KR20130108104A

KR20130108104A - 말초혈 ｓｐａｒｃ 결합 항체와 이들의 용도

Info

Publication number: KR20130108104A
Application number: KR1020127034202A
Authority: KR
Inventors: 부옹 트리에우; 크시핑 리우; 베일 데자이
Original assignee: 아브락시스 바이오사이언스, 엘엘씨
Priority date: 2010-06-03
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2013-10-02
Also published as: AU2011261270A1; US20120052007A1; EP2598164A4; WO2011153431A2; EP2598164A2; MX2012013875A; CA2801184A1; CN103221062A; WO2011153431A3; JP2013530165A

Abstract

이 발명은 SPARC, 특히 혈장 SPARC에 대하여 높은 친화성을 갖는 SPARC 결합 항체와 암을 포함한 증상을 치료하는데 이와 같은 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

말초혈 ＳＰＡＲＣ 결합 항체와 이들의 용도{PERIPHERAL BLOOD SPARC ANTIBODIES AND USES THEREOF}

이 특허출원은 2010년 06월 03일에 제출된 미국 가특허출원번호 61/351,246의 35 U.S.C. § 1 19(e)하의 우선권 이점을 청구한 것이다.

오스테오넥틴으로도 알려져있는 시스테인의 풍부한, 산성 분비 단백질(SPARC)은 281 아미노산 당단백질이다. SPARC는 양이온(예를들어, Ca² ⁺, Cu² ⁺, Fe²⁺), 성장 인자[예를들어, 성장 인자에서 유도된 혈소판(PDGF)과, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)], 세포외 기질(ECM) 단백질(예를들어, 콜라겐 I-V와 콜라겐 Ⅸ, 비트로넥틴과 트롬보스폰딘-1), 내피세포, 혈소판, 알부민과 수산화 인회석을 포함하는 광범위한 리간드의 친화성을 갖는다. SPARC 발현은 발전적으로 조절되고, 정상 발육하는 동안 또는 상처에 대한 반응에 있어 개조를 받는 조직에서 우세하게 발현된다.(참조, 예를들어. Lane 등., FASEB J., 8, 163-173(1994)). 높은 수준의 SPARC 단백질은 뼈와 치아 발육에 발현된다.

SPARC는 몇몇 공격성 암에서는 조절되지 않지만, 아주 대부분의 정상 조직에는 존재하지 않는다(Porter, 등. J. Histochem. Cytochem., 43, 791(1995), 하기 참조). SPARC는 여러가지 종양(예를들어, 방광, 간, 난소, 신장, 장, 유방) 사이에서 유발된다. 방광암에서, 예를들어. SPARC 발현은 진전된 암종과 연관된다. 단계 T2 또는 그 이상의 침입성 방광 종양이 나타나서 단계 T1의 방광 종양보다 더 높은 수준의 SPARC(또는 그 이하의 외면의 종양)가 발현하고, 더 불량한 예후를 갖는다(참조, 예를들어, Yamanaka 등., J. Urology, 166, 2495-2499 (2001)). 수막종에서, SPARC 발현은 침입성 종양만이 관련된다(참조, 예를들어, Rempel 등., Clincal Cancer Res., 5, 237-241 (1999)). 또한 SPARC 발현은 74.5%의 침입성 유방 암종 병변의 원위치(참조, 예를들어, Bellahcene 등., Am. J. Pathol, 146, 95-100 (1995))와, 54.2%의 유방 유관 상피내 암종의 침윤(참조, 예를들어, KIM 등., J Korean Med. ScL, 13, 652-657 (1998))에서 검출된다. 또한. SPARC 발현은 유방암에서 흔한 미세석회화와 관련되고(참조, 예를들어, 상기한 Bellahcene 등.,), SPARC 발현은 뼈에 대한 유방전이 친화성에 있는 것으로 예상된다. 또한, SPARC는 알부민과 결합하는 것으로 알려져 있다(참조, 예를들어 Schnitzer, J Biol. Chem., 269, 6072 (1994)).

따라서, 질병에서 SPARC의 역할, 특히 몇몇 암에서 SPARC의 역할의 이점을 갖는 조성물과 방법이 필요하다.

하나의 특징으로 이 발명은 SPARC 결합 항체가 Imml2, Imml4, hHTI, 또는 이들의 조합으로 이루어지는, SPARC 결합 항체를 함유하는 조성물을 제공한다.

다른 특징으로는, 이 발명은 SPARC 결합 항체가 Imml2, Imml4, hHTI, 또는 이들의 조합인 SPARC 결합 항체를 함유하는 진단적 또는 치료적 유효량의 조성물을 투여하여서하는 암과 같은 동물의 질병을 진단 또는 치료하는 방법을 제공한다.

더우기, 이 발명은 동물에서 생물학적 시료를 단리하고, 생물적학적 시료에서 SPARC 단백질의 발현을 검출하고, 생물학적 시료에 SPARC 단백질이 치료적 유효량의 항암제와 치료적 유효량의 항-SPARC 항체를 투여하여 한계 수준 이상으로 존재할 때, 또는 SPARC 단백질이 SPARC 결합 항체 없이 치료적 유효량의 항암제를 투여하여 한계 수준 이하로 존재할 때, 생물학적 시료에서 SPARC 단백질의 양을 정량하여서 하는, 하나 이상의 항암제와 SPARC 결합 항체로 동물의 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 이 발명에 의하여 사용하는 SPARC 발현 양을 정량하는데 적당한 생물학적 시료에는 예를들어, 혈액, 혈청과 혈장이 있다. 이 발명에 따라 종양을 치료하는데 적당한 SPARC 결합 항체에는 Imml2, Imml4, hHTI 등을 주제로한 인체 SPARC 결합 항체가 있다. SPARC 결합 항체를 사용하는 생물학적 시료의 SPARC 한계 수준은 최소한 약 4.3ng/ml, 최소한 43ng/ml, 또는 바람직하기로는 최소한 약 430ng/ml 일 수 있다.

이 발명의 모든 방법과 조성물에서, SPARC 결합 항체는 치료적 또는 진단적 활성제에 접합 될 수 있다. 이 발명에 의하여 제공되는 조성물의 투여와 이 발명의 방법을 사용하는데 적합한 동물은 제한적인 것은 아니나, 사람 환자가 있다.

도 1은 Imm1 내지 Imm12의 Fab 영역의 클론화와 발현에 사용되는 pASK84의 제한지도이다.
도 2는 두 사람의 SPARC 결합 Fab 클론 Fab6과 Fab16(SEQ ID NOs 15-16)의 아미노산 서열을 제공한다.
도 3은 Fab16의 클론화와 발현에 사용되는 pBAD 벡터의 제한지도이다.
도 4는 pBad에서 Fab16(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 제공한다.
도 5는 Fab6(SEQ ID NO: 15)와 Fab16(SEQ ID NO: 16)에서 완전-사람 항체 Imm13과 Imm14의 클론화와 발현에 사용되는 pcDNA3002NEO의 제한지도이다.
도 6은 Imm1(SEQ ID NOs 1과 8), Imm2(SEQ ID NOs 2와 9), Imm3(SEQ ID NOs 3과 10), Imm4(SEQ ID NOs 4와 11), Imm6(SEQ ID NO 5와 12), ImmlO(SEQ ID NOs 6과 13)과 Imm12(SEQ ID NOs 7과 14)에 대한 골격 영역(FWRs)과 상보성 측정 영역(CDRs)의 아미노산 서열을 제공한다.
도 7은 대조 mAb는 물론 인체 SPARC에 대한 Imm1 내지 Imm6과 Imm8 내지 Imm12 상청액의 1:1, 1:10과 1:100 희석의 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 8은 양성 및 음성 대조체는 물론 인체 SPARC에 대한 정제된 Imm1 내지 Imm12 항체의 0.04μg/mL, 0.2μg/mL, 1μg/mL과 5μg/mL 농도의 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 9는 HTI-SPARC(혈소판 SPARC)에 Imm1, Imm3, Imm4, Imm7, Imm9와, Imm10 항체의 결합과 Bio1-SPARC에 Imm10, Imm11과, Imm12와 대조 항체의 결합을 비교한 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 10은 여러가지 농도로 HTI-SPARC(혈소판 SPARC)와 Bio1-SPARC에 결합하는 Fab16의 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 11은 인체 HTI SPARC에 결합하는 Fab16 표면 플라스몬 공명을 사용하여 제조한 센서그램이다.
도 12는 인체 BIO1 SPARC에 결합한 Fab16의 표면 플라스몬 공명을 사용하여 제조한 센서그램이다.
도 13은 여러가지 농도로 인체 SPARC에 대하여 결합한 Imm11, Imm12, Imm13과 Imm14의 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 14는 변성 인체 SPARC에 대한 Imm 시리즈 항체의 웨스턴 블로트이다.
도 15는 LL/2 루이스 폐 암종을 갖는 동물의 생존에 관하여, 대조 mlgG는 물론 SPARC 결합 항체 mHTI(Imm17로 표시), Imm12와, Imm14의 효과를 표시한 도표이다.
도 16은 사람과 마우스 SPARC에 대한 Imm12, Imm14와 mHTI(Imm17로 표시) 결합의 정량적 ELISA 결과를 제공한다.
도 17A는 고 SPARC와 저 SPARC에 대하여, 선화학요법(PC)을 받은 Cohort 1, 환자의 전체 생존을 표시한 도표이다.
도 17B는 고 SPARC와 저 SPARC에 대하여, 선화학요법을 받지 않은 Cohort 2, 환자의 전체 생존을 표시한 도표이다.
도 18은 처리 전후에 정상 대조체와 비교한 Cohort 1(선화학요법)과 Cohort 2(무 선화학요법)의 SPARC 수준의 점 도표이다.
도 19는 처리 후 혈장 SPARC의 퍼센트 변화를 나타낸 막대 도표이다.
도 20A은 고위험 균주군(균주군 1)과 저위험 균주군(균주군 2)에서 환자의 진행 무생존(PFS)을 나타낸 도표이다.
도 20B는 고위험 균주군(균주군 1)과 저위험 균주군(균주군 B)에서 환자의 전체 생존(OS)을 나타낸 도표이다.
도 21은 고위험(HR)과 저위험(LR)균주군에 대한, Cohort 1(선화학요법)과 Cohort 2(무 선화학요법)의 SPARC 수준을 나타낸 점 도표이다.
도 22A는 고위험(HR)균주군의 모든 환자와 비교한, 위험 수준 2중 0, 1의 환자에 대한 진행 무 생존(PFS)을 표시한 도표이다.
도 22B는 고위험(HR)균주군의 모든 환자와 비교한 위험 수준 2중 0, 1의 환자에 대한 전체 생존(OS)을 표시한 도표이다.
도 23A는 25mg/kg의 5-플루오로우라실과 0.1mg, 0.15mg 또는 0.20mg의 SPARC로 처리한 후, 염수 또는 5-FU 단독과 비교한 종양 체적을 표시한 도표이다.
도 23B는 도세탁셀(10mg/kg)과 0.2mg의 SPARC로 처리한 후, 염수, 도세탁셀 단독, 또는 SPARC 단독과 비교한 종양 체적을 표시한 도표이다.
도 24A는 순티니브(SUT)(30mg/kg), SPARC(BIO1)(0.2mg)과 nab-파클리탁셀(ABX)(15mg/kg)로 처리한 후 음성 대조체, SPARC 단독, nab-파클리탁셀 단독, nab-파클리탁셀과 순티니브와, nab-파클리탁셀과 SPARC와 비교한 HT29 종양 체적을 표시한 도표이다.
도 24B는 베바시주마브(AVS)(0.2mg), SPARC(BIO1)(0.2mg)과, nab-파클리탁셀(ABX)(15mg/kg)로 처리한 후 음성 대조체, SPARC 단독, nab-파클리탁셀 단독, nab-파클리탁셀과 베바시주마브, nab-파클리탁셀과 SPARC와 비교한 HT29 종양 체적을 표시한 도표이다.
도 24C는 순티니브(SUT)(30mg/kg), SPARC(BIO1)(0.2mg)과, nab-파클리탁셀(ABX)(10mg/kg)로 처리한 후 nab-파클리탁셀 단독과, nab-파클리탁셀과 순티니브와 비교한 MDA-MB-231 종양 체적을 나타낸 도포이다.
도 24D는 베바시주마브(AVS)(0.2mg), SPARC(BIO1)(0.2mg)과, nab-파클리탁셀(ABX)(10mg/kg)로 처리한 후 염수, SPARC 단독, nab-파클리탁셀 단독, nab-파클리탁셀과 베바시주마브와, nab-파클리탁셀과 SPARC와 비교한 PC3 종양 체적을 나타낸 도표이다.
도 25는 0μg/mL, 10μg/mL과, 100μg/mL의 재조합 야생형 인체 SPARC(BIO1)을 투여하여 음성 대조체 DPBS와 비교한 구슬당 종자 발아를 나타낸 막대 그래프이다.
도 26A는 0μg/mL, 10μg/mL과, 100μg/mL의 재조합 야생형 인체 SPARC (BIO1)에서의 세관 제제를 나타낸다.
도 26B는 양성 대조 VEGF와 미처리 세관과 비교한 0μg/mL, 10μg/mL과, 100μg/mL 농도의 재조합 야생형 인체 SPARC(BIO1)를 관길이로 표시한 점 도표이다.
도 27은 염수, SPARC 단독과, nab-파클리탁셀 단독과 비교하여, SPARC(4m/kg)과 nab-파클리탁셀(10mg/kg)으로 처리한 MDA-MB-435-LUC+전이 모델의 단백질 수준에 의하여 폐 전이를 표시한 점 도표이다.
도 28은 SPARC(10mg/kg)과 Imm12, SPARC와 Imm14, SPARC와 mHTI(Imm17과 동일), mlgG(음성 대조체), 무 항체(음성 대조체)를 포함하는 LL2 전이 조직 시료에서 SPARC 또는 항체가 없는 세관 제제의 사진을 제공한다.
도 29는 Imm-2와 Imm-3와 비교하여 mHTIC("HTI"로 표시), Imm-12와 Imm-14를 포함하는 여러가지 항체의 종양 위치에 대한 정량적 형광 결과를 제공한다.

이 발명은 맥관 형성과 전이를 억제하는 능력은 물론, 두 사람과 마우스 SPARC에 특이성을 결합하기 위하여 분석되는 소정의 SPARC 결합 항체에 관한 것이다. 놀랍게도, 분석에서 세가지 항체가 선별 ELISA에서 자생 및 변성 사람 SPARC에 결합되드라도, 단 하나만의 항체는 마우스 SPARC에 결합된다. 또한 이들 세 항체 Imm12, Imm14와 mHTI가 놀랍게도 항 맥관 형성성(즉, 항-종양)과 항-전이성을 갖는 것을 알았다.

[정의]

여기서 상호교환하여 사용되는 "펩티드"와 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의하여 연결되는 아미노산 잔기의 쇄로 이루어지는 화합물을 뜻한다. 폴리펩티드의 "활성부분"은 전장 폴리펩티드보다 작은 펩티드를 뜻하지만, 이는 측정 가능한 생물학적 활성을 보유하고 생물학적 검출을 보유한다.

여기에 사용된 "종양"이란 용어는 양성 또는 악성(암종)여부, 일차 부위 병소 또는 전이 여부에 따른 소정의 신생물성 성장, 증식 또는 세포 집단을 뜻한다.

여기에 사용된 "암"이란 용어는 정상 성장 억제에 대한 감수성을 상실하나 세포의 증식에 의하여 일어나거나 특징을 갖는 증식성 질병을 뜻한다. 동일한 조직형의 암은 통상 동일한 조직에서 나오고, 이들의 생물학적 특성을 기초로한 다른 아형으로 분할된다. 암의 네가지 일반 카테고리에는 암종(상피 조직 유도), 육종(결합조직 또는 중배엽 유도), 백혈병(혈액-형성 조직 유도)와 림프종(림프조직 유도)이 있다. 200가지 이상의 다른 형의 암이 알려져 있고, 몸체의 모든 기관과 조직에 영향을 미친다. 암의 정의가 한정되어 있지 않은 특수한 암의 예를들면, 흑색종, 백혈병, 성상세포종, 교모세포종, 망막모세포종, 림프종, 교세포종, 호지킨 림프종과 만성 림프구 백혈병이 있다. 여러가지 암에 의하여 영향을 받는 기관과 조직의 예를들면, 췌장, 유방, 갑상선, 난소, 자궁, 고환, 전립성, 뇌하수체, 부신, 신장, 위, 식도, 직장, 소장, 결장, 간, 담낭, 머리와 목, 혀, 입, 눈과 안와, 뼈, 관절, 뇌, 신경계, 피부, 혈액, 상인두 조직, 폐, 후두, 뇨관, 경부, 질, 외분비선과 내분비선이 있다. 또한 암은 다중심 또는 미지의 일차부위(CUPS)에 있을 수 있다.

여기에 사용된 "적당한 SPARC 결합 항체" 또는 "SPARC 결합 항체"는 특이성을 가지고 SPARC에 결합할 수 있는 항체를 뜻한다.

여기에 사용된 "종양 표적 항체"는 질병이 종양, 암, 신생물 등인 질병 표적 항체를 뜻한다.

여기서 사용된 "SPARC 결합 항체"란 1, 또는 10, 또는 100, 또는 1000nM-바람직하기로는 10nM이거나 그 이하 범위의 kd를 갖는 순환 SPARC에 대하여 친화성을 갖는 항체를 뜻한다.

여기서 사용된 "치료적 유효량"이란 포유류의 질병 또는 증상의 하나 이상의 증후군을 경감시키는(어느 정도까지, 전문 개업 약사에 의하여 판단)일정량의 조성물을 뜻한다. 더불어, 조성물의 "치료적 유효량"이란 질병 또는 증상의 원인과 연관되는 정상의 부분적 또는 전체적인 생리학적 또는 생화학적 파라미터로 회귀하는 양을 뜻한다. 이 분야의 전문 임상의는 정맥내, 피하, 복강내, 경구 또는 흡입을 통하여 투여할 때, 특정 질병 증상, 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위하여 조성물의 치료적 유효량을 측정할 수 있다. 치료 효과에 요구되는 조성물의 정확한 양은 예를들어 여러 환자의 특이적 고료와 더불어, 활성제의 특이적 활성, 사용되는 전달기구, 제제의 물리적 특성, 투여 목적과 같은 여러가지 요인에 따른다. 그러나, 치료적 유효량은 여기에 열거된 설명의 평가에 따라 통상의 전문 임상의에 의하여 결정된다.

여기에 사용된 "처리", "치료", "치료법"과 "치료적 처리"란 용어는 치료법, 예방법 또는 예방요법을 뜻한다. "치료요법의 예를들면 표적 질병(예를들어, 암 또는 기타증식성 질병) 또는 이에 관련되는 증상의 가능성을 예방 또는 감소시키는 것이 있다. 치료가 필요한 것으로는 예방되는 질병 또는 증상을 가지기 쉬운 것은 물론 이미 질병 또는 증상을 갖는 것이 있다. 또한 여기에 사용된 "처리", "치료", "치료법"과 "치료적 처리"란 용어는 질병 또는 관련된 증상과 싸우기 위한 포유류의 관리와 보호를 기술한 것이고, 증후, 부작용 또는 기타 질병의 합병증, 증상을 완화시키는 조성물의 투여를 포함한다. 암의 치료적 처리는 한정되어 있는 것은 아니나, 수술, 화학요법, 방사선요법, 유전자요법과 면역요법이 있다.

여기에 사용된 "제제" 또는 "약제" 또는 "치료제"란 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 치료성을 갖는 것으로 기대되는 박테리아, 식물, 균 또는 동물(특히 포유류)세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로 만든 추출물을 뜻한다. 제제 또는 약제는 정제, 실질적으로 정제 또는 부분적으로 정제될 수 있다. 또한 이 발명에 따른 "제제"에는 방사선 치료제 또는 "화학요법제"가 있다.

여기에 사용된 "진단체"란 용어는 ELISA와 같은 방법에 의하여 혈장/순환 SPARC의 정량을 허용하는 제제를 뜻한다.

여기에 사용된 "화학요법제"란 용어는 암, 신생물성 과/또는 증식성 질병에 대하여 활성을 갖는 제제를 뜻한다.

여기에 사용된 "방사선 치료요법" 또는 "방사선 치료"란 용어는 암세포를 괴사시키기 위한 방사선 투여를 뜻한다. 방사선은 세포내의 여러가지 분자와 상호작용하지만, 세포괴사를 가져오는 일차 표적은 데옥시리보핵산(DNA)이다. 그러나, 방사선 치료는 세포 및 핵막과 기타 세포 소기관에 손상을 가져온다. 통상 DNA 손상에는 당분-인산 주쇄에서 단쇄 및 이중쇄 파괴를 포함한다. 더우기, 세포기능을 와해 시킬 수 있는 DNA와 단백질의 가교일 수 있다. 방사선 형에 따라, DNA 손상의 메카니즘은 상대의 생물학적 효과에 따라 변할 수 있다. 예를들면, 중 입자(즉, 양자, 중성자)는 직접 DNA에 손상을 주고 더 큰 상대의 생물학적 효과를 가져온다. 반면에, 전자기 방사선은 세포 수분의 이온화에 의하여 일차적으로 생성되는 단수명 히드록시 유리기를 통하여 간접 이온화 작용을 가져온다. 방사선의 임상적 적용은 외부 비임 방사선(외부 공급원으로부터)과 근접치료(환자에게 이식되거나 삽입되는 방사선 공급원을 사용하여)로 구성된다. 외부 비임 방사선은 X-선 과/또는 감마선으로 구성되고, 근접 치료에서는 감마선에 따라 알파 입자, 또는 베타입자를 붕괴하고 방출하는 방사성 핵을 사용한다.

여기서 사용되는 "선택적 치료요법" 또는 "선택적 치료(상술한 첫째 라인의 화학요법은 아니다)"란 용어는 예를들어, 수용체 트로신 키나아제 억제제(예를들어 Iressa™(게피티니브)), Tarceva™(에르로티니브), Erbitux™(세툭시마브), 이마티니브 메실레이트(Gleevec™), 프로테오솜 억제제(예를들어. 보르테조미브, Velcade™); PTK787 (ZK222584)와 같은 VEGFR2억제제, 아우로라 키나아제 억제제(예를들어 ZM447439); 포유류 표적의 라파마이신(mTOR)억제제, 시클로옥시게나아제-2(COX-2)억제제, 라파마이신 억제제(예를들어 시로리무스, Rapamune™); 파르네실트란스페라아제 억제제(예를들어, 티피파르니브, Zarnestra™); 기질 금속단백질 분해효소 억제제(예를들어, BAY 12-9566; 황산화 다당류 테코갈란); 혈관형성 억제제(예를들어, Avastin™(베바시주마브)); TNP-4와 같은 푸마길린의 유도체; 카르복시아미노트리아졸; BB-94와 BB-2516; 탈리도미드; 인터류킨-12; 리노미드; 펩티드 단편; 혈관 성장인자와 혈관 성장인자 수용체에 대한 항체; 혈소판 유도 성장인자 수용체 억제제, 단백질 키나아제 C억제제, 미토겐-활성화 키나아제 억제제, 미토겐-활성화 단백질 키나아제 키나아제 억제제, 라우스 육종 바이러스 형질전환 암유전자(SRC)억제제, 히스톤데아세틸라아제 억제제, 소 저산소증-유도성인자 억제제, 헤지호그 억제제와 TGF-β 신호 억제제를 포함한다. 더우기, 면역요법제에서는 선택적 치료요법을 고려하여야한다. 예를들면, 전성 항체를 함유하는 혈청 또는 감마 글로불린; 비특이성 면역자극 보조제; 활성 특이적 면역요법과 양자 면역 요법이 있다.

더불어, 선택적 치료에는 안티센스분자, 폴리펩티드, 항생물질, 유전자요법 벡터 등을 포함한 폴리뉴클레오티드와 같은 기타 생물학적-기초 화학적 구성을 포함한다. 이와 같은 선택적 치료는 단독으로 또는 조합하여, 또는 여기에 기술된 다른 치료요법과 조합하여 투여할 수 있다. 화학요법제의 사용 방법과 투약 및 투여 요법을 포함한 조합 치료에서의 선택적 치료요법에 사용되는 기타 약제는 이 분야의 전문가에게 알려져 있다.

여기에 사용된 "종양위치"란 용어는 종양을 갖는 동물의 주사에 있어, SPARC 결합 항체가 SPARC-발현 종양에 응집하는 정도를 뜻한다. 종양 위치는 제한되어 있는 것은 아니나, 형광 염료로 항체를 표지, 종양을 갖는 동물에 현재 형광항체를 주사와 종양 형광 대 소정의 육안적 종량이 없는 피부의 형광 비율의 측정을 포함한 적당한 방법으로 측정할 수 있으며, 여기서 위치는 상기 비율이 >20, 바람직하기로 >10, 더 바람직하기로는 >5일때 존재한다.

[항체]

이 발명은 SPARC 결합 항체를 제공한다. SPARC 결합 항체에는 Imm12, Imm14, mHTI, hHTI(mHTI의 인체버전), 또는 이들의 조합이 있다.

더불어, 이 발명은 혈액에서 발견된 SPARC, 예를들어 HTI(혈소판) SPARC와 종양 부위에서 발견된 SPARC, 예를들어 Bio1-SPARC를 결합시킬 수 있는 SPARC 결합 항체를 제공한다. 항체 결합 강도를 측정하는 여러가지 방법은 이 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

인체용에 있어, 면역원성과 면역 반응을 피하기 위하여, Fab', Fab, 또는 Fab2와 같은 인체 SPARC 결합 항체 또는 적당한 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 인체 항체 또는 이들의 단편은 예를들어, 다음과 같은 설정된 방법: 1) 인체 항체는 가변성 CDR 영역을 항체 영역으로 대체하는 사람 IgG 골격을 사용하여 구성할 수 있고, 여기서 중쇄 및 경쇄는 분리된 프로모터 하에서 독립적으로 발현되거나 또는 IRES 서열과 하나의 프로모터 하에서 공동 발현되며; 2) 인체 단클론성 항체는 인체 면역계를 갖도록 계획된 마우스를 사용하여 SPARC에 대하여 상승시킬 수 있고; 3) SPARC에 대한 인체 항체는 파아지미드(M13,람다 콜리파아지, 또는 표면 표시할 수 있는 소정의 파아지)를 사용하여 상승시킬 수 있다. 전장 항체를 구성하기 위하여, 두 중쇄 및 경쇄의 CDR에 가변성 영역을 전이시킬 수 있다. CHO, 293, 또는 인체 골수세포와 같은 포유류 세포에서 중쇄 및 경쇄의 공동발현은 전장 항체를 제공할 수 있다. 비슷하게, Fab', Fab 또는 Fab2 단편과 단일쇄 항체는 잘 설정된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

이 발명은 혈장 SPARC에 유일한 에피토프를 특별히 인식하는 인체항체를 제공한다. 인체항체는 대표적으로 CDRs에서 나온 잔재를 원하는 특이성, 친화성과 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-사람 종의 CDRs에서 나온 잔재로 대치하는 사람 항체이다. 몇가지 예를들면, 사람 항체의 Fv골격은 대응하는 비-사람 잔재로 대치된다. 소정의 적당한 단클론성 항체는 CDRs의 공급원으로서, 예를들어, 두 사람과 마우스 SPARC에 결합하고, 특히 순환 사람 SPARC에 결합하고, 생체외 검정에서 양호한 항 맥관형성 활성을 나타내고, 동물 모델에서 유망한 결과를 갖는(예를들어, 이종이식 모델계에서 전이 감소) 항 SPARC항체로서 사용될 수 있다.

단클론성 항체를 교화하는 네가지 일반 단계가 있다. 이들은: (1) 뉴클레오티드와 경 및 중가변성 영역에서 출발 항체의 예측된 아미노산 서열의 측정; (2) 인체 항체의 설계, 즉. 교화과정에서 사용하는 항체 골격 영역의 결정; (3) 실제 교화 방법/기술과 (4) 인체 항체의 이입과 발현이 있다. 참조, 예를들면 미국특허번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331 ,415; 5,530,101 ; 5,693,761 ; 5,693,762; 5,585,089; 6,180,370과; 6,548,640(이들은 여기에 참고적으로 혼입되어 있다.) 예를들면, 절대 영역은 항체를 임상 실험과 사람의 치료에 사용할 때 면역 반응을 피하기 위하여 더 유사한 사람 절대 영역으로 구성될 수 있다. 참조, 예를들면, 미국특허번호 5,997,867과 5,866,692(이들은 여기에 참고적으로 혼입되어 있다.)

항체가 항원에 대한 높은 친화성과 기타 기호성 생물학적 성질의 보유로 교회되는 것이 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 사람 항체는 양친형 및 사람 서열의 삼차원 모델을 사용하여 양친형 서열과 여러가지 개념적 인체 생성물의 분석 과정에 의하여 제조될 수 있다. 삼차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용할 수 있고 이 분양의 기술자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 예상 삼차원 형태 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 표시 검색으로 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔재의 가능한 역할의 분석, 즉. 이의 향원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔재의 분석이 가능하게 한다: 이러한 방법으로, 골격 잔재를 공통 및 중요 서열에서 선택하고 조합하여 표적 항원에 대한 증가된 친화성가 같은 원하는 항체 특성을 성취할 수 있다. 일반적, CDR 잔재는 영향을 미치는 항원 결합에 직접적으로 가장 실질적으로 포함된다. 또한, 인체 항체는 항체의 하나 이상의 특성을 개량하기 위하여 경첩 영역에서 수정을 가질 수 있다.

또한, 항체는 파아지 표시법에 의하여 선별될 수 있고 재조합될 수 있다. 참조, 예를들어, 미국특허번호. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743과 6,265,150(이들은 여기에 참고적으로 혼입되어 있다.) 또한, 파아지 표시법(McCafferty 등, Nature 348:552-553 (1990))을 사용하여 비면역공여체에서 나은 면역글로불린 가변성(V) 영역 유전자 레퍼토리로부터 사람 항체와 항체 단편을 생성시킬 수 있다.

자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 고율로 돌연변이를 축전한다(체세포 고도 돌연변이). 도입된 몇몇 변화는 더 높은 친화성을 제공하고, 높은-친화성 표면 면역글로불린을 나타내는 B세포는 연속 항원 공격에서 바람직하게 복제되고 차별화 된다. 이러한 자연 과정은 "체인 셔플링(chain shuffling)"으로 알려져 있는 방법을 사용하여 모방할 수 있다(Marks, 등 Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). 이 방법에서 파아지 표시에 의하여 얻은 "일차" 사람 항체의 친화성은 중쇄 및 경쇄 V영역 유전자를 비면역 공여체에서 얻은 V영역 유전자의 자연 발생 변이체(레퍼토리)의 레퍼토리로 연속적으로 대체하여 개량시킬 수 있다. 이 방법은 pM-nM 범위의 친화성을 갖는 항체와 항체 단체를 생성시킨다.

또한 유전자 셔플링을 사용하여 쥐 항체로부터 사람 항체를 유도할 수 있고, 여기서 사람 항체는 출발 쥐 항체와 유사한 친화성과 특이성을 갖는다. "에피토프 날인"으로 언급된 이 방법에 따라서, 파아지 표시법에 의하여 얻은 쥐 항체의 중쇄 또는 경쇄 V영역 유전자를 사람 V영역 유전자의 레퍼토리로 대체하고, 쥐-사람 키메라를 창출시킨다. 항원에 관한 선택은 기능성 항원-결합 부위를 복구할 수 있는 사람의 가변성 영역을 가져오며, 즉. 에피토프가 파트너의 선택을 좌우한다(날인한다). 잔유 쥐 V영역을 대체하기 위하여 과정을 반복하면, 사람 항체를 얻는다(참조. PCT 공보번호 WO 93/06213. 1993,4,1일 공고), CDR 이식에 의한 쥐 항체의 종래 교화와는 달리, 이 방법은 쥐 기원의 골격 또는 CDR 잔재를 갖지 않는 완전한 사람 항체를 제공한다. 상기 토론이 사람 항체에 관계되드라도, 토의된 일반 원리는 예를들어, 개, 고양이, 영장류, 말과 소에 사용하는 항체를 만드는데 응용할 수 있다.

이 발명의 SPARC 결합 항체는 SPARC에 대한 결합 부위를 보유하는 항체 단편(예를들어, Fab', Fab와 Fab2)은 물론 전체 항체를 포함한다. 항체는 소정의 항체 종류, 예를들어 IgM, IgA, IgG, IgE, IgD와 IgY가 있다. 항체는 예를들어 SPARC에 대한 하나의 원자와 활성제에 대한 다른 원자가(tTF 또는 리신 A, 또는 여기에 기술된 다른 활성제)를 갖는 이가, 일가, 또는 키메라 항체일 수 있다. 사람 항체는 IgG에 한정되는 것은 아니다. 동일한 방법을 사용하여 IgE, IgA, IgD, IgM과 같은 다른 종류의 모든 항체를 생성시킬 수 있고, 각각은 특정 질병 표적에 적합한 다른 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)와 완전한 의존성 세포독성(CDC)활성을 갖는다. 항체의 단편은 제한된 단백질 분해에 의하여 발생 될 수 있다. 이들 단편은 Fab'와 같은 일가 또는 Fab2와 같은 2가일 수 있다. 또한, 단편은 이. 콜리에서 단일 쇄 scfv 또는 이체로 합성될 수 있다.

[조성물]

이 발명은 상술한 바와 같은 SPARC 결합 항체를 함유하는 조성물을 제공한다. 몇몇 구성에 있어, 조성물은 적당한 담체와 함께 Imm12, Imm14, mHTI, 또는 hHTI로 이루어진다. 다른 구성으로는, 조성물은 적당한 담체와 함께 Imm12, Imm14, mHTI, 또는 hHTI의 조합물로 이루어진다. 바람직한 구성으로, 조성물은 SPARC 결합 항체와 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하는 약학적으로 허용할 수 있는 조성물이다.

이 발명의 조성물은 활성제를 더 함유할 수 있다. 몇몇 구성에 있어, 활성제는 직접 그의 약리학적 효과를 나타낼 수 있는 약학적 활성 치료제를 뜻한다. 다른 구성에 있어, 활성제는 진단제이다. 바람직한 구성으로는 활성제가 SPARC 결합 항체와 함께 투여되는 또는 접합되는 진단적 또는 치료적 활성제인 것이다. 몇몇 활성제는 치료제와 진단제로서 둘다 유용하므로 이와 같은 용어는 서로 양립할 수 있다.

이 발명의 조성물을 사용하여 활성제 단독 배출에 비하여 질병 부위에 활성제의 배출을 강화시킬 수 있고, 또는 SPARC의 혈액 수준 감소를 가져오는 SPARC 클리어란스를 강화시킬 수 있다. 바람직한 구성으로는, SPARC의 혈액수준 감소가 최소한 약 10%일 때이다. 더 바람직한 구성으로는, SPARC의 혈액수준 감소가 최소한 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%일 때이고, 가장 바람직하기로는 최소한 50%일 때이다.

활성제는 화학요법제 또는 항암제와 같은 소정의 적당한 치료제 또는 진단제일 수 있다. 적당한 진단제에는 플루오로크롬, 방사성제, MRI 조영제, X-선 조영제, 초음파 조영제와 PET 조영제가 있다.

이 발명에 사용하는데 적당한 화학요법제 또는 기타 항암제에는 한정되는 것은 아니나, 티로신 키나아제 억제제(게니스테인), 생물학적 활성제(TNF, 또는 tTF), 방사성 핵종(1311, 9OY, 11 Hn, 21 1At, 32P와 기타 공지된 치료적 방사성 핵종),아드리아마이신, 안사마이신, 항생물질, 아스파라기나아제, 블레오마이신, 부술판, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카페시타빈, 클로람부실, 시타라빈, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 에포틸론, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노데칸, 로무스틴, 메클로레타민, 머캅토푸린, 메플하란, 메토트렉세이트, 라파마이신(시로리무스)와 유도체, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 니트로수레아, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카르바진, 리툭시마브, 스트렙토조신, 테니포시드, 티오구아닌, 티오테파, 탁산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 탁솔, 콤브레타스타틴, 디스코더몰리드와 트란스플라티늄이 있다.

이 발명에서 사용하는데 적합한 다른 화학요법제로는 한정되는 것은 아니나, 항대사제(예를들어, 아스파라키나아제), 항유사분열제(예를들어, 빈카 알카롤이드, DNA 손상제(예를들어, 시스플라틴), 전괴사제(계획된-세포-괴사 또는 자멸사를 유도하는 제제)(예를들어, 에피포도필로톡신), 분화 유도제(예를들어, 레티노이드), 항생물질(예, 블레오마이신)과 호르몬(예, 타목시펜, 디에틸스틸베스트롤)이 있다. 또한 이 발명에 사용하는데 적합한 화학요법제에는 예를들어, INF-알파, 푸마길린, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 탈리도미드 등과 같은 항 혈관 형성제(혈관형성 억제제)가 있다.

여러가지 기타 항-혈관 형성제는 Carmeliet와 Jain (2000)에 의하여 기록된 것을 포함하여, 이 분야에서 확인되고 있고 공지되어 있다. 항-혈관형성제는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 몇몇 구성에 있어, 화학요법제는 합성 항혈관형성 펩티드이다. 예를들면, 소 합성 선-세포자연사 펩티드의 항혈관형성 활성은 두 기능성 영역으로 이루어지며, 하나는 종양 미세혈관 상에서 CD13 수용체(아미노펩티다아제 N)를 표적으로 하고 다른 하나는 내부 이행에 따라 사립체막을 파괴하는 것으로 이미 보고되어 있다. Nat. Med. 1999, 5(9): 1032-8, 항-혈관형성제는 제이 발생 이량체 펩티드, CNGRC-GG-d(KLAKLAK)₂이고, 명명된 HKP(Hunter Killer Peptide)는 개량된 항종양 활성을 갖는 것으로 알려졌다. 소정의 구성에 있어, 이 분야의 통상의 기술자가 베바시주마브가 이 발명에 의하여 사용될 수 있다하드라도 항-VEGF 항체(베바시주마브와 같은 것)는 항혈관형성제로서는 배제된다.

바람직한 화학요법제에는 도세탁셀, 파클리탁셀과 이들의 조합물이 있다. "이들의 조합물"이란 도세탁셀과 파클리탁셀을 순차적이나 일시적으로 구분하여 투여(예를들어 한 주기에서 도세탁셀을 사용하고 다음에 파클리탁셀 사용)는 물론 하나 이상의 약제, 예를들어 도세탁셀과 파클리탁셀을 포함하는 투약 형태로 투여하는 것을 뜻한다. 특히 바람직한 화학요법제는 한정되는 것은 아니나, 단백질-결합 약제의 입자를 함유하는 것이고, 여기서 단백질 구성 단백질-결합 약제 입자는 50% 이상의 화학요법제가 나노입자형태인 알부민을 함유한다. 가장 바람직한 화학요법제는 예를들어, Abraxane^®과 같은 알부민-결합 파클리탁셀의 입자를 함유하는 것이있다. 이와 같은 알부민-결합 파클리탁셀 제제는 파클리탁셀 투약량을 약 3주의 투약주기(즉, 약 3주 동안 매 일회 파클리탁셀 투약량 투여)로 약 30mg/mL 내지 약 1000mg/mL로 하여 사용할 수 있다. 또한, 파클리탁셀 투약량은 약 3주의 투약 주기로 약 50mg/mL 내지 약 800mg/mL, 바람직하기로는 약 80mg/mL 내지 약 700mg/mL, 가장 바람직하기로는 약 250mg/mL 내지 약 300mg/mL로 하는 것이 바람직하다.

또한, 기타 치료제에는 한정되어 있는 것은 아니나 생물학적 활성 폴리펩티드, 항체와 이들의 단편, 렉틴과 톡신(예, 리신A), 또는 방사성 핵종이 있다. 이 발명에 사용하는데 활성제로서 적합한 항체로는 한정되어 있는 것은 아니나, 접합(결합) 또는 비접합(비결합)항체, 단클론 또는 다클론 항체, 인유화 또는 비인유화 항체, 및 Fab', Fab 또는 Fab2, 단일쇄 항체 등이 있다. 예측되는 항체 또는 항체 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM의 Fc 단편일 수 있다. 여러가지 바람직한 구성에 있어, 활성제는 단쇄 항체, Fab 단편, 디아보디 등이 있다. 더 바람직한 구성으로는, 항체 또는 항체 단편이 보체 활성화, 세포 매개 세포독성 옵소닌화, 비만세포 활성화 와/또는 기타 면역 반응을 매개하는 것이다.

더불어, 약학적 활성제는 siRNA일 수 있다. 바람직한 구성에 있어, siRNA분자는 예를들어 c-Sis와 기타 성장 인자, EGFR, PDGFR, VEGFR, HER2, 기타 수용체 티로신 키나아제, Src-계 유전자, Syk-ZAP-70계 유전자, BTK계 유전자, 기타 세포질 티로신 키나아제, Raf 키나아제, 시클린 의존성 키나아제, 기타 세포질 세린/트레오닌 키나아제, Ras 단백질과 기타 조절 GTPase와 같은, 종양과 연관되는 유전자의 발현을 억제한다.

또한, SPARC 결합 항체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합될 수 있다. PEG 접합은 단백질의 순환 반감기를 증가시키고, 단백질의 면역원성과 항원성을 감소시키고, 생체 활성을 개량시킬 수 있다. 적당한 접합 방법은 한정되어 있는 것은 아니나, 예를들어 메톡시-PEG를 SPARC 결합 항체의 이용성 아미노기 또는 예를들어 히스티딘 또는 시스테인과 같은 기타 반응 부위와 반응시켜서 사용할 수 있다. 더불어, 제조합 DNA 방법을 사용하여 이 발명의 SPARAC 결합 항체에 PEG-반응성 기를 갖는 아미노산을 가할 수 있다. PEG는 SPARC 결합 항체와 반응하기 전에 처리될 수 있으며, 예를들어, 링커기를 PEG에 첨가할 수 있다. 또한, 예를들어, SPARC 결합 항체의 소정의 부위에 부가되는 PEG 분자가 생체내에서 방출되는 SPARC 결합 항체의 PEG화와 같이, 방출성 및 교잡 PEG화 방법을 이 발명에서 사용할 수 있다: 이와 같은 PEG 접합 방법은 분야에 알려져 있다(참조, 예를들어, Greenwald 등, Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003)).

예측되는 SPARC 결합 항체와 이들의 접합체는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제조할 수 있다. 약학적으로 허용할 수 있는 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기와 형성)이 있고 이는 예를들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는, 초산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산로 형성된다. 또한 유리카르복실기로 형성되는 염은 예를들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물과 같은 무기염기와, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기에서 유도될 수 있다.

이 발명의 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 같은, 담체와의 제제로 제공된다. 대표적으로, 담체는 액체이나 고체 또는 액체와 고체 성분의 조합물일 수 있다. 담체는 생리학적으로 허용할 수 있는(예를들어, 약학적으로 또는 약리학적으로 허용할 수 있는)담체(예를들어, 부형제 또는 희석제)가 바람직하다. 적당한 약학적 부형제에는 안정화제, 항산화제, 삼투압 조절제, 완충제와 pH조절제가 있다. 적당한 첨가제에는 생리학적 생체 적합성 완충제, 컬레이트제 또는 칼슘 컬레이트 착화합물의 첨가물, 또는 임의의 칼슘 또는 나트륨 염의 첨가물이 있다. 약학적 조성물은 액체형의 사용으로 포장될 수 있고, 또는 동결건조될 수 있다. 생리학적으로 허용할 수 있는 담체 매체는 물, 완충수, 규정 염수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 바람직하다. 생리학적으로 허용할 수 있는 잘 알려져 있고 쉽게 이용할 수 있다. 담체 선택은 표적 조직 과/또는 세포의 위치와 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의하여 최소한 부분적으로 결정될 수 있다.

조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 척수강내, 경막외, 전신, 경피, 피하, 경점막(예를들어, 폐 포함), 비강내, 직장, 질 또는 구강을 포함한 경로에 투여하기 위하여 제조할 수 있다. 또한 조성물은 희석제, 보조제, 부형제, 방부제와 pH조절제 등과 같은 부가적 성분을 함유할 수 있다.

주사용 투여에 적합한 제제에는 항산화제, 완충제, 정균제와, 의도되는 수혈자의 혈액과 등장성을 갖는 제제가 되게하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사액과, 현탁제, 용해 보조제, 농후제, 안정화제, 분산 보호제와 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 있다. 제제는 앰플과 작은 유리병과 같은 단위-투약량 또는 다수-투약량의 밀봉 용기에 넣을 수 있고, 사용 직전, 멸균액 담체 예를들어, 물, 주사용 물의 첨가만을 요구하는 얼림-건조(동결 건조)조건하에 저장할 수 있다. 일시적 주사액과 현탁액은 멸균 분제, 입제, 또는 정제로 제조할 수 있다.

멸균 주사액은 상기 열거한 하나 또는 조합한 성분과 적당한 용매에서 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 필요에 따라 여과 살균하여 제조할 수 있다. 바람직하기로는 주사액에서 내 독소를 없애는 것이다. 일반적으로 분산제는 기본 분산 매체와 상기 열거한 기타 필요 성분을 함유하는 멸균 매개체에 활성 화합물을 혼합하여 제조한다. 멸균 주사액의 제조용 멸균 분제의 경우, 바람직한 제조 방법은 이들의 미리 살균-여과한 용액으로부터 활성 성분 플러스 소정의 부가적 필요성분의 분제를 생성되게 하는 진공 건조와 동결-건조가 있다. 모든 경우에, 제제는 멸균 되어야 하고, 쉽게 주사할 수 있는 범위까지 유체이어야 한다. 이는 제조 조건으로 안정성을 가져야 하고 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 활동에 대하여 보호되어야 한다. 유리 염기로서 활성 화합물 또는 약리학적으로 허용할 수 있는 염의 용액은 히드록시 셀루로오스와 같은 계면활성제와 적당히 혼합한 물에서 제조할 수 있다. 또한, 분산제는 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜과 이들의 혼합물에서와 오일에서 제조할 수 있다. 통상의 저장과 사용 조건하에서 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위하여 방부제를 함유한다.

바람직한 구성으로, 유효 성분은 각 콜로이드성 약제 방출 시스템(예를들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자와 나노 캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 예를들어 코아세르베이션법에 의하여 또는 계면 중합에 의하여 제조된 마이크로캡슐, 예를들어, 히드록시 메틸 셀루로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐과 폴리(메틸메타실레이트)마이크로캡슐에 넣을 수 있다. 이와 같은 방법은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기술되어 있다. 특히 SPARC 결합 항체를 함유하는 리포솜은 Rezler 등, J. Am. Chem. Soc. 129(16): 4961-72 (2007); Samad 등, Curr. Drug Deliv. 4(4): 297-305 (2007)와; U.S. Pat. Nos. 4,485,045와 4,544,545에 기술되어 있는 이러한 방법으로 제조할 수 있다. 강화된 순환 시간을 갖는 리포솜은 U.S. Pat. No. 5,013,556에 기술되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 예를들어 역-상 증발법에 의하여, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤과 PEG-유도 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물로 생성될 수 있다. 리포솜을 미세공 크기의 필터로 압출하여 원하는 직경을 갖는 리포솜을 얻는다. 이 발명의 폴리펩티드는 Werle 등, Int. J. Pharm. 370(1-2): 26-32 (2009)에 기술된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다.

다른 구성에 있어, 조성물은 천연 바이러스 또는 바이러스-유사 입자, 덴드리머, 탄소 나노아셈블리, 중합체 담체, 상자성 입자, 강자성 입자, 폴리머솜, 필로미셀, 미셀 또는 리포단백질을 사용하여 전달될 수 있다.

기도에 투여는 전신 또는 국소 투여, 예를들어 기관 과/또는 폐에 공급할 수 있다. 이와 같은 투여는 에어러솔, 용액과 기관지경과 같은 기구를 사용하여, 흡입을 통하거나 물리적 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 흡입에 있어, 여기의 조성물은 통상적으로 흡입기, 분무기, 펌프, 가압 팩, 또는 에어로솔, 분제의 비-에어러솔 스프레이, 또는 액체의 비-에어로솔 스프레이를 전달하는 기타 일반적 수단으로 전달된다. 가압 팩은 액화가스 또는 압축 가스와 같은 적당한 추진제를 함유할 수 있다. 액화가스에는 예를들면 플루오로화 염소화 탄소수소, 하이드로클로로플루오로탄소, 하이드로클로로탄소, 탄화수소와 탄화수소 에테르가 있다. 압축 가스에는 예를들면, 질소, 산화 질소와 이산화 탄소가 있다. 특히 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 가스의 사용이 예측된다. 가압 에어로솔의 경우에, 투약 단위는 조절양을 방출하는 밸브의 제공에 의하여 결정된다. 무수 분제 조성물의 투여에 있어, 분제 혼합물은 락토오스 또는 전분과 같은 적당한 분제 기초재를 포함할 수 있다. 분제 조성물은 예를들어, 캡슐, 카트리지, 또는 분제를 흡입기 또는 흡수기의 도움으로 투여할 수 있는 기포 팩과 같은 단위 투약 형태로 할 수 있다.

또한 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의하여 할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어, 투과되는 장벽에 적합한 침투제를 제제에 사용한다. 이와 같은 침투제는 일반적으로 이 분야에 알려져 있고, 예를들면, 경점막 투여용으로 세정제, 담즙산염과 푸시드산 유도체가 있다. 경점막 투여는 비강 분무, 흡입 에어로솔, 직장 또는 질 좌제, 마우스 워시, 급속 용해 정제 또는 함당 정제의 사용을 통하여 달성될 수 있다. 경피 투여에 있어, 활성 화합물을 이 분야에 일반적으로 알려져 있는 연고, 고약, 겔, 포옴 또는 크림으로 제조한다.

약학적 조성물은 약제 방출 시스템을 사용하여 방출할 수 있다. 이와 같은 방출 시스템은 콜라겐 단편의 히알루론산 용액 또는 현탁액이 있다. 약제는 폴리초산, 에틸히드록시 셀루로오스, 폴리카프로락톤, 폴리카프로락톤 디올, 폴리리신, 폴리글리콜산, 폴리말레산, 폴르[N-(2-히드록시프로필)메틸아크릴아미드]등과 같은 방출 억제용에 적당한 중합체 물질로 설계된 마이크로 캡슐로 제조할 수 있다. 약제 전달 시스템을 사용한 특정 제형으로는 현탁액, 연고, 붕대와의 복합제, 콜라겐 차폐제 등의 형태로 할 수 있다.

조성물은 특히, 조성물의 안정성 과/또는 이들의 최종-사용을 강화하는데 적당한 기타 성분을 더 함유할 수 있다. 따라서, 이 발명의 조성물에 적합한 제형은 광범위하다.

또한, 서방성 조성물도 예를들어, U.S. Pat. Nos. 5,672,659와 5,595,760에 기술되어 있는 것과 같이, 이 조성물에서 사용할 수 있다. 속효성 또는 서방성 조성물의 사용은 치료되는 증상의 성질에 따른다. 증상이 급성 또는 과급성 장애이면, 급속 방출 형태로 치료는 지속적 방출 조성물에 바람직할 것이다. 또한, 소정의 예방 또는 장기간 치료에 있어서는 서방형 조성물이 적합하다.

더불어, 조성물은 치료적 또는 생물학적 활성제를 부가적으로 함유할 수 있다. 예를들면, 특정 적응증 치료에 유용한 치료적 인자가 존재할 수 있다. 이부프로펜 또는 스테로이드와 같은 염증을 억제하는 인자는 약학적 조성물의 생체내 투여와 연관되는 종창 및 염증과 생리적 고통을 감소 시키는 조성물의 부분일 수 있다.

이 발명에 위하여 제공되는 조성물은 예를들어 약 10mg/mL 내지 약 100mg/mL, 바람직하기로는 약 1mg/mL 내지 약 10mg/mL, 더 바람직하기로는 약 0.1mg/mL 내지 약 1mg/mL의 활성제 농도로, SPARC 결합 항체에 결합되는 활성제를 갖는 약 0.5mL 내지 약 4mL의 수성 또는 유기 액체를 포함할 수 있다. 활성제는 안정적이고 치료적으로 효과가 있는 농도, 예를들어 약 10mg/mL 내지 약 50mg/mL 농도의 베바시주마브로 존재할 수 있다.

[방법]

이 발명은 Imm12, Imm14, mHTI, hHTI 또는 이들의 조합물을 함유하는 SPARC 결합 항체로 이루어지는 진단적 또는 치료적 유효량의 조성물을 투여하여 동물의 질병을 진단 또는 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구성에 있어, 이 발명은 유효량의 Imm12, Imm14, mHTI, hHTI, 또는 이들의 조합물을 투여하여 동물의 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 다른 구성에 있어, 유효량의 Imm12, Imm14, mHTI, hHTI, 또는 이들의 조합물을 투여하여 동물의 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 상술한 소정의 조성물은 이 발명의 방법에 사용될 수 있다.

이 발명의 방법에 따라, 치료적 유효량의 조성물을 포유류에 투여하여 활성제 단독의 방출에 비하여 질병 부위에 활성제 방출을 강화할 수 있고 또는 SPARC의 혈액 수준의 감소를 가져오는 클리어란스를 강화시킬 수 있다. 바람직한 구성으로는, SPARC 혈액 수준의 감소가 최소한 약 10%일 때이다. 더 바람직한 구성으로는, SPARC 혈액 수준의 감소가 최소한 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%일 때이고, 가장 바람직하기로는 최소한 약 50%일 때이다.

또한 이 발명은 (a) Imm12, Imm14, mHTI, hHTI, 또는 이들의 조합물을 함유하는 진단적 유효량의 SPARC 결합 항체를 동물에 투여하고; (b) 동물의 특정 부위 또는 조직에 존재하는 SPARC 결합 항체의 양을 검출하고; (c) 존재하는 SPARC 결합 항체의 양이 SPARC의 정상 수준보다 현저히 더 크게 특정 부위 또는 조직에 존재하는 것을 나타내면 질병 또는 증상이 존재함을 진단하는 것으로 이루어지는 동물의 질병 또는 증상의 진단 방법을 제공한다.

또한, 이 발명은 동물에서 생물학적 시료를 단리하고; 생물학적 시료에서 SPARC 단백질의 발현을 검출하고, 생물학적 시료에 SPARC 단백질이 치료적 유효량의 항암제와 치료적 유효량의 항-SPARC 항체를 투여하는 한계 수준이상으로 존재할 때, 또는 SPARC 단백질이 SPARC 결합 항체 없이 치료적 유효량의 항암제를 투여하는 한계 수준 이하로 존재할 때, 생물학적 시료에서 SPARC 단백질의 양을 정량하여서하는, 하나 이상의 항암제로 SPARC 결합 항체로 동물의 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

시료에 존재하는 SPARC 단백질의 수준은 통상 항-SPARC 항체를 사용하여 검출한다. 그러나, 몇몇 구성에 있어, SPARC 단백질의 발현은 일부의 항체만을 사용하여, 항체가 없는 SPARC 결합 분자를 사용하여, 또는 항체 또는 SPARC 결합 분자를 요구하지 않는 SPARC 발현을 검출하는 몇몇 다른 방법을 사용하여 검출할 수 있다.

이 발명은 SPARC의 과발현에 의한 특징을 갖는 소정의 정상에 사용할 수 있다. 이 발명이 유용한 질병에 예시하면 연조직, 연결성 조직, 뼈, 고체 기관, 혈관 등을 포함한 소정의 몸체 조직에서 증식의 비정상 증상, 조직 개조, 이상증식, 과도한 창상 치유가 있다. 이 발명의 방법과 조성물을 사용하여 치료 또는 진단할 수 있는 질병의 예를들면 암, 당뇨병 또는 기타 망막증, 염증, 관절염, 혈관 또는 인공혈관 이식 또는 정맥내 기구의 재판협착 등이 있다.

이 발명 방법의 범위 내의 기타 질병에는 한정되어 있는 것은 아니나, 암, 재판협착 또는 기타 증식성 질병, 섬유 조직 증식, 골다공증 또한 과도한 창상 치유가 있다. 특히, 이에 적합한 질병은 한정되어 있는 것은 아니나, (a) 암은 예를들어 원위치 암종, 비정형 이상증식, 암종, 육종, 암육종, 폐암, 췌장암, 피부암, 혈액학적 신생물, 유방암, 뇌암, 결장암, 방광암, 목암, 자궁내 암, 식도암, 위암, 머리와 목암, 다발성 골수암, 간암, 백혈병, 림프종, 구강암, 골육종, 난소암, 전립선 암, 고환암과 갑상선암에서 선택하고, (b) 재판협착은 예를들어 관상동맥 재판협착, 대뇌 동맥 재판협착, 경동맥 재판협착, 직장 동맥 재판협착, 대퇴 동맥 재판협착, 말초동맥 재판협착 또는 이들 조합에서 선택하고, (c) 기타 증식성 질병은 예를들어 이상증식, 자궁내막염, 비대 반흔과 켈로이드, 증식성 당뇨 망막증, 사구체 신염, 증식성 폐 고혈압, 류머티스성 관절염, 동정맥 기형, 주상동맥 용혈반, 관상 동맥 질병, 지연성 창 치유, 호혈균 관절, 유착불능 골절, 오슬러-웨버증후군, 건선, 발열원성 육아종, 경화증, 트라코마, 월경과다, 혈관 점착과 유두종에서 선택하며, (d) 섬유조직증식 질병은 예를들어 간 섬유조직증식, 폐 섬유조직증식과 후복막 섬유조직증식에서 선택하는 것이다.

동물은 치료 또는 진단이 필요한 소정의 환자 또는 대상체일 수 있다. 바람직한 구성으로는, 동물이 포유류일 때이다. 특히 바람직한 구성으로는 동물이 사람일 때이다. 다른 구성에 있어서는 동물이 마우스, 쥐, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 양, 말, 소 또는 사람이 아닌 영장류일 때이다.

또한, 이 발명은 SPARC에 대한 중성 항체, 예를들어, 적당한 SPARC 결합 항체를 사용하여 SPARC 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 중성 항체는 SPARC와 생체내 이의 작동인자의 상호작용, 예를들면, 세포 표면 성분과 SPARC의 상호작용 또는 알부민, 성장 인자와 Ca² ⁺와 같은 자연 리간드에 SPARC의 결합을 차단하는 능력을 갖는다. 이 발명은 포유류의 종양에 화학요법제를 방출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료적 유효량의 약학적 조성물을 사람 또는 동물에 투여하는 것이고, 여기서 약학적 조성물은 적당한 SPARC 결합 항체에 결합되는 화학요법제와 약학적으로 허용할 수 있는 담체로 이루어진다. 또한 이 발명의 다른 구성과 연관하여 여기에 열거한 화학요법제, 동물과 이들의 성분의 설명은 종양에 화학요법제를 방출하는 상기 방법의 동일한 특징으로 응용할 수 있다.

화학요법에 대한 반응을 예측하거나 측정할 수 있고, 이 발명에 따라 치료될 수 있는 검출된 종양형은 일반적으로 사람과 동물에서 발견되는 것이다. 종양은 실험 동물에서와 같이 잘 접종한 결과일 수 있다. 종양의 여러가지 형과 형태는 사람과 기타 동물 증상에서 만나며, 소정의 특정 형 또는 다양성에 존재하는 방법의 사용은 한정되어 있지 않다. 알려져 있는 종양에는 비 조절 및 진행성 세포 분열에서 나오는 조직의 비정상 집단이고, 통상 "신생물"로서 알려져 있다. 이 발명의 방법은 종양세포와 연관되는 스트로마 세포, 예를들어, 사람의, 연조직 육종과 같은 연조직과 연관되는 종양에 유용하다.

종양 또는 암은 구강과 인두, 소화계, 호흡계, 뼈와 관절(예를들어, 골 전이), 연 조직, 피부(예를들어 흑색종), 유방, 생식계, 요도계, 눈과 안구, 뇌와 중추신경계(예를들어 교세포종), 또는 내분비계(예를들어 갑상선)에 위치할 수 있고 실제 일차 종양 또는 암에 한정되는 것은 아니다. 구강과 연관되는 조직은 한정되어 있는 것은 아니나, 혀와 입의 조직이 있다. 암은 예를들어 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 항문, 간, 담낭과 췌장을 포함한 소화계의 조직에서 일어날 수 있다. 호흡계의 암은 후두, 폐와 기관지에 영향을 줄 수 있고 예를들면 소세포와 비-소세포 폐 암종이 있다. 종양은 암수 생식계에서 이루어지는 자궁경관, 자궁 내분비신, 난소음부, 질, 전립선, 정소와 음경과, 요로계에서 이루어지는 요로 방광, 신장, 신우, 뇨관에서 일어날 수 있다. 종양 또는 암은 머리 와/또는 목에 위치할 수 있다(예를들어, 후두암과 부갑상선 암). 또한, 종양 또는 암은 조혈계 또는 림프계에 위치할 수 있고, 예를들면 림프종(예를들어, 호지킨 질병과 비-호지킨 림프종), 다발성 골수종 또는 백혈병(예를들어 급성 림프세포 백혈병, 만성 림프세포 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병 등)이 있다. 바람직하기로는 종양이 방광, 간, 난소, 신장, 장, 뇌 또는 유방에 위치하는 것이다.

다른 구성으로는, 이 발명은 SPARC 결합 항체에 의하여 SPARC의 과발현에 의한 특징을 갖는 질병 부위에 약학적 활성제를 방출하는 방법을 제공한다. 이와 같은 질병에는 몸체 조직(예를들어, 연조직, 연결성 조직, 뼈, 고체 기관, 혈관 등)에서 증식의 비정상 증상, 조직 개조, 이상 증식과 과도한 창상 치유가 있다. 적당한 SPARC 항체에 결합되는 치료제를 함유하는 약학적 조성물을 투여하여 치료할 수 있거나 또는 진단할 수 있는 질병의 예를들면, 암, 당뇨병 또는 기타, 망막증, 염증, 관절염, 혈관의 재판 협착증, 인공 혈관 이식 또는 혈관내 기구 등이 있다. 또한 이 발명의 다른 구성과 연관하여 여기에 열거한 화학요법제, 종양, 동물과 이들의 성분의 설명은 약학적 활성제의 상기 방법의 동일한 특징에 응용할 수 있다.

다른 구성에 있어, 이 발명의 방법은 리포솜 또는 알부민이 적당한 질병 표적 SPARC 결합 항체에 결합되는 리포솜 결합 또는 알부민 결합 화학요법제를 함유하는 치료적 유효량의 약학적 조성물을 포유류에 투여하는 것이다. 화학요법제는 소정의 적당한 방법을 사용하여 SPARC 결합 항체에 결합시킬 수 있다. 바람직하기로는 화학요법제가 예를들어 이 황화물 결합을 포함한 공유결합을 통하여 화합물에 화학적으로 결합되는 것이다.

상술한 것과 같은 하나 이상의 화학요법제를 하나 이상의 투약양으로 이 발명의 방법에 따라 투여할 수 있다. 이 발명의 방법에 사용되는 화학요법제의 형과 수는 특정 종양형에 대한 표준 화학요법에 따른다. 다시 말해서, 특정 암은 통상 단일 화학요법제로 치료될 수 있고, 다른 것은 통상 화학요법제와 조합하여 치료될 수 있다. 적당한 치료제, 화학요법제, 방사성 핵종 등을 항체 또는 이들의 단편에 결합 또는 접합시키는 방법은 이 분야에 기술되어 있다. 다음 실시예는 이 발명을 더 예시한 것이지만, 이의 범위를 어떠한 방법으로 제한하는 것으로 해석되어서는 않된다.

이 발명에 따른 방법에는 예를들어 동물이 수술, 화학요법, 방사선요법, 열요법, 면역요법, 호르몬요법과 레이저요법에서 선택된 하나 이상의 암요법을 받고 있는 조합요법이 있다. "공동-투여"와 "조합요법"이란 용어는 둘 이상의 치료적 활성제를 대상체에 투여하는 것을 뜻한다. 제제는 단일 약학적 조성물에 함유되어 동시에 투여될 수 있거나 또는 제제는 분리된 제형에 함유되어 대상체에 연속적으로 투여될 수 있다. 두 제제가 동시에 대상체에서 검출되면 두 제제가 공동-투여된 것이다.

이 발명에서 예측되는 조합 치료법은 항체 투여에 한정되는 것은 아니지만, 백신투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체와 생물학적 반응 수식인자의 투여가 있다. 둘 이상의 조합된 화합물은 함께 또는 연속적으로 사용할 수 있다. 화학요법제의 예를들면. 알킬화제, 항대사물질, 천연생성물, 호르몬 및 길항물질과 기타 제제가 있다. 알킬화제의 예를들면, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 이소스파미드, 멜파란(L-사르콜리신)과 클로람부신과 같은 질소 머스타드; 에틸에니민 및 헥사메틸멜라민과 같은 메틸멜라민과 티오테파; 부술판과 같은 알킬 술포네이트; 카르무스틴(BCNU), 세무스틴(메틸-CCNU); 로무스틴(CCNU)과 스트렙토조신(스트렙토조토신)과 같은 니트로소우레아; 인산에스트라무스틴과 같은 DNA 합성 길항물질; 다카르바진(DTIC, 디메틸-트리아제노이미다졸카르복스아미드)와 테모졸로미드와 같은 트리아진이 있다. 항대사물질의 예를들면, 메토트렉에이트(아메토프테린)와 같은 폴산 유사체; 플루오로우라신(5-플루오로우라실, 5-FU, 5FU), 플록수리딘(플루오로데옥시우리딘, FUdR), 시타라빈(시토신 아라비노시드)와 젬시타빈과 같은 피리미딘; 머캅토푸린(6-머캅토푸린, 6-MP), 티오구아닌(6-티오구아닌, TG), 및 펜토스타틴(2'-데옥시코포르마이신, 데옥시코포르마이신), 클라드리빈과 플루다라빈과 같은 푸린 유사체; 암사크린과 같은 위상이성질화 효소억제제가 있다. 천연 생성물의 예를들면 빈블라스틴(VLB)과 빈크리스틴과 같은 빈카 알카로이드; 파클리탁셀(Abraxane™)과 도세탁셀(Taxotere™)과 같은 탁산; 에토포시드와 테나포시드와 같은 에피포도필로톡신; 토포테칸과 이리노테칸과 같은 캄프토테신; 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신(다우노마이신, 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신(미토마이신 C), 이다루비신, 에피루비신과 같은 항생물질; L-아스파라기나아제와 같은 효소; 인터페론 알파와 인터류킨 2와 같은 생물학적 반응 수식인자가 있다. 호르몬과 길항물질의 예를들면, 부세레린과 같은 항체형성 호르몬 방출 작동제; 프레드니손과 같은 아드레노코르티코스테로이드와 관련 제제; 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 초산 메드록시프로게스테론과, 초산 메게스트롤과 같은 프로게스틴; 디에틸스틸베스트롤과 에틴일 에스트라디올과 같은 에스트로겐과 관련 제제; 타목시펜과 안나스트로졸과 같은 에스트로겐 길항물질; 프로피온산 테스토스테론과 플루옥시메스테론과 같은 안드로겐과 관련 제제; 플루타미드와 비칼루타미드와 같은 안드로겐 길항물질; 류프롤리드와 같은 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체가 있다. 기타 제제의 예를들면, 탈리도미드; 시스플라틴(cis-DDP), 옥사리플라틴과 카르보플라틴과 같은 백금 배위 복합체; 미톡산트론과 같은 안트라센에디온; 히드록시우레아와 같은 치환된 우레아; 프로카르바진(N-메틸히드라진, MIH)과 같은 메틸히드라진 유도체; 미토탄(o,p'-DDD)과 아미노글루테티미드와 같은 아드레노코르티칼 억제제; 벡사로텐과 같은 RXR 작용제; 이마티니브와 같은 티로신 키나아제 억제제가 있다.

항-SPARC 항체가 조직학적 단면을 항체 염색하는가 아닌가 여부 즉, 조직학적 단면이 SPARC-양성인가 아닌가 여부의 측정은 이 분야의 통상의 전문가가 알 수 있음을 이해할 것이다. 몇몇 구성에 있어, 항체 염색의 수준은 어떠한 병리학의 표준방법을 사용하여 정량할 수 있으므로, 예정 수준이상으로 어떠한 수준의 항체 염색이 SPARC-양성 시료를 구성함을 이해할 것이다. 예를들면, 항체 염색은 0~3의 스케일로 평가될 수 있으며, 여기서 0= 음성(<5%의 세포염색), 1=매우 약함, 2=중간 염색(즉, 적당한 세포하의 분포에서 중간 강도 염색으로 약함을 나타내는 5~50%의 세포), 3=강한 염색(즉 매우 강한 염색을 나타내는 5%의 세포 또는 적당한 세포하의 분포에서 적당히 강한 염색으로 약함을 나타내는 >50%의 세포). 바람직하기로는 이러한 스케일을 사용할때, 시료는 스코어가 3일때 SPARC-양성인 것으로 측정된다. 다른 구성에 있어, 시료는 스코어가 2 또는 평균 1일때 SPARC-양성인 것으로 측정될 수 있다. 다른 구성에 있어, 항체 염색의 수준은 예를들어 양성 또는 음성 대조 시료를 비교하여 질적으로 측정될 수 있다. 예를들면, 조직학적 단면이 SPARC-양성으로 미리 또는 분리하여 측정된 시료와 동일하거나 또는 그 이상인 항체 염색을 나타내면, 이때 조직학적 단면은 SPARC-양성으로 이해하게 된다. 비슷하게, 조직학적 단면이 SPARC-음성으로 미리 또는 분리하여 측정된 시료와 동일하거나 또는 그 이하인 항체 염색을 나타내면, 이때 조직학적 단면은 SPARC-음성으로 이해하게 된다.

이 발명의 방법에서 특징을 갖는 조성물은 단일 투약량으로 또는 복합 투약량으로 투여될 수 있다. 항체를 주사로 투여할 때, 주사는 단일 지속 투약량으로 할 수 있고 또는 복합주사로 방출할 수 있다. 제제의 주사는 이상 표적 유전자 발현 부위에서 또는 그 근처에서 조직에 직접할 수 있다. 제제의 복합 주사는 부위에서 또는 그 근처에서의 조직에서 이루어질 수 있다.

투여당 약 1㎍/kg 내지 100㎍/kg의 체중 상태의 투약량 수준이 질병 치료에 유용하다. 투약량에 있어서, 항체는 체중 kg당 약 75mg 이하, 또는 체중 kg당 약 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0005mg 이하와 체중 kg당 200mmol 이하 또는 체중 kg당 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015mmol 이하의 항체의 단위 투약량으로 투여될 수 있다. 예를들면, 단위 투약량은 주사(예를들어, 정맥내 또는 근육내, 동맥내 또는 기관에 직접), 흡입 또는 경피사용에 의하여 투여될 수 있다.

또한 이 분야의 전문가는 주어진 대상체에 이 발명의 항체를 투여하는데 적당한 투약 요법을 쉽게 결정할 수 있다. 예를들면, SPARC-결합 항체 조성물은 SPARC 발현 부위에 또는 그 근체에서 단일 주사 또는 침착으로, 한번에 대상체에 투여될 수 있다. 이 발명의 조성물은 매일, 매 반-주, 매주, 매 이주, 매 반달, 매달, 매 두달, 또는 임상의 판단에 따라 투여될 수 있다. 몇몇 구성에 있어서는, 조성물을 약 3일 내지 약 28일, 더 바람직하기로는 약 7일 내지 약 10일의 기간동안 매일 1회 또는 2회 투여하는 것이다. 다른 구성에 있어서, 단위 투약량은 예를들어, 매 2, 4, 8 또는 30일 이하 자주 한번 투여한다. 다른 구성에 있어서는 단위 투약량은 도수로 투여되지 않는 것이다(예를들어, 비규칙적 도수).

투약 요법이 복수 투여로 이루어질때 대상체에 투여되는 유효량의 SPARC 결합 항체 조성물이 전체 투약 요법에 걸쳐서 투여되는 항체의 총량을 포함함을 알 수 있다. 이 분야의 전문가는 정확한 개별 투약은 투여되는 특이적 SPARC 결합 항체 조성물, 투여시간, 투여 경로, 제제 성질, 배출속도, 치료되는 특정질환, 질병의 심도, 올리고뉴클레오티드제의 약역학, 나이, 성별, 체중과 환자의 일반 건강을 포함한 여러가지 요인에 따라 어느 정도 조절될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 필요한 투약 수준의 넓은 변이는 여러 투여 경로의 다른 효능면에서 기대되는 것이다.

효과적 투약량은 특이한 환경하에서 적당하다고 생각하거나 원함에 따라, 단일 투약량으로 또는 둘이상의 투약량으로 투여될 수 있다. 반복 또는 수시 주입을 쉽게하기를 원하면, 전달기구, 예를들어, 펌프, 반영구 스텐트의 이식(예를들어 정맥내, 복강내, 저장기내, 또는 협막내) 또는 보유체를 권장할 수 있다. 성공적 치료에 따라, 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자에게 유지 요법을 받게하는 것이 바람직하다. 항체 조성물의 농도는 질병의 치료 또는 예방에 효과적이고 또는 사람의 생리적 증상을 조절하는데 충분한 양이어야 한다. 투여되는 항체의 농도 또는 양은 투여 방법과 제제를 결정하는 파라미터에 따른다.

소정의 요인은 한정적인 것은 아니나 질병 또는 장애의 심도, 선치료, 대상체의 일반 건강 과/또는 나이와, 기타 존재하는 질병을 포함한 효과적으로 대상체를 치료하는데 요구되는 투약량에 영향을 미친다. 치료에 사용되는 항체의 효과적 투약량은 특정 치료과정에서 증가 또는 감소시킬 수 있다. 투약량의 변경은 결과에 따르고 진단 검정의 결과로서 분명하게 된다. 예를들면, 항체 조성물의 투여 후 대상체를 감시할 수 있다. 감시에서 나온 정보를 기초로하여, 부가적 양의 조성물을 투여할 수 있다. 일반 전문가는 최적의 투약량, 투약 방법론과 반복율을 쉽게 측정할 수 있다.

이 실시예는 사람 SPARC에 결합할 수 있는 일련의 항체의 제조를 예시한 것이다.

열두 마우스 - 유도 항-사람 SPARC 항생체는 일반적으로 마우스 균주 RBF/DnJ를 사용한 통상의 잡종 세포 방법을 사용하여 생성시킨다.

pASK84 발현 벡터(도 1)를 사용하여 생성한 항체의 Fab영역을 발현시키고, Imm1 내지 Imm12를 설계한다. Fab영역은 주변 세포질을 표적으로하고 여기서 이들을 수집한 다음 단백질A 세파로스 컬럼에서 활성 크로마토그래피를 통하여 정제한다. 동정은 웨스턴 블로트에 의하여 검증하고, SPARC 결합 활성은 ELISA에 의하여 검증한다.

Imm13과 Imm114는 사람 파아지 표시 라이브러리를 사용하여 생성되는 완전 사람 항-사람 SPARC 항체이다. SPARC는 통상의 사람 Fab 파아지 표시 라이브러리 HuFabL^®로 채취된다(Creative Biolabs, Shirley, NY). 두 관련 Fab 서열을 도 2에 표시된 바와 같이, Fab6(SEQ ID NO 15)과 Fab16(SEQ ID NO 16)으로 동정한다. SPARC 결합 활성은 이들 두 Fab 분자의 ELISA에 의하여 검증한다.

이들 Fab영역은 pBAD 벡터(도 3)로 클론화 하고 박테리아에서 발현하고 정제한다. pBAD 벡터에 의하여 발현된 Fab 단백질은 용해된 박테리아의 주변 세포질 분획과 단리하고, 서열은 도 4에 표시한다. 주변세포질 분획에서 얻은 Fab 영역의 동정은 SDS 파아지로 검증한다. Fab 단백질은 단백질A 세파로스 컬럼에서 활성 크로마토그래피를 통하여 균질성으로 정제한다.

완전 사람 SPARC 결합 항체를 창출하기 위하여, Fab6과 Fab16의 유전자를 pcDNA3002Neo 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)통하여 클론화하고 발현한다(도 5). 생성한 항체를 정제하고 이들의 동정은 겔 전기 영동과 N-말단 분석에 의하여 검증한다. Fab6에서 창출된 완전 사람 항체로 Imm13를 설계하고 Fab16에서 창출된 완전 사람 항체로 Imm14를 설계한다.

전술한 방법으로 Imm1 내지 Imm14를 생성시킨 후, 이들을 통상 마우스 동위형 시험 키트(AbD Serotec, Raleigh, NC)를 이용하여 동위형에 따른 특징을 갖게한다. 그 결과는 다음 1에 표시했다.

클론번호	아브락시스 명칭	동위형
16	Imm1	IgG1 (k)
38	Imm2	IgG1,2b (k)
39	Imm3	IgG1,2b (k)
43	Imm4	IgG1 (k)
47	Imm5	IgG2a (k)
49	Imm6	IgG1 (k)
55	Imm7	IgG2a (k)
58	Imm8	IgG2b (k)
62	Imm9	IgG1 (k)
66	Imm10	IgG1 (k)
70	Imm11	IgG1 (k)
71	Imm12	IgG1 (k)
F6	Imm13	IgG1 (k)
F16	Imm14	IgG1 (k)

Imm12를 포함한, 선택된 Imm 시리즈 항체에 대한 가변성 우대 측정 영역의 서열은 도 6에 표시했다. 표 1의 클론, Imm1 내지 Imm14은 ATCC와 같은, 적당한 기탁소에 기탁 될 것이다.

이 실시예에서는 Imm 시리즈 항체의 SPARC 결합의 특징을 나타내는 ELISA 검정의 사용을 예시한다.

재조합 사람 SPARC(Bio1-SPARC)를 결합하는 Imm1 내지 Imm12(마우스-유도-항-사람 SPARC 항체)의 능력은 여러 정제 단계에서 행한 다수 ELISA 검정에 의한 특징을 갖는다. 도 7은 정제전 항체 상청액의 계열 희석(1:1, 1:10과 1:100)으로 행한 ELISA 검정의 결과를 나타낸다. 이 검정에서, Imm4, Imm6, Imm9, Imm10과 Imm12는 최고의 Bio1-SPARC 결합을 나타내고, Imm12는 최고의 결합 전체를 나타낸다. 다른 ELISA는 0.04μg/mL, 0.2μg/mL, 1μg/mL과 5μg/mL의 농도에서 정제된 항체(도 8)로 행한다. 정제된 항체는 일반적으로 비정제된 상청액이상으로 개량된다. 이 검정에서 Imm4, Imm9, Imm11과 Imm12는 최고의 Bio1-SPARC 결합을 나타낸다. 부가적 ELISA를 행하여 두 다른 SPARC의 변체: Bio1-SPARC와, 사람 혈소판 SPARC(HTI-SPARC)에 마우스 유도 Imm 시리즈 항체의 결합을 비교한다(도 9). 이 검정에서, Imm4와 Imm9는 둘다 HTI-SPARC 보다 현저하게 더 양호한 Bio1-SPARC를 결합함을 알 수 있다. Imm11과 Imm12는 두 사람 SPARC 변체와 아주 동일하게 결합한다.

ELISA 검정을 사용하여 완전 사람 SPARC 결합 항체, Imm13과 Imm14의 SPARC 결합의 특징을 나타낸다. 예를들면, 단백질 ELISA(도 10)에 따르면, Fab16(Imm14의 Fab영역)은 11nM의 KD를 갖는 HTI-SPARC와 결합하고 7nM의 KD를 갖는 Bio1-SPARC와 결합한다. Biacore 3000® (GE/Biacore International AB, Uppsala, Sweden)으로 행한, 표면 플라스몬 공명 결합 검정으로, 센서칩상에 고정화된 두 SPARC 변체에 Fab16의 결합을 시험한다. 이들 검정으로 HTI SPARC에 대한 76.2nM과 Bi01-SPARC에 대한 132nM의 KD값을 가져온다.

또한, ELISA 검정을 행하여 선택된-유도 항 사람 SPARC 항체, Imm11과 Imm12의 SPARC 결합 능력을 완전 사람 Imm13과 Imm14와 직접 비교하고, 그 결과를 도 13에 표시했다. 그 결과는 Imm13은 두 마우스 유도 항체보다 SPARC에 대하여 더 높은 친화성을 갖는 반면에, Imm14는 더 낮은 친화성을 갖는 것을 나타낸다.

이 실시예는 결합 검정에서, 두 재조합 사람 SPARC와 사람 혈소판 SPARC에 대한 소정의 생체외 Imm 시리즈 항체를 나타낸 것이다.

이 실시예는 Imm 시리즈 항체가 결합하는 에피토프의 분석을 나타낸 것이다.

웨스턴 블로팅을 사용하여 Imm 시리즈 항체가 선상 또는 배좌 에피토프에 결합하는지를 측정한다. 이 분석에서, SPARC 단백질은 SDS의 존재하에서 폴리아크릴아미드 겔을 계속한다. 따라서, 겔상의 SPARC 단백질은 이의 변성 형태로 있다. Imm 시리즈 항체를 일차 항체로서 사용하고 다음 염소 항-마우스 IgG로 조사한다. BSA를 음성 대조물로서 사용한다. 도 14에 표시된, 검정 결과는 Imm11과 Imm12가 SPARC에 결합하는 반면, Imm1 내지 Imm11은 변성 SPARC에 결합하지 않음을 나타낸다. 또한, 연속 시험에서 Imm14와 mHTI가 변성 SPARC에 결합함을 알았다(데이타에 표시되지 않음).

이들 결과는 선상, 또는 일차, 에피토프를 기초로한 SPARC를 결합할 수 있음을 나타낸다.

이 실시예는 LL/2 루이스 폐암으로 공격받은 무모 마우스의 생존에 관한 소정의 항체 효과를 시험한 생체내 검정의 결과를 나타낸 것이다.

C57BL 숫 마우스(약 6주 나이)의 체중을 측정한 다음, 약 1 x 10⁶ 세포(약 0.1ml)의 LL/2(루이스 폐암)를 25-게이지 침으로 정맥내 주사한다. 최소 10마리의 동물을 그룹당 사용한다. 4주 동안 매 2주, 모든 그룹의 각 동물에 200μg/마우스의 시험 항체 또는 마우스 IgG를 받게 한다. 이들 시험 물체/항체를 복부내 주사를 통하여 25-27 게이지 침으로 복강에 투약한다. 제일 투약량은 종양 세포 주사의 30분내에 투여한다.

동물은 종양세포 주사전에 무게를 측정하고 투약전에 매 2주 측정한다. 모든 동물을 사망율/이병율에 대하여 2일마다 측정한다. 실험 끝에, 마우스는 죽고, 일차 종양과 폐는 제거되고, 고정되고 포매된다. 안락사한 동물과 사후 경직전에 죽은 소정의 동물을 부검한다. 모든 동물에서 혈장과 폐를 수집하고 종결시에 무게를 측정한다. 폐에 10% 중성 완충 포르말린을 주입한 다음 이에 침지시킨다. 부가적으로 육안적 및 조직병리학적 분석을 위하여 조직을 저장한다.

동물에 mHTI, Imm12 또는 Imm14를 투여한다. 음성 대조그룹에 mlgG를 투여한다. 항체를 PBS에서 제조하고, 4주 동안 2주마다 200μg/마우스의 투약량을 투여한다. 이때 동물의 생존을 20일 이상 기록한다.

mHTI로 처리된 동물이 더 높은 퍼센트로 Imm12 또는 Imm14로 처리된 동물보다 여러시간 포인트에서 생존했다. 도 15에 표시된 바와 같이, mHTI만이 마우스, P=0.02 대 마우스 대조 IgG, 로그 등급 통계치에서 폐 전이를 억제하는 효과가 있었다. 예상된 바와 같이, 마우스 SPARC는 인식하지 않지만, 사람 SPARC는 인식하는 Imm12와 Imm14는 폐 LL/2 전이를 억제하지 않았다. 도 16에 표시된 바와 같이, Imm12와 Imm14는 특히 사람 SPARC에 결합하고 마우스 SPARC에는 결합하지 않는 반면에, mHTI는 두 마우스와 사람 SPARC에 결합할 수 있다.

이러한 결과는 mHTI에 의한 마우스 SPARC의 특이적 억제가 마우스에서 동계의 LL/2 세포의 정착 과/또는 성장 억제를 가져옴을 나타내고 mHTI 또는 이들의 인간 버전이 암처리에 유용함을 나타낸다.

이 실시예는 두 평행 상Ⅱ 임상시험(코호트)으로 이루어지는 연구를 설명하여 비절제성 단계Ⅳ 악성 흑색종을 갖는 환자에게서 카르보플라틴과 nab-파클리탁셀(Abraxane^®, 또는 ABI-007로 표시) 조합의 항-종양 활성 안전성 프로필을 평가한다.

코호트 1은 화학요법으로 선처리된 환자로 구성되고 코호트 2는 새롭게 진단되고 화학요법 미경험을 갖는 환자로 구성된다.

여기에 표시된 데이타는 North Central Cancer Treatment Group (NCCTG)을 통하여 행한 다수-협동 학회 그룹 연구에서 나온 것이다. 이 연구는 모든 참여 학회의 학술적 논문지로 승인된다. 적격의 환자는 비절제성, 조직학적으로 확인된, 단계Ⅳ 흑색종을 갖는 18세 나이 또는 그 이상일 때이다. 부가적 적격성 기준에는 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST), 0.2의 Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)활동도, 3개월 또는 그 이상의 평균 수명, 적당한 혈액학적 및 간 기능, 최종 화학요법 치료(코호트 1에서만) 이후 4주 또는 그 이상, 방사선 요법 또는 면역요법에 의하여 정의되는 측정가능한 질병이 포함된다. 배제기준에는: 백금 또는 탁산으로 소정의 선처리(코호트 1과 2), 전이 질병에 대한 소정의 선처리(코호트 2), 확성 감염, 뉴욕 심장 협회 클라스 Ⅲ 또는 Ⅳ, 등급 2 또는 그 이상의 말초 신경장해, 지난 5년간 기타 악성(경부의 원위치에서 비-흑색종성 피부암 또는 암종 제외) 또는 뇌에 비처리된 전이 흑색종 또는 연구 진입 3개월내의 뇌전이 진행이 포함된다.

적격 환자를 30분 이상 정맥내 주입에 의하여 100 mg/㎡의 nab-파클리탁셀로 치료한 다음 최대 8주기 동안 28일 주기 중1, 8과 25일에 30분 이상 2의 표적 AUC(콕크로프트와 고울트 방정식을 갖는 칼버트식과 실제체중에 의하여)로 카르보플라틴(CBDCA)에 의하여 치료한다. 환자가 과도한 독성 또는 진행 질병을 나타내지 않으면, 8주기 이상의 치료는 치료 의사의 판단에 있다. 등록 14일 내에 환자는 완전한 진찰, ECOG PS의 평가, 완전한 혈액 세포 계수(CBC), 락트산 탈수소 효소(LDH)를 포함한 포괄적 대사패널과, 일반적 CT 또는 MRI 또는 나선 CT에 의한 종양 평가받는다. 종양 상태는 RECIST기준을 사용하여 8주마다 평가한다. 각 치료 주기 중 1일에, 절대 호중구 계수(ANC)가 1,500/㎣ 이하이고, 혈소판 계수(PLT)가 100,000/㎣이고, 환자가 등급 2 또는 그 이상의 AST 신경병증, 또는 기타 등급 3 또는 그 이상의 비-혈액학적 독성을 나타내면 치료를 보류한다. 환자가 이들 독성에서 회복되면, 두 제제에서 20% 투약량을 감소하여 치료를 다시 시작한다. 각 치료 주기 중 8 또는 15일에, ANC가 1,000㎣ 이하이거나 PLT가 100,000/㎣ 이하이거나 또는 환자가 등급 2 또는 그 이상의 신경병증 또는 등급 3 또는 그 이상의 비-혈액학적 독성을 나타내면, 치료를 생략한다. 독성이 4주 내에 수용할 수 있는 수준으로 회복되지 않거나 또는 환자가 독성으로 인하여 세번째 투약량 감소를 요구할때 연구치료는 종결한다. 모든 환자는 치료의사의 판단하에 진토제, 항생물질, 혈액/혈소판 수혈, 적혈구 조혈과 콜로니 자극 인자를 포함한 표준 지지 의료를 받는다.

35명의 환자는 코호트 1로 자연증가하고, 41명의 환자는 2006,11,15과 2007,07,31 사이에 코호트 2호로 자연증가한다(표 2). 코호트(PT)에서 1명의 환자는 동의서 서명 후 치료 시작 전에 참여를 취소했다. 이와같이 연구 코호트 1은 연구 치료를 시작한 34명의 환자(67.6% 남성)로 구성된다: 등록시에 중간 나이는 60세 이었다(28~84세 범위의 나이): 코호트 2(CN)에서, 2명의 환자는 동의서 서명 후 치료 시작 전에 참여를 취소했다. 이와같이, 연구 코호트 2는 연구 치료를 시작한 39명의 환자(59.0 남성)로 구성된다. 등록시에 중간 나이는 59세이다(23~91세 범위의 나이).

코호트 1에 있어서, 투여되는 주기의 중간수는 4주기이다(전체:135주기, 범위 1-10), 21명의 환자(61.8%)는 치료 8일 또는 15일에 치료를 생략했거나 최소한 하나의 투약량 감소를 가졌다. 이것은 주로 심한 호중구 감소, 피로와 신경병 때문이다. 연구 중지의 주 이유는 질병의 진행이었다(27명의 환자).

코호트 2에 있어서, 투여되는 주기의 중간 수는 4주기 이다(전체:193주기, 범위:1-25), 25명의 환자는 치료 8 또는 15일에 치료를 생략하거나 또는 심한 호중구 감소와 신경병으로 인하여 크게, 최소한 하나의 투약량 감소를 가졌다. 연구 중지에 대한 첫째 이유는 질병의 진행이었다(27명의 환자).

혈장 SPARC의 예후 이용성은 환자를 "고" 및 "저" 그룹으로 등급별로 분류하여 평가한다. 혈장 SPARC에 대한 중간이 431ng/ml이므로, 고 SPARC 그룹은 431ng/ml 이상의 혈장 SPARC를 갖는 환자로서 정의된다. 환자 개체군의 붕괴는 표 2에 표시했다. 1명을 제외하고, 그 결과는 전 화학요법 그룹에서 OS 만이 통계적으로 우수하다고 할지라도(P=0.01) "고 SPARC" 환자들은 그들의 "저 SPARC" 대응자 보다 더 불량한 진행 무 생존(PFS)과 전체 생존(OS)을 갖는 경향이 있음을 나타낸다.

	중간	P-값	N
진행 무 생존
전 화학요법 그룹		0.21	31
저 SPARC	141일		17
고 SPARC	58일		14
비-전 화학요법 그룹		0.47	35
저 SPARC	122일		16
고 SPARC	167일		19
전체 생존
전 화학요법 그룹		0.01	31
저 SPARC	378일		17
고 SPARC	206일		14
비-전 화학요법 그룹		0.43	35
저 SPARC	426일		16
고 SPARC	304일		19

전체 반응율은 두 코호트(25.6% 대 8.8%)사이에서 현저하게 차이가 있는 반면에, 진행 무 생존 또는 전체 생존의 차이는 없었다(도 17A-B). 전체적으로, 치료는 주 독성이 구역, 구토, 말초 신경병증과 혈구감소증(호중구감소증, 트롬보혈구감소증, 백혈구감소증)인 것으로 적당히 잘 관용된다.

이들 결과는 낮은 순환 SPARC 수준이 개량된 전체 생존과 연관된다. 더불어 nab-파클리탁셀과 카르보플라틴의 조합은 사전 치료 아니면 화학요법 미경험인 전이 흑색종을 갖는 환자에게 적당한 치료적 선택이다.

이 실시예는 전이 흑색종 환자와 건강한 개인으로부터 유도된 시료에서 혈장 SPARC 농도의 평가를 기술한 것이다.

ELISA 플레이트는 0℃하에 하룻밤 50mM 탄산염 완충제에서 2.5μg/㎖ SPARC 결합 다클론 항체(R&D Biosystems, Minneapolis, MN)로 피복한다. 플레이트를 PBS 0.1% Tween 20 (PBST)로 4회 세척하고 실온(RT)에서 2시간 동안 카제인 차단/희석 완충제(Thermo Fisher Scientific Inc., IL)로 차단한다. SPARC 표준 곡선의 발생에 있어, 공지된 농도의 사람 혈소판 SPARC 단백질(Hematologic Technologies, Essex junction, VT)을 SPARC 음성 10% 푸울 정상 사람 헤파린 혈장(PNHP)을 함유하는 차단/희석 완충제로 희석한다: 시험전, 환자 시료를 차단/희석 완충제로 1/10 회석한다. 차단 용액을 제거한 후 PBST로 세번 세척하고, 표준 및 희석된 혈장 시료를 100㎕/웰 복제물로 ELISA 플레이트에 놓고 실온(RT)에서 2시간 동안 배양한 다음, PBST로 세번 더 세척한다. 결합된 SPARC의 검출에 있어, 차단/희석 완충제에서 100㎕의 0.5㎕/㎖ 바이오틴일화 항 SPARC 단클론 항체(R&D Biosystems, Minneapolis, MN)를 가하고 RT에서 1시간 동안 배양한 다음 PBST로 세번 세척한다. 다음 100㎕/웰의 1:20000 희석 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화 효소(HRP)를 가하고 RT에서 1시간 동안 배양한다. PBST로 세번 세척한 후, 100㎕의 HRP-기질 TMB(KPL #52-00-03)를 각 웰에 가하고 650nm에서 OD를 감시한다. 2N 황산으로 OD 0.6 내지 0.8에서 측정하기 위하여 반응을 중지한다. 웰들의 광학 밀도를 30분내 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices; Sunnyvale, CA)로 판독한다.

건강한 개인에서 유도된 20 시료 전체에서 나온 결과를 도 18에 표시된 65명의 암 환자 혈장 시료에서 나온 결과와 비교한다. ELISA 결과의 분석은 두 그룹의 SPARC 농도에서 통계적으로 현저한 차이를 나타낸다. 건강한 개인의 SPARC 수준은 192ng/㎖의 중간 농도에서 측정하고 암 환자 시료의 중간 혈장 SPARC 농도는 390ng/㎖(P값 0.0002)에서 측정한다(도 18). 부가적으로, 치료로 대부분의 환자에서 혈장 SPARC의 현저한 강하가 따른다(도 19).

이러한 결과는 전이 흑색종 환자의 증가된 SPARC 발현을 나타내고 종양 고통과 양성적으로 서로 관계될 수 있다.

이 실시예는 SPARC 미세 환경 시그니처(SMS)의 제조를 나타낸다.

SPARC에 대한 항체 시리즈를 정상 및 종양 조직의 범위에서 이들의 결합 특징에 대하여 평가한다. 종양의 여러가지 성분에서, 항체 염색에 의하여 측정된, SPARC 발현 패턴은 종양세포, 혈관, 섬유아세포, 스트로마, 염증성 세포와 인접한 정상 조직의 SPARC 발현 수준을 포함하여 측정된다. 두 항체를 SPARC에 대한 부분적 친화성을 동정하고 연구에 따라 사용한다. 특히, 염색 패턴은 단클론 항체("항체 M")(SPARC 단클론항체(R&D Systems, Minneapolis, MN), 카달로그 # MAB941 Lot # ECH045011, 트리 기재 희석제로 1:100 희석)와 다클론 항체("항체 P")(SPARC 다클론 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN, 카달로그 # AF941 Lot # EWN04 트리 주재 희석제로 1 : 50희석)를 사용하여 측정한다.

종양의 조직학적 절편을 슬라이드상에서 제조하고 표준 항체 염색 프로토콜을 사용하여 염색한다. 주로, 포름말린-고정, 파라핀-포매된 종양 블록에서 조직 코어(블록당 가장 대표적인 부분으로부터 2코어)를 배열하여(Beecher Instruments, Silver Spring, Md) 각 2.0mm로 측정한 코어의 조직 미량 배열을 만들고 양전하 슬라이드에 놓는다. 표본을 갖는 슬라이드를 1시간 동안 60℃ 오븐에 넣은 다음, 냉각하고, 탈파라핀하고, 크실렌을 재수화하고 에탄올 수용액으로 전환되게 한다. 모든 슬라이드를 자동 염색 장치(Dako Cytomation Autostainer, Dako, Carpinteria, CA)를 사용하여 염색한다.

모든 슬라이드를 3% 과산화수소 수용액에서 5분 동안 급냉하여 내생 과산화효소를 차단한다. 완충제를 세척한 후, 슬라이드를 30분 동안 항체 M 또는 음성 대조 시약으로 배양한다. 마우스 양고추냉이 과산화 효소 중합체 키트(Mouse MACH 3 HRP Polymer Kit, Biocare Medical, Concord, CA)를 시약당 20분 동안 배양한다. 다른 완충제를 세척한 후, DAB 색소생산균(Dako, Carpinteria, CA)을 10분 동안 사용한다. 헤마톡시린을 사용하여 슬라이드를 대비염색한다. 시약당 15분 동안 배양되는 아비딘-바이오틴 검출 키트(Biocare Medical, Concord, CA)를 HFP 검출 키트 대신에 사용하더라도, 항체 P를 갖는 항체 염색 표본에 동일한 프로토콜을 사용한다.

종양 시리즈에서 SPARC 발현의 상세한 병리학적 평가는 광범위하게 증명되는 병리학자가 행한다. 면역조직화학에 의하여 측정된 SPARC 발현 수준은 다른 종양 성분으로 설정한다. 스코어는 통상적으로 이 분야에서 행하고 있고 이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 0-3의 스케일로 SPARC 발현 수준으로 설정되며, 3이 가장 양성 스코어이다.

다클론 항체가 섬유아세포에서 바람직한 염색을 나타낸다. 반면에 단클론 항체는 종양세포의 SPARC를 바람직하게 염색한다.

로지스틱 재회귀와 위험율 비례를 사용하여 SPARC 패턴에 대한 반응, 진행-무 생존("PFS")와 전체 생존("OS") 사이의 상호관계를 측정한다.

종양 세트 중 하나는 비절제성 단계Ⅳ 흑색종을 갖는 환자에게서 카르보플라틴과 nab-파클리탁셀(ABI-007)의 상Ⅱ 시험을 뜻한다: 특히, nab-파클리탁셀(100mg/㎡)과 카르보플라틴(AUC2)은 28일 주기 중 1, 8과 15일에 투여한다. 종양 생검의 SMS를 사용하여 두 균주군, 고위험(균주군 1)과 저위험(균주군 2)으로 환자를 그룹으로한다. 표 3과 도 20A-B에 표시된 바와 같이, 고위험과 저위험 SPARC 시그니처는 진행-무 생존과 전체 생존과 상호관계를 갖는다.

	중간PFS(월)	6개월에서 PFS %	중간 OS(월)	12개월에서 OS%
균주군 1(고위험)	3.7	17%	9.4	37%
균주군 2(저위험)	6.6	67%	17.7	67%

이 결과는 SPARC 미세환경 시그니처 단독으로 진행 무 생존과 전체 생존에 관한 저위험과 고위험 그룹 사이를 판별할 수 있음을 나타낸다.

이 실시예는 SPARC 미세환경 시그니처와 혈장 SPARC 수준 사이의 상호관계 분석을 기술한 것이다.

상기 실시예 5와 7에서 기술한 바와 같이, 혈장 SPARC 수준과 SMS를 분석하고 그 결과를 조합하여 환자 결과에 대한 상호관계를 측정한다.

도 21에서 볼 수 있는 바와 같이, 기준선 혈장 SPARC는 SMS 고위험과 SMS 저-위험 그룹 사이에서 유사하다. 기준선 혈장 SPARC와 SMS 고위험 대 저위험을 기초로하여 환자를 0.1 또는 2의 위험 수준을 갖는 것으로 코드화한다. 0의 위험 수준은 SMS 저위험을 갖는, 낮은 기준선 혈장 SPARC로서 동정한다. 1의 위험 수준은 높은 기준선 혈장 SPARC 또는 SMS 고위험으로 동정한다. 2의 위험 수준은 높은 기준선 혈장 SPARC과 SMS 고위험으로 동정한다. 전체 생존과 진행 무 생존에 대한 데이타는 다음 표 4에 표시했다.

	중간 진행 무 생존 (월)	6개월에서 진행 무 생존 %	중간 전체 생존 (월)	12개월에서 전체 생존 %
0 위험	6.1	50%	14.1	50%
1 위험	4.1	21%	14.4	53%
2 위험	3.6	25%	9.5	33%

도 22A-B에서 볼 수 있는 바와 같이, 결과가 2위험 그룹에서 환자의 진행 무 생존에 현저한 차이가 없드라도, 위험 수준 증가를 갖는 불량한 진행 무 생존과 전체 생존의 일반적 경향을 갖는다.

이들 결과는 높은 혈장 SPARC와 고-위험 SMS를 환자가 상당히 불량한 전체 생존을 갖는 것을 볼 수 있다.

이 실시예는 SPARC가 소정의 화학요법의 효과를 부정하는 것을 나타내는 종양 이종이식 검정을 기술한 것이다.

체중이 약 20g인 5와 6주 사이의 나이를 갖는 암컷 및 수컷 무흉선 NCr-nu 마우스를 Harlan, Inc(Madison, Wisconsin, USA)에서 구매한다. 사람 암 세포 HT29(결장), PC3(전립선)과 MDA-MB-231(유방)을 세포 배지에서 번식시키고, 암컷(MDA-MB-231과 HT29) 또는 수컷(PC3 전립선 종양), 무모 마우스의 옆구리당 일백만세포로 피하에 접종하고 처리 시작 전 약 60-100㎣로 성장시킨다. 처리에는 외생적으로 투여되는 SPARC를 갖거나 갖지 않는 5-플루오로우라실(5FU), 도세탁셀(Taxotere^®), 알부민-결합 파클리탁셀(nab-파클리탁셀), nab-파클리탁셀 플러스 순티니브(Sutent^®), 또는 nab-파클리탁셀 플러스 베바시주마브(Avastin^®)가 포함된다. 각 이종이식에 대한 대조 동물에 PBS를 투여한다. 가장 긴(길이)와 가장 짧은(폭) 종양 직경(밀리미터)와 종양 깊이를 매주 두번 측정한다. 종양 체질은 식: 종양체적(㎣)= 폭×길이×깊이로 계산한다. 종양 성장 억제(TGI)는 대조 동물의 안락사 시간에 대조 그룹과 비교한 종양 체적 감소의 퍼센트로 정의한다. 종양 배가 시간은 이중 두배로 종양 체적에 요구되는 시간으로 정의한다. 동물 무게는 매주 두번 측정한다. 통계적 분석을 프리즘 프로그램(GraphPad, San Diego, California, USA)을 사용하여 행한다. 변화 분석(ANOVA)통계를 사용하여 종양 성작 곡선을 비교한다.

SPARC 투여의 충격은 5-플루오로우라실로 처리하여 평가한다. HT29 결장암 이종이식 모델에서, 5-FU는 체중 감소 없이 종양 성장(TGI 89.8%, P < 0.0001 대 염수)억제에 효과적이다. 도 23A에서 볼 수 있는 바와 같이, SPARC의 투여는 4, 6과 8mg/kg 투약량 수준(P = 0.003 대 5-FU 아암, 윌콕선 등급 총 시험)에서 각 50.8%, 47.4%와 10.4%의 TGI를 가져오는 5-FU 항종양 활성의 억제에 따른 투약량의 원인이 된다. SPARC 단독은 적당한 항종양 활성(35.4%; NS)을 갖는다. 유사한 결과를 도세탁셀에서 얻는다(도 23B).

또한 SPARC 투여 충격은 3주기 동안; 매 4일, 15mg/kg으로 nab-파클리탁셀과 조합한 동일한 HT29 이종이식 모델에서 평가한다. 항혈관 형성제 순티니브(Sutent^®)와의 조합은 nab-파클리탁셀(TGI >100% 대 94.8%, P = 0.015 대 nab-파클리탁셀 단일요법, 윌콕선 등급 총 시험)을 상당히 강화시킨다. 대조적으로, SPARC의 투여는 nab-파클리탁셀 항종양 활성(TGI 84.8% 대 94.8%, P = 0.007 대 nab-파클리탁셀 단일요법, 윌콕선 등급 총 시험)을 상당히 감소시킨다. 더욱 중요하기로는, 외생적 SPARC는 순티니브와 nab-파클리탁셀(TGI 52.3% 대 >100% (후일-51), P = 0.006 대 nab-파클리탁셀 플러스 조합 아암, 윌콕선 등급 총 시험)의 상승 작용을 크게 파괴한다(도 24A). na-파클리탁셀 플러스 순티니브 와/또는 SPARC로의 처리는 내견적 중량 손실을 충분히 보여준다. 유사한 것으로 베바시주마브 단독은 현저한 TGI(75%, P < 0.001)을 유도한다. 그러나, nab-파클리탁셀의 항종양 활성이 이 실험에서 베바시주마브에 의하여 강화되더라도, SPARC로의 처리는 nab-파클리탁셀/베바시주마브 조합에 관한 최소의 음성 충격만 가져온다(도 24B). nab-파클리탁셀 플러스 베바시주마브 와/또는 SPARC로의 처리는 내견적 중량 손실을 충분히 보여준다.

이러한 소견은 MDA-MB-231 유방암 이종이식(도 24C)과 PC3 전립선암 이종이식(도 24D)에서 더 확인된다: 이들 검정에서, nab-파클리탁셀과 순티니브 또는 nab-파클리탁셀과 베바시주마브의 조합으로 관찰되는 항종양 효과는 SPARC(P < 0.001, 도 24C와 도 24D)의 투여에 의하여 현저하게 억제된다. 이들 실험에서, nab-파클리탁셀은 다섯주기 동안 매일, 10mg/kg으로 부차적으로 최선으로 투약된다.

이들 데이타는 외생적 SPARC가 종양 성장을 촉진하고 nab-파클리탁셀, 도세탁셀과 5-플루오로우라실과 같은 화학요법제의 치료적 이점을 부정함을 나타낸다.

이 실시예에서, SPARC의 혈관 형성 행위는 두 생체외 검정으로 이를 연구했다.

첫째, 발아에 관한 SPARC의 효과를 Nakatsu 등(Methods Enzymol. 443:65-82 (2008))에 의하여 기술된 사람 탯줄코드 정맥 내피세포(HUVEC)를 사용하여 제조한 생체외 혈관형성 모델계에서 연구했다. 10% FBS(Gibco, Carlsbad, CA)로 보충된 Ml 99 배지에서 낮은 계대 HUVEC성장을 비드화 2일전에 EGM-2 배지(Clonetics, Walkersville, MD)로 스위치한다; 시토덱스 3 미세 담체 비드(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 수화하고 PBS(pH 7.4)로 세척한다; l×lO⁶ HUVEC 세포를 피복하는 동안 37℃에서 4시간 동안 EGM-2 배지에서 2500의 수화되고 살균된 비드로 배양한다. 다음 피복된 비드를 500비드/㎖의 농도로 0.15units/㎖ 아프로티닌을 갖는 PBS에서 2mg/㎖ 섬유소원에 포매한다. 다음 0.625units/㎖ 트롬빈을 가하고 0.5㎖의 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰에 가한다. 용액을 5동안 실온에서 다른 15분 동안 37℃에서 응괴한다. 응괴 후 EGM-2 배지에서 20,000 폐 섬유아세포를 각 웰에 접종한다. PBS의 1, 10 또는 100μg/mL Biol SPARC 단백질 아니면 단백질이 없는 PBS를 성장 배지에 가하고, 발아를 광학 현미경으로 평가할 때까지 배양물을 5일 동안 유지한다. 배양물에서 형성된 튜브/비드의 수와 발아 HUVEC 세포의 형태를 영상 프로 소프트웨어((Media Cybernetics, Bethesda, MD)를 사용하여 측정한다.

이러한 검정 결과는 SPARC로의 처리가 방법에 따른 투약량에서 발아를 유도함을 나타낸다(도 25). 1μg/mL에서 50% 이하의 접종된 HUVEC/비드가 발아를 나타낸다. 10 또는 100μg/mL SPARC의 첨가는 각각 0.9 또는 1.9 발아/비드의 평균치를 가져오는 반면에 SPARC가 없는 배양물의 평균 발아수는 약 0.5 이하의 발아/비드를 유지한다.

다음 세관 제제에서 SPARC의 효과는 세포작용 사람 안지오키트 모델 키트(TCS-ZHA-1000, TCS Cell Works Buckingham, UK)를 사용하여 시험한다. 이 검정에서, 내피 세포가 배지 내에서 최초로 작은 섬을 형성한다. 이들은 증식을 계속적으로 시작한 다음 이들이 기질로 이동하여 실같은 세관 구조를 형성하는 동안 이동상으로 들어간다. 이들은 점차적으로 합류하여(9-11일) 모세층과 거의 유사한 융착 튜브의 네트워크를 형성한다.

초기 단계 공동-배양물(2-3일)을 함유하는 24-웰 선-접종 내피 세포조직 배양 플레이트를 제조자의 권유사항(TCS Cell Works, Buckingham, UK)에 따라 사용한다. 배양물을 11일 동안 37℃/5% C0₂에서 배양한다. 배양물에서 배지를 부가된 시험에서 변경하고 최초 처리 후 4, 7과 9일에 화합물을 대조한 다음, 11일에 70% 에탄올로 고정한다. 고정된 배양물을 연속적으로 다음과 같이 염색한다: 일차 토끼 항-CD31 항체(Thermo Scientific)를 PBS/1% BSA 차단 완충제에서 2μg/mL의 최종 농도로 희석한다. 다음 0.5mL의 희석된 항-CD31 항체를 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양물을 세번 PBS로 세척한 후 AP 접한 이차 항체(Thermo Scientific, 1μg/mL)를 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS와 물로 광범위하게 세척한다. 형성된 세관물을 노출시키기 위하여, 0.5mL의 1단계 NIB/BCIP용액(Thermo Scientific)을 웰마다 가하고 염색이 완료될 때까지 배양한다. 다음 반응을 물로 정지시킨다.

형성된 세관물의 수와 길이를 광학 현미경으로 평가한다. 세관 발생의 비교는 AngioKit(TCS Cell Works, Buckingham, UK)를 사용하여 생성된 영상의 분석에서 특별히 발생되는 "AngioSys" 영상 분석 시스템을 사용하여 행한다. 분석 소프트웨어에 의하여 포착된 염색된 세관은 단일 화소 폭으로 감소된다. 그러므로 주어진 관찰 분야에서 화소의 총수는 세관의 길이를 나타낸다. 이러한 데이타로, 평균 세관 길이, 표준 편차와 변이 계수를 계산할 수 있다. 전체 혈관수, 전체 세관 부분과 분지점의 수를 비슷하게 측정할 수 있다.

도 26에 표시된 바와 같이, 이 시스템에서, SPARC는 이상성 혈관 형성 활성을 나타낸다. 이러한 결과는 SPARC의 낮은 농도(1과 10㎕/㎖), 특히 10μg/㎖의 농도는 혈관 형성을 모의할 수 있으며, SPARC의 높은 농도(100μg/㎖)는 혈관 형성을 현저하게 억제함을 나타낸다.

이러한 두 검정 결과는 소정의 농도에서 최소한 순환 SPARC 활성이 혈관 형성을 모의함을 나타낸다.

이 실시예는 MDA-435 전이 모델에서 종양 진행에 관한 외생 SPARC와 nab-파클리탁셀의 효과를 예시한 것이다.

약 20g 무게를 갖는 5와 6주 사이의 나이인 암컷과 수컷 무흉선 NCr-nu 마우스를 Harlan, Inc(Madison, Wisconsin, USA)에서 구매한다. MDA-MB-435-Luc+를 50% 매트리겔에서 4x10⁶ 세포로 포유류 지방 패드(MFP)에 정소 이식하고 180㎣의 평균 종양 체적에 도달한 후 처리한다. 처리는 2주기의 10mg/kg nab-파클리탁셀, 4mg/kg SPARC와, 이주마다 베바시주마브로 한다. 적당한 시간 간격으로, 다음 기관을 전이 정량으로 수집한다: 근위 림프절, 대측 림프절, 폐, 간과 뇌 사용되는 통계적 시험에는 t-시험과 Whitney-U가 포함된다.

마우스를 일주에 2~3회 감시하고 종양 성장을 기록한다. 종양 체적이 180㎣에 도달할 때 마우스를 분류하고, 첫 주기의 처리를 한다. 일곱 잔여일을 첫째 및 두째 주기 사이에 부여한다. 베바시주마브와 SPARC를 잔여 기간 동안 계속하여 투여한다. 연구하는 동안 주기적으로 무게를 측정하여 치료에서 독성 효과를 평가한다. nab-파클리탁셀은 약제를 중단한 후 빠르게 회복되는 최소의 무게 손실을 일으킨다.

다음 투약 계획은 다음과 같다: 대조(그룹 1); 3~5주기 동안 매일 10mg/kg nab-파클리탁셀; 이주마다 정맥내 주사하는 4mg/kg 용해성 SPARC(Bio1)(그룹 3)과; 2~5주기 동안 매일 10mg/kg nab-파클리탁셀 및 4mg/kg SPARC-이주마다(그룹 4)

대조 종양은 43.75 + 5.65㎣/일의 평균체적 증가와 56일에서 1870.6㎣의 최종 체적으로 종양 성장이 고정된다. SPARC 처리 그룹은 23.16 + 4.38㎣/일의 유사한 성장율과 63일에서 1765㎣의 평균 체적을 나타낸다. nab-파클리탁셀 단독 그룹은 18일 종양 퇴행을 가졌고, 이는 76%의 종양 체적 감소를 가져온 후 재성장을 일으켰다. 9마리 마우스 중 다섯은 촉진성 종양을 가지며; 그러나 모두는 22.98 ± 0.89㎣/일의 비율로 739㎣의 최종 평균체적으로 성장했다. 종양의 재성장은 nab-파클리탁셀 처리 정지 6일 후에 일어났다. 29일 동안 지속된 퇴행과 재성장은 136㎣의 최종체적으로 6.10 + 1.16㎣/일으로 일어났다. nab-파클리탁셀+SPARC 그룹은 nab-파클리탁셀 그룹과 비슷하게 일어났다. 처리가 653㎣의 최종체적으로 21.05 ± 2.57㎣/일의 비율로 시작한 후, 두 완성 퇴행이 일어났지만, 재성장은 21일에 일어났다(표 5).

그룹	56일에 종양체적	억제 %	대조물에 관한 P-값	ABX에 관한 P-값
그룹 1-대조물	1775	-	-	-
그룹 2-nab-파클리탁셀	542	76	<0.0001	-
그룹 3-SPARC	1524	35	ns	-
그룹 4-nab-파클리탁셀+SPARC	487	82	<0.0001	ns

전체 전이 고통을 계산한다. 이는 mg 단백질마다 정상화된 RLU에서 발현된 조직 추출물의 측정된 루시페라아제로서 표시한다. 모든 대측 림프절은 모든 그룹에 있어 음성이었다. 근위 림프절, 간과 뇌에서 일어난 전이의 발생 빈도는 소수이었다. 근위 림프는 대조 그룹에서 12 동물 중 2에서 전이를 나타냈다. 간 전이는 두 대조물과 SPARC 그룹에서 어느 정도 자주 일어났다(각 그룹에서 3 마우스에 존재). 또한 뇌 전이를 갖는 대조 마우스가 하나 있었다.

대조 그룹은 33840 ± 9176 (N = 12)의 평균 RLU/mg 전체 단백질과 12양성 마우스 중 11을 갖는다. SPARC는 31630 + 10820 (N = 9)의 평균 RLU/mg 전체 단백질과 9양성 마우스 중 9에서 전이에 관한 효과를 거의 갖지 않는다. Nab-파클리탁셀 단독에서는 4722 + 2684 (N= 9), p = 0.015의 RLU/mg 전체 단백질 대 대조물(Student의 t-시험)과 9양성 마우스 중 4만에서 폐 전이에 관한 약간의 효과를 갖는다. nab-파클리탁셀과 공동 투여된 SPARC에서는 10양성 마우스 중 9와 13690 ± 3579 (N = 10), p = ns 대 대조물(Student의 t-시험)에 발생 빈도가 증가했다. 이들 데이타는 순환 SPARC가 nab-파클리탁셀의 항-전이 활성을 부인하는 것을 나타낸다.

순환 혈소판과 대식세포가 높은 수준의 SPARC를 발현하고 혈장 SPARC의 근원일 수 있기 때문에(Sangaletti S. 등, Cancer Res. 68: 9050-9059 (2008); Sangaletti S. 등, J. Exp. Med. 198: 1475-1485(2003)), 이러한 결과는 소정의 환경하에서 실험적으로(즉, 외생적 투여 SPARC에 의하여) 아니면 순환 SPARC의 고유 과발현에 의하여(즉. 종양, 백혈구, 혈소판과 대식세포와 같은 환자의 SPARC 발현기관에 의하여) SPARC를 상승시키고, SPARC는 화학요법의 존재하에 전위 위험을 증가시킨다.

이 실시예는 튜브형성 검정을 사용하여 SPARC의 혈관 형성 행위에서 단클론 SPARC 결합 항체 Imm12, Imm14와 mHTI의 효과를 측정함을 기술한다.

이 검정은 상기 실시예 10에서 기술한 것과 같이 TCS 세포작용, 사람 Angiokit 모델 키트(TCS-ZHA-1000, TCS Cell Works, Buckingham, UK)를 사용하여 행한다. 배지는 10μg/mL의 재조합 사람 SPARC 단백질을 함유한다. 또한 배지는 10μg/mL의 상기 제조한 마우스 SPARC 결합 단클론 항체(Imm12, Imm14, mHTI)중 하나, 또는 대조물(마우스 IgG)을 함유한다.

세관 형성에 관한 SPARC의 효과와, SPARC 결합 단클론 항체에 의하여 작용하는 간섭을 시험하기 위하여, 형성된 세관의 수와 이들의 길이를 광학현미경으로 평가한다.

이 검정의 결과는 도 28에 표시했다. 배지에서 SPARC의 존재는 다수의 긴 세관의 형성을 가져온다. 이러한 결과로 이 모델 시스템에서 SPARC의 선-혈관형성 효과를 확인한다. 그러나, 3항-SPARC 항체 중 어느 것을 첨가하면 이 효과의 억제를 가져온다. Imm12 또는 Imm14 단클론 항체의 존재에서 매우 짧은 세관의 매우 적은 형성만이 관찰되었다. 배지에 mHTI를 첨가하면 튜브형성의 거의 완전한 억제를 유도한다.

이러한 결과는 SPARC 결합 항체 Imm12, Imm14와 mHTI가 SPARC의 혈관 형성-자극 효과를 극복할 수 있음을 나타낸다.

이 실시예는 mHTI, Imm12와 Imm14가 생체내 동물 모델의 종양 부위에 위치하지 않음을 나타낸다.

피하 HT29 결장 이종이식으로 이식된 무모마우스를 200ug/마우스의 투약량으로 Alexa 680 형광 염료로 표지한 Imm 시리즈 항체로 처리한다. 표지된 Imm 항체를 염수에서 제조하고 1일 정맥내에 투여한다. 형광 신호를 36일 과정 이상으로 이들 마우스에 보낸다.

이러한 연구 결과는 도 29에 표시했고, 여기서 mHTI("HTI"로 표지), Imm12와 Imm14는 이 모델에서 종양 부위에 위치하지 않는 반면에, Imm2는 위치함을 나타낸다.

여기에서 인용된, 공보, 특허출원과 특허를 포함한, 모든 참고 문헌은 각 참고 문헌이 개별적으로 특별하게 표시되어 참고적으로 혼입되고 그들이 전체가 여기에 설명되는 것과 같이 동일한 범위로 여기에 참고적으로 혼힙된다.

이 발명을 기술한 문맥에서(특히 다음 특허 청구 범위의 문맥에서) "a" 및 "an"과 "the"와 유사한 지시 대상의 용어 사용은 여기서 다른 표시가 없거나 문맥에 분명한 부인이 없는 한 단수와 복수를 둘 다 커버 하는 것으로 해석된다. "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)"이란 용어는 다른 언급이 없는 한 제한 없는 용어(즉, "포함하나 이에 한정되지 않는(including, but not limited to)"의 의미)로 해석된다. 여기에서 값 범위의 기술은 다른 언급이 없는 한, 범위에 들어가는 각 분리된 값으로 개별적으로 나타내는 속기 방법으로 단지 표시하고자 하는 것이고 각 분리된 값은 여기서 개별적으로 열거된 것과 같이 명세서에 혼입된다. 여기에 기술된 모든 방법은 여기에 다른 언급이 없거나 문맥에서 다른 분명한 부인이 없으면 어떠한 적당한 순서로 행할 수 있다. 여기에서 제공된 소정의 및 모든 실시예, 또는 예시한 언어(예를들어, "와 같은")의 사용은 다른 청구가 없는 한, 이 발명을 단지 더 좋게 예시한 것이고 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 명세서의 언어는 발명의 실시에 필수적인 소정의 특허 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 않된다.

이 발명의 바람직한 구성은 발명을 행하는 발명자에게 알려져 있는 가장 좋은 방법을 포함하여, 여기에 기술되어 있다. 이들 바람직한 구성의 변경은 전술한 설명의 판독에 따라 이 분야의 통상의 숙련자는 분명하게 알 수 있을 것이다. 발명자는 이러한 적당한 변경을 사용하는 숙련자를 예상하고 발명자는 여기에 특별히 기술된 것 이상의 다른 방법으로 발명을 실시하고자 할 것이다. 따라서, 이 발명에는 적용법에서 허용되는 첨부된 특허 청구 범위에 열거된 동등한 주제와 모든 수정이 포함된다. 더우기, 이의 모든 가능한 변경에 있어 상술한 요소의 소정의 조합은 여기 다른 언급이 없거나 문맥에 다른 분명한 부인이 없으면 이 발명에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Abraxis BioSciences, LLC Trieu, Vuong Liu, Xiping Neil, Desai <120> PERIPHERAL BLOOD SPARC BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 708292 <150> 61/351,246 <151> 2010-06-03 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Val Glu Trp Val Lys 1 5 10 15 Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly 20 25 30 Ile Ser Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Phe 35 40 45 Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 50 55 60 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Arg Pro Ala 65 70 75 80 Trp Ser Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 85 90 <210> 2 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Ile 1 5 10 15 Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr 20 25 30 Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 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Trp Ile 20 25 30 Tyr Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala 50 55 60 Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile 65 70 75 80 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 85 90 <210> 11 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Gly Glu Gly Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ile His Trp Tyr Gln Arg Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 20 25 30 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu 50 55 60 Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro 65 70 75 80 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 85 90 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Ala Ser 1 5 10 15 Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Glu Gly Arg 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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser 210 215 220 Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 225 230 235 240 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 245 250 255 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 260 265 270 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 275 280 285 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 290 295 300 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 305 310 315 320 Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 325 330 335 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Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser 210 215 220 Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 225 230 235 240 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 245 250 255 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 260 265 270 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 275 280 285 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile 260 265 270 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 275 280 285 Val Ser Ser Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 290 295 300 Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 325 330 335 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 340 345 350 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly 355 360 365 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 370 375 380 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 385 390 395 400 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 405 410 415 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 420 425 430 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 435 440 445 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 450 455 460 Lys Pro Ser Asn Thr Lys 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Claims

SPARC 결합 항체가 Imm12, Imm14, hHTI 또는 이들의 조합으로 이루어지는 SPARC 결합 항체를 함유하는 조성물.
제1항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 hHTI인 조성물.
제1항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 Imm12인 조성물.
제1항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 Imm12인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
활성제가 SPARC 결합 항체에 결합하는, 활성제를 더 함유하는 조성물.
제5항에 있어서,
활성제가 치료제 또는 진단제인 조성물.
제6항에 있어서,
치료제 또는 진단제를 티로신 키나아제 억제제, 키나아제 억제제, 생물학적 활성제, 생물학적 분자, 방사성 핵종, 아드리아마이신, 안사마이신, 항생물질, 아스파라기나아제, 블레오마이신, 부술판, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카페시타빈, 클로람부실, 시타라빈, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 에포틸론, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노데칸, 로무스틴, 메클로레타민, 머캅토푸린, 메플하란, 메토트렉세이트, 라파마이신(시로리무스), 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 니트로수레아, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카르바진, 리툭시마브, 스트렙토조신, 테니포시드, 티오구아닌, 티오테파, 탁산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 탁솔, 콤브레타스타틴, 디스코더몰리드와 트란스플라티늄, 항-혈관 내피 성장 인자 화합물("항-VEGFs"), 항-표피 성장 인자 수용체 화합물("항-EGFRs"), 5-플루오로우라실과 유도체, 폴리펩티드 톡신, 세포자멸사 유도물질, 요법 감작체, 효소 또는 이들의 활성 단편과 이들의 조합물에서 선택한 치료제인 조성물.
제6항에 있어서,
치료제 또는 진단제가 항체 또는 항체 단편으로 이루어지는 치료제인 조성물.
제8항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편인 IgG, 또는 IgA, 또는 IgD, 또는 IgE, 또는 IgM의 Fc 단편인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 보체 활성화, 세포 매개 세포독성 또는 옵선화, 또는 비만 세포 활성화, 또는 기타 면역반응을 매개하는 조성물.
제6항에 있어서,
치료제 또는 진단제를 플루오로크롬, 방사성제, MRI 조영제, X-선 조영제, 초음파 조영제와 PET 조영제에서 선택한 진단제인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물에 리포솜이 함유되는 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물에 알부민 나노입자가 함유되는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물에 적당한 약학적 담체가 더 함유되는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물을 정맥내 국소, 주사, 흡입, 비강내, 직장 또는 구강을 통하여 환자에게 투여하는 조성물.
SPARC 결합 항체가 Imm12, Imm14, hHTI 또는 이들의 조합인 SPARC 결합 항체를 함유하는 진단적 또는 치료적 유효량의 조성물을 투여하여서하는 동물 질병의 진단 또는 치료방법.
제16항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 hHTI인 방법.
제16항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 Imm12인 방법.
제16항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 Imm14인 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 SPARC 결합 항체에 결합되는 활성제를 더 함유하는 방법.
제 20항에 있어서,
활성제가 치료제 또는 진단제인 방법.
제21항에 있어서,
치료제 또는 진단제를 티로신 키나아제 억제제, 키나아제 억제제, 생물학적 활성제, 생물학적 분자, 방사성 핵종, 아드리아마이신, 안사마이신, 항생물질, 아스파라기나아제, 블레오마이신, 부술판, 시스플라틴, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카페시타빈, 클로람부실, 시타라빈, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱스라족산, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 에포틸론, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노데칸, 로무스틴, 메클로레타민, 머캅토푸린, 메플하란, 메토트렉세이트, 라파마이신(시로리무스), 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 니트로수레아, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프로카르바진, 리툭시마브, 스트렙토조신, 테니포시드, 티오구아닌, 티오테파, 탁산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 탁솔, 콤브레타스타틴, 디스코더몰리드와 트란스플라티늄, 항-혈관 내피 성장 인자 화합물("항-VEGFs"), 항-표피 성장 인자 수용체 화합물("항-EGFRs"), 5-플루오로우라실과 유도체, 폴리펩티드 톡신, 세포자멸사 유도물질, 요법 감작체, 효소 또는 이들의 활성 단편에서 선택한 치료제인 방법.
제21항에 있어서,
치료제 또는 진단제가 항체 또는 항체 단편으로 이루어지는 치료제인 방법.
제23항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편인 IgG, 또는 IgA, 또는 IgD, 또는 IgE, 또는 IgM의 Fc 단편인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 보체 활성화, 세포 매개 세포독성 또는 옵선화, 또는 비만 세포 활성화, 또는 기타 면역반응을 매개하는 방법.
제21항에 있어서,
치료제 또는 진단제를 플루오로크롬, 방사성제, MRI 조영제, X-선 조영제, 초음파 조영제와 PET 조영제에서 선택한 진단제인 방법.
제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물에 적당한 약학적 담체가 더 함유되는 방법.
제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물을 정맥내 국소, 주사, 흡입, 비강내, 직장 또는 구강을 통하여 환자에게 투여하는 방법.
제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
치료적 유효량의 알부민 결합 나노입자 파클리탁셀의 투여를 더 함유하는 방법.
제16항에 있어서,
종양을 구강종양, 인두종양, 소화계종양, 호흡계종양, 골종양, 연골종양, 골전이병, 육종, 피부종양, 흑색종, 유방종양, 생식계종양, 요로종양, 안구공종양, 뇌와 중추신경계종양, 교세포종, 내분비계종양, 갑상선종양, 식도종양, 위종양, 소장종양, 결장종양, 직장종양, 간종양, 담낭종양, 췌장종양, 후드종양, 폐종양, 기관지종양, 비-소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 자궁경관종양, 자궁내분비 선종양, 난소종양, 음부종양, 질종양, 전립선종양, 전립선암종, 고환종양, 음경종양, 방광종양, 신장종양, 신우종양, 요관종양, 머리와 목종양, 부갑상선 암, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병에서 선택하는 방법.
제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
동물이 사람인 방법.
(a) 동물에서 생물학적 시료를 단리하고;
(b) 생물학적 시료에서 SPARC 단백질의 발현을 검출하고;
(c) SPARC 단백질이 치료적 유효량의 항암제와 치료적 유효량의 SPARC 결합 항체를 투여하여 한계 수준 이상으로 존재할 때; 또는 SPARC 단백질이 SPARC 결합 항체 없이 치료적 유효량의 항암제를 투여하여 한계 수준 이하로 존재할 때,
생물학적 시료에서 SPARC 단백질의 양을 정량하여서 하는, 항암제와 SPARC 결합 항체로 동물의 종양을 치료하는 방법.
제32항에 있어서,
SPARC 결합 항체가 Imm12, Imm14, hHTI, 또는 이들의 조합물인 방법.
제32항에 있어서,
생물학적 시료를 체액에서 단리하는 방법.
제34항에 있어서,
체액을 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청과 소변에서 선택하는 방법.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
동물이 사람인 방법.
제32항에 있어서,
종양을 구강종양, 인두종양, 소화계종양, 호흡계종양, 골종양, 연골종양, 골전이병, 육종, 피부종양, 흑색종, 유방종양, 생식계종양, 요로종양, 안구공종양, 뇌와 중추신경계종양, 교세포종, 내분비계종양, 갑상선종양, 식도종양, 위종양, 소장종양, 결장종양, 직장종양, 간종양, 담낭종양, 췌장종양, 후드종양, 폐종양, 기관지종양, 비-소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 자궁경관종양, 자궁내분비 선종양, 난소종양, 음부종양, 질종양, 전립선종양, 전립선암종, 고환종양, 음경종양, 방광종양, 신장종양, 신우종양, 요관종양, 머리와 목종양, 부갑상선 암, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병에서 선택하는 방법.
제32항에 있어서,
화학요법에 또는 항암제를 도세탁셀, 파클리탁셀, 탁산, 백금화합물, 항엽산제, 항대사제, 항유사분열물질, DNA 손상제, 전괴사제, 분화유도체, 항혈관형성제, 항생물질, 호르몬, 펩티드, 항체와 이들의 조합물에서 선택하는 방법.
제32항에 있어서,
치료적 유효량의 혈관 형성 억제제의 투여를 더 함유하는 동물의 치료방법.
제39항에 있어서,
혈관 형성 억제제를 베바시주마브, 순티니브, HKP, IFN-알파, 푸마길린, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 탈리도미드와, 이들의 조합물에서 선택하는 방법.
제32항에 있어서,
화학요법제가 단백질-결합 약제의 입자를 함유하는 방법.
제40항에 있어서,
단백질-결합 약제 입자의 단백질 성분이 알부민인 방법.
제41항에 있어서,
화학요법제가 알부민-결합 파클리탁셀의 입자인 방법.
제32항에 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
SPARC 단백질의 발현을 항체로 검출하는 방법.
제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
SPARC 단백질의 발현을 항체 없이 검출하는 방법.
제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
SPARC 단백질의 발현을 비-항체 SPARC 결합 분자로 검출하는 방법.
제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
SPARC 단백질의 발현을 SPARC 결합 분자를 사용하지 않고 검출하는 방법.