CN106501517B - 检测血清中sparc蛋白的物质在制备筛查肝细胞癌试剂盒中的应用 - Google Patents

检测血清中sparc蛋白的物质在制备筛查肝细胞癌试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测SPARC蛋白浓度的物质的新用途。本发明所提供的新用途为用于检测SPARC蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助筛查肝细胞癌产品中的应用。实验证明，SPARC蛋白可作为肝细胞癌的肿瘤标志物；在以正常人为筛查对象的情况下进行筛查，判定为HCC患者的灵敏度为82％、特异度为93％，AUC为0.89；在以LC患者为筛查对象的情况下进行筛查，判定为HCC患者的灵敏度为62％、特异度为86％，AUC为0.73；SPARC蛋白可用于诊断AFP阴性肝癌；SPARC蛋白还可与AFP联合用于在正常人或LC患者中筛查或辅助诊断HCC。

Description

检测血清中SPARC蛋白的物质在制备筛查肝细胞癌试剂盒中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测血清中SPARC蛋白的物质在制备筛查肝细胞癌试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和死亡率，每年约650 000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该病多发于东南亚，其中约有50％以上发生于中国。肝细胞癌的发生情况是一个多因素、多阶段的过程，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是重要的高危因素，有乙型肝炎背景的肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者是可能发展为肝癌的高危人群。目前肝细胞癌5年生存率较差，肝细胞癌的早期筛查，尤其是肝硬化患者高危人群中筛查早期肝癌患者，及时采取治疗措施，可提高继发于乙型肝炎病毒感染的肝细胞癌患者的生存率。
目前HCC临床诊断与病情监测等仍主要依赖于B超等影像学检查联合血清标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平的检测。而AFP作为目前HCC诊断和病情监测一个最主要的生物标志物，其灵敏度仍不理想。所以，寻找灵敏的肝细胞癌血清生物标记物，尤其可应用于AFP阴性的肝癌患者，对于诊断肝细胞癌非常重要。
SPARC蛋白是一种糖蛋白，通过与胞外基质和细胞因子相互作用调节细胞生长。SPARC蛋白与肿瘤的发生发展关系密切，有研究表明SPARC蛋白在HCC组织中过表达(LeBail,B.et al.Osteonectin/SPARC is overexpressed in human hepatocellularcarcinoma.J Pathol.1999)。然而每种蛋白在外周血和组织中表达水平的关系非常复杂，无法简单地从组织中的表达水平推导出其在外周血中的表达水平，甚至有时候两者的表达水平会完全相反。例如有研究报道liver carboxylesterase 1(CES1)蛋白在肝癌患者组织中显著下调，而在肝癌患者血清中该蛋白显著上调(Na,K.,et al.,Human livercarboxylesterase 1outperforms alpha-fetoprotein as biomarker to discriminatehepatocellular carcinoma from other liver diseases in Korean patients.Int JCancer,2013)。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质的用途。
本发明提供的检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用。
本发明还提供的检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌产品中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述肝细胞癌具体为继发于HBV感染的有肝硬化背景的肝细胞癌。
所述SPARC蛋白为人SPARC蛋白。
上述应用中，所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质包括检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂和仪器。
上述应用中，所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂包括SPARC蛋白抗体。
本发明第二个目的是提供检测血清或血浆中SPARC浓度的物质和检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度的物质的用途。
本发明提供了检测血清或血浆中SPARC浓度的物质和检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用。
上述应用中，所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质包括检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂和仪器；
或，所述检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度的物质包括检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度所需的试剂和仪器。
在本发明的一个实施例中，检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度所需的试剂为AFP化学发光法试剂盒，仪器为罗氏全自动电化学发光免疫分析仪。
上述应用中，所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂包括SPARC蛋白抗体。
本发明第三个目的是提供一种筛查或辅助诊断肝细胞癌产品。
本发明提供的产品，其包括上述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质。
在本发明的一个实施例中，所述用于检测SPARC蛋白浓度的物质为SPARC蛋白抗体，具体为ELISA所用SPARC抗体(R&D Systems公司，货号：DSP00)。当然，也可以为其它类型的抗体或是其它可用于检测SPARC蛋白浓度的物质。
在本发明中，所述产品的筛查或诊断对象是肝硬化(LC)患者或健康人。
在本发明的一个实施例中，所述肝硬化(LC)患者具体为HBV感染的肝硬化患者。
所述检测SPARC蛋白浓度具体可为检测人血清或血浆中的SPARC蛋白浓度。
本发明第四个目的是提供一种筛查或辅助诊断肝细胞癌产品。
本发明提供的产品，其包括上述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质和上述检测血清或血浆中甲胎蛋白浓度的物质。
上述产品中，所述产品为试剂盒。
为了寻找肝细胞癌血清生物标记物，发明人对AFP阴性肝癌患者的配对的肿瘤与癌旁组织间隙液进行鉴定，发现SPARC蛋白在肝癌患者肿瘤组织间隙液中显著上调。因为组织间隙液是连接细胞内液和循环体液的接口，该结果提示SPARC蛋白非常有可能从肝癌组织中通过组织间隙液分泌到血液中去。进而检测了该蛋白在临床血清样本中的表达水平，发现其血清浓度在肝癌患者中显著增高，提出SPARC蛋白可作为AFP阴性肝癌患者的血清诊断标志物，且可与AFP联合诊断肝癌。
实验证明，血清SPARC蛋白可作为肝细胞癌(HCC)的肿瘤标志物。当以无症状的正常人作为筛查对象时，受试者工作特征曲线(receiver operating characteristiccurve,ROC)分析结果表明曲线下面积(Area Under roc Curve,AUC)达到0.89，灵敏度为82％、特异度为93％；在以LC患者为筛查对象的情况下，AUC＝0.73，灵敏度为62％、特异度为86％。SPARC蛋白用于诊断AFP阴性肝癌患者时，以正常人为筛查对象，AUC＝0.88，灵敏度为78％，特异度为93％；以LC患者为筛查对象，AUC＝0.72，灵敏度为61％，特异度为84％。SPARC蛋白还可与AFP联合用于在LC患者中筛查或辅助诊断HCC。
附图说明
图1为正常组(N)、肝硬化患者组(LC)和肝癌患者组(HCC)血清中SPARC蛋白水平散点图。
图2为正常组(N)、肝硬化患者组(LC)和肝癌患者组(HCC)血清中SPARC蛋白水平的ROC曲线分析结果。
图3为正常组(N)、AFP阴性肝硬化患者组(LC)和AFP阴性肝癌患者组(HCC)血清中SAPRC蛋白水平的ROC曲线分析结果。
图4为肝硬化患者组(LC)和肝癌患者组(HCC)SPARC与AFP联合诊断的ROC曲线分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的名词解释：
受试者工作特征(receiver(relative)operating characteristic,ROC)曲线反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标。分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，面积大者，试验的诊断价值大。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度100％。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、血清中SPARC蛋白与HCC病人的关系
一、实验材料
血清样本来自：
正常组：正常人(N)30例；
LC患者组：有HBV慢性感染背景的肝硬化患者(未转化为肝细胞癌，LC)35例；
HCC患者组：有HBV慢性感染背景的肝细胞癌患者(HCC)50例(其中23例为APF阴性)。
其中，正常人血清来自健康体检者；肝硬化患者和肝细胞癌患者均为临床确诊病人的血清样本。
二、血清中SPARC蛋白与HCC病人的关系
对上述一的血清样本中的SPARC蛋白水平进行ELISA检测，所用试剂盒为R&DSystems公司SPARC ELISA检测试剂盒(货号：DSP00)，具体方法如下：
1、用稀释液(试剂盒中配备dilution buffer)1：40稀释血清样本，标准品稀释梯度50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml、0ng/ml，血清样本和标准品各100ul加入到包有一抗的96孔板(试剂盒配备)中，室温孵育3小时。
2、用洗液(试剂盒中配备wash buffer)洗6次，每孔350微升，每次1分钟。
3、每孔加入200微升SPARC二抗(试剂盒中自带)，4度孵育1小时。
4、用洗液洗6次，每孔350微升，每次1分钟。
5、每孔加入200微升显示底物(试剂盒中配备substrate solution)，室温避光孵育30分钟。
6、每孔加50微升终止液(试剂盒中配备stop solution)。
7、450nm波长读数。
8、通过SPARC标准蛋白浓度和其对应的OD值绘制标准曲线。通过各孔血清样本所测得的OD值，利用Excel软件对SPARC的标准曲线进行拟合，计算各血清样本中SPARC蛋白的含量。
9、用SPSS 16.0软件分别对健康的正常人(N)和肝细胞癌患者(HCC)、肝硬化患者(LC)和肝细胞癌患者(HCC)血清中SPARC蛋白水平进行ROC曲线分析，并对肝硬化患者(LC)和肝细胞癌患者(HCC)进行AFP与SPARC联合诊断ROC曲线分析。
SPARC蛋白表达水平在正常组、LC患者组、HCC患者组的血清样本中的ELISA检测结果：正常组SPARC蛋白的浓度平均值±标准差为72.77±51.79ng/ml，LC患者组为165.54±88.47ng/ml，HCC患者组为319.00±192.66ng/ml。对各组样本中SPARC蛋白含量进行统计学分析(Mann-Whitney test)，发现血清SPARC蛋白在正常组和HCC患者组(p<0.0001)以及LC患者组和HCC患者组(p＝0.0002)均有显著性差异(图1)。
以正常组为对照组，HCC患者组为疾病组，对血清中SPARC蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.89(如图2中A所示)，灵敏度为82％、特异度为93％；以LC患者组为对照组，HCC患者组为疾病组，AUC＝0.73(如图2中B所示)，灵敏度为62％、特异度为86％。
由上述结果可知，血清中SPARC蛋白可用作正常人与HCC患者、以及LC与HCC患者进行判别诊断的潜在标志物。
进行正常人和HCC患者的判别诊断时，若待测人血清中SPARC蛋白浓度大于等于130.72ng/ml，则该待测人为或候选为HCC患者。
进行LC患者和HCC患者的判别诊断时，若待测人血清中SPARC蛋白浓度大于等于261.80ng/ml，则该待测人为或候选为HCC患者。
上述两个判别诊断的浓度阈值为ROC曲线的最大约登指数对应的阈值，以正常人和HCC患者的判别诊断为例，约登指数及对应阈值详见表1(最大约登指数及对应阈值粗体标注)。
表1以正常组为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数
三、血清中SPARC蛋白在检测AFP阴性的HCC患者中的应用
将上述一中的正常人、有HBV慢性感染背景的17例AFP阴性的肝硬化(LC)和23例AFP阴性的肝细胞癌(HCC)患者血清样本按照上述二的方法检测。
结果正常组SPARC蛋白的血清浓度平均值±标准差为72.77±51.79ng/ml，17例AFP阴性的LC患者组为152.25±94.30ng/ml，23例AFP阴性的HCC患者组为308.62±196.04ng/ml。
以AFP阴性(AFP<20ng/ml)的HCC患者组为疾病组，正常组为对照组，对血清中SPARC蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.88(图3A)，灵敏度为78％，特异度为93％。以AFP阴性的HCC患者组为疾病组，AFP阴性肝硬化患者组为对照组，对血清中SPARC蛋白水平进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC＝0.72(图3B)，灵敏度为61％，特异度为84％。说明SPARC蛋白可用于判别诊断AFP阴性的肝癌患者。
进行正常人和AFP阴性的HCC患者的判别诊断时，若待测人血清中SPARC蛋白浓度大于等于136.18ng/ml，则该待测人为或候选为HCC患者。
进行AFP阴性的LC患者与AFP阴性的HCC患者的判别诊断时，若待测人血清中SPARC蛋白浓度大于等于247.36ng/ml，则该待测人为或候选为HCC患者。
上述两个判别诊断的浓度阈值为ROC曲线的最大约登指数对应的阈值。
四、SPARC蛋白和AFP蛋白在检测HCC患者中的应用
AFP血清蛋白浓度检测方法：使用罗氏全自动电化学发光免疫分析仪，利用AFP化学发光法试剂盒检测，详细步骤参照仪器说明书。
正常组AFP蛋白的血清浓度均小于20ng/ml，LC患者组为2260.6±12582.0ng/ml，HCC患者组为13626.6±47251.9ng/ml。SPARC蛋白浓度在正常组、LC患者组、HCC患者组的血清样本中的ELISA检测结果：正常组SPARC蛋白的浓度平均值±标准差为72.77±51.79ng/ml，LC患者组为165.54±88.47ng/ml，HCC患者组为319.00±192.66ng/ml。
对各组样本中SPARC蛋白和AFP蛋白浓度进行统计学分析(Mann-Whitney test)，发现血清SPARC蛋白和AFP蛋白浓度在正常组和HCC患者组(p<0.0001)以及LC患者组和HCC患者组(p＝0.0002)均有显著性差异。
共同判断SPARC蛋白和AFP蛋白的标准依据二元Logistic回归计算结果，区分HCC与正常组具体计算公式为：P＝1/(1+e-(-2.415+0.018*SPARC+0.002*AFP))，当p大于等于0.643时，判断为HCC；区分HCC与LC的计算公式为：P＝1/(1+e-(-1.498+0.008*SPARC+0.000016*AFP))，当p大于等于0.633时，判断为HCC。
用SPSS 16.0软件分别对正常人(N)和肝细胞癌患者(HCC)、肝硬化(LC)和肝细胞癌患者(HCC)进行AFP与SPARC联合使用诊断HCC的ROC曲线分析。
以正常组为对照组，HCC患者组为疾病组，血清SPARC蛋白与AFP蛋白联合使用判别诊断HCC患者的曲线下面积AUC＝0.93(如图4中A所示)，灵敏度为86％、特异度为97％；以LC患者组为对照组，HCC患者组为疾病组，两者联合使用判别诊断HCC患者的AUC＝0.78(如图4中B所示)，灵敏度为67％、特异度为84％。
由上述结果可知，血清中SPARC蛋白和AFP蛋白可用作正常人与HCC患者、以及LC与HCC患者进行判别诊断的潜在标志物。
上述结果汇总于表2和表3，展示了SPARC蛋白、AFP蛋白及其联合应用用于肝细胞癌患者与正常人或LC患者鉴别诊断的效果。
表2 SPARC蛋白和AFP蛋白判别诊断正常人和肝细胞癌患者效果比较(SPARC或SPARC与AFP联合使用效果优于AFP)
表3 SPARC蛋白和AFP蛋白判别诊断肝硬化和肝细胞癌患者效果比较(SPARC或SPARC与AFP联合使用效果优于AFP)
由上述结果可知，血清中SPARC蛋白可用作正常人与HCC患者、以及LC与HCC患者进行判别诊断的潜在标志物。
序列表
<110>北京蛋白质组研究中心
<120>检测血清中SPARC蛋白的物质在制备筛查肝细胞癌试剂盒中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 303
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu
20 25 30
Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val
35 40 45
Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu
50 55 60
Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly
65 70 75 80
Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln
85 90 95
Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys
100 105 110
Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr
115 120 125
Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp
130 135 140
Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu
145 150 155 160
Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val
165 170 175
Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln
180 185 190
Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala
195 200 205
Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr
210 215 220
Asn Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln
225 230 235 240
His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg
245 250 255
Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr
260 265 270
Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly
275 280 285
Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile
290 295 300

Claims (3)

1.检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度的物质包括检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂和仪器。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述检测血清或血浆中SPARC蛋白浓度所需的试剂包括SPARC蛋白抗体。
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