KR20130071961A

KR20130071961A - ＦｃＲｎ 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130071961A
Application number: KR1020110139472A
Authority: KR
Inventors: 김성욱; 박승국; 정재갑; 김민선; 김은선; 허정행; 송연정
Original assignee: 한올바이오파마주식회사
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-07-01

Abstract

본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn에 특이적인 인간 항체, 이를 제조하는 방법, 그러한 항체를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가면역 질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내(serum) 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환(auto-immune disease)에 대한 치료용 및 진단용으로 활용이 가능하다.

Description

ＦｃＲｎ 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물{FcRn specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases}

본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn(neonatal Fc receptor의 약자로, 태아 Fc-수용체, FcRP, FcRB. Brambell 수용체라고도 불린다)에 특이적인 인간 항체, 이를 제조하는 방법, 그러한 항체를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가면역 질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내(serum) 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환(auto-immune disease)에 대한 치료용 및 진단용으로 활용이 가능하다.

항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질로 인간 및 생쥐를 비롯한 대부분의 동물에서 중쇄(heavy chain)과 경쇄(light chain)의 폴리펩타이드가 쌍을 이루고 있다. 각 쇄는 가변영역(variable domain) 및 불변영역(constant domain)으로 지칭되는 2개의 구별되는 영역으로 구성되어 있으며, 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항체 간에 상당한 서열 다양성을 나타내고, 표적 항원에 특이적 결합 특성을 담당하며, 불변영역은 항체 간 서열 다양성이 적고, 중요한 생화학적 반응을 유도하는 다수의 천연 단백질에의 결합을 담당한다. 인간에서, IgA(IgA1 및 IgA2 하위부류 포함), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 하위부류로 세분된다.), 그리고 IgM를 비롯한 다섯 가지 아이소타입 (isotype) 항체가 존재하는데, 이들 아이소타입은 주로 불변영역의 특성에 따라 구분된다.

혈중내에 가장 많이 존재하며, 병원균의 침입시 생체를 보호하고 면역계(immune system) 관련 물질의 동원(recruitment)을 촉진하고, 조직에서 염증반응을 매개하는 IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 사합체(tetrameric) 단백질이다. IgG 중쇄는 각각 중쇄 가변 도메인(VH), 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 나타내는 VH-CH1-CH2-CH3의 순서로 N- 말단에서 C 말단으로 연결된 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다.

또한, IgG 경쇄는 각각 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 나타내는 VL-CL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 연결된 2개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다.

정상적인 조건 하에, 혈청 내에서 IgG3 아이소타입을 제외한 대부분의 IgG의 반감기는 인간에서 약 22-23일인데, 이는 다른 혈장 단백질의 혈청 반감기에 비하여 비교적 긴 것이다. 이러한 긴 IgG의 혈중 반감기는 세포흡수작용(pinocytosis)에 의해 세포속으로 들어온 IgG는 pH 6.0 조건의 엔도좀(endosome)에서 Fc 감마 수용체의 일종인 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, FcRn)에 강하게 결합하여 분해성 리소좀 (degradative lysosome) 경로를 회피할 수 있으며, 다시 세포막으로 순환하면 IgG는 약한 염기성 pH (~7.4)인 혈류 (bloodstream) 내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리된다. 이러한 수용체-매개된 재순환 메커니즘 (receptor mediated recycling mechanism)에 의해 FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다(Roopenian et al. J. Immunol. 170:3528, 2003).

FcRn은 쥐 신생아 장에서 모유로부터 IgG 항체의 흡수를 매개하는 기능을 하고 순환계 (circulatory system)로 이의 수송을 촉진하는 것으로도 밝혀져 있다. FcRn은 인간 태반으로부터도 분리되었는데, FcRn은 모계 IgG의 흡수와 태아 순환(fetal circulation)으로의 수송을 매개하는 것으로 알려져 있다. 성인에서, FcRn은 폐, 장, 신장의 상피 조직, 그리고 코, 질, 그리고 담관가지 (biliary tree) 표면을 비롯한 다수의 조직에서 발현된다.

FcRn은 전형적으로, 내피 세포와 상피 세포의 엔도솜 내에 거주하는 비-공유 이형이합체(non-covalent heterodimer)이다. FcRn은 세개의 중쇄 알파 도메인(α1, α2와 α3)과 하나의 수용성 경쇄 β2-microglobulin(β2m) 도메인을 갖는 막결합 수용체이다. 구조적으로, 이는 공통 경쇄(light chain)로서 β2m을 보유하는 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex) 클래스 1 분자의 집단에 속한다. αFcRn 쇄는 α1, α2와 α3 세개의 중쇄 도메인(heavy chain domain)과 β2m 경쇄 도메인(light chain domain)을 포함하고 하나의 당사슬을 가지는 세포외 도메인(ectodomain), 단일-통과 막간(single-pass transmembrane), 그리고 상대적으로 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)로 구성되어 약 46 kD의 분자량을 가진다(Burmeister et al. Nature 372:366, 1994.).

IgG 항상성(homeostasis)에 대한 FcRn의 역할을 확인하기 위해 생쥐의 β2m과 FcRn 중쇄(heavy chain)를 인코딩하는 유전자를 "녹아웃(knockout)"시켜 이들 단백질이 발현되지 않도록 조작했을때, 이들 생쥐에서, IgG의 혈청 반감기와 농도가 급격하게 감소하였는데(Junghans et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5512, 1996), 이는 IgG 항상성에 대한 FcRn 의존성 메커니즘을 암시한다. 또한, 항-인간 FcRn 항체가 이들 FcRn 녹아웃 생쥐에서 산출될 수 있고, 이들 항체가 FcRn에 IgG의 결합을 예방할 수 있는 것으로 제안 되었지만, 아직 이런 항체는 산출되거나 시험되지 않았다(WO 02/43658 A).

FcRn에 대한 IgG 결합의 저해는 IgG의 재순환을 감소시킴으로써 IgG 혈청 반감기를 감소시켜 자가항체에 의한 자가면역 질환을 치료할 수 있다는 가능성은 자가면역 피부 수포성 질병의 생쥐 모형에서 밝혀졌다(Li et al. J. Clin. Invest. 115:3440, 2005). 따라서 FcRn과 IgG의 결합을 차단하거나 길항하는 작용제는 IgG에 의해 매개되는 자가면역 질환 및 염증 질환 등을 치료 또는 예방하는 방법에 이용될 수 있다.

자가면역질환 및 동종면역 질환은 병원성 항체에 의해 매개되는 질환으로, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, 이하 'ITP'라 한다)이 대표적인 질환이다. ITP 경우는 특정 혈소판 막당단백질에 결합하는 자가항체의 발생에 의해 말초의 혈소판 파괴가 진행되어 발생되는 질환이다. 항혈소판 항체는 혈소판을 옵소니화(opsoniaztion)하고 망상세포 (예를 들면 대식세포)에 의한 급속한 혈소판 파괴를 가져온다.

일반적으로 ITP를 치료하기 위해 면역계를 억제하여 혈소판 농도를 높이는 시도가 행해지고 있다. ITP는 남성보다 여성에서 유병율이 높고, 또 성인보다 소아에서 많이 발생하며, 그 유병율은 인구 1만명 당 1명이다. 만성적 ITP는 성인과 소아의 양쪽에 있어서 주요한 혈액질환의 하나이다. 또 미국 및 전세계에 있어 거액의 입원료 및 치료비용을 발생시키는 원인이 되고 있다. 매년 미국에서 2만건의 새로운 증례가 발생하고 있으며, ITP의 치료 및 특별요법에 관련되는 비용 또한 막대하다. 대부분의 ITP 소아환자는 매우 낮은 수의 혈소판을 가져 돌연의 출혈(전형적인 증상으로서, 좌상, 피부의 작은 붉은 반점, 코피, 및 잇몸 출혈)이 일어난다. 소아는 때론 치료하지 않아도 회복하는 경우가 있지만 많은 의사들이 면밀한 관찰과 완화 및 감마 글로불린(globulin)의 점적 정맥주사(intraveneous infusion)에 의한 치료를 추천하고 있다.

다양한 자가면역질환에 과량의 IgG를 점적정맥투여(IVIG)하여, 자가면역질환을 치료하는 방법이 널리 사용되고 있다(Arnson autoimmunity 42:553 (2009)). IVIG 효과는 다양한 기작에 의해 설명되지만 그 중 하나는 FcRn에 대한 내인성 IgG와의 경합에 의해 병원성 항체의 클리어런스(clearance)를 증가시키는 기작으로도 설명된다. 대량의 사람면역글로불린(IgG)의 정맥투여(IVIG)는 면역성 ITP에 고통받는 소아의 혈소판 수를 증가시키며, 복수의 다른 자가면역질환의 치료에 유익하다는 것이 증명되었다. 많은 연구로, IVIG의 자가면역질환 치료에 있어서 효과를 발휘하는 메커니즘(mechanism)이 규명되었다. ITP와 관련하여, 초기 연구에서 IVIG의 효과는 주로 항체- 옵소닌화 혈소판의 식균작용에 관여하는 Fc 수용체(recetor)를 차단하여 발생하는 것이라고 알려져 왔다. 그 뒤의 연구는 Fc-결손 IVIG는 일부 ITP 환자에 있어서 혈소판 수의 증가를 가져온다는 것이 밝혀졌고, 최근에는 IVIG의 효과는 혈소판 탐식의 저해에 연결되는 대식세포(macrophage) 세포상의 FcγRIIb 발현을 자극하는 것에 기인한다는 보고도 있다.

그렇지만 이와 같은 IVIG 치료는 큰 부작용을 가지고 투여에 상당히 큰 비용(cost)이 든다. 또한 IVIG 이외의 자가면역/동종 면역성 질환의 치료에 사용되는 다른 치료법으로는 폴리클론날 항D 면역 글로불린, 부신피질 스테로이드(steroid) 및 화학요법제를 포함하는 면역 억제제 등을 이용하는 방법, 사이토카인 혈장 분리교환법, 체외 항체 흡착(예를 들면 Prosorba 칼럼을 사용하는 방법) 또는 비장적출 등의 외과적 처치 등이 포함된다. 그렇지만 IVIG와 마찬가지로, 이러한 치료법 역시 충분하지 않은 효력 및 고비용 때문에 그 이용이 제한적일 수 밖에 없다. 또한, FcRn결합의 IVIG 저해의 가상 기작(mechanism)의 경합적 저해는 IgG의 생리학적 pH(즉, pH7.2~7.4)에서 FcRn에 대한 낮은 친화성에 의해 병원성 항체의 클리어런스(clearance)의 실질적인 증가를 가져오기 위해서는 상당히 다량의 IVIG이 요구되는데, IVIG의 전형적인 임상용량은 2 g/kg) 정도이다.

IgG의 FcRn에 대한 결합을 경합적으로 억제함으로써 자가면역질환을 치료하는 개념을 갖는 저해제를 이용하는 것은 유망한 치료법 중 하나이지만, 현재로서는 내인성 IgG의 FcRn에 대한 고친화성 및 혈중의 내인성 IgG의 농도로 인해 상당히 많은 양의 저해제가 필요하고, 그로 인해 현재의 IVIG 치료법과 동일한 한계를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

따라서, FcRn에 대한 높은 친화력을 가지고 있어, 적은 양으로 병인성 항체를 제거할 수 있으며, 면역원성을 줄일 수 있는 인간항체에 대한 개발 필요성이 절실한 상황이다.

Burmeister et al. Nature 372:366, 1994. Roopenian et al. J. Immunol. 170:3528, 2003. Li et al. J. Clin. Invest. 115:3440, 2005.

상기와 같은 문제를 해결하고자 본 발명은 효과적으로 ITP를 포함한 자가면역질환을 효율적이고 근본적으로 치료할 수 있는 치료제를 제공하기 위하여, FcRn에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체 및 그러한 항체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 특이적이며 pH 비의존적(pH independent)으로 결합하여 FcRn에 대한 항체 Fc의 결합을 비경합적(non-competitive)으로 방해하여 자가면역질환의 원인인 생체내 자가항체를 감소시킴으로써 자가면역질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 FcRn 특이적 항체를 함유하는 ITP, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염 및 루프스 등의 자가면역질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 FcRn 특이적 항체를 이용한 ITP, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염 및 루프스 등의 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 FcRn에 높은 친화도(affinity)를 가지고 특이적(specific)이고 pH 비의존적으로 결합할 수 있으며, 인간에서 유래한 서열로 이루어져 체내 투여시 면역반응 유발이 거의 없는 완전 인간 항체를 제조하였다.

본 발명에서 제공되는 항체는 FcRn에 대한 특이성을 가지는 폴리크로날 또는 모노크노날(monoclonal) 항체이며, 바람직하게는 인간 FcRn에 대한 모노크노날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체의 형태를 가지며, FcRn과의 결합에 있어, IgG의 비경합적 저해제(non-competitive inhibitor)로 작용한다. 본 발명에 따른 항체와 FcRn 결합에 의해 FcRn에 대한 병원성 항체의 결합이 저해되고, 이에 따라 개체의 체내로부터 병원성 항체의 클리어런스(clearance), 즉 제거가 촉진되어 반감기가 감소하게 된다.

본 발명에서 사용되는 '병원성 항체'는 병적인 상태 또는 질병을 일으키는 항체를 의미하며, 이와 같은 항체에는 항혈소판 항체, 항아세틸콜린 항체, 항핵산 항체, 항인지질 항체(anti-phospholipid antibody), 항콜라겐 항체(anti-collagen antibody), 항강글리오사이드 항체(anti-ganglioside antibody), 항데스모그레인 항체 (anti-desmoglein antibody) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항체는 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서 병원성 항체와 FcRn과의 결합을 비경합적으로 저해를 가능하게 한다는 장점이 있다. US 2002/0138863A 등에는 항체가 FcRn에 결합한 경우 FcRn에의 IgG의 결합이 저해되도록 FcRn에 대한 항체는 IgG이 Fc에 결합하는 것에 중요한 동일 사이트(site)에서 FcRn에 결합해야 한다고 기재되어 있다. FcRn은 그 리간드, 즉 IgG에 pH 의존적으로 결합하며, 산성이 아닌 생리학적 pH에서는 IgG에 대해 실질적으로 친화성을 나타내지 않는다. 따라서 생리학적 pH에서 FcRn에 특이적으로 결합하는 항 FcRn 항체는 IgG와 FcRn의 결합에 비경합적 저해제로서 작용하며, 이 경우 FcRn에의 항 FcRn 항체의 결합은 IgG의 존재 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, pH 비의존성에 의해 IgG와 비경합적으로 FcRn과 결합하는 본 발명에 따른 항체는 경합적 저해제, 즉 IgG와 경쟁적으로 FcRn에 결합하는 기존의 항체들에 비해 훨씬 낮은 농도만으로도 IgG의 FcRn 매개 신호전달로 인한 질병의 치료가 가능하다는 장점이 있다. 또한, FcRn과 결합한 상태로 세포내 이동의 과정에 있어서, 본 발명에 따른 항 FcRn 항체는 FcRn에 대해 혈중 IgG보다 높은 친화도로 결합을 유지하므로 IgG와 FcRn이 결합할 수 있는 산성 pH 환경인 엔도솜 내에서도 IgG과 FcRn의 결합을 저해할 수 있어, IgG의 클리어런스를 촉진할 수 있는 효과를 가진다.

정리하면, 선행기술에 개시된 항체와는 다르게 본 발명에 따른 항체는 IgG가 FcRn에 결합하지 못하는 환경인 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서도 FcRn에 친화성을 가지고 pH 6.0에서는 혈중내 IgG 보다 FcRn에 더욱 높은 친화성을 가져 비경합적 저해제로 작용한다.

본 발명에서는 단일쇄 Fv(scFv) 파지 라이브러리(phage library)로부터 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 FcRn에 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하는 완전 인간 항체를 수득하였다. 파지 라이브러리의 제조 및 파지 디스플레이는 US 7,063,943B, US 6,172,197B 등에 공지된 바와 같이 제조하여 실시할 수 있다.

상기 방법을 통해 수득되어 제공되는 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역을 가지거나,

서열번호 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역을 가진다.

특히 본 발명에 따른 항체는,

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 18의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(b) 서열번호 4의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 20의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(c) 서열번호 6의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(d) 서열번호 8의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 24의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(e) 서열번호 10의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 26의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(f) 서열번호 12의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 28의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(g) 서열번호 14의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및

(h) 서열번호 16의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역을 가진다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는,

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(b) 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(d) 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(f) 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

(g) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및

(h) 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;

에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역을 가진다.

상기와 같은 본 발명에 따른 항체는 항체의 단편도 포함한다. 본 발명에서의 항체의 단편은 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab’)₂ 단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, FcRn에 대한 결합 기능이 유지되는 한, 본 발명에 따른 어떠한 형태의 항체의 단편도 본 발명에 따른 항체와 동일한 특성을 나타낼 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

또한 본 발명의 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)이 일어난 항체를 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 다른 물질과 접합된 복합체(conjugate)의 형태로도 이용가능하다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 접합하여 이용할 수 있는 물질로는 통상적으로 자가면역질환의 치료에 이용되는 치료제 및 FcRn의 활성을 저해할 수 있는 물질, 또는 혈액, 혈청, 림프, 또는 기타 조직의 순환계 내에서 이의 안정화 및/또는 유지를 향상시키는 모이어티(moiety)와 물리적으로 연결된다. 가령, FcRn-결합 항체는 중합체, 예를 들면, 폴리알킬렌폴리알킬렌 산화물 또는 폴리에틸렌 산화물과 같은 비-항원성 중합체와 연결될 수 있다. 적절한 중합체는 중량에 의해 실질적으로 변할 것이다. 대략 200 내지 대략 35,000(또는 대략 1,000 내지 대략 15,000, 그리고 2,000 내지 대략 12,500) 범위의 수평균분자량(molecular number average weight)을 갖는 중합체가 이용될 수 있다. 가령, FcRn-결합 항체는 물 가용성 중합체, 예를 들면, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들면, 폴리비닐알코올과 폴리비닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이런 중합체의 무제한적 목록에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올과 같은 폴리알킬렌 산화물의 동종중합체, 공중합체, 그리고 이들의 블록 공중합체 등이 대표적인 예이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단서로써 이들 블록 공중합체의 물 용해도(water solubility)가 유지되어야 한다.

본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에는 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 부형제 등이 추가적으로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명에 따른 항체 등의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로도 제제화되어 제공될 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등의 형태로 제공될 수도 있다.

상기 약학적 조성물은 IgG와 FcRn에 의해 매개되는 모든 자가면역 질환에 적용될 수 있는데, 대표적인 질환으로는 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그러한 항체의 단편을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법을 제공하며, 동시에 특정의 항 FcRn 요법도 제공한다.

본 발명에 따른 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법 또는 항 FcRn 요법은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 달성될 수 있는데, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하며, 구체적으로는 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있는데, 단회 또는 반복 투여 할 수 있다. 일반적으로 1~200 mg/kg, 보다 바람직한 것은 1~40 mg/kg을 자가면역성 또는 동종 면역성 증상을 가지는 환자에게 투여할 수 있고, 이러한 투여 계획은 바람직한 것은 혈청 내인성 IgG 농도를 치료전의 값의 75% 미만에 줄이도록 설계할 수 있으며, 환자의 상태 등을 감안하여 간헐적 또는 만성적(계속적) 투약 방침을 적용할 수 있다.

본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 FcRn에 결합하고 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 시험관 내와 생체 내 진단적 유용성을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명에서는 시험관 내 또는 생체 내에서 FcRn의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

시험관내 검출 방법은 예를 들어 (1) 샘플을 FcRn-결합 항체와 접촉시키는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및/또는 (3) 참고 샘플 (가령, 대조 샘플)을 항체와 접촉시키는 단계; (4) 참고 샘플에서와 비교하여 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성의 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조 샘플 또는 개체와 비교하여 샘플 또는 개체 내에 복합체의 형성에서 변화, 예를 들면, 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 내에 FcRn의 존재를 의미할 수 있다.

생체 내 검출 방법은 (1) FcRn-결합 항체를 개체에 투여하는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 개체 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출은 복합체 형성의 위치 또는 시점을 결정하는 것을 포함할 수 있다. FcRn-결합 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하는 검출가능 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 적절한 검출가능 물질에는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. FcRn-결합 항체와 FcRn 사이에 복합체 형성은 FcRn에 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체를 측정하거나 가시화시킴으로써 검출될 수 있다. 전통적인 검출 분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA) 또는 조직 면역조직화학(tissue immunohistochemistry)이 이용될 수 있다. FcRn-결합 항체의 표지화에 더하여, FcRn의 존재는 검출가능 물질로 표지화된 기준 및 표지화되지 않은 FcRn-결합 항체를 이용한 경쟁 면역분석(competition immunoassay)에 의해 샘플 내에서 분석될 수 있다. 이러한 분석의 한 가지 실례에서, 생물학적 샘플, 표지화된 기준, 그리고 FcRn-결합 항체가 결합되고, 그리고 표지화되지않은 항체에 결합된 표지화된 기준의 양이 측정된다. 샘플 내에 FcRn의 양은 FcRn-결합 항체에 결합된 표지화된기준의 양에 반비례한다.

진단 목적으로의 사용을 위해 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 형광단 또는 발색단으로 표지화될 수 있다. 항체 및 다른 단백질이 대략 310 nm까지의 파장을 갖는 광을 흡수하기 때문에, 형광 모이어티는 310 nm 초과, 바람직하게는 400 nm 초과의 파장에서 실질적인 흡수를 갖도록 선택되어야 한다. 다양한 적절한 형광 물질과 발색단은 형광 발색단 군으로 표지화될 수 있다. 형광 발색단 군 중에서 일군의 형광물질은 크산텐(xanthene) 염료인데, 여기에는 플루오레세인과 로다민이 포함된다. 다른 군의 형광 화합물은 나프틸아민(naphthylamine)이다. 형광단 또는 발색단으로 일단 표지화되면, 항체는 예로써, 형광 검경 (가령, 공초점 또는 디컨볼루션(deconvolution, 검경)을 이용하여샘플 내에서 FcRn의 존재 또는 국지화를 검출하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용한 FcRn의 존재 또는 국지화 여부는 하기와 같은 다양한 방법을 통해 검출이 가능하다.

조직학적 분석 : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 라벨(가령, 정제 또는 에피토프 태그)과 함께 합성되거나, 또는 예로써, 라벨 또는 라벨-결합 군을 접합함으로써 검출가능하게 표지화될 수 있다. 항체는 이후, 조직 표본, 예를 들면, 현미경 슬라이드 위에 놓인 조직의 고정된 절단면에 접촉된다. 결합을 위한 배양후, 조직 표본은 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 세척된다. 이후, 조직 표본은 항체가 조직 표본에 결합되는 지를 확인하기위하여 예로써, 검경을 이용하여 분석된다. 당연히, 항체는 결합 시점에 표지화되지 않을 수 있다. 결합과 세척후, 항체는 검출이 가능하도록 표지화된다.

단백질 어레이 : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 단백질 어레이에 고정되어 이용될 수 있다. 단백질 어레이는 예로써, 의학 샘플 (가령, 분리된 세포, 혈액, 혈청, 생검 등)을 선별하기 위한 진단 도구로서 이용될 수 있다. 당연히, 단백질 어레이는 예로써, FcRn 또는 기타 표적 분자에 결합하는 다른 리간드 역시 포함할 수 있다. 어레이용 폴리펩티드는 상업적으로 가용한 로봇 장치(가령, Genetic MicroSystems 또는 BioRobotics로부터)를 이용하여 고속으로 뿌려질 수 있다. 어레이 기질은 예로써, 니트로셀룰로오스, 플라스틱, 유리, 예를 들면, 표면-변형된 유리일 수 있다. 어레이는 또한, 다공성 매트릭스, 예를 들면, 아크릴아미드, 아가로즈, 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다.

FACS (형광 활성화된 세포 분류) : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 세포, 예를 들면, 샘플(가령, 환자 샘플) 내에 세포를 표지화하는데 이용될 수 있다. 항체는 또한, 형광 화합물에 부착될 수 있다. 세포는 이후, 형광활성화된 세포 분류기(가령, Becton Dickinson) 를 이용하여 분류될 수 있다. 세포가 분류기를 통과할 때, 레이저 빔이 형광 화합물을 흥분시키고, 검출기가 통과하는 세포를 계수하고 형광을 검출함으로써 형광 화합물이 세포에 부착되는 지를 결정한다. 각 세포에 결합된 라벨의 양은 샘플을 특성화하기 위하여 정량되고 분석될 수 있다.

본 발명에 따른 생체 내에서의 FcRn 또는 FcRn-발현 조직의 존재는 in vivo 화상검출 방법을 통해 확인될 수 있다. 상기 방법은 (1) 개체 (가령, 자가면역 질환 환자)에, 검출가능 마커에 접합된 항-FcRn 항체를 투여하는 단계; (ii) FcRn-발현 조직 또는 세포에 대한 검출가능 마커를 검출하기 위한 수단에 상기 개체를 노출시키는 단계를 포함한다. 가령, 개체는 예로써, NMR 또는 다른 단층촬영 수단에 의해 화상 진찰된다. 진단적 화상 진찰에 유용한 라벨의 예로는 방사성 라벨, 형광 라벨, 양전자 방출 동위원소(positron emitting isotope), 화학발광물질, 발광효소 등이 있다. 방사성 표지화된 항체는 시험관내 진단 검사에도 이용될 수 있다. 동위원소-표지화된 항체의 특이적인 활성은 반감기, 방사성 라벨의 동위원소 순도 (isotopic purity), 그리고 라벨이 항체 내로 통합되는 방법에 좌우된다.

본 발명은 또한, FcRn에 결합하는 항체, 그리고 진단적 용도, 예를 들면, 시험관내에서, 예를 들면, 샘플, 예를들면, 자가면역 질환 환자로부터 생검 또는 세포 내에서, 또는 생체내에서, 예를 들면, 개체를 화상 진찰함으로써 FcRn을 검출하기 위한, FcRn-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 대한 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 예를 들면, 라벨 또는 추가의 진단제를 더욱 포함할수 있다. 생체내 이용의 경우에, 항체는 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다.

또한 본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15에서 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지거나,

경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열을 가진다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은

서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15에서 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과,

17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지며,

특히 바람직하게는

(a) 서열번호 1 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 17 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(b) 서열번호 3 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 19 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(c) 서열번호 5 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 21 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(d) 서열번호 7 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 23 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(e) 서열번호 9 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 25 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(f) 서열번호 11 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 27 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

(g) 서열번호 13 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 29 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열; 및

(h) 서열번호 15 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 31 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;

에서 선택될 수 있다.

본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포, 그리고 상기 재조합 벡터 또는 숙주세포를 이용하여 본 발명에 따른 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 특히 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 제조하는 것이 바람직한데, 구체적으로 본 발명에 따른 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 가변영역을 각각 따로, 또는 하나의 숙주세포에서 동시에 발현시켜서 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다

본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질감염된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질감염된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.

본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터의 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2℃ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.

상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질감염체를 형성하는데, 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.

또한 상기 숙주세포는 바람직하게는 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있는데, 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하며, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포이다.

본 발명에서 숙주세포로의 “형질감염” 또는 “형질전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질감염, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질감염 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

재조합 벡터가 발현되는 형질감염체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기와 같이 재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 이에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않으며, 특히 프로테인 A(Protein A)를 이용하여 분리, 정제하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 제공되는 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn에 특이적인 인간 항체는 높은 친화도(affinity) 및 특이성(specificity)을 가지고 있으며, 면역원성으로 인한 문제가 거의 없고, FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시키는 특성을 가지고 있어 자가면역질환의 치료 및 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 FcRn 중 αFcRn에만 결합하고 β2m에는 결합하지 않는 항체 가변 영역(variable domain)의 선별결과를 나타내는 도면으로, 인간항체 cDNA 라이브러리로 제작된 phage를 αFcRn(heavy chain), β2m, α-Myc이 결합된 96-웰 플레이트(well plate)에 처리하여 ELISA 방법에 의해 pH6.0과 pH7.4에서 αFcRn(heavy chain)에는 결합하고 β2m에는 결합하지 않는 파지(phage)를 패닝(panning)한 결과를 나타낸다.
도 2는 선별(hit)된 항체의 세포 표면(cell surface) 인간 FcRn(hFcRn)에 대한 결합(binding)능을 나타내는 도면으로, 세포표면에 존재하는 인간 FcRn에 결합하는 선별된 8종의 항체를 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293 세포에 처리하여 pH 6.0과 pH7.4에서 세포표면 FcRn에 결합하는 항체를 확인한 결과이다. 항체와 FcRn과의 결합은 항체를 각 pH에서 세포에 처리한 후 Alexa488 표지(labeled)된 항-인간 염소 항체(anti-human goat antibody)를 사용하여 형광 활성화 세포 분류기(Flurescent activated cell sorter, FACS) 분석을 통해 확인하였으며, 선별된 항체의 세포표면 결합능에 대한 결과는 인간 IgG1(hIgG1)의 MFI를 기준으로 상대적인 값으로 표현하였다.
도 3은 세포표면 인간 FcRn에 결합하는 선별된 항체가 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 저해할 수 있는지를 세포수준에서 관찰한 결과를 나타내는 도면으로, 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293 세포에 결합하는 것이 확인된 8종의 선별된 항체 및 표지되지 않은 인간 IgG1 250 nM, 500 nM 및 1000 nM을 처리하여 Alexa488 표지된 인간 IgG1의 세포표면 결합능 감소로 저해능력을 확인하였다.
도 4는 인간 FcRn에 결합하는 항체가 다른종의 FcRn에도 결합하는지 여부를 마우스(mouse), 랫(rat) 및 원숭이(monkey)에 대한 교차반응성(cross-reactivity)을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면으로, 마우스, 랫, 원숭이 FcRn이 과발현되는 세포주 NIH3T3L1, Rat-2, Cos7 세포 각각에 각 종의 IgG 항체를 처리하고, 각 종의 항체를 인지하는 FITC 표지된 항-마우스, 항-랫, 항-인간 염소 항체를 처리하여 세포표면에 결합된 각 종의 항체 형광값을 FACS로 분석한 결과이다. 형광의 세기는 인간 IgG1의 MFI를 기준으로 3종의 선별된 항체, 항-마우스, 항-랫 FcRn 항체 및 사이노몰구스(cynomolgus) IgG 항체의 MFI 값을 상대적인 비율로 나타내었다.
도 5는 인간 FcRn이 발현되는 형질감염 마우스(transgenic mouse)인 Tg276(hFcRn+/+, hβ2m+/+, mFcRn-/-, mβ2m-/-)에서 선별된 항체인 HL161_1A, HL161_11G 항체가 hIgG1의 이화작용(catabolism)에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 도면으로, 5 mg/kg의 바이오티닐레이트(Biotinylated)된 인간 IgG1을 Tg276 마우스에 복강주사(IP injection)하고, 주사 24, 48, 72, 96 시간 후 10 mg/kg의 인간 IgG1, HL161_1A, HL161_11H 또는 PBS를 복강주사하여 수득한 결과이다. 시료채취는 Biotin-IgG의 투여 후 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며, 24, 48, 72, 96 시간에는 약물 투여전 채혈을 하여 ELISA 방법으로 Biotin-IgG의 잔존량을 확인하였다. 결과는 6시간 채혈 샘플의 잔존량을 100%로 하여 각 시간대의 잔존량을 상대적인 비율로 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

[실시예 1] 수용성(soluble) FcRn 발현벡터 제작

FcRn은 막간 고정된(transmembrane anchored) α-중쇄(heavy chain, αFcRn)와 β쇄(β2m)가 비공유결합(non-covalently)으로 연결된 이종이형체 단백질(heterodimeric protein)이다. 따라서 수용성 FcRn의 발현벡터 제작은 다위치 게이트웨이 시스템(multisite gateway system)을 이용하여 두 가지 유전자를 하나의 발현 벡터로 제작하고자 하였다. 인간 성장 호르몬(human growth hormone)의 신호서열을 가진 αFcRn과 β2m 유전자에 각각 αFcRn 5'말단 NheⅠ/3'말단 XhoⅠ 이며, β2m 5'말단 NheⅠ/3'말단 XbaⅠ의 제한효소 서열을 부가한 표 1에 기재된 프라이머(primer)를 사용 PCR 방법으로 유전자 증폭 후 증폭 산물을 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝 하였다.

구체적으로, 한국생명공학연구원로부터 구입한 클론(clone) (αFcRn : hMU008093/B2m : hMU005156)으로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 추출하여 사용하였다. 2 μl 200 ng 주형(template), 2 μl 10 pmole N-프라이머, 2 μl 10 pmole C-프라이머, 25 μl 2X 솔전트 혼합물(Solgent mixture), 19 μl 증류수를 넣어 50 μl의 반응 용액을 만들었다.

PCR 반응은 1차 변성 95℃ 2분, 2차변성 95℃ 20초, 프라이머 접합 60℃ 40초, 신장 반응 72℃ 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72℃ 5분으로 진행하였다. hGH 신호서열 증폭도 같은 조성으로 진행하였으며, 매회 PCR 반응이 끝나면 아가로스 젤(agarose gel) 상의 PCR 밴드로부터 DNA 추출하여 그 다음 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. hGH 리더(leader) αFcRn 유전자 증폭 산물은 NheⅠ 및 XhoⅠ 효소로, hGH 리더 β2m 유전자 증폭 산물은 NheⅠ 및 XbaⅠ 효소로 37℃에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 NheⅠ/XhoⅠ과 NheⅠ/XbaⅠ효소로 각각 37℃에서 4시간 이상 처리후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트(agarose gel extraction kit)를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 ul가 되도록 혼합하여 10 μl NEB 리가제 버퍼(ligase buffer), 1 μl 리가제를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션(incubation)하였다. 라이게이션 혼합물(Ligation mixture)에서 5 μl 를 DH5α 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 42℃에서 1분간 열충격(heat shock) 처리하여 형질전환하고 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니(colony)를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37℃ 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 천연 리더 αFcRn, hGH 리더 αFcRn, 천연 리더 β2m, hGH 리더 β2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다.

Jump-In^TM 패스트 게이트웨이 클로닝 키트(fast gateway cloning kit)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5'말단 및 3'말단 attB 부위(site)가 삽입된 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTI^TM Fast DEST 벡터에는 hGH 리더 αFcRn/β2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인하였다.

[실시예 2] 수용성 FcRn 발현 세포주 제작

형질감염(transfection)에 사용할 플라스미드 DNA는 높은 농도와 순도를 가져야 하므로 QIAGEN 플라스미드 정제(plasmid purification)를 진행하여 준비하였다. 유전자 서열 분석을 통해 확인 hGH leader FcRn pJTI^TM Fast DEST 벡터의 박테리아 클론(bacterial clone)을 앰피실린이 포함된 100 ml LB 플라스크(flask)에 접종하였다. 박테리아 세포를 3600rpm으로 15분간 원심분리하여 회수하였다. 배지(media) 제거 후, 10 ml P1 용액을 혼합한 뒤 보텍싱(vortexing)을 통해 펠릿(pellet)을 완전히 풀어준 후, 10 ml P2 용액을 첨가하여 부드럽게 5회 인버팅(inverting)하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음 10 ml P3 용액을 첨가하여 5회 인버팅 한 뒤 ice에서 30분 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면 4℃ 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액(Supernatant)을 새로운 50 ml 원심분리용 튜브(centrifuge tube)에 옮긴 뒤, 추가로 15분간 원심분리하였다. 10 ml QBT 용액으로 평형화(equilibrium)시킨 컬럼(column)에 상등액을 로딩하였다. 중력에 의해 용액의 로딩이 끝나면 30 ml QC 용액으로 2회 세척(washing)하였다. 컬럼 밑에 50 ml 원심분리용 튜브를 위치시킨 뒤, 15 ml QF 용액으로 용출(elution)하였다. 용출(eluent) 용액에 10.5 ml 이소프로판올(isopropanol) 용액을 혼합하여 4℃ 15,000 rpm 30분간 원심분리하였다. DNA 펠릿을 육안으로 확인 후 조심스럽게 상등액을 제거해주고 5 ml 70% 에탄올을 첨가하여 15분간 원심분리한 후, 펠릿이 떨어지지 않게 상등액을 제거한 뒤 LAR 수(LAR water) 150 μl로 펠릿을 녹였다. 펠릿이 다 녹으면 0.22 μm 필터로 여과시켰다. 나노드롭(Nanodrop) 기기를 이용하여 DNA 농도를 확인하며, 순도는 A260 값이 0.1~1.0 사이면 형질감염용 DNA로 사용할 수 있다.

형질감염 과정 24시간 전에 6~7 X 10⁵cells/ml로 접종하여 준비하였다. 24시간이 지나면 세포 생존도(cell viability) 및 세포수를 측정하였다. 세포의 클럼프(clump)를 제거하기 위해 측정된 부피만큼 50 ml 튜브에 옮겨 20에서 30초간 보텍싱 해준다. 총 28 ml의 배지에 3 X 10⁷viable cell이 되도록 새로운 플라스크에 옮겨준다.

hGH 리더 서열(leader sequence)을 가진 FcRn DEST 벡터와 phiC31 인테그라제(integrase) 벡터 각각 20 μg을 OptiMEM^®Ⅰ 배지 1 ml에 희석하였다. 이어서 293 펙틴(Fectin) 80 μg을 OptiMEM^®Ⅰ배지 1 ml에 희석 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 방치 시간이 5분 이상이 되면 펙틴의 활성이 감소하므로 오랜 시간 방치하지 않도록 하였다. 방치 시간이 끝나면 각 1 ml의 희석 용액을 혼합하여 DNA와 펙틴이 복합체(complex)를 이룰 수 있도록 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합액의 방치 시간이 끝나면 3 X 10⁷ viable cells이 들어있는 플라스크에 넣어주었다. 8% CO₂, 37℃ 인큐베이터 안의 오비탈 진탕기(orbital shaker)에 플라스크를 장착 후, 125rpm으로 진탕(shaking)하였다. 형질감염 진행 24시간 후에 신선한(fresh) 293 배지로 배지를 교환하여 배양하였다.

FcRn 발현벡터가 크로모좀에 영구히 통합(integration)된 세포를 선택적으로 선별하기 위한 과정을 통해 통합되지 않은 세포를 선택적으로 죽임으로써, 세포수 대비 발현량을 증대시킬 수 있었다. 형질감염 48시간 후에 Hygromycin B를 첨가하여 선별(selection)을 시작하였다. 3일 배양에 1회로 배지 교환 및 항생제 처리를 진행하였고, 시간에 따른 세포 생존도 및 세포수를 계수(counting)하여 분석하여 발현세포주를 제작하였다.

제작된 FcRn 안정된 세포주(stable cell line)의 발현 확인은 αFcRn과 β2m에 대한 1차 항체(primary antibody)를 사용하여 웨스턴 블라팅(western blotting) 분석으로 진행하였다. 정량분석은 상업적으로 판매되고 있는 인간 β2-마이그로클로불린(human β2-microglobulin)을 스탠다드(standard)로 사용하였으며 이미지(image) 분석을 통해 결과를 분석하였다.

FcRn 안정된 세포주 배양 과정 중의 배지를 채취(sampling)하여, 15,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 20 μl의 상층액을 옮겨 5 X 환원성 샘플 로딩 염료(reducing sample loading dye) 4 μl를 넣어 95℃에서 5분간 방치하였다. 이렇게 준비된 샘플을 12% NuPAGE Bis-Tris gel에 12 μl를 로딩하였다. 인간 β2-마이그로클로불린 스탠다드 물질은 5 ng 및 10 ng으로 로딩하였다. PAGE gel은 250 volt에서 35분간 런닝(running)하였으며, 30 volt에서 90분간 PVDF 멤브레인(membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 블로킹(Blocking)는 10% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 진행하였다. αFcRn 및 β2m에 대한 1차 항체는 각각 TBST 용액에 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였으며, 2차 항체(secondary antibody)는 TBST 용액에 1:5,000으로 희석하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이후 TBST용액으로 30분 이상 세척하였다. ECL solution A와 B를 1:1로 혼합하여 멤브레인에 뿌린 뒤, 1분간 반응시켰다. 매 10초씩 수동 증가분(manual increasement)으로 발색시키고, 결과는 이미지 분석으로 진행하였다.

[실시예 3] 수용성 FcRn 발현 및 정제

제작된 안정된 세포주로부터 발현하는 FcRn은 배지로 분비되는 형태이다. 안정된 세포주의 배양액으로부터 수용성 FcRn을 확보하기 위한 시기를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 30X10⁴ cell/ml과 60X10⁴ cells/ml의 30 ml 플라스크를 준비하여, 세포 접종 날짜부터 7일간 샘플을 수집하였다. 샘플은 WB(western blotting)으로 분석하였으며 접종 후 발현이 최대로 나타나는 날짜를 샘플 배지(sample media) 확보 시기로 결정지었다. 세포 접종 후, 배양이 끝나면 배지는 4℃ 3,600rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠릿이 떨어지지 않도록 배지 상등액(supernatant media)만 수집한 뒤, 0.22 μm 필터(filter)를 사용하여 여과하였다. 확보한 샘플 800 ml ~ 1,000 ml를 정제하기 위해서 버퍼 교환(buffer change) 및 농축(concentration) 과정을 UF(ultra filtration)로 진행하였다. 먼저 필터안의 NaOH를 제거하기 위해 약 2 L 증류수를 흘리고, 충분히 증류수로 세척 후, 사용하고자 하는 버퍼인 20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 6.0 버퍼 200 ml 이상을 흘려주었다. 이 때, 공급원(feed reservoir)에 넣어주는 버퍼의 pH와 투과액(permeate)의 pH를 측정 및 비교함으로써 필터내의 NaOH 제거 정도를 확인할 수 있다. 투과액의 pH가 pH 6.0으로 동등해지면 샘플을 공급원에 주입하여 200 ml로 농축하였다. 배지 샘플의 버퍼를 20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 6.0 버퍼로 바꿔주기 위하여 약 10배 이상인 2 L 정도를 여과시켰다. 압력 센서는 feed/inlet인 P1에 연결하여 사용하며 수동모드(manual mode)로 작동시켰다. 막간 압력(Trans-membrane pressure) (TMP)는 0.15 ~ 0.20 사이가 되게 하며, 0.5 이상이 되지 않게 하였다. 버퍼 교환이 끝나면 200 ml의 샘플 배지를 50 ml로 농축시켰다. 농축된 sample은 4 ℃ 3,600rpm으로 15분간 원심분리 후, 상등액만 옮겨준다.

UF를 통해 준비된 약 50 ml의 시료는 IgG Sepharose 6 fast flow를 이용한 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 정제하였다. IgG Sepharose 6 fast flow는 XK16 컬럼에 충진하여 8 ml의 컬럼 부피(column volume)로 사용하였고, 선속도 150 cm/hr (5ml/min)로 어피니티 크로마토그래피를 진행하였다. 2 ml/min 유속으로 농축된 50 ml 시료를 주입한 후, 같은 유속으로 세척 버퍼(washing buffer) (20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 5.8)를 약5 CV 이상 흘려주어 기준선(baseline)이 회복되는 시점까지 진행하였다. 그 후, 용출버퍼(50 mM Tris-Cl, pH8.0)를 4 ml/min의 유속으로 흘려주며, 2 ml씩 분획하여 시료를 수집하였다. Bradford 정량 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정하였으며, 전기영동 후 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 통해 순도 분석을 진행하였다.

[실시예 4] 파지 디스플레이(phage display) 방법에 의한 폴리파지 (polyphage) 및 모노 파지(monophage) 선별

분리정제된 shFcRn(수용성(soluble) human FcRn)을 항원으로 사용하여 인간 항체 cDNA 라이브러리로부터 pH 6.0에서 pH 7.4 범위내에서 pH에 비의존적으로 FcRn α chain에는 결합하고 β2m에는 결합하지 않는 폴리파지를 선별하였고(도 1 참조) 그 중 8개의 모노파지(monophage)를 선별 유전자 분석을 수행하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.

2.7x10¹⁰의 다양성을 가진 라이브러리를 30 ℃에 16시간 배양하여, PEG (polyethyleneglycol)로 농축한 다음, PBS 완충용액에 준비하였다. shFcRn 항원으로 3차까지 패닝(panning)을 수행하여, 3차에서 항원에 대한 파아지의 콜로니 타이터(colony titer)가 10~100배 정도 증폭됨을 확인하였고, 3차 다클론 파아지 항체군에서 단일클론 파아지 항체군을 준비하여 항원에 대한 각각의 결합능을 확인하여 일차 선별하였고, 핑커 프린팅(finger priniting)과 서열분석을 통해 단일클론 파아지 항체를 얻었다. 라이브러리 세포(library cell)에서부터 3차 패닝하여 수득된 세포에 헬퍼 파지(helper phage)를 감염하여 배양한 다음 상층액에 존재 하는 poly ScFv-phage들을 면역-플레이트(immuno-plate)를 사용하여 ELSIA를 수행하였다. 그 결과, 항원에 대한 결합능이 3차 폴리 ScFv-파지에서 증강(enrichment)됨을 확인하였다 (도 1 참조). BstN1 에 의한 핑거 프린팅으로 확인된 모노파지 클론(monophage clone)들 각각의 서열 분석을 하기 위해 모노 클론 세포(mono clone cell)의 DNA 분리를 수행하여 DNA를 얻어 서열 분석 결과를 보고, 선별된 항체의 V_H와 V_L의 CDR 영역(region)을 확인하였고 이들 항체와 점라인(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 웹페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)의 Ig BLAST 프로그램을 이용, 조사하여 그 결과 8종의 shFcRn에 특이적인 파지 항체를 선별하여 수득할 수 있었다. 선별된 8종 항체의 가변영역 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 2 및 표 3에 기재되어 있다. 또한, 각 가변영역에서의 CDR 서열은 표 4에 기재되어 있다.

[실시예 5] 인간항체 제작 및 생산

선별된 단클론 scFv 파지로부터 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light cahin)의 가변영역(variable region)을 각각 PCR 증폭(amplification)한 다음, 인간항체발현용 pNATAB 벡터에 클로닝을 하였다. 중쇄 발현용 pNATAB 벡터에는 Fc 유전자(gene)가, 경쇄 발현용 pNATAB 벡터에는 경쇄 불변영역(light chain constant region)이 이미 구축(construction)되어 있어 클로닝된 가변영역 유전자와 연결되어 온전한 인간 IgG(whole human IgG) 형태로 발현되었다. 인간항체는 중쇄와 경쇄을 발현하는 2 종류의 플라스미드 DNA를 293E 세포에 일시적 형질감염(transient transfection)시켜 배지로 분비(secretion)된 항체를 프로테인 A 컬럼(protein A column)을 이용하여 정제함으로써 수득하였으며, 자세한 생산방법은 다음과 같다.

형질감염 전날, 5x10⁶ 수의 293E 세포를 100mm 배양접시에 접종하였다. 컨플루언스(confluence)가 90 % 이상 된 것을 확인한 다음, 형질감염(transfection)을 진행하였다. 중쇄와 경쇄 플라스미드 DNA를 각각 5 μg씩 준비한 다음 500 μl 무혈청(serum free) DMEM 배지에 넣어주었다. 플라스미드 DNA가 들어있는 배지에 형질감염 시약(transfection reagent)인 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine) (polyscience, cat#. 23966) 20 μg를 추가로 넣어준 다음 파이펫으로 잘 섞은 후, 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그리고 나서 DNA와 형질감염 시약 혼합물(trasfection reagent mixture)을 293E 세포가 자라고 있는 배지에 넣어주었다. 다음날, 새로운 무혈청 배지로 배지를 교환한 다음, 이틀 간격으로 배지를 교환해 주면서 배지를 회수(harvest)하였다. 항체가 발현된 배지는 펠리콘 3 필터(Pellicon 3 filter) (Millipore, cat#. P3C030C01)를 이용하여 농축한 다음, AKTA 정제 시스템(AKTA purifier system)에서 Hi-Trap 프로테인 A FF 컬럼(protein A FF column) (GE healthcare, cat#. 17-5079-01)을 사용하여 인간 항체를 정제하였다. 100 mM 글리신(Glycine)-HCl (pH3.3) 버퍼로 이용하여 용출 된 항체는 PBS로 투석(dialysis)한 후, 280 nm 파장에서 흡광도를 측정하는 방법으로 정량하였다.

[실시예 6] SPR을 통한 항체의 결합력 측정

SPR을 통한 항체의 결합력은 shFcRn를 리간드로 Proteon GLC chip(Bio-Rad)에 고정화(immobilization)하여 친화도(affinity)를 측정하는 방법으로 진행하였다.

FcRn에 결합하는 anti-FcRn 161 항체의 K_D를 결정하기 위해 Proteon XPR36 (Bio-Rad) SPR 기기를 이용한 분석이 수행되었다. 리간드와 분석대상(analyte)의 분석은 Proteon GLC chip을 사용하였으며 상호반응(interaction)은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 분석하였다. 리간드의 고정화는 1X EDAC(EDC)과 1X Surfo-NHS를 1:1로 섞어 5 분간 주입시켜 활성화(activation)하였다. 리간드는 10 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), pH 4.5에 shFcRn을 25 μg/ml로 희석하여, 30 μl/min 유속(flow rate)으로 5분간 주입하였다. 비활성화(deactivation)는 에탄올아민(Ethanolamine) HCl을 30 μl/min으로 유속으로 5분 진행하여 shFcRn이 1200~1500 RU 정도 고정화된 것을 확인할 수 있었다. 고정화된 칩에 분석대상(analyte) 항체를 30 μl/min 유속으로 흘려준다. 분석대상 항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4인 0.05% Tween 20/PBS에 희석된 분석대상 항체를 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM로 희석하여 주입시켰다. 분석대상 항체의 결합시간(association time)은 240초, 해리시간(dissociation time)은 600초였다. 칩의 재생(regeneration)은 10 mM Glycine, pH 2.5를 100 μl/min 유속으로 18초간 흘려주었다. 분석대상의 총 6가지 농도로부터 나온 센소그램(sensorgram)을 토대로 키네틱스(kinetics) 분석을 진행하였다. 키네틱스 분석은 Proteon XPR36 software를 사용하였다. SPR 분석 결과로 나온 항체의 키네틱 파라미터(kinetic parameter)는 표 5에 나타내었다.

[실시예 8] 전장(Full length) FcRn 발현벡터 제작

8종의 항체가 인간 세포 표면에 존재하는 hFcRn에의 결합과 이를 통한 IgG Fc와의 상호작용을 저해하는지를 알아보기 위해 인간 FcRn이 세포 표면에 발현되는 세포주와 원숭이, 마우스 및 랫 각각의 FcRn과의 교차반응성을 조사하기 위해 각종의 FcRn이 각종의 세포 표면에 과발현하는 세포주 제작을 위한 발현벡터를 제작하였다.

1) 인간 FcRn

한국생명공학연구소로부터 구입한 클론(FcRn : hMU008093 / B2m : hMU005156)으로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 사용하였다. 2 μl 200 ng template, 2 μl 10 pmole N-프라이머 2 μl 10 pmole C-프라이머, 25 μl 2X 솔전트 혼합물(Solgent mixture), 19 μl 증류수를 넣어 50 μl의 반응 용액을 만들었다. 실험에 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 기재되어 있다. PCR 반응은 1차 변성 95℃ 2분, 2차변성 95℃ 20초, 프라이머 접합 60℃ 40초, 신장 반응 72℃ 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72℃ 5분 진행하였다. αFcRn 유전자 증폭 산물은 NheⅠ 및 XhoⅠ 효소로, β2m 유전자 증폭 산물은 NheⅠ 및 XbaⅠ 효소로 37℃에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 NheⅠ/XhoⅠ과 NheⅠ/XbaⅠ효소로 각각 37℃에서 4시간 이상 처리후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트(agarose gel extraction kit)를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 μl가 되도록 혼합하여 10 μl NEB 리가제 버퍼, 1 μl 리가제를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 라이게이션 혼합물(ligation mixture)에서 5 μl를 DH5α 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 42℃에서 1분간 열 충격 처리하여 형질전환하고 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37℃ 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 αFcRn / β2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다.

Jump-In^TM 패스트 게이트웨이 클로닝 키트(fast gateway cloning kit)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5’ 말단 및 3’말단에 attB 부위를 넣은 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTI^TM Fast DEST 벡터에는 hGH 리더 αFcRn/β2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인 하였다

2) 마우스, 랫, 원숭이 전장 FcRn 발현벡터 제작

마우스, 랫, 원숭이의 cDNA 라이브러리를 바이오체인(BioChain)으로부터 구입하여 사용하였다. 마우스 cDNA(C1334149), 랫 cDNA (C1434149), 원숭이 cDNA (C1534150-cy)를 주형으로 사용하였다. 1 μl 주형, 표 1에 기재된 2 μl 10 pmole 각 종의 N-프라이머, 2 μl 10 pmole C-프라이머, 25 μl 2X 솔전트 혼합물, 20 μl 증류수를 넣어 50 μl의 반응 용액을 만들었다. 실험에 사용된 프라이머 염기서열은 표 1에 기재되어 있다. PCR 반응은 1차 변성 95℃ 2분, 2차 변성 95℃ 20초, 프라이머 접합 56℃ 40초, 신장 반응 72℃ 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72℃ 5분으로 진행하였다. αFcRn 및 β2m 유전자 증폭 산물은 KpnⅠ 및 XhoⅠ 효소로 37℃에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 KpnⅠ/XhoⅠ 효소로 각각 37℃에서 4시간 이상 처리 후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 ul가 되도록 혼합하여 10 μl NEB 리가제 버퍼, 1 μl 리가제 를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 라이게이션 혼합물에서 5 μl를 DH5α 컴피턴트 세포에 넣어 42℃에서 1분간 열충격 처리하여 형질전환하고 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37℃ 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 각 종의 FcRn/β2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다. Jump-In^TM 패스트 게이트웨이 클로닝 키트를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5’ 말단 및 3’말단에 attB 부위를 넣은 PCR 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTI^TM Fast DEST 벡터에는 hGH 리더를 가지는 각 종의 αFcRn/β2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인하였다.

[실시예 9] 전장 FcRn 발현 세포주 제작

형질감염에 사용할 플라스미드 DNA는 높은 농도와 순도를 가져야 하므로 QIAGEN 플라스미드 정제(plasmid purification)을 진행하여 준비하였다. 유전자 서열 분석을 통해 확인 hGH 리더 FcRn pJTI^TM Fast DEST 벡터의 박테리아 클론을 앰피실린이 포함된 100 ml LB 플라스크에 접종하였다. 박테리아 세포를 3600rpm으로 15분간 원심분리하여 회수하였다. 배지 제거 후, 10 ml P1 용액을 혼합한 뒤 보텍싱을 통해 펠릿을 완전히 풀어준다. 10 ml P2 용액을 첨가하여 부드럽게 5회 인버팅하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음 10 ml P3 용액을 첨가하여 5회 인버팅한 뒤 얼음에서 30분 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면 4℃ 15,000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 50 ml 원심분리 튜브에 옮긴 뒤, 추가로 15분간 원심분리하였다. 10 ml QBT 용액으로 평형화(equilibrium)시킨 컬럼에 상등액을 로딩하였다. 중력에 의해 용액의 로딩이 끝나면 30 ml QC 용액으로 2회 세척하였다. 컬럼 밑에 50 ml 원심분리 튜브를 위치시킨 뒤, 15 ml QF 용액으로 용출하였다. 용출 용액에 10.5 ml 이소프로판올 용액을 혼합하여 4℃ 15,000rpm 30분간 원심분리하였다. DNA 펠릿을 육안으로 확인 후 조심스럽게 상등액을 제거해주고 5ml 70% 에탄올을 첨가하여 15분간 원심분리하였다. 펠릿이 떨어지지 않게 상등액을 제거한 뒤 LAR 수(LAR water) 150 μl로 펠릿을 녹여준다. 펠릿이 다 녹으면 0.22 μm 필터로 여과시켜 주었다. 나노드롭 기기를 이용DNA 농도를 확인하며, 순도는 A260 값이 0.1~1.0 사이의 DNA를 형질감염용으로 사용하였다.

인간, 랫, 마우스 및 원숭이 FcRn을 발현하는 세포주는 각각 다음과 같다. 인간은 HEK293 세포, 마우스는 3T3L1 세포, 랫은 Rat-2 피브로블라스트(fibroblast) 세포, 원숭이는 COS-7 세포주를 사용하였다. 각 세포주는 형질감염 과정 24시간 전에 T75 플라스크에 80% 컨플루언트(confluent)하게 되도록 접종하였다. 24시간이 지나면 신선한 배지로 교체해 주었다.

각 종의 FcRn DEST 벡터와 phiC31 Integrase 벡터 각각 5 μg을 OptiMEM^®Ⅰ배지 500 μl에 희석하였다. 이어서 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 20 μl을 OptiMEM^®Ⅰ 배지 500 μl에 희석 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 방치 시간이 끝나면 각 500 μl의 희석 용액을 혼합하여 DNA와 리포펙타민이 복합체(complex)를 이룰 수 있도록 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합액의 방치 시간이 끝나면 세포가 들어있는 플라스크에 넣어주었다. 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 안에서 6시간 배양 후, 신선한 10 % FBS/DMEM 배지로 교환하여 다시 배양하였다.

FcRn 발현벡터가 크로모좀(chromosome)에 영구히 통합(integration)된 세포를 선택적으로 골라내기 위해 다음의 과정을 수행하였다. 이 과정을 통해 통합되지 않은 세포를 선택적으로 죽임으로써, 세포수 대비 발현량을 증대시킬 수 있다. 형질감염 48시간 후에 하이그로마이신(Hygromycin) B를 첨가하여 선별을 시작하였다. 3일 배양에 1회 배지 교환 및 항생제 처리를 진행하였고, 시간에 따라 형성된 콜로니를 떼어내어 배양을 진행하였다. 이렇게 전체적으로 선별된 세포군으로부터 클론 선별(clonal selection)을 통해 단일 클론으로 형성된 안정화된 세포주를 구축하였다.

선별된 안정화된 세포주 구축 확인은 FACS 분석을 통해 진행하였다. 인간 FcRn 안정화된 세포주는 Alexa488이 표지된 hIgG1을 pH 6.0에서 결합시켜 개체수(population)의 변화(shift)를 통해 확인하였다. 마찬가지로 원숭이 안정화된 세포주도 Alexa488이 표지된 사이노몰구스 원숭이(Cynomolgus monkey) IgG1을 pH 6.0에서 결합시켜 개체수의 변화를 통해 확인하였다. 마우스 FcRn 안정화된 세포주는 pH 6.0에서 마우스 IgG1을 1시간 동안 결합시킨 뒤, FITC 표지된 항-마우스 IgG1을 사용하여 결합되어있는 마우스 IgG1의 양을 FACS로 측정하였다. 이에 따라 개체수의 변화를 확인하였다. 랫 FcRn 안정화된 세포주는 항-랫 FcRn 마우스 항체를 pH 7.4에서 1시간 동안 결합시킨 뒤, FITC 표지된 항-Rat IgG 항체를 사용하여 결합되어 있는 랫 IgG의 양을 FACS로 측정하여 개체수의 변화를 확인하였다.

[실시예 10] FACS를 이용한 항체의 FcRn 결합 분석

인간 FcRn을 발현하는 HEK293 안정화 세포를 대상으로 FcRn에 대한 pH별 결합 정도를 FACS 시스템을 사용하여 분석하였다. 100,000개의 HEK293 안정화 세포를 PBS에 세척하고 탁상용 마이크로 원심분리기에서 4500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. pH 6.0 또는 pH 7.4 PBS/10 mM EDTA 100 μl에 항체 1 μg을 첨가하였다. 100 μl의 항체 용액으로 펠릿을 재현탁시켜 얼음위에서 60분 동안 배양시켰다. 이들 세포는 pH별 완충액 150 μl로 1회 세척시킨 후 펠릿으로 만들었다. Alexa488이 표지된 항 인간항체 염소 항체(1 mg/ml)를 pH별 완충액에 1/20으로 희석한 후, 100 μl로 펠릿을 재현탁시킨 후, 얼음위에서 60분 동안 배양시켰다. 이들 세포는 pH별 완충액 150 μl로 1회 세척시켜 펠릿으로 만든 후, pH별 완충에 150 μl로 재현탁 시켜 FACS 분석용 튜브에 옮겨준다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어 (BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity: MFI)로서 표시되었다(도 2 참조). 8종의 선별된 항체 중 HL161-1A, HL161-11G, HL161-11H가 비교물질인 IgG1 보다 강하게 결합하여 세포 표면 hFcRn에 결합한 것을 확인하였다.

[실시예 11] FACS를 이용한 항체의 블로킹 기능 분석

세포 표면 hFcRn에 대한 결합능이 확인된 8종의 항체를 세포 표면에 hFcRn이 발현되는 HEK293 세포에 처리하고, Alexa-Fluo-488 형광표지된 hIgG1의 결합이 감소되는 것으로 항체의 블로킹 기능을 확인하였다. 분석과정을 자세히 설명하면 다음과 같다.

1) Alexa-Fluor-488로 인간 IgG1의 표지화

인간 IgG1 (Calbiochem, cat#.400120)은 제조업체의 제안된 프로토콜에 따라 Alexa Fluor 488 단백질 표지화 키트 (Molecular Probed/Invitrogen, Carlsbad, CA)로 표지화되었다. 구체적으로, 50 μl의 1 M 중탄산나트륨, pH 9.0이 PBS에서 500 μl의 2 mg/ml IgG 용액에 첨가되었다. 상기 단백질 용액은 이후 Alexa-Fluor-488 숙신이미딜 에스테르 (건성분말)에 첨가되고 실온에서 교반상태로 1시간 동안 배양시켰다. 상기 단백질은 키트 성분 칼럼 (Bio-Rad Biogel P-30 Fine 크기 배제 정제 수지)를 이용한 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 정제되었다. 샘플은 칼럼에 적하되고 PBS로 용리되었다. 가장 먼저 착색된 띠는 표지화된 단백질을 포함하고 있다. 표지화 정도는 A280(280 nm에서의 흡광도와 A494(494 nm에서의 흡광도)에서, 용리된 IgG의 흡광도(Absorbance)를 측정함으로써 결정되었다. 단백질 몰 농도는 아래의 공식을 이용하여 결정되었다.

(M)=[A280 - (A494 x 0.11) x 희석 인자]/203,000

이에 더하여 단백질 몰(mole) 당 염료의 몰을 도출하는 이용된 공식은 아래와 같았다.

(M)=A494 x 희석인자 / 71,000 x 단백질 농도

전형적으로 IgG 몰단 4~5 몰의 Alexa-Fluor-488이 통합되었다.

2) FcRn 발현 세포를 이용한 세포 경합 분석

인간 FcRn을 발현하는 HEK293 안정화 세포를 대상으로 FcRn에 대한 항체의 블로킹 정도를 FACS를 이용하여 분석하였다. 항체는 결합 완충액 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)에 희석하여 2,000 nM, 400 nM, 80 nM 농도로 50 μl로 만들어 튜브에 분주하였다. 여기에 1uM Alexa488이 표지화된 hIgG1(pH 6.0)을 10 μl씩 각 튜브에 첨가시켰다. HEK293 안정화 세포는 결합 완충액에 2,500,000/ml이 되도록 희석한 후, 세포현탁액 40 μl를 항체와 표지항체가 첨가된 튜브에 첨가하였다. 따라서 최종 부피 100 μl 안에 100,000개의 세포와 100 nM의 표지항체, 1000 nM, 500 nM, 250 nM 경합항체가 존재하도록 하였다. 이들 세포는 pH 6.0 완충액 150 μl로 1회 세척시켜 펠릿으로 만든 후, pH별 완충에 150 μl로 재현탁 시켜 FACS 분석용 튜브에 옮겨준다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어(BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도 (MFI)로서 표시되었다.

실험군의 MFI는 세포만을 통해 측정된 MFI 값(background signal)을 빼준 후 처리하였다. 대조 튜브 (Alexa Fluor 488 단독, 그리고 경합이자 없음)의 MFI를 100%로 환산하여 경합이자 포함 튜브의 MFI의 백분율을 환산하였다.

인간 IgG1의 경합이자 포함 튜브의 MFI 보다 낮은 경우에 경합항체의 경합률이 높은 것으로 판단하였다. 도 3의 결과를 참조하여 살펴보면 HL161-1A, HL161-11G, HL161-11H는 블로킹 기능을 하는 것으로 확인되었다.

[실시예 12] FACS를 이용한 교차반응성 확인

블로킹 기능을 갖는 3종의 인간 항체가 다른종의 FcRn에 결합하여 각 종의 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 블로킹할 수 있는지를 보기위해 각 종별 교차반응성을 확인 하였다. 자세한 실험내용은 다음과 같다.

1) 마우스 FcRn에 대한 교차반응성 확인

마우스 FcRn을 안정하게 발현하는 3T3-L1 세포를 10 % FCS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신(trypsin)을 처리하여 배양 플레이트(culture plate)에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼(Cold binding buffer) (PBS, pH 6.0 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 10⁵/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 10⁴ 개의 세포가 들어가도록 100 μl씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 μl 넣어 주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 마우스 FcRn에 결합하는 토끼 항체 (Santacruz, sc-66893)와 인간 IgG(Abcam, cat#. 409120)를 1 μl씩 사용하였다. 4℃, 4000rpm 조건으로 5분동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 μl 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁(resuspension)하였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체로 항-인간 IgG 염소 항체(Invitrogen, Cat#. A11013)를 1 μl씩 세포에 넣어 주었다. 항-마우스 FcRn 토끼 항체의 실험의 경우는 항-토끼 항체를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 다음, 4℃, 700g 조건으로 5분동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 ul 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH 6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 마우스 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH 7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 hl161-11G는 마우스 FcRn에 결합하였지만, HL161-11H는 결합하지 않았다(도 4 참조)

2) 랫 FcRn에 대한 교차 반응성 확인

랫 FcRn을 안정하게 발현하는 랫 피브로블라스트 인 Rat-2 (KCTC #. AC28203) 세포를 10 % FBS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신을 처리하여 배양 플레이트 에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼(PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 10⁵/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 10⁴ 세포가 들어가도록 100 μl씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 μl 넣어 주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 랫 FcRn에 결합하는 마우스 1G3 항체와 인간 IgG (Abcam, cat#. 409120)를 1 μl씩 사용하였다. 1G3 항체는 마우스 하이브리도마 세포(ATCC #. CRL2434)로부터 생산된 것을 정제하여 사용하였다. 4℃, 4000rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하여 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 μl 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁하였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체로 항-인간 IgG 염소 항체(Invitrogen, cat#. A11013)를 1 μl씩 세포에 넣어 주었다. 항-랫 FcRn 마우스 항체를 처리한 실험의 경우는 항-마우스 IgG 염소 항체 (Invitrogen, cat#. A11001) 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 다음, 4℃, 4000rmp 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 μl 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 랫 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 HL161-11G는 랫 FcRn에 결합하였지만, HL161-11H는 결합하지 않았다(도 4 참조).

3) 원숭이 FcRn에 대한 교차 반응성 확인

원숭이 FcRn을 안정하게 발현하는 Cos7 세포를 10 % FBS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신을 처리하여 배양 플레이트에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 10⁵/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 10⁴ 세포가 들어가도록 100 μl씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 μl 넣어주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 사이노몰구스 원숭이 IgG (Equitech-Bio Inc, cat#. SLCM66 0100)와 인간 IgG (Abcam, cat#. 409120)를 1 μg 씩 사용하였다. 4℃, 700g 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 μl 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체인 항-인간 IgG 염소 항체 (Invitrogen, cat#. A11013)를 1 μl씩 세포에 넣어 준 다음, 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이후, 4℃, 700g 조건으로 5분동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 μl 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH 6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 원숭이 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH 7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 HL161-11G 그리고 HL161-11H는 원숭이 FcRn에 결합하였다(도 4 참조).

[실시예 13] mFcRn -/- hFCRN 형질전환 276 마우스에서 인간 항체의 효력시험

FACS 분석에 의해 hFcRn에 결합하여 hIgG1의 결합을 블로킹하는 3종의 인간항체 중 2종을 골라 hFcRn이 발현되는 Tg276(hFcRn+/+, hβ2m+/+, mFcRn-/-, mβ2m-/-) 마우스(Jackson Laboratory)에 인간 IgG를 주사한 후 HL161_1A와 HL161_11H 및 인간 IgG를 투여하여 인간 IgG의 이화작용(catabolism)에 영향을 주는지 알아보았다. HL161 후보물질 2종(HL161_1A와 HL161_11H), 및 인간 IgG(Greencross, IVglobulinS)를 1 mg/mL로 조제하여 4일 투여를 위해 분주하여 보관하였고 전달체(vehicle)로 pH 7.4의 PBS (Phosphate buffered saline) 을 사용하였다. hFcRn Tg276 마우스는 약 7일간 적응시켜서 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(23 ± 2 ℃), 습도(55 ± 5%) 및 명암주기(12시간)는 자동으로 조절되도록 하였다. 각 군마다 3마리로 실험을 진행하였으며, 전달체군은 1 마리로 실험을 진행하였다. 인간 IgG을 추적물질(tracer)로 사용하기 위해 비오틴(Biotin)이 접합된 hIgG를 kit(Pierce, Cat#. 21327)를 사용하여 제조하였다. 제조자의 프로토콜을 따라 제조하였고 제조된 비오틴-IgG를 5 mg/kg의 용량으로 복강주사하였다. 약물의 투여는 비오틴-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96시간 후에 10 mg/kg의 용량으로 복강주사하였다. 채혈은 포란액(Isoflurane, JW pharmaceutical)을 이용하여 가볍게 마취시킨 후, 헤파린 처리된 마이크로-헤마토그리트 튜브(Heparinized Micro-hematocrit capillary tube)(Fisher)를 사용하여, 안와정맥총에서 채혈을 진행하였다. 비오틴-IgG의 투여 후 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며, 24, 48, 72, 96 시간에는 채혈 진행 후 약물을 투여하였다. 0.1 mL의 전혈을 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 받은 후 바로 원심분리기로 혈장을 분리하여 분석 전까지 딥 프리저(Deep freezer)(Thermo)에 -70℃ 상태로 보관하였다.

채혈된 혈액속 비오틴-hIgG1양은 다음과 같이 ELISA 방법에 의해 분석되었다.

96 웰 플레이트(Costar, Cat. No: 2592)에 1.0 μg/ml 농도가 되도록 100 μl 뉴트라비딘(Neutravidin)(Pierce, 31000)를 주입한 후, 4℃에서 16시간 고정화하였다. 버퍼 A(Buffer A) (0.05 % Tween-20, 10 mM PBS, pH 7.4)을 이용하여 3회 플레이트를 세척 후, 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4) 용액으로 2시간 상온에서 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후, 1 μg/ml 에 해당하도록 0.5 % BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액으로 뉴트라비딘 플레이트를 제조하였다. 각 웰에 버퍼 B(Buffer B) (100 mM MES, 150 mM NaCl, 0.5 % BSA IgG-free, 0.05 % Tween-20, pH 6.0)를 이용하여 혈액 시료를 500배 에서 1000배 범위로 순차적 희석(serial dilution)을 진행하여 각 150 μl씩 플레이트에 주입하였다. 주입된 시료는 상온에서 1시간 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후 HRP가 접합된 항 인간 IgG 염소항체를 1nM로 제조한 후 200 μl씩 주입하여 37도에서 2시간 반응시켰다. 얼음을 이용하여 냉각된(Ice cold) 버퍼 B를 사용하여 3회 플레이트를 세척 후, 기질 용액인 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, RnD, Cat. No: DY999)를 100 μl 주입한 후 상온에서 15분 반응시켰다. 1.0 M 황산 용액(삼전, Cat. No: S2129) 50 μl를 주입하여 반응을 중지한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6시간 (마우스에서 비오틴-IgG의 대략적인 T_max이자, 비오틴-IgG의 이화작용이 일어나기 전 시간) 경과 후의 비오틴-IgG의 농도를 100%로 고정하고, 나머지 시간의 농도를 %로 표시한 결과는 도 5에 도시되어 있다.

전달체군의 반감기는 97.55시간이었으며, IVIG 효과를 보기 위한 hIgG군의 반감기는 75시간이었다. HL161의 두 후보물질인 HL161-1A와 HL161-11H의 반감기는 각각 72, 57시간이었다. HL161-1A의 경우 전달체군에 비해 반감기가 25시간 이상 짧아졌으나, hIgG군과 유사한 반감기를 보였다. HL161-11H의 경우 전달체군에 비하여 반감기가 40시간 이상 짧아졌으며, hIgG군에 비해서도 약 20시간 가량이 짧아졌다. 이를 통해 hFcRn에 pH 비의존적, Fc 비경합적인 항체가 내인성 항체의 이화작용 증가에 효력이 있다는 것을 확인하였다.

<110> Hanall Biopharma Co., Ltd. <120> FcRn specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HL161-1A Heavy chain <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cagttttggt gaatatggca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt gttagttgga acagtggtag cattgcctat 180 gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtaga 300 agtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HL161-1A Heavy chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Glu Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser 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<220> <223> HL161-9F Light chain <400> 26 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ala Asn 20 25 30 Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Pro Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Asn Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Thr Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 27 <211> 327 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HL161-10E Light chain <400> 27 tcctatgagc tgacacagcc actctcggtg tcaatgtccc caggacaaac ggccaggatc 60 acctgttctg gagatgcttt gtcaaagcaa tatgcttctt ggtaccagct gaagccaggc 120 caggcccctg tggtggtgat gtataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgaccga 180 ttctctggct ccagctccgg gacaacagtc acgttgacca tcagtggagt ccaggcagaa 240 gacgaggctg attattactg tcaatcaata acagacaaga gtggtactga tgtgatcttc 300 ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 28 <211> 109 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HL161-10E Light chain <400> 28 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Gln Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met Tyr 35 40 45 Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr 85 90 95 Asp Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 29 <211> 330 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HL161-11G Light chain <400> 29 aattttatgc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaagcagcag cgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccca actcatcatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgat tctccggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctggactc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcataca gcagcagcac tttttacgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 30 <211> 110 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HL161-11G Light chain <400> 30 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 31 <211> 321 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HL161-11H Light chain <400> 31 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agccggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagct tagaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ttgtcaacag acgaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HL161-11H Light chain <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역.
청구항 제1항에 있어서,
서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역.
서열번호 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역.
청구항 제3항에 있어서,
서열번호 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역.
청구항 제1항 또는 제2항에 따른 중쇄 가변영역 중에서 선택된 어느 하나와 청구항 제3항 또는 제4항에 따른 경쇄 가변영역 중에서 선택된 어느 하나로 구성되는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편.
하기 (a) 내지 (h)에서 선택된 가변영역의 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편.
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 18의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 20의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(d) 서열번호 8의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 24의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(e) 서열번호 10의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 26의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(f) 서열번호 12의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 28의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(g) 서열번호 14의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및
(h) 서열번호 16의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역.
하기 (a) 내지 (h)에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편.
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(d) 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(e) 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(f) 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(g) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및
(h) 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역.
청구항 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 항체의 단편은 FcRn 에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab’)₂ 단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 및 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체에서 선택된 것임을 특징으로 하는 FcRn -특이적 항체 또는 그러한 항체의 단편.
청구항 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 단편; 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 자가면역질환 치료용 약학조성물.
청구항 제9항에 있어서,
상기 자가면역질환은 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제9항에 있어서,
상기 자가면역질환은 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제11항에 있어서,
서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에 기재된 서열에서 선택된 하나의 서열, 또는 그러한 서열과 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열에서 선택되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 제13항에 있어서,
하기 폴리뉴클레오티드 서열의 조합에서 선택된 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(a) 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 17 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(b) 서열번호 3 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 19 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(c) 서열번호 5 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 21 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(d) 서열번호 7 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 23 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(e) 서열번호 9 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 25 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(f) 서열번호 11 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 27 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(g) 서열번호 13 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 29 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열; 및
(h) 서열번호 15 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 31 또는 이와 90% 이상의 서열상동성을 가지는 서열.
청구항 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
청구항 제15항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
청구항 제16항에 있어서,
상기 숙주세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균, 곤충세포에서 선택된 것임을 특징으로 하는 숙주세포.
청구항 제16항에 있어서,
상기 형질감염된 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주세포.
청구항 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 FcRn 특이적 항체, 그러한 항체의 단편 또는 가변영역의 생산 방법.
청구항 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
청구항 제20항에 있어서,
상기 자가면역질환은 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 포함하는 FcRn 검출용 조성물.
청구항 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 이용한 FcRn 검출 방법.
청구항 제23항에 있어서,
시험관 내 또는 생체 내에서 수행됨을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.
청구항 제23항에 있어서,
상기 항체 또는 그러한 항체의 단편은 검출 가능한 물질을 이용하여 표지(labeling)되어 있는 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.
청구항 제25항에 있어서,
상기 표지는 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질에서 선택된 하나의 물질을 이용하여 이루어진 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.
청구항 제23항에 있어서,
효소-연결된 면역흡착분석법(ELISA), 방사면역분석법(raioimmunoassay, RIA), 조직 면역조직화학법(tissue immunhistochemistry) 및 경쟁 면역분석(competition immunoassay)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.