KR20130118890A - B형 간염의 예방 및 치료를 위한 dna 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염의 치료에 이용하는 DNA 백신 조성물을 제공한다. 해당 백신 조성물은, B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드, B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드를 포함한다. B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 바람직하게는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자 또는 B형 간염 바이러스 외피의 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자를 포함한다. 본 발명은 추가로 해당 DNA 백신 조성물의 B형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도를 제공한다

Description

B형 간염의 예방 및 치료를 위한 DNA 백신 조성물{Composition of DNA vaccine for preventing and treating hepatitis B}

본 발명은 B형 간염을 예방 및/또는 치료하기 위한 DNA백신 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드, B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드를 포함한다.

B형 간염은 인류의 건강을 크게 해치고, 현시점에서는 특효적인 치료 수단이 없다. B형 간염이 만성화하는 주된 원인은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 후에 인체가 지속적인 특이성 세포 면역과 체액 면역이 부족하기 때문이다.

HBV 외피 단백질(envelope proteins)은 라지 단백질(large protein) LS(S1S2S 항원, preS1－preS2－S 유전자에 의해 코드됨), 미들 단백질(middle protein) MS(S2S 항원, preS2－S유전자에 의해 코드됨), 스몰 단백질(small protein) S(S항원, S유전자에 의해 코드됨)의 3종류의 분자에 의해 구성되며, 여기에서, 프레 S2 항원 분자량은 작고, 항원성은 강하고, B형 간염 바이러스의 숙주 세포에 대한 흡착과 관련이 있다.

HBcAg는 B형 간염 바이러스 유전자 C구역 유전자에 의해 코드되어 제2의 ATG로부터 번역을 개시하고, 183~185개의 아미노산을 포함한 펩티드이며, 분자량은 약 21 KD이고, 그의 C단에는 아르기닌 및 복수의 프로테아제 작용 부위가 있으며, RNA를 결합하는 능력을 가지고, 또한 B형 간염 코어 과립을 조립하는 것과 밀접하게 관련되어 있다. HBcAg 과립은 복수의 코어 단백질 아기에 의해서 구성되며, 20면체의 대칭의 과립상 구조를 나타내고, 개별의 코어 단백질아기(183~185개의 아미노산의 폴리펩티드 사슬을 포함함)는 먼저 호모 2량체(Homodimer)를 형성하여 호모2량체를 추가로 응집하여 HBcAg 과립을 형성한다.　

　Mancini(Mancini　M,　Hadchouel　M,　Daｖis　HL,　et　al.　DNA－mediated　immunization　in　a　transgenic　mouse　model　of　the　hepatitis　B　surface　antigen　chronic　carrier　state.　Pro　Natl　Acad　Sci　USA.　1996, 93：12496~12501) 들은 preS2/S　HBV 외피 단백질을 코드하는 재조합 플라스미드에 의해 HBV 유전자 재조합된 마우스를 면역하고, DNA 백신의 만성 B형 간염 바이러스 감염자의 치료에 있어서의 잠재적인 장점을 증명하고 있다. Mancini－Bourgine　M 등(Mancini－Bourgine　M,　Fontaine　H,　Scott－Algara　D,　et　al.　Induction　or　expansion　of　T－cell　responsese　by　a　hepatitis　B　DanA　ｖaccine　administered　to　chronic　HBV　carriers.　Hepatology.　2004, 40：874－882)은 preS2/S　HBV 외피 단백질을 코드하는 재조합 플라스미드에 의해, 10명의 만성적인 B형 간염 감염자를 면역시키고 이러한 10명의 감염자는 어떠한 항바이러스 치료도 받지 않았다. 결과적으로는, 이하와 같이 발견하였다. 그들은 백신에 대한 내성이 우수하고, 여기에서 2건의 감염자의 PBMC는 항원 특이성 T림프액 세포 증식 반응을 일으키는 한편 HBV 특이성적으로 IFN－γ를 분비하는 T세포는, 면역 후에 큰 폭으로 증가하여 5명의 감염자 혈청의 HBV　DNA 레벨은 저하였으나 이러한 저하는 일시적인 것이었다. 이 연구는, HBV　DNA 백신의 안전성, 및 일부의 만성 B형 간염 감염자 체내에서 특이적인 T세포 면역 응답을 유도하였다. 　

HBcAg는 우세 항원으로서 B형 간염 백신의 연구에 대해 넓게 응용되어 Veremeiko　TA 등(Veremeiko　TA,　Lebedeｖ　LR,　Chikaeｖ　NA,　et　al. Humoral　immune　response　of　Balb/c　mice　immunized　with　chimer　HBcAg　proteins　carrying　the　epitopes　of　surface　hepatic　B　ｖirus　protein. Vopr　ｖirusol, 2007, 52：40－45)은, HBV 외피 단백질 에피토프를 HBcAg에 삽입하고, 성공적으로 HBcAg－HBsAg 융합 단백질을 구축하며, 추가로 이 융합 단백질에 의해, Balb/cxiaoshi 마우스를 면역시켜,고 적정량의 삽입 에피토프 HBsAg 및 벡터 단백질 HBcAg에 대한 항체를 생성하였다. ZhangWei 등(ZhangWei, Dong Shengfu, Sun Shuhui등, B형 간염 바이러스 코어 항원　DNA 백신은 마우스 항원 특이성　CD8^＋T　세포를 유도하는 것의 다이나믹 변화 및 다이나믹 분포, 중국 면역학 잡지, 2004, 20(6)：379－383)은 재조합 HBcAg 진핵 발현 플라스미드 pHBcl44의 C57BL/6 마우스에 대한 면역 작용에 대해 연구하였다. 결과적으로, pHBcl44 면역 후의 항원 특이성 CD8^＋T 세포는 서서히 많아져서 첫번째 면역의 14 일째에 최고의 면역 응답 피크가 출현하고, 그 후에 이 항원 특이성 CD8^＋T 세포 수량은 서서히 저하하여 면역 기억기에 접어들고, 더욱이 1년 이내에 안정적인 레벨을 유지한다.

중국 특허 CN1316518A는 재조합 진핵 발현 플라스미드 pS2S를 개시하고 있는데, 해당 플라스미드 중에는 세포 콜로니 자극 인자를 포함하며, 또 재조합 백신 플라스미드와 IL－2 및 IFN－γ를 포함한 재조합 조제 플라스미드와 함께 사용하고, 재조합 조제 플라스미드는 재조합 면역 플라스미드의 면역 및 치료 작용을 향상시킬 수가 있다. 중국 특허 CN101095951A는, 치료성의 HBV　DNA 백신을 개시하고 있는데, 해당 백신은 더블 플라스미드 HBV　DNA 백신이며, 재조합 백신 플라스미드 pS2. S와 재조합 조제 플라스미드 pIIF를 포함하고, 이러한 치료성의 더블 플라스미드는 Tg－HBV 마우스에 대해서 효과를 가지며, 이러한 치료성의 더블 플라스미드는 Tg－HBV 마우스에 대해서, 마우스 체내의 HBV　DNA의 복제를 억제할 수 있는 한편 혈청 HBsAg 및 혈청 ALT의 레벨을 떨어뜨리게 되어 현재 이 두 개의 프로젝트는 이미 임상 연구 단계에 있다.

주도우(周陶友) 등(주도우, 조연삼(趙連三), 진민(陣敏) 등, HBsAg 및 HBcAg 융합 발현 플라스미드의 HBV 유전자 재조합 마우스에 대한 체액 면역 치료 효과, 중화 전염병 잡지［J］.2005, 23(6)：372－374)은 융합 발현 플라스미드 pcDNA3.1－SC를 구축하고, 100μgC57BL/6　HBV　DNA를 근육 접종하는 것에 의해 유전자 재조합 마우스에 접종하고, 2, 4주 후에 각각 1회 면역을 강화하고 있다. B형 간염 코어 C단백질 유전자를 플라스미드 중에 융합시킨 후, 해당 융합 발현 플라스미드는 마우스의 혈청에 항-HBs의 생성을 촉진할 뿐이 아니라 항-HBc의 생성도 촉진하지만, 항-HBc의 플러스 전환율은 매우 낮고, 그 양성 전환율은 20%보다 낮다. S-H Yang 등(S-H Yang,　C－G　Lee,　S－H　Park,　et　al.　Correlation　of　antiｖiral　T－cell　responses　with　suppression　of　ｖiral　rebound　in　chronic　Hepatitis　B　carriers：　a　proof－of－concept　study.　Gene　Therapy［J］. 2006, 13：1110－1117)은 유전자 재조합 마우스에 대해서, 주사에 의해 HB－100 백신을 제공하고(해당 백신은 5 종류의 다른 플라스미드를 포함하며, 각각은 pGX10　S,　pGX10　Sl/S2/X,　pGX10　core,　pGX10　Pol,　pGX10　ML－12 N222L 임), 이것에 의해 B형 간염 마우스 체내의 혈청 HBV　DNA 레벨을 저하시킴과 더불어 혈청의 HBc－Ab의 생성을 촉진하고 있다.

종래의 DNA 백신의 연구는 이미 일정한 성과를 얻고 있지만, 그 면역 치료 효과는 사람들을 만족시키지 못하고 있고, 예방 및 치료 효과가 더욱 향상된 B형 간염 백신 제품을 개발할 필요가 있다.

본 발명은 B형 간염을 예방 및/또는 치료하는 신규한 DNA 백신 조성물을 제공하고, 구체적으로는, 3개의 플라스미드에 의해 구성된 HBV　DNA 백신 조성물인 것이다. 해당 백신 조성물은 Tg－HBV 마우스에 대해 분명한 치료 효과를 가지며, HBV 마우스의 혈청 HBV　DNA, 혈청 HBsAg 레벨 및 혈청 ALT 레벨을 저하시키는 한편 일부의 마우스 개체의 HBsAg,　HBV　DNA를 음성으로 전환시켜 혈청 ALT는 정상 레벨로 돌려놓게 된다. 본 발명의 백신 조성물은 동시에 비교적 강한 HBsAg 및 HBcAg 면역 효과를 가지며, B형 간염에 대해 현저한 예방 및 치료 효과를 갖는다.

구체적으로, 본 발명은 이하와 같다.

1. B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드, B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드를 포함하는 B형 간염을 치료하기 위한 DNA 백신 조성물.

2. 상기 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함하며, 상기 B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자 또는 B형 간염 표면 항원의 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자인 것이 바람직한 상기 1에 기재한 DNA 백신 조성물.

3. 상기 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. l으로 표시되는 뉴클레오티드의 배열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 한편 그것이 코드하는 B형 간염 표면 항원 S2S 단백질은 천연 B형 간염 표면 항원 단백질 S2S와 동일한 면역원성을 갖는 상기 2에 기재한 DNA 백신 조성물.

4. 상기 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. l, No. 2, No. 3 또는 No. 4으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 상기 3에 기재한 DNA 백신 조성물.

5. 상기 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 SEQ　ID　No. 9으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 1~4 중 어느 것에 기재한 DNA 백신 조성물.

6. 상기 B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 상기 1~5 중 어느 것에 기재한 DNA 백신 조성물.

7. 상기 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. 5으로 표시되는 뉴클레오티드 배열과 적어도 70%의 상동성을 가지는 한편 그것이 코드하는 B형 간염 코어 항원 단백질은 천연 B형 간염 코어 항원 단백질과 같은 면역원성을 갖는 상기 6에 기재한 DNA 백신 조성물.

8. 상기 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. 5, No. 6, No. 7또는 No. 8으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 7에 기재한 DNA 백신 조성물.

9. 상기 B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 SEQ　ID　No. 10으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 상기 6~8 중 어느 것에 기재한 DNA 백신 조성물.

10. 상기 재조합 조제 플라스미드는 티모신, G－CSF, IL－2, IL－4, IL－12및 IFN－γ로부터 되는 그룹으로부터 선택된 것을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 1~9 중 어느 것에 기재한 DNA 백신 조성물.

11. 상기 재조합 조제 플라스미드는 IL－12를 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 10에 기재한 DNA 백신 조성물.

12, 상기 1~11 중 어느 것에 기재한 DNA 백신 조성물의 B형 간염의 예방 및/또는 치료약의 제조에의 사용.

13. B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드, B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드 및 약학적으로 허용 할 수 있는 벡터를 포함하는 의약품 조성물에서, 상기 B형 간염 표면 항원 단백질은, 바람직하게는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S이고, 상기 조제는 IL－12가 바람직한 것을 특징으로 하는 의약품 조성물.

14. B형 간염 예방 및/또는 치료하는 방법에서, 포유동물에 유효량의 상기 1~11 중 어느 것에 기재한 상기 DNA 백신 조성물 또는 상기 13의 의약품 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상기 방법.

15. B형 간염의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 조성물 및/또는 의약품 조성물에서, 해당 조성물은 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드, B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드를 포함하고, 상기 B형 간염 표면 항원은 바람직하게 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 스몰 단백질 S인 것을 특징으로 하는 백신 조성물 또는 의약품 조성물.

16. 제품 및 키트로서, 본 발명의 백신 조성물 또는 의약 조성물을 넣은 용기 및 상기 백신 조성물 또는 의약 조성물을 B형 간염의 예방 및/또는 치료에 이용하는 것이 기재된 설명서를 포함한다.

17. 미생물에서, 그 기탁 번호는 CGMCC　No. 3276, CGMCC　No. 3727, CGMCC　No. 4170 및 CGMCC　No. 4181이다.

본 발명의 치료성 3개의 플라스미드 HBV DNA 백신은 50% HBV 유전자 재조합 마우스 혈청 HBsAg 혈청 HBV DNA를 음성으로 전환시켜 절반의 마우스 혈청 ALT를 정상 수준 회복시킨다.

도 1은 재조합 백신 플라스미드 pRec2.0－S2S(약칭으로 pS2S)의 구조 모식도이다.
도 2는 재조합 백신 플라스미드 pRec2.0－C(약칭으로 pC)의 구조 모식도이다.
도 3은 재조합 조제 플라스미드 phIL12의 구조 모식도이다.
도 4는 재조합 조제 플라스미드 pmIL12의 구조 모식도이다.
도 5는 재조합 백신 플라스미드 pS2S의 제한성 효소 절단-전기 영동도로서, 여기에서, 레인 1은 플라스미드 pS2S의 Ndel＋Pstl의 2종류의 효소에 의해 절단한 것의 도면이며, 235 bp, 1294 bp 및 3607 bp의 3개의 밴드를 얻고, 그 중 235 bp사이즈의 밴드는 얼룩(smear)이다. 레인 2는 플라스미드 pS2S가 PｖuII＋Xbal의 2종류의 효소에 의해 절단된 것의 도면이며, 사이즈가 1035 bp, 4101 bp의 밴드가 얻어진다. 레인 5는, 플라스미드 pS2S가 EcoRI라고 하는 한 종류의 효소에 의해 절단 된 사이즈가 5136 bp의 밴드이며, 레인 6은, 제한성 효소 절단을 행하지 않은 재조합 플라스미드 pS2S이며, 레인 3은 DL15000의 분자량 기준이며, 레인 4는 DL2000의 분자량 기준이다.
도 6은 재조합 백신 플라스미드 pC의 제한성 효소 절단-전기 영동도로서, 그 중에서 레인 1은 플라스미드 pC가 Ndel＋Pstl라고 하는 2종류의 제한성 효소에 의해 절단된 2 개의 사이즈가 각각 1294 bp, 3548 bp의 밴드이다. 레인 2는 플라스미드 pC가 Pstl＋Xbal라고 하는 2종류의 제한성 효소에 의해 절단된 2 개의 사이즈가 각각 577 bp, 4265 bp의 밴드이며, 레인 5는 플라스미드 pC가 PｖuII라고 하는 한종류의 제한성 효소에 의해 절단된 사이즈가 484 bp, 4358 bp의 2 개의 밴드이고, 레인 6은, 플라스미드가 EcoRI라고 하는 한 종류의 제한성 효소에 의해 절단된 사이즈가 4842 bp의 밴드이며, 레인 7은 제한성 효소 절단을 실시하지 않은 재조합 백신 플라스미드 pC이며, 레인 3은 DL15000의 분자량 기준이고, 레인 4는 DL2000의 분자량 기준이다.
도 7은 재조합 조제 플라스미드 pmIL12의 제한성 효소 절단-전기 영동도로서, 그 중에서 레인 1은 PstI라고 하는 한 종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 3개의 밴드이며, 그 사이즈는 각각 275 bp, 2164 bp, 3286 bp이고, 275 bp의 사이즈의 밴드는 얼룩이다. 레인 2는, Ndel라고 하는 한 종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 2개의 밴드이며, 그 사이즈는 각각 1870 bp, 3855 bp이다. 레인 3은, EcoRI＋BglII라고 하는 2종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 2개의 밴드이고, 그 사이즈는 각각 1740 bp, 3985 bp이며, 레인 6은 플라스미드가 EcoRI라고 하는 한 종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 사이즈가 5725 bp의 밴드이고, 레인 7은 제한성 효소 절단을 하지 않은 재조합 조제 플라스미드 pmIL12이다. 레인 4, 5는 각각 DL15000, DL2000의 분자량 기준이다.
도 8은 재조합 조제 플라스미드 phIL12의 제한성 효소 절단-전기 영동도로서, 그 중에서 레인 1, 2는 각각 DL2000, DL15000 분자량 기준이며, 레인 3은 HindIII의 한 종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 3개의 밴드이고, 그 사이즈는 각각 1496 bp, 1882 bp, 2343 bp이며, 레인 4는 EcoRI＋BglII의 2종류의 제한성 효소로 절단되어 얻어진 2 개의 밴드이며, 그 사이즈는 각각 1752 bp,　3942 bp이며, 레인 5는 EcoRI라고 하는 한 종류의 제한성 효소로 절단된 선형 단편이며, 사이즈는 5694 bp이고, 레인 6은 제한성 효소로 절단하지 않은 재조합 조제 플라스미드 phIL12이다.
도 9(a)는 다른 형식의 코어 항원 HBcAg 특이성 항체값을 ELISA에 의해 측정한 결과를 나타낸 도면으로서, 1은 B형 간염 코어 항원을 코드하는 유전자와 B형 간염 미들 단백질을 코드하는 유전자를 하나의 플라스미드 중에서 융합한 것이며, 2는 B형 간염 코어 항원의 전체 길이를 코드하는 유전자를 포함한 플라스미드이고, 3은 절단 후의 B형 간염 코어 항원을 코드하는 유전자를 포함한 플라스미드이며, 4는 네거티브 대조군이다. 도 9(b)는 다른 형식의 B형 간염 코어 항원의 HBcAg 특이성 세포 면역 반응을 IFN－γ의 ELISPOT에 의해 검측한 결과를 나타낸 도면으로서, 1은 B형 간염 코어 항원을 코드하는 유전자 및 B형 간염 미들 단백질을 코드하는 유전자를 하나의 플라스미드 상에서 융합시킨 것이며, 2는 전체 길이의 B형 간염 코어 항원을 코드하는 유전자를 포함한 플라스미드이고, 3은 절단 후의 B형 간염 코어 항원을 코드하는 유전자를 포함한 플라스미드이며, 4는 네가티브 대조군이다.
도 10은 각 플라스미드에 의해 건강한 Balb/c마우스에 면역한 후에, IFN－γELISPOT에 의해 특이성 세포 면역(HBsAg 및 HBcAg에 대한 면역 반응) 반응을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 막대 그래프는 왼쪽에서 오른쪽으로 순서대로 플라스미드 pRec2. 0, pS2S, pC, pS2S－C, 및 pS2S＋pC이다.
도 11은 IFN－γELISPOT에 의해 특이성 세포 면역(HBsAg 및 HBcAg에 대한 세포 면역) 반응을 측정한 결과를 나타낸 도면으로서, 조제 플라스미드 pmIL12를 첨가하는 전후의 건강한 Balb/c마우스에 대한 면역 작용을 나타낸 것이다. 막대 그래프는 왼쪽에서 오른쪽으로 순서대로 pS2S, pS2S＋pmIL12, pS2S＋pC, pS2S＋pC＋pmIL12이다.
도 12(a)는 IFN－γELISPOT에 의해 특이성 세포 면역(HBsAg 및 HBcAg에 대한 세포 면역) 반응을 측정한 결과를 나타낸 도면이고, 도 12(b)는 ELISA에 의해 각 면역 방안의 HBcAg 특이성 항체값을 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, 컬럼 1은 근육내 주사 면역의 것이고, 컬럼 2는 전기 천공에 의한 면역의 것이다.
도 13(a)~(b) 및 도 13(c)의 1~6은, 각 그룹의 마우스의 면역 후의 간장 조직 슬라이스 사진이다. 도 13(a)은 정상의 마우스 간장 조직 슬라이스 사진이다. 도 13(b)은 Tg－HBV 마우스의 포지티브 대조군의 슬라이스 사진이고, 도 13(c)의 1~6은, Tg－HBV 마우스에 대해 3개의 플라스미드 백신 pS2S＋pC＋pmIL12으로 치료한 후의 마우스 간장 조직 슬라이스 사진이며, 그 중에서 마우스 3마리의 간장 조직 슬라이스는 정상 그룹과 유사하였다.

본 발명의 하나의 목적은 B형 간염을 치료하기 위한 DNA 백신 조성물을 제공하는 것으로, 해당 DNA 백신 조성물은, B형 간염 표면 항원을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, B형 간염 코어 항원을 코드하는 폴리 뉴클레오티드, 및 조제(예를 들면 사이토카인(cytokine), 예를 들면 티모신(thymosin), G－CSF, IL－2, IL－4, IL－12 및 IFN－γ. 가장 바람직하게는 IL－12이다)를 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 포함한다. 그 중에서 상기 B형 간염 표면 항원, 바람직하게는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S이며, 가장 바람직하게는 B형 간염 표면 항원이 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S이다. 상기 폴리 뉴클레오티드는 본 분야에서 공지의 유전자 재조합 방법에 의해, 재조합 발현 플라스미드 중에 삽입되어 개체로서 발현된다.

용어 「벡터」는, 본문에서 이용하는 경우는, 그것과 접속하는 그 외의 폴리 뉴클레오티드의 핵산 분자를 운반할 수 있는 것을 말한다. 하나의 타입의 벡터는 「플라스미드」이며, 그 외의 DNA 단편을 접속할 수 있는 환상 이중 사슬 DNA환이 있다. 추가로 한 개의 타입은 파지 벡터(phage vector)이다. 추가로 한 개의 타입의 벡터는 바이러스 벡터이다. 이러한 벡터는, 그것을 도입한 숙주 세포 중에서 자주적으로 복제하는 것이 가능하다(예를 들면, 세균 복제 개시점을 갖는 세균 벡터 및 부가형 포유동물 벡터). 그 외의 벡터(예를 들면 비부가형 포유동물 벡터)는 숙주 세포를 도입한 후, 숙주 세포의 게놈에 정합할 수 있고, 이것은 숙주 게놈과 함께 카피된다. 또, 이러한 벡터는, 그것과 조작 가능하게 접속하고 있는 유전자를 발현하는 것을 지도한다. 이 타입의 벡터는 본문 중에서, 「재조합 발현 벡터」로 칭하며(약칭으로서는 「재조합 벡터」). 통상의 경우는 재조합 DNA 기술 중에서 유용한 발현 벡터는, 플라스미드 형식이다. 본 명세서에서, 「플라스미드」와「벡터」는 교환될 수 있도록 사용 가능하고, 플라스미드는 벡터의 가장 좋게 사용되는 형식이다.

본 발명은 추가로 B형 간염 표면 항원을 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 포함한 벡터, B형 간염 코어 항원을 코드하는 뉴클레오티드를 포함한 벡터, 및 조제를 코드하는 뉴클레오티드의 벡터와 관련된다. 본 발명은 추가로 이러한 벡터의 B형 간염을 예방 및/또는 치료하는 백신 조성물의 제조에 있어서 용도와 관련된 것이다. 또, 본 발명은 추가로 상기 벡터의, 본 발명의 교시에 따라 B형 간염 바이러스에 대한 면역 반응의 유도에 있어서의 사용과 관련된 것이다. 용어「벡터」는 당업자가 숙지하는 어떠한 벡터이어도 좋다. 예를 들면, pBR322, pRec2. 0, pcDNA3. 1 또는 pUC계 벡터와 같은 플라스미드 벡터이다. 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함한 벡터 DNA를 백신으로서 사용한다. 해당 DNA 백신은 근육주사에 의해 포유류 동물에 주사되는데 예를 들면 사람의 체내에 주사되어 해당 발현 유니트의 코드하는 단백질의 발현을 가져온다. 발현된 단백질은 면역 시스템 중에 노출되어 B형 간염 바이러스에 대한 특이성 면역 반응을 가져오게 된다.

본 발명에서 「개체」란 척수 동물이다. 몇 개의 실시 형태에서, 척수 동물은 포유류 동물이다. 포유류 동물이란, 이하를 포함하지만, 이것들에 한정되지 않는다. 이들로는 가축(예를 들면 소), 운동용 동물, 애완동물(예를 들면 고양이, 개, 말), 영장류 동물, 마우스 및 토끼 등이 있다. 일부의 실시 형태에서, 포유동물은 사람을 의미한다.

용어 「B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S」, 「B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S」및 「B형 간염 코어 항원 단백질」은 천연 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S, B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S 및 B형 간염 코어 항원 단백질 및 이들의 유도체 또는 변이체이다. 상기 유도체는, 상기 천연 단백질 중에 서, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결손 및/또는 삽입하는 것으로 부터 얻어진 단백질이다. 예를 들면 1 ~ 10개, 1 ~ 25개, 1 ~ 10개, 1 ~ 5개의 아미노산을 보존 치환g여얻어진 유도체이며, 한편으로는 해당 유도체는 상기 천연 단백질과 동일한 B형 간염 바이러스에 대한 항원성 및 면역원성을 가지게 된다.

본 발명에서, 상기의 B형 간염 표면 항원의 재조합 플라스미드는 B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드이며, 여기에서, B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자, 바람직하지는, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 배열 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 배열이며, 추가로 바람직하기로는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 배열이다. B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자, 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자는 전체 길이 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S의 천연 뉴클레오티드 배열이어도 좋고, 또 해당 천연 뉴클레오티드 배열의 유도체 또는 변이체이어도 괜찮다. 해당 유도체와 해당 천연 S2S 단백질 또는 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자란 뉴클레오티드 배열에 대해 적어도 70%의 상동성을 갖는다. 바람직하게는 적어도 75%의 상동성을 갖는다. 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 85%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는다. 상기 뉴클레오티드 배열이 코드하는 단백질은 천연 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 표면 코어 스몰 단백질 S와 동일한 면역원성을 갖는다.

본 발명에서 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는유전자는, 바람직하게는 Seq　ID　No. 1, Seq　ID　No. 2, Seq　ID　No. 3 또는 Seq　ID　No. 4로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 함유하고, 바람직하게는 Seq　ID　No. l, Seq　ID　No. 2, Seq　ID　No. 3또는 Seq　ID　No. 4로 표시된 뉴클레오티드산으로부터 된다.

본 발명에서 용어 「B형 간염 코어 항원 단백질」,「B형 간염 코어 단백질」,「B형 간염 코어 항원」및 「B형 간염 코어 단백질 항원」은 변환하여 사용할 수가 있다.

본 발명에서 상기 B형 간염 코어 단백질 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드이며, 상기 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자는 천연의 전체 길이 코어 항원 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 배열이어도 좋다. 또한, 절단된 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 배열이어도 좋다. 예를 들면, 상기 절단 된 B형 간염 코어 단백질은, N말단의 144 aa만을 포함하는 것이어도 좋다. 또한, 해당 천연 유전자의 뉴클레오티드 배열과 적어도 70%의 상동성을 갖는다. 바람직하게는 적어도 75%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 85%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는다. 보다 바람직하지는 적어도 95%의 상동성을 갖는다. 추가로 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는다. 한편 그것이 코드하는 단백질은 천연 B형 간염 코어 단백질과 동일한 면역원성이 있는 상기 뉴클레오티드 배열의 유도체 또는 변이체이어도 좋다.

본 발명에서 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 배열은 SeqID　No. 5, SeqID　No. 6, SeqID　No. 7, SeqID　No. 8으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것이면 좋다. 또한,　Seq　ID　No. 5, Seq　ID　No. 6, Seq　ID　No. 7, Seq　ID　No. 8으로 표시되는 뉴클레오티드 배열로부터 되는 것이어도 좋다.

상기 B형 간염 항원 단백질 또는 그 뉴클레오티드 배열의 유도체 또는 변이체는 본 분야에서 잘 알려진 방법에 따라서 생성할 수가 있다. 예를 들면 올리고 뉴클레오티드 개재의(부위 특이적) 돌연변이 유도, 알라닌 스캐닝(Alanine scanning) 및 PCR 변이 유도가 있다. 클론한 DNA에 대해서 부위 특이적 돌연변이 유도를 실시할 수가 있다(Carter 등, Nucl. Acids　Res. 13：4331(1986)；Zoller등, Nucl. Acids　Res. 10：6487(1987)), 카셋트 변이 유도(Wells 등, Gene　34：315(1985)), 제한성 선택 변이 유도(restriction　selection　mutagenesis)(Wells등, Philos. Trans. R. Soc. London　SerA　317：415(1986)) 또는 그 외에 이미 알려진 기술에 의해 B형 간염 항원 단백질 변이체 또는 DNA 변이체를 생성한다.

본 발명 중에 포함되는 B형 간염 표면 항원 미들 단백질 S2S, B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S, B형 간염 코어 항원 단백질 또는 그것들을 코드하는 유전자와 관련하는 「유도체」및 「변이체」는 천연의 대응물과 비교했을 경우 그 아미노산 배열 또는 뉴클레오티드 배열은 유한의 형태로 개변(改變)된다. 이것은 점이변(点異變)을 포함하고, 단백질의 성질을 바꿀 수가 있는데 예를 들면 원핵 시스템 중에서 발현되고, 또는 희망하지 않는 활성, 예를 들면, 희망하지 않는 효소 활성을 제거하는 것이 포함된다. 그러나, 해당 항원은 천연 항원과 충분히 유사하고, 이와 같이 백신 중의 소망하는 항원 성질을 보유하는 한편 이것들이 천연 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수가 있는 바, 즉 천연 항원과 같은 항원성 및 면역원성을 가진다. 구체적으로, 「유도물」또는 「변이체」가, 이 타입의 면역 반응을 일으킬 수 있는지는 본 분야에서 이미 알려진 면역학 측정법에 따르는 것으로 예를 들면 ELISA(항체에 대해서 반응) 또는 세포 마커(marker) 및 사이토카인(cytokine)을 이용한 적절한 플로우 사이트메트리(flow cytometry)(세포에 대하여 반응)로 측정한다.

본 발명은 B형 간염 표면 항원 미들 단백질 S2S, B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S, B형 간염 코어 항원 단백질과 관련있지만, 이러한 「면역원성 단편」도 포함한다. 상기 면역원성 단편은 상기 항원의 적어도 하나의 에피토프를 가지고, 한편으로 B형 간염 표면 항원 미들 단백질 S2S 단백질, B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S, 또는 B형 간염 코어 단백질 항원의 면역원성을 나타내며, 한편으로 적절한 구축체로서 존재하는 경우, 천연 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수가 있다. 통상의 경우는 면역 항원 단편은 적어도 20개, 바람직하게는 50개, 한층 더 바람직하게는 100개의 상기 항원 단백질 아미노산 배열을 포함한 연속 아미노산이다.

상기 B형 간염 항원 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열은 그 천연 뉴클레오티드 배열과 스트린젠트(stringent)한 조건으로 하이브리드(hybrid) 하는 폴리 뉴클레오티드 배열이다.

　하이브리드 반응의 「스트린젠트도」는 당업자에 의해 용이하게 확정하는 것이 가능하고, 한편으로 통상의 경우는 프로브의 길이, 세정 조건 및 염 농도는 경험에 근거하여 계산된다. 통상의 경우는 비교적 긴 프로브는 비교적 높은 온도에서 정확하게 어닐링하는 것이 필요하고, 비교적 짧은 프로브는 비교적 낮은 온도를 필요로 한다. 하이브리드는 통상적으로 상보 사슬(complemental strand)이 그 해리 온도보다 낮은 환경 중에서 변성 DNA가 새롭게 어닐링하는 능력에 의존한다. 프로브와 하이브리드 가능한 배열 간의 기대 상동성이 높으면 높을수록 사용할 수 있는 상대 온도도 높아진다. 결과적으로 비교적 높은 상대 온도는 반응 조건을 한층 더 스트린젠트 한다고 추측할 수 있고 비교적 낮은 온도에서는 스트린젠트는 없다. 하이브리드 반응의 스트린젠트도에 대한 기타 상세한 해석은 Ausubel 등 「Current　Protocols　in　Molecular　Biology」, Wiley　Interscience　Publishers, 1995를 참조할 수가 있다.

「스트린젠트 조건」또는 「하이 스트린젠트 조건」은 본문 중에서 정의하는 바와 같이 이하에서와 같이 판단할 수 있다. (1) 저 이온 강도 및 고온에서 세정을 실시한다, 예를 들면 0.015M 염화 나트륨/0.0015M 구연산 나트륨, 0.1% 도데실 황산 나트륨, 50°C이다. (2) 하이브리드 과정에서 변성제, 예를 들면 포름 아미드, 예를 들면 50%(ｖ／ｖ) 포름 아미드 및 0.1% 소 혈청알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐 피롤리돈/50mM, 인산 나트륨 완충액 pH　6.5는 750mM의 염화 나트륨, 75mM 구연산 나트륨을 포함하며, 42℃이고, 또는 (3) 50% 포름 아미드, 5 x SSC(0.75M　NaCl, 0.075M 구연산 나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH　6.8), 0.1% 피로 인산 나트륨이며, 5 x Denhardt씨 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(5μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 황산 우선성(dextrorotation)의 글리코시드 용액 중에서 42℃에서 하이브리드하여 하룻밤 방치하고, 42℃에서 0.2 x SSC(염화 나트륨/구연산 나트륨) 중에서 10분간 세정하고, EDTA를 포함한 0.l x SSC 중에서 55℃에서 10분간 하이스트린젠트로 세정한다.

　본 발명의 백신 조성물은, 재조합 조제 플라스미드를 포함하며, 해당 재조합 조제 플라스미드, 바람직하게는 사이토카인 재조합 조제 플라스미드이다. 본 발명의 제재중에서, 바람직하게는 조제가 우선적으로 Thl 반응을 유도하는 즉 Thl－형 조제이다. 예를 들면, Thl－형 조제는 인비트로에서 항원을 사용하여 재차 자극하는 경우 자극에 의해 분리된 T세포군이 고 레벨의 Thl－형 사이토카인을 생성하고, 또 Thl－형과 동타입의 관련의 항원 특이성 면역 글로블린과 반응하는 조제를 유도한다. 통상에 있어서, Thl－형 반응과 INF－γ, IL－2 및 IL－12등의 사이토카인의 생성과 관련이 있다. 따라서, 본 발명 재조합 조제 플라스미드, 바람직하게는 INF－γ, IL－2 및 IL－12의 재조합 조제 플라스미드로부터 선택되는 것이고, 콜로니 자극 인자와 티모신 재조합 조제 플라스미드로부터 선택되는 것이며, 또는 상기조제는 어떠한 조합을 발현하는 재조합 플라스미드이다.

본 분야의 표준적인 방법으로서, 본 발명의 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질을 코드하는 유전자를 휴대하는 재조합 플라스미드(재조합 백신 플라스미드) 및 조제를 코드하는 유전자를 휴대하는 재조합 플라스미드(재조합 조제플라스미드)를 구축한다. 하나의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명이 구축하는 재조합 플라스미드는, B형 간염 바이러스(HBV) 단백질을 코드하는 유전자를 포함하며, 또 대장균 복제 개시점 ColEl, 카나마이신(Kanamycin) 항성 유전자 배열 Kan^r, SV40으로부터 유래하는 인핸서 엘리먼트 Enhancer, 전사 제어 엘리먼트 인트론 Intronl 및 엑슨 Exonl, HBV로부터 유래하는 전사 후의 조정 유니트 HPRE 및 면역 조정 배열 CpG등의 엘리먼트를 포함하며, 여기에서 B형 간염 바이러스 단백질 인자는 인핸서, 거대 세포 바이러스 프로모터, 전사 제어 엘리먼트 Intronl 및 Exonl 및 전사 후 조정 엘리먼트 HPRE 및 소성장 호르몬 유전자의 폴리아데닌 뉴클레오티드 신호에 의해 제어된다.

상기 구축한 재조합 플라스미드에 대해서 B형 간염 바이러스 단백질을 코드하는 유전자는, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 및 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열을 포함하고, 여기에서, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 및 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열을 각각 2개의 다른 재조합 플라스미드 중에 삽입하고, 이것에 의해 각각 재조합 백신 플라스미드 pRec2.0－S2S 및 재조합 백신 플라스미드 pRec2.0－C를 얻는다.

　본 발명의 하나의 실시 형태에서, 구축된 재조합 조제 플라스미드는 인터루킨 12를 코드하는 유전자 배열(마우스 또는 사람으로부터 유래하는 천연 뉴클레오티드 배열)을 포함하고, 또는 대장균 복제 개시점ColEl, 카나마이신 항성 유전자 배열 Kan^r 및 2개의 목적 단백질을 발현하는 카셋트 및 SV40로부터 유래하는 인핸서 엘리먼트 Enhancer, 면역 조정 배열 CpG등의 엘리먼트를 포함한다. 여기에서 인터루킨 12를 코드하는 유전자는 각각 인터루킨 12 p35 단백질을 코드하는 유전자 및 인터루킨 12 p40 단백질을 코드하는 유전자를 같은 재조합 조제 플라스미드의 다른 위치에 삽입한다.

본 발명의 DNA 백신 조성물 중에 있어서, 상기 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 백신 플라스미드는, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자 또는 B형 간염 표면 항원 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자를 포함한 백신 플라스미드이며, 상기 재조합 B형 간염 코어 항원 플라스미드는, B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함한 백신 플라스미드이고, 상기 재조합 조제 플라스미드는 인터루킨 12 조제 플라스미드이다.

본 발명의 하나의 실시 형태에 의하면, 본 발명의 재조합 백신 플라스미드 pS2S를 구축하는 방법을 제공하되, 먼저 공백의 벡터 플라스미드를 구축하는 한편 빈 벡터 플라스미드중에, 조정 엘리먼트 및 복수의 제한성 효소 절단 부위를 설치하고 그리고, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자를 공백의 벡터 플라스미드중에 삽입하여 구축에 의해 재조합 백신 플라스미드 pS2S를 얻는다.

본 발명은 또한 하나의 실시 형태에 의하면, 본 발명의 재조합 백신 플라스미드 pC를 구축하는 방법을 제공하되, B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자를 미리 구축된 공백의 벡터 플라스미드 중에 삽입하여 구축에 의해 재조합 백신 플라스미드 pC를 얻는다.

본 발명은 또한 하나의 실시 형태에 의하면, 본 발명의 재조합 조제 플라스미드 pIL12를 구축하는 방법을 제공하되 사람 또는 마우스의 인터루킨 12 p35 단백질을 코드하는 유전자 및 p40 단백질을 코드하는 유전자를 각각 공백의 벡터 pcDNA3.1중에 삽입하여 사람 또는 마우스 유전자의 pcDNA3. 1－p35 및 pcDNA－p40를 얻는다. 구축에 의해 얻을 수 있는 플라스미드를 재조합 플라스미드 pS2S으로 클론하여, 제한성 효소 절단에 의해 순 방향 클론의 목표물을 선택하여 재조합 조제 플라스미드를 얻는다.

본 발명에서, 용어 「pRec2. 0－S2S」는 「pS2S」라고 간략화할 수가 있다. 「pRec2.0－C」는 「pC」에 간략화할 수가 있다.

본 발명은 또한 하나의 실시 형태에 의하면, 추가로 플라스미드의 제조 방법을 제공한다. 각 플라스미드(pS2S, pC 및 pIL12)의 제조 방법은 동일하며, 분할해서 생산하고, 재조합 플라스미드 pS2S, pC, pmIL12와 phIL12에서 각각 대장균 DH5a를 형질 전환하여 양성 클론을 스크리닝하고, 재조합 플라스미드를 포함한 양성 모노클론을 발효 배양, 증폭, 그리고 분해 및 컬럼 정제에 의해 정제된 재조합 플라스미드를 얻는다. 구체적으로는 이하와 같다.

＜발효＞－70℃에서 플라스미드를 포함한 대장균 DH5a를 꺼내서 접종 링으로 소량의 균액을 취하여 플레이트상에서 모노클론 5~10 ml의 대응하는 항생 물질을 포함한 LB액체 배지중에 배치하고, 37℃, 200 rpm에서 10~12 h 동안 배양하고 1：1000의 비율로 배양액을 2.5 L의 대응하는 항생 물질을 포함한 LB배지 중에 첨가한 후 37℃, 200 rpm에서 12~16 h 동안 배양한 후 배양물에 대해서 원심 처리를 실시하여 균체를 수집하고 플라스미드를 포함한 발효 배양물을 얻는다.

＜분해＞ 균체에 분해 버퍼를 첨가하고 조용하게 원심 튜브를 몇 차례 역으로 돌려 실온에서 방치시켜서 충분히 분해시킨다.

＜컬럼 크로마토그래피＞ 분해한 균체를 DNA 제조 컬럼에 통해서 이탈 분리시킨다. 플라스미드를 수집하여 유기용매로 침전시켜, 생리 식염수로 플라스미드 DNA를 용해시켜서 얻는다.

보다 편리하고 효율 높게 본 발명에서 기재한 재조합 플라스미드 및 재조합조제 플라스미드를 발현시키기 위해서, 추가로 재조합 플라스미드의 대장균을 구축하고 재조합 대장균을 응용하면, 보다 편리하게 각 플라스미드를 제조할 수 있다.

대장균 균주 DH5a/pmIL12는 재조합 조제 플라스미드 pmIL12를 포함하고 사전에 구축한 재조합 pmIL12에 의해, 대장균 DH5a를 형질 전환한 후에 카나마이신 항성을 포함한 LB플레이트중에서 스크리닝 하는 것으로 얻을 수 있고 중국 미생물 균종보장위원회 보통 미생물 센터에 기탁하고 있는(주소：북경시 조양구(朝陽區)) 대둔로(大屯路) 중국 과학원 미생물 연구소, 우편 번호 100101), 기탁일：2010년 04월 13일, 추천되는 분류명은 대장 에이시스씨균 Escherichia coli, 기탁 번호는 CGMCCNo. 3726이다.

대장균 균주 DH5a/phIL12는, 재조합 조제 플라스미드 phIL12를 포함하며, 사전에 구축한 재조합 플라스미드 phIL12에 의해 대장균 DH5a를 형질 전환한 후에 카나마이신 항성을 포함한 LB플레이트중에서 스크리닝 하는 것에 의해 얻을 수 있어 중국 미생물 균종 기탁 위원회 보통 미생물 센터에 기탁하고 있는(주소：북경시 조양구 대둔로 중국 과학원 미생물 연구소, 우편 번호 100101), 기탁일：2010년 04월 13일, 추천되는 분류명은 대장 에이시스씨균 Escherichia coli, 기탁 번호는 CGMCCNo. 3727이다.

대장균 균주 DH5a/pRec2.0－S2S는, 재조합 백신 플라스미드 pS2S를 포함하며, 사전에 구축한 재조합 플라스미드 pS2S에 의해, 대장균 DH5a를 형질 전환한 후에, 카나마이신 항성을 포함한 LB플레이트중에서 스크리닝하는 것에서 얻을 수 있으며, 중국 미생물 균종 기탁 위원회 보통 미생물 센터에 기탁하고 있다(주소：북경시 조양구 대둔로 중국 과학원 미생물 연구소, 우편 번호　100101), 기탁일：2010년 9월 15일, 추천되는 분류명은 대장 에이시스씨균 Escherichia coli, 기탁 번호는 CGMCCNo. 4181이다.

대장균 균주 DH5a/pRec2.0－C는, 재조합 백신 플라스미드 pC를 포함하며, 사전에 구축한 재조합 플라스미드 pC에 의해 대장균 DH5a를 형질 전환한 후에, 카나마이신 항성을 포함한 LB플레이트중에서 스크리닝 하는 것에서 얻을 수 있으며 중국 미생물 균종 기탁 위원회 보통 미생물 센터에 기탁되어 있다(주소：북경시 조양구 대둔로 중국 과학원 미생물 연구소, 우편 번호　100101), 기탁일：2010년 9월 15일, 추천되는 분류명은 대장 에이시스씨균 Escherichia coli, 기탁 번호는 CGMCCNo. 4170이다.

본 분야는 상규적인 방법에 의해 핵산을 어떠한 벡터 중에 포함된 핵산을 동물 개체 세포에 도입한다. 예를 들면, 핵산을 직접 환자 체내에 근육주사하거나 또는 그것을 다공막 내에 들어갈 수 있게 환자 체내에 이식(미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조)하거나 또는 지방질 시스템(지질 개재의 유전자 이전에 이용하는 지질은 예를 들면 DOTMA, DOPE 및 DC－Choi이다). 핵산을 지질체에 의해 캡슐화하는 기술은 Fullerton의 미국특허 제4,235,877호에 기재되어 있다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 감염 질병을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이며, 동물 개체에 상기의 3개의 플라스미드 조성물을 사용한다. 동시에, 본 발명은 또한 상기 3개의 플라스미드 조성물의 B형 간염 바이러스 감염 질병의 치료 및 예방에 있어서의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 백신 조성물을 사용하는 양은 일반 백신 접종자 중에서 면역 보호 반응을 유도하여 현저하게 불량한 부작용이 발생하지 않는 양이다. 이러한 사용량은 선택할 수 있는 접종 방법에 따라 변화한다. 구체적인 백신의 최적 사용량은 표준화 연구에 의해 확정할 수 있으며 치료를 받는 사람의 항체값 및 그 외의 면역 반응에 대한 관찰을 포함한다. 최초의 접종 후에 치료를 받는 사람은 4주간 이내에 강화 면역을 받을 수가 있고 그런 후에 2회째에 면역을 강화한다.

상기에 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 B형 간염 항원 단백질, 예를 들면, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 스몰 단백질 S와 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자의 발현 벡터(플라스미드 DNA)를 포함한 B형 간염 백신 조성물이다. 바람직하게는 해당 백신 조성물중에는 또한 조제를 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열의 발현 벡터(플라스미드 DNA)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 외피의 미들 단백질 S2S를 발현하는 플라스미드 또는 B형 간염 스몰 단백질 S를 발현하는 플라스미드와 B형 간염 코어 항원 단백질을 발현하는 플라스미드는 다른 것이며, 즉 B형 간염 표면 단백질(예를 들면 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S 또는 B형 간염 스몰 단백질 S)을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열 및 B형 간염 코어 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드를 다른 벡터 중에 삽입하여 각각 발현시킨다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시 형태는 3개의 플라스미드를 포함한 백신 조성물에 관한 것으로, 즉 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 B형 간염 스몰 단백질 S를 발현하는 재조합 플라스미드와 B형 간염 코어 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드이다.

본 발명은 또한 다른 B형 간염 코어 단백질 형식을 코드하는 유전자를 포함한 3개의 플라스미드 조성물의 B형 간염에 대한 예방 및 치료 효과에 대해 검증하였다. 상기 3개의 플라스미드 조성물은 전체 길이의 천연 B형 간염 코어 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열을 포함하거나 또는 절단된 천연 B형 간염 코어 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열을 포함하거나 또는 천연 B형 간염 코어 단백질과 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S의 폴리 뉴클레오티드 배열 융합체를 포함한다. 건강한 마우스에 대한 면역 효과의 비교 실험으로부터 천연 B형 간염 코어 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함한 3개의 플라스미드 조성물의 면역 효과는 짧고 절단되거나 또는 융합한 B형 간염 코어 단백질을 코드하는 폴리 뉴클레오티드 배열을 포함한 3개의 플라스미드 조성물의 면역 효과보다 우수하다.

연구하는데 있어서, 발명자는 B형 간염 코어 단백질과 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질을 코드하는 유전자의 융합체를 구축하는 경우 몇 종류에 대해 다른 구축 방식을 시험하고, 즉, B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 우선적으로 발현한 후에 B형 간염 코어 단백질을 발현하는 방식(S2S－C결합 모델)이며, 또는 B형 간염 코어 단백질을 우선적으로 발현한 후에, B형 간염 외피의 미들 단백질을 발현하는 방식(C－S2S 모델)이다. 구축에 의해 얻을 수 있던 플라스미드를 동물체 내에 주사하고, 어떠한 형식이든 2종류의 단백질은 서로 간섭하여, 후에 발현한 단백질이 숙주 체내에서 얻을 수 있던 면역 작용은 약하지만, 그러나 발명자는 B형 간염 코어 단백질 및 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질을 코드하는 유전자를 각각 2개의 벡터로 나누어 구축하여 각각 2개의 B형 간염 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드를 얻고, 양자를 숙주 체내에 주사하는 경우, 현저하게 이 2종류의 단백질의 체내에 있어서의 서로의 간섭을 분명하게 저하시켜, 이것에 의해 양호한 면역 효과를 얻을 수 있는 것을 찾아냈다.

본 발명의 또한 하나의 실시 형태에 의하면, 재조합 백신 플라스미드를 단독, 융합 또는 병용한 경우 건강한 마우스에 대한 면역 치료 효과를 제공한다. 즉 pS2S 단독 사용, pC단독 사용, pS2S－C융합 형식 단독 사용 및 pS2S＋pC 병용의 4개의 방식을 이용하여 면역 반응을 실시한다. 결과로부터 알 수 있는 것은, pS2S＋pC 병용 형식은 마우스 체내에서, HBsAg 및 HBcAg에 대한 세포 및 체액 면역 효과를 동시에 얻을 수 있는 것이며, 한편 양자의 상호 영향은 최소한으로 억제할 수가 있다. 단독으로 pS2S 또는 pC를 사용하는 경우, 표면 항원 또는 코어 항원, 한종류의 면역 효과 밖에 얻을 수 없다. pS2S－C 융합 형식을 사용하는 경우, HBsAg 및 HBcAg에 대한 면역 효과를 얻을 수 있지만, HBcAg에 대한 면역 반응 레벨은 pS2S＋pC병용 형식에 비해 크게 저하되었다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에 의하면, pS2S + pC 조합 방식을 이용한 경우 재조합 조제 플라스미드 pmIL12을 첨가하는 것과 첨가하지 않은 경우의 항 마우스 면역 효과에 대해 비교한 경우, 재조합 조제 플라스미드를 첨가한 경우, HBsAg와 HBcAg의 면역 효과는 더욱 강한 것으로 나타났다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에 의하면, 세 개의 플라스미드의 조합은 다른 면역 형식에 의해 건강한 마우스에 면역 영향을 제공하고, 즉 각각의 근육 주사 방식 및 근육 주사 방식과 전기 천공을 조합하여 면역 반응을 실시한 경우, 천공 방식을 이용하여 면역을 행하고 HBsAg과 HBcAg에 대한 면역 효과를 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명은 다른 실시 형태에 의하면, 본 발명의 세 개의 플라스미드 백신 조성물의 Tg-HBV 마우스에 대한 치료 효과를 제공하며, 세 개의 플라스미드 백신 조성물은 HBV 마우스 혈청 HBV DNA, 혈청 HBsAg 레벨, 및 혈청 ALT 레벨을 저하시키는 한편 일부 HBsAg, HBV DNA를 음성으로 변화시켜 혈청 ALT를 정상 레벨로 회복시키고 HBV 마우스에 대해 비교적 양호한 치료 효과를 나타낸다.

본 발명은 또한 상기 플라스미드를 포함하는 B 형 간염 예방 및/또는 치료하는 B형 간염 백신 조성물 또는 의약품 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 해당 백신 조성물 또는 약학 조성물은 이상에서 기재한 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 백신 플라스미드, B형 간염 핵심 항원을 발현하는 재조합 백신 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드, 및 제약상 허용할 수 벡터를 포함한다. 다른 하나의 실시 형태에 의하면, 본 발명의 의약 조성물은 또한 다른 항 바이러스 의약품을 포함하며, 바람직하게는, 항 B형 간염 바이러스류 의약품 또는 유기체의 면역 반응 조절류 의약품이다.

본 발명의 백신 조성물 또는 의약 조성물은 다른 항 바이러스류 의약품, 바람직하게는 항 B형 간염 바이러스류 의약품 및 / 또는 유기체의 면역 반응 조정류 류 의약품과 동시에 또는 순차적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 본 발명 백신 조성물 또는 의약 조성물은 상기 항 바이러스류 의약품 및/또는 유기체의 면역 반응 조정류 의약품을 사용하기 전, 동시에 및/또는 후에 사용하고 이를 통해 전반적인 치료 효과를 얻는다.

본 발명은 또한 상기 플라스미드, 상기 세 개의 플라스미드를 함유하는 조성물, 백신 조성물 또는 의약 조성물의 B 형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료의 제조에 사용에 관한 것이다. 또한, 해당 의약품은 다른 항 바이러스류 의약품, 바람직하게는 항 B형 간염 바이러스류 의약품 및/또는 유기체의 면역 반응 조절류 의약품과 동시에 또는 순차적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 해당 의약품은 위 항 바이러스류 의약품 및/또는 유기체의 면역 반응 조절류 의약품 앞에 동시에 및/또는 그 사용한다.

본 발명은 또한 제품 및 키트에 관한 것으로, 제품 및 키트 중에는 본 발명의 백신 조성물 또는 의약 조성물의 용기, 및 본 발명 백신 조성물 또는 의약품 조성물의 B형 간염 바이러스 감염 예방 및/또는 치료를 위한 사용 설명서를 포함한다. 하나의 실시 형태로서, 상기 제품 및 키트 중의 제1 용기 중에는 첫회 접종 (다음회 면역)에서 사용하는 본 발명의 백신 조성물 또는 의약품 조성물을 포함하고, 제2 용기 중에는 다음회 접종 (면역 강화)에서 사용하는 본 발명의 백신 조성물 또는 의약품 조성물을 포함한다. 상기 적절한 용기는 예를 들어, 병, 튜브, 주사기 등을 포함한다. 용기는 각종 재료로 만들 수 있으며, 예를 들면 유리 또는 플라스틱이다. 상기 사용 설명서는 상기 조성물을 B형 간염 바이러스 감염 질병의 예방 및/또는 치료에 이용하는 것을 가르킨다. 또한 상기 제품 또는 키트는 또한 다른 용기를 포함하며, 그 중에는 약학상 허용할 수 버퍼를 포함하고, 예를 들면 주사용 세균 억제물(BWFI), 인산염 버퍼, 링거 (Ringer) 용액과 포도당 용액을 포함한다. 또한, 비즈니스 및 사용자 입장에서 본 필요한 기타 물질 및 기타 완충재, 희석액, 필터, 침과 주사기 등을 포함할 수 있다.

하나의 실시 형태로서, 본 발명의 제품 및 키트는 또한 다른 항 바이러스류 의약품을 포함하며, 바람직하게는 항 B형 간염 바이러스류 의약품 및/또는 유기체의 면역 반응 조정류 의약품의 용기를 포함하고, 본 발명의 백신 조성물 또는 의약 조성물을 상기 항 바이러스류 의약품 및/또는 유기체의 면역 반응 조제류 의약품을 사용하기 전에, 동시에 및/또는 그 후에 사용할 때를 가르키는 사용 설명서를 포함한다.

실시예

본 발명의 재조합 백신의 제조

<플라스미드의 구축>

사용 시약 및 재료 : 대장균 DH5a는 Invitrogen 사로부터 구입하였다. 전사 후 조절요소(HPRE)을 갖는 DNA 플라스미드 pInH, 플라스미드 pDRVISVl.0은 중국 질병 예방 통제 센터 성병 에이즈 예방 통제 센터 바이러스 면역실에서 증정받은 것이다 (해당 플라스미드의 구축 프로세스 및 상세한 자료는 중국 특허 문헌 CN1560259A에서 완전하게 공개되어 있다). 진핵 발현 플라스미드 pcDNA3.1는 Invitrogen 사에서 구입한 것이다. 진핵 발현 벡터 pHPRE (즉 plnH 플라스미드)는 중국 질병 예방 통제 센터 성병 에이즈 예방 통제 센터 바이러스 면역실에서 구축 된 것이다 (상기 플라스미드 구축 프로세스 및 상세한 자료는 문헌 DNA Cell Biol. 2009 May 28 (5) : 233-40에 공개되어 있다). 내부 리보솜 진입 사이트(IRES)를 포함한 2 시스트론성 발현 플라스미드 pIRESneo는 Clontech 사에서 구입하였고 293T, COS-7 세포는 ATCC에서 구입하였으며 마우스 비장 세포는 1640 완전 배지에 의해 서 배양되었다(10% 태아 소 혈청, Invitrogen 사). 각종 제한성 효소, pfu 폴리메라아제, DNA 연속 시약 SolI는 모두 NEB 사에서 구입한 것이며, 플라스미드 추출 정제 시약 키트는 TIANGEN 사에서 구입한 것이고, B형 간염 표면 항원과 표면 항체 정량 ELISA 측정 키트(화학 발광법)은 북경 원덕 바이오 과학 기술 유한 회사에서 구입한 것이다. 마우스 IFN-γ의 ELISPOT 측정 키트는 BD사에서 구입한 것이다. 항원 자극 펩티드는 북경 새백성(賽百盛) 바이오 기술 유한 회사가 합성한 것이다. 유전자 합성 및 유전자 배열 결정 작업은 베이징 영준(英駿) 바이오 과학 기술 유한 회사에 의해서 이루어졌다.

1 재조합 HBV DNA 백신 플라스미드 pRec2.0-preS2S 구축

(1) 먼저 재조합 플라스미드 벡터 골격 pOE-EKS를 구축한다.

pDRVISV1.0을 템플릿으로 프라이머 l 및 프라이머 2 (프라이머 2는 5' 말단 인산화의 프라이머임)를 프라이머로 하고 증폭에 의해 사이즈가 748bp이 레프리콘 구역(Ori)을 얻고, 동시에 EcoRl. Kpnl 및 Swal 효소 절단 부위를 도입한다.

프라이머 1 :

5'-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3 '

프라이머 2 :

5'-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3 '

pDRVISV1.0을 템플릿으로 하여 프라이머 3 (여기에서 프라이머 3은 5 '말단 인산화한 프라이머임)과 프라이머 4를 프라이머로 하고 증폭에 의해 사이즈가 1056bp인 카나마이신 항성 마크 유전자 (Kan^r)을 얻었다. 동시에 EcoRI 효소 절단 부위를 도입한다.

프라이머 3 :

5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3 '

프라이머 4 :

5'-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3 '

위 두개의 단편을 각각 EcoRI에 의해 단종류의 효소 절단을 행하고, 접속한 후에 재조합 클론 pOK-EKS을 구축하였다.

(2) 재조합 플라스미드 DNA 백신 pRec2.0-PreS2.S을 구축한다.

합성 유전자 PreS2S을 Xhol + Xbal 두 종류의 효소로 절단한 것과 Sall + Xbal 두 종류의 효소로 절단한 벡터 pHPRE를 접속하여 재조합 클론 pHPRE-PreS2S을 구축하였다.

사용하는 합성 유전자 PreS2S는 북경 뇌묵(雷默) 바이오 과학 기술 유한 회사에 위탁하여 합성하고 뉴클레오티드 배열 SeqID No.2는 최적화 된 S2S 단백질을 코드하는 유전자 배열이며, Seq ID No. 2에 나타난 뉴쿨레오티드 배열 중에서는 그 개시 위치의 효소 절단 부위 배열 및 말단의 효소 절단 부위 및 터미네이터에 대해 나타냄이 없이 합성 유전자 PreS2S의 완전한 배열은 SeqID No. 2의 뉴클레오티트 배열의 개시단에는 CCGCTCGAGCCGCCACC의 17 개의 뉴클레오티드를 포함하고, 그의 말단에는 TTCTAGAGC와 같은 9 개의 뉴클레오티드 배열을 포함한다.

pDRVISV1.0을 템플릿으로 프라이머 5와 프라이머 6을 프라이머로 하고 증폭하여 사이즈 271bp의 BGHpolyA 구역을 얻고, 동시에 상류에 BamHI 효소 절단 부위를 도입하고, 하류에 BglII-EcoRV-SalI-Kpnl 효소 절단 부위를 도입하며, BamHI + KpnI이라는 두 종류의 효소로 절단한 후 BglII + KpnI 두 종류의 효소로 절단한 pHPRE-PreS2S 벡터에 도입하여 재조합 플라스미드 pHPRE'-PreS2S을 얻었다.

프라이머 5 :

5'-CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3 '

프라이머 6 :

5'-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3 '

EcoRI + KpnI에 의해 재조합 플라스미드 pHPRE'-PreS2S의 PreS2S 발현 카세트를 벡터 pOK-EKS 중에 도입하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-PreS2S을 구축하였다.

2, 재조합 HBV DNA 백신 플라스미드 pRec2.0-C의 구축

합성 유전자 CPreS1 (뉴클레오티드 배열 SEQ ID No.11)을 XhoI + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 것과 SalI + XbaI의 두 종류의 효소로 절단된 벡터 pHPRE를 접속하여 재조합 클론 pHPRE-CPreS1를 구축하였다.

pDRVISV1.0을 템플릿으로 프라이머 5와 프라이머 6을 프라이머로 하고, 증폭하여 사이즈 271bp의 BGHpolyA 구역을 얻고, 동시에 상류에 BamHI 효소 절단 부위를 도입하고, 하류에 BglII-EcoRV-SalI-KpnI 효소 절단 부위를 도입하며, BamHI + KpnI이라는 두 종류의 효소로 절단한 후 BglII + KpnI 두 종류의 효소로 절단한 pHPRE-CPreS1 벡터에 도입하여 재조합 플라스미드 pHPRE'-CPreS1을 얻는다.

EcoRI + KpnI에 의해 재조합 플라스미드 pHPRE'-CPreS1의 CPreS1 발현 카세트를 벡터 pOK-EKS 중에 도입하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-CPreS1를 구축한다.

pRec2.0-CPreSl을 템플릿으로 프라이머 7 및 프라이머 8을 프라이머로 하고, 증폭하여 사이즈 596bp의 B형 간염 코어 단백질 유전자 (C)를 얻고, 또한 PstI + XbaI의 두 종류의 효소로 절단한 후 PstI + XbaI 두 종류의 효소로 절단 된 pRec2.0-CPreSl 벡터에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-C를 얻었다. 그 배열은 SEQ ID No.10에 나타낸다.

프라이머 7 :

5'-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3 '

프라이머 8 :

5'-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3 '

재조합 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-C의 구축

pRec2.0-C를 템플릿으로 프라이머 9 및 프라이머 8을 프라이머로 하고 증폭하여 사이즈가 579bp인 B형 간염 핵심 단백질 유전자 (C)를 얻었다. HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 것과 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 벡터 pcDNA3.1를 접속하여 pcDNA3.1-C를 구축하였다.

프라이머 9 :

5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3 '

프라이머 8 :

5-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3 '

BglII + Pvull 두 종류의 효소 절단에 의해 플라스미드 pcDNA3.1-C에서 B 형 간염 핵심 단백질 (Core) 발현 카세트를 얻고 BglII + EcoRV 두 종류의 효소로 절단되어서 얻어진 pRec2.0-preS2S 중에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-C를 구축하였다.

3, 재조합 조제 플라스미드 pmIL12 구축

(1) 합성 유전자 mP35 (SeqID No.12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가짐)를 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단하고 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 벡터 pcDNA3.1와 접속하고 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-mP35을 구축하였다.

(2) BglII + PvuII 두 종류의 효소로 절단하여 플라스미드 pcDNA3.1-mP35에서 mP35 발현 카세트를 얻어 BglII + EcoRV 두 종류의 효소로 절단되어 얻어진 pRec2.0-PreS2S에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-mP35을 구축하였다.

(3) 합성 유전자 mP40 (SeqID No.13로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가짐)를 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단하고 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단 한 벡터 pcDNA3.1와 접속하여 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-mP40을 구축하였다.

(4) SalI + PvuII 두 종류의 효소로 절단하여 mP40 유전자 발현 카세트를 잘라 내고, SalI + SwaI 두 종류의 효소로 절단 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-mP35에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0 -PreS2S-mIL12을 얻었다.

(5) Ndel 효소로 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-mILl2을 절단하여 총 3 개의 밴드 (1870bp +3448 bp +3855 bp)를 얻고, 1870bp 조각 및 3855bp 조각을 회수하고 회수한 3855bp 조각을 CIP 탈인산화한 후 1870bp 조각과 접속하여 순방향 클론의 재조합 플라스미드 pmIL12을 스크리닝하였다. 그 뉴클레오티드 서열은 Seq ID Νο No.16으로 표시되어 있다.

4 재조합 조제 플라스미드 phIL12의 구축

(1) 합성 유전자 mP35 (SeqID No.14로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가짐)를 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단하고 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 벡터 pcDNA3.1와 접속하여 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-hP35을 구축했다.

(2) BglII + PvuII 두 종류의 효소로 절단하여 플라스미드 pcDNA3.1-hP35에서 hP35 유전자 발현 카세트를 얻고 BglII + EcoRV 두 종류의 효소로 절단하여서 얻어진 플라스미드 pRec2.0-preS2S에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-hP35을 구축하였다.

(3) 합성 유전자 hP40 (SeqID No.15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가짐)를 HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단하고, HindIII + XbaI 두 종류의 효소로 절단한 벡터 pcDNA3.1와 접속하여 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-hP40을 구축하였다.

(4) SalI + PvuII 두 종류의 효소로 절단하여 hP40 유전자 발현 카세트를 절단하여 SalI + SwaI 두 종류의 효소로 절단한 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-hP35 중에 클론하여 재조합 플라스미드 pRec2.0 -PreS2S-hIL12을 얻었다.

(5) NdeI 효소로 플라스미드 pRec2.0-PreS2S-hILl2을 절단하여 총 3 개의 밴드 (1882bp +3448 bp +3812 bp)를 얻고, 1882bp 단편 및 3812bp 단편을 회수하고 회수한 3812bp 단편을 CIP 의해 탈인산화를 한 후 1882bp 단편과 접속하여 순방향 클론의 재조합 플라스미드 phIL12을 스크리닝하였다. 그 뉴클레오티드 서열은 Seq ID Νο. 17로 표시되어 있다.

5 플라스미드 백신의 제조

백신 플라스미드 (pS2S, pC) 및 조제 플라스미드 (pmIL12, phIL12)의 제조 방법은 동일하며, 각 플라스미드가 각각 생산된다. 구체적인 단계는 다음과 같다.

1) 플레이트 상에서 모노 클론을 선출하여 5 ~ 10ml의 대응 항생제를 포함한 LB 액체 배지 중에 설치하고 37 ℃, 200rpm에서 10 ~ 12h 배양한다.

2) 1:1000의 비율로 얻어진 배양액을 2.5L의 대응 항생제를 포함한 LB 배지 중에 첨가하고 37 ℃, 200rpm에서 12 ~ 16h 배양한다.

3) 4 °C에서 6000rpm으로 15min 원심 분리한 후 상등액을 제거하고, 침전을 500ml의 얼음으로 식힌 STE 용액 중에 부유시켜서 4 °C, 6000rpm에서 15min 원심분리하고 상등액을 제거한다.

4) 균체 침전을 125ml의 Buffer P1 중에 부유시키고 침전 덩어리가 나오지 않을 때까지 진탕을 한다. 125ml의 Buffer P2를 첨가하고 부드럽게 여러 번 원심 튜브를 상하를 거꾸로 하여 실온 하에서 5min 방치한다. 분해가 충분히 진행된 후 125ml의 Buffer P3를 첨가하고 원심용 튜브를 여러 번 거꾸로 하고 충분히 혼합시킨다.

5) 균일하게 혼합한 후 분열 생성물을 여과 장치 (Mega-Giga Cartridge)에 넣고 실온 하에서 20min 이상 정치하고 진공 펌프를 켜고 가압추출로 여과하고, 액체의 추출 여과를 완료한 후 50ml의 Buffer FWB2을 얻고, 무균 유리봉으로 가볍게 침전 덩어리를 교반하여 추출 여과를 계속했다.

6) 분해액 중에 30ml의 Buffer ER을 첨가하고 거꾸로 하여 균일하게 혼합하고, 30min 빙욕을 실시하고 용액을 맑게 한 후 미리 75ml의 Buffer QBT에서 평형화한 컬럼에 첨가한다.

7) 분해 액체를 완전하게 DNA 제조용 컬럼에 통과시킨 후 600ml의 Buffer QC에 의해 불순물을 용출시키고 액체를 전부 컬럼을 통해서 100ml의 세탈액 Buffer QN 의해 DNA를 용출시킨다.

8) DNA 용출액을 수집하고 70ml의 이소프로판올을 첨가하여 균일하게 혼합 한 후 12 °C에서 10000rpm으로 50min 원심 분리하였다.

9) 주의 깊게 상등액을 제거하고, 10ml의 70 % 에탄올로 침전물을 세정하고 에탄올 세정액을 제거한 후 원심 튜브를 거꾸로 하여 티슈 상에서 자연 건조하였다.

10) 5ml ~ 10ml의 생리 식염수를 첨가하고 플라스미드 DNA를 용해하였다.

11) 분광 광도계에 의해 제조한 플라스미드 DNA의 농도를 측정하고 측정된 플라스미드의 농도에 대응해서 희석하고, 최종 농도가 1μg/μl (또는 0.4μg/μl, 40ng /μl)되도록 희석하여 -20 °C에서 보관하였다.

[실시예 2] 다른 형식의 HBcAg을 발현하는 핵산 백신 면역 효과의 비교

절단, 전장, 전장융합 등 3종류의 다른 형식의 B형 간염 윌스코어 항원(HBcAg)핵산 백신의 마우스 체내에 있는 체액 및 세포 면역 원성을 비교하여 바람직한 면역원의 설계안을 얻었다. 코돈(codon)의 최적화에 의해, 다른 형식의 B형 간염 바이러스 HBcAgNA 백신을 구축했다. 각각 ① pRec2.0-Ct:144aa로 절단된 B형 간염 코어 단백질을 발현하고,② pRec2.0-C: 전장 183aa의 B형 간염 코어 단백질을 발현하고 ③ pRec2.0-CpreSl: 전장 B형 간염 코어 단백질과 PreSl과의 융합 단백질이다. 상기 백신 플라스미드에 의해 293T세포를 형질 전환시켜 Western Blot에 의한 목적 항원 유전자 발현을 측정하였다. 근육 주사법에 의해 Balb/c마우스에 대하여 면역 접종을 실시하고, ELISA 방법에 따라 마우스 혈청 항체-HBc의 항체 레벨을 측정하고 IFN-γELISPOT 방법에 의해 마우스 체내 HBcAg특이성 T세포 면역 응답을 측정하였다.

마우스의 그룹 분배 및 면역: 6 ~ 8주 연령의 메스 Balb/c 마우스는 군사 의학 과학원 실험 동물 센터에서 구입한 것이며, 랜덤으로 이하 4개 그룹으로 나누었다.①음성 대조 그룹, 마우스 6마리; ② pRec2.0-Ct그룹, 마우스 12마리; ③ pRec2.0-C그룹, 마우스 12마리; ④ pRec2.0-C-preSl그룹, 마우스 12마리. 음성 대조 그룹은 pRec2.0 공백 벡터 플라스미드를 주사하고, 실험 그룹은 상응하는 핵산 백신을 접종한다. 각각의 마우스는 매번 플라스미드 DNA50μl(100μL)을 면역 주사한다. 각각의 쥐는 두 후각의 전경골근에 각각 50μ1를 주사하였다. 면역은 0, 2, 4주째에 각각 한번 면역을 실시하고, 4, 6주째에 각각 각 그룹의 절반의 마우스를 도살 처분하고, 혈청을 채집하는 한편 비장 임파 세포를 수집하였다.

결과로부터 알 수 있는 것은 음성 대조 그룹의 마우스 이외에 백신에 의해 면역된 후 각 그룹의 마우스들은 모두 HBc 항원 특이성 항체와 T 세포 반응을 생산하였다. 여기에서 pRec2.0-C 그룹의 Anti-HBc 항체 (110.86 ± 87.03U/ml) 및 T 세포 면역 반응 레벨 (IFN-γ : 471.3±88.0spots /백만 세포)는 모두 분명히 pRec2.0-CpreSlAnti-HBc : 34.56 ± 29.51U/ml (IFN-γ : 70.8 ± 48.2spots / 백만 세포)과 pRec2.0-Ct 그룹 (Anti-HBc : 38. 60 ± 41.87U/ml, IFN-γ : 203.5 ± 126.7spots / 백만 세포) 보다 높다 ((P <0.05). 결론 : HBcAg을 144 개 아미노산으로 짧게 절단하거나 또는 preSl과 융합하는 것으로, 그 체액 및 세포 면역 효과를 저감시킨다.

[실시예 3] 재조합 백신 플라스미드 pS2S, pC, pS2S-C. pS2S + pC의 건강한 Balb/c 마우스에 대한 체액 및 세포 면역 비교

6 ~ 8 주 연령의 Balb / c 메스 마우스는 중국 의학 과학원 동물 번식 센터에서 구입하고 청결 수준에서 사육된 것이다. 50 마리의 마우스를 5 개의 그룹으로 나누어 각각은 pRec2.0 공백 플라스미드 그룹, 4개의 면역 그룹으로서의 재조합 플라스미드 DNA 백신 pS2S 그룹, 재조합 플라스미드 pC 그룹, 재조합 플라스미드 pS2S-C 그룹, 재조합 플라스미드 pS2S + pC 그룹이다. 각 그룹에 대해 각각 50μg을 이용하여 면역을 실시하고 각각의 마우스는 플라스미드의 사용량에 따라 플라스미드 DNA를 주사하고 부피는 100μl이었다. 각각의 마우스는 두개의 후각의 전경골근에 각각 50μ1 주사하였다. 재조합 플라스미드 pS2S + pC 그룹에 대한 투여는 플라스미드 pS2S와 플라스미드 pC를 각각 좌우 두 개의 후각에 주사하였다. 면역은 0, 2, 4 주째에 각각 한 번 면역을 실시하고, 6 주째에 마우스를 도살 처분하고, 혈청을 채취하는 한편 림프 세포를 분리하였다.

(1) 체액 면역 측정 : 마우스 혈청을 채취하고, 엄격하게 북경 원덕(源德) 바이오 과학 기술 회사 키트를 사용하여 설명서의 방법을 사용하여 조작하였다.

(2) 세포 면역 측정 : 마우스 림프 세포는 다음과 같이 제조하였다. 자궁 경부 탈구법에 따라 마우스를 도살 처분하고, 75 % 에탄올을 넣은 비이커 중에서 마우스 체모를 완전히 적시되 약 3 분 이상 적셨다. 그때 마우스의 복부를 절개하여 비장을 제거하고, 분리한 비장을 무균 비이커의 200 개의 망상 위에 방치하고 (배양액적을 가짐), 가볍게 비장 조직을 파괴하고 비장 세포를 연마하여 꺼집어 내고 5ml 혈청 1640 배양액으로 천천히 세포를 비이커 중에 흘려 넣어 5ml 비장 세포 현탁액을 서서히 2.5ml 림프 세포 분리액을 가지는 15ml 원심 튜브에 넣고 2000 ~ 2500r/min에서 20min 동안 원심 분리를 실시하고, 분리된 림프 세포를 수집한 후 IC 원심에 의해 세포를 2회 세정하고, 매번 1500r/min에서 6min 간 원심분리한 후 적당량의 5 % FCS-1640 완전 배양액에 의해 분리한 비장 림프 세포를 현탁시켰다. 트리판블루 염색에 의해서, 각각의 마우스 분리 림프 세포 활동 세포 수를 계수하고 세포 농도를 3 x l0⁵/ml 조정한 후 37 °C, 5% CO₂ 배양기에서 배양하고, ELISPOT 측정에 공급하였다.

(3) ELISPOT 측정 : 엄격하게 BD 사의 키트를 사용하는 설명서 방법에 따라서 조작하고, 다음 조건을 충족 양자는 ELISPOT에 의해 측정한 HBsAg 특이성 세포 양성인 것을 인정한다 : (1) 일정한 세포 밀도하에서 ELISPOT 측정판 중에 같은 샘플에 대하여 HBsAg와 비 HBsAg에 따라 각각 3개의 복수의 구멍을 자극하고 반점 평균수 (SFC)의 비율은 2 이상이다. (2) 면역 실험 그룹 샘플의 림프 세포 밀도가 3 x l0⁵/ml 구멍인 경우 HBsAg과 비 HBsAg에 따라 각각 3개 이상의 복수 구멍을 자극하고 SFC 평균수의 차이는 5 이상이다.

표 1 및 도 10의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 1) 플라스미드 pS2S 면역 그룹에서 유도에 의해 얻어진 HBsAg 항원에 대한 체액 면역 값은 327.4 ± 146.5mIU/ml이며, 세포 면역값은 271.6 ± 73.9 Spots/백만 세포이고; 2) 플라스미드 pC 면역 그룹에서 유도에 의해 얻어진 HBcAg 항원에 대한 체액 면역값은 110.8 ± 30.0U/ml이며, 세포 면역값은 471.3 ± 88.0 Spots/백만 세포이고; 3) 플라스미드 pS2S-C 면역 그룹에서 유도에 의해 얻어진 HBsAg 항원에 대한 세포 면역과 체액 면역 레벨과 pS2S 플라스미드만으로 면역하는 경우는 현저한 차이가 없지만, 유도에 의해 얻어진 HBcAg들에 대한 체액 및 세포 면역 반응은 분명히 저하되었다 (P <0.05). 여기에서 세포 면역 측정 결과는 음성이었다; 4) 플라스미드 pS2S와 플라스미드 pC에서 양쪽의 다리에 대해 별도로 면역을 실시하는 것에 의해 두 항원의 상호 간섭을 공간상으로 피하게 된다. 해당 안은 동시에 효과적으로 HBsAg와 HBcAg에 대한 세포 면역 및 체액 면역 반응을 유도할 수 있다. 5) 공백 벡터 플라스미드의 HBsAg, HBcAg 세포 면역과 체액 면역 결과는 모두 음성이었다.

[실시예 4]

재조합 백신 플라스미드 pS2S + p-C와 pS2S + pC + pmIL12의 건강한 Balb / c 마우스에 대한 체액 및 세포 면역 비교

6 ~ 8 주 연령의 Balb / c 메스 마우스는 중국 의학 과학원 동물 번식 센터에서 구입하고 청결 수준에서 사육되었다. 40 마리의 마우스를 4 개의 그룹으로 분리하고 각각은 pS2S 그룹, pS2S + pmIL12 그룹, pS2S + pC 그룹 및 pS2S + pC + pmIL12 그룹이었다. 백신 플라스미드 및 조제 플라스미드의 사용량은 모두 50μg이었다. 여기에서 pS2S + pC 그룹은 각각 마우스의 양쪽 다리에 플라스미드 pS2S 및 pC을 주사하고 pS2S + pC + pmIL12 그룹은 마우스 양쪽 다리에 각각 pS2S + pmIL12 (50 +25) μg, pC + pmIL12 (50 +25) μg을 주사하였다. 각각의 마우스는 각 그룹의 양에 따라 플라스미드 DNA를 주사하고 부피는 100μl이며, 각 마우스의 두개의 뒷다리의 전경골근에 각각 50μ1을 주사하였다. 면역은 0, 2, 4 주에 각각 한 번 면역을 실시하고, 6 주째에 마우스를 도살 처분하고 림프 세포를 분리하였다.

체액 면역 측정, 세포 면역 측정 및 ELISPOT 측정 방법은 실시예 3의 방법과 동일하다. 그 결과는 표 2와 같다.

도 2 및 도 11의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 1) pS2S 플라스미드 단독 면역 대해 조제 플라스미드 pmIL12의 추가는 마우스에서 유도된 HBsAg 특이성 세포 면역 반응을 현저하게 증가시킨 (P <0.05); 2) 실시예 3에 기재한 바와 같이 플라스미드 pS2S와 플라스미드 pC를 두 다리로 나누어 면역하고, 두 항원 상호 간섭을 공간상으로 격리하는 것과 동시에 효과적으로 HBsAg과 HBcAg에 대한 세포 면역과 체액 면역 반응을 유도할 수 있고, 또한 조제 플라스미드 pmIL12와 함께 마우스에 면역을 실시하여 HBsAg과 HBcAg 항원에 대한 세포 면역 반응을 추가로 향상시켰다. 3) 조제 플라스미드 pmIL12을 조합시켜서 사용하는 것은 HBsAg 및 (또는) HBcAg 특이성 체액 면역 반응 레벨의 향상에 뚜렷한 영향을 초래하였다.

[실시예 5] 전기 천공에 의해 투여한 경우의 건강한 Balb / c 마우스에 대한 체액 및 세포 면역 반응에 미치는 영향

6 ~ 8 주 연령 Balb / c 메스마우스는 중국 의학 과학원 동물 번식 센터에서 구입한 것으로, 청결 수준에서 사육되었다. 20 마리의 마우스를 두 그룹으로 나누고 모두 플라스미드 조성물 pS2S + pC + pmIL12 (50 +50 +50) μg을 주고 면역을 실시하였다. 한 그룹은 기존의 근육 주사 그룹이고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 마우스의 양쪽 다리에 각각 pS2S + pmIL12 (50 +25) μg, pC + pmIL12 (50 +25) μg을 주사하고, 주사 부위는 마우스의 두 개의 뒷다리 전경골근에 각각 50μ1을 주사하였다. 또 다른 하나의 그룹은 전기 천공 그룹으로서, 상기의 면역 주사 방식 및 약제량은 근육 주사와 동일하며 근육에 투여 한 후 WJ-2005 전기 천공기 (寧波新芝社 제품)에 의해 마우스 주사 부위에 대해 전기 충격을 실시하였다. 전기 천공 용 파라미터는 다음과 같다 : 전압 100V, 충격 시간 60ms, 자극 간격 255ms, 총 10 회 전기 충격을 하였다. 마우스의 면역는 0, 2, 4 주째에 각각 한 번 면역을 실시하였고, 6 주째에 마우스를 도살 처분하고 림프 세포를 분리하였다. 체액 면역 측정, 세포 면역 측정 및 ELISPOT 측정 방법은 실시예 3의 방법과 동일하며 실험 결과는 표 3과 같다.

도 3과 도표의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 세 개의 플라스미드 백신 pS2S + pC + pmIL12에서 전기 천공 방식으로 면역을 실시한 경우, 현저하게 HBsAg과 HBcAg 항원 특이성 세포 면역 반응을 증가시키고 (P <0.05), 또한 현저하게 HBcAg 항원 특이성 체액 면역 반응 (P <0.05)를 증가시켰다. 전기 천공 투여 방법의 면역 강화 방면에서 유효한 효과를 실현하였다.

[실시예 6] 세개의 플라스미드 백신 pS2S + pC + pmIL12의 Tg-HBV 마우스에 대한 치료 효과

실험 동물 : HBV 유전자 재조합 마우스는 북경 대학 의과부 실험 동물 학부에서 구입한 것이며, 상기 유전자 재조합 마우스의 모든 명칭은 C57BL/6J-TgN (AlblHBV) 44Bri이며, 미국 Jackson 실험실에서 도입하고 이전한 유전자는 HBV S, Pre2S 및 X 유전자를 포함하고, 도입한 HBV 유전자는 ayw 서브 형이고, 혈청 B 형 간염 표면 항원 (HBsAg)은 양성이며, 안정적으로 수직 유전될 수 있다. 10 마리의 4 ~ 6 주 연령의 청결 수준 유전자 재조합 마우스는 전부 북경대학 의학부 실험 동물 과학부에서 무균 사육된 것이다.

유전자 재조합 마우스 그룹화 및 면역 프로세스: 12 마리 Tg-HBV 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누고 그 중 6 마리는 Tg 대조 그룹이며, 100μl PBS 용액을 주사하고, 추가로 전기 천공에 의한 면역 투여도 병용하였다. 6 마리는 Tg 실험 그룹이며, 다리를 나누어 B 형 간염 치료 플라스미드 (pC + pmIL12/pS2S + pmIL12, 약제량은 모두 50μg +25 μg)을 주사하고 전기 천공 방식도 병용하여 투여하였다. Tg-HBV 마우스는 2 주마다 1 회 면역을 실시하여 총 4 회 주사하였다. 마지막 회에 투여 후 2 주 안에, 안와 채혈(眼窩採血)을 실시하는 한편 혈청을 분리하였다. Tg-HBV 마우스를 도살 처분하고 해부하여 간을 꺼내 고정액중에서 고정하고 간장조직을 슬라이스한 후 면역 조직 화학 측정을 하였다.

(1) 혈청 중의 HBsAg 항원 측정 결과 (ELISA) :

실험 방법 : Merieux 키트 설명서를 참조하기로 한다. 스트라이프 상 지지 선반에, 필요한 수량의 마이크로 플레이트를 설치하고, 한편 지정된 구멍 중 25μL 샘플 희석액을 넣어 100μL 샘플 또는 대조를 첨가하였다. 각각의 스트라이프 지지 선반 위에는 세 개의 음성 대조와 한개의 양성 대조가 있으며, 37 ℃에서 약 60 분간 배양하여 다음 각 구멍 사이 50μL 효소 결합물 용액을 넣고, 37 ℃에서 60 분간 배양한 다음 인산염 완충액으로 각각의 구멍을 6 회에 걸쳐 세정 및 침적하고, 각각의 구멍 중에 100μlΤΜΒ을 첨가하였다. 다섯째로, 스트라이프를 15 ~ 30 ° C 조건 하에서 차광하고 약 30 분간 배양하였다. 그리고 각각의 구멍 중에 100μl lmol/l 황산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 620 ~ 700nm를 참고 파장으로서 (이 파장)를 참고로 15 분 이내에 450nm시의 흡광도를 관찰한 후 그 OD 값을 기록하고 OD 값이 0.1보다 작은 결과 음성이라고 인정된다. 결과는 표 4와 같다.

실험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, Tg 실험 그룹 중에서 3개의 마우스 항원이 음성으로 전환되었다.

(2) 혈청 중 HBsAb, PreS2 및 HBcAb 항체 측정 결과

1, HBsAb, PreS2 혈청 항체 레벨 측정

실험 방법 : 간접 ELISA 법, 화학 발광 정량 측정에 의해 B 형 간염 코어 항체를 측정하였다.

사카로마이스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 정제화 발현에 의해, HBsAg VLP 입자를 정제한 다음 피복 Elisa 마이크로 플레이트를 피복하고 HBsAb 항체 레벨을 측정하였다. 대장균 발현 시스템에 의해 발현을 실시하고, PreS2 항원 단백질을 정제하며 그때 Elisa 마이크로 플레이트를 피복하고, PreS2 항체 수준을 측정하였다. 그 결과는 표 5와 같다.

2. 혈청 HBcAg 항체 레벨 측정

북경 덕원 바이오 의학 공정 유한 회사의 B 형 간염 코어 항체 (HBcAb) 측정 키트 (화학 발광법)을 이용하여 HBcAb 항체 레벨을 측정하였다. 마우스 혈청을 채취하고 키트의 설명서 작업 단계에 따라 측정을 실시하였으며, 그 결과는 표 6과 같다.

실험 결과 : 표 5 및 표 6의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, Tg 실험 그룹에서 6 개의 유전자 재조합 마우스에는 3 마리의 마우스 HBsAb 항체가 양성되고, 5 마리의 마우스 PreS2 항체 및 HBcAb는 양성이었으며, 5 마리의 마우스 HBcAg 항체가 양성으로 되었다.

(3) 혈청에서 DNA 수준 측정

B 형 간염 바이러스 핵산 증폭(PCR) 형광 정량 측정 키트는 심천 필기 바이오 공학 유한 회사에서 구입한 것이며, 자세한 측정 방법은 키트 설명서를 참조하기로 한다.

결과 판단은 이하와 같다.

측정 샘플에서 5.0 x l0²IU/ml ≤ HBV DNA ≤ 5.0 x l0⁷IU/ml 인 경우 측정 결과는 유효적으로, 대응의 농도값을 직접 보고할 수 있다.

측정 샘플에서 HBV DNA> 5.0 x l0⁷IU/ml의 경우> 5.0 x l0⁷IU/ml와 직접보고 할 수 있다.

측정 샘플 중에서, HBV DNA <5.0 x l0²IU/ml의 경우 최소 검출 한도 보다 적다고 보고하고 음성으로 전환되었다고 판단할 수 있다. 측정 결과는 표 7과 같다.

실험 결과는 다음과 같다. Tg 실험 그룹 중에서, 3 개의 마우스의 HBV DNA 농도는 측정 라인 이하이며, HBV DNA가 음성으로 전환되었다는 것을 나타낸다.

(4) 혈청 ALT 레벨의 측정

알라닌 전이 효소 키트 : 북경 금호 제약 주식 회사에서 구입하였다.

혈청 ALT 측정 방법 : (1) 96 웰 마이크로 플레이트 위에서, 시약 공백 웰, 두개의 표준 웰을 설치하고, 공백 웰 중에 증류수 20μ을 첨가하여 표준 웰 내에 각각 표준 혈청(혈장) 20μ를 첨가하고, 이 때 각 웰 중에 가공액 100μL을 첨가하여 균일하게 37 °C에서 15 분간 인큐베이션하였다. (2) 각각의 웰에 종지액 100μL을 넣고, 균일하게 혼합한 후 마이크로 플레이트 리더로 색을 비교하고 주파장은 492nm이며, 부파장은 630nm이고, 시약 공백 웰, 표준 웰 및 측정 웰에 넣고, 표준 농도를 입력하고, 시약 공백 구멍 웰을 0으로 하여 측정을 실시하고, 측정한 결과을 아래 식에 따라 ALT 활성에 대해 계산한다.

혈청 ALT 활성 (U/L) = 측정 웰 흡광도/표준 웰 흡광도 × 56. 이 결과는 표 8에 나타낸 바와 같다.

실험 결과 : 표 중의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, Tg 실험 그룹 중에는 3 마리의 마우스 ATL 레벨이 정상 레벨로 회복되었다.

(5) 간장 조직 면역 조직 화학 측정

1 실험 재료

1.1 Tg 마우스 간장 조직

1.2 항체 유래 : Mouse anti-HBsAg 단일 클론 항체 (ZM-0122) : Zhongshanjinqiao 바이오 과학 기술 유한 회사

1.3 측정 장비 : EnVision Detection System (GK500705) DAKO

1.4 농축형 DAB 키트 (ZLI-9032) : Zhongshanjinqiao 바이오 과학 기술 유한 회사

1.5 30 % H₂O₂ 규격 500ml/병 제조 업체 : 북경 화학 시약 회사

1.6 0.01MPBS (pH7.4) 실험실에서 직접 제작한 것이다

2 실험 방법

2.1 왁스 슬라이스에 대해 상식적으로 왁스와 물을 제거하고 탈 이온수로 세정한다.

2.2 3 % H₂0 2min 실온

2.3 0.01MPBS을 사용하여 3min x 3회 세정한다

2.4 제1 항원을 적하하고(1:200), 4 °C 냉장고에서 철야 인큐베이션을 한다

2.5 0.01MPBS에서 3min x 3회 세정한다

2.6 En Vision을 적하하여 실온에서 30min 인큐베이션한다

2.7 0.01MPBS에서 3min x 3회 세정한다

2.8 DAB에서 3 ~ 5min 발색하고 탈이온수로 발색을 종료시킨다.

2.9 헤마톡시린(Haematoxylin)으로 중복 연색하고, 분화, 남색으로 되돌리고, 탈수, 투명화, 슬라이스 봉입.

간장 조직 HBsAg의 면역 조직 화학 결과 (도 13)는 다음에서 나타낸 바와 같다. Tg-HBV 양성 대조 마우스 세포장내에 큰 입자의 과립상을 띠고 본 발명의 세개의 플라스미드 백신을 이용하여 치료 한 후 음성으로 전환된 마우스 세포 장내에는 소량의 과립이 있고, 정상 마우스의 간장 조직 슬라이스와 유사하고 음성 전환 효과는 분명하게 있다.

이상의 연구 결과로부터 알 수 있는 바와 같은 본 발명의 치료성 3개의 플라스미드 HBV DNA 백신은 50% HBV 유전자 재조합 마우스 혈청 HBsAg 혈청 HBV DNA를 음성으로 전환시켜 절반의 마우스 혈청 ALT를 정상 수준 회복시켰다.

CGMCC 중국미생물균종보존관리위원회일반미생물센터 CGMCC3726 20100413 CGMCC 중국미생물균종보존관리위원회일반미생물센터 CGMCC3727 20100413 CGMCC 중국미생물균종보존관리위원회일반미생물센터 CGMCC4181 20100915 CGMCC 중국미생물균종보존관리위원회일반미생물센터 CGMCC4170 20100915

SEQUENCE LISTING <110> Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd；Beijing Kawin Bio-Tech Co., Ltd <120> a DNA vaccine composition for prevention and treatment of hepatitis B virus <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 846 <212> DNA <213> hepatitis B virus <400> 1 atgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag accccagagt gaggggccta 60 tactttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca 120 cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gaacacaaca 180 tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240 ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca 300 cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt 360 cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc 420 atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc 480 gtttgtcctc tacttccagg aacatcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg 540 attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga 600 aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg 660 gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 720 ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780 tacaacatct tgagtccctt tttacctcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840 atttga 846 <210> 2 <211> 846 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus surface antigen protein S2S <400> 2 atgcagtgga actctaccac attccatcag gctctgctgg accctagagt gaggggactc 60 tatttccccg ccggaggaag ctcctctggc actgtgaacc cagtgcccac aaccgcaagc 120 cctatttcct ctatctttag ccggaccgga gaccccgctc ctaatatgga aaacactacc 180 tccggctttc tgggtccact gctcgtcctg caggccggct tcttcctgct caccagaatc 240 ctgacaatcc cccagagcct ggactcttgg tggacatccc tgaacttcct cggaggcgca 300 cccacttgtc ctggtcagaa tagccagtcc ccaaccagca accactcccc tacatcttgt 360 cccccaattt gccctggcta caggtggatg tgtctgagac gctttatcat tttcctgttt 420 atcctgctcc tgtgcctgat tttcctgctc gtgctgctgg actaccaggg aatgctcccc 480 gtgtgtccac tgctccccgg aaccagcacc acttccaccg gtccttgtaa gacatgcaca 540 atccccgctc agggcaccag catgtttcca tcctgttgct gtaccaaacc cagcgacggc 600 aactgcactt gtattcccat cccttcttcc tgggccttcg ccagattcct gtgggaatgg 660 gcaagcgtca ggttctcctg gctgagcctg ctcgtgccct ttgtgcagtg gtttgtcggc 720 ctgtctccca cagtgtggct gagcgtgatt tggatgatgt ggtattgggg accatccctg 780 tataatatcc tctctccctt cctgcctctg ctcccaattt tcttttgcct gtgggtttac 840 atctga 846 <210> 3 <211> 846 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus surface antigen protein S2S <400> 3 atgcagtgga actccacaac cttccatcaa gcccttctgg accccagagt tcgcggcctg 60 tactttcctg ctggtggcag cagttctgga actgtgaacc ctgtgccaac aaccgcctca 120 cccataagct ccatcttctc taggactggg gatcctgcac cgaacatgga gaacaccaca 180 tcaggcttcc tgggacccct cctggtctta caggctgggt ttttcttgtt gacccggatc 240 ctgacaatac cacagagtct ggacagctgg tggacctccc tcaattttct gggaggggca 300 ccaacctgtc ctggccagaa tagccagtcc ccaaccagta atcactctcc cacctcctgt 360 cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgcctcagga gatttatcat attcctgttc 420 atcctgctcc tgtgcctgat cttcttgttg gtcctgcttg actaccaagg tatgttgccc 480 gtgtgtcctc tgcttccagg aacatcaacc actagcaccg gaccctgcaa gacatgcacc 540 attcctgctc aaggcactag catgtttccc tcttgctgct gtaccaaacc ttcagatggc 600 aactgcacct gtattcccat cccaagctcc tgggctttcg ccagattcct gtgggaatgg 660 gcctcagtgc ggttctcctg gctcagttta ctggtgccat ttgtgcagtg gttcgttggg 720 ctttctccca cagtctggct gagcgtcata tggatgatgt ggtattgggg gccatccctc 780 tacaacatct tgagtccctt tttacctctg ttaccaattt tcttttgcct ttgggtgtac 840 atttga 846 <210> 4 <211> 846 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus surface antigen protein S2S <400> 4 atgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag accccagagt caggggcctg 60 tactttcctg ccggtggctc cagctccgga acagttaacc ctgtgccgac tactgcctca 120 cccatatcct caatcttctc caggactggg gaccctgcac cgaacatgga gaacacaaca 180 tcaggcttcc taggacccct gctcgtatta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240 ctcacaatac cacagagcct ggactcctgg tggacttctc tcaattttct agggggagca 300 cccacgtgtc ctggccaaaa ttcccagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt 360 cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc 420 atcctgctgc tgtgcctcat cttcttgttg gtgcttctgg actaccaagg tatgttgccc 480 gtctgtcctc tgcttccagg aacatcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg 540 attcctgccc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttccgacggc 600 aactgcactt gtattcccat cccatcaagc tgggctttcg caagattcct gtgggagtgg 660 gcctcagtgc gtttctcctg gctcagctta ctagttccat ttgtccagtg gttcgttggg 720 ctttccccca ctgtgtggct ttcagtaata tggatgatgt ggtattgggg gccaagcctg 780 tacaacatct tgagcccctt tttacctcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtctac 840 atttga 846 <210> 5 <211> 552 <212> DNA <213> hepatitis B virus <400> 5 atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120 gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca 240 tccagggaat tagtagtcag ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta 300 ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgtt ag 552 <210> 6 <211> 552 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus core antigen protein <400> 6 atggatattg atccttacaa agagtttggc gcctctgtgg aactgctcag cttcctgccc 60 tctgacttct ttccatccat tagagacctg ctcgataccg ccagcgcact gtatcgcgag 120 gccctggaat cccctgagca ctgtagccct caccatacag ccctgagaca ggctatcctc 180 tgttggggag aactgatgaa cctggcaacc tgggtcggct ccaacctgga ggacccagcc 240 tctagggaac tcgtggtgag ctacgtcaat gtgaacatgg gcctgaagat tagacagctg 300 ctgtggttcc acatctcctg cctcaccttc ggtcgggaga ctgtgctgga atatctggtg 360 agctttggcg tttggattag aactcctcct gcttacaggc ctccaaatgc ccctatcctg 420 tccaccctcc ctgagaccac cgtggtcaga cgcagaggca ggtctccaag acggaggaca 480 cccagcccta gacgcaggag atcacagtcc cctagacgga gaaggtctca gagccgcgaa 540 tcccagtgtt ga 552 <210> 7 <211> 552 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus core antigen protein <400> 7 atggacattg atccctataa agaatttgga gctagcgtgg agctgctttc ctttttgcca 60 tctgacttct ttccttctat tcgggatctg ctcgacactg ccagcgctct gtatagagag 120 gccttggagt ctcccgaaca ttgtagccca caccatacag cactcaggca ggctattctg 180 tgttggggtg agttgatgaa tctggccact tgggtgggca gtaatttgga agaccctgca 240 tcccgcgaac tggtagtcag ctatgtcaat gttaatatgg gcctgaaaat ccggcaactc 300 ttgtggtttc acatttcctg tcttaccttt ggcagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattag gaccccacct gcttaccggc cccctaatgc cccaatcctg 420 tccacacttc ccgaaactac cgtcgttaga cgacgcggca ggagtcctag acggcgcacc 480 ccatcaccca ggagacgccg gagccagtca cctagacgcc gtcggtccca aagcagggaa 540 tctcagtgtt ag 552 <210> 8 <211> 552 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of hepatitis B virus core antigen protein <400> 8 atggacattg atccctataa agaatttgga gcttccgtgg agctgctcag ctttttgcct 60 tctgacttct ttccttccat tcgggatctc ctcgacaccg ccagcgctct gtatcgggag 120 gccttggagt ctcccgaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca ggctattctg 180 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggca gtaatttgga agacccagca 240 tccagggaac tggtagtcag ctatgtcaat gttaatatgg gcctgaaaat cagacaactg 300 ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggcagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360 tcctttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatcctg 420 tcaacacttc ccgaaactac tgttgttaga cgacgcggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcacctc gcagacgaag gagccagtca ccccgtcgca gaagatctca aagccgggaa 540 tctcagtgtt ag 552 <210> 9 <211> 5112 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid containing enhancer-exon-intron-coding gene of HBV preS2S protein <400> 9 gaattctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 60 ctggggactt tccacaccca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660 tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 720 gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 780 ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga ctctataggc 840 acaccccttt ggctcttatg catgctatac tgtttttggc ttggggccta tacacccccg 900 cttccttatg ctataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta ttgaccatta 960 ttgaccactc ccctattggt gacgatactt tccattacta atccataaca tggctctttg 1020 ccacaactat ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact gacacggact 1080 ctgtattttt acaggatggg gtcccattta ttatttacaa attcacatat acaacaacgc 1140 cgtcccccgt gcccgcagtt tttattaaac atagcgtggg atctccacgc gaatctcggg 1200 tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg tagcggcgga gcttccacat ccgagccctg 1260 gtcccatgcc tccagcggct catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa cagtggaggc 1320 cagacttagg cacagcacaa tgcccaccac caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt 1380 agggtatgtg tctgaaaatg agcgtggaga ttgggctcgc acggctgacg cagatggaag 1440 acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct gataagagtc 1500 agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact 1560 cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc 1620 catgggtctt ttctgcagtc accgtcgtcg agccgccacc atgcagtgga actctaccac 1680 attccatcag gctctgctgg accctagagt gaggggactc tatttccccg ccggaggaag 1740 ctcctctggc actgtgaacc cagtgcccac aaccgcaagc cctatttcct ctatctttag 1800 ccggaccgga gaccccgctc ctaatatgga aaacactacc tccggctttc tgggtccact 1860 gctcgtcctg caggccggct tcttcctgct caccagaatc ctgacaatcc cccagagcct 1920 ggactcttgg tggacatccc tgaacttcct cggaggcgca cccacttgtc ctggtcagaa 1980 tagccagtcc ccaaccagca accactcccc tacatcttgt cccccaattt gccctggcta 2040 caggtggatg tgtctgagac gctttatcat tttcctgttt atcctgctcc tgtgcctgat 2100 tttcctgctc gtgctgctgg actaccaggg aatgctcccc gtgtgtccac tgctccccgg 2160 aaccagcacc acttccaccg gtccttgtaa gacatgcaca atccccgctc agggcaccag 2220 catgtttcca tcctgttgct gtaccaaacc cagcgacggc aactgcactt gtattcccat 2280 cccttcttcc tgggccttcg ccagattcct gtgggaatgg gcaagcgtca ggttctcctg 2340 gctgagcctg ctcgtgccct ttgtgcagtg gtttgtcggc ctgtctccca cagtgtggct 2400 gagcgtgatt tggatgatgt ggtattgggg accatccctg tataatatcc tctctccctt 2460 cctgcctctg ctcccaattt tcttttgcct gtgggtttac atctgattct agagcatgcg 2520 tggaaccttt gtggctcctc tgcgatccat actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct 2580 cgcagccggt ctggagcaaa gctcatcgga actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa 2640 tatacatcgt ttccatggct gctaggctgt actgccaact ggatccttcg cgggacgtcc 2700 tttgtttacg tcccgtcggc gctgaatccc gcggacgacc cctctcgggg ccgcttggga 2760 ctctctcgtc ccctctccgt ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg 2820 ccggtctccc cgtctgtgcc ttctcatctg ccggtccgtg tgcacttcgc ttcacctctg 2880 cacgttgcat ggagaccacc gtgaacgccc atcagatcct gcccaaggtc ttacataaga 2940 ggactcttgg actcccagca atgtcaacga ccgaccttga ggcctacttc aaagactgtg 3000 tgtttaagga ctgggaggag ctgggggagg agattaggtt aaaggtcttt gtattaggag 3060 gctgtaggca caaattggtc tgcgcaagat ccgctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 3120 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 3180 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 3240 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 3300 atgcggtggg cttatgagat ctaacgttga tatcaacgtt gtcgacggta ccatttaaat 3360 ttgaacgttc gcaatatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 3420 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 3480 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 3540 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 3600 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 3660 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 3720 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 3780 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 3840 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 3900 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 3960 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 4020 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggt tgaacgttcg caatcgtcgt tttcggcgcg 4080 cgccgttgaa cgttcgcaat tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta 4140 accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca 4200 ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg 4260 aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca 4320 tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca 4380 tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt 4440 tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc 4500 attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa 4560 acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct 4620 gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt 4680 aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc 4740 gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca 4800 tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct 4860 gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa 4920 tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta 4980 ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca 5040 atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttctt gaacgttcgc atcgtcgttt 5100 tcggcgcgcg cc 5112 <210> 10 <211> 4819 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid containing enhancer-exon-intron-coding gene of HBV core protein <400> 10 gaattctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 60 ctggggactt tccacaccca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660 tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 720 gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 780 ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga ctctataggc 840 acaccccttt ggctcttatg catgctatac tgtttttggc ttggggccta tacacccccg 900 cttccttatg ctataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta ttgaccatta 960 ttgaccactc ccctattggt gacgatactt tccattacta atccataaca tggctctttg 1020 ccacaactat ctctattggc tatatgccaa tactctgtcc ttcagagact gacacggact 1080 ctgtattttt acaggatggg gtcccattta ttatttacaa attcacatat acaacaacgc 1140 cgtcccccgt gcccgcagtt tttattaaac atagcgtggg atctccacgc gaatctcggg 1200 tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg tagcggcgga gcttccacat ccgagccctg 1260 gtcccatgcc tccagcggct catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa cagtggaggc 1320 cagacttagg cacagcacaa tgcccaccac caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt 1380 agggtatgtg tctgaaaatg agcgtggaga ttgggctcgc acggctgacg cagatggaag 1440 acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg cagctgagtt gttgtattct gataagagtc 1500 agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact 1560 cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc 1620 catgggtctt ttctgcagtc accgtcgtcg agccgccacc atggatattg atccttacaa 1680 agagtttggc gcctctgtgg aactgctcag cttcctgccc tctgacttct ttccatccat 1740 tagagacctg ctcgataccg ccagcgcact gtatcgcgag gccctggaat cccctgagca 1800 ctgtagccct caccatacag ccctgagaca ggctatcctc tgttggggag aactgatgaa 1860 cctggcaacc tgggtcggct ccaacctgga ggacccagcc tctagggaac tcgtggtgag 1920 ctacgtcaat gtgaacatgg gcctgaagat tagacagctg ctgtggttcc acatctcctg 1980 cctcaccttc ggtcgggaga ctgtgctgga atatctggtg agctttggcg tttggattag 2040 aactcctcct gcttacaggc ctccaaatgc ccctatcctg tccaccctcc ctgagaccac 2100 cgtggtcaga cgcagaggca ggtctccaag acggaggaca cccagcccta gacgcaggag 2160 atcacagtcc cctagacgga gaaggtctca gagccgcgaa tcccagtgtt gattctagag 2220 catgcgtgga acctttgtgg ctcctctgcg atccatactg cggaactcct agccgcttgt 2280 tttgctcgca gccggtctgg agcaaagctc atcggaactg acaattctgt cgtcctctcg 2340 cggaaatata catcgtttcc atggctgcta ggctgtactg ccaactggat ccttcgcggg 2400 acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccctc tcggggccgc 2460 ttgggactct ctcgtcccct ctccgtctgc cgttccagcc gaccacgggg cgcacctctc 2520 tttacgccgg tctccccgtc tgtgccttct catctgccgg tccgtgtgca cttcgcttca 2580 cctctgcacg ttgcatggag accaccgtga acgcccatca gatcctgccc aaggtcttac 2640 ataagaggac tcttggactc ccagcaatgt caacgaccga ccttgaggcc tacttcaaag 2700 actgtgtgtt taaggactgg gaggagctgg gggaggagat taggttaaag gtctttgtat 2760 taggaggctg taggcacaaa ttggtctgcg caagatccgc tgtgccttct agttgccagc 2820 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 2880 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 2940 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 3000 ctggggatgc ggtgggctct atgagatcta acgttgatat caacgttgtc gacggtacca 3060 tttaaatttg aacgttcgca atatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 3120 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 3180 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 3240 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 3300 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 3360 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 3420 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 3480 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 3540 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 3600 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 3660 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 3720 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacgggttga acgttcgcaa tcgtcgtttt 3780 cggcgcgcgc cgttgaacgt tcgcaattca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa 3840 ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 3900 catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 3960 ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 4020 tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 4080 atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca 4140 gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 4200 gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca 4260 attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 4320 ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt 4380 ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 4440 aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 4500 tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 4560 cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 4620 gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 4680 ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc 4740 ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg ctttcttgaa cgttcgcatc 4800 gtcgttttcg gcgcgcgcc 4819 <210> 11 <211> 950 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> artificially synthesized sequence containing the coding genes of HBV core protein and surface antigen S1 linked to each other by GGCGGAGGCGGTAGC linker peptide <400> 11 ccgctcgagc cgccaccatg gatattgatc cttacaaaga gtttggcgcc tctgtggaac 60 tgctcagctt cctgccctct gacttctttc catccattag agacctgctc gataccgcca 120 gcgcactgta tcgcgaggcc ctggaatccc ctgagcactg tagccctcac catacagccc 180 tgagacaggc tatcctctgt tggggagaac tgatgaacct ggcaacctgg gtcggctcca 240 acctggagga cccagcctct agggaactcg tggtgagcta cgtcaatgtg aacatgggcc 300 tgaagattag acagctcctg tggttccaca tctcctgcct caccttcggt cgggagactg 360 tgctggaata tctggtgagc tttggcgttt ggattagaac tcctcctgct tacaggcctc 420 caaatgcccc tatcctgtcc accctccctg agaccaccgt ggtcagacgc agaggcaggt 480 ctccaagacg gaggacaccc agccctagac gcaggagatc acagtcccct agacggagaa 540 ggtctcagag ccgcgaatcc cagtgtggcg gaggcggtag catgggcgga tggtcttcca 600 aaccaagaca gggcatgggc accaacctga gcgtgcctaa ccctctgggc ttcttcccag 660 atcaccagct cgaccctgca tttggcgcca attccaataa cccagactgg gatttcaacc 720 ctaacaagga ccattggcct gaggccaatc aggtgggtgc tggcgccttc ggacccggat 780 ttacaccacc ccacggtggc ctgctgggtt ggagccctca ggcccagggc attctcacca 840 ctgttcccgc agctccacct cctgcatcta ccaacaggca gtccggaaga cagccaactc 900 ccatcagccc tcctctgcgg gatagccacc ctcaggcttg attctagagc 950 <210> 12 <211> 675 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of mouse IL-12P35 protein containing HindIII and XbaI restriction endonuclease cleavage sites <400> 12 cccaagcttg ccgccaccat gtgtcagagc aggtatctgc tctttctggc taccctggcc 60 cttctgaatc acctgtccct cgcaagggtg atccccgtgt ctggccctgc ccggtgcctg 120 agccagtcca ggaacctgct taagacaact gacgatatgg tgaagaccgc tagagagaaa 180 ctgaagcact actcttgtac agccgaagac atcgatcatg aggacattac tagagatcag 240 accagcacac tgaaaacttg cctgccactg gaactccaca agaatgagtc ctgtctggca 300 accagggaga catctagcac taccagaggc tcctgcctgc cacctcagaa gacatctctc 360 atgatgactc tgtgtctggg aagcatctat gaagacctca aaatgtacca gaccgagttc 420 caggccatca acgctgccct gcagaatcat aaccaccagc agattatcct ggataagggc 480 atgctggtcg caatcgacga gcttatgcag tccctgaatc acaacggcga aacactgcgg 540 cagaaaccac ccgtgggaga agccgatcct tatagggtga agatgaaact gtgcattctc 600 ctgcatgctt tttctactag agtcgtgacc atcaatcgcg tgatgggcta cctgagctcc 660 gcctgattct agagc 675 <210> 13 <211> 1035 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of mouse IL-12P40 protein containing HindIII and XbaI restriction endonuclease cleavage sites <400> 13 cccaagcttg ccgccaccat gtgtccacag aagctcacaa tctcctggtt tgcaatcgtg 60 ctgctggtga gccccctgat ggccatgtgg gagcttgaga aggacgtgta cgtcgtggaa 120 gtggattgga cccctgacgc tccaggcgag actgtgaacc tgacctgcga tacacccgaa 180 gaggacgata ttacttggac ctctgaccag aggcacggcg ttatcggaag cggcaaaaca 240 ctgactatca ccgtgaagga gttcctggat gccggccagt atacatgtca caaaggaggc 300 gaaactctct cccattctca cctgctcctg cataagaaag agaatggcat ttggagcacc 360 gaaatcctga agaactttaa aaataagaca ttcctgaaat gcgaggcacc taactactcc 420 ggaagattta cttgttcttg gctggtgcag cggaatatgg accttaagtt caacatcaag 480 agctcctcta gctccccaga ttctagggcc gtgacctgcg gcatggctag cctgtccgcc 540 gagaaagtca cactggacca gagagattat gagaagtact ctgtgagctg tcaggaagac 600 gtgacttgcc ccaccgcaga ggaaacactg cctattgagc tcgccctgga ggctcgccag 660 cagaataagt atgaaaacta ctccacttct ttctttatca gggacatcat taaaccagac 720 cctcccaaga atctgcagat gaaaccactg aagaacagcc aggtggaggt ctcctgggaa 780 tatcctgatt cttggagcac cccccactcc tacttttctc tcaagttctt tgtgagaatc 840 cagcggaaga aagagaagat gaaagagaca gaagagggct gtaatcagaa gggagccttc 900 ctggtggaaa agactagcac cgaggttcag tgcaaaggcg gaaacgtgtg tgtgcaggca 960 caggacaggt attacaattc ctcttgcagc aagtgggcct gtgtgccctg cagagtcagg 1020 tcctgattct agagc 1035 <210> 14 <211> 687 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of human IL-12P35 protein containing HindIII and XbaI restriction endonuclease cleavage sites <400> 14 cccaagcttg ccgccaccat gtgtcctgct agatcactgc ttctggttgc cacactcgtg 60 ctgctggacc accttagcct ggcaaggaac ctgccagtgg ctactcccga tcctggcatg 120 ttcccatgcc tccaccattc ccagaatctg ctgagagccg tgagcaacat gcttcagaag 180 gccaggcaga ccctggagtt ctacccatgt acatctgagg aaatcgacca cgaggacatc 240 accaaggaca aaacttccac cgtcgaagca tgcctgcctc tggagctcac aaagaatgag 300 agctgtctga actccagaga aacttccttc attaccaatg gaagctgcct ggcctctcgc 360 aaaacatcct ttatgatggc tctgtgtctt agctctatct atgaggatct gaagatgtac 420 caggtggagt tcaagactat gaacgccaaa ctgctcatgg acccaaagag gcagattttc 480 ctggaccaga atatgctggc agtgattgac gagctgatgc aggccctgaa cttcaactcc 540 gagaccgtgc cccagaaaag ctctcttgaa gagcctgatt tctacaagac taagatcaaa 600 ctgtgcattc tgctccatgc tttcagaatc agggccgtca caatcgaccg ggtgatgtcc 660 tacctgaatg ccagttgatt ctagagc 687 <210> 15 <211> 1014 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding gene sequence of human IL-12P40 protein containing HindIII and XbaI restriction endonuclease cleavage sites <400> 15 cccaagcttg ccgccaccat gtgtcatcag cagcttgtta tctcttggtt tagcctggtg 60 ttcctggcct ctcccctggt ggcaatctgg gagctcaaga aggacgtgta cgtcgtggag 120 ctggattggt atccagacgc tcctggcgaa atggtggttc tgacctgcga tacacccgag 180 gaagacggca ttacttggac cctggatcag agctccgagg tgcttggctc cggaaagaca 240 ctgactatcc aggtgaagga gtttggcgac gccggccagt acacctgtca caaaggaggc 300 gaagtgctga gccactctct gctcctgctt cataagaagg aggatggcat ctggtccaca 360 gacattctga aagatcagaa ggaaccaaag aacaagactt tcctgaggtg cgaggccaag 420 aattatagcg gaagatttac ctgttggtgg ctgacaacta tctctaccga cctcacattc 480 tccgtgaaaa gctctcgcgg ctccagcgat cctcagggcg tcacttgcgg agcagccacc 540 ctgtctgctg agagggtgag aggcgacaac aaggaatacg agtattccgt ggaatgtcag 600 gaggatagcg catgtcccgc cgctgaggaa tctctgccaa tcgaggtgat ggtggacgcc 660 gtgcacaaac tgaagtacga aaattataca tccagcttct tcattcggga catcattaag 720 cctgacccac ctaagaacct gcagctcaag cctcttaaga atagcaggca ggtggaggtg 780 tcctgggagt accccgatac ttggagcaca ccacactctt atttcagcct gaccttctgc 840 gttcaggtgc agggcaagtc taagcgcgag aagaaggacc gcgtgtttac tgataaaaca 900 tctgcaaccg tgatctgcag gaagaacgct tccatcagcg tcagagccca ggaccggtac 960 tattctagct cctggtctga gtgggcctcc gtgccttgca gttgattcta gagc 1014 <210> 16 <211> 5693 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid containing enhancer and coding genes of human IL-12P35 and IL-12P40 proteins <400> 16 gaattctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 60 ctggggactt tccacaccca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660 tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa 720 ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg tttaaactta agcttgccgc 780 caccatgtgt cctgctagat cactgcttct ggttgccaca ctcgtgctgc tggaccacct 840 tagcctggca aggaacctgc cagtggctac tcccgatcct ggcatgttcc catgcctcca 900 ccattcccag aatctgctga gagccgtgag caacatgctt cagaaggcca ggcagaccct 960 ggagttctac ccatgtacat ctgaggaaat cgaccacgag gacatcacca aggacaaaac 1020 ttccaccgtc gaagcatgcc tgcctctgga gctcacaaag aatgagagct gtctgaactc 1080 cagagaaact tccttcatta ccaatggaag ctgcctggcc tctcgcaaaa catcctttat 1140 gatggctctg tgtcttagct ctatctatga ggatctgaag atgtaccagg tggagttcaa 1200 gactatgaac gccaaactgc tcatggaccc aaagaggcag attttcctgg accagaatat 1260 gctggcagtg attgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aactccgaga ccgtgcccca 1320 gaaaagctct cttgaagagc ctgatttcta caagactaag atcaaactgt gcattctgct 1380 ccatgctttc agaatcaggg ccgtcacaat cgaccgggtg atgtcctacc tgaatgccag 1440 ttgattctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc 1500 agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1560 ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1620 ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1680 atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccaga tcaacgttgt 1740 cgacggatcg ggagatctcc cgatccccta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 1800 gccgcatagt taagccagta tctgctccct gcttgtgtgt tggaggtcgc tgagtagtgc 1860 gcgagcaaaa tttaagctac aacaaggcaa ggcttgaccg acaattgcat gaagaatctg 1920 cttagggtta ggcgttttgc gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat 1980 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 2040 atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 2100 ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 2160 cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 2220 tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 2280 tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 2340 atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 2400 gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 2460 caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc 2520 ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc 2580 actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag 2640 cgtttaaact taagcttgcc gccaccatgt gtcatcagca gcttgttatc tcttggttta 2700 gcctggtgtt cctggcctct cccctggtgg caatctggga gctcaagaag gacgtgtacg 2760 tcgtggagct ggattggtat ccagacgctc ctggcgaaat ggtggttctg acctgcgata 2820 cacccgagga agacggcatt acttggaccc tggatcagag ctccgaggtg cttggctccg 2880 gaaagacact gactatccag gtgaaggagt ttggcgacgc cggccagtac acctgtcaca 2940 aaggaggcga agtgctgagc cactctctgc tcctgcttca taagaaggag gatggcatct 3000 ggtccacaga cattctgaaa gatcagaagg aaccaaagaa caagactttc ctgaggtgcg 3060 aggccaagaa ttatagcgga agatttacct gttggtggct gacaactatc tctaccgacc 3120 tcacattctc cgtgaaaagc tctcgcggct ccagcgatcc tcagggcgtc acttgcggag 3180 cagccaccct gtctgctgag agggtgagag gcgacaacaa ggaatacgag tattccgtgg 3240 aatgtcagga ggatagcgca tgtcccgccg ctgaggaatc tctgccaatc gaggtgatgg 3300 tggacgccgt gcacaaactg aagtacgaaa attatacatc cagcttcttc attcgggaca 3360 tcattaagcc tgacccacct aagaacctgc agctcaagcc tcttaagaat agcaggcagg 3420 tggaggtgtc ctgggagtac cccgatactt ggagcacacc acactcttat ttcagcctga 3480 ccttctgcgt tcaggtgcag ggcaagtcta agcgcgagaa gaaggaccgc gtgtttactg 3540 ataaaacatc tgcaaccgtg atctgcagga agaacgcttc catcagcgtc agagcccagg 3600 accggtacta ttctagctcc tggtctgagt gggcctccgt gccttgcagt tgattctaga 3660 gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 3720 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 3780 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 3840 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 3900 gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagaa atttgaacgt tcgcaatatg 3960 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4020 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4080 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4140 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4200 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4260 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4320 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 4380 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 4440 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 4500 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 4560 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 4620 ttttctacgg gttgaacgtt cgcaatcgtc gttttcggcg cgcgccgttg aacgttcgca 4680 attcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc tgattagaaa 4740 aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat 4800 ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg 4860 gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat 4920 ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc 4980 ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta 5040 cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga 5100 gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac 5160 cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct 5220 aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga 5280 gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg 5340 accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct 5400 ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg 5460 cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctcgag 5520 caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt tatgtaagca 5580 gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca tcagagattt 5640 tgagacacaa cgtggctttc ttgaacgttc gcatcgtcgt tttcggcgcg cgc 5693 <210> 17 <211> 5703 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid containing enhancer and coding genes of mouse IL-12P35 and IL-12P40 proteins <400> 17 gaattctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 60 ctggggactt tccacaccca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660 tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa 720 ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg tttaaactta agcttgccgc 780 caccatgtgt cagagcaggt atctgctctt tctggctacc ctggcccttc tgaatcacct 840 gtccctcgca agggtgatcc ccgtgtctgg ccctgcccgg tgcctgagcc agtccaggaa 900 cctgcttaag acaactgacg atatggtgaa gaccgctaga gagaaactga agcactactc 960 ttgtacagcc gaagacatcg atcatgagga cattactaga gatcagacca gcacactgaa 1020 aacttgcctg ccactggaac tccacaagaa tgagtcctgt ctggcaacca gggagacatc 1080 tagcactacc agaggctcct gcctgccacc tcagaagaca tctctcatga tgactctgtg 1140 tctgggaagc atctatgaag acctcaaaat gtaccagacc gagttccagg ccatcaacgc 1200 tgccctgcag aatcataacc accagcagat tatcctggat aagggcatgc tggtcgcaat 1260 cgacgagctt atgcagtccc tgaatcacaa cggcgaaaca ctgcggcaga aaccacccgt 1320 gggagaagcc gatccttata gggtgaagat gaaactgtgc attctcctgc atgctttttc 1380 tactagagtc gtgaccatca atcgcgtgat gggctacctg agctccgcct gattctagag 1440 ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 1500 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 1560 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 1620 gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 1680 cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagatc aacgttgtcg acggatcggg 1740 agatctcccg atcccctatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 1800 agccagtatc tgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg agtagtgcgc gagcaaaatt 1860 taagctacaa caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg 1920 cgttttgcgc tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact 1980 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 2040 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2100 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2160 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2220 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2280 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2340 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2400 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2460 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2520 cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg 2580 cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg tttaaactta 2640 agcttgccgc caccatgtgt ccacagaagc tcacaatctc ctggtttgca atcgtgctgc 2700 tggtgagccc cctgatggcc atgtgggagc ttgagaagga cgtgtacgtc gtggaagtgg 2760 attggacccc tgacgctcca ggcgagactg tgaacctgac ctgcgataca cccgaagagg 2820 acgatattac ttggacctct gaccagaggc acggcgttat cggaagcggc aaaacactga 2880 ctatcaccgt gaaggagttc ctggatgccg gccagtatac atgtcacaaa ggaggcgaaa 2940 ctctctccca ttctcacctg ctcctgcata agaaagagaa tggcatttgg agcaccgaaa 3000 tcctgaagaa ctttaaaaat aagacattcc tgaaatgcga ggcacctaac tactccggaa 3060 gatttacttg ttcttggctg gtgcagcgga atatggacct taagttcaac atcaagagct 3120 cctctagctc cccagattct agggccgtga cctgcggcat ggctagcctg tccgccgaga 3180 aagtcacact ggaccagaga gattatgaga agtactctgt gagctgtcag gaagacgtga 3240 cttgccccac cgcagaggaa acactgccta ttgagctcgc cctggaggct cgccagcaga 3300 ataagtatga aaactactcc acttctttct ttatcaggga catcattaaa ccagaccctc 3360 ccaagaatct gcagatgaaa ccactgaaga acagccaggt ggaggtctcc tgggaatatc 3420 ctgattcttg gagcaccccc cactcctact tttctctcaa gttctttgtg agaatccagc 3480 ggaagaaaga gaagatgaaa gagacagaag agggctgtaa tcagaaggga gccttcctgg 3540 tggaaaagac tagcaccgag gttcagtgca aaggcggaaa cgtgtgtgtg caggcacagg 3600 acaggtatta caattcctct tgcagcaagt gggcctgtgt gccctgcaga gtcaggtcct 3660 gattctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 3720 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 3780 gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 3840 ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 3900 gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagaaa tttgaacgtt 3960 cgcaatatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 4020 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 4080 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 4140 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4200 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 4260 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 4320 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 4380 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 4440 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 4500 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 4560 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 4620 cctttgatct tttctacggg ttgaacgttc gcaatcgtcg ttttcggcgc gcgccgttga 4680 acgttcgcaa ttcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct 4740 gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 4800 ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 4860 cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 4920 cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 4980 actgaatccg gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc 5040 cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat 5100 tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc 5160 gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga 5220 tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca 5280 tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag 5340 tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga 5400 aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg 5460 acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc 5520 ggcctcgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt 5580 atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat 5640 cagagatttt gagacacaac gtggctttct tgaacgttcg catcgtcgtt ttcggcgcgc 5700 gcc 5703

Claims (11)

1. B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드,
   B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드 및 재조합 조제 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염을 치료하기 위한 DNA 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함하고, 상기 B형 간염 표면 항원 단백질을 코드하는 유전자는 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자 또는 B형 간염 표면 항원의 스몰 단백질 S를 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. l으로 표시되는 뉴클레오티드의 배열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 한편 천연 B형 간염 표면 항원 단백질 S2S와 동일한 면역원성을 갖는 B형 간염 표면 항원 S2S 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 외피의 미들 단백질 S2S를 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. l, No. 2, No. 3 또는 No. 4로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 B형 간염 표면 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 SEQ　ID　No. 9로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. 5으로 표시되는 뉴클레오티드 배열과 적어도 70%의 상동성을 가지는 한편 천연 B형 간염 코어 항원 단백질과 동일한 면역원성을 갖는 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 B형 간염 코어 항원 단백질을 코드하는 유전자는 SEQ　ID　No. 5, No. 6, No. 7 또는 No. 8로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 B형 간염 코어 항원을 발현하는 재조합 플라스미드는 SEQ　ID　No. 10으로 표시되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 조제 플라스미드는 티모신, G－CSF, IL－2, IL－4, IL－12및 IFN－γ로부터 되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 또는 임의로 조합시킨 것을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 기재한 DNA 백신 조성물로부터 제조되는 포유류 동물의 B형 간염의 예방 및/또는 치료약.

Images