KR101460228B1 - Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same - Google Patents
Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR101460228B1 KR101460228B1 KR1020110121244A KR20110121244A KR101460228B1 KR 101460228 B1 KR101460228 B1 KR 101460228B1 KR 1020110121244 A KR1020110121244 A KR 1020110121244A KR 20110121244 A KR20110121244 A KR 20110121244A KR 101460228 B1 KR101460228 B1 KR 101460228B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- lipase
- ala
- ser
- pro
- leu
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 활성이 증진된 변이 리파제, 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법 및 상기 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 생산된 활성이 증진되도록 변이된 리파제를 이용하면, 종래의 리파제보다도 효율적인 효소 반응을 수행할 수 있어 바이오디젤의 경제적 생산에 널리 활용할 수 있다.The present invention relates to a mutant lipase having enhanced activity, a polynucleotide encoding the mutant lipase, an expression vector containing the polynucleotide, a transformant transformed by introducing the expression vector into a host cell, The present invention relates to a method for producing a mutant lipase with enhanced activity and a method for producing biodiesel using the mutated lipase, wherein the enzyme reaction is more efficient than the conventional lipase by using the lipase mutated so as to enhance the activity produced according to the present invention And can be widely used in the economic production of biodiesel.
Description
본 발명은 활성이 증진된 변이 리파제 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 활성이 증진된 변이 리파제, 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법 및 상기 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 관한 것이다.
More particularly, the present invention relates to a mutant lipase having enhanced activity, a polynucleotide encoding the mutant lipase, an expression vector containing the polynucleotide, and a method for producing the same. A transformant transformed by introducing the expression vector into a host cell, a method for producing mutant lipase with enhanced activity using the transformant, and a method for producing biodiesel using the mutant lipase.
트리아실글리세롤 리파제(triacylglycerol lipase, EC 3.1.1.3)는 트리아실글리세롤을 분해하는 카르복실릭 에스터 수산화효소(carboxylic ester hydrolase)로서 세제, 유지화합물, 식품 및 정밀화학제품 산업 등 다양한 산업에서 활용되는 생물촉매(biocatalyst)이다. 최근 원유고갈이나 지구온난화 문제로 원유를 대체하는 바이오에너지 연구가 활발하며, 특히 수송용 연료로서 경유를 대체할 수 있는 동, 식물성 유지 유래의 바이오디젤이 전세계적으로 활용되고 있다. 이러한 바이오디젤의 생산 방법은 산이나 알칼리 촉매를 사용하는 화학적인 방법이 주로 이용되고 있으나 고에너지 요구성 공정이며 폐수 등으로 인한 2차 환경오염 문제를 안고 있다(Pizarro 등, 2003, Pceess Biochem, 38,1077). 향후 대규모의 바이오디젤의 생산을 위해서는 친환경적인 바이오디젤 전환공정이 필요한데 다양한 미생물 유래의 생물촉매인 리파제가 바이오디젤 전환반응에 활용되고 있다. 효소를 이용한 바이오디젤 전환은 폐식용유나 유리지방산 함량이 높은 원료 등 다양한 종류의 원료를 이용할 수 있고 바이오디젤 전환을 위해 에너지 비용이 적고 특히 폐수의 발생이 없다는 장점이 있다. 또한, 바이오디젤의 회수가 용이하며 부산물로서 고품질의 글리세린을 얻을 수 있다(Fjerbaek 등, 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). 그러나 효소공정은 상대적으로 반응속도가 느리며 촉매의 생산비용이 높고 장기적인 활성유지가 어려운 단점이 있다. 따라서, 효소를 이용한 바이오디젤의 생산을 위해서는 고활성의 효소를 저비용으로 대량생산하는 기술이 절대적으로 필요하다.
Triacylglycerol lipase (EC 3.1.1.3) is a carboxylic ester hydrolase that degrades triacylglycerol. It is used in a variety of industries including detergents, preservatives, food and fine chemicals industries Catalyst (biocatalyst). In recent years, bio-energy research has been actively carried out to replace crude oil due to the depletion of crude oil and global warming. In particular, biodiesel derived from copper and vegetable oils, which can replace diesel as transportation fuel, is being used worldwide. Although the chemical method using acid or alkali catalyst is mainly used for the production of biodiesel, it is a high energy requirement process and has a secondary environmental pollution problem due to wastewater (Pizarro et al., 2003, Pceess Biochem, 38 , 1077). In order to produce large-scale biodiesel in the future, an environmentally friendly biodiesel conversion process is required. Lipase, which is a biocatalyst derived from various microorganisms, is used for biodiesel conversion reaction. Enzyme-based biodiesel conversion can utilize various kinds of raw materials such as waste cooking oil and high free fatty acid content, and has the advantage of low energy cost for conversion to biodiesel and particularly, no waste water is generated. Also, the recovery of biodiesel is easy and high-quality glycerin can be obtained as a by-product (Fjerbaek et al., 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). However, the enzymatic process has a disadvantage that the reaction rate is relatively slow, the production cost of the catalyst is high, and long-term maintenance of the activity is difficult. Therefore, in order to produce biodiesel using enzymes, it is absolutely necessary to develop a technique for mass production of a highly active enzyme at low cost.
바이오디젤 생산을 위한 리파제로서 박테리아, 효모 및 곰팡이 등 다양한 미생물 유래의 리파제가 이용되고 있다(Fjerbaek 등, 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). 효모 칸디다 안타티카 유래의 리파제 B(Candida antarctica lipase B, CalB)는 이성질체 전환반응이나 폴리에스터 합성, 바이오디젤 전환반응 등에서 활용되는 효율적인 생물촉매이며, 특히 노보자임스(Novozymes)사에서 판매하는 고정화 효소인 Novozym435는 바이오디젤 전환반응용 효소로 많이 연구되고 있다. Novozym435는 곰팡이 발현시스템을 이용하여 대량 분비생산하고 아크릴릭 레진에 고정화한 효소로서 매우 고가(200만원/kg)에 판매되고 있어서 실제 바이오디젤 생산공정에 적용하기에는 비용 측면에서 무리가 있다. 따라서 효소활성 개량을 통해서 효소비용을 절감하려는 연구와 재조합 방법으로 대량생산 하려는 연구가 진행되고 있다.
Lipase derived from various microorganisms such as bacteria, yeast and fungi is used as a lipase for producing biodiesel (Fjerbaek et al., 2009, Biotechnol. Bioeng, 102, 1298). Candida antarctica lipase B (CalB) derived from yeast Candida anthica is an efficient biocatalyst used in isomer conversion, polyester synthesis, and biodiesel conversion reaction. In particular, it is an enzyme which is an immobilized enzyme that is commercially available from Novozymes Novozym435 has been extensively studied as an enzyme for biodiesel conversion reaction. Novozym435 is an enzyme immobilized on acrylic resin by mass production using fungi expression system and is sold at very high price (2,000,000 Won / kg), which makes it difficult to apply it to actual biodiesel production process. Therefore, studies to reduce the cost of enzymes through improvement of enzymatic activity and studies to mass-produce by recombinant method are underway.
이와 관련하여, 본 발명자들은 효모표면 발현 방법을 이용하여 CalB를 분자진화하고 스크리닝하여 고활성의 효소 CalB14를 개발(한국특허 제0475133호)한 바 있으며, 이를 효모 단백질융합인자 기술을 이용하여 재조합 대량생산(한국특허 제0626753호)하였고, 이를 이용하여 생물학적 친환경 바이오디젤 생산에 적용한바 있다(한국특허 제0697310호).In this regard, the present inventors developed a highly active enzyme CalB14 (Korean Patent No. 0475133) by molecular evolution and screening of CalB using a yeast surface expression method, and using this yeast protein fusion factor technique, (Korean Patent No. 0626753), and has been applied to the production of biologically environmentally friendly biodiesel (Korean Patent No. 0697310).
이러한 배경 하에서, 효소의 추가적인 개량을 통해 효소활성을 더욱 증진시키고 효소비용을 절감하기 위하여 CalB14를 분자진화하였다. 고활성의 CalB를 스크리닝하는 방법으로 분자진화 후 유전자 라이브러리를 효모에 형질전환하고 트리뷰티린 배지에 도말하여 나타나는 기질분해 환(halo)의 크기를 보고 1차 선별하는데 CalB14는 이미 활성이 매우 높은 상태라 활성환의 크기가 커서 추가 개량 및 스크리닝하는데 문제가 있었다. 이에, 본 발명자들은 보다 활성이 증진된 변이 리파제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CalB14가 가진 변이부분(L219Q와 L278P)을 제외한 나머지 부분만을 이용하여 분자진화한 후 활성이 증가된 변이주를 선별하고 원래 CalB14가 가진 변이 부분을 세포내 재조합(in vivo recombination) 방법으로 재도입하여 CalB14보다 활성이 더욱 증가된 변이주를 다수 선별하였으며, 이를 효모 사카로마이세스 및 피키아 파스토리스에서 재조합 대량생산하는 방법을 개발하여 효소를 대량생산하고 레진에 고정화하여 바이오디젤 전환효율을 개선함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under this background, CalB14 was molecularly evolved to further enhance enzyme activity and reduce enzyme costs through further modification of the enzyme. CalB14 is a highly active form of the gene that is used to screen the high-activity CalB, transforming the gene library into the yeast after molecular evolution, and measuring the size of the substrate degradation ring (halo) The size of the active ring was too large to further improve and screen. Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop mutant lipases having enhanced activity, and as a result, they have used mutation portions (except L219Q and L278P) possessed by CalB14 and selected mutants having increased activity after molecular evolution, The mutation region of CalB14 was reintroduced in vivo recombination method to select a number of mutants having a higher activity than CalB14 and recombinantly mass-produced the recombinant mutants in yeast Saccharomyces and Pichia pastoris The present invention has been accomplished by improving the biodiesel conversion efficiency by mass-producing the enzyme and immobilizing it in the resin.
본 발명의 목적은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 리파제에 변이가 도입되어 활성이 증진된 변이 리파제를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a mutant lipase in which the mutation is introduced into lipase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to thereby increase the activity.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding said mutated lipase.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide an expression vector comprising the polynucleotide.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a transformant in which the expression vector is introduced into a host cell and transformed.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing an activated mutant lipase comprising culturing the transformant and recovering lipase from the culture or culture supernatant thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing a transformant, comprising: (a) introducing the expression vector into a host cell to obtain a transformant transformed; (b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; (c) producing the biodiesel from the oil and alcohol by using the recovered lipase.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 리파제에 변이가 도입되어 활성이 증진된, 변이 리파제를 제공한다.In one aspect to achieve the above object, the present invention provides a mutant lipase in which a mutation is introduced into a lipase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to thereby increase the activity.
본 발명에서 용어, "활성이 증진된 변이 리파제"는 지방을 분해하는 효소인 리파제 고유의 활성이 증대되도록, 리파제의 아미노산 서열이 변이된 리파제를 의미한다.In the present invention, the term " mutated lipase with enhanced activity "means a lipase in which the amino acid sequence of lipase is mutated so that the activity inherent to lipase, which is an enzyme for degrading fat, is increased.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 변이를 유도하기 위하여 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법과 세포내 재조합 방법을 이용하였고, 이를 위치지정 변이도입(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 변이의 특성을 분석함으로써, 리파제 활성이 증진되는 변이를 확인하였다.In one embodiment of the present invention, mutation induction polymerase chain reaction (error-prone PCR) and intracellular recombination methods were used to induce the mutation, and the site-directed mutagenesis By analyzing the characteristics of the mutations, mutations promoting lipase activity were identified.
본 발명에서 용어, "리파제"는 카르복실릭 에스터 수산화효소(carboxylic ester hydrolase)로 식품 산업, 미세화합물 합성, 계면활성제 사업 등에 많이 이용되는 효소로서, 본 발명의 일 실시예에서는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB)를 주형으로 하여 변이를 유도하였다.The term "lipase" in the present invention is a carboxylic ester hydrolase, an enzyme widely used in the food industry, synthesis of fine compounds, surfactant business, etc. In one embodiment of the present invention, Candida The mutation was induced using lipase B (CalB) derived from E. antarctica as a template.
본 발명에서 용어, "리파제 CalB"는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B 단백질로서, 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이지만, 20℃ 이하의 저온조건에서만 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상이 없이 정상적인 단백질이 생성되고, 효모의 생육 적정온도인 30℃에서 배양하게 되면 단백질의 접힘이나 퇴화 현상 등으로 인해 전체적인 생산성이 감소되는 특성을 가지고 있어 대량 생산에 어려움이 있는 단백질로 알려져 있는 효소이다.As used herein, the term "lipase CalB" is Candida has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 antatika (Candida antarctica- derived lipase B protein. It is an enzyme most commonly used in the synthesis of medicines and fine chemical products, but normal proteins are produced without folding or degradation of proteins only at low temperatures below 20 ° C, It is an enzyme known as a protein which is difficult to mass-produce because it has a characteristic that the productivity is reduced due to the folding or degeneration of the protein when the yeast grows at an appropriate temperature of 30 ° C.
본 발명자들은 상기 리파제 CalB의 대량 생산에 대한 문제를 극복하고자 리파제 CalB의 219번 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로 치환되고, 278번 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 리파제 CalB14를 개발한 바 있으며(한국특허 제0475133호), 이는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명은 상기 리파제 CalB14에 추가적인 변이를 도입하여, 리파제 활성이 더욱 증진된 변이 리파제에 관한 것으로서, 상기 변이 리파제를 이용하면 바이오디젤의 생산에 있어 바이오디젤 전환반응 효율 및 효소의 반복사용 효율이 더욱 증진될 수 있다.In order to overcome the problem of mass production of the lipase CalB, the inventors of the present invention found that Lysine (L), which is
상기 변이 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 71번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 세린(S)으로, 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지거나, 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 80번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로, 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환된 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
The mutant lipase include, but are not limited to, preferably antatika Candida (Candida phenylalanine (F), which is the 71st amino acid of the polypeptide expressed from antarctica lipase B (CalB) is serine (S), leucine (L) as the 219th amino acid is glutamine (Q) The threonine (T), which is the 80th amino acid of the polypeptide expressed by lipase B (CalB) derived from candida anthracis, has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 substituted with proline (P) , And the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in which the 219th amino acid, leucine (L), is replaced with glutamine (Q) and the 278th amino acid, leucine (L), is replaced with proline (P).
본 발명에서 상기 변이 리파제는 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP) 단백질과 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 직접적으로 또는 링커에 의해서 연결된 것일 수 있다.In the present invention, the mutant lipase may be linked to a protein of a translational fusion partner (TFP). The connection may be directly or by a linker.
본 발명에서 용어, "단백질융합인자"는 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미한다. 또한, "단백질융합인자 단백질"은 상기한 바와 같은 단백질융합인자 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 단백질을 의미한다. 상기 단백질융합인자는 바람직하게는 한국특허 제0626753호, 제0798894호, 제0975596호에 개시되어 있는 단백질융합인자를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 TFP3 일 수 있다.In the present invention, the term "protein fusion factor" refers to a gene that induces the secretory production of a protein having a low expression rate by fusion with a gene encoding a protein having a low expression ratio. The term "protein fusion protein protein" means a protein having an amino acid sequence encoded by the protein fusion gene as described above. Preferably, the protein fusion factor may be a protein fusion factor disclosed in Korean Patent Nos. 0626753, 0798894, and 0975596, and more preferably TFP3.
상기 단백질융합인자 단백질은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 TFP3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 30번째 아미노산인 트립토판(W)이 아르기닌(R)으로 치환된 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다.The protein fusion protein protein may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in which tryptophan (W), which is the 30 th amino acid of the polypeptide expressed from TFP3, is substituted with arginine (R).
따라서, 상기 단백질융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로, TFP3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 30번째 아미노산인 트립토판(W)이 아르기닌(R)으로 치환된 서열을 가질 수 있다.
Therefore, although the mutant lipase linked to the protein fusion protein is not limited thereto, it is preferable that the 219th amino acid of the polypeptide expressed from lipase B (CalB) derived from candida anthracis is lucine (L) (L), which is the 278th amino acid, is proline (P), and tryptophan (W), which is the 30th amino acid of the polypeptide expressed from TFP3, is substituted with arginine (R).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding the mutated lipase.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥으로서, 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.The term "polynucleotide" in the present invention is a polymer of a nucleotide in which a nucleotide monomer is linked in a long chain by covalent bonds, and is a DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid) Is a polynucleotide encoding a mutant lipase.
본 발명의 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 변이 리파제를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 변이 리파제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.The polynucleotide encoding the mutant lipase of the present invention can be obtained by changing the amino acid sequence of the mutant lipase expressed from the coding region in consideration of codon degeneracy or considering the codon preference in the organism to which the mutant lipase is to be expressed Various modifications can be made to the coding region within a range not to affect the expression of the gene in the region other than the coding region and various modifications or modifications can be made within a range not affecting the expression of the gene, It will be understood by those skilled in the art. That is, as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having equivalent activity, one or more nucleotide bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 활성이 증진된 변이 리파제뿐만 아니라, 상기 리파제와 단백질융합인자 단백질이 연결된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.The polynucleotide of the present invention may be a polynucleotide encoding a polypeptide in which the lipase and a protein fusion protein protein are linked, as well as mutant lipases with enhanced activity.
상기 폴리뉴클레오타이드는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 12의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 12는 칸디다 안타티카 유래 리파제 B(CalB)로부터 발현되는 폴리펩타이드의 219번째 아미노산인 루이신(L)이 글루타민(Q)으로 치환되고, 278번째 아미노산인 루이신(L)이 프롤린(P)으로 치환되고, 80번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환되고, 단백질융합인자3으로부터 발현되는 폴리펩타이드의 99번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 염기서열이다.
The polynucleotide may have, but is not limited to, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 12 shows that the 219th amino acid of the polypeptide expressed from Candida anthraca-derived lipase B (CalB) is substituted with glutamine (Q), the 278th amino acid, leucine (L) ) In which the threonine (T), which is the 80th amino acid, is substituted with alanine (A), threonine (T) which is the 99th amino acid of the polypeptide expressed from the
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.In yet another embodiment, the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide.
본 발명에서 용어, "벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.The term "vector" in the present invention means a nucleic acid molecule capable of carrying other nucleic acid to which it is linked. One type of vector, "plasmid ", is a circular double- stranded DNA Loop.
본 발명에서 용어, "발현벡터"는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시하는 벡터를 의미하며, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 바람직하게는 플라스미드 형태일 수 있다.The term "expression vector" in the present invention means a vector that directs the expression of a gene encoding a target protein operatively linked thereto, and may preferably be in the form of a plasmid in the use of recombinant DNA technology.
본 발명의 발현벡터는 활성이 증진된 변이 리파제 또는 단백질융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특히, 단백질 융합인자 단백질과 연결된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 경우, 단백질융합인자에 의하여 활성이 증진된 변이 리파제를 고효율로 생산할 수 있다.The expression vector of the present invention may contain a polynucleotide encoding a mutant lipase whose activity is enhanced or a mutant lipase linked with a protein fusion protein protein. In particular, when an expression vector containing a polynucleotide encoding a mutant lipase encoding a protein fusion protein linked to a protein fusion protein is introduced into a host cell, it is possible to produce a mutant lipase with enhanced activity by a protein fusion factor with high efficiency.
본 발명의 일 실시예에서는, 피키아 발현벡터 pAO815를 사용하여 ST3-CalB1422를 삽입하여 도 5에 도시된 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터를 구축하였다.
In one embodiment of the present invention, ST3-CalB1422 was inserted using the Pichia expression vector pAO815 to construct the pAO815-ST3-CalB1422 expression vector shown in Fig.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.In still another embodiment, the present invention provides a transformant obtained by introducing the expression vector into a host cell.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.The term "transformed" in the present invention means that DNA is introduced into the host and the DNA becomes replicable as an extrachromosomal factor or by chromosome integration completion.
본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 등의 효모류, 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium) 및 라이조퍼스(Rhizopus) 속 등의 사상 균류 및 에셔리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus) 속 등의 세균류를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용할 수 있다.The host cell used for transformation according to the present invention may be any host cell known in the art including, but not limited to, Candida , Debaryomyces , (Hansenula), Cluj Vero My process (Kluyveromyces), Pichia (Pichia), ski irradiation Caro My process (Schizosaccharomyces), Yarrow's (Yarrowia) and a saccharide as hyomoryu such as My process (Saccharomyces) genus Aspergillus (Aspergillus ), Penny chamber William (Penicillium) and rayijo Perth (Rhizopus) in such and the use of fungi such as filamentous fungi and Escher Escherichia (Escherichia), Bacillus (Bacillus) genus, and more preferably from my process or blood in Saccharomyces Pichia pastoris may be used.
본 발명의 일 실시예에서는 전기천공법을 사용하여 피키아 파스토리스 GS115 균주에 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터를 도입시켜 형질전환하여 GS115/pAO815-ST3-CalB1422 형질전환체를 제조하였고, 상기 형질전환체가 발현하는 단백질의 리파제 활성이 높음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, GS115 / pAO815-ST3-CalB1422 transformants were prepared by introducing a pAO815-ST3-CalB1422 expression vector into a Pichia pastoris strain GS115 using an electroporation method, It was confirmed that the lipase activity of the protein expressed in the body was high.
상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 통하여 상기 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 다중카피로 도입된 것일 수 있다. 상기 다중카피는 바람직하게는 3 내지 6 카피로 도입된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 5 카피로 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 다중카피로 도입된 형질전환체가 단일카피로 도입된 형질전환체보다 4,000 U/L 이상의 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 11 및 표 6).
The transformant may be obtained by introducing multiple copies of the polynucleotide encoding the mutated lipase through the expression vector. The multiple copies may preferably be introduced in 3 to 6 copies, more preferably in 4 to 5 copies. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the transformants introduced into multiple copies had a higher activity than the transformants introduced with a single copy of 4,000 U / L or more (FIG. 11 and Table 6).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 변이 리파제의 생산방법을 제공한다.In yet another embodiment, the present invention provides a method for producing an activated mutant lipase comprising culturing the transformant and recovering lipase from the culture or culture supernatant thereof.
상기 변이된 리파제를 회수하는 단계는 상기 배양물로부터 수득한 배양균체 또는 배양 상등액을 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질 침전, 투석 등의 공지된 정제방법을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 수행될 수 있고, 회수된 목적 단백질의 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 등의 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
The step of recovering the mutated lipase comprises culturing the cultured cells or the culture supernatant obtained from the culture in a culture broth, an extraction, an affinity chromatography, an ion exchange chromatography, a gel filtration chromatography, a hydrophobic chromatography, a protein precipitation, a dialysis , Alone or in an appropriate combination, and identification of the recovered target protein can be performed using known conventional methods such as SDS-PAGE, Western blot, and the like.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법을 제공한다.(A) introducing the expression vector into a host cell to obtain a transformant transformed with the transformant; (b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; And (c) producing biodiesel from the oil and alcohol using the recovered lipase.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 상기 활성이 증진된 변이 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계로서, 형질전환체에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the step (a) is a step of introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding the mutated lipase into which the activity has been enhanced into a host cell to obtain a transformed transformant, Respectively.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계로서, 리파제를 회수하는 단계에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the step (b) is a step of culturing the transformant obtained in step (a) to recover the lipase from the culture or the culture supernatant, and the step of recovering the lipase is as described above.
본 발명에서 상기 (c) 단계는 (b) 단계에서 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계이다.In the present invention, step (c) is a step of producing biodiesel from the oil and alcohol using the lipase recovered in step (b).
상기 회수된 리파제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 자유로운 형태 또는 고정화된 형태로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 고정화된 형태로 사용할 수 있다. 상기 리파제의 고정화는 당업계에서 통상적으로 사용하는 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는 다양한 응용이 가능하다. 예를 들어, 흡착법, 포괄법 등의 물리적인 방법 및 공유결합법, 가교연결방법 등의 화학적인 방법을 사용할 수 있다.The recovered lipase is not limited thereto, but may be used in a free form or in a fixed form, and more preferably in a fixed form. The lipase can be immobilized by various methods commonly used in the art, and various applications are possible without limitation. For example, physical methods such as an adsorption method and an inclusion method, and chemical methods such as a covalent bonding method and a crosslinking method can be used.
본 발명의 일 실시예에서는 고정화 흡착담체로서 Lewatit VP OC 1600 (Bayer)을 이용하여 재조합 대량생산된 CalB1411 및 CalB1422를 고정화하였으며(도 14), 상기 고정화 효소를 이용하여 바이오디젤의 전환반응 효율 및 반복사용 효율을 확인한 결과, 대조군인 CalB14에 비하여 그 효율이 월등히 높음을 확인하였다(도 15 및 16). 이러한 결과는, 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 대량 생산방법은 고효율, 반복사용 및 경제성의 장점을 가짐으로써, 바이오디젤 생산에 있어 걸림돌이 되고 있는 효소의 비용 및 대량생산에 관한 문제점을 해결할 수 있음을 의미한다.In one embodiment of the present invention, recombinant mass-produced CalB1411 and CalB1422 were immobilized using Lewatit VP OC 1600 (Bayer) as an immobilized adsorption carrier (FIG. 14), and the conversion efficiency and repeatability of biodiesel using the immobilized enzyme As a result of checking the use efficiency, it was confirmed that the efficiency was much higher than that of the control group CalB14 (FIGS. 15 and 16). These results show that the method for mass production of biodiesel using the mutant lipase of the present invention has advantages of high efficiency, repeated use and economical efficiency, thereby solving the problems related to the cost and mass production of the enzyme which is a stumbling block in the production of biodiesel .
상기 유지는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 천연유지, 가공유지 및 폐유지 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 대두유, 채종유, 팜유 등을 사용할 수 있다.Preferably, the oil is selected from among natural oils, processed oils and pulmonary oils, and more preferably soy oil, vegetable oil, palm oil, etc. may be used.
상기 알코올은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 8개인 알코올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 탄소 수가 2개 내지 4개인 알코올을 사용할 수 있으며, 구체적으로 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 이소-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소-부탄올 또는 테르-부탄올 등을 사용할 수 있다. 상기 알코올은 당업계에 공지된 다양한 공급 방식을 이용하여 공급할 수 있으며, 여러 단계에 걸쳐서 공급하거나 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 연속적으로 공급하는 방식을 이용할 수 있다. The alcohol is not limited thereto, but preferably an alcohol having 2 to 8 carbon atoms can be used. More preferably, an alcohol having 2 to 4 carbon atoms can be used. Specifically, ethanol, methanol, 1- Propanol, iso-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol or ter-butanol. The alcohol may be supplied using various feeding methods known in the art, and may be supplied in several steps or continuously. In this case, a continuous feeding method may be used.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 변이 리파제인 CalB1411 및 CalB1422를 담체에 고정화하여 식물성 유지와 메탄올로부터 바이오디젤로 전환하는 반응을 수행한 결과, 대조군인 CalB14에 비하여 초기반응속도가 월등히 빠름을 확인하였다(도 15). 따라서, 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤의 생산방법은 효율이 월등하며 경제적인 방법임을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, the conversion of the vegetable oil and methanol to biodiesel was carried out by immobilizing CalB1411 and CalB1422, which are mutant lipases of the present invention, on the carrier. As a result, the initial reaction rate was much faster than that of CalB14 as the control group (Fig. 15). Accordingly, it has been confirmed that the method of producing biodiesel using the modified lipase of the present invention is superior in efficiency and economical.
본 발명에 따라 생산된 활성이 증진되도록 변이된 리파제를 이용하면, 종래의 리파제보다도 효율적인 효소 반응을 수행할 수 있어 바이오디젤의 경제적 생산에 널리 활용할 수 있다.
The use of lipases mutated so as to enhance activity produced according to the present invention enables efficient enzymatic reaction to be performed more efficiently than conventional lipases, and can be widely used for the economical production of biodiesel.
도 1은 CalB14의 변이주 라이브러리 제조과정을 도식한 그림이다.
도 2는 CalB14의 변이주의 활성을 평판 배지상에서 확인한 그림이다.
도 3은 CalB14 변이주의 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4는 리파제를 발현하는 효모균주(Y2805△gal80/pYGaST3-CalB1422)를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 pAO815-ST3-CalB1422 발현벡터의 제조과정을 도식한 그림이다.
도 6은 피키아 파스토리스 GS115에 도입된 ST3-CalB1422 형질전환체들의 활성을 트리뷰티린이 첨가된 평판 배지 상에서 확인한 결과이다.
도 7은 피키아 파스토리스 GS115에 도입된 ST3-CalB1422 형질전환체들의 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 8은 리파제를 발현하는 피키아 파스토리스(GS115/pAO815-ST3-CalB1422)를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 9는 피키아 파스토리스에 다중카피 도입을 위한 pPIC-ST3-CalB1422 발현벡터의 제조과정을 도식한 그림이다.
도 10은 피키아 파스토리스 GS115에 다중 도입된 CalB1422 형질전환체들의 활성을 트리뷰티린이 첨가된 평판 배지 상에서 확인한 결과이다.
도 11은 피키아 파스토리스 GS115에 다중 도입된 CalB1422 형질전환체들의 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 12는 GS115/pPIC-ST3-CalB1422 변이주의 카피 수를 나타낸 결과이다.
도 13은 다중 카피 GS115/pPIC-ST3-CalB1422 균주를 5ℓ 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프 및 시간별 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 14는 흡착레진에 효소를 고정화하면서 상등액에 남아있는 효소의 활성(A) 및 잔여단백질(B)을 시간별로 분석한 결과이다.
도 15는 고정화 효소를 이용하여 바이오디젤 전환율을 시간별로 측정한 그래프이다.
도 16은 고정화 효소를 바이오디젤 전환반응에 반복 사용하였을 때 효소의 안정성을 측정한 그래프이다.
도 17은 고정화 효소 CalB1422를 이용하여 메탄올 공급방법(3단계 및 연속공급)에 따른 바이오디젤 전환율을 측정한 그래프이다.FIG. 1 is a diagram illustrating a process for producing a mutant library of CalB14. FIG.
Fig. 2 shows the activity of the mutant strain of CalB14 on a plate medium.
3 is an electrophoresis image showing the result of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of the CalB14 mutant strain.
4 is an electrophoresis image showing the result of SDS-PAGE analysis of cell growth graph and time-course culture supernatant showing the results of fed-batch culture of yeast strain (Y2805? Gal80 / pYGaST3-CalB1422) expressing lipase in a 5 L fermenter.
FIG. 5 is a diagram illustrating the production process of pAO815-ST3-CalB1422 expression vector.
FIG. 6 shows the activity of ST3-CalB1422 transformants introduced into Pichia pastoris GS115 on a plate medium supplemented with trivitrin.
7 is an electrophoresis image showing the result of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of ST3-CalB1422 transformants introduced into Pichia pastoris GS115.
FIG. 8 is a graph showing cell growth and results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant obtained by the fermentation of Pichia pastoris (GS115 / pAO815-ST3-CalB1422) expressing lipase in a 5 L fermentor to be.
FIG. 9 is a diagram illustrating a process for preparing a pPIC-ST3-CalB1422 expression vector for introduction of multiple copies into Pichia pastoris.
FIG. 10 shows the activity of CalB1422 transformants multiplexed into Pichia pastoris GS115 on a plate medium supplemented with trivitrin.
11 is an electrophoresis image showing the result of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant of CalB1422 transformants multiplexed into Pichia pastoris GS115.
Fig. 12 shows the number of copies of GS115 / pPIC-ST3-CalB1422 mutant.
FIG. 13 is an electrophoresis image showing SDS-PAGE analysis of the cell growth graph and time-series culture supernatant showing the result of fed-batch culture of multi-copy GS115 / pPIC-ST3-CalB1422 strain in a 5 L fermenter.
FIG. 14 shows the results of analyzing the enzyme activity (A) and residual protein (B) remaining in the supernatant while immobilizing the enzyme on the adsorbent resin.
FIG. 15 is a graph showing the biodiesel conversion rate measured over time using an immobilized enzyme. FIG.
16 is a graph showing the stability of the enzyme when the immobilized enzyme is repeatedly used in the biodiesel conversion reaction.
17 is a graph showing the conversion of biodiesel according to the methanol feeding method (three steps and continuous feeding) using the immobilized enzyme CalB1422.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예Example 1: One: CalB14CalB14 변이주 라이브러리 구축 Construct mutation library
CalB14 변이주 라이브러리를 구축하기 위하여, 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법과 세포내 재조합 방법을 이용하였다. CalB14의 경우 219번째 루이신이 글루타민으로 교체된 변이(L219Q)가 단백질 생산량을 증가시키며, 278번째 루이신이 프롤린으로 교체된 변이(L278P)는 단백질 비활성을 증가시키는 것을 이전의 연구에서 확인하였다(Kim 등, 2007, J Microbiol Biotechnol. 17; 한국특허 제0475133호). 추가적인 효소 활성 개량 및 분비생산성 개량 변이를 유도하기 위해서 CalB14의 L219Q와 L278P 변이부분을 변화시키지 않고 단백질융합인자(TFP3) 서열과 CalB 유전자의 218번째 아미노산까지만 변이를 유도하였다. 그러나 처음부터 L219Q와 L278P 변이를 도입하게 되면 효소 활성이 높아 트리뷰티린 배지에서 활성 개량된 변이를 선별하는데 어려움이 있다. 따라서 CalB14 유전자를 주형으로 218번 아미노산까지만 변이를 유도하여 활성이 개량된 변이를 선별하고, 추후 L219Q와 L278P 변이를 도입하여 활성이 더 개량된 균주를 선별하였다. CalB14를 분비 발현하는 벡터인 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 2 프라이머를 사용하여 변이유도 중합효소연쇄반응(PCR random mutagenesis kit, Clontech)을 수행하였다. 변이유도는 1kb당 2개 정도의 변이를 유도하는 조건으로 수행하였으며, 94℃에서 30초 동안 1회; 94℃ 30초간, 68℃ 1분간 반응을 25회; 68℃에서 1분간 1회 반응조건으로 PCR을 수행하였다. 219번 아미노산 이후의 유전자 확보를 위해 pYGa-ST3-wt CalB를 주형으로 하고 서열번호 3 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였고, 증폭된 유전자는 아가로스젤 전기영동을 통해 회수하였다. 상기의 방법으로 얻어진 두 개의 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805(Mat a pep4 :: HIS3 prb1 can1 his3 -200 ura3-52)균주에 도입하였다(도 1).
To construct the CalB14 mutant library, mutation-inducible PCR (error-prone PCR) and intracellular recombination methods were used. Previous studies have confirmed that the mutation (L219Q) in which the 219th mutant of lucins is replaced by glutamine in CalB14 increases the protein production and the mutation (L278P) in which the 278th mutant lucins is replaced by proline increases protein inactivity (Kim et al , 2007, J Microbiol Biotechnol. 17; Korean Patent No. 0475133). In order to induce additional enzyme activity improvement and secretory productivity improvement mutations, mutations were induced only in the protein fusion factor (TFP3) sequence and the 218th amino acid of the CalB gene without changing the L219Q and L278P mutation portions of CalB14. However, when L219Q and L278P mutations are introduced from the beginning, the enzymatic activity is high, and it is difficult to select the mutant which is active in the triuvulinin medium. Therefore, mutants with improved activity were selected by using the CalB14 gene as a template and mutations were induced up to amino acid 218, and L219Q and L278P mutations were introduced to select more improved strains. A PCR random mutagenesis kit (Clontech) was performed using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 with pYGa-ST3-CalB14 as a template for expressing CalB14. Mutagenesis was carried out under conditions inducing about 2 mutations per 1 kb, once at 94 ° C for 30 seconds; Reaction at 94 占 폚 for 30 seconds and 68 占 폚 for 1
실시예Example 2: 2: CalB14CalB14 변이주 선별 Mutant selection
세포내 재조합을 통해 형성된 형질전환체는 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.077% 우라실이 결핍된 영양보충물, 2% 포도당)에 72 시간 배양하여 활성환이 증가된 균주를 1차 선별하였다. 약 1,000개의 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 접종하여 배양 후 큰 활성환을 보이는 균주 22주를 2차 선별하였다(도 2).Transformants formed through intracellular recombination were cultured for 72 hours in a selective medium containing 1% triovalin (0.67% amino acid-deficient yeast substrate, 0.077% uracil deficient nutrient supplement, 2% glucose) for 72 hours, Increased strains were first selected. Approximately 1,000 strains were each inoculated on a selective medium containing 1% triovirinin, and then 22 strains showing large active rings were selected for the second time (FIG. 2).
형질전환체들의 리파제 활성을 측정하기 위하여 100㎕ 50mM pNPP(ρ-nitrophenyl palmitate), 1.9㎖ 에틸 알콜, 38㎖ 50mM pH 7.5의 트리스 완충액이 조합된 반응액 1㎖에 20㎕의 배양 상등액을 첨가한 후 410㎚에서의 흡광도를 측정하였다. pNPP를 기질로 사용한 리파제 활성 측정 방법은 pNP기와 팔미테이트가 연결된 pNPP가 리파제에 의해 팔미테이트로부터 pNP기가 절단되어 나오면서 유리된 pNP기가 410 nm에서 흡광하는 정도를 측정하는 방법이다. 본 발명에서 리파제의 활성 1 unit는 1분당 1μM의 pNP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다.To measure the lipase activity of the transformants, 20 μl of the culture supernatant was added to 1 ml of the reaction solution containing 100 μl of 50 mM pNPP (ρ-nitrophenyl palmitate), 1.9 ml of ethyl alcohol and 38 ml of 50 mM of pH 7.5 tris buffer The absorbance at 410 nm was then measured. The method of measuring lipase activity using pNPP as a substrate is a method of measuring the degree of absorption of pNPP at 410 nm liberated from the cleavage of pNP group from palmitate by pNPP in which pNPP and palmitate are linked by lipase. In the present invention, 1 unit of the activity of lipase was defined as the activity of the enzyme liberating 1 μM of pNP per minute.
22개 형질전환체들의 리파제 활성을 측정한 결과, 야생형 CalB보다는 수십배 활성이 개량되었으나 CalB14보다 활성이 높은 변이체가 없음을 확인하였다(표 1). 이후, CalB14의 추가 활성 개량을 위하여 L219Q와 L278P 변이를 도입하였다.
The lipase activity of the 22 transformants was measured, and it was confirmed that there was no mutant having activity higher than that of CalB14, although the activity was improved several tens times as compared with the wild-type CalB (Table 1). L219Q and L278P mutations were then introduced for additional activity improvement of CalB14.
실시예Example 3: 선별된 3: Selected CalBCalB 변이주에 In mutation L219QL219Q , , L278PL278P 변이 도입 Mutation introduction
확보된 CalB 변이주에 L219Q와 L278P 변이를 도입하기 위해 22개의 형질전환체를 혼합 후 게놈 DNA를 분리하였다. 이를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 2 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 도입된 STFP 서열과 CalB 유전자의 218번째까지의 아미노산 서열을 증폭하였다. 219번 아미노산 이후의 유전자 확보를 위해 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 3 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 L219Q와 L278P 변이를 도입하였다.
To introduce L219Q and L278P mutations into the obtained CalB mutants, genomic DNA was isolated after mixing 22 transformants. PCR was carried out using primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (25 cycles of reaction at 94 DEG C for 30 seconds, 55 DEG C for 30 seconds, 72 DEG C for 1 minute, 72 DEG C for 1 minute, , The amino acid sequence of the STFP sequence in which the mutation was introduced and the 218th amino acid sequence of the CalB gene were amplified. PCR was carried out using primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 with primers of pYGa-ST3-CalB14 as a template and primers of SEQ ID NO: 4 (94 ° C for 30 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C L219Q and L278P mutations were introduced through a 30 second reaction at 72 < 0 > C for 30 seconds and 25 times at 72 < 0 > C for 7 minutes.
실시예Example 4: 4: L219QL219Q 와 Wow L278PL278P 가 도입된 Introduced CalBCalB 변이주의 선별 Selection of mutant strains
세포내 재조합을 통해 형성된 형질전환체는 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 72 시간 배양하여 활성환이 증가된 균주를 1차 선별하였다. 약 500개의 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 선택배지에 접종하여 배양한 후, 큰 활성환을 보이는 균주 22주를 2차 선별하였다. pNPP를 기질로 사용하여 형질전환체들의 리파제 활성을 측정한 결과 7개 변이주에서 CalB14보다 활성이 증가한 것을 확인하였다(표 2).
Transformants formed through intracellular recombination were cultured for 72 hours in a selective medium containing 1% tributyrin, and strains with increased active rings were firstly screened. Approximately 500 strains were cultured in a selective medium containing 1% triovalin, respectively, and then 22 strains showing large active rings were screened secondarily. As a result of measuring the lipase activity of transformants using pNPP as a substrate, it was confirmed that activity was increased in 7 mutants than in CalB14 (Table 2).
각 변이주의 활성증가 요인을 분석하기 위하여 YPDG(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 갈락토오스) 배지에서 40시간 배양한 후, 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석하였다. 그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 활성이 증가한 균주에서 단백질 생산량 또한 증가한 것을 확인하였다(도 3).
In order to analyze the increase of activity of each mutant, the culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE after culturing in YPDG (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose) for 40 hours. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the protein production was also increased in the strain with increased activity (FIG. 3).
실시예Example 5: 변이주의 염기서열 및 5: The nucleotide sequence of the mutant and 리파제Lipase 활성 분석 Activity analysis
실시예 4에서 높은 활성을 나타내는 6종의 변이주로부터 유전자를 분리한 후 염기 서열 분석을 실시하였다. 변이는 STFP 부분과 CalB 부분에서 각각 확인되었다. 1번, 6번, 15번 변이주의 경우 STFP 서열에서 30번째 트립토판이 아르기닌으로 치환된 변이가 확인되었으며, 9번 변이주는 STFP 서열에서 31번째 세린이 프롤린으로, CalB14 서열에서 71번째 페닐알라닌이 세린으로 치환된 변이가 확인되었다. 11번 변이주는 CalB14 서열에서 71번째 페닐알라닌이 세린으로 치환된 변이가 확인되었고, 22번 변이주는 STFP 서열에서 99번째 트레오닌이 알라닌으로, CalB14 서열에서는 80번째 트레오닌이 알라닌으로 치환된 변이가 확인되었다(표 3).
The gene was isolated from the six mutant strains exhibiting high activity in Example 4 and sequenced. Mutations were identified in the STFP portion and the CalB portion, respectively. In the case of
실시예Example 6: 위치지정 변이도입( 6: Positioning mutation introduction ( sitesite -- directeddirected mutagenesismutagenesis ) 방법을 이용한 변이 특성 분석Analysis of mutation characteristics by method
각 변이 단백질의 아미노산 변이가 활성 변화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 위치지정 변이도입을 시도하였다. 9번 변이주에 존재하는 STFP-S31P 변이만을 단독 도입한 construct 1을 제조하기 위하여 먼저 9번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 포함된 STFP 유전자를 증폭하였다. 이후 CalB14 유전자만의 증폭을 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 통하여 두 절편을 연결하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 1을 제조하였다.In order to analyze the effect of the amino acid variation of each mutant protein on the activity change, we attempted to introduce the positional mutation. In order to construct the
22번 변이주에 존재하는 STFP-T99A 변이만을 단독 도입한 construct 2를 제조하기 위하여 먼저 22번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 통하여 변이가 포함된 STFP 유전자를 증폭하였다. 이후 CalB14 유전자만의 증폭을 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 통하여 두 절편을 연결하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 2를 제조하였다.In order to prepare the
22번 변이주에 존재하는 CalB14-T80A 변이만을 단독으로 도입한 construct 3을 제조하기 위하여 pYGa-ST3-CalB14를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 5 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하여 STFP 유전자 부분을 증폭하였다. 이후 T80A 변이 도입을 위하여 22번 변이주 유전자를 주형으로 하고 서열번호 6 및 서열번호 4 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃에서 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회)을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 4 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 하여 두 절편을 연결하였고, 중합효소 연쇄산물은 EcoRI/SalI으로 절단하여 얻어진 pYGa 벡터와 함께 세포내 재조합을 통하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 construct 3을 제조하였다.In order to prepare the
상기 획득한 형질전환 균주는 YPDG 배지에서 40시간 배양한 후 배양 상등액을 회수하여, 상기와 동일한 방법으로 리파제 활성을 측정하였다. 1번 변이주의 경우, STFP-W30R 단독 변이에 의해서도 약 31%의 활성 증가를 보여 단백질분비융합인자의 변이에 따른 분비효율 증가인 것을 확인하였다. 11번 변이주의 경우, CalB-F71S 변이가 도입되면서 리파제 활성이 약 54% 증가하였으며, Construct 3의 경우, CalB-T80A 변이가 도입되면서 리파제 활성이 약 15% 증가한 것을 확인하였다. 그러나, STFP-S31P 및 STFP-T99A 변이가 도입된 Construct 1 및 2의 경우, 오히려 리파제 활성이 감소하는 경향을 나타내었다(표 4). 결론적으로, CalB-F71S 및 CalB-T80A 변이가 분비효율 향상 또는 직접적인 활성증가에 영향을 주며, 분비효율에 영향을 준 변이는 STFP-W30R 변이임을 확인하였다.
The obtained transformant was cultured in YPDG medium for 40 hours, and the culture supernatant was recovered and the lipase activity was measured in the same manner as described above. In the case of
Lipase activity (U / L)
실시예Example 7: 7: 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애를Servebiia 이용한 변이 Mutation used 리파제의Lipase 대량생산 massive production
사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에서 Gal10 프로모터가 발현되기 위해서는 인듀서(inducer)로서 갈락토오즈(galactose)가 존재하여야 하는데 갈락토오즈는 매우 값비싼 당류이며 세포의 성장을 위하여 탄소원으로 사용되어 없어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 포도당만 사용하여 Gal10 프로모터를 발현할 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805△gal80(Mat a pep4 :: HIS3 gal80::Tc190, prb1 can1 his3 -200 ura3 -52)을 사용하여 효율적인 재조합 생산을 시도하였다. In order to express the Gal10 promoter in Saccharomyces cerevisiae Y2805 strain, galactose should be present as an inducer. Galactose is a very expensive saccharide and used as a carbon source for cell growth It disappears. In order to solve these problems, the present inventors have found that Saccharomyces cerevisiae Y2805? Gal80 ( Mat a pep4 :: HIS3 gal80 :: Tc190, prb1 can1 His3 -200 ura3 -52 ) was used for efficient recombinant production.
리파제 활성이 높고 하기 실시예 16에서 고정화 효율이 좋은 것으로 확인된 CalB1422를 대량 생산하기 위하여, pYGa-ST3-CalB1422 재조합 벡터를 Y2805△gal80 균주에 형질전환 하여 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본배양에 들어가기 전에 50mℓ의 최소 액체배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노에시드, 2% 포도당)에 초기배양한 후 200mℓ의 YPD 액체배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배지로 분비된 리파제를 확인하기 위하여 시간별 배양 상등액을 취하여 SDS-PAGE 분석하였다(도 4). CalB1422 유전자 크기로부터 유추되는 단백질 크기(33 kD)보다 큰 50 kD 단백질로 분비 생산되었는데, 이는 단백질분비융합인자 TFP3의 pro 서열이 융합된 형태로 분비 생산되기 때문임을 선행연구에서 확인한 바 있다. 48시간의 발효 배양 후 약 3g/ℓ의 리파제가 배지로 분비 생산되었음을 확인하였다. pNPP 측정법을 이용하여 발효 시간별 활성을 분석한 결과 48시간의 발효 배양 후 약 250,000 U/L의 활성을 확인하였다(도 4).
In order to mass-produce CalB1422 having high lipase activity and confirmed to be immobilized in Example 16, a recombinant vector pYGa-ST3-CalB1422 was transformed into strain Y2805ΔGal80, and fed-batch culture was carried out in a 5 L fermenter. The cells were cultured in a minimal liquid medium (yeast substrate lacking 0.67% amino acid, 0.5% casamino ester, 2% glucose) in a volume of 50 ml before starting the culture, and then 200 ml of YPD liquid medium (1% yeast extract, 2% 2% glucose) and incubated at 30 ° C for 48 hours. To identify the lipase secreted in the medium, the culture supernatant was taken over time and analyzed by SDS-PAGE (Fig. 4). Previous studies have confirmed that the 50 kD protein, which is larger than the protein size (33 kD) deduced from the CalB1422 gene size, is secreted because the pro sequence of the protein secretion factor TFP3 is secreted into a fused form. After fermentation for 48 hours, it was confirmed that about 3 g / l of lipase was secreted by the medium. As a result of analyzing the activity by fermentation time using the pNPP assay, about 250,000 U / L activity was confirmed after fermentation for 48 hours (FIG. 4).
실시예Example 8: 8: 피키아Pikia 파스토리스에서From Pastoris CalB1422CalB1422 의 분비 발현을 위한 벡터 제조For vector expression
메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 메탄올에 의해 발현이 유도되는 AOX 프로모터를 이용하여 리터당 수십 그람의 재조합 단백질을 발현할 수 있고 값싼 배지를 사용하여 손쉽게 고농도 세포배양이 가능하며 특히 하이퍼-글리코실레이션 문제도 다른 효모와 비교하여 커다란 문제가 되지 않는 등의 다양한 장점이 있다. 따라서 CalB1422 변이주를 피키아 파스토리스에서 발현하여 대량생산하고자 하였다. Pichia pastoris , a methanol-inducing yeast, is capable of expressing several tens of grams of recombinant protein per liter by using an AOX promoter that is induced by methanol expression. High-concentration cells can be easily cultured using an inexpensive medium, - The glycosylation problem is not a big problem compared with other yeast. Therefore, the CalB1422 mutant was expressed in Pichia pastoris and mass produced.
CalB1422 유전자의 분비 발현 벡터 제조를 위해 상용화되어 있는 피키아 발현 벡터인 pAO815(Invitrogen)를 사용하였다. 본 발명에서 구축된 pYGa-ST3-CalB1422를 주형으로 하여 서열번호 13 및 서열번호 14 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 CalB1422 유전자를 획득하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분 조건으로 25 cycle 반응하고 72 ℃에서 10분간 반응하였다. PCR 증폭 후 제한효소 EcoRI 으로 3시간 처리 한 다음 동일 효소로 처리된 pAO815와 T4 ligase를 첨가하여 16℃에서 1시간 반응 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환체는 항생제 앰피실린이 포함된 2YT 평판배지 (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar)에서 배양하여 선별하였다. 선별된 콜로니는 염기서열 분석을 통해 확인하였고 최종적으로 pAO815-ST3-CalB1422 발현 벡터를 구축하였다(도 5).
For the production of the secretion expression vector of the CalB1422 gene, the commercially available Pichia expression vector pAO815 (Invitrogen) was used. CalB1422 gene was obtained by polymerase chain reaction using the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 using pYGa-ST3-CalB1422 constructed in the present invention as a template. The PCR conditions were 95 ° C for 5 minutes, followed by 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute, followed by 25 cycles of reaction at 72 ° C for 10 minutes. After PCR amplification, the cells were treated with restriction enzyme Eco RI for 3 hours. Then, pAO815 and T4 ligase treated with the same enzyme were added and reacted at 16 ° C for 1 hour and transformed into E. coli strain DH5α. The transformants were selected by culturing in 2YT plate medium (1.6% Tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar) containing the antibiotic ampicillin. The selected colonies were identified by sequencing and finally the pAO815-ST3-CalB1422 expression vector was constructed (Fig. 5).
실시예Example 9: 9: 피키아Pikia 파스토리스Pastor 균주의 형질전환 및 형질전환체 선별 Transformation of strains and screening of transformants
상기 실시예 8에서 구축된 pAO815-ST3-CalB1422의 HIS4 부분을 SalI 제한효소로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들고 이를 농축시켰다. 피키아 파스토리스 GS115 균주를 YPD 배지에 접종하여 OD600이 1.3~1.5가 될 때까지 배양하였다. 배양된 균주를 4℃, 1500ㅧg로 5분간 원심분리하고 냉각 멸균 증류수로 펠렛을 녹이고 다시 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 펠렛에 10mM DTT가 첨가된 LiAc(100mM LiAc, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.6M Sorbitol) 10 ml에 현탁하여 실온에서 30분간 반응하였다. 이후, 1M 솔비톨을 처리한 후 원심분리 과정을 반복하여 최종 부피 1 ml이 되는 컴피턴트 세포(competent cell)를 얻었다. 상기 컴피턴트 세포 100 ㎕에 SalI으로 처리하여 선형으로 만든 pAO815-ST3-CalB1422 5 ㎕를 혼합하여 전기천공법(electroporation, 2.0kV, 200Ω, 2.5 msec)을 통해 형질전환하였다. 즉시 1M 솔비톨 1ml을 첨가하여 멸균튜브로 옮긴 후 30℃에서 1시간 정치배양하여 세포들을 회복시켰다. 형질전환체들은 minimal dextrose(MD) 배지에 도말하여 히스티딘(histidine) 요구성에 따라 1차 선별하였다. 선별된 형질전환체들을 무작위로 선별 후 MD-1% Tributyrin + 0.5% Methanol 배지에 점적(spotting)하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후 균주 주변의 환의 크기를 측정하여 형질전환체들의 활성을 확인하였고 그 중 활성이 가장 좋은 형질전환체 10개를 선별하였다(도 6).
The HIS4 portion of pAO815-ST3-CalB1422 constructed in Example 8 was treated with Sal I restriction enzyme to make linear DNA and it was concentrated. Pichia pastoris GS115 strain was inoculated on YPD medium and cultured until the OD 600 reached 1.3 ~ 1.5. The cultured strain was centrifuged at 1500 ㅧ g for 5 minutes at 4 째 C, the pellet was dissolved with cold sterilized distilled water, and centrifuged again for 5 minutes. The centrifuged pellet was suspended in 10 ml of LiAc (100 mM LiAc, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.6 M Sorbitol) supplemented with 10 mM DTT and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, 1M sorbitol was treated and centrifugation was repeated to obtain a competent cell having a final volume of 1 ml. 100 μl of the competent cells were mixed with 5 μl of pAO815-ST3-CalB1422 linearized by treatment with Sal I and transformed through electroporation (2.0 kV, 200 Ω, 2.5 msec). Immediately, 1 ml of 1 M sorbitol was added, transferred to a sterilized tube, and cultured at 30 ° C for 1 hour to recover the cells. Transformants were smeared on minimal dextrose (MD) medium and primary screened according to histidine requirement. The selected transformants were randomly selected and spotted on MD-1% Tributyrin + 0.5% Methanol medium and incubated at 30 ° C for 24 hours. The size of the rings around the strain was measured to confirm the activity of the transformants Among them, 10 transformants having the best activity were selected (Fig. 6).
실시예Example 10: 10: 피키아Pikia 파스토리스를Pastoris 이용한 Used CalB1422CalB1422 의 재조합 발현Recombinant expression of
피키아 파스토리스로 형질전환된 GS115/pAO815-ST3-CalB1422의 발현을 위해 선별된 형질전환체를 글리세롤을 탄소원으로 하는 YPG(1% Yeast extract, 2% Peptone, 1% Glycerol) 배지에 접종하여 30℃에서 200rpm으로 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 원심 분리하여 세포를 분리한 후 YPM(1% Yeast extract, 2% Peptone, 4ㅧ10-5% Biotin, 0.5% Methanol) 배지에 접종하고, 30℃에서 48시간 배양하였고, 24시간 간격으로 0.5% 메탄올을 첨가하여 발현을 유도하였다. The transformants selected for expression of GS115 / pAO815-ST3-CalB1422 transformed with Pichia pastoris were inoculated into YPG (1% Yeast extract, 2% Peptone, 1% Glycerol) medium containing glycerol as a carbon source, Lt; 0 > C and 200 rpm for 12 hours. The culture was centrifuged to separate the cells and inoculated into YPM (1% yeast extract, 2% Peptone, 4 ㅧ 10 -5 % Biotin, 0.5% Methanol) medium and cultured at 30 캜 for 48 hours. And 0.5% methanol was added to induce expression.
배양 상등액에 아세톤을 첨가하여 농축 후 SDS-PAGE 분석한 결과 리파제가 배지로 분비 생산되었음을 확인하였다(도 7). 피키아 파스토리스의 경우에도 CalB1422 유전자 크기로부터 유추되는 단백질 크기(33 kD) 보다 큰 TFP3의 pro부분이 융합된 형태의 단백질인 50 kD 단백질로 분비 생산되었다. 발현된 단백질을 pNPP를 기질로 하여 리파제 활성을 측정한 결과 10개의 형질전환체들은 2800~3200 U/L로 비슷한 활성을 보였으며, 그 중 1번 형질전환체에서 가장 높은 활성을 보여 최종 균주로 선별하였다(표 5).
After adding acetone to the culture supernatant, SDS-PAGE analysis after concentration showed that the lipase was secreted into the medium (Fig. 7). In the case of Pichia pastoris, the pro portion of TFP3 larger than the protein size (33 kD) deduced from the CalB1422 gene size was secreted into the fused form of the 50 kD protein. As a result of measuring lipase activity using pNPP as a substrate, 10 transformants showed similar activity at 2800 ~ 3200 U / L, and the highest activity was observed in the first transformant. (Table 5).
실시예Example 11: 11: 피키아Pikia 파스토리스를Pastoris 이용한 Used 리파제Lipase 대량 생산 massive production
CalB1422를 대량 생산하기 위하여 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖의 최소 액체배지(0.67% Yeast nitrogen base without amino acid, 0.5% Casamino acid, 2% Glucose)에 1단계 초기배양한 후 다시 200 ㎖의 YPG 액체배지(3% Yeast extract, 1.5% Peptone, 2% Glycerol)에서 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(10% Yeast extract, 40% Glycerol)를 추가 공급하였다. 재조합 균주는 30℃에서 빠르게 성장하였고, 배양 20시간부터 6시간 간격으로 0.5% methanol을 공급하여 발현을 유도하였다. 배지로 분비된 CalB1422 단백질을 확인하기 위하여 시간별 배양 상등액을 취하여 SDS-PAGE 분석한 결과 시간이 증가됨에 따라 발현 단백질 양도 증가됨을 확인하였고, 배양 48시간 후 세포농도가 260 OD600에 도달하였고 약 37,200 U/L의 활성을 확인하였다(도 8).
For mass production of CalB1422, fed-batch culture was carried out in a 5 L fermenter. The cells were cultured for 1 week in 50 ml of a minimal liquid medium (0.67% yeast nitrogen base without amino acid, 0.5% Casamino acid, 2% glucose) and 200 ml of YPG liquid medium (3% Yeast extract, 1.5% Peptone, 2% Glycerol) and incubated at 30 ° C for 48 hours. (10% yeast extract, 40% Glycerol) was added to the culture media according to the cell growth rate. The recombinant strains grew rapidly at 30 ℃, and the expression was induced by feeding 0.5% methanol at intervals of 6 hours from 20 hours of culture. SDS-PAGE analysis of the supernatant of the culture supernatant was performed to confirm the secreted CalB1422 protein. As a result, it was confirmed that the amount of the expressed protein was increased with increasing time. After 48 hours, the cell concentration reached 260 OD 600 and about 37,200 U / L was confirmed (Fig. 8).
실시예Example 12: 12: CalB1422CalB1422 유전자 다중 도입 Gene multiplex introduction 피키아Pikia 균주 제조 Strain production
도입된 유전자 카피수와 단백질 발현량은 절대적인 것은 아니지만, 일반적으로 어느 정도의 비례관계를 가지고 있기 때문에 CalB1422 유전자가 다중 도입된 균주를 제조하여 발현을 비교하였다. 다중카피 도입을 위한 벡터 제조를 위해 상용화되어있는 피키아 발현 벡터인 pPIC3.5K(Invitrogen)를 사용하였다. 실시예 8에서 구축된 발현 벡터 pAO815-ST3-CalB1422를 EcoRI 으로 3시간 처리하여 ST3-CalB1422 유전자를 얻어 동일 효소로 처리된 pPIC3.5K에 T4-ligase를 첨가하여 하여 16℃에서 1시간 반응 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환체는 항생제 앰피실린이 포함된 2YT 평판배지 (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar)에서 배양하여 선별하였다. 선별된 콜로니는 제한효소를 통해 ST3-CalB1422 유전자가 제대로 들어가 있음을 확인하였고 최종적으로 pPIC-ST3-CalB1422 발현 벡터를 구축하였다(도 9). 구축된 pPIC-ST3-CalB1422의 AOX1 부분을 SacI 제한효소로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들어 전기천공법을 통해 피키아 파스토리스 GS115 균주에 형질전환하였다. 형질전환체들은 1mg/ml의 G418이 첨가된 minimal dextrose(MD) 배지에 도말하여 1차 선별하였다. 1차 선별된 형질전환체들을 다시 MD-1% 트리뷰티린 + 0.5% 메탄올 배지에 점적(spotting)하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후 단일카피 도입 균주보다 환의 크기가 큰 5개의 형질전환체를 선별하였다(도 10). 선별된 형질전환체를 상기 실시예 10에서 설명한 방법으로 배양하여 CalB1422 단백질 분비정도 및 각 균주의 활성을 비교하였다(도 11 및 표 6). 다중 카피 CalB1422가 단일 카피 CalB1422보다 4,000 U/L 이상의 높은 활성을 보였고, 그 중 3번과 5번의 형질전환체에서 가장 높은 활성을 확인하였다.
Although the number of introduced gene copies and the expressed amount of proteins are not absolute, they generally have a proportional relationship to each other. Therefore, strains containing multiple CalB1422 genes were prepared and their expression was compared. The pKIC3.5K (Invitrogen), a commercially available Pichia expression vector, was used for vector preparation for multiple copy introduction. The ST3-CalB1422 gene was obtained by treating the expression vector pAO815-ST3-CalB1422 constructed in Example 8 with EcoRI for 3 hours, and then T4-ligase was added to pPIC3.5K treated with the same enzyme. After reacting at 16 ° C for 1 hour, And transformed into strain DH5?. The transformants were selected by culturing in 2YT plate medium (1.6% Tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% Agar) containing the antibiotic ampicillin. The selected colonies were confirmed to contain the ST3-CalB1422 gene through the restriction enzyme, and finally the pPIC-ST3-CalB1422 expression vector was constructed (FIG. 9). The AOX1 portion of the constructed pPIC-ST3-CalB1422 was treated with SacI restriction enzyme to obtain a linear DNA, which was transformed into Pichia pastoris GS115 strain by electroporation. The transformants were firstly screened on minimal dextrose (MD) medium supplemented with 1 mg / ml G418. The first selected transformants were spotted in MD-1% trivitilin + 0.5% methanol medium and cultured at 30 ° C for 24 hours. Then, 5 transformants having larger ring sizes than the single copy introduction strain (Fig. 10). The selected transformants were cultured by the method described in Example 10 to compare the degree of CalB1422 protein secretion and the activity of each strain (FIG. 11 and Table 6). The multi-copy CalB1422 showed higher activity than the single copy CalB1422 at over 4,000 U / L, and the highest activity was observed in the 3 and 5 transformants.
실시예Example 13: 13: CalB1422CalB1422 변이주의 카피 수 결정 및 Determining the number of copies of mutants and 리파제Lipase 대량생산 massive production
염색체에 도입된 유전자의 카피수를 결정하기 위하여 RNA를 추출하여 real-time PCR 분석(JMC R&D, 한국)하였다. 대조구인 단일카피 CalB1422와 다중카피 CalB1422 중 리파제 활성이 높았던 2개의 형질전환체의 카피수를 비교하였다. 총 RNA로부터 폴리아데닐화된 mRNA를 분리 후 cDNA를 합성하여 각 샘플의 보정 유전자와 확인하고자 하는 유전자의 Ct(Cycle Threshold) 값을 비교하였다. Ct란, 형광의 기준치를 정하고 이에 도달하기 위해 각 시료가 진행해야 하는 사이클 수이다. Delta CT relative quantitation 분석 결과 대조구로 사용된 단일카피 CalB1422 변이주를 캘리브레이터(calibrator)로 정하였을때 이를 기준으로 하여 3번의 형질전환체는 4 카피, 5번의 형질전환체는 5 카피로 GS115 균주에 삽입되었음을 확인하였다(도 12). Delta CT relative quantitation 분석법이란 보정 유전자의 Ct값으로 양을 보정하여 확인 유전자의 발현양의 차이를 비교하여 상대적인 비교양을 분석하는 방법이다. 이 결과로 CalB1422 변이주의 카피수가 높을수록 리파제 활성이 더 높음을 확인하였고, 5번 형질전환체를 최종 균주로 선별하였다. 최종 선별된 다중카피 CalB1422 변이주의 대량 생산을 위하여 실시예 11에서 제시한 방법과 동일하게 5ℓ 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 배양 22시간부터 0.5% 메탄올을 6시간 간격으로 공급하고 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(10% Yeast extract, 20% Glycerol)를 추가 공급하였다. 배양 결과, 배양말기에 220 OD600까지 증가하였고, 리파제 활성은 370,000 U/L로 단일 카피 변이주에 비해 활성이 10배 정도 증가한 것을 확인하였고 분비단백질의 양은 리터당 약 5 g 수준이었다(도 13).
To determine the copy number of the gene introduced into the chromosome, RNA was extracted and analyzed by real-time PCR (JMC R & D, Korea). The copy numbers of the two transfectants with high lipase activity among the control single copy CalB1422 and multiple copy CalB1422 were compared. After separating the polyadenylated mRNA from the total RNA, cDNA was synthesized and the Ct (Cycle Threshold) value of the gene to be verified and the corrected gene of each sample was compared. Ct is the number of cycles that each sample must go through to establish a fluorescence threshold and reach it. Delta CT relative quantitation analysis showed that a single copy of CalB1422 mutant used as a control was used as a calibrator and 3 copies of the transformant were inserted into the GS115 strain with 5 copies of 5 transformants (Fig. 12). The Delta CT relative quantitation method is a method of analyzing the relative amount of comparison by comparing the amount of expression of the confirmed gene by correcting the amount by the Ct value of the corrected gene. As a result, it was confirmed that the higher the number of copies of CalB1422 mutant, the higher the lipase activity, and the 5th transformant was selected as the final strain. For mass production of the finally selected multi-copy CalB1422 mutant strain, the fermentation was carried out in a 5 L fermenter in the same manner as in Example 11. 0.5% methanol was supplied at intervals of 6 hours starting from 22 hours after culturing and supplemented with 10% yeast extract (20% Glycerol) according to the cell growth rate. As a result, the lipase activity was increased to 220 OD 600 at the end of the culture and the activity of lipase was 370,000 U / L, which was 10 times higher than that of the single-copy mutant. The amount of secreted protein was about 5 g per liter (FIG.
실시예Example 14: 재조합 14: Recombination CalB1411CalB1411 및 And CalB1422CalB1422 의 레진 고정화 및 활성측정Of resin immobilization and activity measurement
재조합 대량생산된 CalB1411 및 CalB1422를 이용하여 바이오디젤 생산용 고정화촉매를 개발하기 위해서, 고정화 흡착담체로서 Lewatit VP OC 1600 (Bayer)을 이용하여 고정화하였다. 효소를 고정화하기 전에 담체 30g을 메탄올 75㎖에 60분간 세척한 후 다시 300㎖의 50mM 트리스 완충용액(pH 7.6)에 25℃에서 1시간동안 세척하여 전처리하였다. 효소액은 레진 그람 당 2000u을 첨가하여 진탕배양기에서 25℃, 200rpm의 속도로 15시간 고정화시켰다. 고정화 시간은 상등액에 존재하는 초기 효소활성과 일정시간이 경과한 후 잔여 효소활성을 비교하여 더 이상 잔여활성이 변화가 없을 때까지 고정화 반응을 진행하였다(도 14의 (A)). 또한 도 14의 (B)에서 보는 바와 같이 반응시간별 상등액에 남아 있는 단백질량을 확인하기 위하여, 고정화 시간별로 시료를 취해서 고정화되지 않고 상등액에 남아 있는 CalB 효소의 양을 확인하였다. 고정화 반응이 끝난 담체는 거름종이와 유리깔때기를 이용하여 회수하고 다시 300㎖의 상기 완충용액으로 고정화된 담체를 반복 세척하였다. 세척된 고정화 효소는 상온에서 진공펌프를 이용하여 건조시키고 4℃에 보관하였다.
In order to develop the immobilized catalyst for biodiesel production using recombinant mass produced CalB1411 and CalB1422, immobilization was carried out using Lewatit VP OC 1600 (Bayer) as a fixed adsorption carrier. 30 g of the carrier was washed with 75 ml of methanol for 60 minutes before immobilization of the enzyme, and further washed with 300 ml of 50 mM Tris buffer solution (pH 7.6) at 25 ° C for 1 hour. The enzyme solution was added to 2000 U per gram of resin and immobilized in a shaking incubator at 25 ° C and 200 rpm for 15 hours. The immobilization time was compared with the initial enzyme activity present in the supernatant after the elapse of a certain time, and the immobilization reaction was performed until the residual activity was no longer changed (Fig. 14 (A)). As shown in FIG. 14 (B), in order to confirm the amount of protein remaining in the supernatant by reaction time, the amount of CalB enzyme remaining in the supernatant was determined by immersing the sample in immobilized time. After the immobilization reaction, the carrier was recovered by using a filter paper and a glass funnel, and the carrier immobilized with 300 ml of the buffer solution was repeatedly washed. The washed immobilized enzyme was dried at room temperature using a vacuum pump and stored at 4 ° C.
실시예Example 15: 고정화된 효소를 이용한 바이오디젤 전환반응 효율 비교 15: Comparison of biodiesel conversion efficiency using immobilized enzyme
상기한 바와 같이 흡착 담체에 CalB14, CalB1411 및 CalB1422를 고정화하여 바이오디젤 전환반응 효율을 비교하였다. 식물성유지(대두유, soybean oil) 9.65㎖에 메탄올 0.35㎖을 첨가하고 각 고정화 효소를 10%(w/v) 첨가하여 40℃에서 강력하게 교반하면서 시간별로 생성된 바이오디젤을 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 식물성 유지(triacylglyceride, TG)와 메탄올이 반응하여 바이오디젤(fatty acid methyl ester)로 100% 전환되기 위해서는 전체 유지 양의 11%(v/v) 정도의 메탄올이 필요하다. 그러나 고농도의 메탄올은 효소를 불활성화 하기 때문에 메탄올을 단계적으로 첨가하는 것이 효소를 장기간 사용하기 위해서는 유리하다. 본 반응에서는 메탄올을 초기 반응 시 3.5%의 메탄올을 첨가하고 추가로 메탄올을 첨가하지 않았기 때문에 최대 바이오디젤 전환율은 약 35% 정도이다. As described above, CalB14, CalB1411 and CalB1422 were immobilized on an adsorbent carrier to compare biodiesel conversion reaction efficiencies. 0.35 ml of methanol was added to 9.65 ml of vegetable oil (soybean oil), 10% (w / v) of each immobilized enzyme was added, and the resulting biodiesel was stirred at 40 ° C under high performance liquid chromatography , Agilent). To achieve 100% conversion of fatty acid methyl ester to triacylglyceride (TG) and methanol, about 11% (v / v) of methanol is needed. However, since methanol at high concentration deactivates the enzyme, the stepwise addition of methanol is advantageous for long-term use of the enzyme. In the present reaction, the maximum biodiesel conversion rate is about 35% since methanol was added in the initial reaction with 3.5% of methanol and no additional methanol.
전환된 바이오디젤의 분석은 시간별로 시료를 200㎕ 회수하여 13,000ㅧg에서 5분간 원심분리한 뒤 상등액을 회수하고 이를 아세톤에 적절한 비율로 희석하여 이중 5㎕를 앞서 설명한 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 고정상인 칼럼(C18 4.6 x 150 mm)과 이동상인 아세톤, 아세토나이트릴을 사용하였다. 분석 방법은 초기 분석 후 20분까지는 아세토나이트릴을 100% 사용하다가, 20분에서 30분까지는 50%, 30분에서 40분까지는 100%로 변화시킨 그레디언트를 사용하였다. 분석이 끝난 후, 목표한 위치에 나타난 피크 면적을 적분 계산하고 표준곡선과 비교하여 전환율을 측정하였다. 표준곡선은 시판중인 각각의 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl ester, Sigma)를 구입하여 동일한 조건에서 분석하였으며, 각 지방산 메틸 에스터의 농도별 피크면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 측정결과, 초기반응속도가 본 발명에서 발굴한 두 가지 변이효소 CalB1411 및 CalB1422의 경우 CalB14에 비해 월등히 빠름을 알 수 있었다(도 15). 이러한 결과는 본 발명의 변이 리파제를 이용한 바이오디젤 생산방법은 대조군인 CalB14를 이용하는 경우에 비하여 바이오디젤의 생산율을 증진시킬 수 있으며, 특히 초기 생산율을 월등히 증진시킴으로써 고효율의 생산방법을 제공할 수 있음을 의미한다.
For the analysis of the converted biodiesel, 200 μl of the sample was recovered by time, and the supernatant was recovered by centrifugation at 13,000 ㅧ g for 5 minutes. The supernatant was recovered and diluted with acetone at an appropriate ratio. 5 μl of the recovered biodiesel was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) Agilent). Analytical conditions were a stationary phase column (C18 4.6 x 150 mm) and mobile phase acetone, acetonitrile. For the analytical method, 100% of acetonitrile was used for 20 minutes after the initial analysis, and a gradient of 50% for 20 minutes to 30 minutes and 100% for 30 minutes to 40 minutes was used. After the analysis, the peak area at the target position was integrated and the conversion rate was measured by comparing with the standard curve. Standard curves were obtained by purchasing commercially available fatty acid methyl esters (Sigma) and analyzing them under the same conditions. Standard curves were prepared using the peak area of each fatty acid methyl ester concentration. As a result of the measurement, it was found that the two reaction enzymes CalB1411 and CalB1422, which were found in the present invention, had much faster initial reaction rates than CalB14 (FIG. 15). These results show that the production method of biodiesel using the mutant lipase of the present invention can improve the production rate of biodiesel compared with the case of using CalB14 as the control group and can provide a highly efficient production method by significantly improving the initial production rate it means.
실시예Example 16: 고정화 효소의 반복사용 효율 확인 16: Confirmation of efficiency of repeated use of immobilized enzyme
두가지 변이효소 CalB1411 및 CalB1422를 고정화한 효소가 바이오디젤 전환반응을 위해 안정적으로 반복사용 가능한지 확인하였다. 이는 효소를 이용하여 바이오디젤 생산시 효소 비용이 높기 때문에 반복적인 사용을 통해서 효소비용을 절감할 수 있어야 하기 때문이다. 식물성유지(대두유, soybean oil) 9.65㎖에 메탄올 0.35㎖을 첨가하고 각 고정화 효소를 10%(w/v) 첨가하여 40℃에서 1시간 반응 후, 상등액을 회수하고 남은 고정화 효소에 다시 새로운 식물성유지와 메탄올을 첨가하는 과정을 9회 반복적으로 수행하여 각 시간별 상등액에서의 FAME 전환율을 HPLC(High performance liquid chromatography, Agilent)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, CalB1422로 고정화된 고정화 효소는 9회 반복 사용하여도 전환율이 감소하지 않고 높은 활성을 유지하였으며, CalB1411은 지속적으로 활성이 감소하여 9회 반응 후 잔여활성이 초기에 비해 50% 정도 감소하였음을 알 수 있었다(도 16). 이러한 결과는 본 발명의 변이 리파제의 고정화 효소가 바이오디젤의 전환을 위한 안정성과 경제성이 우수함을 나타내며, 특히 CalB1422의 경우 반복사용 효율이 우수함을 나타낸다.
It was confirmed that the enzymes immobilized with the two mutant enzymes CalB1411 and CalB1422 were stable and repeatable for the biodiesel conversion reaction. This is because the enzyme cost is high in the production of biodiesel using the enzyme, so it is necessary to reduce the enzyme cost through repeated use. To 9.65 ml of vegetable oil (soybean oil), 0.35 ml of methanol was added, and 10% (w / v) of each immobilized enzyme was added. After reaction at 40 ° C for 1 hour, the supernatant was recovered, And methanol were repeatedly performed 9 times, and the FAME conversion in the supernatant was analyzed by HPLC (High performance liquid chromatography, Agilent). As a result, the immobilized enzyme immobilized with CalB1422 retained its high activity without decreasing the conversion even when it was used 9 times repeatedly, and the activity of CalB1411 was continuously decreased, and the residual activity after the 9th reaction was reduced by 50% (Fig. 16). These results indicate that the immobilized enzyme of the mutant lipase of the present invention is excellent in stability and economical efficiency for the conversion of biodiesel, and in particular, CalB1422 shows excellent efficiency of repeated use.
실시예Example 17: 메탄올 공급 방식에 따른 바이오디젤 전환 효율 17: Biodiesel conversion efficiency according to methanol feeding method
최종 선별된 CalB1422가 고정화된 레진을 고정화효소로 사용하여 바이오디젤 전환반응을 수행하였다. 고농도의 메탄올에 의한 효소의 불활성화를 막기 위하여 3.5% 의 메탄올을 3단계에 걸쳐서 공급하는 방법과 펌프를 이용하여 시간당 반응액의 2%의 메탄올을 연속적으로 공급하는 방법을 이용하여 바이오디젤 전환속도를 비교하였다. 그 결과, 3단계에 걸쳐서 메탄올을 공급하는 방법은 시작시 한번, 반응 후 1시간 및 3시간째 3.5% 의 메탄올을 추가 공급한 경우 약 5시간 후 최대 전환율을 보여 약 97%의 전환율을 보였다(도 17). 그러나 메탄올을 연속공급하는 방식에서는 약 4시간만에 최대 전환율 97%에 도달하여 간헐적 공급보다는 연속공급 방식이 전환속도가 빠름을 확인하였다(도 17).
The biodiesel conversion reaction was carried out using the resin with immobilized CalB1422 as the immobilized enzyme. In order to prevent inactivation of the enzyme by high concentration of methanol, 3.5% of methanol was fed in three steps, and 2% of methanol was continuously fed in the reaction solution at a rate of 2% Were compared. As a result, in the method of supplying methanol over three steps, when the methanol was fed at a time of starting once and 3.5% of methanol after 1 hour and 3 hours after the reaction, the maximum conversion was obtained after about 5 hours, showing a conversion of about 97% 17). However, in the case of continuous feeding of methanol, the maximum conversion rate reached 97% in about 4 hours, so that the continuous feeding method was faster than the intermittent feeding (FIG. 17).
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same <130> PA110372KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 forward primer <400> 1 gtatatggtg gtaatgccat g 21 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(1~218) reverse primer <400> 2 cggcccacac acagcctgtg cctggacgtt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(219~317) forward primer <400> 3 tcctacctct tcaacggaaa gaacgtccag 30 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(219~317) reverse primer <400> 4 gtcattatta aatatatata tatatatatt gtcactccgt tcaagtcgac 50 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 reverse primer <400> 5 tcttttatct aaggcgaggc cagcagaggc cgaggcggcc 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14(1~218) forward primer <400> 6 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Candida antarctica <400> 7 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 8 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 <400> 8 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 9 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 F71S mutant <400> 9 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Ser Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 T80A mutant <400> 10 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 W30R mutant <400> 11 Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Arg Ser Thr 20 25 30 Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr 35 40 45 Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg 50 55 60 Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80 Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Met Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu 100 105 110 Ala Leu Asp Lys Arg 115 <210> 12 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 <400> 12 atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60 gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120 tgtggtgcag ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180 aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240 gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccagccagc 300 tccgaaaaga tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag actaccttcc 360 ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag 420 ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc atccttctcg tccccggaac cggcaccaca 480 ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc cccctctctg cgcagctggg ttacacaccc 540 tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc aacgacaccc aggtcaacgc ggagtacatg 600 gtcaacgcca tcaccacgct ctacgctggt tcgggcaaca acaagcttcc cgtgctcacc 660 tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc 720 aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct 780 ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc 840 actaccgcac tccgaaacgc aggcggtctg acccagatcg tgcccaccac caacctctac 900 tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac 960 ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcgac 1020 catgcaggct cgctcacctc gcagttctcn tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc 1080 accacgggcc aggctcgtag tgcggactat ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc 1140 aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc gcggctgcgc tcccggcgcc ggcggctgca 1200 gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc 1260 tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc atcgtcaccc cctga 1305 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 forward primer <400> 13 gaattcatgc aattcaaaaa cgtcgcccta 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 reverse primer <400> 14 gaattcgggg gtgacgatgc cggagcaggt 30 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same <130> PA110372KR <160> 14 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 forward primer <400> 1 gtatatggtg gtaatgccat g 21 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > CalB14 (1 to 218) reverse primer <400> 2 cggcccacac acagcctgtg cctggacgtt 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (219-317) forward primer <400> 3 tcctacctct tcaacggaaa gaacgtccag 30 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (219-317) reverse primer <400> 4 gtcattatta aatatatata tatatatatt gtcactccgt tcaagtcgac 50 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 reverse primer <400> 5 tcttttatct aaggcgaggc cagcagaggc cgaggcggcc 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 (1 to 218) forward primer <400> 6 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Candida antarctica <400> 7 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ale Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 8 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 <400> 8 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ale Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 9 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 F71S mutant <400> 9 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Ser Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ale Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 T80A mutant <400> 10 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ale Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STFP3 W30R mutant <400> 11 Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Arg Ser Thr 20 25 30 Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr 35 40 45 Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg 50 55 60 Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80 Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Met Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu 100 105 110 Ala Leu Asp Lys Arg 115 <210> 12 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 <400> 12 atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60 gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120 tgtggtgcag ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180 aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240 gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccagccagc 300 tccgaaaaga tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag actaccttcc 360 ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag 420 ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc atccttctcg tccccggaac cggcaccaca 480 ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc cccctctctg cgcagctggg ttacacaccc 540 tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc aacgacaccc aggtcaacgc ggagtacatg 600 gtcaacgcca tcaccacgct ctacgctggt tcgggcaaca acaagcttcc cgtgctcacc 660 tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc 720 aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct 780 ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc 840 actaccgcac tccgaaacgc aggcggtctg acccagatcg tgcccaccac caacctctac 900 tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac 960 ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcgac 1020 catgcaggct cgctcacctc gcagttctcn tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc 1080 accacgggcc aggctcgtag tgcggactat ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc 1140 aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc gcggctgcgc tcccggcgcc ggcggctgca 1200 gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc 1260 tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc atcgtcaccc cctga 1305 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 forward primer <400> 13 gaattcatgc aattcaaaaa cgtcgcccta 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 reverse primer <400> 14 gaattcgggg gtgacgatgc cggagcaggt 30
Claims (11)
A mutant lipase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10.
The mutant lipase according to claim 1, wherein the transfection lipase is linked to a protein of a fusion protein (TFP) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
7. A polynucleotide encoding the mutant lipase of claim 1 or 3.
A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
An expression vector comprising the polynucleotide of claim 5.
A transformant transformed by introducing the expression vector of claim 7 into a host cell.
9. The transformant according to claim 8, wherein the expression vector has 3 to 6 copies of the polynucleotide encoding the mutant lipase.
Culturing the transformant of claim 8, and recovering the lipase from the culture or culture supernatant thereof.
(b) 상기 수득한 형질전환체를 배양하여 배양물 또는 배양 상등액으로부터 리파제를 회수하는 단계; 및
(c) 상기 회수된 리파제를 사용하여 유지와 알코올로부터 바이오디젤을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산방법.
(a) introducing the expression vector of claim 7 into a host cell to obtain a transformed transformant;
(b) culturing the obtained transformant to recover lipase from the culture or culture supernatant; And
(c) producing the biodiesel from the oil and alcohol using the recovered lipase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110121244A KR101460228B1 (en) | 2011-11-18 | 2011-11-18 | Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110121244A KR101460228B1 (en) | 2011-11-18 | 2011-11-18 | Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130055477A KR20130055477A (en) | 2013-05-28 |
| KR101460228B1 true KR101460228B1 (en) | 2014-11-10 |
Family
ID=48663958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110121244A KR101460228B1 (en) | 2011-11-18 | 2011-11-18 | Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101460228B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210037520A (en) * | 2019-09-27 | 2021-04-06 | (주)대한뷰티산업진흥원 | Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102181315B1 (en) * | 2018-11-01 | 2020-11-20 | 한국생명공학연구원 | Mutant lipases of Rhizomucor miehei having enhanced transesterification activity and a method of producing the lipase |
| KR102225519B1 (en) * | 2019-09-05 | 2021-03-11 | 한국생명공학연구원 | Variants of Candida antartica Lipase B and Their Use |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100475133B1 (en) | 2002-09-13 | 2005-03-10 | 한국생명공학연구원 | Method for screening of a lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and the lipase |
| KR100697310B1 (en) | 2005-04-12 | 2007-03-20 | 한국생명공학연구원 | Biological method for the production of biodiesel |
-
2011
- 2011-11-18 KR KR1020110121244A patent/KR101460228B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100475133B1 (en) | 2002-09-13 | 2005-03-10 | 한국생명공학연구원 | Method for screening of a lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and the lipase |
| KR100697310B1 (en) | 2005-04-12 | 2007-03-20 | 한국생명공학연구원 | Biological method for the production of biodiesel |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210037520A (en) * | 2019-09-27 | 2021-04-06 | (주)대한뷰티산업진흥원 | Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same |
| KR102254208B1 (en) * | 2019-09-27 | 2021-05-21 | 주식회사 대한뷰티산업진흥원 | Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130055477A (en) | 2013-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takahashi et al. | Extracellular production of active Rhizopus oryzae lipase by Saccharomyces cerevisiae | |
| CN110054702B (en) | Zearalenone degrading enzyme fusion protein and encoding gene and application thereof | |
| CN109280656B (en) | Recombinant beauveria bassiana proteinase K mutant PK-M1 and preparation method thereof | |
| WO2011023009A1 (en) | Recombinant expression of carboxylesterases | |
| CN109182298B (en) | Recombinant lipase mutant, engineering bacterium and application | |
| KR100697310B1 (en) | Biological method for the production of biodiesel | |
| KR101087760B1 (en) | Novel recombinant yeasts and methods of simultaneously producing ethanols and target proteins using them | |
| KR101460228B1 (en) | Mutant lipase with advanced activity and process for production bio-diesel using the same | |
| CN108251400B (en) | Lipase and application thereof | |
| KR101749429B1 (en) | Oleate Hydratase Gene, Expression Vector Containing the Gene, and Transformant Transformed by the Vector | |
| CN109207460B (en) | Recombinant beauveria bassiana proteinase K mutant PK-M2 and preparation method thereof | |
| CN111684065A (en) | Random interesterified lipase | |
| CN108220267B (en) | Phospholipase and application thereof | |
| CN106754818B (en) | Heat-resistant esterase mutant and preparation method and application thereof | |
| KR102170228B1 (en) | A mutant lipase having enhanced transesterification activity and its application for biodiesel production | |
| KR101779890B1 (en) | A microorganism having enhanced levan fructotransferase productivity and a method of producing difructose anhydride IV using the microorganism | |
| KR101837130B1 (en) | Novel lipase from yeast Candida butyri SH-14 and the Use thereof | |
| KR101412468B1 (en) | Mutant Beta-glucosidase with Advanced Activity and Process for Preparing Bio-ethanol Employing the Same | |
| CN111073864B (en) | Novel mutant protein for improving malic acid yield | |
| CN103540558B (en) | A kind of method of biological process synthesis prenol | |
| KR101535526B1 (en) | Fusion proteins of GH61 with enhanced secretory capability comparing to its wild-type | |
| KR101826927B1 (en) | A microorganism having enhanced levansucrase productivity and a method of producing levan using the microorganism | |
| KR101741873B1 (en) | Novel esterase fusion protein with improved activity | |
| CN114921437B (en) | Marine streptomycete lipase mutant and application thereof | |
| KR101481755B1 (en) | Novel endoglucanase and the Use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171106 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190328 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191008 Year of fee payment: 6 |