및 재구성 전 250초까지 계속되었다. 혈장의 결합 반응을 나타내는 빨강색 선은 기타 다른 혈장 단백질 및 거대 분자로부터의 방해의 결과로서 0 근처에 있다. 하부(분홍색) 선은 G 단백질 및 산 용리를 사용하여 분리된 IgG 에 대한 반응을 나타낸다. 다가 유도 및 대조군 센서에 대하여 생성된 결합 증가로 인하여 결과는 음의 값을 나타낸다. 상부(파랑색) 선은 친황성 흡착제를 사용하여 제조된 IgG의 반응이다. 초기 125초는 전체 항-올리고머 항체 결합 활성(높고 낮은 친화력)을 반영하는 반면, 완충액 세척 후(125초 후) 센소그램의 부분은 주로 높은 친화력의 결합 활성을 가지는 항체에 기인한다.
도입
알츠하이머병은 특히 초기 단계에서 다양한 다른 정신적인 병태와 공통적인 증상을 보인다는 사실로 인해서, 알츠하이머병의 진단은 어렵다. 최종적인 진단은 뇌에서 형성된 Aβ 덩어리(tangle) 및 플라크의 시각화에 의해 달성될 수 있다. 마찬가지로, 기타 다른 아밀로이드 관련 질환 및 병태는 일반적으로 조직 생검의 도움으로 진단되고, 상기 조직 상의 아밀로이드 침전물은 콩고레드(Congo red) 절차를 사용하여 염색될 수 있다(Linke, R.P. (2006) “Protein misfolding, aggregation and conformational diseases”(V.N. Uversky and A.L. Fink, eds.), Protein Reviews, Volume 4, (M.Z. Atassi, ed.); Chapter 11.1, pp. 239-276; Springer). 그러나, 뇌 및 심장과 같은 기관의 생검을 실행하는데 수반되는 위험 및 합병증으로 인하여, 다양한 아밀로이드 관련 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야곱병 및 심유전분증(cardiac amyloidosis)의 진단에 대한 현실적인 해결책이 아니다.
유리하게, 본 발명은 혈액 및 혈장 샘플에서 아밀로이드 단백질의 특이적인 검출 및/또는 정량화를 통하여, 아밀로이드 관련 질환의 진단을 위한, 또는 진단에서 도움을 주는 비침습적 방법을 제공한다. 임의의 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 아밀로이드 관련 장애의 진단에 도움을 주는데 유용하며, 여기에서 방법은 제2 진단 방법을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어 본원에 제공된 방법은 다른 진단 도구와 조합하여 아밀로이드 단백질 관련 장애에 대한 진단 또는 예후를 제공하는데 도움이 될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 알츠하이머병을 진단하는데 사용되는 시험 및 평가와 조합하여 사용될 수 있으며, 상기 시험 및 평가는 제한없이 인지능력검사(cognitive test), 심리사회적 과거력(psychosocial history), 정신상태 검사(mental state examination), 신경심리 검사(neuropsychological testing), 가족력, CT 스캔, 뇌파검사(electroencephalography), 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Tomography; PET) 스캔, 단일 광자 방출 단층촬영(Single Photon Emission Computed Tomography; SPECT) 스캔, 자기 공명 분광 영상법(Magnetic Resonance Spectroscopy Imaging; MRSI), 기타 다른 장애를 배제하는 시험(신체 검사, 흉부 X선 촬영, 자기 공명 영상법, 심전도(ECG)) 등을 포함한다. 이들 방법은 아밀로이드 단백질에 대하여 낮은 결합활성 및/또는 다가 항체의 비특이적 결합과 같은 이들 단백질의 검출과 연관된 상당한 난관을 극복한다.
유사하게, 본 발명은 또한 치료 결정에 도움을 주는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 비침습적 방법은 아밀로이드 관련 장애에 대한 치료법의 지정 및/또는 투여를 가능하게 한다. 예를 들어, 본 발명은 아밀로이드 관련 장애에 대한 치료, 아밀로이드 관련 장애를 진단, 아밀로이드 관련 장애에 대한 예후를 제공하는 것으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 식별하는 방을 제공한다. 따라서, 임의의 실시형태에서, 방법은 아밀로이드 관련 장애에 대한 치료제를 개체에게 지정 및/또는 투여(예컨대, IVIG 투여 또는 기타 다른 공지된 치료법)하는 단계를 추가로 포함한다.
인간 면역글로불린 G(IgG) 레퍼토리는 면역화의 부재 시 일어나는 베타 아밀로이드(Aβ)에 대한 내인성 항체를 포함한다. 이러한 항체는 알츠하이머병(AD)와 같은 아밀로이드 관련 질환의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.본 발명은 IVIG(수집된 혈장으로부터의 면역글로불린 제조물)와 같은 혈장 및 수집한 면역글로불린 제조물 중 이러한 항체의 측정을 복잡하게 하는 문제점을 다룬다. 이러한 문제점은 빈 ELISA 웰에 결합하는 상대적으로 높은 배경 결합, 다른 혈장 단백질에 기인한 분석 방해, 및 다가의 혼동 효과를 포함한다. 항체 특이성에 의심을 가지는 혼동되는 논점을 다루는 것은 또한 아밀로이드 특이적 항체를 사용하여 아밀로이드 검출의 신뢰성을 개선시킨다.
본 발명은 다른 양태 중에서도, 혈장 중 항-Aβ 항체의 측정을 개선시키는 방법을 제공한다. 항-Aβ 항체 측정의 정확도를 혼동시킬 수 있는 하나의 요인은 블랭크 ELISA 플레이트(뿐만 아니라 Aβ 플레이트 상의 채워지지 않은 부분)에 결합하는 인간 혈장 중 다가 IgG의 존재이다. 블랭크 플레이트 결합은 모든 개체에 걸쳐서 가변적이며, 표준 ELISA 차단제 또는 배경 차감에 의해 효과적으로 제거되지 않는다.
인간 혈장 또는 혈청 중 항-Aβ 항체의 정량화는 대부분의 경우에 단량체 또는 응집된 (올리고머 또는 피브릴) Aβ 펩타이드를 보유하는 ELISA 플레이트 상에서 수행되어 왔다. 이러한 방법에 의해 분석되는 정상 인간 공여체로부터의 혈장 샘플은 블랭크 ELISA 웰(임의의 첨가된 항원을 보유하지 않는 웰)에 상당하게 결합한다. 탈지유, 우태아혈청, 알부민 및 상업적인 차단 제조물과 같은 전통적인 차단제의 사용에도 불구하고 광범위하고, 비특이적인 블랭크 플레이트 결합이 일어난다(Klaver et al ., J. Neurosci. Meth. 187, 263-269).
블랭크 웰에 대하여 획득된 관찰된 흡광도는 아밀로이드 보유 플레이트에 대하여 획득된 것과 비슷하거나 또는 그보다 훨씬 더 클 수 있으므로, 블랭크 ELISA 웰에 결합하는 능력을 가지는 항체의 존재는 개체에서 항-Aβ 올리고머 항체의 측정을 복잡하게 한다(도 1).
블랭크 플레이트 결합은 적당한 몰농도의 카오트로픽 염 용액에 항원-항체 복합체의 노출에 의해 상당히 감소되어 특이적인 항-Aβ 항체의 결합을 상당히 감소시키지 않고 약하게 결합된 다가 항체를 제거할 수 있음이 본원에 설명되어 있다.
항-Aβ 항체 측정에서 부정확성의 다른 잠재적인 공급원은 전체 혈장에 존재하는 다른 단백질 및 거대 분자에 의한 결합 방해이다. 혈장으로부터 IgG의 분리는 이러한 방해를 제거할 수 있지만, G 단백질 크로마토그래피에 의한 분리 동안 낮은 pH에의 노출은 항-Aβ 항체의 측정된 수분을 인공적으로 팽창시키는 다가를 생성한다.
본원에 제공된 개선된 방법을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 측정은 인간 혈액(및 IVIG)이 Aβ에 대하여 상대적으로 낮은 결합활성을 가지는 다가 항체뿐만 아니라 Aβ 단량체 및 응집체(예컨대, 올리고머, 필라멘트) 상의 입체형태 에피토프에 대하여 보통 내지 높은 결합활성을 가지는 항체를 포함하는 것을 확인한다.
보다 정확한 결합 측정은 분리 동안 변성 조건에의 IgG의 노출을 피함으로써 획득될 수 있음이 본원에 설명되어 있다. 친황성 크로마토그래피를 거치게 되는 IgG의 분석은 출발 물질로부터 본질적으로 변화되지 않는 항-아밀로이드 항체의 역가를 산출하며, 이는 어떠한 인공적인 다가도 형성되지 않음을 나타낸다. 그에 반해서, G 단백질 컬럼으로부터의 산-용리를 거치게 되는 IgG는 인공적으로 항-아밀로이드 활성의 1자리수 이상만큼 많이 획득된다. 친황성 흡착제 컬럼의 통과에 의해 생성된 IgG는 항원에 결합된 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 측정된 역가는 항체가 없는 것의 것이다. 친황성 크로마토그래피는 대부분의 혈장 단백질을 제거하며, 상기 혈장 단백질의 일부는 전체 혈장 중 항-아밀로이드 항체의 측정을 방해한다. 전체 혈장을 사용하여 마이크로어레이 방법과 같은 측정은 상이한 연령 및 질환 상태의 개체에 걸쳐서 다양할 수 있는 다른 단백질의 존재를 혼동시킬 수 있다(Britshgi M et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 106:12145-12150 (2009)).
상기 설명된 바와 같이, 인간 항-아밀로이드 항체를 측정하는데 관여된 복잡성은, 내인성 아밀로이드 특이적 IgG가 실제로 존재하는지 여부 또는 상기 항체가 자연적으로 생성되거나 인공적으로 유도되는 다가 항체를 나타내는지에 관한 불확실성을 형성하였다. 본원에 제시된 결과는 내인성 인간 항-아밀로이드 항체는 정말로 친화성 크로마토그래피에 의해 IVIG로부터 분리될 수 있음을 나타낸다. 이러한 항체는 수백 나노몰 범위의 결합 상수를 가지는 베타 아밀로이드의 선형 또는 입체형태의 에피토프에 대하여 특이성을 나타낸다. 이는 동일한 SPR 센서를 사용하여 쥐 단일클론 항-아밀로이드 항체에 대하여 측정된 Kd의 1자리수 이내에 있고, 예측된 것보다 상당히 더 높은 결합 활성은 비특이적이고, 다가인 항체-항원 상호작용으로부터 일어나는 활성을 나타낸다.
게다가, 베타 아밀로이드 및 IAPP 피브릴 친화성 컬럼의 순차적 통과에 의해 분리된 항-피브릴 항체는 단량체 및 올리고머 아밀로이드 항원뿐만 아니라 블랭크 플레이트와의 더 낮은 교차 반응성을 나타낸다. 이러한 결과는 아밀로이드 집합체(assembly)의 단계를 거쳐서 상이한 입체형태의 네오에피토프가 인간 IgG 레퍼토리에 의해 인식됨을 시사한다.
높은 결합활성의 내인성 항-아밀로이드 항체는 혈장 유래 인간 IgG의 전체 질량의 0.1% 미만을 나타냄이 본원에 나타내어져 있다. 개별적인 혈장 샘플에 비하여 IVIG의 더 큰 아밀로이드 결합 능력은 수천명의 혈장 공여체로부터 유래한 것이 내재하는 IVIG의 클론 다양성을 반영할 수 있다. 증가된 항-Aβ 활성의 다른 공급원은 IVIG 생성에 관여된 화학적 및 물리적 공정의 결과로서 일어나는 덜 특이적인 결합일 수 있다.
자연적으로 생성되는 자기 항체는 자기 항원의 흡수를 조절하고 특이적인 CD4+ T 세포 반응을 촉진할 수 있다(Nielsen, Eur J Immunol ., 31:2660-2668 (2001)). 다가의 항-Aβ 자가 항체 및/또는 온화한 변성 조건에의 노출에 의해 생성되는 항체는 순환계 또는 중추신경계에서 Aβ 펩타이드의 수준에 대하여 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 내인성 항-Aβ 항체는 AD 환자에서 IVIG의 치료적 이익의 원인이 될 수 있다.
유리하게, 본원에 제공된 방법은 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체의 특이적인 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 구체적으로, 본원에 제공된 방법은 높은 친화력을 가지는, 예컨대 관심의 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적으로 일어나는 단일클론 항체의 범위 내 Kd를 가지는 관심의 아밀로이드 단백질에 결합하는 항체의 외래 집단의 검출 및 정량화를 가능하게 한다.
정의
본원에서 사용된 “카오트로픽제”는 단백질의 3차원 구조를 불안정화시키는 화학물질을 말한다. 임의의 실시형태에서, 카오트로픽제는 이온 카오트로프(chaotrope)(예컨대, 카오트로픽 이온 또는 카오트로픽 염) 또는 대안적으로 비이온 카오트로프를 말할 수 있다. 카오트로픽 염의 비제한적인 예는 구아니디늄 염, 예컨대 염화구아니디늄, 질산구아니디늄, 티오사이안산구아니디늄; 티오사이안산 염, 예컨대 티오사이안산암모늄, 티오사이안산칼륨, 티오사이안산나트륨, 티오사이안산리튬, 티오사이안산칼슘, 티오사이안산구아니디늄; 과염소산 염, 예컨대 과염소산암모늄, 과염소산나트륨, 과염소산리튬, 과염소산마그네슘, 과염소산칼슘; 요오드산 염, 예컨대 요오드화암모늄, 요오드화칼륨, 요오드화나트륨, 요오드화리튬, 요오드화마그네슘, 요오드화칼슘; 염소산 염, 예컨대 염소산나트륨, 염소산리튬, 염소산마그네슘, 염소산칼슘; 등을 포함한다. 비이온 카오트로프는 제한없이 유레아 및 티오유레아를 포함한다.
크로마토그래피 및 유사한 친화력 기초 방법과 관련하여 “친황성”은 특정 염의 높은 농도로 단백질, 특히 면역글로불린에 대하여 황-함유 리간드에 기초한 친화력 선택을 말한다. 단백질은 염의 제거에 의해 용리될 수 있다. 친황성 친화력 크로마토그래피(TAC)는 상이한 부류 및 종의 면역글로불린에 대하여 넓은 특이성을 가지고, 상대적으로 온화한 조건, 물질의 감소된 비용, 및 특이성의 넓은 범위로 인하여 A 단백질 또는 G 단백질 정제에 대하여 이점을 제공한다. 기타 다른 염이 일반적으로 사용되지만, TAC와 함께 사용하는 예시적인 염은 황산 암모늄, 황산 나트륨 및 황산 칼륨을 포함한다. TAC 시약 및 겔은 예컨대 Millipore(등록상표)로부터 상업적으로 이용가능하다. 검토를 위하여, 문헌[Matejtschuk (2004) Methods in Mol. Biol . 244:195-204]을 참조한다.
용어 “항체”, “면역글로불린” 등의 용어는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 절편에 의해 실질적으로 암호화되는 폴리펩타이드를 말하며, 이는 분석물질(항원)을 특이적으로 결합하고 인식한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 미리아드(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 면역글로불린 부류, 즉 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 2쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있으며, 각각의 쌍은 하나의 “경쇄”(약 25kD) 및 하나의 “중쇄”(약 50~70kD)를 가진다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이러한 경쇄 및 중쇄를 말한다. 각각의 중쇄의 C 말단은 함께 이황화 결합되어 있으며, 항체의 불변 영역을 형성한다.
용어 “특이적으로 결합”은 비표적 화합물보다 적어도 2배 더 높은 친화력으로, 예컨대 적어도 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 25배, 50배, 또는 100배 더 높은 친화력으로 표적(항원, 에피토프 등)에 결합하는 분자(예컨대, 표적화제, 항체)를 말한다.
용어 “항원”, “분석물질”, “항체 표적” 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 경우에서, 표적과 항체의 상호작용의 부위는, 예컨대 표적화된 부위, 결합 상호작용 부위, 또는 “에피토프”로 정의된다. 일부 경우에서, 에피토프는 3차원 부분이다. 따라서, 예를 들어 표적이 단백질인 경우에, 에피토프는 연속적인 아미노산, 또는 단백질 접힘에 의해 근접하게 이동한 단백질(예컨대, 불연속적인 에피토프)의 상이한 부분으로부터의 아미노산으로 구성될 수 있다. 3차원 구조를 형성하는 표적 분자의 다른 유형에 대하여도 마찬가지이다.
따라서, 용어 “아밀로이드 항원”은 아밀로이드 단량체, 올리고머, 또는 피브릴을 말할 수 있거나, 그 대신에 아밀로이드 절편 또는 단일 에피토프를 말할 수 있다. 당업자는 주어진 아밀로이드 단백질 또는 응집체는 전형적으로 복수의 아밀로이드 항원 또는 에피토프를 포함할 것임을 인식할 것이다.
항체 친화력은 단일 항원 결정기와 항체상의 단일 결합 부위 사이의 반응의 강도이다. 항원 결정기와 항체의 결합 부위 사이의 인력 및 척력의 합이다. 친화력은 전형적으로 해리 상수(KD, Kd, 등)에 의하여 표현된다. 항원에 대한 항체의 친화력이 더 높을수록 Kd는 더 낮다.
본원에서 사용된 용어 “낮은 친화력” 및 “비특이적”은 상대적인 용어이다. 높은, 중간, 낮은 친화력, 그리고 친화력이 없음 사이의 구별은 원하는 엄격함, 특정 개체에서 획득되는 친화력 측정의 범위에 따라서 사용자에 의해 설정될 수 있다. 전형적으로, 높은 친화력 항체는 Kd가 약 10nM 미만일 것이다. 임의의 실시형태에서, 높은 친화력 항체는 Kd가 약 10nM 미만이거나, 또는 약 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM, 500pM, 400pM, 300pM, 200pM, 100pM, 50pM, 25pM, 10pM, 5pM, 1pM 미만, 또는 그 이하일 것이다. 전형적으로 낮은 친화력 항체는 Kd가 약 100nM을 초과할 것이다. 임의의 실시형태에서, 낮은 친화력 항체는 Kd가 약 100nM을 초과하거나, 또는 약 200nM, 300nM, 400nM, 500nM, 600nM, 700nM, 800nM, 900nM, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM 초과, 또는 그 이상일 것이다.
결합활성은 다수의 항원 결정기 및 다가 항체와 항원의 결합의 전체적인 강도의 측정값이다. 결합활성은 항체의 수가(valence) 및 항원의 수가 모두에 의해 영향을 받는다. 그러나, 결합활성은 각각의 친화력의 합보다 크다. 즉, 친화력은 단일 항원 결정기 및 각각의 항체 결합 부위 사이의 결합의 강도를 말하는 반면, 결합활성은 다가 항원과 항체 사이의 결합의 전체적인 강도를 말한다. 본원에 제공된 방법의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 표적 아밀로이드 단백질에 대하여 높은 결합활성을 가진다. 임의의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 표적 아밀로이드 에피토프에 대하여 높은 결합활성과 높은 친화력 모두를 가진다. 다른 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 표적 아밀로이드 단백질에 대하여 높은 결합활성을 가지지만 각각의 아밀로이드 에피토프에 대하여 낮은 친화력을 가진다.
본원에 사용된 “아밀로이드 단백질”은 생체내 또는 시험관내 교차-베타 구조를 형성하기 위해 중합화할 수 있는 폴리펩타이드를 말한다. 이러한 단백질은 유전분증(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야곱병 등)을 특징으로 하는 병태를 앓고 있는 개체의 기관 및/또는 조직에 비정상적으로 침착된다. 따라서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 항-아밀로이드 항체는 특정 아밀로이드 단백질의 하나 이상의 올리고머 상태, 예를 들어 단량체, 이량체, 또는 올리고머 아밀로이드 단백질을 특이적으로 인식한다. 아밀로이드 단백질의 비제한적인 예는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타(Abeta)), 아일렛(Islet) 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린(Amylin)), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(Major Prion Protein; PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질(Apolipoprotein) AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(Medin amyloid)(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린(Keratoepithelin)), 시스타틴 C(CST3), 및 면역글로불린 경쇄(AL)를 포함한다. 이들 또는 기타 다른 아밀로이드 단백질 중 임의의 것은 본원에 제공된 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
본원에 사용된 “생물학적 샘플”은 개체로부터의 세포 또는 세포 집단 또는 다수의 조직 또는 유체를 말한다. 대단히 자주, 샘플은 동물, 예컨대 인간에서 분리되었다. “생물학적 샘플”은 혈액 및 혈액 분획(예컨대, 혈장, 혈청 등), 기타 다른 생물학적 유체(예컨대, 소변, 타액, 림프액, 뇌척수액(CSF) 등), 생검 및 부검 샘플, 조직학적 목적을 위해 취한 냉동 절편, 림프 조직, 배양 세포 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 “약”은 지정된 값으로부터 +10% 또는 -10%의 대략적인 범위를 의미한다. 예를 들어, 용어 “약 20%”는 18~22%의 범위를 포함한다. 본원에 사용된 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서 “약 20%”는 “약 20%” 및 또한 “20%”를 의미한다. 본원에 사용된 “약”은 지정된 값 또는 지정된 값 근처의 범위를 말한다.
용어 “용량” 및 “투약량”은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용량은 각각의 투여에서 개체에게 주어지는 활성 성분의 양을 말한다. 용량은 다수의 인자, 예를 들어 투여 빈도; 개체의 크기 및 내성; 병태의 중증도; 부작용의 위험; 및 투여 경로에 따라서 다양할 것이다. 당업자는 치료 경과에 기초하여 상기 인자에 따라서 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 용어 “투약 형태”는 제약의 특정 형식을 말하며, 투여 경로에 좌우된다. 예를 들어, 투약 형태는 액체, 예컨대 주사용 생리식염수일 수 있다.
“치료적으로 유효한” 양 또는 용량 또는 “충분한/유효한” 양 또는 용량은 용량이 투여되어 효과를 생성하는 용량이다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라서 다를 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예컨대, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; [Pickar, Dosage Calculations (1999)]; 및 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
본원에 사용된 용어 “예방하다”는 환자에서 인지적 증상 또는 아밀로이드 플라크의 가능성을 감소시키거나 빈도를 감소시키는 것을 말한다. 예방은 완전하거나 부분적일 수 있어서 본 발명이 없을 경우 일어나는 것보다 환자에서 더 적은 증상이 관찰된다.
용어 “치료법”, “치료” 및 “호전”은 증상의 중증도 또는 아밀로이드 응집의 양에서의 임의의 감소, 또는 인지기능에서의 개선을 말한다. 본원에서 사용된 용어 “치료하다” 및 “예방하다”는 절대적인 용어인 것으로 의도되지 않는다. 치료는 증상의 개시, 호전에서의 임의의 지연, 환자 생존에서의 개선, 생존 시간 또는 비율에서의 증가 등을 말할 수 있다. 치료 효과는 치료를 받지 않은 개체 또는 개체의 집단과 비교될 수 있다.
“대조” 샘플 또는 값은 시험 샘플과의 비교를 위하여 참조, 보통 공지된 참조로서의 역할을 하는 샘플을 말한다. 예를 들어, 시험 샘플은 미지의 아밀로이드 상태의 환자로부터 취해지며, 유전분증(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야곱병 등)으로 진단된 환자 및/또는 유전분증을 앓고 있지 않거나 낮은 항-아밀로이드 항체 역가를 가지는 것으로 공지된 개체로부터의 대조군 샘플과 비교될 수 있다. 대조군은 또한 유사한 의학적 배경을 가지거나, 또는 동일한 연령, 체중 등을 가지는 유사한 개체의 집단, 예컨대 알츠하이머병 환자, 파킨슨병 환자, 크로이츠펠트-야곱병 등으로부터 수집된 평균값을 나타낼 수 있다. 대조값은 또한 증상 전, 또는 치료 시점 이전 또는 상이한 치료 시점에 동일한 개체로부터, 예컨대 보다 초기에 획득된 샘플로부터 획득될 수 있다. 일부 경우에, 대조군은 개체 이내에서 또는 개체 간에서의 비교, 예컨대 하나 이상의 공지된 항체의 역가를 가지는 항-아밀로이드 항체 역가의 비교를 포함할 수 있다.
당업자는 대조군이 주어진 상황에서 유익하며 대조값과의 비교에 기초하여 데이터를 분석할 수 있음을 이해할 것이다. 대조군은 또한 데이터의 유의성을 결정하는데 유익하다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 대한 값이 대조군에서 광범위하게 상이하다면, 시험 샘플에서의 변화량은 유의한 것으로서 간주되지 않을 것이다.
알츠하이머병 및 기타 다른 아밀로이드 관련 장애
아밀로이드 단백질 및 비정상적인 단백질 응집체는 다수의 상이한 질환 및 병태에서 역할을 한다. 본 발명은 진단 및 치료 과정의 결정에 유용할 수 있는 아밀로이드 단백질 또는 특정 단백질 응집체의 다양한 형태에 대하여 특이적인 높은 결합활성의 자기 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
아밀로이드 관련 장애는 알츠하이머병(AD)뿐만 아니라, 파킨슨병, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(Familial Amyloid Polyneuropathy; FAP), 다양한 형태의 유전분증(예컨대, 노인성 전신, 핀란드 유형, 아이슬란드 유형, 연수막, 가족성 내장, 피부, 투석 관련 등), 및 대동맥 내측 아밀로이드(aoric medial amyloid)를 포함한다. 비정상적인 단백질 응집과 관련된 추가적인 장애는 제2형 당뇨병, 전염성 해면양뇌증, 크로이츠펠트-야곱병, 헌팅턴병, 수질 갑상선암, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 프로락틴종, 전측두엽 치매, 다운증후군, 루이바디병, 및 유사한 질환을 포함한다.
따라서, 본 발명은 아밀로이드 관련 장애에서 발견되는 아밀로이드 및 아밀로이드 응집체의 특이적인 형태에 대하여 자기 항체를 검출 및/또는 분리하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 방법은 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 폴리Q 반복을 지니는 단백질, 타우 단백질(Tau), 및 기타 다른 아밀로이드 단백질로부터 형성된 비정상적인 단백질 응집체에 대한 항체의 검출에 적용될 수 있다.
특이적인 자기 항체, 예컨대 AD 및 파킨스병의 경우에서 Ab 피브릴에 대하여 특이적인 자기 항체의 검출은 진단 또는 위험 인자 평가에서 사용될 수 있다. 본 발명의 진단 방법은, 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 예컨대 연령, 가족력, 인지적 증상 등에 기초하여 아밀로이드관련 장애를 진행시킬 위험이 있는 것으로 고려되는 개체에 적용될 수 있다.
아밀로이드 관련 장애의 위험 인자 및 증상은 숙련된 의사에 의해 가장 적절하게 결정될 것이다. 이러한 장애를 진행시킬 위험은 연령의 증가와 함께 증가하며, 가족력과 상관관계가 있다. 많은 경우에서, 절대적으로 최종적인 진단은 실행될 수 없는 것으로 여겨진다. AD의 식별가능한 증상은 와해성(disruptive) 기억 상실, 문제를 해결하는 능력의 차이, 시간 또는 장소에 관한 혼동, 일상적인 일을 완료하는데 있어서의 어려움, 사회적 위축, 및 기분 변화를 포함한다. 이들은 증가된 아밀로이드 플라크 형성 및 뇌 부피에서 전체적인 감소와 같은 질환의 신체적인 징후와 상관관계가 있다.
항-아밀로이드 면역글로불린의 검출 및 분리
자기 항체의 낮은 수준은 주어진 항원으로 접종되지 않은 개체의 혈액에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 다수의 개체로부터 수집된 혈장 제조물은 Ab와 같은 아밀로이드 단백질에 결합하는 IgG 항체의 소분획을 포함한다. 본원에 설명된 바와 같이, 항체 특이성을 결정하는 부정확한 방법 및 항체 분리의 거친 방법은 아밀로이드 특이적 항체가 실제로 존재하는지, 또는 그 대신에 인공적 또는 비특이적인 상호작용을 나타내는지 여부에 대해 불확실성을 야기하였다.
본 발명은 다양한 형태의 아밀로이드, 예를 들어 모노머, 올리고머 및 피브릴 아밀로이드 단백질(즉,Ab)에 특이적인 항체를 검출 및/또는 분리 방법을 제공한다. 예를 들어, Ab 특이적인 IgG의 소집단은 온화한 카오트로픽 세척을 사용하여 낮은 친화력 및 비특이적인 항체를 제거함으로써 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 우선 친황성 친화력-기초 방법을 사용하여 샘플 중의 다른 단백질로부터 IgG를 분리하는 단계, 및 온화한 카오트로픽 세척을 사용하여 낮은 친화력 및 비특이적인 항체를 제거하는 단계를 포함한다. 이들 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있다. 전형적으로, 생물학적 샘플은 혈액 혈장 또는 혈청이다.
당업자는 카오트로픽제가 높은 친화력의 항체의 결합 특이성을 상당히 파괴하지 않으면서 낮은 친화력 또는 비특이적인 항체의 약한 결합 상호작용을 파괴하는데 충분한 양으로 존재하여야 함을 인식할 것이다. 예를 들어, 유레아가 카오트로픽제인 경우, 높은 농도의 유레아는 다가를 생성할 수 있다. 이는 본 발명의 검출 방법에 대하여 치명적이지 않은데, 그 이유는 카오트로픽제에 의해 생성되는 임의의 아밀로이드 특이적 친화력은 전형적으로 낮을 것이기 때문이다.
항체는 표준 방법을 사용하여, 예컨대 항-인간 2차 항체와 같이 검출가능하게 표지화된 항체 결합제, 항원(예컨대, Ab), A 단백질, G 단백질 등을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 방법은 ELISA, 웨스턴 블럿, 면역형광법, 및 당업계에 공지된 기타 다른 단백질 검출 방법을 포함한다(예컨대, 미국 특허 제4,366,241호; 제4,376,110호; 제4,517,288호; 및 제4,837,168호를 참조). 일반적인 면역분석법의 검토를 위하여, 또한 문헌[Methods in Cell Biology, Vol. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993)]; [Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991)]을 참조한다. 면역학적 결합 분석법(또는 면역분석법)은 전형적으로 항체에 특이적으로 결합하고 종종 항체를 고정시키는 리간드(예컨대, 아밀로이드, Ab, 또는 Ab의 특정 형태)를 이용한다.
면역분석법은 또한 종종 리간드 및 항체에 의해 형성되는 결합 복합체에 특이적으로 결합하여 상기 복합체를 표지화하는 표지자를 이용한다. 표지자는 그 자체가 항체/분석물질 복합체, 예컨대 검출가능하게 표지화된 분석물질을 포함하는 모이어티 중 하나일 수 있다. 대안적으로, 표지자는 항체/분석물질 복합체에 특이적으로 결합하는, 다른 항체와 같은 제3 모이어티일 수 있다.
경쟁적 분석법이 사용될 수 있으며, 여기에서 표지자는 표지를 보유하는 제2 항-아밀로이드 항체이다. 그 다음 2개의 항체가 고정화된 아밀로이드 항원에 결합하기 위하여 경쟁한다. 대안적으로, 비경쟁적인 형식에서, 항-아밀로이드 항체는 표지가 없지만, 항-아밀로이드 항체가 유래하고, 항-아밀로이드 항체에 결합하는 종, 예컨대 인간의 항체에 특이적인 제2 항체가 표지화된다.
A 단백질 또는 G 단백질과 같은 면역글로불린 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 다른 단백질은 또한 표지자로서 사용될 수 있다(일반적으로 문헌[Kronval, et al., J. Immunol . 111:1401-1406 (1973)]; 및 [Akerstrom, et al., J. Immunol . 135:2589-2542 (1985)]을 참조).
분석을 통하여, 항온처리 및/또는 세척 단계는 시약의 각각의 조합 후에 필요로 할 수 있다. 항온처리 단계는 약 5초 내지 수 시간, 예컨대 약 5분 내지 약 24시간으로 다양할 수 있다. 그러나, 항온처리 시간은 분석 형태, 항체, 용액 부피, 농도 등에 따라서 다를 것이다. 분석법은 10℃ 내지 40℃와 같은 온도 범위에서 수행될 수 있지만, 보통 분석법은 주변 온도에서 수행될 것이다.
원한다면, 사용자는 높은, 중간의, 그리고 낮은 친화력/결합활성에 대한 컷오프 범위를 설정하고, 이들 범위 내에 속하는 항체를 검출할 수 있다. 친화력 분석법은 항체의 해리 상수(Kd)를 결정하는데 사용될 수 있다. 어구 “해리 상수”는 항원에 대한 항체의 친화력을 말한다. 항체의 해리 상수(KD = 1/K, 여기에서 K는 친화 상수임)가 < 1mM이면, 항체와 항원 사이의 결합의 특이성이 존재하며, 특이성 및 친화력 항체가 증가하는 것은 종종 KD < 100 nM 또는 < 10 nM이다. KD　= [Ab-Ag]/[Ab][Ag]이며, 여기에서 [Ab]는 항체의 평형 농도이고, [Ag]는 항원의 평형 농도이며, [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 평형 농도이다. 전형적으로, 항원과 항체 사이의 결합 상호작용은 정전기적 인력, 반데르발스 힘 및 수소 결합과 같은 가역적인 비공유 결합을 포함한다. 결합 특이성을 한정하는 방법은 단일 중쇄 및/또는 경쇄, CDR, 융합 단백질 또는 중쇄 및/또는 경쇄의 절편에 적용된다.
Ab-특이적 항체의 생성된 집단은 외래의 것이지만, 높은 친화력으로, 예컨대 Ab에 대하여 특이적으로 상승된 단일클론 항체의 범위에서의 Kd로 Ab에 결합한다.
아밀로이드 관련 장애 및 알츠하이머병에 대한 치료법
AD와 같은 아밀로이드 관련 질환 및 병태의 치료는 전형적으로 질환의 인지 및 기분 증상에 집중되어 있다. 초기 치료 및 예방 요법은 신체적 및 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐과 문제 해결을 포함한다. 증상을 보이는 개체에 대한 약학적 치료법은 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)를 포함한다. 콜린에스테라제 억제제는 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린)을 포함한다.
수집된 면역글로불린 제조물은 AD 증상을 개선시키는데 효과적일 수 있음이 또한 관찰되었다. IVIG(면역글로불린 정맥 주사)로 불리는 이러한 제조물은 예컨대 USSN 제12/789,345호(2010년 5월 27일자로 출원됨) 및 USSN 제12/789,365호(2010년 5월 27일자로 출원됨)에 기술된 바와 같이 제조된다. AD, 파킨슨병, 및 기타 다른 단백질 응집 장애를 IVIG를 사용하여 치료하는 방법은 미국 공개특허 제2009/0148463호 및 제2009/0221017호에 개시되어 있다.
간략하게, IVIG는 1명 초과의 개체로부터 정맥혈을 수집하고, 혈장 분획을 분리하며, 크로마토그래피, 한외여과 및 정용여과(diafiltration)의 조합을 사용하여 IgG 면역글로불린을 풍부화함으로써 형성된다. IVIG는 전형적으로 정맥내 주입에 의해 투여된다.
항-아밀로이드 항체의 검출 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체를 검출하는 개선된 방법을 제공한다. 예를 들어, 포유동물의 혈액에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체의 측정 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 유체에 존재하는 응집 또는 비응집된 아밀로이드 단백질에 대하여 항체의 정확한 정량화 방법을 제공한다. 이러한 항체는 인간의 유전분증의 질환, 예를 들어 알츠하이머병(AD) 및 기타 다른 퇴행성신경 장애의 예측, 진단 및 치료에 대한 중요한 도구로서 떠오르고 있다. 항체는 또한 특히 이러한 질환의 모델로서 사용되는 기타 다른 포유동물 종에서 발생할 수 있다. 따라서, 연구될 유체 중 단량체의 수준이 낮을 경우, 본 발명은 응집된 아밀로이드 단백질뿐만 아니라 응집되지 않은 아밀로이드 단량체에 대한 항체의 정량화 및 특성화를 개선시킨다.
따라서, 본 발명은 예컨대 개체로부터의 생물학적 샘플로부터 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 항-아밀로이드 항체는 생물학적 샘플, 예컨대 혈청, 혈장, 뇌척수액, 림프액, 소변 또는 기타 다른 생물학적 유체 또는 분획에 용해성일 것이다. 그러나, 항-아밀로이드 항체는 또한 조직 생검으로 검출될 수 있다.
바람직한 방법에서, 생물학적 샘플(예컨대, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플)이 수집되거나 또는 생검이 실행되고 수집된 생물학적 샘플은 시험관내에서 시험된다. 임의의 실시형태에서, 샘플에 존재하는 면역글로불린은 검출 전에 풍부화된다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린은 검출 전에 추가로 풍부화된다. 그 다음 조직 또는 유체는 아밀로이드 항원 및 임의의 면역 복합체와 접촉되며, 그 결과는 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 존재를 나타낸다. 이러한 검출을 용이하게 하기 위하여, 아밀로이드 항원은 방사성 표지화되거나 형광 표지와 같은 검출가능한 표지인 효과기(effector) 분자에 결합될 수 있다.
항-아밀로이드 항체 및 아밀로이드 단백질 및/또는 응집체는 표준 면역분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 표준 방법은 예를 들어 방사면역측정법, 샌드위치 면역분석법(ELISA를 포함함), 면역형광 분석법, 웨스턴 블럿, 친화성 크로마토그래피(고체상에 결합되는 친화성 리간드), 및 표지화된 항체를 이용한 동일계내(in situ) 검출을 포함한다. 이러한 사용에 적당한 검출가능한 표지는 분광기, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 표지는 자기 비드(예컨대, DYNABEADS), 형광 염료(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스레드(Texas red), 로다민, 녹색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예컨대, 3H, 125I, 35S, 14C, or 32P), 효소(예컨대, 호스래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제 및 기타 ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 금콜로이드 또는 색유리 또는 플라스틱(예컨대, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스) 비드와 같은 비색 표지(colorimetric label)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 검출제는 항-아밀로이드 항체 결합(예컨대, 염소 항-인간 FITC)을 검출하는데 이용된다. 적용가능한 기술의 일반적인 개요는 문헌[Harlow & Lane, Antibodies : A Laboratory Manual (1988)]에서 찾아볼 수 있다.
생물학적 견본으로부터 추출된 항-아밀로이드 항체를 측정하는데 현재 이용되는 방법은 변성 조건에의 노출의 결과로서 항-아밀로이드 활성의 인공적인 이득 또는 손실을 겪는다. 예를 들어, 일부 방법은 단백질 A 또는 단백질 G 친화 크로마토그래피를 사용하여 항체(Ig)의 풍부화 동안 또는 결합된 항원으로부터 항체를 유리시키기 위해 산성화를 이용한다. 낮은 pH에의 노출은 특정 포유동물 면역글로불린의 전체 또는 부분적 변성을 야기한다. 이는 기능의 손실 또는 다가의 증가로 이어지며, 이러한 현상 모두 특이적인 항-아밀로이드 항체의 수준을 측정하는데 해로운 영향을 미친다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 혈장으로부터 Ig를 분리하고, 산 또는 다른 변성 조건에의 노출 없이 항-아밀로이드 항체로부터 약하게 결합된 항원 분자를 분리한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 항체의 수준을 정량화하는 방법을 제공한다. 기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 내인성 항-아밀로이드 활성을 측정하는데 전체 혈장을 이용한 이전의 분석법은 아직까지 미확인된 혈장 거대 분자인 다른 것으로부터의 방해에 의해 인공적으로 변경된다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 관심의 항-아밀로이드 항체를 보존하는 방식으로 이러한 미확인된 혈장 거대 분자의 활성을 방해하는 것을 제거한다.
종래 유리, 금속 또는 플라스틱 기질 상에서 이루어지는 측정은 아밀로이드 단백질 및 분석 플레이트에의 항체의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다. 인간 혈장은 아밀로이드 응집체에 대하여 낮은 결합활성을 가지는 다가 항체를 상대적으로 다량 포함한다. 이러한 항체뿐만 아니라 분석 기질에 비특이적으로 결합하는 항체의 존재는 다양한 분석 방법으로 측정된 항-아밀로이드 활성을 인공적으로 변경한다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 결합의 결합활성에서의 차이점에 기초하여 특이적 항체와 비특이적 항체를 구별할 수 있다.
카오트로픽 세척 단계를 이용하는 방법
하나의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 항체의 수준을 정량화하는 방법을 제공한다. 기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 종래 유리, 금속 또는 플라스틱 기질 상에서 이루어지는 측정은 아밀로이드 단백질 및 분석 플레이트에의 항체의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다. 인간 혈장은 아밀로이드 응집체에 대하여 낮은 결합활성을 가지는 다가 항체를 상대적으로 다량 포함한다. 이러한 항체뿐만 아니라 분석 기질에 비특이적으로 결합하는 항체의 존재는 다양한 분석 방법으로 측정된 항-아밀로이드 활성을 인공적으로 변경한다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 결합의 결합활성에서의 차이점에 기초하여 특이적 항체와 비특이적 항체를 구별할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 림프액, 윤활액 등이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 생검일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 혈장 분획)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 면역글로불린 제조물 또는 농축물이다. 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 친황성 크로마토그래피에 의해 실행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 혼합형 리간드 크로마토그래피에 의해 실행된다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다.
하나의 실시형태에서, 카오트로픽 염은 구아니디늄 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 구아니디늄 염의 비제한적인 예는 염화구아니디늄, 질산구아니디늄, 및 티오사이안산구아니디늄을 포함한다.
다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 티오사이안산 염의 비제한적인 예는 티오사이안산암모늄, 티오사이안산칼륨, 티오사이안산나트륨, 티오사이안산리튬, 티오사이안산칼슘, 및 티오사이안산구아니디늄을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 과염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 과염소산 염의 비제한적인 예는 과염소산암모늄, 과염소산나트륨, 과염소산리튬, 과염소산마그네슘, 및 과염소산칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 요오드산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 요오드산 염의 비제한적인 예는 요오드화암모늄, 요오드화칼륨, 요오드화나트륨, 요오드화리튬, 요오드화마그네슘, 및 요오드화칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 염소산 염은 염소산나트륨, 염소산리튬, 염소산마그네슘, 및 염소산칼슘을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 생물학적 샘플(즉, 혈액, 혈장, 소변, 림프액 등)에서 발견되는 면역글로불린은 생물학적 샘플을 하나 이상의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계 전에 풍부화된다. 바람직하게, 면역글로불린은 항체를 부분적으로 또는 완전히 변성하지 않는 방법에 의해 풍부화된다. 하나의 실시형태에서, 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 친황성 수지를 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 혼합형 리간드 화학(Upfront Chromatography A/S)을 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 비크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다.
친황성 풍부화 단계를 이용하는 방법
하나의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 항체의 수준을 정량화하는 방법을 제공한다. 기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 내인성 항-아밀로이드 활성을 측정하는데 전체 혈장을 이용한 이전의 분석법은 아직까지 미확인된 혈장 거대 분자인 다른 것으로부터의 방해에 의해 인공적으로 변경된다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 관심의 항-아밀로이드 항체를 보존하는 방식으로 이러한 미확인된 혈장 거대 분자의 활성을 방해하는 것을 제거한다.
생물학적 견본으로부터 추출된 항-아밀로이드 항체를 측정하는데 현재 이용되는 방법은 변성 조건에의 노출의 결과로서 항-아밀로이드 활성의 인공적인 이득 또는 손실을 겪는다. 예를 들어, 일부 방법은 단백질 A 또는 단백질 G 친화 크로마토그래피를 사용하여 항체(Ig)의 풍부화 동안 또는 결합된 항원으로부터 항체를 유리시키기 위해 산성화를 이용한다. 낮은 pH에의 노출은 특정 포유동물 면역글로불린의 전체 또는 부분적 변성을 야기한다. 이는 기능의 손실 또는 다가의 증가로 이어지며, 이러한 현상 모두 특이적인 항-아밀로이드 항체의 수준을 측정하는데 해로운 영향을 미친다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 혈장으로부터 Ig를 분리하고, 산 또는 다른 변성 조건에의 노출 없이 항-아밀로이드 항체로부터 약하게 결합된 항원 분자를 분리한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및 (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체는, 비특이적인 항체(즉, 낮은 결합활성의 항체)와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 분리하기 위하여 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하기 전에 카오트로픽 염을 포함하는 용액으로 세척된다. 본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 유레아, 티오유레아, 구아니디늄 염, 티오사이안산 염, 과염소산 염, 요오드산 염, 및 염소산 염으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
진단 및 예상 방법
임의의 양태에서, 항-아밀로이드 항체를 검출하는 본원에 제공된 방법은 상기 기술된 바와 같이 아밀로이드 관련 질환의 위험이 있거나, 또는 아밀로이드 관련 질환을 앓고 있는 개체의 진단 및 예상에 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈청 및 특정 조직 중 아밀로이드, 특히 Ab의 높은 수준은 알츠하이머병과 연관된 아밀로이드 플라크가 진행할 증가된 가능성을 나타낼 수 있다. 아밀로이드 특이적 자기 항체의 높은 수준은 또한 개체가 AD에 대한 위험에 있거나, AD 관련 증상이 악화되고 있음을 나타낸다.
진단 및/또는 적당한 치료를 선택하는 방법
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 장애를 가지거나 또는 가지는 것으로 의심이 되는 개체에 대하여 진단 및/또는 치료의 과정을 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 자기 항체의 검출 및/또는 측정을 포함한다. 아밀로이드 단백질에 대하여 높은 결합활성이 있는 내인성 항체를 검출하는 방법이 본원에 개괄되어 있다.
하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법은 개체로부터 항체 포함 샘플, 편리하게는 혈액 또는 혈장 샘플을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은, 예컨대 혈장 및 세포 물질로 추가로 분리되어 항체 포함 분획을 분리할 수 있지만, 이 단계가 필수적이지는 않다. 샘플은 또한 크기 여과 및/또는 크로마토그래피 방법에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 친황성 크로마토그래피에 노출되어 샘플로부터 비면역글로불린 단백질을 제거한다. 그 다음 샘플 또는 용리액은, 항체과 항원, 예를 들어 편리한 매트릭스, 예컨대 ELISA 플레이트 또는 크로마토그래피 매트릭스에 접합된 항원 사이의 상호작용을 검출하도록 고안된 시스템 중 아밀로이드 항원과 접촉될 수 있다. 아밀로이드 항원은 외래 아밀로이드, 또는 주로 균질인 아밀로이드 단량체, 올리고머, 또는 피브릴의 임의의 형태일 수 있다. 아밀로이드-항체 복합체의 형성이 가능하도록 충분히 항온처리한 후, 아밀로이드-항체 복합체는 카오트로픽제를 포함하는 세척에 노출되어 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 제거한다. 카오트로픽 세척 후, 아밀로이드 항원과 복합체화된 항체의 존재 또는 수준이 검출된다. 항체는 원한다면 검출 전에 항원으로부터 용리되거나 검출의 용이함을 위해 표지화된 아밀로이드 항원과 경쟁될 수 있다. 항체는 상기 기술된 바와 같이 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 대조군은 샘플과 나란히 실행되고, 항체의 양 및/또는 결합 수준에 대하여 비교된다. 다른 실시형태에서, 분석의 결과는 관심의 시스템에 대하여 이전에 확립된 대조군 수준과 비교될 수 있다. 예를 들어, 양성 대조군은 아밀로이드-관련 질환이 있는 것으로 알려진 개체 또는 개체의 그룹으로부터 획득된 동일한 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 적당한 양성 대조군의 다른 예는, 예컨대 높은 친화력 및/또는 결합활성 비교로서 공지된 항-아밀로이드 단일클론 항체이다. 예시적인 음성 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 진행할 위험이 낮은 개체 또는 개체의 그룹으로부터 획득된 동일한 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 적당한 음성 대조군의 다른 예는 비아밀로이드 항원에 대하여 특이적이거나 아밀로이드 항원에 대하여 결합활성이 낮은 공지된 항체이다.
이러한 방법을 사용하고, 개체가 아밀로이드 관련 장애가 진행할 위험이 있거나 위험에 있는 가능성이 증가된 항-아밀로이드 항체의 상대적으로 높은 수준을 서로 연관시켜서, 당업자는 개체에서 아밀로이드 관련 질환을 진단할 수 있다.
상기 방법은 아밀로이드-관련 질환 치료법에 대하여 환자군을 선택하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 항-아밀로이드 항체의 수준은 복수의 개체에서 결정될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 항-아밀로이드 항체의 상대적으로 높은 수준을 가지도록 결정된 개체가 치료에 대하여 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체의 수준은 치료의 과정 동안 정기적으로 검출된다. 일부 실시형태에서, 치료는 IVIG의 투여를 포함한다.
카오트로픽 세척 단계를 이용하는 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 카오트로픽 세척 단계는 비특이적이고 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항원 결합과 연관된 신호를 감소시키는데 이용된다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 아밀로이드-관련 질환은 알츠하이머병이다.
관련 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 카오트로픽 세척 단계는 비특이적이고 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항원 결합과 연관된 신호를 감소시키는데 이용된다. 바람직한 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하기 위한 것이다.
기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 종래 유리, 금속 또는 플라스틱 기질 상에서 이루어지는 측정은 아밀로이드 단백질 및 분석 플레이트에의 항체의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다. 인간 혈장은 아밀로이드 응집체에 대하여 낮은 결합활성을 가지는 다가 항체를 상대적으로 다량 포함한다. 이러한 항체뿐만 아니라 분석 기질에 비특이적으로 결합하는 항체의 존재는 다양한 분석 방법으로 측정된 항-아밀로이드 활성을 인공적으로 변경한다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 결합의 결합활성에서의 차이점에 기초하여 특이적 항체와 비특이적 항체를 구별할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 아밀로이드 관련 질환 또는 병태에 대한 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환으로 진단받고 치료의 특정 과정에 대하여 유리하게 반응한 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이다. 다른 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환으로 진단받고 치료의 특정 과정에 대하여 유리하게 반응하지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가질 가능성이 있거나 또는 특정 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 아밀로이드 관련 병태가 없는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대,아밀로이드 관련 병태를 가지는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 단계를 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함한다.
개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가지는 높은 가능성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환을 가지는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가지는 높은 가능성을 나타낸다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가질 가능성이 있거나 또는 특정 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 아밀로이드 관련 병태가 없는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대,아밀로이드 관련 병태를 가지는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법 또는 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법의 하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 림프액, 윤활액 등이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 생검일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 혈장 분획)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 면역글로불린 제조물 또는 농축물이다. 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 친황성 크로마토그래피에 의해 실행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 혼합형 리간드 크로마토그래피에 의해 실행된다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
하나의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태는 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증(Lattice corneal dystrophy), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이고 검출될 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드(Aβ; 아베타) 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 특정 아밀로이드 단백질의 존재 또는 수준의 검출은 특정 질환 또는 병태를 진단, 또는 특정 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자를 선택하는데 유용하다. 본원에 제공된 방법에서의 사용에 매우 적합한 아밀로이드-아밀로이드 질환 조합의 비제한적인 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표 1에 열거된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 높은 결합활성의 항체의 존재 또는 수준의 검출은 열거된 상응하는 질환의 진단에 유용할 것이다.
[표 1]
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바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다.
하나의 실시형태에서, 카오트로픽 염은 구아니디늄 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 구아니디늄 염의 비제한적인 예는 염화구아니디늄, 질산구아니디늄, 및 티오사이안산구아니디늄을 포함한다.
다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 티오사이안산 염의 비제한적인 예는 티오사이안산암모늄, 티오사이안산칼륨, 티오사이안산나트륨, 티오사이안산리튬, 티오사이안산칼슘, 및 티오사이안산구아니디늄을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 과염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 과염소산 염의 비제한적인 예는 과염소산암모늄, 과염소산나트륨, 과염소산리튬, 과염소산마그네슘, 및 과염소산칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 요오드산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 요오드산 염의 비제한적인 예는 요오드화암모늄, 요오드화칼륨, 요오드화나트륨, 요오드화리튬, 요오드화마그네슘, 및 요오드화칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 염소산 염은 염소산나트륨, 염소산리튬, 염소산마그네슘, 및 염소산칼슘을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 생물학적 샘플(즉, 혈액, 혈장, 소변, 림프액 등)에서 발견되는 면역글로불린은 생물학적 샘플을 하나 이상의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계 전에 풍부화된다. 바람직하게, 면역글로불린은 항체를 부분적으로 또는 완전히 변성하지 않는 방법에 의해 풍부화된다. 하나의 실시형태에서, 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 친황성 수지를 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 혼합형 리간드 화학(Upfront Chromatography A/S)을 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 비-크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다.
친황성 풍부화 단계를 이용하는 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하고, 여기에서 친황성 풍부화 단계는 비특이적인 항체 결합과 연관된 신호, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 감소시키는데 이용된다.
관련 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하고, 여기에서 친황성 풍부화 단계는 비특이적인 항체 결합과 연관된 신호, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 감소시키는데 이용된다.
기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 내인성 항-아밀로이드 활성을 측정하는데 전체 혈장을 이용한 이전의 분석법은 아직까지 미확인된 혈장 거대 분자인 다른 것으로부터의 방해에 의해 인공적으로 변경된다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 관심의 항-아밀로이드 항체를 보존하는 방식으로 이러한 미확인된 혈장 거대 분자의 활성을 방해하는 것을 제거한다.
생물학적 견본으로부터 추출된 항-아밀로이드 항체를 측정하는데 현재 이용되는 방법은 변성 조건에의 노출의 결과로서 항-아밀로이드 활성의 인공적인 이득 또는 손실을 겪는다. 예를 들어, 일부 방법은 단백질 A 또는 단백질 G 친화 크로마토그래피를 사용하여 항체(Ig)의 풍부화 동안 또는 결합된 항원으로부터 항체를 유리시키기 위해 산성화를 이용한다. 낮은 pH에의 노출은 특정 포유동물 면역글로불린의 전체 또는 부분적 변성을 야기한다. 이는 기능의 손실 또는 다가의 증가로 이어지며, 이러한 현상 모두 특이적인 항-아밀로이드 항체의 수준을 측정하는데 해로운 영향을 미친다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 혈장으로부터 Ig를 분리하고, 산 또는 다른 변성 조건에의 노출 없이 항-아밀로이드 항체로부터 약하게 결합된 항원 분자를 분리한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 해당 샘플에 존재하는 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 치료에 대한 후보자임을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환으로 진단받고 치료의 특정 과정에 대하여 유리하게 반응한 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이다. 다른 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환으로 진단받고 치료의 특정 과정에 대하여 유리하게 반응하지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하여 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가질 가능성이 있거나 또는 특정 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 아밀로이드 관련 병태가 없는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대,아밀로이드 관련 병태를 가지는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 단계를 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및 (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함한다.
개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환이 없는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가지는 높은 가능성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 아밀로이드 관련 질환을 가지는 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가지는 높은 가능성을 나타낸다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 개체가 아밀로이드 관련 병태를 가질 가능성이 있거나 또는 특정 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 아밀로이드 관련 병태가 없는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대,아밀로이드 관련 병태를 가지는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준 또는 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법 또는 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법의 하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 림프액, 윤활액 등이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 생검일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 혈장 분획)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 면역글로불린 제조물 또는 농축물이다. 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 친황성 크로마토그래피에 의해 실행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 혼합형 리간드 크로마토그래피에 의해 실행된다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
하나의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태는 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이고 검출될 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드(Aβ; 아베타) 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 특정 아밀로이드 단백질의 존재 또는 수준의 검출은 특정 질환 또는 병태를 진단, 또는 특정 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자를 선택하는데 유용하다. 본원에 제공된 방법에서의 사용에 매우 적합한 아밀로이드-아밀로이드 질환 조합의 비제한적인 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표 1에 열거된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 높은 결합활성의 항체의 존재 또는 수준의 검출은 열거된 상응하는 질환의 진단에 유용할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체는, 비특이적인 항체(즉, 낮은 결합활성의 항체)와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 분리하기 위하여 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하기 전에 카오트로픽 염을 포함하는 용액으로 세척된다. 본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 유레아, 티오유레아, 구아니디늄 염, 티오사이안산 염, 과염소산 염, 요오드산 염, 및 염소산 염으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
예후를 제공하는 방법
일부 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체 수준의 검출은 개체에 대하여 예후를 제공할 수 있다. 개체는 아밀로이드 관련 질환에 대하여 치료받지 않거나 진단받지 않거나, 또는 현재 치료를 받고 있거나 예방책을 취하고 있을 수 있다. 따라서, 항-아밀로이드 항체의 수준은 정기적으로 검출되어 시간의 경과에 따라서 개체를 모니터링할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체의 높은 수준의 검출은 개체에 대하여 예후를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법은 치료 요법을 결정하는데 사용될 수 있다. 아밀로이드 관련 질환이 진행할 위험이 상대적으로 낮은 것으로 보이는 경우에, 개체는 예방책을 취할 것을 권고받을 수 있다. 그러나, 아밀로이드 관련 질환이 진행할 위험이 더 높은 것으로 결정되는 일부 경우에, 치료가 처방될 수 있다.치료는 면역글로불린 제조물, 예컨대 IVIG와 같은 수집된 면역글로불린 제조물 또는 면역치료법의 기타 다른 형태의 투여를 포함할 수 있다.
아밀로이드를 검출하는 방법은 상기에 개괄되어 있다. 예를 들어, 방법은 개체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계, 샘플을 아밀로이드 단백질 또는 이의 항원과 접촉시키는 단계, 항-아밀로이드 항체 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 및 대조군과 비교하여 샘플 중 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체의 수준에 기초하여 아밀로이드 관련 장애가 진행할 가능성의 증가를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 개체에 대하여 적절한 치료의 과정을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 본원에 기술된 바와 같이 개체에 IVIG를 투여하는 단계를 포함한다.
카오트로픽 세척 단계를 이용하는 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 카오트로픽 세척 단계는 비특이적이고 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항원 결합과 연관된 신호를 감소시키는데 이용된다.
관련 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 카오트로픽 세척 단계는 비특이적이고 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항원 결합과 연관된 신호를 감소시키는데 이용된다.
기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 종래 유리, 금속 또는 플라스틱 기질 상에서 이루어지는 측정은 아밀로이드 단백질 및 분석 플레이트에의 항체의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다. 인간 혈장은 아밀로이드 응집체에 대하여 낮은 결합활성을 가지는 다가 항체를 상대적으로 다량 포함한다. 이러한 항체뿐만 아니라 분석 기질에 비특이적으로 결합하는 항체의 존재는 다양한 분석 방법으로 측정된 항-아밀로이드 활성을 인공적으로 변경한다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 결합의 결합활성에서의 차이점에 기초하여 특이적 항체와 비특이적 항체를 구별할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 질환의 진행을 겪은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 또는 증가된 수준은 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 질환의 진행을 겪지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 진행의 낮은 가능성을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 보다 초기에 취하여진 동일한 환자로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타낸다. 임의의 실시형태에서, 이전의 샘플은 약 1개월 전, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개월 전, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 전에 취하여질 수 있다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 질환의 진행을 겪지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대, 질환의 진행을 겪은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료, 예를 들어 AD에 대한 공지된 치료법 또는 예방적인 전략에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 개체에서 IVIG와 같은 면역글로불린 제조물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및 (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 치료에 대하여 양호한 예후를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 치료에 대하여 나쁜 예후를 나타낸다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 음성 대조군(예컨대, 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대, 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법 또는 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법의 하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 림프액, 윤활액 등이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 생검일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 혈장 분획)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 면역글로불린 제조물 또는 농축물이다. 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 친황성 크로마토그래피에 의해 실행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 혼합형 리간드 크로마토그래피에 의해 실행된다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
하나의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태는 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이고 검출될 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드(Aβ; 아베타) 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 특정 아밀로이드 단백질의 존재 또는 수준의 검출은 질환의 진행에 대한 예후를 제공하거나 또는 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공한다. 본원에 제공된 방법에서의 사용에 매우 적합한 아밀로이드-아밀로이드 질환 조합의 비제한적인 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표 1에 열거된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 높은 결합활성의 항체의 존재 또는 수준의 검출은 열거된 상응하는 질환의 진단에 유용할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다.
하나의 실시형태에서, 카오트로픽 염은 구아니디늄 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 구아니디늄 염의 비제한적인 예는 염화구아니디늄, 질산구아니디늄, 및 구아니디늄 티오시아네이트를 포함한다.
다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 티오사이안산 염의 비제한적인 예는 티오사이안산암모늄, 티오사이안산칼륨, 티오사이안산나트륨, 티오사이안산리튬, 티오사이안산칼슘,, 및 티오사이안산구아니디늄을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 과염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 과염소산 염의 비제한적인 예는 과염소산암모늄, 과염소산나트륨, 과염소산리튬, 과염소산마그네슘, 및 과염소산칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 요오드 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 요오드산 염의 비제한적인 예는 요오드화암모늄, 요오드화칼륨, 요오드화나트륨, 요오드화리튬, 요오드화마그네슘, 및 요오드화칼슘을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 카오트로픽 염은 염소산 염이다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 염소산 염은 염소산나트륨, 염소산리튬, 염소산마그네슘, 및 염소산칼슘을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 생물학적 샘플(즉, 혈액, 혈장, 소변, 림프액 등)에서 발견되는 면역글로불린은 생물학적 샘플을 하나 이상의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계 전에 풍부화된다. 바람직하게, 면역글로불린은 항체를 부분적으로 또는 완전히 변성하지 않는 방법에 의해 풍부화된다. 하나의 실시형태에서, 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 친황성 수지를 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 혼합형 리간드 화학(Upfront Chromatography A/S)을 이용하여 실행된다. 다른 실시형태에서 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 본원에 제공된 방법은 항체의 변성을 초래하지 않는 비-크로마토그래피 방법에 의해 면역글로불린을 풍부화하는 단계를 포함한다.
친황성 풍부화 단계를 이용하는 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대하여 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 친황성 풍부화 단계는 비특이적인 항체 결합과 연관된 신호, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 감소시키는데 이용된다.
관련 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 제공하며, 이는 포유동물 혈장 및 기타 다른 생물학적 유체 중 아밀로이드 형성 단백질에 대한 항체의 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기에서 친황성 풍부화 단계는 비특이적인 항체 결합과 연관된 신호, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 감소시키는데 이용된다.
기존의 방법과 달리, 본 발명은 비특이적인 항체 결합의 혼동 효과, 혈장 거대분자로부터의 방해 및 정제 동안 면역글로불린의 변성에 의한 결합 활성의 인공적인 생성을 피한다.
예를 들어, 내인성 항-아밀로이드 활성을 측정하는데 전체 혈장을 이용한 이전의 분석법은 아직까지 미확인된 혈장 거대 분자인 다른 것으로부터의 방해에 의해 인공적으로 변경된다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 관심의 항-아밀로이드 항체를 보존하는 방식으로 이러한 미확인된 혈장 거대 분자의 활성을 방해하는 것을 제거한다.
생물학적 견본으로부터 추출된 항-아밀로이드 항체를 측정하는데 현재 이용되는 방법은 변성 조건에의 노출의 결과로서 항-아밀로이드 활성의 인공적인 이득 또는 손실을 겪는다. 예를 들어, 일부 방법은 단백질 A 또는 단백질 G 친화 크로마토그래피를 사용하여 항체(Ig)의 풍부화 동안 또는 결합된 항원으로부터 항체를 유리시키기 위해 산성화를 이용한다. 낮은 pH에의 노출은 특정 포유동물 면역글로불린의 전체 또는 부분적 변성을 야기한다. 이는 기능의 손실 또는 다가의 증가로 이어지며, 이러한 현상 모두 특이적인 항-아밀로이드 항체의 수준을 측정하는데 해로운 영향을 미친다. 유리하게, 본원에 제공된 방법은 혈장으로부터 Ig를 분리하고, 산 또는 다른 변성 조건에의 노출 없이 항-아밀로이드 항체로부터 약하게 결합된 항원 분자를 분리한다.
따라서, 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 질환의 진행을 겪은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 또는 증가된 수준은 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 질환의 진행을 겪지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 진행의 낮은 가능성을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 보다 초기에 취하여진 동일한 환자로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 증가된 수준은 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타낸다. 임의의 실시형태에서, 이전의 샘플은 약 1개월 전, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개월 전, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 전에 취하여질 수 있다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 대조군 임계값(예컨대, 질환의 높은 가능성 또는 진행을 나타내는 임계값)을 초과하거나, 또는 음성 대조군(예컨대, 질환의 진행을 겪지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대, 질환의 진행을 겪은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료, 예를 들어 AD에 대한 공지된 치료법 또는 예방적인 전략에 대한 예후를 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료는 개체에서 IVIG와 같은 면역글로불린 제조물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (d) 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 (e) 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법의 일부 실시형태에서, 대조군은 특정 치료에 대하여 유리하게 반응한 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 치료에 대하여 양호한 예후를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대조군은 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 개체 또는 개체의 군으로부터의 것이어서, 대조군에 비하여 잔여 복합체의 유사한 수준은 질환의 치료에 대하여 나쁜 예후를 나타낸다. 당업자는 적어도 하나의 적절한 대조군을 선택하는 방법 및 그에 따른 결과를 해석하는 방법을 이해할 것이다.
임의의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법은 치료의 과정을 지정하는 단계 또는 개체에 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플 중 항-아밀로이드 항체의 수준이 음성 대조군(예컨대, 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하지 않은 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)보다 양성 대조군(예컨대, 특정 치료에 대하여 유리하게 반응하는 군 또는 개체로부터의 대조군 수준)에 보다 밀접하게 유사할 때, 이러한 치료의 과정이 지정될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다.
임의의 실시형태에서, 치료는 인지 치료, 예를 들어 신체적 및/또는 사회적 활동, 기억 게임, 및 퍼즐 및/또는 문제 해결; 약학적 치료법, 예를 들어 콜린에스테라제 억제제(감소된 아세틸콜린을 다룸), 부분적 글루타메이트 길항제(예컨대, 메만틴), 및 정신과 약물(예컨대, 항정신병약, 수면 유도제, 항불안제 및 베타-차단제)로부터 선택된다. 콜린에스테라제 억제제는 제한없이 Aricept(등록상표)(도네페질 염산염), Exelon(등록상표)(리바스티그민), Razadyne(등록상표)(갈란타민), 및 Cognex(등록상표)(타크린), 및 이의 조합을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함한다.
아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법 또는 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법의 하나의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈액, 혈장, 소변, 림프액, 윤활액 등이다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플 또는 생검일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 분획(예컨대, 혈장 또는 혈장 분획)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 면역글로불린 제조물 또는 농축물이다. 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 친황성 크로마토그래피에 의해 실행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 면역글로불린 풍부화는 혼합형 리간드 크로마토그래피에 의해 실행된다.
하나의 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로부터 선택되는 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴에 대하여 특이적이다.
하나의 실시형태에서, 아밀로이드 단백질과 연관된 질환 또는 병태는 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이고 검출될 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드(Aβ; 아베타) 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 특정 아밀로이드 단백질의 존재 또는 수준의 검출은 질환의 진행에 대한 예후를 제공하거나 또는 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공한다. 본원에 제공된 방법에서의 사용에 매우 적합한 아밀로이드-아밀로이드 질환 조합의 비제한적인 예는 표 1에서 찾아볼 수 있다. 임의의 실시형태에서, 표 1에 열거된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 높은 결합활성의 항체의 존재 또는 수준의 검출은 열거된 상응하는 질환의 진단에 유용할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 검출될 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타)에 대하여 특이적인 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 단량체에 대하여 특이적이다. 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 올리고머(즉, 이량체, 삼량체 등)에 대하여 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 항-Aβ 항체는 Aβ 피브릴에 대하여 특이적이다.
본원에 제공된 방법의 하나의 실시형태에서, 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다. 구체적인 실시형태에서, 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 낮은 결합활성의 항-Aβ 항체이다.
본원에 제공된 방법의 임의의 실시형태에서, 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체는, 비특이적인 항체(즉, 낮은 결합활성의 항체)와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 분리하기 위하여 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하기 전에 카오트로픽 염을 포함하는 용액으로 세척된다. 본원에 제공된 방법에서 이용되는 카오트로픽 세척 단계는 임의의 공지된 카오트로픽제를 이용하여 실행될 수 있다. 카오트로픽 염이 이용될 때, 상기 염은 일반적으로 염소산염 이온(ClO3 -)과 동일 또는 그보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 음이온 또는 칼슘 이온보다 더 큰 카오트로픽 효과를 가지는 양이온을 포함할 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 유레아, 티오유레아, 구아니디늄 염, 티오사이안산 염, 과염소산 염, 요오드산 염, 및 염소산 염으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 카오트로픽 염은 티오사이안산암모늄이다. 하나의 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 티오사이안산암모늄은 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
본원에 제공된 방법의 세척 단계에서 사용되는 카오트로픽제의 농도는 비특이적(즉, 낮은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용을 붕괴시키는데 충분하도록 선택되어야 하지만, 특이적(즉, 높은 결합활성) 항-아밀로이드 항체와 아밀로이드 항원 사이의 상호작용은 붕괴시키지 않는다. 이용되는 카오트로픽제의 절대 농도는 다수의 요인, 예를 들어 특정 카오트로픽제의 강도 및 이용될 특정 시스템(예컨대, 항-Aβ 항체 ELISA 분석법)에서 형성되는 항체-아밀로이드 항원 상호작용의 강도에 좌우될 것이다. 특정 시스템에 대하여 사용하기 위한 카오트로픽제의 최적 농도를 용이하게 결정하는 방법을 당업자는 알 것이다. 하나의 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 0.5M 내지 약 4.0M의 세척 농도로 사용된다. 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.0M 내지 약 3.0M의 세척 농도로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 카오트로픽제는 약 1.5M 내지 약 2.5M의 세척 농도로 사용된다.
약학적 조성물 및 투약량
면역글로불린을 포함하는 약학적 조성물, 예컨대 외래 인간 항체를 포함하는 풍부화된 면역글로불린 제조물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라서 다양할 수 있지만, 전형적으로 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하일 것이다. 약학적 조성물은 (예컨대, 주사 또는 주입에 의해) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여에 적당한 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
조성물의 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산제의 경우에는 필요한 입도의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 만니톨 또는 솔비톨과 같은 다가알코올, 및 조성물 중 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간의 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 스테아르산 알루미늄 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 잘 알려지고 일상적으로 수행된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 약학적 조성물은 바람직하게 GMP 조건 하에서 제조된다. 전형적으로, 면역글로불린 제조물의 치료적으로 유효한 용량 또는 효과적인 용량은 본 발명의 약학적 조성물 중에 이용된다. 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 종래 방법에 의해 투약 형태로 제형화될 수 있다. 투약 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회로 나눈 용량이 시간에 따라서 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 위기상황에 의해 나타내어지는 바에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위하여 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 투약 단위 형태는 치료될 개체에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 공동으로 원하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 소정량을 포함한다.
실제 투약량 수준은 특정 환자에게 독성없이 환자에 대하여 원하는 치료적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 획득하기 위하여 다양할 수 있다. 의사는 원하는 치료적 효과를 얻고 원하는 효과가 달성될 때까지 투약량을 점차 증가시키는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 약학 조성물의 복용을 시작할 수 있다. 일반적으로, 효과적인 용량은 다수의 상이한 요인, 예를 들어 치료될 구체적인 질환 또는 병태, 질환 또는 병태의 중증도, 환자의 생리적 상태, 투여되는 기타 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부에 따라서 다양하다. 예시적인 치료 요법은 2주에 한 번, 또는 1개월에 한 번, 또는 3 내지 6개월에 한 번 투여를 수반한다.
조성물은 다수의 경우로 투여될 수 있다. 단일 투약 사이의 간격은 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 치료 진행 상황을 측정함으로써 나타내어지는 바에 따라 불규칙할 수 있다. 투약량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라서 다를 수 있다.
면역글로불린 제조물의 경우에, 면역글로불린 정맥 주사(IVIG)가 일반적으로 사용된다. IVIG 제형은 주사에 의한 투여를 위해 고안된다. 본 발명의 IgG 제조물은, 치료적으로 유효한 용량을 위하여 부피를 상당히 감소시키는, 예외적으로 높은 면역글로불린 농도(10% w/v 이상)를 달성하기 때문에, 본 발명의 조성물은 보다 일반적으로 사용되는 정맥내 투여뿐만 아니라 환자에게 피하 및/또는 근육내 투여에 특히 유리하다.
용어 “유효한 양”은 면역글로불린, 특히 IgG, 개체에서 치료될 의학적 병태(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병 등)의 개선 또는 교정을 초래하는 제조물의 양을 말한다. 개체게 투여될 유효한 양은 연령, 체중, 질환 중증도, 경로(예컨대, 정맥내, 피하) 및 치료에 대한 반응에서의 각각의 차이점을 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 본 발명의 면역글로불린 제조물은 매일 약 5㎎/㎏ 내지 약 2000㎎/㎏으로 개체에 투여될 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 면역글로불린 제조물은 적어도 약 10㎎/㎏, 적어도 15㎎/㎏, 적어도 20㎎/㎏, 적어도 25㎎/㎏, 적어도 30㎎/㎏, 또는 적어도 50㎎/㎏의 양으로 투여될 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 면역글로불린 제조물은 매일 최대 약 100㎎/㎏, 최대 약 150㎎/㎏, 최대 약 200㎎/㎏, 최대 약 250㎎/㎏, 최대 약 300㎎/㎏, 최대 약 400㎎/㎏의 양으로 개체에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린 제조물의 용량은 더 많거나 더 적을 수 있다. 또한, 면역글로불린 제조물은 하루에 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. IgG 제조물에 의해 치료되는 질환에 익숙한 임상의는 당업계에 공지된 기준에 따라서 환자에게 적절한 용량을 결정할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 농축된 IgG 제조물은 투여당 약 5㎎/㎏ 내지 약 2000㎎/㎏의 용량으로 개체에게 투여될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 용량은 적어도 약 5㎎/㎏, 또는 적어도 약 10㎎/㎏, 또는 적어도 약 20㎎/㎏, 30㎎/㎏, 40㎎/㎏, 50㎎/㎏, 60㎎/㎏, 70㎎/㎏, 80㎎/㎏, 90㎎/㎏, 100㎎/㎏, 125㎎/㎏, 150㎎/㎏, 175㎎/㎏, 200㎎/㎏, 250㎎/㎏, 300㎎/㎏, 350㎎/㎏, 400㎎/㎏, 450㎎/㎏, 500㎎/㎏, 550㎎/㎏, 600㎎/㎏, 650㎎/㎏, 700㎎/㎏, 750㎎/㎏, 800㎎/㎏, 850㎎/㎏, 900㎎/㎏, 950㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 1100㎎/㎏, 1200㎎/㎏, 1300㎎/㎏, 1400㎎/㎏, 1500㎎/㎏, 1600㎎/㎏, 1700㎎/㎏, 1800㎎/㎏, 1900㎎/㎏, 또는 적어도 약 2000㎎/㎏일 수 있다.
본 발명에 따라서, 치료의 과정을 완료하는데 필요한 시간은 의사에 의해 결정될 수 있으며, 1일만큼 짧은 시간 내지 1달 초과의 범위일 수 있다. 임의의 실시형태에서, 치료의 과정은 1 내지 6개월일 수 있다.
키트
본 발명은 높은 친화력의 항-아밀로이드 항체의 검출 및/또는 분리를 위한 키트를 추가로 제공한다. 키트는 아밀로이드 관련 장애의 진단, IVIG를 이용하는 것과 같은 적절한 치료법에 대한 개체의 선별에 유용할 수 있다.
키트는 전형적으로 서면 또는 전자 형식으로 사용을 위한 설명서, 및 원하는 분석을 위한 표준 시약, 용액 및 완충액을 포함할 것이다. 키트는 선택적으로 표준 대조군 또는 소모성 실험 장비, 예를 들어 ELISA 플레이트, 크로마토그래피 도구, 용기, 및 반응기를 포함한다. 키트는 또한 생물학적 샘플의 수집을 위한 장치, 예컨대 시린지 및 혈액 분획 장치를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 아밀로이드에 특이적인 내인성인 높은 결합활성의 항체의 검출을 위한 물질을 포함할 수 있다. 키트는 친황성 크로마토그래피 시약 및 적절한 세척 및 용리 완충액을 포함하여 샘플 중 다른 단백질로부터 IgG를 분리할 수 있다.
키트는 또한 낮은 결합활성 또는 비특이적인 항체로부터 높은 결합활성의 아밀로이드 특이적 항체를 분리하는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 아밀로이드의 원하는 형태, 예컨대 단량체, 올리고머(구형) 또는 피브릴 아밀로이드(예컨대, Ab)에 접합되는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 고체 지지체는 비드, 크로마토그래피 정지상(예컨대, 아가로스, 실리카 등), ELISA 플레이트 등일 수 있다. 물질은 또한 적어도 하나의 카오트로픽 세척 완충액을 포함하여 아밀로이드 접합 지지체로부터 낮은 친화력의 항체를 분리 및 제거할 수 있다. 시험 샘플에 대한 비교를 위하여 키트는 유리하게 공지된 높은 결합활성의 (양성) 대조군 및 낮은 결합활성의 (음성) 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 본원에 기술된 바와 같이 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체의 검출을 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 생물학적 샘플을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원, 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 생물학적 샘플을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계; (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; 및 (c) 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 아밀로이드 항원 및 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 키트를 제공하며, 카오트로픽제 및 친황성 크로마토그래피 흡착제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키트는 카오트로픽제와 친황성 크로마토그래피 흡착제를 모두 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 키트의 제조를 위한 카오트로픽제 및/또는 친황성 크로마토그래피 흡착제의 용도를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 키트의 제조를 위하여 조합한 카오트로픽제 및 친황성 크로마토그래피 흡착제의 용도를 제공한다.
실시예
실시예 1
인간 혈장 및 IgG 제조물의 수집. 건강한 성인 및 AD 환자로부터의 혈액 샘플을 웰리 의과대학 기관 감사 위원회(Weill Medical College Institutional Review Board)에 의해 승인된 프로토콜 하에서 획득하고, 표준 방법에 의해 혈장의 생성을 위하여 EDTA 튜브 중에 수집하였다. -80℃에서 보관하고 실온에서 30분 동안의 노출에 의해 해동한 견본 상에서 전체 혈장을 사용하여 실험을 수행하였다. IgG는 다음의 2가지 방법에 의해 혈장으로부터 정제하였다: (1) G 단백질 세파로스(
Figure pct00003
et al., J Biol Chem ., 261:10240-10247 (1986)) 및 (2) 제조자에 의해 명시된 친황성 흡착제 상의 정제 크로마토그래피(Pierce, Rockford, IL). G 단백질 크로마토그래피를 위하여, IgG는 0.1M 글리신-HCl(pH 2.8)로 융리되고, 2M 트리스 염기를 포함하는 튜브 중에 수집하여 낮은 pH에의 노출 시간을 감소시켰다. 컬럼으로부터 용리한 IgG는 사용 전에 PBS에 대하여 투석하였다.
실시예 2
Aβ의 다양한 올리고미 종의 제조. Aβ 단량체(Biosource International, Camarillo, CA)를 50% 아세토니트릴 중에 용해하고, 30분 동안 37℃에서 항온처리하여 동결건조하였다. 생성된 펠릿을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올, HFIP 중에 용해하고, 37℃에서 20~30분 동안 항온처리한 다음 아르곤하에서 건조하였다.
Aβ 올리고머는 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다(Barghorn et al., J Neurochem., 95:834-847 (2005)). 그 다음 건조한 Aβ 펩타이드 막을 무수 DMSO 중 5mM에서 용해하고 초음파분해기 수조(bath sonicator)에서 30분 동안 초음파분해하여 Aβ 구조의 완전 붕괴를 확실히 하였다. Aβ는 PBS를 이용하여 400μM으로 조정하고, 1/10 부피의 2% SDS를 첨가하며 혼합물을 37℃에서 6시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 혼합물을 3부피의 물로 희석하고 18시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 생성된 구형 올리고머는 SDS:PAGE 및 SEC로 특성화하고 4℃에서 최대 4주 동안 보관하였다.
Aβ 피브릴은 O'Nuallain의 방법의 변형에 의해 제조하고(O'Nuallain et al., J Immunol., 176:7071-7078 (2006)), HFIP-처리 Aβ 단량체를 새로 만든 2mM NaOH 중에 용해하였다. 가볍게 교반한 후, 용액을 10,000 x g에서 60분 동안 원심분리하여 큰 덩어리 또는 피브릴을 제거하였다. 그 다음 상청액을 0.05% 아자이드화나트륨을 포함하는 1 x PBS로 조정하고 교반하면서 37℃에서 10 내지 14일 동안 항온처리하였다. 피브릴 구조를 음성 염색된 그리드의 투과 전자 현미경에 의해 확인하였다.
실시예 3
인간 항-Aβ 항체의 ELISA . Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)를 전체 Aβ, 단량체(포름산 중 1㎎/㎖) 또는 미리 만든 Aβ 글로불로머(globulomer)를 0.1㎍ 포함하는 0.1M NaHCO3(pH 9.6) 0.1㎖로 1시간 동안 37℃에서 코팅하였다. Aβ 피브릴 플레이트는 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다(O'Nuallain et al., J Immunol ., 176:7071-7078 (2006)). 플레이트는 즉시 사용하거나 4℃에서 보관하였다. Aβ 코팅 완충제를 제거한 후, 플레이트를 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, pH 7.4)(PBST) 0.2㎖로 3회 세척하였다. 마지막 세척 후, 플레이트를 0.2㎖/웰의 PBST 중 1% BSA로 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 차단 용액을 제거하고 상기 기술한 바와 같이 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다.
각각의 ELISA 플레이트를 각각 PBST로 1:10으로 희석된 10개의 혈장 샘플뿐만 아니라 음성 PBST 대조군 및 IVIG 10㎎/㎖(Gammagard Liquid, Baxter)의 양성 대조군을 분석하는데 사용하였다. 완전한 적정 농도가 이루어질 때, 각각의 샘플을 PBST 중 3배 계열 희석물로서 분석하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 0.2㎖ PBST로 3회 세척하며, PBST 중호스래디쉬 페록시다제-접합 염소, 친화력-정제된 항-인간 IgG 항체(Biosource International, Camarillo, CA)의 1:10,000 희석물 0.1㎖와 함께 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 0.1㎖/웰 TMB(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가함으로써 15~30분 동안 실온에서 반응을 전개시켰다. 음성 대조군 웰이 색깔을 변화시키고 있음을 처음 나타낼 때, 1M HCl 0.1㎖를 각각의 웰에 첨가하여 반응을 종결시켰다. 405nm에서의 OD는 Synergy HT ELISA 판독기(Bio-Tek, Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다.
항-Aβ항체 역가는 KC4 Signature 소프트웨어를 사용하여 계산하여 혈장 또는 IVIG의 계열 희석물로부터 획득한 OD에 대하여 4개 파라미터 시그모이드 곡선을 만들었다. 곡선을 만들기 전에, 2차 항체-대조군만의 평균 OD를 혈장, 또는 IVIG가 있는 웰의 OD에서 차감하였다. 필요하다면, 샘플의 희석물을 감소시켜서 가장 적은 희석물 샘플의 최대 OD가 IVIG 표준의 최대 절반 미만이 되도록 하였다. 샘플 중 항-Aβ 항체의 역가는 희석물의 역수로서 취하여졌으며, 이때 OD는 10㎎/㎖로 희석된 IVIG 표준의 최대 OD(보통 2.0~3.0)의 절반과 동일하였다.
실시예 4
SPR 측정. 카복실화 센서를 SensiQ SPR 장치(ICX Nomadics, Oklahoma City, OK)에 로딩하고, 0.1M 인산의 1분 주입으로 세정하여 표면 오염 물질을 제거하며, 대조군 및 실험 채널 모두에 2mM EDC, 0.5mM NHS를 주입함으로써 활성화시켰다. 10mM 아세트산염 완충액(pH 4.7) 중 Neutravidin(25㎍/㎖)을 실험 채널에 주입한 후, 10mM HEPES 완충액(pH 7.4) 중 비오틴-태그 Aβ 단량체, 올리고머 또는 피브릴, 150mM NaCl, 1.34mM EDTA, 및 1% Tween 20의 용액 50㎍/㎖를 주입하였다. 결합을 모든 채널에 1M 에탄올아민(pH 8)의 주입에 의해 종결시켰다. SPR 항체 결합 분석은 혈장의 2배 계열 희석물 또는 정제된 IgG 제조물을 사용하여 이루어졌다. 결합의 분석은 Qdat 소프트웨어(ICX Nomadics, Oklahoma City, OK)를 사용하여 이루어졌다.
실시예 5
카오트로픽 염에 의한 선택적인 항원-항체 분리. 선택적인 분리에 대한 조건은 블랭크 플레이트 및 Aβ-코팅 플레이트에 결합하는 항체의 결합활성을 우선 측정함으로써 결정하였다. 그 다음 본 발명자들은 블랭크 또는 아밀로이드 플레이트에의 결합 사이의 최적의 분리를 제공하는데 필요한 카오트로픽 염(티오사이안산암모늄)의 몰농도를 결정하였다(Pullen et al., J Immunol Methods ., 86:83-87 (1986)). 간략하게, Aβ-코팅 ELISA 플레이트는 상기 기술된 바와 같이 PBST 중에 희석된 인간 혈장 또는 쥐 단일클론 항-Aβ 항체(1 ㎍/㎖)와 함께 항온처리하였다. 웰을 비우고, 50 mM 인산나트륨(pH 6.0) 0.2㎖, 또는 농도가 증가하는 티오사이안산암모늄을 포함하는 완충액을 웰의 각각의 세트에 4중으로 첨가하였다. 플레이트를 30분 동안 25℃에서 항온처리하고, PBST로 3회 세척하였으며, 상기 기술된 바와 같이 표준 ELISA에 대하여 진행시켰다.
실시예 6
친화 정제에 의한 항-아밀로이드 항체의 분리. 아미노 또는 카복실 말단에서 수지에 Aβ 펩타이드를 결합시킨 항-Aβ 단량체 항체의 친화 정제를 위한 수지를 상업적으로 획득하였다(Alpha Diagnostic Intl., San Antonio, TX). 항-Aβ 올리고머 및 항-Aβ 피브릴 항체를 위한 수지는 상기 기술된 바돠 같이 제조된 Aβ 올리고머 및 피브릴을 제조자에 의해 추천된 바와 같이 N-하이드록시석신이미드-활성화 세파로스 4 패스트 플로우(N-hydroxysuccinimide-activated Sepharose 4 Fast Flow)에 결합시킴으로써 제조하였다. 컬럼을 PBS 중에서 평형화시키고, PBS 중 10㎎/㎖로 희석된 5g/㎖ IVIG를 500㎖의 적어도 5회의 완전 통과 동안 0.5㎖/분으로 컬럼을 통과시킨 후, PBS 및 1M 글리신이 있는 표준 용리액(pH 2.5)으로 세척하였다. 용리된 IgG는 즉시 중화시키고, 한외여과 스킨 컬럼 상에서 원심분리에 의해 농축하며 PBS에 대하여 투석하였다.
실시예 7
항-Aβ 항체 측정 동안 블랭크 플레이트 결합. 인간 혈장 또는 혈청 중 항-Aβ 항체의 정량화는 대부분의 경우에 단량체 또는 응집된 (올리고머 또는 피브릴) Aβ 펩타이드를 보유하는 ELISA 플레이트 상에서 수행되어 왔다. 이러한 방법에 의해 분석되는 정상 인간 공여체로부터의 혈장 샘플은 블랭크 ELISA 웰(임의의 첨가된 항원을 보유하지 않은 웰)에 상당하게 결합한다. 탈지유, 우태아혈청, 알부민 및 상업적인 차단 제조물과 같은 전통적인 차단제의 사용에도 불구하고 광범위하고, 비특이적인 블랭크 플레이트 결합이 일어난다(Klaver et al ., J. Neurosci. Meth. 187, 263-269). 블랭크 ELISA 플레이트에 결합의 정도는 혈장 공여체에 걸쳐서 가변적이다(도 1).
블랭크 ELISA에의 결합은 또한 혈장 샘플로부터 분리된 정제된 IgG 및 IVIG와 같이 수집된 면역글로불린 제조물을 이용하여 일어난다. IVIG는 블랭크, Aβ 단량체, Aβ 올리고머 및 Aβ 피브릴 플레이트에 포화가능한 농도-의존성 방식으로 결합한다. A450nm 단위로 최대 결합값은 각각 4.54(블랭크), 2.7(단량체), 2.88(올리고머) 및 2.82(피브릴)이었다. ELISA 곡선의 최상의 맞춤에 기초하여, 흡광도 단위로 IVIG에 대한 최대 결합은 아밀로이드 보유 플레이트 중 임의의 것 상에서보다 블랭크 플레이트 상에서 대략 1.6배 더 크다. 유사한 결과가 정상 개체 또는 AD 환자의 혈장으로부터 분리된 IgG에 대하여 얻어졌다. 최대 결합의 절대값은 개체에 따라서 상이하였다. 블랭크 플레이트에 대한 IVIG의 상당한 결합은 아밀로이드-보유 플레이트에 비하여 블랭크 플레이트 상에서의 보다 많은 잠재적인 항체 결합 부위를 나타낸다.
최대 결합 진폭의 차이에도 불구하고, 블랭크 ELISA 웰에 항체의 결합의 겉보기 역가는 일반적으로 Aβ 펩타이드 또는 이의 집합체를 포함하는 웰에 결합하는 항체보다 더 낮았다. IVIG에 대한 블랭크 플레이트의 최대 절반 결합 역가(half maximum binding titer)는 항-Aβ 단량체, Aβ 올리고머 및 Aβ 피브릴 항체에 대한 것보다 각각 17.6배, 3.9배 및 6.5배 더 낮았다. 전형적인 최대 절반 역가 값은 2.44(블랭크 플레이트), 42.84(단량체), 9.42(올리고머), 및 15.85(피브릴)이었다. 대부분의 개체 공여체의 혈장으로부터 분리된 IgG를 이용하여 유사한 결과를 얻었다. 블랭크 플레이트 결합의 정도는 개체에 걸쳐서 다양하였지만, ELISA 곡선 맞춤으로부터 유래한 최대 결합값은 항-아밀로이드 항체보다 블랭크 플레이트에 대하여 항상 더 높았다. 이는 블랭크 플레이트 결합의 추가된 영향 때문에 역가 커브보다 단일 희석에 기초한 항-아밀로이드 항체 수준의 측정이 과대평가될 가능성이 있음을 시사한다.
빈 웰에 대하여 얻은 관찰된 흡광도 값이 아밀로이드-보유 플레이트에 대하여 얻은 것과 비슷하거나 또는 훨씬 더 클 수 있으므로, 블랭크 ELISA에 결합하는 능력을 가지는 항체의 존재는 개체에서 항-Aβ 올리고머 항체의 측정을 복잡하게 한다(도 1). 이는 플레이트-결합 항체가 동일한 것을 의미하지 않는다. 사실 사용된 농도에서 빈 웰로 얻은 흡광도는, 항체가 모두 동일한 특이성을 가지지 않음을 시사하는 도 1에 나타낸 22명의 개체 중 6명에서 아밀로이드를 포함하는 웰에 대한 것보다 더 컸다. 따라서 블랭크 플레이트 결합은 일부 경우에 블랭크 플레이트와 아밀로이드-보유 플레이트 모두에 결합할 수 있는 다가 항체의 존재를 반영할 수 있다.
실시예 8
블랭크 플레이트 결합은 Fab 매개된다 . 플레이트 결합 상호작용의 성질을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 5명의 개체로부터 IgG의 상업적으로 이용가능한 집단뿐만 아니라 이의 동일한 집단으로부터 분리된 Fab, Fab2' 및 Fc 절편의 결합을 시험하였다. 본 발명자들은, 블랭크 ELISA 웰에 대한 항체의 결합이 다른 도메인을 수반하는 비특이적인 상호작용과는 대조적으로 IgG 분자의 항원-결합 영역(Fab)에의 결합의 결과임을 발견하였다. 도 2는 IgG의 항원-결합 영역(Fab 및 Fab2' 절편)이 면역글로불린 분자의 다른 도메인을 통한 비특이적 상호작용보다 빈 웰에 대한 결합을 담당함을 나타낸다.
실시예 9
블랭크 플레이트 결합 항체의 감소. 혈장 샘플로부터의 IgG의 분리는 블랭크 ELISA 플레이트에 대한 항체의 결합을 제거하지 않는다. 폴리스타이렌 및/또는 아가로스의 컬럼에 대한 IVIG의 통과가 이들 기질에 용이하게 결합하는 IgG 분자를 감소시키고 블랭크 ELISA 웰에 대한 IVIG의 결합을 감소시키는 것이 가능할 것인지의 여부를 시험하였다. 감소는 블랭크 플레이트 결합 항체에 대하여 특이적이지 않았다. 블랭크 플레이트 및 Aβ-보유 플레이트로 얻은 흡광도의 절대 비율은 컬럼 크로마토그래피에 관계없이 상대적으로 일정하였다. 이러한 접근법에 대한 추가의 결점은 항-Aβ-결합 항체의 전체 양이 모든 감소 절차에 의해 상당히 감소되며, 이는 Aβ에 결합하는 항체 중 일부가 또한 아가로스 또는 폴리스타이렌에 부착할 수 있음을 시사한다. 이러한 결합은 Aβ 및 폴리스타이렌을 포함하여 다수의 관련되지 않은 에피토프에 결합하는 낮은 친화력의 다가 항체에 기인할 가능성이 높다.
임의의 항-Aβ 항체의 다가에 대한 더 많은 직접적인 증거가 혈장 단백질인 티로글로불린을 사용한 경쟁 연구로부터 나온다(도 3). 티로글로불린이 경쟁자로서 사용될 때, Aβ 펩타이드-보유 ELISA 웰에 대한 IVIG의 결합은 감소하였으며, 이는 IVIG 중 항-Aβ 항체의 큰 집단이 다가이고 상기 단백질 모두에 결합할 수 있음을 확인하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 티로글로불린-보유 ELISA 플레이트에 대한 IVIG의 결합을 완전히 제거한 티로글로불린의 농도는 대조군 값의 대략 50%로 Aβ 플레이트에 대한 IVIG의 결합을 감소시킨다.
실시예 10
카오트로픽 염에 의핸 블랭크 플레이트 결합의 감소. 결합활성에서의 차이점에 기초하여 Aβ에 결합한 항체로부터 블랭크 웰에 결합한 항체를 분리하는 잠재력을 시험하였다. 결합활성 측정은 카오트로픽 염인 티오사이안산암모늄의 농도 증가를 사용하여 실행하여 ELISA 플레이트상에서 형성된 항체/항원 복합체를 분리하였다. 웰이 블랭크이거나 구형 Aβ 올리고머로 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 IVIG의 결합을 비교하였다. 도 4는 IVIG 중 항-구형 Aβ 올리고머 항체의 결합활성이 블랭크 플레이트에 대한 IVIG의 결합에 대하여 관찰되는 것보다 분명히 더 큼을 보이는 전형적인 실험을 나타낸다. 블랭크 플레이트 상에서, 인산염 완충액 조절 조건에 대하여 보여지는 결합의 50%는 플레이트가 대략 2.5M 티오사이안산암모늄 중에서 항온처리될 때 일어난다. Aβ 올리고머-보유 플레이트에 대하여, 50% 결합으로의 감소는, 본 연구에서 사용된 가능 높은 농도인 4M 티오사이안산암모늄에서 조차도 달성되지 않는다. 몇몇의 독립적인 방법, 예를 들어 교차 결합 및 비교차 방법(Barghorn et al., J Neurochem ., 95:834-847 (2005); Kayed et al., Molecular Neurodegeneration, 2:18-29 (2007))에 의해 제조된 Aβ 올리고머는 본질적으로 동일한 결과를 제공하였다.
이러한 결과는 적어도 일부 항-Aβ 올리고미 항체가 결합 활성에 기초하여 블랭크 플레이트에 결합하는 항체와 구별될 수 있음을 시사한다. 이러한 가설을 추가적으로 시험하기 위하여, 본 발명자들은 A 글로불로머를 보유하는 친화성 컬럼의 통과에 의하여 높은 친화력의 항-Aβ 올리고머 항체의 IVIG를 감소시켰다. 항-Aβ 올리고머-감소 IVIG에 대하여 구형 Aβ 올리고머의 50% 최대 결합을 달성하기에 필요한 카오트로픽 염의 농도는 티오사이안산암모늄이 >4M에서 1.3M로 감소하였다. 유사하게, 빈 웰에 있어서 티오사이안산암모늄이 2.5M에서 0.9M로 감소하였다. 이러한 결과는 인간 레퍼토리 중 일부 항체가 Aβ 올리고머 및 빈 웰 모두와 상호작용함을 시사한다. 그러나 또한 Aβ 올리고머에 대하여 특이적으로 높은 결합활성을 가지는 항체가 있다.
실시예 11
항체 결합 후 티오사이안산암모늄 중의 항온처리가 높은 친화력의 항-Aβ 올리고머 항체와 빈 ELISA 웰에 대하여 보다 난잡하게 결합하는 항체 사이에서 차이가 있을 수 있게 하는 것을 확인하기 위하여, 개체 4명(젊은이 2명, 노인 2명의 대조군)으로부터의 혈장 중 IgG 및 정제된 IgG의 결합활성을 측정하였다(도 5). 이들 개체로부터 정제된 IgG(1㎎/㎖)는 빈 웰에 대한 결합과 일관성을 나타내었다. 블랭크 플레이트 결합에 대하여 관찰된 흡광도는 4M 티오사이안산염 처리 후 약 80%로 감소하였고; 이는 실시예 10에서 IVIG로 얻은 결과와 유사하였다. 반대로, Aβ42 올리고머를 보유하는 웰에 대한 상대적인 결함은 단지 약 20%만 감소하였다. Aβ 올리고머와 같이, 항-Aβ 단량체 및 항-Aβ 피브릴 항체는 모두 블랭크 플레이트에 대한 항체 결합 보다 티오사이안산암모늄 분리에 대하여 저항성이 더 크다. 따라서, 빈 ELISA 웰에 결합하는 능력이 있는 항체로부터 최소 방해가 있는 정제된 인간 항체의 혼합물 중 항-Aβ 항체의 측정을 가능하게 하는 조건의 세트를 한정하는 것이 가능한 것으로 보인다.
실시예 12
산 및 불안정화제에 의한 다가 항체의 생성. 심지어 가벼운 산성 조건에 혈청의 노출은 다가 항체의 역가를 증가시키는 것으로 보여졌으며, 상기 항체 중 다수는 자기 항원을 표적화한다(Bouvet et al., J Autoimmun., 16:163-172 (2001); Djoumerska et al., Scand J of Immunol., 61: 357-363 (2005)). 가벼운 산성화에 의한 다가의 생성은 또한 pH 변화가 항원 결합 부위의 부분적인 변성을 통하여 다가 결합의 증가를 초래하는 특이적인 단일클론 항체에 대하여 보고되었다(Dimitrov et al., Molec Immunol , 44:1854-1863 (2007)). 본 발명자들은 여러 가지의 많은 IVIG(Gammaguard, Baxter)를 시험하였고, pH 3.0에서의 산성화는 3.7배 내지 9.8배의 범위로 Aβ 단량체 역가의 초래하였다. 역가의 이러한 증가는 중성 pH 및 실온에서 24시간 항온처리 기간에 의하여 반전되었다. pH 2.0에서 항온처리에 의한 다가의 생성은 완전히 가역적이지 않았다. 이는 매우 낮은 pH에서의 항온처리는 항체의 구조적 완전성(integrity)을 비가역적으로 변경시키며, 그럼에도 불구하고 다양한 항원에 비특이적으로 결합하는 능력을 유지함을 시사한다.
보다 엄격한 변성 처리인 6M 유레아에의 노출은 또한 IVIG에 존재하는 다수의 자기 항체의 겉보기 역가를 증가시킨다. PBS 중 IVIG(10㎎/㎖)는 PBS 단독에 대하여 또는 6M 유레아와 함께 투석하였다. 항체 역가에서의 증가는 유레아 처리 후 항체 역가를 PBS 대조군의 항체 역가로 나눔으로써 계산하였다(Wardemann et al., Science, 301:1374-1377 (2003). 표 1에 나타낸 결과는 각각의 자기 항원에 대하여 2가지 실험의 최소값의 평균이다. 표 1은 6M 유레아 처리가 Aβ를 포함한 자기 항원의 세트에 대하여 IVIG 중 항체의 결합을 증가시켰음을 나타낸다. 증가는 대조군 IVIG 제조물과 비교하여 유레아 처리 후 4배 내지 23배의 범위이었으며, 가장 큰 효과는 Aβ 펩타이드에 대하여 관찰되었다. 그로므로, IgG의 부분적 변성은 혈청 항-Aβ 항체의 역가를 증가시키며, 짐작컨대 항원 결합 부위를 변경시킴으로써 보다 난잡한 결합을 가능하게 할 것이다.
6M 유레아*에 대한 투석 후 IVIG 중 항체 역가의 증가
자기 항원 역가 증가(배수)
Aβ42 펩타이드 단량체 23
티로글로불린 9
LPS+ 4
ssDNA+ 6
dsDNA+ 5
인슐린+ 5
산 또는 기타 다른 변성 조건에의 노출에 의한 Aβ 결합 활성의 인공적인 생성은 정제된 인간 IgG 제조물에서 항-Aβ 항체 역가의 측정에 대하여 중요한 것을 암시한다. 예를 들어, 정상 대조군에서 단백질 G 방법에 의해 정제된 IgG에 의한 블랭프 플레이트 결합에 대한 최대 절단 역가는 원래 혈장에 대한 최대 절반 역가보다 평균 100배 초과로 더 높았다. 이러한 동일한 개체에서, 50배 증가는 올리고머 플레이트에의 결합에 대한 산성화 후에 확인되었다. 적어도 부분적으로 IgG를 변성시킬 수 있는 방법, 예컨대 G 단백질 수지로부터의 산 용리에 의한 인간 IgG의 정제는 산 유도 다가로 인하여 인공적으로 높은 역가를 초래한다.
실시예 13
비변성 IgG 정제의 영향. 그 다음 본 발명자들은 친황성 흡착제 크로마토그래피에 의한 IgG의 분리가 산 용리와 연관된 다가의 생성을 피할 것인지의 여부를 조사하였다. 친황성 흡착제 크로마토그래피는 설폰기가 티오에테르에 근접하게 존재하는 모이어티에 대한 IgG의 결합을 이용한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 IgG는 혈장에 존재하는 대다수의 비면역글로불린 단백질을 제거한다. 친황성 흡착제는 G 단백질 크로마토그래피보다 기타 다른 혈장 구성 성분을 제거하는데 다소 덜 효과적인 반면, 면역글로불린은 다가의 생성을 조성할 수 있는 변성 조건에 처해지지 않는다. 이러한 주장과 일치하여, 친황성 흡착제를 사용하여 IVIG로부터의 IgG의 재정제는 Aβ 또는 블랭크 플레이트에 결합하는 항체의 역가를 변경시키지 않는다.
다양한 방법에 의해 정제된 것과 전체 혈장 중 항-Aβ 항체의 결합을 비교하기 위하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 상기 기술한 바와 같이 이용하였다. 본 발명자들은 친황성 흡착제 또는 G 단백질 크로마토그래피에 의해 동일한 혈장으로부터 정제된 IgG에 대하여 정상 대조군으로부터의 전체 혈장의 결합을 비교하였다. 측정은 Aβ 올리고머 센서 상에서 수행하였다. Aβ 올리고머 센서는 Neutravidin에 결합된 비오틴화 Aβ 올리고머를 포함하였으며, 상기 Neutravidin은 센서 상의 PEG 사슬에 공유적으로 결합하였다.
3가지 제조물의 비슷한 농도에 대한 SPR 반응 곡선이 도 7에 나타내어져 있다. 친황성 시약에 의해 정제된 IgG는 전체 혈장보다 보다 적극적인 변형을 산출한다. 이러한 차이점은 Aβ 결합과 함께 혈장 단백질에 의한 방해의 감소를 아마도 반영할 것이다. IgG가 친황성 크로마토그래피에 의해 분리될 때, 블랭크 플레이트 결합에 대한 최대 절반 역가에서의 증가는 혈장보다 대략 3배 더 크고, 올리고머 플레이트에 대한 결합에 대한 최대 절반 역가에서의 증가는 거의 5배 더 컸다. 따라서, Aβ 올리고머 플레이트에의 특이적 결합은 친황성 분리 방법을 이용하여 개선되며, 이는 아마도 혈장 단백질의 제거를 반영할 것이다.
G 단백질 크로마토그래피에 의해 정제된 IgG는 항원 보유 플레이트보다 대조군 센서에 대하여 더 큰 결합을 나타내는, 두드러지게 상이하고 부정적인 반응을 나타내었다. 대조군 센서는 말단에 알라닌을 이용한 PEG 코팅이 있으며, G 단백질 크로마토그래피 후에 부정적인 반응은 아마도 산 노출 후 IgG에서 새로운 다가 특이성의 형성으로 생성될 것이고, 다가 특이성 중 적어도 일부는 대조군 센서 상의 PEG 코팅을 인식한다.
실시예 14
혈장 항-아밀로이드 활성의 측정. 인간 혈장에서 측정되는 항-아밀로이드 활성이 배타적으로 천연 또는 유도된 다가의 결과인지 여부를 측정하기 위하여, 친화 크로마토그래피가 항-Aβ 단량체, Aβ 올리고머 및 Aβ피브릴 항체를 포함하는 IVIG로부터 다양한 특이성의 인간 항-아밀로이드 항체를 분리하는데 사용되었다. 항-Aβ 단량체 항체의 경우에, 2가지 유형의 항체를 분리하였다. Aβ 단량체에 결합된 항체의 제1세트는 아미노 말단에서 친화 수지와 결합하였고(항-AβN), Aβ 단량체에 결합된 제2세트는 카복실 말단에서 결합하였다(항-AβC).
본 발명자들은 SPR 분석에 의해 항-Aβ 단량체 및 항-올리고머 항체의 2가지 유형에 대하여 해리 상수를 결정하였다. 표 2는 본 발명자들이 분리한 항-아밀로이드 항체, 아미노 말단 근체에 위치하는 Aβ 에피토프에 결합하는 단일클론 항-Aβ 항체인 6E10에 대한 Kd 측정값을 나타낸다. Kd 값은, 친화 정제에 사용된 결합 친화력이 아밀로이드의 동일한 형태를 포함하는 센서보다 더 높으므로 친화 정제된 항체가 상이한 특이성을 가짐을 나타낸다. 그러나 일부 중복되는 특이성이 있을 수 있다. 모든 친화 정제된 항체 제조물은 블랭크 ELISA 플레이트의 웰에 대한 결합을 나타내었다. 블랭크 웰 결합에 대하여 얻어진 다양한 아밀로이드 플레이트 상에서 확인된 OD의 백분율은 상이한 친화 정제된 항체 제조물로 다양하였다. 예를 들어, 항-AβN 항체의 경우에, 블랭크 웰에 대한 결합은 단량체 웰에 대한 결합의 대략 28%, 피브릴 웰에 대한 결합의 15% 및 올리고머 웰에 대한 결합의 본적적으로 모두와 동일하였다.
IVIG로부터의 친화 정제된 항-아밀로이드 항체의 Kd
센서 항체 Kd(nM)
C-말단 단량체 C-말단 단량체 650
N-말단 단량체 24,000
올리고머 20,000
6E10 47
N-말단 단량체 C-말단 단량체 1,900
N-말단 단량체 450
올리고머 4,000
6E10 158
올리고머 C-말단 단량체 4,400
N-말단 단량체 2,300
올리고머 590
6E10 69
표 3은 IVIG로부터 분리한 친화 정제된 항-Aβ 항체의 블랭크 플레이트 결합 특성을 요약한다. 항-피브릴의 경우에, 2가지 상이한 제조물을 분석하였다. 제1항체 제조물은 Aβ42 피브릴 컬럼 상에서 친화 정제하였고, Aβ 펩타이드 및 피브릴화(fibrillization)와 연관된 구조적 네오-에피토프에 대한 항체를 포함한다. 항-Aβ 피브릴 항체의 제2 제조물은 IAPP(아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드) 피브릴 컬럼 상에서 두번째 친화 정제하였고, 짐작컨대 피브릴과 연관된 네오-에피토프에 대한 항체만을 포함한다(O'Nuallain et al., J Immunol ., 176:7071-7078 (2006)). 후자의 분획은 감소된 블랭크 플레이트 결합을 나타내었다.
친화 정제된 항-Aβ 항체의 블랭크 플레이트 결합. 아밀로이드 플레이트 결합에 대한 블랭크 플레이트 결합의 비율.
친화 정제된 항체 ELISA 플레이트
단량체 올리고머 피브릴
항-AβN 단량체 0.28 1.00 0.15
항-AβC 단량체 0.56 0.36 0.49
항-Aβ 올리고머 0.58 0.73 0.62
항-Aβ 피브릴 #1* 0.72 1.00 0.62
항-Aβ 피브릴 #2** 0.27 0.63 0.13
* 피브릴 Aβ42 친화 수지의 통과에 의한 정제
** 피브릴 Aβ42 친화 수지 통과에 의한 정제 후 피브릴 IAPP 수지 상에서의 재정제
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Claims (62)

  1. 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 상기 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계; 및
    (c) 잔여 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합특성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  4. 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 상기 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 아밀로이드 관련 질환 또는 병태의 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 상기 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원 및 낮은 친화력의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계;
    (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 면역글로불린 제조물(immunoglobulin preparation)의 투여를 포함하는 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 치료는 신체적 또는 사회적 활동을 포함하는 것인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 콜린에스테라제 억제제, 부분적 글루타메이트 길항제, 또는 정신과 약물을 포함하는 것인 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합활성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질(Apolipoprotein) AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체를 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머를 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴을 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드 항체인 것인 방법.
  17. 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 치료에 대한 후보자인 개체를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 해당 샘플에 존재하는 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당 아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (d) 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 치료로부터 개체가 이익을 얻을 것인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 치료는 면역글로불린 제조물의 투여를 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 치료는 신체적 또는 사회적 활동을 포함하는 것인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 콜린에스테라제 억제제, 부분적 글루타메이트 길항제, 또는 정신과 약물을 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 아밀로이드 단백질과 연관된 질환으로 진단받은 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병인 것인 방법.
  25. 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계;
    (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합특성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  28. 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 상기 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당 아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (d) 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 개체를 진단하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  30. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병, 제2형 당뇨병, 파킨슨병, 전염성 해면양뇌증, 헌팅턴병, 갑상샘 수질암, 부정맥, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 대동맥 내측 아밀로이드, 프로락틴종, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증, 유전성 비신경병증성 전신 유전분증, 투석 관련 유전분증, 핀란드 유전분증, 격자 각막 이영양증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증(아이슬란드 유형), 및 전신 AL 유전분증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병인 것인 방법.
  32. 제6항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 면역글로불린 제조물의 치료적으로 유효한 양을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제6항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 신체적 또는 사회적 활동을 포함하는 것인 방법.
  34. 제6항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 콜린에스테라제 억제제, 부분적 글루타메이트 길항제, 또는 정신과 약물을 포함하는 것인 방법.
  35. 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원 및 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계;
    (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합특성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  38. 개체에서 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 상기 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당 아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (d) 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 진행에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계;
    (c) 잔여 복합체의 수준을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전체 혈장 또는 이의 분획인 것인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합특성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  44. 아밀로이드 단백질과 연관된 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 상기 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당 아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계;
    (d) 상기 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 항-아밀로이드 항체의 수준을 대조군의 수준과 비교함으로써 질환의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전체 혈장 또는 이의 분획인 것인 방법.
  47. 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 생물학적 샘플을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) (i) 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 복합체; 및 (ii) 아밀로이드 항원 및 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하기에 적당한 조건 하에서, 개체로부터의 생물학적 샘플을 복수의 아밀로이드 항원과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 형성된 아밀로이드 항원 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하여 아밀로이드 항원, 및 낮은 친화력의 또는 비특이적인 항체를 포함하는 적어도 하나의 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 친황성 크로마토그래피에 의해 준비된 면역글로불린 조성물인 것인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 비특이적인 항체는 낮은 결합특성의 항-아밀로이드 항체인 것인 방법.
  50. 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 생물학적 샘플을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 생물학적 샘플을 항-아밀로이드 항체에 결합하는 친황성 수지와 접촉시키는 단계;
    (b) 비변성 pH에서 상기 친황성 수지로부터 상기 항체를 용리시켜 용리액을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 용리액을 아밀로이드 항원과 접촉시켜 해당 아밀로이드 항원 및 상기 항-아밀로이드 항체를 포함하는 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 형성된 복합체를 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  52. 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 키트로서, 카오트로픽제 및 친황성 크로마토그래피 흡착제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 키트.
  53. 제52항에 있어서, 카오트로픽제 및 친황성 크로마토그래피 흡착제를 모두 포함하는 것인 키트.
  54. 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하는 키트의 제조를 위한 카오트로픽제 및/또는 친황성 크로마토그래피 흡착제의 용도.
  55. 생물학적 샘플에 존재하는 높은 결합활성의 항-아밀로이드 항체를 검출하기 위한 키트의 제조를 위하여 조합한 카오트로픽제 및 친황성 크로마토그래피 흡착제의 용도.
  56. 제17항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 베타 아밀로이드(Aβ; 아베타), 아일렛 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP; 아밀린), 알파-시누클레인(SNCA), 주요 프리온 단백질(PrP), 헌팅틴(HD), 칼시토닌(CCP), 심방 나트륨이뇨성 인자(ANF), 아포지방단백질 AI(Apo-A1), 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 메딘 아밀로이드(유지방구-EGF 인자 8 단백질의 절편; MFG-E8), 프로락틴(PRL), 트랜스티레틴(ATTR), 라이소자임 C(1,4-베타-N-아세틸뮤라미다제 C), 베타 2 마이크로글로불린(β2M), 겔솔린(AGEL), 형질 전환 생장 인자-베타-유도 단백질 ig-h3(베타 ig-h3; 케라토에피텔린), 시스타틴 C(CST3), 면역글로불린 경쇄(AL), 및 폴리Q 반복을 지니는 아밀로이드 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 아밀로이드 단백질에 대하여 특이적인 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 단량체를 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 올리고머를 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 단백질 피브릴을 특이적으로 인식하는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-아밀로이드 항체는 항-베타 아밀로이드 항체인 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 인간 유래의 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카오트로픽제는 티오사이안산 염인 것인 방법.
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