KR20130055477A - Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same - Google Patents

Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same Download PDF

Info

Publication number
KR20130055477A
KR20130055477A KR1020110121244A KR20110121244A KR20130055477A KR 20130055477 A KR20130055477 A KR 20130055477A KR 1020110121244 A KR1020110121244 A KR 1020110121244A KR 20110121244 A KR20110121244 A KR 20110121244A KR 20130055477 A KR20130055477 A KR 20130055477A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lipase
ala
pro
ser
leu
Prior art date
Application number
KR1020110121244A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101460228B1 (en
Inventor
손정훈
김현진
김미진
배정훈
서문지훈
임광묵
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020110121244A priority Critical patent/KR101460228B1/en
Publication of KR20130055477A publication Critical patent/KR20130055477A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101460228B1 publication Critical patent/KR101460228B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PURPOSE: Mutant lipase is provided to enable efficient enzyme reaction, and to cheaply produce bio-diesel. CONSTITUTION: Mutant lipase is prepared by applying mutation to lipase with an amino acid of sequence number 8 and enhances activity. The mutant lipase has an amino acid sequence of sequence number 9 or 10. A polynucleotide encodes the mutant lipase. An expression vector contains the polynucleotide. A method for producing bio-diesel comprises: a step of introducing the expression vector to a host cell and preparing a transformant; a step of culturing the transformant and collecting lipase from the culture or supernatant thereof; and a step of preparing bio-diesel from fats and fatty oil and alcohol using the collected lipase.

Description

활성이 증진된 변이 리파제 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산방법{Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same}Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same}

본 발명은 활성이 증진된 변이 리파제 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 활성이 증진된 변이 리파제, 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법 및 상기 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a mutant lipase having enhanced activity and a method for producing biodiesel using the same. More specifically, the present invention relates to a mutant lipase having enhanced activity, a polynucleotide encoding the mutant lipase, and an expression vector comprising the polynucleotide. The present invention relates to a transformant transformed by introducing the expression vector into a host cell, a method of producing mutant lipase having enhanced activity using the transformant, and a method of producing biodiesel using the mutant lipase.

트리아실글리세롤 리파제(triacylglycerol lipase, EC 3.1.1.3)는 트리아실글리세롤을 분해하는 카르복실릭 에스터 수산화효소(carboxylic ester hydrolase)로서 세제, 유지화합물, 식품 및 정밀화학제품 산업 등 다양한 산업에서 활용되는 생물촉매(biocatalyst)이다. 최근 원유고갈이나 지구온난화 문제로 원유를 대체하는 바이오에너지 연구가 활발하며, 특히 수송용 연료로서 경유를 대체할 수 있는 동, 식물성 유지 유래의 바이오디젤이 전세계적으로 활용되고 있다. 이러한 바이오디젤의 생산 방법은 산이나 알칼리 촉매를 사용하는 화학적인 방법이 주로 이용되고 있으나 고에너지 요구성 공정이며 폐수 등으로 인한 2차 환경오염 문제를 안고 있다(Pizarro 등, 2003, Pceess Biochem, 38,1077). 향후 대규모의 바이오디젤의 생산을 위해서는 친환경적인 바이오디젤 전환공정이 필요한데 다양한 미생물 유래의 생물촉매인 리파제가 바이오디젤 전환반응에 활용되고 있다. 효소를 이용한 바이오디젤 전환은 폐식용유나 유리지방산 함량이 높은 원료 등 다양한 종류의 원료를 이용할 수 있고 바이오디젤 전환을 위해 에너지 비용이 적고 특히 폐수의 발생이 없다는 장점이 있다. 또한, 바이오디젤의 회수가 용이하며 부산물로서 고품질의 글리세린을 얻을 수 있다(Fjerbaek 등, 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). 그러나 효소공정은 상대적으로 반응속도가 느리며 촉매의 생산비용이 높고 장기적인 활성유지가 어려운 단점이 있다. 따라서, 효소를 이용한 바이오디젤의 생산을 위해서는 고활성의 효소를 저비용으로 대량생산하는 기술이 절대적으로 필요하다.
Triacylglycerol lipase (EC 3.1.1.3) is a carboxylic ester hydrolase that breaks down triacylglycerols and is used in a variety of industries, including detergents, oil compounds, food and fine chemicals industries. It is a biocatalyst. Recently, bioenergy research to replace crude oil due to crude oil depletion or global warming is active, and biodiesel derived from copper and vegetable oils, which can replace diesel oil as a fuel for transportation, is being used worldwide. The biodiesel production method is mainly a chemical method using an acid or an alkali catalyst, but is a high energy requirement process and has a secondary environmental pollution problem due to wastewater (Pizarro et al., 2003, Pceess Biochem, 38). , 1077). In order to produce large-scale biodiesel, eco-friendly biodiesel conversion process is required. Lipase, a biocatalyst derived from various microorganisms, is being used for biodiesel conversion. Biodiesel conversion using enzymes has the advantage of using a variety of raw materials, such as waste cooking oil or a high content of free fatty acids, and low energy costs for biodiesel conversion, and there is no generation of waste water. In addition, the recovery of biodiesel is easy and high quality glycerin can be obtained as a by-product (Fjerbaek et al., 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). However, the enzyme process has a relatively slow reaction rate, high production cost of the catalyst, and long term activity is difficult to maintain. Therefore, in order to produce biodiesel using enzymes, a technique for mass-producing highly active enzymes at low cost is absolutely necessary.

바이오디젤 생산을 위한 리파제로서 박테리아, 효모 및 곰팡이 등 다양한 미생물 유래의 리파제가 이용되고 있다(Fjerbaek 등, 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). 효모 칸디다 안타티카 유래의 리파제 B(Candida antarctica lipase B, CalB)는 이성질체 전환반응이나 폴리에스터 합성, 바이오디젤 전환반응 등에서 활용되는 효율적인 생물촉매이며, 특히 노보자임스(Novozymes)사에서 판매하는 고정화 효소인 Novozym435는 바이오디젤 전환반응용 효소로 많이 연구되고 있다. Novozym435는 곰팡이 발현시스템을 이용하여 대량 분비생산하고 아크릴릭 레진에 고정화한 효소로서 매우 고가(200만원/kg)에 판매되고 있어서 실제 바이오디젤 생산공정에 적용하기에는 비용 측면에서 무리가 있다. 따라서 효소활성 개량을 통해서 효소비용을 절감하려는 연구와 재조합 방법으로 대량생산 하려는 연구가 진행되고 있다.
Lipases derived from various microorganisms such as bacteria, yeast and mold are used as lipases for biodiesel production (Fjerbaek et al., 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). Candida antarctica lipase B (CalB) derived from yeast Candida antarctica is an efficient biocatalyst used in isomeric conversion, polyester synthesis, and biodiesel conversion, and is an immobilization enzyme sold by Novozymes. Novozym435 is being studied as an enzyme for biodiesel conversion reaction. Novozym435 is an enzyme produced by mass production using a fungal expression system and immobilized on acrylic resin. It is sold at a very high price (2 million won / kg), which makes it difficult to apply it to the actual biodiesel production process. Therefore, researches to reduce enzyme cost by improving enzyme activity and mass production by recombination method are being conducted.

이와 관련하여, 본 발명자들은 효모표면 발현 방법을 이용하여 CalB를 분자진화하고 스크리닝하여 고활성의 효소 CalB14를 개발(한국특허 제0475133호)한 바 있으며, 이를 효모 단백질융합인자 기술을 이용하여 재조합 대량생산(한국특허 제0626753호)하였고, 이를 이용하여 생물학적 친환경 바이오디젤 생산에 적용한바 있다(한국특허 제0697310호).In this regard, the present inventors have developed a highly active enzyme CalB14 (Korean Patent No. 0475133) by molecularly evolving and screening CalB using a yeast surface expression method, and using a recombinant yeast protein fusion factor technology. It was produced (Korean Patent No. 0626753), and has been applied to the production of bio-friendly biodiesel using this (Korean Patent No. 0697310).

이러한 배경 하에서, 효소의 추가적인 개량을 통해 효소활성을 더욱 증진시키고 효소비용을 절감하기 위하여 CalB14를 분자진화하였다. 고활성의 CalB를 스크리닝하는 방법으로 분자진화 후 유전자 라이브러리를 효모에 형질전환하고 트리뷰티린 배지에 도말하여 나타나는 기질분해 환(halo)의 크기를 보고 1차 선별하는데 CalB14는 이미 활성이 매우 높은 상태라 활성환의 크기가 커서 추가 개량 및 스크리닝하는데 문제가 있었다. 이에, 본 발명자들은 보다 활성이 증진된 변이 리파제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CalB14가 가진 변이부분(L219Q와 L278P)을 제외한 나머지 부분만을 이용하여 분자진화한 후 활성이 증가된 변이주를 선별하고 원래 CalB14가 가진 변이 부분을 세포내 재조합(in vivo recombination) 방법으로 재도입하여 CalB14보다 활성이 더욱 증가된 변이주를 다수 선별하였으며, 이를 효모 사카로마이세스 및 피키아 파스토리스에서 재조합 대량생산하는 방법을 개발하여 효소를 대량생산하고 레진에 고정화하여 바이오디젤 전환효율을 개선함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under this background, CalB14 was molecularly evolved to further enhance enzyme activity and reduce enzyme cost through further improvement of enzyme. The screening method of high activity CalB transforms the genetic library into yeast after molecular evolution, and selects it first by looking at the size of the stromal halo that appears in the tributyrin medium. CalB14 is already very active. D. The size of the active ring was large and there was a problem in further improvement and screening. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop more active mutant lipases. As a result, the mutant strains having increased activity after molecular evolution using only the remaining portions except for the mutant portions (L219Q and L278P) of CalB14 were selected and originally By re-introducing the mutant portion of CalB14 by in vivo recombination method, a number of mutant strains with more activity than CalB14 were selected, and a method for recombinant mass production in yeast Saccharomyces and Pichia pastoris The present invention was completed by improving the biodiesel conversion efficiency by developing and mass producing enzymes and immobilizing on resin.

본 발명의 목적은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 리파제에 변이가 도입되어 활성이 증진된 변이 리파제를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a mutant lipase having enhanced activity by introducing a mutation into a lipase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the mutant lipase.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a transformant in which the expression vector is introduced into a host cell.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for producing a mutant lipase having enhanced activity, comprising culturing the transformant and recovering the lipase from the culture or the culture supernatant thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to obtain a transformed transformant by (a) introducing the expression vector into a host cell; (b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; (c) to provide a biodiesel production method comprising the step of producing biodiesel from fats and oils using the recovered lipase.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 리파제에 변이가 도입되어 활성이 증진된, 변이 리파제를 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a mutant lipase, the activity is enhanced by introducing a mutation into a lipase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

본 발명에서 용어, "활성이 증진된 변이 리파제"는 지방을 분해하는 효소인 리파제 고유의 활성이 증대되도록, 리파제의 아미노산 서열이 변이된 리파제를 의미한다.As used herein, the term "mutant lipase having enhanced activity" refers to a lipase in which the amino acid sequence of the lipase is mutated so that the intrinsic activity of the lipase, an enzyme that degrades fat, is increased.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 변이를 유도하기 위하여 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법과 세포내 재조합 방법을 이용하였고, 이를 위치지정 변이도입(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 변이의 특성을 분석함으로써, 리파제 활성이 증진되는 변이를 확인하였다.In an embodiment of the present invention, the mutation-induced polymerase chain reaction (error-prone PCR) method and intracellular recombination method were used to induce the mutation, and the site-directed mutagenesis method was used. By analyzing the nature of the mutations, we identified variations that enhance lipase activity.

본 발명에서 용어, "리파제"는 카르복실릭 에스터 수산화효소(carboxylic ester hydrolase)로 식품 산업, 미세화합물 합성, 계면활성제 사업 등에 많이 이용되는 효소로서, 본 발명의 일 실시예에서는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB)를 주형으로 하여 변이를 유도하였다.In the present invention, the term "lipase" is a carboxylic ester hydrolase, which is widely used in the food industry, microcompound synthesis, surfactant business, and the like, and in one embodiment of the present invention, Candida antarctica ( Candyda) Mutation was induced using lipase B (CalB) derived from antarctica ).

본 발명에서 용어, "리파제 CalB"는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B 단백질로서, 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이지만, 20℃ 이하의 저온조건에서만 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상이 없이 정상적인 단백질이 생성되고, 효모의 생육 적정온도인 30℃에서 배양하게 되면 단백질의 접힘이나 퇴화 현상 등으로 인해 전체적인 생산성이 감소되는 특성을 가지고 있어 대량 생산에 어려움이 있는 단백질로 알려져 있는 효소이다.As used herein, the term "lipase CalB" is Candida has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 antatika (Candida Antarctica ) -derived lipase B protein, which is the most used enzyme for the synthesis of pharmaceuticals and fine chemicals, but produces only normal protein without folding or degradation of the protein only at low temperature below 20 ℃, It is an enzyme known as a protein having difficulty in mass production because it has a characteristic of reducing overall productivity due to protein folding or degeneration when cultured at a proper temperature for growth of yeast at 30 ° C.

본 발명자들은 상기 리파제 CalB의 대량 생산에 대한 문제를 극복하고자 리파제 CalB의 219번 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로 치환되고, 278번 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 리파제 CalB14를 개발한 바 있으며(한국특허 제0475133호), 이는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명은 상기 리파제 CalB14에 추가적인 변이를 도입하여, 리파제 활성이 더욱 증진된 변이 리파제에 관한 것으로서, 상기 변이 리파제를 이용하면 바이오디젤의 생산에 있어 바이오디젤 전환반응 효율 및 효소의 반복사용 효율이 더욱 증진될 수 있다.In order to overcome the problem of mass production of the lipase CalB, the present inventors have substituted leucine (L), amino acid 219 of lipase CalB, with glutamine (Q), and leucine (L), amino acid 278, is proline (P). The lipase CalB14 substituted with the above has been developed (Korean Patent No. 0475133), which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The present invention relates to a mutant lipase by introducing additional mutations into the lipase CalB14, which further enhances lipase activity. The use of the mutant lipase further improves biodiesel conversion efficiency and repeated use efficiency of enzymes in the production of biodiesel. Can be promoted.

상기 변이 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 71번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 세린(S)으로, 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지거나, 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 80번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로, 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
The mutant lipase include, but are not limited to, preferably antatika Candida (Candida Phenylalanine (F), the 71st amino acid of the polypeptide expressed from lipase B (CalB) derived from antarctica ), is serine (S), leucine (L), the 219th amino acid, is glutamine (Q), and the 278th amino acid, Louis Threonine (T), the 80th amino acid of a polypeptide expressed from Candida antartica-derived lipase B (CalB), having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in which cine (L) is substituted with proline (P), is replaced by alanine (A). The amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, wherein the 219th amino acid leucine (L) is substituted with glutamine (Q) and the 278th amino acid leucine (L) is substituted with proline (P).

본 발명에서 상기 변이 리파제는 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP) 단백질과 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 직접적으로 또는 링커에 의해서 연결된 것일 수 있다.In the present invention, the mutant lipase may be linked with a protein fusion factor (TFP) protein. The connection may be directly or by a linker.

본 발명에서 용어, "단백질융합인자"는 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미한다. 또한, "단백질융합인자 단백질"은 상기한 바와 같은 단백질융합인자 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 단백질을 의미한다. 상기 단백질융합인자는 바람직하게는 한국특허 제0626753호, 제0798894호, 제0975596호에 개시되어 있는 단백질융합인자를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 TFP3 일 수 있다.As used herein, the term "protein fusion factor" refers to a gene that is fused with a gene encoding a low expression protein to induce secretion of a low expression protein. In addition, "protein fusion factor protein" means a protein of the amino acid sequence encoded by a protein fusion factor gene as described above. Preferably, the protein fusion factor may be the protein fusion factor disclosed in Korean Patent Nos. 0626753, 0798894, and 0975596, and more preferably, TFP3.

상기 단백질융합인자 단백질은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 TFP3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 30번째 아미노산인 트립토판(W)이 아르기닌(R)으로 치환된 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다.The protein fusion factor protein is not limited thereto, but may preferably have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in which the tryptophan (W), the 30th amino acid of the polypeptide expressed from TFP3, is substituted with arginine (R).

따라서, 상기 단백질융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로, TFP3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 30번째 아미노산인 트립토판(W)이 아르기닌(R)으로 치환된 서열을 가질 수 있다.
Accordingly, the mutant lipase linked to the protein fusion factor protein is not limited thereto, and preferably, leucine (L), which is the 219th amino acid of the polypeptide expressed from Candida anthica lipase B (CalB), is converted into glutamine (Q). The 278th amino acid leucine (L) may be a proline (P), and the tryptophan (W), the 30th amino acid of the polypeptide expressed from TFP3, may be substituted with arginine (R).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding said variant lipase.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥으로서, 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.As used herein, the term "polynucleotide" is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are long chained by covalent bonds, and are DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid) strands of a predetermined length or more. Polynucleotides encoding variant lipases.

본 발명의 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 변이 리파제를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 변이 리파제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.The polynucleotide encoding the mutant lipase of the present invention changes the amino acid sequence of the mutant lipase expressed from the coding region due to the degeneracy of the codon or in consideration of the codons preferred in the organism to which the mutant lipase is to be expressed. Various modifications may be made to the coding region within a range not to be made, and various modifications or modifications may be made within the range not affecting the expression of genes in parts other than the coding region, and such modified genes may also be included in the scope of the present invention. Those skilled in the art will appreciate that included. That is, as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having equivalent activity, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, which are also included in the scope of the present invention.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 활성이 증진된 변이 리파제뿐만 아니라, 상기 리파제와 단백질융합인자 단백질이 연결된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.The polynucleotide of the present invention may be a polynucleotide encoding a polypeptide to which the lipase and a protein fusion factor protein are linked, as well as a mutant lipase having enhanced activity.

상기 폴리뉴클레오타이드는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 12의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 12는 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로 치환되고, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환되고, 80번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환되고, 단백질융합인자3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 99번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열이다.
The polynucleotide is not limited thereto, but may preferably have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 12 shows that leucine (L), the 219th amino acid of the polypeptide expressed from Candida anthica lipase B (CalB), is replaced with glutamine (Q), and 278th amino acid, leucine (L) is the proline (P). Amino acid sequence wherein threonine (T), the 80th amino acid, is substituted with alanine (A), and threonine (T), the 99th amino acid of the polypeptide expressed from protein fusion factor 3, with alanine (A). The base sequence encoding the polypeptide consisting of.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.As another aspect, the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명에서 용어, "벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which it is linked, and one type of vector "plasmid" refers to a circular double-stranded DNA capable of additionally connecting DNA fragments therein. It means a loop.

본 발명에서 용어, "발현벡터"는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시하는 벡터를 의미하며, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 바람직하게는 플라스미드 형태일 수 있다.As used herein, the term "expression vector" means a vector that directs the expression of a gene encoding a target protein operably linked, and may be preferably in the form of a plasmid in the use of recombinant DNA technology.

본 발명의 발현벡터는 활성이 증진된 변이 리파제 또는 단백질융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특히, 단백질 융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 경우, 단백질융합인자에 의하여 활성이 증진된 변이 리파제를 고효율로 생산할 수 있다.The expression vector of the present invention may include a polynucleotide encoding a mutant lipase linked to a mutant lipase or a protein fusion factor protein having enhanced activity. In particular, when transforming by introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding a mutant lipase linked to a protein fusion factor protein into a host cell, the mutant lipase whose activity is enhanced by the protein fusion factor can be produced with high efficiency.

본 발명의 일 실시예에서는, 피키아 발현벡터 pAO815를 사용하여 ST3-CalB1422를 삽입하여 도 5에 도시된 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터를 구축하였다.
In one embodiment of the present invention, the pAO815-ST3-CalB1422 expression vector shown in FIG. 5 was constructed by inserting ST3-CalB1422 using the Pichia expression vector pAO815.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a transformant transformed by introducing the expression vector into a host cell.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.As used herein, the term "transformation" means that the DNA is introduced into the host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 등의 효모류, 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium) 및 라이조퍼스(Rhizopus) 속 등의 사상 균류 및 에셔리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus) 속 등의 세균류를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용할 수 있다.The host cell used for transformation according to the present invention may be any host cell well known in the art, but is not limited thereto. Preferably, Candida , Debaryomyces , and Hansenula (Hansenula), Cluj Vero My process (Kluyveromyces), Pichia (Pichia), ski irradiation Caro My process (Schizosaccharomyces), Yarrow's (Yarrowia) and a saccharide as hyomoryu such as My process (Saccharomyces) genus Aspergillus (Aspergillus ), Penny chamber William (Penicillium) and rayijo Perth (Rhizopus) in such and the use of fungi such as filamentous fungi and Escher Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus) genus, and more preferably from my process or blood in Saccharomyces Pichia pastoris can be used.

본 발명의 일 실시예에서는 전기천공법을 사용하여 피키아 파스토리스 GS115 균주에 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터를 도입시켜 형질전환하여 GS115/pAO815-ST3-CalB1422 형질전환체를 제조하였고, 상기 형질전환체가 발현하는 단백질의 리파제 활성이 높음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention using the electroporation method was transformed by introducing the pAO815-ST3-CalB1422 expression vector to the Pichia pastoris GS115 strain to prepare a GS115 / pAO815-ST3-CalB1422 transformant, the transformation It was confirmed that the lipase activity of the protein expressed by the sieve is high.

상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 통하여 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 다중카피로 도입된 것일 수 있다. 상기 다중카피는 바람직하게는 3 내지 6 카피로 도입된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 5 카피로 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 다중카피로 도입된 형질전환체가 단일카피로 도입된 형질전환체보다 4,000 U/L 이상의 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 11 및 표 6).
The transformant may be one in which the polynucleotide encoding the mutant lipase is introduced into multiple copies through the expression vector. The multicopy may preferably be introduced in 3 to 6 copies, more preferably in 4 to 5 copies. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the transformants introduced by multicopy show higher activity than 4,000 U / L than the transformants introduced by single copy (FIG. 11 and Table 6).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법을 제공한다.As another aspect, the present invention provides a method for producing a modified lipase having enhanced activity, comprising culturing the transformant and recovering the lipase from the culture or the culture supernatant thereof.

상기 변이된 리파제를 회수하는 단계는 상기 배양물로부터 수득한 배양균체 또는 배양 상등액을 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질 침전, 투석 등의 공지된 정제방법을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 수행될 수 있고, 회수된 목적 단백질의 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 등의 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
The step of recovering the mutated lipase is cell culture or culture supernatant obtained from the culture cell disruption, extraction, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, protein precipitation, dialysis, etc. Known purification methods may be performed alone or in a suitable combination, and the identification of the protein of interest recovered may be performed using conventional methods known in the art, such as SDS-PAGE and Western blot.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법을 제공한다.(A) introducing the expression vector into a host cell to obtain a transformant transformed with the transformant; (b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; And (c) producing biodiesel from the fats and oils using the recovered lipase.

본 발명에서 상기 (a) 단계는 상기 활성이 증진된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계로서, 형질전환체에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the step (a) is a step of obtaining a transformant transformed by introducing an expression vector comprising a polynucleotide encoding the mutant lipase having enhanced activity into a host cell, the transformant As described above.

본 발명에서 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계로서, 리파제를 회수하는 단계에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, step (b) is a step of recovering the lipase from the culture or the culture supernatant by culturing the transformant obtained in step (a), as described above for the step of recovering the lipase.

본 발명에서 상기 (c) 단계는 (b) 단계에서 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계이다.In the present invention, step (c) is a step of producing biodiesel from fats and oils using the lipase recovered in step (b).

상기 회수된 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 자유로운 형태 또는 고정화된 형태로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 고정화된 형태로 사용할 수 있다. 상기 리파제의 고정화는 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는 다양한 응용이 가능하다. 예를 들어, 흡착법, 포괄법 등의 물리적인 방법 및 공유결합법, 가교연결방법 등의 화학적인 방법을 사용할 수 있다.The recovered lipase is not limited thereto, but may be preferably used in free form or immobilized form, and more preferably in immobilized form. Immobilization of the lipase may use various methods commonly used in the art, and various applications are not limited thereto. For example, physical methods such as adsorption, encapsulation, and chemical methods such as covalent bonding and crosslinking can be used.

본 발명의 일 실시예에서는 고정화 흡착담체로서 Lewatit VP OC 1600 (Bayer)을 이용하여 재조합 대량생산된 CalB1411 및 CalB1422를 고정화하였으며(도 14), 상기 고정화 효소를 이용하여 바이오디젤의 전환반응 효율 및 반복사용 효율을 확인한 결과, 대조군인 CalB14에 비하여 그 효율이 월등히 높음을 확인하였다(도 15 및 16). 이러한 결과는, 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 대량 생산방법은 고효율, 반복사용 및 경제성의 장점을 가짐으로써, 바이오디젤 생산에 있어 걸림돌이 되고 있는 효소의 비용 및 대량생산에 관한 문제점을 해결할 수 있음을 의미한다.In an embodiment of the present invention, the recombinant mass-produced CalB1411 and CalB1422 were immobilized using Lewatit VP OC 1600 (Bayer) as an immobilized adsorption carrier (FIG. 14), and the conversion reaction efficiency and repetition of biodiesel using the immobilized enzyme. As a result of confirming the use efficiency, it was confirmed that the efficiency is much higher than the control group CalB14 (Figs. 15 and 16). These results, the mass production method of biodiesel using the mutant lipase of the present invention has the advantages of high efficiency, repeated use and economical, thereby solving the problems related to the cost and mass production of enzymes that are obstacles in biodiesel production Means that you can.

상기 유지는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 천연유지, 가공유지 및 폐유지 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 대두유, 채종유, 팜유 등을 사용할 수 있다.The fat or oil is not limited thereto, but may be preferably selected from natural oils, processed oils and waste oils, and more preferably soybean oil, rapeseed oil, palm oil and the like.

상기 알코올은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 8개인 알코올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 4개인 알코올을 사용할 수 있으며, 구체적으로 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 이소-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올 또는 테르-부탄올 등을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 당업계에 공지된 다양한 공급 방식을 이용하여 공급할 수 있으며, 여러 단계에 걸쳐서 공급하거나 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있다. The alcohol is not limited thereto, but preferably, alcohol having 2 to 8 carbon atoms may be used, and more preferably alcohol having 2 to 4 carbon atoms may be used, and specifically, ethanol, methanol, 1- Propanol, iso-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol or ter-butanol and the like can be used. The alcohol may be supplied using a variety of feeding methods known in the art, may be used to supply a plurality of stages or a continuous supply, preferably a continuous supply.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 변이 리파제인 CalB1411 및 CalB1422를 담체에 고정화하여 식물성 유지와 메탄올로부터 바이오디젤로 전환하는 반응을 수행한 결과, 대조군인 CalB14에 비하여 초기반응속도가 월등히 빠름을 확인하였다(도 15). 따라서, 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법은 효율이 월등하며 경제적인 방법임을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, as a result of immobilizing the mutant lipases of CalB1411 and CalB1422 of the present invention to the carrier to perform the reaction of vegetable oil and methanol to biodiesel, the initial reaction rate is significantly faster than the control CalB14 (FIG. 15). Therefore, it was confirmed that the production method of biodiesel using the mutant lipase of the present invention is superior and economical.

본 발명에 따라 생산된 활성이 증진되도록 변이된 리파제를 이용하면, 종래의 리파제보다도 효율적인 효소 반응을 수행할 수 있어 바이오디젤의 경제적 생산에 널리 활용할 수 있다.
By using a lipase mutated to enhance the activity produced according to the present invention, it is possible to perform an enzyme reaction more efficient than conventional lipases can be widely used for economic production of biodiesel.

도 1은 CalB14의 변이주 라이브러리 제조과정을 도식한 그림이다.
도 2는 CalB14의 변이주의 활성을 평판 배지상에서 확인한 그림이다.
도 3은 CalB14 변이주의 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 리파제를 발현하는 효모균주(Y2805△gal80/pYGaST3-CalB1422)를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터의 제조과정을 도식한 그림이다.
도 6은 피키아 파스토리스 GS115에 도입된 ST3-CalB1422 형질전환체들의 활성을 트리뷰티린이 첨가된 평판 배지 상에서 확인한 결과이다.
도 7은 피키아 파스토리스 GS115에 도입된 ST3-CalB1422 형질전환체들의 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 8은 리파제를 발현하는 피키아 파스토리스(GS115/pAO815-ST3-CalB1422)를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 9는 피키아 파스토리스에 다중카피 도입을 위한 pPIC-ST3-CalB1422 발현벡터의 제조과정을 도식한 그림이다.
도 10은 피키아 파스토리스 GS115에 다중 도입된 CalB1422 형질전환체들의 활성을 트리뷰티린이 첨가된 평판 배지 상에서 확인한 결과이다.
도 11은 피키아 파스토리스 GS115에 다중 도입된 CalB1422 형질전환체들의 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 12는 GS115/pPIC-ST3-CalB1422 변이주의 카피 수를 나타낸 결과이다.
도 13은 다중 카피 GS115/pPIC-ST3-CalB1422 균주를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 14는 흡착레진에 효소를 고정화하면서 상등액에 남아있는 효소의 활성(A) 및 잔여단백질(B)을 시간별로 분석한 결과이다.
도 15는 고정화 효소를 이용하여 바이오디젤 전환율을 시간별로 측정한 그래프이다.
도 16은 고정화 효소를 바이오디젤 전환반응에 반복 사용하였을 때 효소의 안정성을 측정한 그래프이다.
도 17은 고정화 효소 CalB1422를 이용하여 메탄올 공급방법(3단계 및 연속공급)에 따른 바이오디젤 전환율을 측정한 그래프이다.1 is a diagram illustrating a process for preparing a mutant strain library of CalB14.
Figure 2 is a picture confirming the activity of the mutant strains of CalB14 on the plate medium.
Figure 3 is an electrophoresis picture showing the results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of CalB14 mutant strains.
4 is an electrophoresis photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of the cell growth graph showing the results of fed-batch culture of yeast strain expressing lipase (Y2805Δgal80 / pYGaST3-CalB1422) in a 5 L fermenter and the culture supernatant of each hour.
FIG. 5 is a diagram illustrating the production process of pAO815-ST3-CalB1422 expression vector.
Figure 6 shows the results of the activity of the ST3-CalB1422 transformants introduced into Pichia pastoris GS115 on a tributyrin added plate medium.
Figure 7 is an electrophoresis picture showing the results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatants of ST3-CalB1422 transformants introduced into Pichia pastoris GS115.
8 is a cell growth graph showing the results of fed-batch cultivation of lipase expressing Pichia pastoris (GS115 / pAO815-ST3-CalB1422) in a 5 L fermenter and electrophoresis photographs showing the results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant over time to be.
9 is a diagram illustrating a manufacturing process of a pPIC-ST3-CalB1422 expression vector for introducing multiple copies into Pichia pastoris.
FIG. 10 shows the results of calB1422 transformants introduced into Pichia pastoris GS115 on tributyrin-added flat medium.
Figure 11 is an electrophoresis picture showing the results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of CalB1422 transformants multiplexed into Pichia pastoris GS115.
12 shows the copy numbers of GS115 / pPIC-ST3-CalB1422 mutant strains.
FIG. 13 is a cell growth graph showing the results of fed-batch culture of the multi-copy GS115 / pPIC-ST3-CalB1422 strain in a 5 L fermenter and an electrophoresis photograph showing the results of the SDS-PAGE analysis of the culture supernatant over time.
14 is a result of analyzing the activity (A) and the residual protein (B) of the enzyme remaining in the supernatant while fixing the enzyme in the adsorption resin over time.
15 is a graph measuring biodiesel conversion rate by time using immobilized enzyme.
16 is a graph measuring the stability of the enzyme when the immobilized enzyme is repeatedly used in the biodiesel conversion reaction.
Figure 17 is a graph measuring the biodiesel conversion according to the methanol supply method (three steps and continuous supply) using the immobilized enzyme CalB1422.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

실시예Example 1:  One: CalB14Calb14 변이주 라이브러리 구축 Mutant library construction

CalB14 변이주 라이브러리를 구축하기 위하여, 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법과 세포내 재조합 방법을 이용하였다. CalB14의 경우 219번째 루이신이 글루타민으로 교체된 변이(L219Q)가 단백질 생산량을 증가시키며, 278번째 루이신이 프롤린으로 교체된 변이(L278P)는 단백질 비활성을 증가시키는 것을 이전의 연구에서 확인하였다(Kim 등, 2007, J Microbiol Biotechnol. 17; 한국특허 제0475133호). 추가적인 효소 활성 개량 및 분비생산성 개량 변이를 유도하기 위해서 CalB14의 L219Q와 L278P 변이부분을 변화시키지 않고 단백질융합인자(TFP3) 서열과 CalB 유전자의 218번째 아미노산까지만 변이를 유도하였다. 그러나 처음부터 L219Q와 L278P 변이를 도입하게 되면 효소 활성이 높아 트리뷰티린 배지에서 활성 개량된 변이를 선별하는데 어려움이 있다. 따라서 CalB14 유전자를 주형으로 218번 아미노산까지만 변이를 유도하여 활성이 개량된 변이를 선별하고, 추후 L219Q와 L278P 변이를 도입하여 활성이 더 개량된 균주를 선별하였다. CalB14를 분비 발현하는 벡터인 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 2 프라이머를 사용하여 변이유도 중합효소연쇄반응(PCR random mutagenesis kit, Clontech)을 수행하였다. 변이유도는 1kb당 2개 정도의 변이를 유도하는 조건으로 수행하였으며, 94℃에서 30초 동안 1회; 94℃ 30초간, 68℃ 1분간 반응을 25회; 68℃에서 1분간 1회 반응조건으로 PCR을 수행하였다. 219번 아미노산 이후의 유전자 확보를 위해 pYGa-ST3-wt CalB를 주형으로 하고 서열번호 3 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 증폭된 유전자는 아가로스젤 전기영동을 통해 회수하였다. 상기의 방법으로 얻어진 두 개의 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805(Mat a pep4 :: HIS3 prb1 can1 his3 -200 ura3-52)균주에 도입하였다(도 1).
To construct the CalB14 mutant strain library, mutation-induced polymerase chain reaction (error-prone PCR) and intracellular recombination were used. In the case of CalB14, a previous study confirmed that the 219th leucine-substituted glutamine-induced mutation (L219Q) increased protein production and the 278th leucine-proline-mutated (L278P) increased protein inactivation (Kim et al. , 2007, J Microbiol Biotechnol. 17; Korean Patent No. 0475133). To induce additional enzyme activity and secretion improvement, only the fusion factor (TFP3) sequence and the 218th amino acid of CalB gene were induced without altering the L219Q and L278P mutations of CalB14. However, the introduction of L219Q and L278P mutations from the beginning, it is difficult to screen for improved activity in tributyrin medium because of the high enzyme activity. Therefore, the strain was selected to improve the activity by inducing mutations up to amino acid No. 218 as a template of the CalB14 gene, and further strains were further selected by introducing L219Q and L278P mutations. Mutation-induced polymerase chain reaction (PCR random mutagenesis kit, Clontech) was carried out using pYGa-ST3-CalB14, a vector expressing CalB14 as a template, using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 primers. Mutation induction was carried out under the condition of inducing about 2 mutations per kb, once at 94 ° C. for 30 seconds; 25 reactions of 94 DEG C for 30 seconds and 68 DEG C for 1 minute; PCR was performed under reaction conditions once at 68 ° C. for 1 minute. Polymerization chain reaction using pYGa-ST3-wt CalB as a template and using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 primers (once for 5 minutes at 94 ° C; for 94 minutes for 30 seconds, 55) The reaction was carried out 25 times for 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds; once 7 minutes at 72 ℃), the amplified gene was recovered by agarose gel electrophoresis. The two polymerase chain products obtained by the above method were subjected to Saccharomyces cerevisiae Y2805 ( Mat a pep4 :: HIS3) by intracellular recombination with pYGa vector obtained by digestion with EcoRI / SalI. prb1 can1 his3 -200 ura3-52 ) was introduced into the strain (Fig. 1).

실시예Example 2:  2: CalB14Calb14 변이주 선별 Mutant strain screening

세포내 재조합을 통해 형성된 형질전환체는 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.077% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 포도당)에 72 시간 배양하여 활성환이 증가된 균주를 1차 선별하였다. 약 1,000개의 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 접종하여 배양 후 큰 활성환을 보이는 균주 22주를 2차 선별하였다(도 2).The transformants formed through intracellular recombination were incubated for 72 hours in selective medium containing 1% tributyrin (yeast substrate lacking 0.67% amino acid, nutrient supplement lacking 0.077% uracil, 2% glucose). Increased strains were selected first. About 1,000 strains were inoculated in selective medium containing 1% tributyrin, respectively, and the second strain of 22 strains showing a large active ring after incubation was selected (FIG. 2).

형질전환체들의 리파제 활성을 측정하기 위하여 100㎕ 50mM pNPP(ρ-nitrophenyl palmitate), 1.9㎖ 에틸 알콜, 38㎖ 50mM pH 7.5의 트리스 완충액이 조합된 반응액 1㎖에 20㎕의 배양 상등액을 첨가한 후 410㎚에서의 흡광도를 측정하였다. pNPP를 기질로 사용한 리파제 활성 측정 방법은 pNP기와 팔미테이트가 연결된 pNPP가 리파제에 의해 팔미테이트로부터 pNP기가 절단되어 나오면서 유리된 pNP기가 410 nm에서 흡광하는 정도를 측정하는 방법이다. 본 발명에서 리파제의 활성 1 unit는 1분당 1μM의 pNP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다.To measure the lipase activity of the transformants, 20 μl of culture supernatant was added to 1 ml of the reaction solution containing 100 μl 50 mM pNPP (ρ-nitrophenyl palmitate), 1.9 mL ethyl alcohol, and 38 mL 50 mM Tris buffer at pH 7.5. The absorbance at 410 nm was then measured. The lipase activity measuring method using pNPP as a substrate is a method of measuring the extent to which pNPP, which is linked with pNP group and palmitate, is cleaved out of pNP group from palmitate by lipase, and the free pNP group absorbs at 410 nm. In the present invention, one unit of lipase activity was defined as the activity of an enzyme releasing a pNP group of 1 μM per minute.

22개 형질전환체들의 리파제 활성을 측정한 결과, 야생형 CalB보다는 수십배 활성이 개량되었으나 CalB14보다 활성이 높은 변이체가 없음을 확인하였다(표 1). 이후, CalB14의 추가 활성 개량을 위하여 L219Q와 L278P 변이를 도입하였다.
As a result of measuring the lipase activity of 22 transformants, it was confirmed that there was no mutant having higher activity than CalB14, although the activity was improved several times than that of wild type CalB (Table 1). Later, L219Q and L278P mutations were introduced to further improve CalB14 activity.

각 형질전환체들의 리파제 활성 분석Analysis of lipase activity of each transformant Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) wt CalBwt CalB 4.84.8 1111 264264 CalB14Calb14 16201620 1212 361361 1One 232232 1313 334334 22 264264 1414 183183 33 189189 1515 189189 44 189189 1616 156156 55 453453 1717 183183 66 205205 1818 183183 77 210210 1919 189189 88 199199 2020 183183 99 205205 2121 329329 1010 151151 2222 183183

실시예Example 3: 선별된  3: screened CalBCalb 변이주에  In variation L219QL219Q , , L278PL278P 변이 도입 Mutation introduction

확보된 CalB 변이주에 L219Q와 L278P 변이를 도입하기 위해 22개의 형질전환체를 혼합 후 게놈 DNA를 분리하였다. 이를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 2 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 도입된 STFP 서열과 CalB 유전자의 218번째까지의 아미노산 서열을 증폭하였다. 219번 아미노산 이후의 유전자 확보를 위해 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 3 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 L219Q와 L278P 변이를 도입하였다.
In order to introduce L219Q and L278P mutations in the obtained CalB mutants, genomic DNA was isolated after mixing 22 transformants. As a template, the polymerase chain reaction was carried out using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 primers (once for 5 minutes at 94 ° C; for 30 minutes at 94 ° C for 30 seconds, for 30 seconds at 55 ° C for 30 minutes; 1 time 7 minutes) in the amplified STFP sequence and the 218th amino acid sequence of the CalB gene was amplified. Polymerization chain reaction using pYGa-ST3-CalB14 as a template and using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 primers (once for 5 minutes at 94 ° C; for 94 minutes for 30 seconds and 55 ° C) L219Q and L278P mutations were introduced through 25 reactions for 30 seconds at 72 ° C. for 30 seconds; once at 72 ° C. for 7 minutes.

실시예Example 4:  4: L219QL219Q 와 Wow L278PL278P 가 도입된 Introduced CalBCalb 변이주의 선별 Mutantism Screening

세포내 재조합을 통해 형성된 형질전환체는 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 72 시간 배양하여 활성환이 증가된 균주를 1차 선별하였다. 약 500개의 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 접종하여 배양한 후, 큰 활성환을 보이는 균주 22주를 2차 선별하였다. pNPP를 기질로 사용하여 형질전환체들의 리파제 활성을 측정한 결과 7개 변이주에서 CalB14보다 활성이 증가한 것을 확인하였다(표 2).
The transformants formed through intracellular recombination were cultured for 72 hours in a selective medium containing 1% tributyrin, and the strains with increased active ring were first selected. About 500 strains were inoculated into selective medium containing 1% tributyrin, respectively, and then cultured, and 22 strains showing a large active ring were secondarily selected. As a result of measuring the lipase activity of the transformants using pNPP as a substrate, it was confirmed that the activity of CalB14 was increased in seven mutant strains (Table 2).

각 형질전환체들의 리파제 활성 분석Analysis of lipase activity of each transformant Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) CalB14Calb14 12961296 1212 15661566 1One 13501350 1313 937937 22 783783 1414 10801080 33 972972 1515 14531453 44 945945 1616 10261026 55 10531053 1717 10261026 66 13501350 1818 999999 77 918918 1919 12151215 88 810810 2020 10101010 99 20082008 2121 10531053 1010 891891 2222 20362036 1111 21602160

각 변이주의 활성증가 요인을 분석하기 위하여 YPDG(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 갈락토오스) 배지에서 40시간 배양한 후, 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석하였다. 그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 활성이 증가한 균주에서 단백질 생산량 또한 증가한 것을 확인하였다(도 3).
In order to analyze the factor of increase in activity of each mutant strain, the culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE after 40 hours incubation in YPDG (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose) medium. As a result, as shown in Figure 3, it was confirmed that the protein production also increased in the strain with increased activity (Fig. 3).

실시예Example 5: 변이주의 염기서열 및  5: The nucleotide sequence of the mutant and 리파제Lipase 활성 분석 Activity analysis

실시예 4에서 높은 활성을 나타내는 6종의 변이주로부터 유전자를 분리한 후 염기 서열 분석을 실시하였다. 변이는 STFP 부분과 CalB 부분에서 각각 확인되었다. 1번, 6번, 15번 변이주의 경우 STFP 서열에서 30번째 트립토판이 아르기닌으로 치환된 변이가 확인되었으며, 9번 변이주는 STFP 서열에서 31번째 세린이 프롤린으로, CalB14 서열에서 71번째 페닐알라닌이 세린으로 치환된 변이가 확인되었다. 11번 변이주는 CalB14 서열에서 71번째 페닐알라닌이 세린으로 치환된 변이가 확인되었고, 22번 변이주는 STFP 서열에서 99번째 트레오닌이 알라닌으로, CalB14 서열에서는 80번째 트레오닌이 알라닌으로 치환된 변이가 확인되었다(표 3).
In Example 4, genes were separated from six mutants showing high activity, followed by sequencing. Mutations were identified in the STFP and CalB regions, respectively. In variants 1, 6, and 15, mutations in which the 30th tryptophan was substituted with arginine in the STFP sequence were identified, and in the 9th strain, the 31st serine was selected from proline in the STFP sequence, and the 71st phenylalanine was replaced from serine in the CalB14 sequence. Substituted mutations were identified. Variant 11 confirmed the substitution of serine in the 71st phenylalanine sequence in the CalB14 sequence, and variant 22 in the STFP sequence identified the substitution of alanine for the 99th threonine and in the CalB14 sequence for the 80th threonine. Table 3).

선별 변이주의 아미노산 변이서열 및 리파제 활성Amino Acid Variation Sequence and Lipase Activity of Selected Mutants CalB14 변이주CalB14 Variation 변이서열Variant sequence STFP3 부분STFP3 part CalB14 추가변이CalB14 additional variation 1One W30RW30R -- 66 W30RW30R -- 99 S31PS31P F71SF71S 1111 -- F71SF71S 1515 W30RW30R -- 2222 T99AT99A T80AT80A

실시예Example 6: 위치지정 변이도입( 6: Introduce positioning mutations sitesite -- directeddirected mutagenesismutagenesis ) 방법을 이용한 변이 특성 분석Analysis of Mutation Characteristics Using

각 변이 단백질의 아미노산 변이가 활성 변화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 위치지정 변이도입을 시도하였다. 9번 변이주에 존재하는 STFP-S31P 변이만을 단독 도입한 construct 1을 제조하기 위하여 먼저 9번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 포함된 STFP 유전자를 증폭하였다. 이후 CalB14 유전자만의 증폭을 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 통하여 두 절편을 연결하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 1을 제조하였다.In order to analyze the effect of amino acid variation of each mutant protein on the activity change, we tried to introduce the positional mutation. In order to prepare construct 1 incorporating only STFP-S31P mutation present in mutant 9, polymerase chain reaction was carried out using the mutant 9 gene as a template and using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 primers (5 minutes at 94 ° C). 1 time; 25 ° C for 94 ° C for 30 seconds, 25 ° C for 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds for 1 minute at 72 ° C for 7 minutes) to amplify the STFP gene containing the mutation. Then, for amplification of the CalB14 gene alone, pYGa-ST3-CalB14 was used as a template, and the polymerase chain reaction was carried out using the SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 4 primers (once at 94 ° C. for 5 minutes; 94 ° C. for 30 seconds and 55 ° C. 30). 25 seconds at 72 ° C. for 1 minute; once at 72 ° C. for 7 minutes). After each gene fragment was mixed, the two fragments were linked to each other by the polymerase chain reaction under the same conditions as the above using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 primers. The polymerase chain product obtained by the above method was introduced into Y2805 into Saccharomyces cerevisiae through intracellular recombination with pYGa vector obtained by cleavage with EcoRI / SalI to prepare construct 1.

22번 변이주에 존재하는 STFP-T99A 변이만을 단독 도입한 construct 2를 제조하기 위하여 먼저 22번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 포함된 STFP 유전자를 증폭하였다. 이후 CalB14 유전자만의 증폭을 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 통하여 두 절편을 연결하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 2를 제조하였다.To prepare construct 2 incorporating only STFP-T99A variant present in mutant 22 alone, polymerase chain reaction (5 min at 94 ° C.) was performed using mutant 22 gene as a template and using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 primers. 1 time; 25 ° C for 94 ° C for 30 seconds, 25 ° C for 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds for 1 minute at 72 ° C for 7 minutes) to amplify the STFP gene containing the mutation. Then, for amplification of the CalB14 gene alone, pYGa-ST3-CalB14 was used as a template, and the polymerase chain reaction was carried out using the SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 4 primers (once at 94 ° C. for 5 minutes; 94 ° C. for 30 seconds and 55 ° C. 30). 25 seconds at 72 ° C. for 1 minute; once at 72 ° C. for 7 minutes). After each gene fragment was mixed, the two fragments were linked to each other by the polymerase chain reaction under the same conditions as the above using SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 primers. The polymerase chain product obtained by the above method was introduced into Y2805 into Saccharomyces cerevisiae by intracellular recombination with pYGa vector obtained by digestion with EcoRI / SalI to prepare construct 2.

22번 변이주에 존재하는 CalB14-T80A 변이만을 단독으로 도입한 construct 3을 제조하기 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하여 STFP 유전자 부분을 증폭하였다. 이후 T80A 변이 도입을 위하여 22번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 하여 두 절편을 연결하였고, 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 3을 제조하였다.To prepare construct 3 incorporating only CalB14-T80A mutation present in mutant 22, pYGa-ST3-CalB14 was used as a template, and the polymerase chain reaction (5 at 94 ° C. using primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5). STFP gene portions were amplified by one time for 1 minute; 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute of reaction; 25 minutes for 1 minute at 72 ° C. Then, in order to introduce the T80A mutation, the mutant strain 22 was used as a template, and the polymerase chain reaction was performed using the SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 4 primers (once for 5 minutes at 94 ° C; for 30 minutes at 55 ° C for 30 seconds and at 72 ° C for 72 hours). The reaction was carried out 25 times for 1 minute; once for 7 minutes at 72 ° C. After mixing each gene fragment, the mixture was used as a template, and the two fragments were linked by polymerase chain reaction under the same conditions as those of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and the polymerase chain product was digested with EcoRI / SalI. Construct 3 was prepared by introducing Y2805 into Saccharomyces cerevisiae through intracellular recombination with the obtained pYGa vector.

상기 획득한 형질전환 균주는 YPDG 배지에서 40시간 배양한 후 배양 상등액을 회수하여, 상기와 동일한 방법으로 리파제 활성을 측정하였다. 1번 변이주의 경우, STFP-W30R 단독 변이에 의해서도 약 31%의 활성 증가를 보여 단백질분비융합인자의 변이에 따른 분비효율 증가인 것을 확인하였다. 11번 변이주의 경우, CalB-F71S 변이가 도입되면서 리파제 활성이 약 54% 증가하였으며, Construct 3의 경우, CalB-T80A 변이가 도입되면서 리파제 활성이 약 15% 증가한 것을 확인하였다. 그러나, STFP-S31P 및 STFP-T99A 변이가 도입된 Construct 1 및 2의 경우, 오히려 리파제 활성이 감소하는 경향을 나타내었다(표 4). 결론적으로, CalB-F71S 및 CalB-T80A 변이가 분비효율 향상 또는 직접적인 활성증가에 영향을 주며, 분비효율에 영향을 준 변이는 STFP-W30R 변이임을 확인하였다.
The obtained transformed strain was cultured in YPDG medium for 40 hours, and then the culture supernatant was recovered, and lipase activity was measured in the same manner as described above. In case of mutant 1, the STFP-W30R alone showed increased activity of about 31%, confirming the increased secretion efficiency according to the mutation of the protein secretion fusion factor. In mutant 11, the lipase activity was increased by about 54% with the introduction of the CalB-F71S mutation, and in construct 3, the lipase activity was increased by about 15% with the introduction of the CalB-T80A mutation. However, for Constructs 1 and 2, in which STFP-S31P and STFP-T99A mutations were introduced, lipase activity tended to decrease (Table 4). In conclusion, it was confirmed that CalB-F71S and CalB-T80A mutations affect the secretion efficiency or direct activity increase, and the mutations affecting secretion efficiency were STFP-W30R mutations.

각 변이주들의 리파제 활성 분석Analysis of Lipase Activity in Different Mutants CalB14 변이주CalB14 Variation 변이서열Variant sequence Lipase activity (U/L)
Lipase activity (U / L)
STFP3STFP3 CalB14Calb14 CalB14Calb14 -- -- 41844184 CalB1401CalB1401 W30RW30R -- 54805480 CalB1409Calb1409 S31PS31P F71SF71S 60466046 CalB1411Calb1411 -- F71SF71S 64786478 CalB1422Calb1422 T99AT99A T80AT80A 48324832 construct 1construct 1 S31PS31P -- 30183018 construct 2construct 2 T99AT99A -- 31043104 construct 3construct 3 -- T80AT80A 48464846

실시예Example 7:  7: 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애를Servebiia 이용한 변이  Used variation 리파제의Lipase 대량생산 massive production

사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에서 Gal10 프로모터가 발현되기 위해서는 인듀서(inducer)로서 갈락토오즈(galactose)가 존재하여야 하는데 갈락토오즈는 매우 값비싼 당류이며 세포의 성장을 위하여 탄소원으로 사용되어 없어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 포도당만 사용하여 Gal10 프로모터를 발현할 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805△gal80(Mat a pep4 :: HIS3 gal80::Tc190, prb1 can1 his3 -200 ura3 -52)을 사용하여 효율적인 재조합 생산을 시도하였다. In order to express Gal10 promoter in Saccharomyces cerevisiae Y2805 strain, galactose must exist as an inducer. Galactose is a very expensive saccharide and is used as a carbon source for cell growth. Disappear. In order to solve this problem, the present inventors used Saccharomyces cerevisiae Y2805Δgal80 ( Mat a pep4 :: HIS3 gal80 :: Tc190, prb1) , which can express the Gal10 promoter using only glucose. can1 his3 -200 ura3 -52 ) was used for efficient recombinant production.

리파제 활성이 높고 하기 실시예 16에서 고정화 효율이 좋은 것으로 확인된 CalB1422를 대량 생산하기 위하여, pYGa-ST3-CalB1422 재조합 벡터를 Y2805△gal80 균주에 형질전환 하여 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본배양에 들어가기 전에 50mℓ의 최소 액체배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노에시드, 2% 포도당)에 초기배양한 후 200mℓ의 YPD 액체배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배지로 분비된 리파제를 확인하기 위하여 시간별 배양 상등액을 취하여 SDS-PAGE 분석하였다(도 4). CalB1422 유전자 크기로부터 유추되는 단백질 크기(33 kD)보다 큰 50 kD 단백질로 분비 생산되었는데, 이는 단백질분비융합인자 TFP3의 pro 서열이 융합된 형태로 분비 생산되기 때문임을 선행연구에서 확인한 바 있다. 48시간의 발효 배양 후 약 3g/ℓ의 리파제가 배지로 분비 생산되었음을 확인하였다. pNPP 측정법을 이용하여 발효 시간별 활성을 분석한 결과 48시간의 발효 배양 후 약 250,000 U/L의 활성을 확인하였다(도 4).
In order to mass-produce CalB1422 having high lipase activity and good immobilization efficiency in Example 16, pYGa-ST3-CalB1422 recombinant vector was transformed into Y2805Δgal80 strain and fed-batch culture in a 5 L fermenter. 200 ml of YPD liquid medium (1% yeast extract, 2% peptone) after initial incubation in 50 ml of minimum liquid medium (yield substrate lacking 0.67% amino acid, 0.5% cassamino acid, 2% glucose) before entering the main culture 2% glucose) was activated and then inoculated into the culture medium and incubated at 30 ° C. for 48 hours. In order to identify the lipase secreted into the medium, an hourly culture supernatant was taken and analyzed by SDS-PAGE (FIG. 4). A previous study confirmed that 50 kD protein was secreted and produced larger than the protein size (33 kD) inferred from the CalB1422 gene size, because the pro sequence of the protein secretion factor TFP3 was produced in a fused form. After 48 hours of fermentation culture, it was confirmed that about 3 g / L of lipase was secreted into the medium. As a result of analyzing the activity of the fermentation time using the pNPP measurement method, the activity of about 250,000 U / L was confirmed after 48 hours of fermentation culture (FIG. 4).

실시예Example 8:  8: 피키아Pikia 파스토리스에서In pastoris CalB1422Calb1422 의 분비 발현을 위한 벡터 제조Preparation for secretory expression of

메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메탄올에 의해 발현이 유도되는 AOX 프로모터를 이용하여 리터당 수십 그람의 재조합 단백질을 발현할 수 있고 값싼 배지를 사용하여 손쉽게 고농도 세포배양이 가능하며 특히 하이퍼-글리코실레이션 문제도 다른 효모와 비교하여 커다란 문제가 되지 않는 등의 다양한 장점이 있다. 따라서 CalB1422 변이주를 피키아 파스토리스에서 발현하여 대량생산하고자 하였다.Methanol magnetized yeast, Pichia pastoris , can express dozens of grams of recombinant protein per liter using the AOX promoter, which is induced by methanol, and can easily culture high concentrations of cells using cheap media, especially hyper -Glycosylation problem is not a big problem compared to other yeast, and has various advantages. Therefore, mutant CalB1422 was expressed in Pichia pastoris and mass production.

CalB1422 유전자의 분비 발현 벡터 제조를 위해 상용화되어 있는 피키아 발현 벡터인 pAO815(Invitrogen)를 사용하였다. 본 발명에서 구축된 pYGa-ST3-CalB1422를 주형으로 하여 서열번호 13 및 서열번호 14 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 CalB1422 유전자를 획득하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분 조건으로 25 cycle 반응하고 72 ℃에서 10분간 반응하였다. PCR 증폭 후 제한효소 EcoRI 으로 3시간 처리 한 다음 동일 효소로 처리된 pAO815와 T4 ligase를 첨가하여 16℃에서 1시간 반응 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환체는 항생제 앰피실린이 포함된 2YT 평판배지 (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar)에서 배양하여 선별하였다. 선별된 콜로니는 염기서열 분석을 통해 확인하였고 최종적으로 pAO815-ST3-CalB1422 발현 벡터를 구축하였다(도 5).
A pKia expression vector, pAO815 (Invitrogen), which is commercially available for the production of the secreted expression vector of CalB1422 gene, was used. CalB1422 gene was obtained by polymerase chain reaction using pYGa-ST3-CalB1422 constructed in the present invention as a template and using SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 primers. After PCR reaction for 5 minutes at 95 ℃ for 25 cycles of 95 ℃ 30 seconds, 55 ℃ 1 minutes, 72 ℃ 1 minutes conditions were reacted for 10 minutes at 72 ℃. After PCR amplification, the enzyme was treated with restriction enzyme Eco RI for 3 hours, and then, pAO815 and T4 ligase treated with the same enzyme were added and transformed into E. coli strain DH5α after 1 hour reaction at 16 ° C. Transformants were selected by culturing in 2YT plate medium containing antibiotic ampicillin (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar). Selected colonies were confirmed by sequencing and finally, a pAO815-ST3-CalB1422 expression vector was constructed (FIG. 5).

실시예Example 9:  9: 피키아Pikia 파스토리스Pastor 균주의 형질전환 및 형질전환체 선별 Transformation of strains and selection of transformants

상기 실시예 8에서 구축된 pAO815-ST3-CalB1422의 HIS4 부분을 SalI 제한효소로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들고 이를 농축시켰다. 피키아 파스토리스 GS115 균주를 YPD 배지에 접종하여 OD600이 1.3~1.5가 될 때까지 배양하였다. 배양된 균주를 4℃, 1500ㅧg로 5분간 원심분리하고 냉각 멸균 증류수로 펠렛을 녹이고 다시 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 펠렛에 10mM DTT가 첨가된 LiAc(100mM LiAc, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.6M Sorbitol) 10 ml에 현탁하여 실온에서 30분간 반응하였다. 이후, 1M 솔비톨을 처리한 후 원심분리 과정을 반복하여 최종 부피 1 ml이 되는 컴피턴트 세포(competent cell)를 얻었다. 상기 컴피턴트 세포 100 ㎕에 SalI으로 처리하여 선형으로 만든 pAO815-ST3-CalB1422 5 ㎕를 혼합하여 전기천공법(electroporation, 2.0kV, 200Ω, 2.5 msec)을 통해 형질전환하였다. 즉시 1M 솔비톨 1ml을 첨가하여 멸균튜브로 옮긴 후 30℃에서 1시간 정치배양하여 세포들을 회복시켰다. 형질전환체들은 minimal dextrose(MD) 배지에 도말하여 히스티딘(histidine) 요구성에 따라 1차 선별하였다. 선별된 형질전환체들을 무작위로 선별 후 MD-1% Tributyrin + 0.5% Methanol 배지에 점적(spotting)하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후 균주 주변의 환의 크기를 측정하여 형질전환체들의 활성을 확인하였고 그 중 활성이 가장 좋은 형질전환체 10개를 선별하였다(도 6).
The HIS4 portion of pAO815-ST3-CalB1422 constructed in Example 8 was treated with Sal I restriction enzymes to make a linear DNA state and concentrated. Pichia Pastoris GS115 strains were inoculated in YPD medium and cultured until the OD 600 was 1.3-1.5. The cultured strain was centrifuged at 1500 ° C. for 4 minutes at 4 ° C., the pellet was dissolved in cold sterile distilled water, and centrifuged again for 5 minutes. The pellet was centrifuged and suspended in 10 ml of LiAc (100 mM LiAc, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.6 M Sorbitol) to which 10 mM DTT was added and reacted at room temperature for 30 minutes. Thereafter, after treating with 1M sorbitol, centrifugation was repeated to obtain competent cells having a final volume of 1 ml. 100 μl of the competent cells were mixed with 5 μl of pAO815-ST3-CalB1422, which was linearly treated with Sal I, and transformed by electroporation (2.0 kV, 200 Ω, 2.5 msec). Immediately, 1 ml of 1M sorbitol was added to the sterile tube, and the cells were recovered by standing incubation at 30 ° C. for 1 hour. Transformants were first screened according to histidine requirements by plating in minimal dextrose (MD) medium. The selected transformants were randomly selected and then spotted in MD-1% Tributyrin + 0.5% Methanol medium for 24 hours at 30 ° C, and then the activity of the transformants was confirmed by measuring the size of the ring around the strain. Among them, 10 of the best transformants were selected (Fig. 6).

실시예Example 10:  10: 피키아Pikia 파스토리스를Pastoris 이용한  Used CalB1422Calb1422 의 재조합 발현Recombinant Expression of

피키아 파스토리스로 형질전환된 GS115/pAO815-ST3-CalB1422의 발현을 위해 선별된 형질전환체를 글리세롤을 탄소원으로 하는 YPG(1% Yeast extract, 2% Peptone, 1% Glycerol) 배지에 접종하여 30℃에서 200rpm으로 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 원심 분리하여 세포를 분리한 후 YPM(1% Yeast extract, 2% Peptone, 4ㅧ10-5% Biotin, 0.5% Methanol) 배지에 접종하고, 30℃에서 48시간 배양하였고, 24시간 간격으로 0.5% 메탄올을 첨가하여 발현을 유도하였다. Transformants selected for expression of GS115 / pAO815-ST3-CalB1422 transformed with Pichia pastoris were inoculated in YPG (1% Yeast extract, 2% Peptone, 1% Glycerol) medium using glycerol as a carbon source. Incubated at 200 rpm for 12 hours. Cells were separated by centrifugation and the cells were inoculated in YPM (1% Yeast extract, 2% Peptone, 4 ㅧ 10 -5 % Biotin, 0.5% Methanol) medium, incubated at 30 ° C for 48 hours, and 24 hour intervals. 0.5% methanol was added to induce expression.

배양 상등액에 아세톤을 첨가하여 농축 후 SDS-PAGE 분석한 결과 리파제가 배지로 분비 생산되었음을 확인하였다(도 7). 피키아 파스토리스의 경우에도 CalB1422 유전자 크기로부터 유추되는 단백질 크기(33 kD) 보다 큰 TFP3의 pro부분이 융합된 형태의 단백질인 50 kD 단백질로 분비 생산되었다. 발현된 단백질을 pNPP를 기질로 하여 리파제 활성을 측정한 결과 10개의 형질전환체들은 2800~3200 U/L로 비슷한 활성을 보였으며, 그 중 1번 형질전환체에서 가장 높은 활성을 보여 최종 균주로 선별하였다(표 5).
Acetone was added to the culture supernatant, concentrated, and then analyzed by SDS-PAGE to confirm that lipase was secreted into the medium (FIG. 7). In the case of Pichia pastoris, the pro portion of TFP3, which is larger than the protein size (33 kD) inferred from the CalB1422 gene size, was secreted and produced as a fused form of 50 kD protein. As a result of measuring the lipase activity of the expressed protein as pNPP, 10 transformants showed similar activity at 2800 ~ 3200 U / L. Selected (Table 5).

재조합 피키아 파스토리스 형질전환체의 리파제 활성 분석Analysis of Lipase Activity of Recombinant Pichia Pastoris Transformants 형질전환체Transformant Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) 1One 32543254 22 30423042 33 29062906 44 28162816 55 27542754 66 27682768 77 26582658 88 26282628 99 28052805 1010 28362836

실시예Example 11:  11: 피키아Pikia 파스토리스를Pastoris 이용한  Used 리파제Lipase 대량 생산  massive production

CalB1422를 대량 생산하기 위하여 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖의 최소 액체배지(0.67% Yeast nitrogen base without amino acid, 0.5% Casamino acid, 2% Glucose)에 1단계 초기배양한 후 다시 200 ㎖의 YPG 액체배지(3% Yeast extract, 1.5% Peptone, 2% Glycerol)에서 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(10% Yeast extract, 40% Glycerol)를 추가 공급하였다. 재조합 균주는 30℃에서 빠르게 성장하였고, 배양 20시간부터 6시간 간격으로 0.5% methanol을 공급하여 발현을 유도하였다. 배지로 분비된 CalB1422 단백질을 확인하기 위하여 시간별 배양 상등액을 취하여 SDS-PAGE 분석한 결과 시간이 증가됨에 따라 발현 단백질 양도 증가됨을 확인하였고, 배양 48시간 후 세포농도가 260 OD600에 도달하였고 약 37,200 U/L의 활성을 확인하였다(도 8).
Fed-batch culture was carried out in a 5 L fermenter for mass production of CalB1422. Prior to the incubation, 1 ml initial culture in 50 ml of minimum liquid medium (0.67% Yeast nitrogen base without amino acid, 0.5% Casamino acid, 2% Glucose) and then 200 ml of YPG liquid medium (3% Yeast extract, 1.5% Peptone, 2% Glycerol) was activated by incubation in the culture medium and incubated for 48 hours at 30 ℃. Feeding culture medium (10% Yeast extract, 40% Glycerol) was further supplied according to the cell growth rate. Recombinant strains were rapidly grown at 30 ℃, expression was induced by feeding 0.5% methanol every 6 hours from 20 hours culture. SDS-PAGE analysis of the culture supernatant taken to confirm the secreted CalB1422 protein in the medium was confirmed that the amount of expression protein increased with increasing time, the cell concentration reached 260 OD 600 after 48 hours of culture and about 37,200 U The activity of / L was confirmed (FIG. 8).

실시예Example 12:  12: CalB1422Calb1422 유전자 다중 도입  Gene multiple introduction 피키아Pikia 균주 제조 Strain manufacturing

도입된 유전자 카피수와 단백질 발현량은 절대적인 것은 아니지만, 일반적으로 어느 정도의 비례관계를 가지고 있기 때문에 CalB1422 유전자가 다중 도입된 균주를 제조하여 발현을 비교하였다. 다중카피 도입을 위한 벡터 제조를 위해 상용화되어있는 피키아 발현 벡터인 pPIC3.5K(Invitrogen)를 사용하였다. 실시예 8에서 구축된 발현 벡터 pAO815-ST3-CalB1422를 EcoRI 으로 3시간 처리하여 ST3-CalB1422 유전자를 얻어 동일 효소로 처리된 pPIC3.5K에 T4-ligase를 첨가하여 하여 16℃에서 1시간 반응 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환체는 항생제 앰피실린이 포함된 2YT 평판배지 (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar)에서 배양하여 선별하였다. 선별된 콜로니는 제한효소를 통해 ST3-CalB1422 유전자가 제대로 들어가 있음을 확인하였고 최종적으로 pPIC-ST3-CalB1422 발현 벡터를 구축하였다(도 9). 구축된 pPIC-ST3-CalB1422의 AOX1 부분을 SacI 제한효소로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들어 전기천공법을 통해 피키아 파스토리스 GS115 균주에 형질전환하였다. 형질전환체들은 1mg/ml의 G418이 첨가된 minimal dextrose(MD) 배지에 도말하여 1차 선별하였다. 1차 선별된 형질전환체들을 다시 MD-1% 트리뷰티린 + 0.5% 메탄올 배지에 점적(spotting)하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후 단일카피 도입 균주보다 환의 크기가 큰 5개의 형질전환체를 선별하였다(도 10). 선별된 형질전환체를 상기 실시예 10에서 설명한 방법으로 배양하여 CalB1422 단백질 분비정도 및 각 균주의 활성을 비교하였다(도 11 및 표 6). 다중 카피 CalB1422가 단일 카피 CalB1422보다 4,000 U/L 이상의 높은 활성을 보였고, 그 중 3번과 5번의 형질전환체에서 가장 높은 활성을 확인하였다.
Although the number of gene copies introduced and the amount of protein expression are not absolute, they generally have some proportional relationship, and thus, the expressions of the CalB1422 genes introduced in multiples were prepared and compared. A pichia expression vector, pPIC3.5K (Invitrogen), which is commercially available for the preparation of a vector for multicopy introduction, was used. The expression vector pAO815-ST3-CalB1422 constructed in Example 8 was treated with EcoRI for 3 hours to obtain ST3-CalB1422 gene, and T4-ligase was added to pPIC3.5K treated with the same enzyme. Strain DH5α was transformed. Transformants were selected by culturing in 2YT plate medium containing antibiotic ampicillin (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar). Selected colonies confirmed that the ST3-CalB1422 gene was properly inserted through restriction enzymes, and finally, a pPIC-ST3-CalB1422 expression vector was constructed (FIG. 9). The AOX1 portion of the constructed pPIC-ST3-CalB1422 was treated with SacI restriction enzymes to make a linear DNA state and transformed into Pichia Pastoris GS115 strain by electroporation. Transformants were first screened by plating in minimal dextrose (MD) medium supplemented with 1 mg / ml G418. The first selected transformants were spotted again in MD-1% tributyrin + 0.5% methanol medium and incubated at 30 ° C. for 24 hours, and five transformants having a larger ring size than the single copy introduced strains were obtained. Screened (FIG. 10). Selected transformants were cultured by the method described in Example 10 above to compare the degree of CalB1422 protein secretion and the activity of each strain (FIG. 11 and Table 6). Multi-copy CalB1422 showed more than 4,000 U / L higher activity than single-copy CalB1422, of which the highest activity was confirmed in 3 and 5 transformants.

다중카피 발현 벡터를 함유한 형질전환체의 리파제 활성 분석Analysis of Lipase Activity of Transformants Containing Multiple Copy Expression Vectors 형질전환체Transformant Lipase activity (U/L)Lipase activity (U / L) Single copySingle copy 36963696 1One 81008100 22 83928392 33 85548554 44 81658165 55 88788878

실시예Example 13:  13: CalB1422Calb1422 변이주의 카피 수 결정 및  Determine the number of copies of variation 리파제Lipase 대량생산 massive production

염색체에 도입된 유전자의 카피수를 결정하기 위하여 RNA를 추출하여 real-time PCR 분석(JMC R&D, 한국)하였다. 대조구인 단일카피 CalB1422와 다중카피 CalB1422 중 리파제 활성이 높았던 2개의 형질전환체의 카피수를 비교하였다. 총 RNA로부터 폴리아데닐화된 mRNA를 분리 후 cDNA를 합성하여 각 샘플의 보정 유전자와 확인하고자 하는 유전자의 Ct(Cycle Threshold) 값을 비교하였다. Ct란, 형광의 기준치를 정하고 이에 도달하기 위해 각 시료가 진행해야 하는 사이클 수이다. Delta CT relative quantitation 분석 결과 대조구로 사용된 단일카피 CalB1422 변이주를 캘리브레이터(calibrator)로 정하였을때 이를 기준으로 하여 3번의 형질전환체는 4 카피, 5번의 형질전환체는 5 카피로 GS115 균주에 삽입되었음을 확인하였다(도 12). Delta CT relative quantitation 분석법이란 보정 유전자의 Ct값으로 양을 보정하여 확인 유전자의 발현양의 차이를 비교하여 상대적인 비교양을 분석하는 방법이다. 이 결과로 CalB1422 변이주의 카피수가 높을수록 리파제 활성이 더 높음을 확인하였고, 5번 형질전환체를 최종 균주로 선별하였다. 최종 선별된 다중카피 CalB1422 변이주의 대량 생산을 위하여 실시예 11에서 제시한 방법과 동일하게 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 배양 22시간부터 0.5% 메탄올을 6시간 간격으로 공급하고 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(10% Yeast extract, 20% Glycerol)를 추가 공급하였다. 배양 결과, 배양말기에 220 OD600까지 증가하였고, 리파제 활성은 370,000 U/L로 단일 카피 변이주에 비해 활성이 10배 정도 증가한 것을 확인하였고 분비단백질의 양은 리터당 약 5 g 수준이었다(도 13).
In order to determine the copy number of the gene introduced into the chromosome, RNA was extracted and real-time PCR analysis (JMC R & D, Korea). The copy number of two transformants with high lipase activity in the control single copy CalB1422 and multicopy CalB1422 were compared. Polyadenylation mRNA was isolated from total RNA, and cDNA was synthesized to compare Ct (Cycle Threshold) values of the genes to be confirmed and the genes to be identified. Ct is the number of cycles each sample must proceed in order to determine and reach the reference value of fluorescence. Based on the Delta CT relative quantitation analysis, the single copy CalB1422 mutant strain was used as a control. Based on this, three transformants were inserted into the GS115 strain with four copies and five transforms with five copies. It was confirmed (FIG. 12). Delta CT relative quantitation analysis is a method of analyzing the relative comparison amount by comparing the difference in the expression amount of the identified gene by correcting the amount by the Ct value of the corrected gene. As a result, it was confirmed that the higher the copy number of CalB1422 mutant strain, the higher the lipase activity, and 5 transformants were selected as the final strain. Fed-batch culture was performed in a 5 L fermenter in the same manner as in Example 11 for mass production of the finally selected multicopy CalB1422 mutant strains. 0.5% methanol was supplied at 6 hour intervals from 22 hours of incubation, and fed fed fed culture medium (10% Yeast extract, 20% Glycerol) according to the cell growth rate. As a result of the culture, it was increased to 220 OD 600 at the end of the culture, the lipase activity was 370,000 U / L was confirmed that the activity was increased by 10 times compared to the single copy mutant strain and the amount of secreted protein was about 5 g per liter (Fig. 13).

실시예Example 14: 재조합  14: recombination CalB1411Calb1411 및  And CalB1422Calb1422 의 레진 고정화 및 활성측정Resin fixation and activity measurement

재조합 대량생산된 CalB1411 및 CalB1422를 이용하여 바이오디젤 생산용 고정화촉매를 개발하기 위해서, 고정화 흡착담체로서 Lewatit VP OC 1600 (Bayer)을 이용하여 고정화하였다. 효소를 고정화하기 전에 담체 30g을 메탄올 75㎖에 60분간 세척한 후 다시 300㎖의 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)에 25℃에서 1시간동안 세척하여 전처리하였다. 효소액은 레진 그람 당 2000u을 첨가하여 진탕배양기에서 25℃, 200rpm의 속도로 15시간 고정화시켰다. 고정화 시간은 상등액에 존재하는 초기 효소활성과 일정시간이 경과한 후 잔여 효소활성을 비교하여 더 이상 잔여활성이 변화가 없을 때까지 고정화 반응을 진행하였다(도 14의 (A)). 또한 도 14의 (B)에서 보는 바와 같이 반응시간별 상등액에 남아 있는 단백질량을 확인하기 위하여, 고정화 시간별로 시료를 취해서 고정화되지 않고 상등액에 남아 있는 CalB 효소의 양을 확인하였다. 고정화 반응이 끝난 담체는 거름종이와 유리깔때기를 이용하여 회수하고 다시 300㎖의 상기 완충용액으로 고정화된 담체를 반복 세척하였다. 세척된 고정화 효소는 상온에서 진공펌프를 이용하여 건조시키고 4℃에 보관하였다.
In order to develop an immobilization catalyst for biodiesel production using recombinant mass-produced CalB1411 and CalB1422, it was immobilized using Lewatit VP OC 1600 (Bayer) as an immobilized adsorption carrier. Before the enzyme was immobilized, 30 g of the carrier was washed with 75 ml of methanol for 60 minutes and then pretreated by 300 ml of 50 mM Tris buffer solution (pH 7.6) at 25 ° C. for 1 hour. Enzyme solution was added to 2000 grams per gram of resin and fixed at 15 ° C. at 25 ° C. at 200 rpm in a shake incubator. The immobilization time was compared with the initial enzyme activity present in the supernatant and the residual enzyme activity after a certain time, and the immobilization reaction proceeded until the residual activity was no longer changed (FIG. 14A). In addition, in order to confirm the amount of protein remaining in the supernatant for each reaction time, as shown in FIG. 14B, samples were taken for each immobilization time to confirm the amount of CalB enzyme remaining in the supernatant without immobilization. After the immobilization reaction, the carrier was recovered using a filter paper and a glass funnel, and the carrier immobilized with 300 ml of the buffer solution was repeatedly washed. The washed immobilized enzyme was dried using a vacuum pump at room temperature and stored at 4 ℃.

실시예Example 15: 고정화된 효소를 이용한 바이오디젤 전환반응 효율 비교 15: Comparison of biodiesel conversion efficiency using immobilized enzyme

상기한 바와 같이 흡착 담체에 CalB14, CalB1411 및 CalB1422를 고정화하여 바이오디젤 전환반응 효율을 비교하였다. 식물성유지(대두유, soybean oil) 9.65㎖에 메탄올 0.35㎖을 첨가하고 각 고정화 효소를 10%(w/v) 첨가하여 40℃에서 강력하게 교반하면서 시간별로 생성된 바이오디젤을 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 식물성 유지(triacylglyceride, TG)와 메탄올이 반응하여 바이오디젤(fatty acid methyl ester)로 100% 전환되기 위해서는 전체 유지 양의 11%(v/v) 정도의 메탄올이 필요하다. 그러나 고농도의 메탄올은 효소를 불활성화 하기 때문에 메탄올을 단계적으로 첨가하는 것이 효소를 장기간 사용하기 위해서는 유리하다. 본 반응에서는 메탄올을 초기 반응 시 3.5%의 메탄올을 첨가하고 추가로 메탄올을 첨가하지 않았기 때문에 최대 바이오디젤 전환율은 약 35% 정도이다. As described above, the biodiesel conversion efficiency was compared by immobilizing CalB14, CalB1411 and CalB1422 on the adsorption carrier. 9.65 ml of vegetable oil (soybean oil) was added to 0.35 ml of methanol, and 10% (w / v) of each immobilized enzyme was added. , Agilent). Vegetable oil (triacylglyceride (TG)) and methanol to react to 100% conversion to biodiesel (fatty acid methyl ester) 100% of the total amount of methanol (v / v) of methanol is required. However, high concentrations of methanol inactivate the enzyme, so stepwise addition of methanol is advantageous for long-term use of the enzyme. In this reaction, the maximum biodiesel conversion was about 35% because methanol was added in the initial reaction with 3.5% methanol added and no additional methanol.

전환된 바이오디젤의 분석은 시간별로 시료를 200㎕ 회수하여 13,000ㅧg에서 5분간 원심분리한 뒤 상등액을 회수하고 이를 아세톤에 적절한 비율로 희석하여 이중 5㎕를 앞서 설명한 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 고정상인 칼럼(C18 4.6 x 150 mm)과 이동상인 아세톤, 아세토나이트릴을 사용하였다. 분석 방법은 초기 분석 후 20분까지는 아세토나이트릴을 100% 사용하다가, 20분에서 30분까지는 50%, 30분에서 40분까지는 100%로 변화시킨 그레디언트를 사용하였다. 분석이 끝난 후, 목표한 위치에 나타난 피크 면적을 적분 계산하고 표준곡선과 비교하여 전환율을 측정하였다. 표준곡선은 시판중인 각각의 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl ester, Sigma)를 구입하여 동일한 조건에서 분석하였으며, 각 지방산 메틸 에스터의 농도별 피크면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 측정결과, 초기반응속도가 본 발명에서 발굴한 두 가지 변이효소 CalB1411 및 CalB1422의 경우 CalB14에 비해 월등히 빠름을 알 수 있었다(도 15). 이러한 결과는 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤 생산방법은 대조군인 CalB14를 이용하는 경우에 비하여 바이오디젤의 생산율을 증진시킬 수 있으며, 특히 초기 생산율을 월등히 증진시킴으로써 고효율의 생산방법을 제공할 수 있음을 의미한다.
In the analysis of the converted biodiesel, 200 μl of the sample was recovered by time, centrifuged at 13,000 μg for 5 minutes, the supernatant was recovered, and diluted to an appropriate ratio in acetone. Agilent). Analytical conditions were used as the stationary phase column (C18 4.6 x 150 mm) and mobile phases acetone and acetonitrile. The analysis method used a gradient of 100% acetonitrile until 20 minutes after the initial analysis, 50% from 20 to 30 minutes, 100% from 30 to 40 minutes. After the analysis, the peak area at the target location was integrated and the conversion was measured by comparing with the standard curve. Standard curves were analyzed under the same conditions by purchasing each fatty acid methyl ester (Sigma), and a standard curve was prepared using the peak area of each fatty acid methyl ester. As a result, the initial reaction rate was found to be significantly faster than CalB14 for the two mutant enzymes CalB1411 and CalB1422 discovered in the present invention (Fig. 15). These results suggest that the biodiesel production method using the mutant lipase of the present invention can improve the production rate of biodiesel as compared with the control group CalB14, and in particular, can provide a highly efficient production method by significantly increasing the initial production rate. it means.

실시예Example 16: 고정화 효소의 반복사용 효율 확인 16: Confirmation of repeated use efficiency of immobilized enzyme

두가지 변이효소 CalB1411 및 CalB1422를 고정화한 효소가 바이오디젤 전환반응을 위해 안정적으로 반복사용 가능한지 확인하였다. 이는 효소를 이용하여 바이오디젤 생산시 효소 비용이 높기 때문에 반복적인 사용을 통해서 효소비용을 절감할 수 있어야 하기 때문이다. 식물성유지(대두유, soybean oil) 9.65㎖에 메탄올 0.35㎖을 첨가하고 각 고정화 효소를 10%(w/v) 첨가하여 40℃에서 1시간 반응 후, 상등액을 회수하고 남은 고정화 효소에 다시 새로운 식물성유지와 메탄올을 첨가하는 과정을 9회 반복적으로 수행하여 각 시간별 상등액에서의 FAME 전환율을 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, CalB1422로 고정화된 고정화 효소는 9회 반복 사용하여도 전환율이 감소하지 않고 높은 활성을 유지하였으며, CalB1411은 지속적으로 활성이 감소하여 9회 반응 후 잔여활성이 초기에 비해 50% 정도 감소하였음을 알 수 있었다(도 16). 이러한 결과는 본 발명의 변이 리파제의 고정화 효소가 바이오디젤의 전환을 위한 안정성과 경제성이 우수함을 나타내며, 특히 CalB1422의 경우 반복사용 효율이 우수함을 나타낸다.
It was confirmed that the enzymes immobilized with the two mutant enzymes CalB1411 and CalB1422 can be stably used for biodiesel conversion. This is because the enzyme cost is high in biodiesel production using the enzyme, so it is necessary to reduce the enzyme cost through repeated use. After adding 0.35 ml of methanol to 9.65 ml of vegetable oil (soybean oil) and adding 10% (w / v) of each immobilized enzyme for 1 hour at 40 ° C, the supernatant was recovered and the new vegetable oil was added to the remaining immobilized enzyme. The process of adding methanol and methanol was repeatedly performed nine times, and the FAME conversion rate in the supernatant liquid was analyzed by HPLC (High performance liquid chromatography, Agilent). As a result, the immobilized enzyme immobilized with CalB1422 maintained high activity without decreasing the conversion rate even after 9 repetitions. CalB1411 continuously decreased in activity, resulting in a 50% reduction in residual activity after 9 reactions. It could be seen (Fig. 16). These results indicate that the immobilized enzyme of the mutant lipase of the present invention is excellent in stability and economical efficiency for the conversion of biodiesel, and particularly in the case of CalB1422, it is excellent in repeated use efficiency.

실시예Example 17: 메탄올 공급 방식에 따른 바이오디젤 전환 효율 17: Biodiesel conversion efficiency according to methanol supply method

최종 선별된 CalB1422가 고정화된 레진을 고정화효소로 사용하여 바이오디젤 전환반응을 수행하였다. 고농도의 메탄올에 의한 효소의 불활성화를 막기 위하여 3.5% 의 메탄올을 3단계에 걸쳐서 공급하는 방법과 펌프를 이용하여 시간당 반응액의 2%의 메탄올을 연속적으로 공급하는 방법을 이용하여 바이오디젤 전환속도를 비교하였다. 그 결과, 3단계에 걸쳐서 메탄올을 공급하는 방법은 시작시 한번, 반응 후 1시간 및 3시간째 3.5% 의 메탄올을 추가 공급한 경우 약 5시간 후 최대 전환율을 보여 약 97%의 전환율을 보였다(도 17). 그러나 메탄올을 연속공급하는 방식에서는 약 4시간만에 최대 전환율 97%에 도달하여 간헐적 공급보다는 연속공급 방식이 전환속도가 빠름을 확인하였다(도 17).
The biodiesel conversion reaction was performed using the final selected CalB1422 immobilized resin as an immobilization enzyme. Biodiesel conversion rate by supplying 3.5% methanol in three stages to prevent enzyme inactivation by high concentration of methanol and continuously supplying 2% methanol of reaction solution per hour by pump Was compared. As a result, the method of supplying methanol in three stages showed a maximum conversion rate of about 97% after one hour at the start, and about 5 hours when 3.5% of methanol was added at 1 hour and 3 hours after the reaction ( 17). However, in the method of continuously supplying methanol, the maximum conversion rate reached 97% in about 4 hours, and it was confirmed that the conversion rate of the continuous supply method was faster than the intermittent supply (FIG. 17).

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same <130> PA110372KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 forward primer <400> 1 gtatatggtg gtaatgccat g 21 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(1~218) reverse primer <400> 2 cggcccacac acagcctgtg cctggacgtt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(219~317) forward primer <400> 3 tcctacctct tcaacggaaa gaacgtccag 30 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(219~317) reverse primer <400> 4 gtcattatta aatatatata tatatatatt gtcactccgt tcaagtcgac 50 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 reverse primer <400> 5 tcttttatct aaggcgaggc cagcagaggc cgaggcggcc 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(1~218) forward primer <400> 6 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Candida antarctica <400> 7 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 8 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 <400> 8 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 9 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 F71S mutant <400> 9 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Ser Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 T80A mutant <400> 10 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 W30R mutant <400> 11 Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Arg Ser Thr 20 25 30 Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr 35 40 45 Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg 50 55 60 Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80 Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Met Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu 100 105 110 Ala Leu Asp Lys Arg 115 <210> 12 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 <400> 12 atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60 gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120 tgtggtgcag ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180 aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240 gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccagccagc 300 tccgaaaaga tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag actaccttcc 360 ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag 420 ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc atccttctcg tccccggaac cggcaccaca 480 ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc cccctctctg cgcagctggg ttacacaccc 540 tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc aacgacaccc aggtcaacgc ggagtacatg 600 gtcaacgcca tcaccacgct ctacgctggt tcgggcaaca acaagcttcc cgtgctcacc 660 tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc 720 aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct 780 ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc 840 actaccgcac tccgaaacgc aggcggtctg acccagatcg tgcccaccac caacctctac 900 tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac 960 ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcgac 1020 catgcaggct cgctcacctc gcagttctcn tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc 1080 accacgggcc aggctcgtag tgcggactat ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc 1140 aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc gcggctgcgc tcccggcgcc ggcggctgca 1200 gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc 1260 tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc atcgtcaccc cctga 1305 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 forward primer <400> 13 gaattcatgc aattcaaaaa cgtcgcccta 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 reverse primer <400> 14 gaattcgggg gtgacgatgc cggagcaggt 30 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Mutant lipase with advanced activity and process for production          bio-diesel using the same <130> PA110372KR <160> 14 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 forward primer <400> 1 gtatatggtg gtaatgccat g 21 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (1-218) reverse primer <400> 2 cggcccacac acagcctgtg cctggacgtt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (219-317) forward primer <400> 3 tcctacctct tcaacggaaa gaacgtccag 30 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (219-317) reverse primer <400> 4 gtcattatta aatatatata tatatatatt gtcactccgt tcaagtcgac 50 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 reverse primer <400> 5 tcttttatct aaggcgaggc cagcagaggc cgaggcggcc 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (1-218) forward primer <400> 6 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 7 <211> 317 <212> PRT Candida antarctica <400> 7 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu   1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys              20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe          35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys      50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr  65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn                  85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln             100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu         115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu     130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile                 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro             180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys         195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His     210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr                 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val             260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly         275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe     290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 8 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 <400> 8 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu   1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys              20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe          35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys      50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr  65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn                  85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln             100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu         115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu     130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile                 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro             180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys         195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His     210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr                 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val             260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly         275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe     290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 9 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 F71S mutant <400> 9 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu   1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys              20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe          35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys      50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Met Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr  65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn                  85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln             100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu         115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu     130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile                 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro             180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys         195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His     210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr                 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val             260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly         275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe     290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 T80A mutant <400> 10 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu   1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys              20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe          35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys      50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala  65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn                  85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln             100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu         115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu     130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile                 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro             180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys         195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His     210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr                 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val             260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly         275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe     290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 W30R mutant <400> 11 Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser   1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Arg Ser Thr              20 25 30 Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr          35 40 45 Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg      50 55 60 Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala  65 70 75 80 Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala                  85 90 95 Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Met Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu             100 105 110 Ala Leu Asp Lys Arg         115 <210> 12 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 <400> 12 atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60 gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120 tgtggtgcag ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180 aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240 gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccagccagc 300 tccgaaaaga tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag actaccttcc 360 ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag 420 ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc atccttctcg tccccggaac cggcaccaca 480 ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc cccctctctg cgcagctggg ttacacaccc 540 tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc aacgacaccc aggtcaacgc ggagtacatg 600 gtcaacgcca tcaccacgct ctacgctggt tcgggcaaca acaagcttcc cgtgctcacc 660 tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc 720 aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct 780 ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc 840 actaccgcac tccgaaacgc aggcggtctg acccagatcg tgcccaccac caacctctac 900 tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac 960 ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcgac 1020 catgcaggct cgctcacctc gcagttctcn tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc 1080 accacgggcc aggctcgtag tgcggactat ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc 1140 aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc gcggctgcgc tcccggcgcc ggcggctgca 1200 gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc 1260 tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc atcgtcaccc cctga 1305 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 forward primer <400> 13 gaattcatgc aattcaaaaa cgtcgcccta 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 reverse primer <400> 14 gaattcgggg gtgacgatgc cggagcaggt 30

Claims (11)

서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 리파제에 변이가 도입되어 활성이 증진된, 변이 리파제.
A variant lipase in which a mutation is introduced to a lipase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to enhance activity.
제1항에 있어서, 상기 변이 리파제는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 가지는 것인 변이 리파제.
The variant lipase of claim 1, wherein the variant lipase has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10. 3.
제1항에 있어서, 상기 변이 리파제는 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP) 단백질과 연결된 것인 변이 리파제.
The mutant lipase of claim 1, wherein the mutant lipase is linked to a translational fusion partner (TFP) protein.
제3항에 있어서, 상기 단백질융합인자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것인 변이 리파제.
The mutant lipase of claim 3, wherein the protein fusion factor has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
The polynucleotide encoding the mutant lipase of any one of claims 1 to 4.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12의 염기서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오타이드.
The polynucleotide of claim 5, wherein the polynucleotide has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. 7.
제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터.
An expression vector comprising the polynucleotide of claim 5.
제7항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
A transformant transformed by introducing the expression vector of claim 7 into a host cell.
제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 3 내지 6 카피 도입된 것인 형질전환체.
The transformant of claim 8, wherein the expression vector has 3 to 6 copies of the polynucleotide encoding the variant lipase.
제8항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법.
A method for producing a mutant lipase having enhanced activity, comprising culturing the transformant of claim 8 and recovering the lipase from the culture or the culture supernatant thereof.
(a) 제7항의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; 및
(c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법.
(a) introducing the expression vector of claim 7 into a host cell to obtain a transformed transformant;
(b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; And
(c) using the recovered lipase to produce biodiesel from fats and oils.
KR1020110121244A 2011-11-18 2011-11-18 Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same KR101460228B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110121244A KR101460228B1 (en) 2011-11-18 2011-11-18 Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110121244A KR101460228B1 (en) 2011-11-18 2011-11-18 Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130055477A true KR20130055477A (en) 2013-05-28
KR101460228B1 KR101460228B1 (en) 2014-11-10

Family

ID=48663958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110121244A KR101460228B1 (en) 2011-11-18 2011-11-18 Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101460228B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200050438A (en) * 2018-11-01 2020-05-11 한국생명공학연구원 Mutant lipases of Rhizomucor miehei having enhanced transesterification activity and a method of producing the lipase
KR102225519B1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 한국생명공학연구원 Variants of Candida antartica Lipase B and Their Use

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102254208B1 (en) * 2019-09-27 2021-05-21 주식회사 대한뷰티산업진흥원 Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100475133B1 (en) 2002-09-13 2005-03-10 한국생명공학연구원 Method for screening of a lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and the lipase
KR100697310B1 (en) 2005-04-12 2007-03-20 한국생명공학연구원 Biological method for the production of biodiesel

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200050438A (en) * 2018-11-01 2020-05-11 한국생명공학연구원 Mutant lipases of Rhizomucor miehei having enhanced transesterification activity and a method of producing the lipase
KR102225519B1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 한국생명공학연구원 Variants of Candida antartica Lipase B and Their Use

Also Published As

Publication number Publication date
KR101460228B1 (en) 2014-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011023009A1 (en) Recombinant expression of carboxylesterases
CN109182298B (en) Recombinant lipase mutant, engineering bacterium and application
CN107287222B (en) Application of Hisk2301 gene of histidine kinase
KR101087760B1 (en) Novel recombinant yeasts and methods of simultaneously producing ethanols and target proteins using them
CN107257851A (en) Positive influences are natural or combination of bacterial chaperonin of physiology of eukaryotic of engineering
KR101460228B1 (en) Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same
KR101749429B1 (en) Oleate Hydratase Gene, Expression Vector Containing the Gene, and Transformant Transformed by the Vector
KR20060108327A (en) Biological method for the production of biodiesel
US8652815B2 (en) Transformant comprising gene coding for ws/dgat and method of producing fatty acid ethyl esters using the same
CN106754818B (en) Heat-resistant esterase mutant and preparation method and application thereof
KR102170228B1 (en) A mutant lipase having enhanced transesterification activity and its application for biodiesel production
US9695404B2 (en) Genetically modified microorganism for producing long-chain dicarboxylic acid and method of using thereof
KR101412468B1 (en) Mutant Beta-glucosidase with Advanced Activity and Process for Preparing Bio-ethanol Employing the Same
JP6622564B2 (en) Method for producing 1,4-butanediol
KR102181315B1 (en) Mutant lipases of Rhizomucor miehei having enhanced transesterification activity and a method of producing the lipase
KR101837130B1 (en) Novel lipase from yeast Candida butyri SH-14 and the Use thereof
CN103540558B (en) A kind of method of biological process synthesis prenol
KR101535526B1 (en) Fusion proteins of GH61 with enhanced secretory capability comparing to its wild-type
KR101350955B1 (en) Novel exoglucanase and the Use thereof
Li et al. Overexpression of an inulinase gene in an oleaginous yeast, Aureobasidium melanogenum P10, for efficient lipid production from inulin
CN115851628A (en) Novel mutant protein for increasing malic acid yield
KR101481755B1 (en) Novel endoglucanase and the Use thereof
Yin et al. Construction of a shuttle vector for heterologous expression of a novel fungal α-amylase gene in Aspergillus oryzae
CN116121092B (en) Recombinant saccharomyces cerevisiae with enhanced multiple stress resistance, construction method and application thereof
KR101897189B1 (en) Lipase derived from Penicillium chrysogenum and preparation method of lipase using the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171106

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190328

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191008

Year of fee payment: 6