KR20130127985A - 글루코스-의존 인슐린 친화성 펩티드 유사체 - Google Patents

글루코스-의존 인슐린 친화성 펩티드 유사체 Download PDF

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와지하 칸
조셉 스위스톡
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드(GIP)의 유사체인 화합물 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 상기 화합물은 GIP 수용체의 작용제로서 활성을 갖는다.

Description

글루코스-의존 인슐린 친화성 펩티드 유사체{GLUCOSE-DEPENDENT INSULINOTROPIC PEPTIDE ANALOGS}
본 발명은 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드(GIP)의 유사체인 화합물 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은, 예컨대 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 공복 혈당 장애 및 내당능 장애를 포함하는 대사 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 (D)Tyr; DesNH2-Tyr; (D)Phe; DesNH2-Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl(D)Phe; 3-Cl(D)Phe; 4-Cl(D)Phe; 2-F(D)Phe; 3-F(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 및 3,4,5-TriF(D)Phe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 Lys 또는 Ala이고;
R3은 Lys 또는 PEG화된 Lys이고;
Y는 아실이고;
R1이 (D)Tyr; (D)Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl-(D)Phe; 3-Cl-(D)Phe; 4-Cl-(D)Phe; 2-F-(D)Phe; 3-F-(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 또는 3,4,5-TriF(D)Phe일 경우 n은 1이고;
R1이 DesNH2-Tyr; (D)Phe 또는 DesNH2-Phe일 경우 n은 0이다.
인슐린은 간, 근육 및 지방 조직에서 글루코스의 흡수를 자극함으로써 글루코스의 대사 조절에서 중요한 역할을 하는 호르몬이다. 글루코스는 이와 같은 조직에 저장되고 에너지를 위해 대사된다. 인슐린 생산의 실패, 인슐린 조절 장애 또는 인슐린 내성은 대사 질환 또는 장애, 예컨대 당뇨병을 야기한다.
글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드(GIP)는 상부 위장관에 의해 분비되는 42-잔기 펩티드이다. 탄수화물 및 지질 모두는 GIP의 분비를 자극한다. GLP-1과 함께, GIP는 인슐린의 방출을 자극할 수 있음을 의미하는 인크레틴(incretin)이다. GIP의 효과는 GIP가 GIP 수용체(GIPR)에 결합함으로써 이루어진다. 상기 결합은 췌장의 β-세포에서 글루코스에 의해 자극된 인슐린 방출을 용이하게 해주는 cAMP를 자극하는 것으로 여겨진다.
생체내에서, 천연 GIP는 2개의 N-말단 잔기 Tyr-Ala를 제거하는 효소 다이펩티딜 펩티다아제 IV(DPPIV)에 의해 신속히 분해된다. 생체내의 천연의 GIP의 반감기는 종에 따라 약 2 내지 7분이다. 대사물질(GIP 3 내지 42)은 GIPR을 활성화시키지 않으며, 사실상, GIPR의 길항제 역할을 한다. 또한, 상기 대사물질은 인체에서 쉽게 제거된다. 이와 같은 이유로, 치료법으로서 천연 GIP의 효과는 제한된다.
본 발명은 천연의 GIP에 비해 개선된 혈장 안전성 및 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 동시에, GIP 효능 및 GIPR에 결합할 수 있는 능력을 보유한, 그들의 작용제 역할을 하는 절단된 GIP(1 내지 42) 유사체의 개발에 관한 것이다.
도 1은 실시예 20의 화합물을 함유하는 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 실시예 20의 정제된 화합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 실시예 20의 화합물의 말디-토프(MALDI-TOF) 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 실시예 21의 화합물을 함유하는 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 실시예 21의 정제된 화합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 실시예 21의 화합물의 말디-토프 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 실시예 22의 화합물을 함유하는 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 22의 정제된 화합물의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 실시예 22의 화합물의 말디-토프 스펙트럼을 나타낸다.
본원에 언급된 모든 펩티드 서열은, 다른 언급이 없다면 통상적인 관습에 따라 N-말단 아미노산이 좌측에 기재되고 C-말단 아미노산이 우측에 기재된다. 2개의 아미노산 잔기 사이에 있는 짧은 선은 펩티드 결합을 나타낸다. 아미노산이 이성질성 형태인 경우, 달리 명시되지 않는다면 상기 아미노산은 L 형태이다. 특별히 언급되지 않는다면, 잔기는 PEG화된 것이 아니다.
본 발명의 기술에서 편의상, 다양한 아미노산 잔기를 위한 통상적이고 비통상적인 약어가 사용된다. 상기 약어는 당해 분야의 숙련자에게 익숙하지만, 명확하게 하기 위해 하기에 열거하였다.
Asp=D=아스파르트산; Ala=A=알라닌; Arg=R=아르기닌; Asn=N=아스파라진; Gly=G=글라이신; Glu=E=글루탐산; Gln=Q=글루타민; His=H=히스티딘; Ile=I=이소류신; Leu=L=류신; Lys=K=라이신; Met=M=메티오닌; Phe=F=페닐알라닌; Pro=P=프롤린; Ser=S=세린; Thr=T=트레오닌; Trp=W=트립토판; Tyr=Y=타이로신 및 Val=V=발린.
또한 편의상, 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 공지된 하기 약어 또는 부호가 본 발명에 사용된 잔기, 시약 등을 나타내기 위해 사용된다.
(D)Tyr: D-타이로신
DesNH2-Tyr: 데스아미노타이로신
(D)Phe: D-페닐알라닌
DesNH2-Phe: 데스아미노페닐알라닌
(D)Trp: D-트립토판
(D)3Pya: D-3-피리딜알라닌
2-Cl-(D)Phe : D-2-클로로페닐알라닌
3-Cl-(D)Phe : D-3-클로로페닐알라닌
4-Cl-(D)Phe : D-4-클로로페닐알라닌
2-F-(D)Phe: D-2-플루오로페닐알라닌
3-F(D)Phe: D-3-플루오로페닐알라닌
3,5-DiF-(D)Phe: D-3,5-다이플루오로페닐알라닌
3,4,5-TriF-(D)Phe: D-3,4,5-트라이플루오로페닐알라닌
SSA: 숙신이미딜 숙신아미드
PEG: 폴리에틸렌 글라이콜
PEGm: (메톡시)폴리에틸렌 글라이콜
PEGm(12,000): 약 12kD의 분자량을 갖는 (메톡시)폴리에틸렌 글라이콜
PEGm(20,000): 약 20kD의 분자량을 갖는 (메톡시)폴리에틸렌 글라이콜
PEGm(30,000): 약 30kD의 분자량을 갖는 (메톡시)폴리에틸렌 글라이콜
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카보닐
DMF: 다이메틸포름아미드
DIPEA : N,N-다이이소프로필에틸아민
TFA: 트라이플로오로아세트산
HOBT: N-하이드록시벤조트라이아졸
BOP: 벤조트라이아졸-1-일옥시-트리스-(다이메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트
HBTU: 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트
NMP: N-메틸-피롤리돈
FAB-MS: 고속 원자 충격 질량 분석법
ES-MS : 전자 분사 질량 분석법
본원에 사용된 "PEG 부분"은 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 이들의 유도체, 예컨대 (메톡시)폴리에틸렌 글라이콜(PEGm)을 가리킨다.
본원에 사용된 "PEG화된 펩티드"는 1개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신이 PEG 부분과 공액결합된 펩티드를 가리킨다. "공액결합"은 PEG 부분이 상기 잔기에 직접 연결되거나 스페이서 부분(spacer moiety)(예컨대 가교결합제)을 통해 잔기에 연결되는 것을 의미한다. 상기 공액결합이 리신 잔기에서 일어날 경우, 리신 잔기는 본원에서 "PEG화된 Lys"라고 일컬어진다. 오직 1개의 PEG 부분과 공액결합된 펩티드는 "모노-PEG화된"것으로 일컬어진다.
본원에 사용된 "Lys-PEG" 및 "Lys-PEGm"은 각각 PEG 및 PEGm과 공액결합된 리신 잔기를 가리킨다. "Lys(엡실론-SSA-PEGm)"은 엡실론-아미노 기가 적절하게 기능화된 SSA를 사용하여 PEGm과 가교결합된 리신 잔기를 가리킨다. "Lys(엡실론-SSA-PEGm(12,000))"은 엡실론-아미노 기가 적절하게 기능화된 SSA를 사용하여 PEGm(12,000)과 가교결합된 리신 잔기를 가리킨다. "Lys(엡실론-SSA-PEGm(20,000))"은 엡실론-아미노 기가 적절하게 기능화된 SSA를 사용하여 PEGm(20,000)과 가교결합된 리신 잔기를 가리킨다. "Lys(엡실론-SSA-PEGm(30,000))"은 엡실론-아미노 기가 적절하게 기능화된 SSA를 사용하여 PEGm(30,000)과 가교결합된 리신 잔기를 가리킨다.
본원에 사용된, "약학적으로 허용되는 염"은 화학식 I의 화합물의 임의의 약학적으로 허용되는 염을 의미한다. 염은 무기 및 유기 산 및 염기를 포함하여, 약학적으로 허용되는 비독성 산 및 염기로부터 제조될 수 있다. 상기 산은 아세트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캠포설폰산, 시트르산, 에텐설폰산, 다이클로로아세트산, 포름산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 질산, 옥살산, 팜산, 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타타르산, 트라이플루오로아세트산, 옥살산 및 p-톨루엔설폰산 등을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 산은 푸마르산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 숙신산, 황산, 트라이플루오로아세트산 또는 메탄설폰산이다. 허용되는 염기 염은 알칼리 금속(예컨대, 나트륨, 칼륨), 알칼리 토금속(예컨대, 칼슘, 마그네슘) 및 알루미늄 염을 포함한다.
용어 "약학 제형"은 그들 안에 함유되어 있는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고 상기 제형이 투여되는 대상에게 허용되지 않는 유독한 부수적인 성분을 함유하지 않는 제제를 가리킨다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분을 제외한, 대상에게 비독성인 약학 제형의 성분을 가리킨다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 방부제를 비제한적으로 포함한다.
본원에 사용된 "치료(treatment)"(및 "치료(treat)" 또는 "치료하기(treating)"과 같은 이들의 문법적 변형)는 개체가 치료되는 자연 경과를 변경하기 위한 시도에서의 임상적 개입을 가리키며, 예방의 목적으로 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 및 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 비제한적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체가 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
상기 화합물은 GIP 수용체의 작용제로서 활성을 갖는다.
또한, 본 발명은 치료 효과량의 상기 기술된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제의 제조에서의 상기 기술된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 효과량의 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 질환 또는 장애, 예컨대 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 공복 혈당 장애 및 내당능 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드 수용체(GIPR)를 작용시키는데 효과량의 상기 기술된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 GIPR을 작용시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드(GIP) 유사체인 화합물 및 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 이들 화합물은 GIP 수용체의 작용제로서 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로허용되는 염이다:
화학식 I
Figure pct00002
상기 식에서,
R1은 (D)Tyr; DesNH2-Tyr; (D)Phe; DesNH2-Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl(D)Phe; 3-Cl(D)Phe; 4-Cl(D)Phe; 2-F(D)Phe; 3-F(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 및 3,4,5-TriF(D)Phe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 Lys 또는 Ala이고;
R3은 Lys 또는 PEG화된 Lys이고;
Y는 아실이고;
R1이 (D)Tyr; (D)Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl-(D)Phe; 3-Cl-(D)Phe; 4-Cl-(D)Phe; 2-F-(D)Phe; 3-F-(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 또는 3,4,5-TriF(D)Phe일 경우 n은 1이고;
R1이 DesNH2-Tyr; (D)Phe 또는 DesNH2-Phe일 경우 n은 0이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Phe; DesNH2-Phe; 2-Cl-(D)Phe; 3-Cl-(D)Phe; 4-Cl-(D)Phe; 2-F-(D)Phe; 3-F-(D)Phe; 3,5-DiF-(D)Phe 및 3,4,5-TriF-(D)Phe로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Trp이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)3Pya이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R2는 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R2는 Ala이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys-PEG이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEG 부분이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEG 부분이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEG 부분이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEG 부분이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEGm이 약 5,000 내지 약 4,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEGm이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEGm이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys(엡실론-SSA-PEGm)이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 PEGm이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 Lys(엡실론-SSA-PEGm)이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys(엡실론-SSA-PEGm(12,000)), Lys(엡실론-SSA-PEGm(20,000)) 및 Lys(엡실론-SSA-PEGm(30,000))으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R3은 Lys(엡실론-SSA-PEGm(20,000))이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEG 부분이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEG 부분이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEG 부분이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEG 부분이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEGm이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEGm이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEGm이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, R1은 (D)Tyr이고, R2는 Ala이고, R3은 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되거나 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되거나 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00006
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호의 화합물이거나 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00007
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되거나 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00008
Figure pct00009
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되거나 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00010
본 발명의 하나의 실시양태에서, 화합물은 하기 서열번호의 화합물이거나, 그의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00011
본 발명의 화합물은 아미노산 사이의 펩티드 연결을 형성하기 위한 임의의 공지된 전통적인 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 상기 전통적인 방법은 예컨대, 보호된 카복실 기 및 다른 반응성 기를 갖는 아미노산 또는 그의 단편의 유리 알파 아미노 기와 보호된 아미노 기 또는 다른 반응성 기를 갖는 또 다른 아미노산 또는 그의 단편의 유리 1차 카복실 기 사이의 축합을 허용하는 임의의 용액상(solution phase) 방법을 포함한다.
본 발명의 신규한 화합물을 합성하기 위한 상기 전통적인 방법은 예컨대, 임의의 고상(solid phase) 펩티드 합성 방법을 포함한다. 상기 방법에서, 신규한 화합물을 합성하는 방법은 고상 방법의 일반적인 원리에 따라 목적하는 아미노산 잔기를 성장하는 펩티드 쇄에 차례로 연속하여 혼입시킴으로써 수행될 수 있다. 예컨대 상기 방법은, 문헌[Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963)], 문헌[Barany et al ., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E.] 및 문헌[Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)]에 개시되어 있으며, 이들은 참고로서 본원에 혼입된다.
펩티드를 합성하는 동안, 아미노산의 특정 반응성 기, 예컨대 알파 아미노 기, 하이드록실 기 및/또는 반응성 측쇄 기는 그들과의 화학 반응을 방지하기 위하여 보호되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예컨대, 반응성 기를 후에 제거될 수 있는 보호 기와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 그의 단편의 알파 아미노 기는, 상기 아미노산 또는 그의 단편의 카복실 기가 또 다른 아미노산 또는 그의 단편과 반응하여 펩티드 결합을 형성하는 동안, 그들과의 화학 반응을 방지하기 위하여 보호될 수 있다. 이후 알파 아미노 보호 기를 선택적으로 제거하여 그 부위에서, 예컨대 또 다른 아미노산 또는 그의 단편의 카복실 기와 후속 반응되게 할 수 있다.
예를 들어, 알파 아미노 기는 방향족 우레탄-유형 보호 기, 예컨대 아릴옥시카보닐, 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 벤질옥시카보닐, 예컨대 p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-바이페닐-이소프로필옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz); 및 지방족 우레탄-유형 보호 기, 예컨대 t-부틸옥시카보닐(Boc), 다이이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 및 알릴옥시카보닐로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 알파 아미노 보호에 Fmoc가 사용된다.
예를 들어, 상기 아미노산의 하이드록실 기(OH)는 벤질(Bzl), 2,6-다이클로로벤질(2,6-diCl-Bzl), 및 tert-부틸(t-Bu)로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 타이로신, 세린 또는 트레오닌의 하이드록실 기를 보호하고자 하는 하나의 실시양태에서, 예컨대 t-Bu가 사용될 수 있다.
예를 들어, 엡실론-아미노산 기는 2-클로로-벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), 2-브로모-벤질옥시카보닐(2-Br-Z), 알릴카보닐 및 t-부틸옥시카보닐(Boc)로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 리신의 엡실론-아미노 기를 보호하고자 하는 하나의 실시양태에서, 예컨대 Boc가 사용될 수 있다.
예를 들어, 베타- 및 감마-아미드기는 4-메틸트라이틸(Mtt), 2,4,6-트라이메톡시벤질(Tmob), 4,4'-다이메톡시다이틸(Dod), 비스-(4-메톡시페닐)-메틸 및 트라이틸(Trt)로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 아스파라진 또는 글루타민의 아미드 기를 보호하고자 하는 하나의 실시양태에서, 예컨대 Trt가 사용될 수 있다.
예를 들어, 인돌 기는 포르밀(For), 메시틸-2-설포닐(Mts) 및 t-부틸옥시카보닐(Boc)로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 트립토판의 인돌 기를 보호하고자 하는 하나의 실시양태에서, 예컨대 Boc가 사용될 수 있다.
예를 들어, 이미다졸 기는 벤질(Bzl), t-부틸옥시카보닐(Boc) 및 트라이틸(Trt)로부터 선택되는 적절한 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 기를 보호하고자 하는 하나의 실시양태에서, 예컨대 Trt가 사용될 수 있다.
고상 합성은 보호된 알파 아미노산과 적절한 수지의 커플링에 의해 펩티드의 C-말단 말단부로부터 시작될 수 있다. 상기 출발 물질은 알파 아미노 보호된 아미노산을 p-벤질옥시벤질 알콜 (왕(Wang)) 수지에 에스터 연결에 의해 부착함으로써, 또는 Fmoc-링커(Linker), 예컨대 p-((R, S)-α-(1-(9H-플루오렌-9-일)-메톡시포름아미도)-2,4-다이메틸옥시벤질)-페녹시아세트산(링크 링커(Rink linker))과 벤즈하이드릴아민(BHA) 수지 사이의 아미드 결합에 의해 제조될 수 있다. 하이드록시메틸 수지의 제조는 본 발명에 널리 공지되어 있다. Fmoc-링커-BHA 수지 지지체는 시판중이며, 일반적으로 목적하는 합성되는 펩티드가 C-말단에 비치환된 아미드를 가질 때 사용된다.
하나의 실시양태에서, 펩티드 합성은 마이크로파가 보조된다. 마이크로파가 보조된 펩티드 합성은 고상 펩티드 합성을 촉진하기 위한 매력적인 방법이다. 상기 방법은 마이크로파 펩티드 합성기, 예컨대 리버티(Liberty) 펩티드 합성기(미국 노스캐롤라이나주 매튜스 소재 시이엠 코포레이션(CEM Corporation))를 사용하여 수행될 수 있다. 마이크로파가 보조된 펩티드 합성은 설정한 시간 동안 설정한 온도에서 반응을 조절할 수 있는 방법이 생성되도록 해준다. 합성기는 설정한 시점에서 온도를 유지하기 위해 반응에 전달되는 전력량을 자동으로 조절한다.
전형적으로, 아미노산 또는 모방형은 아미노산 또는 모방형의 Fmoc 보호된 형태를 사용하여 2 내지 5 당량의 아미노산 및 적절한 커플링 시약으로 Fmoc-링커-BHA 수지상에서 커플링된다. 커플링 후에, 상기 수지는 세척되고 진공하에 건조될 수 있다. 수지에 아미노산을 로딩하는 것은 Fmoc-아미노산 수지의 분취량(aliquot)의 아미노산 분석, 또는 자외선(UV) 분석에 의한 Fmoc 기의 측정에 의해 결정될 수 있다. 임의의 반응되지 않은 아미노 기는 수지를 아세트산 무수물 및 메틸렌 클로라이드중의 다이이소프로필에틸아민과 반응시킴으로써 캡핑될 수 있다.
수지는 몇몇의 반복적인 사이클을 따라 운반되어 순차적으로 아미노산에 첨가된다. 알파 아미노 Fmoc 보호 기는 염기성 조건에서 제거된다. DMF중의 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린(20-40%부피/부피)이 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DMF중의 20% 피페리딘이 사용된다.
알파 아미노 보호 기를 제거한 후에, 이후의 보호된 아미노산은 중간의 보호된 펩티드-수지를 수득하기 위하여 바람직한 순서로 순차적으로 커플링된다. 펩티드의 고상 합성에서 아미노산을 커플링하기 위해 사용되는 활성화제는 본 발명에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 상기 합성을 위한 적절한 시약은 벤조트라이아졸-1-일옥시-트라이-(다이메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBroP), 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플로오로포스페이트(HBTU) 및 다이이소프로필카보다이이미드(DIC)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 시약은 HBTU 또는 DIC이다. 다른 활성화제는 배러니 및 메리필드(Barany and Merrifield)(문헌[in The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284])에 의해 기술되어있다. 다양한 시약, 예컨대, 1 하이드록시벤조트라이아졸(HOBT), N-하이드록시숙신이미드(HOSu) 및 3,4-다이하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진(HOOBT)이 합성 사이클을 최적화하기 위해 커플링 혼합물에 첨가될 수 있다. 하나의 실시양태에서, HOBT가 첨가된다.
펩티드를 합성한 후에, 차단 기는 제거될 수 있고, 펩티드는 수지로부터 절단된다. 예를 들어, 펩티드-수지는 수지 1그램 당 100㎕의 에탄다이티올, 100㎕의 다이메틸설파이드, 300㎕의 아니솔 및 9.5㎖의 트라이플루오로아세트산으로 실온에서 180분 동안 처리될 수 있다. 선택적으로, 펩티드-수지는 수지 1그램 당 1.0㎖의 트라이이소프로필 실란 및 9.5㎖의 트라이플루오로아세트산으로 실온에서 90분 동안 처리될 수 있다. 이후, 상기 수지는 여과되고 펩티드는 차가운 에틸 에터를 첨가함으로써 침전된다. 이후, 상기 침전물은 원심분리되고 에터 층이 디캔트(decant)된다.
예컨대, 조질 펩티드의 정제는 역상 C18 컬럼(50 x 250mm, 300Å, 10㎛)상에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 시마즈(Shimadzu) LC-8A 시스템상에서 수행될 수 있다. 펩티드는 최소량의 물 및 아세토나이트릴에 용해되어 컬럼에 주입될 수 있다. 구배 용리가 일반적으로 2 내지 70%에서 70분에 걸쳐(완충액 A: 0.1% TFA/H2O, 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN) 60㎖/분의 유속으로 시작될 수 있다. UV 검출을 220/280nm에서 설정한다. 생성물을 함유하는 분획은 분리되고, 그들의 순도가 2.5㎖/분의 유속으로 10분에 걸친 구배(2 내지 70%)에서 역상 퍼수이트(Pursuit) C18 컬럼(4.6 x 50mm)을 사용하여 시마즈 LC-10AT 분석 시스템에서 측정된다[완충액 A: 0.1% TFA/H2O, 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN)]. 이후, 고순도로 측정된 분획은 모아지고 동결건조된다.
상기 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 본 발명의 펩티드의 30 위치에 있는 리신 잔기는 엡실론-아미노 기에서 예컨대 SSA를 사용하여 PEG 부분과 가교결합된다. 상기 가교결합은 염기성 pH의 용액에서 수행될 수 있으며, 이때 가교결합제는 바람직하게는 1차 아민, 예컨대 엡실론-아민과 반응한다. 생성된 PEG화된 펩티드는 안정한 아미드 결합을 통해 공유결합으로 공액된다. 이후, PEG화된 펩티드는 양이온/음이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있으며, 이때 교환 수지의 선택은 일반적으로 공액체의 순전하에 달려있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 염의 예는 중합체 산, 예컨대 탄닌산 또는 카복시메틸 셀룰로스 뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 유기산, 예컨대 아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아소코르브산, 숙신산, 벤조산, 살리실산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 또는 팜산과 함께 형성되는 염 및 무기산염, 예컨대 할로겐화수소산(예컨대, 염산), 황산, 또는 인산 등의 염이다. 약학적으로 허용되는 염을 수득하기 위한, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 부분적으로, 치료 효과량의 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 대사 질환 또는 장애는 예컨대, 비만, 제 2 형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 공복 혈당 장애 또는 내당능 장애일 수 있다.
본 발명의 방법을 시행함에 있어서, 효과량의 본 발명의 임의의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 또는 본 발명의 임의의 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 조합이 당해 분야에 통상적이고 허용되는 임의의 방법을 통해 단독으로 또는 조합되어 투여된다. 투여는 예컨대, 1일에 1회, 3일에 1회 또는 1주에 1회일 수 있다. 상기 화합물 또는 조성물은 예컨대, 경구(예컨대, 구강), 설하, 비경구(예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하), 직장(예컨대, 좌약 또는 세척(washing)), 경피(예컨대, 피부 전기천공법)에 투여될 수 있거나 또는 흡입(예컨대, 에어로졸)에 의해 및 정제 및 현탁제를 포함한 고체, 액체 또는 기체 투여 형태로 투여될 수 있다. 투여는 임의로 연속적인 치료 요법 또는 1회 치료 요법에서 단일 단위 투여 제형으로 수행될 수 있다. 치료 조성물은 친유성 염(예컨대, 팜산)과 함께 오일 에멀전 또는 분산액의 형태, 또는 피하 또는 근육내 투여를 위한 생분해성의 서방성 조성물의 형태일 수 있다.
본 발명의 방법은 예컨대, 증상의 경감이 특히 요구되거나 아마도 임박했을 때 시행될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 예컨대, 지속적 또는 예방적 치료로서 효과적으로 시행될 수 있다.
또한 본 발명은 부분적으로, 치료 효과량의 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물의 제조를 위한 유용한 약학 담체는 고체, 액체 또는 기체일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 환제, 캡슐, 좌약, 분말, 장용 코팅되거나 달리 보호된(예컨대, 이온-교환 수지에 결합 또는 지질-단백질 소낭에서 패킹) 제형, 서방성 제형, 용액, 현탁액, 엘릭시르제, 에어로졸 등과 같은 형태를 취할 수 있다. 담체는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래 오일, 예컨대, 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등을 포함하는 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 물, 염수, 수용성 덱스트로스 및 글라이콜이 특히 (혈액과 등장성일 때) 주사액을 위한 바람직한 액체 담체이다. 예를 들어, 정맥 투여를 위한 제형은 물에 고체의 활성 성분을 녹여 수용액을 만들고 용액을 멸균함으로써 제조된 활성 성분의 멸균 수용액을 포함한다. 적절한 약학 부형제는 녹말, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글라이세롤 모노스테아레이트, 나트륨 클로라이드, 건조 탈지유, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 전통적인 약학 첨가제, 예컨대, 방부제, 안정제, 습윤 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충액 등을 수반할 수 있다. 적절한 약학 담체 및 그들의 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 어떤 경우이든, 상기 조성물은 수용자에게 적절한 투여를 하기 위한 적절한 제형을 제조하기 위해 효과량의 활성 화합물과 함께 적절한 담체를 함유한다.
본 발명은 또한 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드 수용체를 작용시키는데 효과량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드를 작용시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물의 투여량은 수많은 요인, 예컨대, 투여 방식, 대상의 연령 및 체중, 및 대상이 치료 받는 조건에 달려 있으며, 궁극적으로 주치의 또는 수의사에 의해 결정된다. 주치의 또는 수의사에 의해 결정된 상기 활성 화합물의 이와 같은 양은 본원 명세서 및 청구항에서 "효과량"으로 지칭된다. 예컨대, 비강내 투여를 위한 투여량은 전형적으로 약 0.001 내지 약 0.1mg/kg체중이다. 인간에서, 바람직한 피하 투여량은 약 0.001mg 내지 약 100mg, 예컨대 약 0.1mg 내지 약 15mg이다.
또한 본 발명은 부분적으로, 약제의 제조에서의 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다. 약제는 예컨대, 대사 질환 또는 장애의 치료에서 이용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 약제는 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드 수용체의 작용제로서 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참고하여 보다 충분히 이해된다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본원에 사용된 약어는 하기와 같다.
Et2O: 다이에틸 에터
hr: 시간
TFA: 트라이플루오로아세트산
TIS: 트라이이소프로필실란
모든 용매, 즉 이소프로판올(iPrOH), 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2), 다이메틸포름아미드(DMF) 및 N-메틸피롤리논(NMP)은 피셔(Fisher) 또는 버딕 앤드 잭슨(Burdick & Jackson)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.
트라이플루오로아세트산은 할로카본(Halocarbon) 또는 플루카(Fluka)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.
다이이소프로필카보다이이미드(DIC) 및 다이이소프로필에틸아민(DIPEA)은 플루카 또는 알드리치(Aldrich)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.
하이드록시벤조트라이아졸(HOBT), 다이메틸설파이드(DMS) 및 1,2-에탄다이티올(EDT)은 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.
보호된 아미노산은 일반적으로 L 입체배치이며, 배켐(Bachem) 또는 네오시스템(Neosystem)에서 구입하였다.
상기 시약을 사용하기에 앞서, 박막 크로마토그래피, NMR 및 융점으로 순도를 확인하였다.
벤즈하이드릴아민 수지(BHA)는 배켐 또는 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech)에서 구입한 스티렌과 1% 다이비닐벤젠의 공중합체(100 내지 200 또는 200 내지 400 메시)이다. 상기 수지의 총 질소 함량은 일반적으로 0.3 내지 1.2meq/g이다.
고성능 액체 크로마토크래피(HPLC)를 자동 시마즈 HPLC상에서 클래스(CLASS)-브이피(VP)-7.3 소프트웨어 시스템으로 수행하였다. 분석 HPLC를 역상 방식으로 퍼수이트 C18 컬럼(4.5 x 50mm)을 사용하여 수행하였다.
제조 HPLC 분리를 역상 베리안(Varian)(퍼수이트) 또는 워터스(엑스테라(Xtera) 또는 엑스브릿지(Xbridge)) C18 컬럼(50 x 250mm)상에서 수행하였다.
실시예 1
하기는 실온에서 펩티드를 합성하기 위한 프로토콜이다.
Figure pct00012
모든 세척 및 커플링을 위한 용매를 10 내지 20㎖/g 수지의 양으로 측정하였다. 반응의 종결 정도를 측정하기 위해 합성의 전반적인 커플링 반응을 카이저 닌하이드린(Kaiser Ninhydrin) 시험으로 모니터링하였다(문헌[Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970)]). 임의의 비종결 커플링 반응을 신선하게 제조된 활성화된 아미노산과 재커플링시키거나 상기 기술된 아세트산 무수물로 펩티드 수지를 처리하여 캡핑시켰다. 완전히 조립된 펩티드-수지를 진공에서 수 시간 동안 건조시켰다.
실시예 2
하기는 마이크로파 펩티드를 합성하기 위한 프로토콜이다.
이중 커플링 및 캡핑을 위해, 제조사로부터 공급받은 소프트웨어를 사용하여 미리 설치된 0.25mmol 사이클을 변형하여 리버티(Liberty) 펩티드 합성기(미국 노스캐롤라이나주 매튜스 소재 시이엠 코포레이션)를 프로그램화하였다. Fmoc 탈보호, 아미노산 커플링 및 아세트산 무수물로 캡핑하는 동안 사용하기 위한 마이크로파 전력 방법을 프로그램화하기 위해 마이크로파 편집기를 사용하였다. 사이클 편집기에서 아미노산 첨가 및 최종 탈보호를 위한 디폴트 사이클을 선택하고 펩티드가 생성되는 동안 자동으로 로딩시켰다.
Fmoc-링커-BHA 수지(450mg, 0.25mmol; 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재 아나스펙 인코포레이티드(AnaSpec, Inc.)에서 구입)를 사용하여 0.25mmol 크기에서 합성을 수행하였다. DMF 용액중의 20% 피페리딘으로 탈보호를 수행하였다. 0.5M HBTU 및 2M N-메틸 모르폴린(NMM)으로 모든 커플링 반응을 수행하였으며, 아미노산 각각을 커플링한 후 DMF중의 25% 아세트산 무수물로 캡핑하였다(프로토콜 2). 35와트 전력 및 질소 버블링에서, 75℃에서 360초 동안 마이크로파를 사용하여 탈보호, 커플링 및 캡핑 반응을 각각 수행하였다.
아미노산 각각을 커플링하기 위해, 하기 0.25mmol 커플링 사이클을 사용하였다.
프로토콜 2
수지를 용기로 옮겨 담기
20% 피페리딘 탈보호제 첨가(10㎖)
최대 75℃에서 30초 동안 제 1 탈보호를 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 세척
최대 75℃에서 180초 동안 제 2 탈보호를 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 3회 세척
0.2M 아미노산 첨가(5㎖)
0.5M 활성화제(HBTU) 첨가(2㎖)
2M 활성화제 염기(NMM) 첨가(1㎖)
최대 75℃에서 6분 동안 커플링을 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 세척
0.2M 아미노산 첨가(5㎖)
0.5M 활성화제(HBTU) 첨가(2㎖)
2M 활성화제 염기(NMM) 첨가(1㎖)
최대 75℃에서 6분 동안 커플링을 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 3회 세척
마지막 아미노산을 커플링한 후, DMF중의 25% 아세트산 무수물로 펩티드를 캡핑하였다(프로토콜 3).
프로토콜 3
DMF(10㎖)로 수지를 3회 세척
20% 피페리딘 탈보호제 첨가(10㎖)
최대 75℃에서 30초 동안 제 1 탈보호를 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 세척
최대 75℃에서 180초 동안 제 2 탈보호를 위한 마이크로파 방법
DMF(10㎖)로 수지를 3회 세척
캡핑제 첨가(아세트산 무수물 10㎖)
최대 75℃에서 180초 동안 마이크로파 방법(캡핑)
DMF(10㎖)로 수지를 3회 세척
실시예 3
하기 실시예는 PEGm(30,000)-SSA의 제조를 기술한다. 유사한 방법으로 PEGm(12,000)-SSA 및 PEGm(20,000)-SSA를 제조하였다.
PEGm(30,000)-메실레이트의 합성
Figure pct00013
상기 식에서,
n은 약 682이다.
자석 교반기, 딘-스타크 트랩(dean-stark trap), 환류 냉각기 및 아르곤 유입 버블러(bubbler)가 장착된 환저 플라스크에 PEGm(30,000)-OH(100g, 3.34mmol) 및 톨루엔(500㎖)을 채웠다. 톨루엔중의 PEG 용액을 증류를 통해 공비 건조시킨후 실온까지 식혔다. 무수 다이클로로메탄(200㎖)을 첨가하고 용액을 0 내지 5℃까지 식혔다. 트라이에틸아민(0.67㎖, 4.84mmol) 및 메탄설포닐 클로라이드(0.33㎖, 4.34mmol)를 첨가하고 혼합물을 약 4℃에서 2시간 동안 교반한 후 실온에서 아르곤하에 밤새 교반하였다.
감압하에 회전 증발기를 사용하여 메틸렌 클로라이드를 제거하였다. 잔여 염을 여과하고 생성물을 차가운 이소프로필 알콜 및 다이에틸 에터(30:70, 부피/부피)로 침전시켰다. 상기 생성물을 회수하고 실온에서 진공하에 건조시켰다. 수율은 약 90%였다.
PEGm(30,000)-아민의 합성
Figure pct00014
상기 식에서,
n은 약 682이다.
자석 교반기 및 아르곤 유입 버블러가 장착된 환저 플라스크에 PEGm(30,000)-메실레이트(90g, 3.00mmol) 및 암모늄 하이드록사이드 수용액(30%, 부피/부피)(1600㎖)을 채웠다. 암모늄 클로라이드(160g)를 첨가하고 용액을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 나트륨 클로라이드(160g, 10중량%)를 첨가하고, PEG-아민을 다이클로로메탄으로 추출하였다. 유기 추출물을 모아서 무수 나트륨 설페이트로 건조시켰다. 상기 나트륨 설페이트를 여과하고 회전 증발기를 사용하여 잔여 메틸렌 클로라이드를 제거하였다. 생성물을 차가운 다이에틸 에터로 침전시켰다. 상기 생성물을 회수하고 실온에서 진공하에 밤새 건조시켰다. 수율은 약 94%였다.
PEGm(30,000)-숙신아미드산(SAA)의 합성
Figure pct00015
상기 식에서,
n은 약 682이다.
자석 교반기 및 아르곤 유입 버블러가 장착된 환저 플라스크에 PEGm(30,000)-아민(60g, 2.00mmol) 및 무수 아세토나이트릴(500㎖)을 채웠다. 상기 용액을 약 4℃까지 식힌 후, 무수 아세토나이트릴(50㎖)중의 숙신 무수물(2g, 20.0mmol)을 첨가 깔대기를 통해 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 아르곤하에 밤새 교반하였다.
종결된 후, 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 생성물을 물(400㎖)에 용해시켰다. 1M NaOH 용액으로 용액의 pH를 7.0으로 조정하고 1시간 동안 교반하였다. 나트륨 클로라이드(40g, 10중량%)를 첨가하고, 6N HCl 용액으로 pH를 약 4.2로 조정하였다. 생성물을 다이클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 모아서 무수 나트륨 설페이트로 건조시켰다. 나트륨 설페이트를 여과하여 제거하고 회전 증발기를 사용하여 여과물을 농축하였다. 생성물을 차가운 다이에틸 에터로 침전시켰다. 상기 생성물을 회수하고 진공하에 밤새 건조시켰다. 수율은 약 93%였다.
PEGm(30,000)-숙신이미딜 숙신아미드(SSA)의 합성
Figure pct00016
상기 식에서,
n은 약 682이다.
자석 교반기 및 아르곤 유입 버블러가 장착된 환저 플라스크에 PEGm(30,000)-숙신아미드산(56g, 1.87mmol) 및 무수 다이클로로메탄(500㎖)을 채웠다. N-하이드록시숙신이미드(0.24g, 2.05mmol)및 1,3-다이사이클로헥실카보다이이미드(0.46g, 2.24mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 아르곤하에 밤새 교반하였다.
종결된 후, 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거하였다. 이후, 생성물을 무수 톨루엔에 용해시켰다. 잔여 염을 여과하여 제거한 후, 생성물을 차가운 무수 이소프로필 알콜 및 다이에틸 에터(30:70, 부피/부피)에서 침전시켰다. 상기 생성물을 회수하고 실온에서 진공하에 밤새 건조시켰다. 수율은 80%였다.
실시예 4
Figure pct00017
의 합성
Fmoc 화학을 사용하여 CEM 마이크로파 펩티드 합성기에서 상기 펩티드를 합성하였다. 이중 커플링을 위해 프로토콜 2에 기술된 모듈을 사용하여 상기 합성기를 프로그램화하였다. Fmoc Gln(Trt) 왕 수지(Sub: 6meq/g; 400mg 사용)를 사용하여 0.25mmol 크기로 합성하였다. 합성이 종결되었을 때, 절단을 위해 수지를 진탕기상의 반응 용기로 옮겼다. 17㎖의 97% TFA(3% 물) 및 1㎖의 TIS와 프로판 티올(1:2)을 사용하여 실온에서 1.5시간 동안 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 100㎖의 차가운 Et2O에 탈보호 용액을 첨가한 후, 1㎖의 TFA 및 30㎖의 차가운 Et2O로 세척하여 펩티드를 침전시켰다. 펩티드를 2 x 50㎖의 폴리프로필렌 튜브에서 원심분리하였다. 개별 튜브의 침전물을 하나의 튜브에 모으고 차가운 Et2O로 3회 세척한 후, 하우스 진공하에 데시케이터에서 건조시켰다.
조질 펩티드를 엑스테라 C18 컬럼(250 x 50mm, 10㎛ 입자 크기)상에서 제조 HPLC(시마즈)로 정제하고 10 내지 99%B(완충액 A: 0.1% TFA/H2O; 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN)의 선형 구배로 60㎖/분의 유속으로 90분 동안 용리하여 220/280nm에서 검출하였다. 분획을 회수하여 분석 HPLC로 확인하였다. A: 0.1% 물/TFA 및 B: 0.1% 아세토나이트릴/TFA를 사용하는 10 내지 99%의 구배를 사용하여 C18 역상 물 엑스테라/퍼수이트 4.6 x 50 컬럼을 사용하여 시마즈 HPLC상에서 모든 분석을 수행하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모아서 동결건조하여 138mg(6.1%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C226H338N60O66S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 4983.64, 실측치 4983.62.
실시예 5
Figure pct00018
의 합성
Fmoc 화학을 사용하여 CEM 마이크로파 펩티드 합성기에서 상기 펩티드를 합성하였다. 이중 커플링을 위해 프로토콜 2 및 3에 기술된 모듈을 사용하여 상기 합성기를 프로그램화하였다. Fmoc 링크(Rink) 아미드(Amide) MBHA 수지(Sub: .45meq/g; 450mg 사용)를 사용하여 0.25mmol 크기에서 합성하였다. 합성이 종결되었을 때, 절단을 위해 수지를 진탕기상의 반응 용기로 옮겼다. 17㎖의 97% TFA(3% 물) 및 1㎖의 TIS와 프로판 티올(1:2)을 사용하여 실온에서 1.5시간 동안 펩티드를 절단하였다. 100㎖의 차가운 Et2O에 탈보호 용액을 첨가한 후, 1㎖의 TFA 및 30㎖의 차가운 Et2O로 세척하여 펩티드를 침전시켰다. 펩티드를 2 x 50㎖의 폴리프로필렌 튜브에서 원심분리하였다. 개별 튜브의 침전물을 하나의 튜브에 모으고 차가운 Et2O로 3회 세척한 후, 하우스 진공하에 데시케이터에서 건조시켰다.
조질 펩티드를 엑스테라 C18 컬럼(250 x 50mm, 10㎛ 입자 크기)상에서 제조 HPLC(시마즈)로 정제하고 10 내지 99%B(완충액 A: 0.1% TFA/H2O; 완충액 B: 0.1% TFA/CH3CN)의 선형 구배로 60㎖/분의 유속으로 90분 동안 용리하여 220/280nm에서 검출하였다. 분획을 회수하여 분석 HPLC로 확인하였다. A: 0.1% 물/TFA 및 B: 0.1% 아세토나이트릴/TFA을 사용하는 10 내지 99%의 구배를 사용하여 C18 역상 물 엑스테라/퍼스위트 4.6 x 50 컬럼을 사용하여 시마즈 HPLC상에서 모든 분석을 수행하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 모아서 동결건조하여 180mg(18.9%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H242N40O48S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3574.06, 실측치 3574.04.
실시예 6
Figure pct00019
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성하고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 108mg(11.4%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H242N40O48S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3574.06, 실측치 3574.04.
실시예 7
Figure pct00020
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성하고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 70mg(7%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C162H239N39O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3517.01, 실측치 3516.91.
실시예 8
Figure pct00021
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 80mg(8.3%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H242N40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3558.06, 실측치 3558.11.
실시예 9
Figure pct00022
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 120mg(12.7%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C162H239N39O46S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3501.01, 실측치 3500.98.
실시예 10
Figure pct00023
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 62mg(6.4%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C166H243N41O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3597.10, 실측치 3596.99.
실시예 11
Figure pct00024
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 40mg(4%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C163H241N41O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3559.05, 실측치 3559.01.
실시예 12
Figure pct00025
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 94mg(9.7%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H241ClN40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3592.51, 실측치 3592.49.
실시예 13
Figure pct00026
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 70mg(7.2%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H241Cl N40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3592.51, 실측치 3592.48.
실시예 14
Figure pct00027
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 96mg(10%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H241ClN40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3592.51, 실측치 3592.50.
실시예 15
Figure pct00028
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 92mg(9.5%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H241 FN40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3576.05, 실측치 3576.04.
실시예 16
Figure pct00029
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 100mg(10.4%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H241FN40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3576.05, 실측치 3576.04.
실시예 17
Figure pct00030
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 64mg(6.6%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H240 F2N40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3594.04, 실측치 3593.99.
실시예 18
Figure pct00031
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 30mg(3%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C164H239 F3N40O47S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3612.03, 실측치 3612.01.
실시예 19
Figure pct00032
의 합성
Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(450mg, 0.25mmol)를 고상 합성시키고 실시예 5의 방법에 따라 정제하여 80mg(9%)의 백색 비결정 분말을 수득하였다. C161H235N39O48S의 (ES)+-LCMSm/e: 계산치 3516.96, 실측치 3516.94.
실시예 20 내지 22를 위한 분석 방법
시험 및 대조군을 하기 역상 HPLC/UV 방법을 사용하여 분석하였다:
기구: 포토다이오드 어레이 검출기가 장착된 워터스 액퀴티(Waters Acquity) 시스템
주입량: 2㎕
주입 온도: 상온
검출 파장: 280nm
컬럼: 액퀴티 BEH-C8, 1.8㎛, 50mm x 2.1mm i.d.
컬럼 온도: 25℃
유속: 0.25㎖/분(약 5000psi)
이동상 A: 0.05% TFA 함유 물
이동상 B: 0.05% TFA 함유 아세토나이트릴
수행 시간: 약 10분
샘플 제조: 약 0.2 내지 0.5mg/㎖
희석액: 탈이온수
Figure pct00033
실시예 20
Figure pct00034
의 합성
PEGm(12,000) 부분을 실시예 19의 화합물에 공액결합하였다.
실시예 19의 펩티드를 10mg으로 무게를 재서 50mM 보레이트 pH 8.5 완충액에 용해시켰다. 실시예 3의 방법에 따라 제조한 PEGm(12,000)-숙신이미딜 숙신아미드를 130mg으로 무게를 재서 4:1의 PEG:펩티드 몰 비로 맞춘 후, 용해된 펩티드에 첨가하였다. 우선 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 20mM 트리스 pH 8.0 완충액에 10배 희석한 후, 큐-세퍼로즈(Q-Sepharose)(등록상표) FF(쥐이 헬스케어(GE Healthcare))상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 도 1은 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램이다. 반응 결과 38.1% PEG화된 펩티드를 수득하였다.
NaCl 구배 단계를 사용하여 모노-PEG화된 펩티드를 용리하였다. 목적 모노-PEG화된 펩티드를 200mM NaCl로 용리하였다. 용리액을 1M NaOAc로 산성화한 후, 3kDa MW 컷오프 막을 사용하여 아미콘(Amicon) 한외여과 셀에서 농축하였다. 이후, 20mM NaOAc(pH 4.5)로 10배로 정용여과하였다.
이후, 농축된 PEG화된 펩티드를 분석하고 검정(assay)한 후, 4℃에서 저장하였다. 도 2는 정제된 PEGm(12,000)-펩티드의 RP-HPLC 크로마토그램이다(수행시간 2.72분). PEG화된 펩티드의 순도는 98%를 초과하는 것으로 측정되었다. 도 3은 분자량을 확인하기 위해 수행한 PEGm(12,000)-펩티드의 말디-토프 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
실시예 21
Figure pct00035
의 합성
PEGm(20,000) 부분을 실시예 19의 화합물에 공액결합하였다.
실시예 19의 펩티드를 10mg으로 무게를 재서 50mM 보레이트 pH 8.5 완충액에 용해시켰다. 실시예 3의 방법에 따라 제조한 PEGm(20,000)-숙신이미딜 숙신아미드를 225mg으로 무게를 재서 4:1의 PEG:펩티드 몰 비로 맞춘 후, 용해된 펩티드에 첨가하였다. 우선 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 20mM 트리스 pH 8.0의 완충액에 10배 희석한 후, 큐-세퍼로즈(등록상표) FF(쥐이 헬스케어)상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 도 4는 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램이다. 반응 결과 54.9% PEG화된 펩티드를 수득하였다.
NaCl 구배 단계를 사용하여 모노-PEG화된 펩티드를 용리하였다. 목적 모노-PEG화된 펩티드를 200mM NaCl로 용리하였다. 용리액을 1M NaOAc로 산성화한 후, 3kDa MW 컷오프 막을 사용하여 아미콘 한외여과 셀에서 농축하였다. 이후, pH 4.5의 20mM NaOAc로 10배 정용여과하였다.
이후, 농축된 PEG화된 펩티드를 분석하고 검정한 후, 4℃에서 저장하였다. 도 5는 정제된 PEGm(20,000)-펩티드의 RP-HPLC 크로마토그램이다(수행시간 2.70분). PEG화된 펩티드의 순도는 98%를 초과하는 것으로 측정되었다. 도 6은 분자량을 확인하기 위해 수행한 PEGm(20,000)-펩티드의 말디-토프 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
실시예 22
Figure pct00036
의 합성
PEGm(30,000) 부분을 실시예 19의 화합물에 공액결합하였다.
실시예 19의 펩티드를 50mg으로 무게를 재서 50mM 보레이트 pH 8.5 완충액에 용해시켰다. 실시예 3의 방법에 따라 제조한 PEGm(30,000)-숙신이미딜 숙신아미드를 1625mg으로 무게를 재서 4:1의 PEG:펩티드 몰 비로 맞춘 후, 용해된 펩티드에 첨가하였다. 우선 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 20mM 트리스 pH 8.0 완충액에서 10배 희석한 후, 큐-세퍼로즈(등록상표) FF(쥐이 헬스케어)상에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 도 7은 반응 혼합물의 RP-HPLC 크로마토그램이다. 반응 결과 85.0% PEG화된 펩티드를 수득하였다.
NaCl 구배 단계를 사용하여 모노-PEG화된 펩티드를 용리하였다. 목적 모노-PEG화된 펩티드를 200mM NaCl로 용리하였다. 용리액을 1M NaOAc로 산성화한 후, 3kDa MW 컷오프 막을 사용하여 아미콘 한외여과 셀에서 농축하였다. 이후, 20mM NaOAc(pH 4.5)로 10배 정용여과하였다.
이후, 농축된 PEG화된 펩티드를 분석하고 검정한 후, 4℃에서 저장하였다. 도 8은 정제된 PEGm(30,000)-펩티드의 RP-HPLC 크로마토그램이다(수행시간 2.59분). PEG화된 펩티드의 순도는 98%를 초과하는 것으로 측정되었다. 도 9는 분자량을 확인하기 위해 수행한 PEGm(30,000)-펩티드의 말디-토프 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
실시예 23
하노버 위스타(Hannover Wistar) 랫트 및 인간의 혈장에서 4시간 및 24시간 후에 실시예 19의 화합물의 안정성을 평가하기 위해 하기 연구를 수행하였다.
실시예 19의 화합물을 2.08mg으로 무게를 재서 4㎖의 앰버 바이알에 두었다. 상기 바이알에 1.0㎖의 DMSO를 첨가하였다. 상기 바이알을 조심스럽게 와류(voltexing)하여 573μM의 화합물의 저장 용액을 제조하였다.
하노버 위스타 랫트 혈장 및 인간 혈장(항-응고 나트륨 EDTA)을 수조에서 30분 동안 37℃로 미리 데웠다. 랫트 혈장은 pH 7.45이었고, 인간 혈장은 pH 7.47이었다. 1.5㎖ 미량원심분리기 바이알을 사용하였다.
실시예 19의 화합물의 573μM 저장 용액의 8.7㎕를 491.3㎕의 랫트 혈장에 첨가하고 하나의 바이알에 두었다. 실시예 19의 화합물의 573μM 저장 용액의 8.7㎕를 491.3㎕의 인간 혈장에 첨가하고 또 다른 바이알에 두었다. 2개의 바이알을 부드럽게 와류하여 충분히 혼합하였다.
6개의 새로운 바이알을 다음과 같이 표지하였다: 랫트 T0, 랫트 T4, 랫트 T24, 인간 T0, 인간 T4, 인간 T24. 각각의 바이알에 50㎕의 처리된 혈장을 첨가하였다. T4 및 T24 바이알을 뚜껑을 덮어서 37℃의 항온처리기에 각각 4시간 및 24시간 동안 두었다.
2개의 T0 바이알에 50㎕의 소렌센(Sorensen) 완충액 및 아세토나이트릴중의 1.0% 아세트산 200㎕를 첨가하였다. 이후, 상기 T0 바이알을 뚜껑을 덮고 와류한 후, 10000xg로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 후 각 바이알의 100㎕의 상청액을 96-웰 주입 블럭(injection block)의 분리된 웰에 첨가하였다. 이후, 밀리-큐(Milli-Q)(등록상표) 물(밀리포어(Millipore))중의 0.1% 아세트산 200㎕를 각각의 웰에 첨가하였다.
T0 바이알에 대해 기술한 상기 방법을 2개의 4시간 시점의 T4 바이알 및 24시간 시점의 T24 바이알에서 반복하였다. 각각의 시점에서, 상기 기술된 바와 같이 신선한 T0 샘플을 제조하여 샘플 열화가 없도록 확실히 하였다.
LC/MS/MS로 모든 샘플을 분석하였다. 생성된 크로마토그래프를 처리하여 각각의 샘플에 대한 피크 면적을 수득하였다. 각각의 시점에 남아있는 화합물의 비율을 비교 T0 샘플의 존재량과 비교하여 계산하였다.
농도(10μM) 랫트 인간
% 잔여물 % 잔여물 % 잔여물 % 잔여물
4시간 24시간 4시간 24시간
124.7 72.7 93.6 75.9
상기 자료는, 화합물이 랫트 혈장에서 4시간 시점에서는 안정했지만, 24시간 시점에서는 허용범위(75 내지 125%)보다 약간 낮은 것을 나타낸다. 인간 혈장에서 펩티드는 4시간 및 24시간 시점 둘 다에서 안정했다.
실시예 24
인간 GIPR을 발현하는 CHO-K1 세포를 디스커버엑스 코포레이션(DiscoverX Corporation)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)으로부터 얻었다. 상기 세포를 10% 소 태아 혈청, 800㎍/㎖ 제네티신, 300㎍/㎖ 하이드로마이신, 2mM L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신(100유닛, 100㎍)이 보충된 함스(Ham's) F-12 영양배지에서 37℃의 5% 이산화탄소 항온처리기에서 배양하였다. 90% 콘플루언스로 세포를 회수하였다.
상기 세포를 함스 F-12 영양배지에서 200,000세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 이후, 상기 세포를 384 웰 플레이트에 웰 1개 당 0.025㎖의 현탁액으로 도말하였다. 상기 세포를 37℃의 5% 이산화탄소 항온처리기에서 밤새 항온처리하였다.
CHO-K1세포를 시험 화합물로 자극하여 상기 화합물의 활성을 측정하고, 생성되는 cAMP의 수준을 측정하였다. GIP가 cAMP의 생산을 자극함에 따라, 상기 화합물의 활성을 천연의 GIP의 활성과 비교하였다. 자극 완충액(990㎖ 행크스 밸런스드(Hank's Balanced) 염 용액(HBSS)(1X)(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp) #14025-092), 10㎖ 헤페스(Hepes) 완충액(1mol.ℓ)(인비트로젠 코포레이션 15630-080), 1g BSA(최종 0.1%), 및 DMSO중의 신선하게 제조된 IBMX 250mM 저장용액(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) I 5879) 1㎖)중의 6㎕의 시험 화합물을 세포에 첨가한후, 6㎕의 자극 완충액중의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표)647-항 cAMP 항체(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 첨가하였다. 또한 자극 완충액중의 6㎕의 천연의 GIP(실시예 4의 화합물)를 대조군으로서 1개의 웰의 세포에 첨가하였다. 웰 플레이트를 300rpm에서 3분 동안 원심분리한 후, 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 12㎕의 검출 혼합물(cAMP 검출 완충액(퍼킨 엘머)중의 바이오틴 cAMP 및 EUW8044로 표지된 스트렙타비딘(Eu-SA))을 첨가한 후, 실온에서 60분 동안 항온처리하였다.
퍼킨 엘머 랜스(LANCE) cAMP 분석 퍼킨 엘머 랜스 cAMP 키트 메뉴얼에 기술된 상세한 프로토콜에 따라, 생성된 cAMP 수준을 측정하였다. 상기 화합물의 활성을 천연의 GIP 활성과 비교하였다.
플레이트를 TRF 검출기인 엔비전(EnVision)(등록상표)(퍼킨 엘머)(340nM에서 여기 및 665nM에서 방출)에 놓고 판독하였다. cAMP 신호값을 표준 cAMP 곡선으로부터 얻고, 최대 자극량 및 cAMP신호를 자극하기 위한 EC50을 측정하기 위해 사용하였다.
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> GLUCOSE-DEPENDENT INSULINOTROPIC PEPTIDE ANALOGS <130> 26781 <140> PCT/EP2011/068385 <141> 2011-10-21 <150> US 61/406186 <151> 2010-10-25 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Tyr <400> 1 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Desamino-Tyr <400> 2 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 3 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Desamino-Phe <400> 4 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Trp <400> 5 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3-pyridylalanine <400> 6 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3-chlorophenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-2-chlorophenylalanine <400> 7 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3-chlorophenylalanine <400> 8 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-4-chlorophenylalanine <400> 9 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-2-fluorophenylalanine <400> 10 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3-fluorophenylalanine <400> 11 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3,5-difluorophenylalanine <400> 12 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-3,4,5-trifluorophenylalanine <400> 13 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Tyr <400> 14 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Ala 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> epsilon-succinimidylsuccinamide-PEGm(12,000) <400> 15 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Ala 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> epsilon-succinimidylsuccinamide-PEGm(20,000) <400> 16 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Ala 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> epsilon-succinimidylsuccinamide-PEGm(30,000) <400> 17 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Ala 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys 20 25 30

Claims (48)

  1. 하기 화학식 I을 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    화학식 I
    Figure pct00038

    상기 식에서,
    R1은 (D)Tyr; DesNH2-Tyr; (D)Phe; DesNH2-Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl(D)Phe; 3-Cl(D)Phe; 4-Cl(D)Phe; 2-F(D)Phe; 3-F(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 및 3,4,5-TriF(D)Phe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 Lys 또는 Ala이고;
    R3은 Lys 또는 PEG화된 Lys이고;
    Y는 아실이고;
    R1이 (D)Tyr; (D)Phe; (D)Trp; (D)3Pya; 2-Cl-(D)Phe; 3-Cl-(D)Phe; 4-Cl-(D)Phe; 2-F-(D)Phe; 3-F-(D)Phe; 3,5-DiF(D)Phe 또는 3,4,5-TriF(D)Phe일 경우 n은 1이고;
    R1이 DesNH2-Tyr; (D)Phe 또는 DesNH2-Phe일 경우 n은 0이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr인 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Phe; DesNH2-Phe; 2-Cl-(D)Phe; 3-Cl-(D)Phe; 4-Cl-(D)Phe; 2-F-(D)Phe; 3-F-(D)Phe; 3,5-DiF-(D)Phe 및 3,4,5-TriF-(D)Phe로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Trp인 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)3Pya인 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    R2가 Lys인 화합물.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    R2가 Ala인 화합물
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys인 화합물.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEG화된 Lys인 화합물.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys-PEG인 화합물.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys-PEGm인 화합물.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEG 부분이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 13 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEG 부분이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항, 제 13 항 및 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEG 부분이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 13 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEG 부분이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  17. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEGm이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  18. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 11 항 및 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEGm이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  19. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 11 항, 제 17 항 및 제 18 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEGm이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  20. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 11 항 및 제 17 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  21. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys(엡실론-SSA-PEGm)인 화합물.
  22. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 21 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys(엡실론-SSA-PEGm(12,000)), Lys(엡실론-SSA-PEGm(20,000)) 및 Lys(엡실론-SSA-PEGm(30,000))로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  23. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 21 항 및 제 22 항중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 Lys(엡실론-SSA-PEGm(20,000))인 화합물.
  24. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala인 화합물.
  25. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEG화된 Lys인 화합물.
  26. 제 1 항 또는 제 25 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEG 부분이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  27. 제 1 항, 제 25 항 및 제 26 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEG 부분이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  28. 제 1 항 및 제 25 항 내지 제 27 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEG 부분이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  29. 제 1 항 및 제 25 항 내지 제 28 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEG 부분이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 PEG화된 Lys인 화합물.
  30. 제 1 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEGm이 약 5,000 내지 약 40,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  31. 제 1 항 또는 제 30 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEGm이 약 10,000 내지 약 30,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  32. 제 1 항, 제 30 항 및 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEGm이 약 15,000 내지 약 25,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  33. 제 1 항 및 제 30 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr 또는 DesNH2-Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  34. 제 1 항 및 제 30 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 (D)Tyr이고, R2가 Ala이고, R3이 PEGm이 약 20,000달톤의 분자량을 갖는 Lys-PEGm인 화합물.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서,
    하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00039

    Figure pct00040
  36. 제 1 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서,
    하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00041
  37. 제 1 항 내지 제 36 항중 어느 한 항에 있어서,
    하기 서열번호인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00042
  38. 제 1 항에 있어서,
    하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00043
  39. 제 1 항에 있어서,
    하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00044
  40. 제 1 항에 있어서,
    하기 서열번호인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00045
  41. 치료 효과량의 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  42. 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 있어서,
    대사 질환 또는 장애의 치료에서 사용되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
  43. 약제의 제조에서의 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
  44. 제 43 항에 있어서,
    약제가 대사 질환 또는 장애의 치료용인 용도.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    약제가 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드 수용체의 작용제로서 사용되는 용도.
  46. 효과량의 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 질환 또는 장애의 치료 방법.
  47. 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드 수용체를 작용시키는데 효과량의 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 글루코스-의존 인슐린 친화성 폴리펩티드를 작용시키는 방법.
  48. 본원에 기술된 발명.
KR20137012976A 2010-10-25 2011-10-21 글루코스-의존 인슐린 친화성 펩티드 유사체 KR20130127985A (ko)

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