KR20130036012A - 생체외 세포의 검출을 위한 진단 방법 - Google Patents

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미카엘 도보즈
베르너 쇼이어
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 본질적으로 생체외에서 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여된다. 또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 있어서 본원에 정의된 결합 도메인의 용도에 관한 것이다. 본원에 정의된 방법에서 사용되는 진단 조성물의 제조를 위한 본원에 정의된 결합 도메인의 용도도 예상된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에서 사용되는 본원에 정의된 결합 도메인에 관한 것이다. 본원에 정의된 결합 도메인 및 상기 결합 도메인을 대상체에게 투여하기 위한 수단, 및 선택적으로 본원에 정의된 방법으로 상기 결합 도메인을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트도 개시된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 의해 확인되었을 때 상기 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 환자의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기 결합 도메인, 바람직하게는 치료적으로 효과적인 항체, 예를 들면, 알렘투주마브, 아폴리주마브, 세툭시마브, 에프라투주마브, 갈릭시마브, 젬투주마브, 이필리무마브, 라베투주마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 트라스투주마브, 니모투주마브, 마파투무마브, 마투주마브, rhMab ICR62, rhMab B-Ly1 및 퍼투주마브 등(이들의 조합물을 포함함)의 용도에 관한 것이다.

Description

생체외 세포의 검출을 위한 진단 방법{DIAGNOSTIC METHOD FOR THE DETECTION OF CELLS EX VIVO}
본 발명은 본질적으로 세포 하위세트(subset)를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여된다. 또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 있어서 본원에 정의된 결합 도메인의 용도에 관한 것이다. 본원에 정의된 방법에서 사용되는 진단 조성물의 제조를 위한 본원에 정의된 결합 도메인의 용도도 예상된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에서 사용되는 본원에 정의된 결합 도메인에 관한 것이다. 본원에 정의된 결합 도메인 및 상기 결합 도메인을 대상체에게 투여하기 위한 수단, 및 선택적으로 본원에 정의된 방법으로 상기 결합 도메인을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트도 개시된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 의해 확인되었을 때 상기 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 환자의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기 결합 도메인, 바람직하게는 치료적으로 효과적인 항체, 예를 들면, 알렘투주마브(alemtuzumab), 아폴리주마브(apolizumab), 세툭시마브(cetuximab), 에프라투주마브(epratuzumab), 갈릭시마브(galiximab), 젬투주마브(gemtuzumab), 이필리무마브(ipilimumab), 라베투주마브(labetuzumab), 파니투무마브(panitumumab), 리툭시마브(rituximab), 트라스투주마브(trastuzumab), 니모투주마브(nimotuzumab), 마파투무마브(mapatumumab), 마투주마브(matuzumab), rhMab ICR62, rhMab B-Ly1 및 퍼투주마브(pertuzumab) 등(이들의 조합물을 포함함)의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체에 의한 종양 관련 표면 항원의 표적화는 다양한 악성물의 치료를 위한 성공적인 방법이다. 그러나, 주어진 항체를 사용한 치료적 시술이 개시되기 전에, 관련된 항원의 발현이 확인되어야 한다. 이것은 외식된 종양 조직의 포르말린 고정 및 파라핀 포매(embedding) 절차 후 통상적인 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화 분석에 의해 종종 달성된다. 치료 항체를 사용한 치료는 관련된 종양 관련 표적 항원의 발현이 확인된 경우에만 정당화된다. 방사성표지된 항체에 기초한 생체분포 방법도 논의되어 있다(문헌[Decker et al., Nucl. Med. And Biol., 35 (2008), pp. 599-604]). 그러나, 이들 방법들은 살아있는 신체 및/또는 외식된 기관 내의 항체의 생체분포에 대한 약간의 정보만을 제공한다.
면역조직화학(IHC)은 마커, 예컨대, 형광 염료, 효소, 방사성 원소 또는 콜로이드 금에 의해 가시화되는 항원-항체 상호작용을 통해 표지된 항체를 특이적 시약으로서 사용하여 조직 절편 내에서 항원의 위치를 확인하는 것이다. 면역조직화학은 일반적으로 하기 단계들로 구성된다: a) 일차 항체가 특이적 항원에 결합하는 단계; b) 항체-항원 복합체가 표지된 이차 항체에 의해 결합되는 단계; 및 c) 표지 및 이에 따라 항원(존재하는 경우)이 항체-항원 결합 부위에서 검출되는 단계. 이차 항체는 일반적으로 충분한 검출을 허용하기에는 너무 낮은 검출 신호를 증강시키기 위해 사용된다.
알버트 에이치 쿤스(Albert H. Coons)와 그의 동료들(문헌[Coons et al. 1941, 1955; Coons and Kaplan 1950])은 최초로 항체를 형광 염료로 표지하여 상기 항체를 조직 절편에서 항원을 확인하는 데에 사용하였다. 면역조직화학 기법의 확장 및 발전에 의해, 효소 표지, 예컨대, 퍼록시다제(peroxidase) 및 알칼리성 포스파타제(phosphatase)뿐만 아니라 콜로이드 금이 도입되었다. 면역조직화학 염색은 비정상 세포, 예컨대, 암 종양에서 발견된 비정상 세포의 진단에 널리 이용되고 있다. 다른 특이적 분자 마커는 특정 세포 이벤트(event), 예컨대, 증식 또는 세포 사멸의 특징이다. 또한, IHC는 생물학적 조직의 다양한 부분에서 생체마커 및 차등적으로 발현된 단백질의 생체분포 및 위치를 이해하기 위한 기본적인 연구에서 널리 이용되고 있다. 면역조직화학은 특이적 항원-항체 반응을 수반하기 때문에 제한된 수의 단백질, 효소 및 조직 구조체만을 확인하는 전통적으로 이용되는 특별한 효소 염색 기법에 비해 분명한 장점을 갖는다. 따라서, 면역조직화학은 매우 중요한 기법이 되었고 많은 의학 연구 실험실 및 임상 진단에서 널리 이용된다.
국제 특허출원 공개 제WO 2008/033495호는 EGF-수용체에 대한 특이성을 나타내는 특정 항체 클론이 피부 질환, 특히 건선의 검출 및 요법에 유용할 수 있다는 놀라운 발견을 보고한다. 상기 항체는 생체내 영상화 방법 및 "고전적인" IHC 기초 방법에서도 사용될 것으로 제안된다. 생체내 영상화 방법은 검출 전에 항체의 투여를 필요로 하지만(상기 문헌의 제26항 및 제33항, 및 단락 [0041] 참조), 국제 특허출원 공개 제WO 2008/033495호에 개시된 IHC 방법(상기 IHC 방법은 생체내 영상화 방법에 대한 대안으로서 이용됨)이 해당 조직의 제거 후에만 표지된 항체를 표적 세포와 접촉시킨다는 것은 분명하다(구체적으로, 단락 [0044], [0102] 및 [0103], 및 실시예 1 참조). 국제 특허출원 공개 제WO 2008/033495호는 각각의 조직 샘플의 제거 전에 항체를 투여하고 결합된 항체를 IHC 방법으로 검출하는 것을 개시하거나 암시하지 않는다.
조직 표본은 면역조직화학의 초석이다. 조직 구조 및 세포 형태의 보존을 보장하기 위해, 즉각적이고 적절한 고정이 필수적이다. 그러나, 부적절한 또는 지연된 고정은 항원성 표적이 고정 절차의 과정 동안 변경되거나 심지어 파괴되기 때문에 항체 결합 성능을 상당히 감소시킬 수 있다. 이것은 감소된 신호 강도, 신호의 완전한 부재 또는 심지어 이보다 더 악화된 상태인 표적의 변경(가짜 양성 및/또는 가짜 음성 신호를 발생시킬 것임)을 초래할 것이다. 따라서, IHC 결과의 신뢰성은 IHC 고정 동안 표적의 가능한 변경에 의해 좌우된다. 다른 요인도 IHC 결과의 신뢰성에 영향을 미칠 것이다. 예를 들면, 고정된 조직을 파라핀에 포매하는 것이 표준이지만, 이것은 IHC 측정에 사용되는 결합 도메인(예를 들면, 항체)이 "파라핀 투과능"을 나타낼 것, 즉 상기 결합 도메인이 파라핀 셋팅에서 그의 표적을 발견할 수 있어야 한다는 것을 전제조건으로 한다. IHC 연구에 적용가능한 항체는 이러한 특정 기준(예를 들면, 파라핀 투과능)을 충족시키도록 최적화되므로 치료 항체와 상이한 결합 특성을 가질 수 있다. 일반적으로 말하면, 치료 항체는 파라핀 반응성을 나타내지 않으므로 치료적으로 효과적인 항체 이외에 IHC에서 표적의 검출에 사용될 수 있는 항체를 개발할 필요가 있다. 그러나, "진단" 항체와 "치료" 항체 사이의 이 차이는 문제점을 발생시키는 경향이 있다. 예를 들면, 초기 및 진행된 HER2 양성 유방 암종을 갖는 환자에서 트라스투주마브의 인상적인 임상 이익에도 불구하고, 모든 치료받은 환자들이 유사한 정도로 이익을 얻지는 못할 것이다. 분자적으로 표적화된 요법이기 때문에, 트라스투주마브의 임상 효과는 치료를 위한 후보 환자의 종양 표본에서 HER2 상태의 정확한 평가에 의해 좌우된다. 현재, 임상적 셋팅에서 HER2 상태 평가를 위한 2종의 가장 표준화된 방법이 면역조직화학(IHC) 및 FISH이다. 상기 방법을 이용한 HER2 양성 종양 환자의 신뢰가능한 선택에도 불구하고, 진행된 유방암을 갖는 환자에서 단일 약제인 트라스투주마브의 반응률(RR)은 단지 19% 내지 34%이다. 이것은 HER2 과발현을 검출하기 위해 가장 널리 이용되는 IHC 방법들이 트라스투주마브의 특이적 표적 부위의 존재를 실제로 입증할 수 없기 때문이다.
따라서, 원하는 표적(바람직하게는 세포 표적) 및/또는 이러한 표적을 특징으로 하는 세포 하위세트의 보다 정확한 및/또는 보다 민감한 검출을 가능하게 하는 개선된 방법이 당업계에서 필요하다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적 과제는 생체외 세포의 검출을 위한 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이 필요성을 해결함으로써, 대상체로부터의 조직 샘플 중의 세포 하위세트를 생체외에서 검출하는 단계를 포함하는, 상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법을 상기 기술적 과제에 대한 해결책으로서 제공하는데, 이때 상기 대상체는 조직 샘플 제거 전에 상기 결합 도메인을 제공받는 대상체이다.
현재까지, 표적 발현의 검증은 일반적으로 치료 항체를 사용함으로써 수행되지 않고 IHC에 적합한 항체를 사용함으로써 수행된다. 그러나, 이 방법은 표적 확인의 잘못 해석을 초래할 수 있는 한계점을 갖는다. 더욱이, 통상적인 포르말린 고정은 단점을 갖는다(문헌[Chu W-S et al. Modern Pathol 2005; 18: 850-863]). 고정은 IHC 항체의 결합이 감소되는(또는 증강되는) 방식으로(이러한 감소 또는 증강은 임상 상태를 반영하지 않음) 표면 항원을 변형시킬 수 있다. 또한, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 조직 슬라이드는 IHC 항체를 사용한 최적 염색을 수득하기 위해 특별한 방식(예를 들면, 가열 또는 특별한 효소와의 항온처리에 의한 항원 회복)으로 처리되어야 한다. 마지막으로, 종양 관련 표면 항원이 종양 성장 및 전이성 전파(spread) 동안 조절될(과발현될, 내재화될 또는 쉐딩될(shedded)) 수 있으므로 요법을 변경하거나(상이한 결합 도메인의 사용) 주어진 요법이 여전히 적합한지를 결정할 수 있도록 가능한 자주 주어진 요법의 실제 효과를 평가할 필요성을 보여준다. 따라서, 요법이 개시되는 시점에서 생체내에서 표적 발현의 검증 및 치료 항체의 결합 입증을 동시에 가능하게 하는 기법이 바람직할 것이고 등급화(stratification) 과정을 최적화할 것이다.
본 발명자들은 상기 두 과제를 해결하는 방법을 개발하였다. 치료 항체를 유기 형광단으로 표지하고 정맥내로 인간 이종이식편에 주사하였다. 이 보고에서, 본 발명자들은 표적 발현 및 종양 조직과의 결합을 검증하는 데 있어서 근적외선 형광(NIRF)의 유용성을 입증하였다. 50 ㎍의 Cy5 표지된 헤르셉틴(Herceptin) 또는 옴니타르그(Omnitarg)를 (Her2 양성 종양을 보유하는) 마우스에게 정맥내로 단회 주사한 후, 강한 형광 신호가 24시간 내지 48시간 후 종양 영역에서 검출될 수 있다. 외식된 종양 조직의 후속 분석은 Her2 특이적 항체가 종양 세포에만 결합하고 뮤린 조직에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 인간 IgE에 대해 유도된 대조군 항체 졸에어(Xolair)에 의해서는 형광 신호가 발생되지 않는다(도 1 내지 3). 이 방법은 하기 이유로 고전적인 IHC에 의한 표적 항원의 통상적인 검출보다 우수하다: i) 관련된 표적이 결합 도메인에 의해 결합되어 있으면서 그의 "천연 환경"에 존재하고; ii) 일차 종양 성장 및 전이성 전파 동안 표적 발현의 조절이 검출될 수 있고; iii) 결합 도메인(항체)이 관련된 표적에 결합된 후 종양 조직의 외식 및 고정화가 수행되어야 하고; iv) 치료 항체 및 IHC 항체의 결합 특성의 차이가 무의미하게 된다.
본 발명의 추가 실시양태는 특징규명되어 있고 본원에 기재되어 있고 특허청구범위에도 반영되어 있다.
도 1: 생체내 NIRF 신호 강도(1a, 1b 및 1c)와, 포르말린에 의해 고정된/파라핀에 포매된 HE 조직 슬라이드(2a, 2b 및 2c)의 상관관계; 및 표지된 헤르셉틴(a), 옴니타르그(b) 및 졸에어(c)를 사용한 외식된 종양 조직의 다중분광 영상화(3a, 3b 및 3c).
도 2: 생체내 NIRF 신호 강도와 생체외 NIRF 신호 강도의 상관관계. 강한 생체내 형광 신호전달이 Cy5 표지된 헤르셉틴 및 옴니타르그의 사용에 의해 Her2 양성 종양에서 가시화될 수 있었다(4a 및 4b). Cy5 표지된 에르비툭스(Erbitux), 항-IGF-1R 및 항-Her3의 사용에 의해서는 특이적 형광 신호가 검출될 수 없었다(4c 내지 4e). 외식되고 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 종양의 생체외 분석은 이들 결과를 확인시켜준다. 표지된 항체의 특이적 결합은 헤르셉틴-Cy5 및 옴니타르그-Cy5의 사용에 의해서만 가시화될 수 있는 반면, 에르비툭스-Cy5, 항-IGF-1R-Cy5 및 항-Her3-Cy5는 종양 세포 상에서 형광 신호를 전혀 보이지 않는다(6a 내지 6e).
도 3: 7a 및 7b는 녹색에 의해 표시된 Her2 유전자 발현을 입증한다. Her2 유전자 발현을 갖지 않는 세포는 뮤린 간질(stroma) 세포로서 확인되었다. 7c 및 7d는 Cy5 표지된 헤르셉틴(항-Her2 단일클론 항체)와 Her2 유전자 발현 종양 세포의 특이적 결합을 입증한다.
본원에서 사용된 단수형은, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 복수형 언급을 포함한다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 예를 들면, "시약"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 상이한 시약을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법에 대해 변형될 수 있거나 치환될 수 있는, 당업자에게 공지된 등가의 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 일련의 요소들 앞에 기재된 용어 "적어도"는 상기 일련의 요소들 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 과도한 실험을 이용하지 않고 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물들을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물들은 본 발명에 의해 포괄된다. 문맥이 달리 요구하고 있지 않은 한, 본 명세서 및 하기 특허청구범위 전체에서 단어 "포함한다" 및 이의 어미변화, 예컨대, "포함하고" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 군의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는다.
여러 문헌들이 본 명세서의 내용 전체에서 인용되어 있다. 상기 또는 하기 본원에서 인용된 문헌들 각각(모든 특허들, 특허출원들, 과학 공개문헌들, 제조자의 명세서, 설명서 등을 포함함)은 전체적으로 참고로 본원에 도입된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명을 통해 이러한 개시내용을 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 취지로서 해석되어서는 안 된다.
제1 양태에서, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 세포 하위세트를 상기 결합 도메인으로 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 IHC 방법에 기초한 방법이다.
또한, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대해 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 세포 하위세트를 상기 결합 도메인으로 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 세포 하위세트는 (a) 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체 또는 (b) 상기 결합 도메인으로 전처리된 대상체로부터 유래된다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 시험관내(또는 생체외) 방법이다.
추가 양태에서, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 표적을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 표적을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트 및/또는 표적을 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여된다.
또한, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 표적을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 표적을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 세포 하위세트는 (a) 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체 또는 (b) 상기 결합 도메인으로 전처리된 대상체로부터 유래된다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 세포 하위세트는 조직 샘플 내에 포함된다.
상기 결합 도메인이 그 자신과 표적의 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 대상체에게 투여된다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 본 발명은 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인이, 특히 상기 표적을 특징으로 하는 세포 하위세트가 상기 대상체로부터 제거되고 IHC 고정 절차로 처리되기 전에 그의 천연 환경 하에서 상기 표적에 결합한다는 것을 특징으로 하는 IHC 방법에 관한 것이다. 여기서, 표적의 "천연 환경"은 예를 들면, 상기 표적이 존재하는 생체내(대상체 내부) 또는 세포 배양 환경 하의 세포주이다. 용어 "IHC 고정 절차"는 조직 구조 및 세포 형태의 보존을 보장하기 위해 수행될 수 있는 모든 잘 공지된 단계 및 방법을 포함한다. 이러한 IHC 고정 절차도 본원에 예시되어 있다.
"IHC 방법"은 표지에 의해 가시화되는 표적-결합 도메인 상호작용을 통해 표지된 결합 도메인을 특이적 시약으로서 사용함으로써 조직 절편 내에서 표적(예를 들면, 항원)의 위치를 확인하는 것을 의미한다. 상기 조직 절편이 조직 샘플로부터 채취된 얇은(약 2 ㎛ 내지 40 ㎛) 슬라이스이거나, 또는 조직 샘플이 그다지 두껍지 않고 침투가능한 경우 상기 조직 절편이 전체로서 사용되는 것이 예상된다. 상기 조직 샘플은 바람직하게는 예를 들면, 파라핀에 포매된다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 세포 하위세트에 대한 특이성을 나타내는 표적을 특징으로 하는 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하는 방법, 바람직하게는 IHC 방법에 관한 것으로서, 상기 표적은 이 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인에 의해 결합되는 것을 특징으로 하고, 상기 결합 도메인은 대상체로부터 상기 세포 하위세트(또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 조직 샘플)를 제거하기 전에 상기 표적에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 하위세트에 대한 특이성을 나타내는 표적을 검출하는 단계를 포함하는 방법, 바람직하게는 IHC 방법에 관한 것으로서, 상기 표적은 이 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인에 의해 결합되는 것을 특징으로 하고, 상기 결합 도메인은 대상체로부터 상기 세포 하위세트(또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 조직 샘플)를 제거하기 전에 상기 표적에 결합된다.
생체외에서 일어나는 "검출"은 당업자에게 잘 공지된 표준 검출 기법에 의해 수행되고 임의의 종류의 적합한 IHC 검출 기법, 예컨대, 형광 기초 현미경관찰, 바람직하게는 선택적으로 슬라이드 스캐닝을 포함하는 근적외선 기초 현미경관찰을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 슬라이드 스캐닝은 후속 3D 재구성에 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "결합 도메인"은 주어진 표적과 특이적으로 결합/상호작용하는 폴리펩티드의 도메인을 특징짓는다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 특이적 항원 또는 종양 표적 항원, 또는 특이적 항원 군, 예를 들면, 상이한 종에서 동일한 항원 또는 종양 표적 항원과 특이적으로 결합/상호작용할 수 있다. 상기 결합/상호작용은 "표적의 특이적 인식"을 정의하는 것으로도 이해된다. 용어 "결합 도메인"은 하나 이상의 항원 또는 에피토프 상호작용 부위를 특징으로 하는 모든 종류의 스카폴드(이들 중 몇몇은 본원에서 추가로 특징규명됨)를 구체적으로 포함한다. 항원 또는 에피토프 상호작용 부위는 항원 또는 에피토프(즉, 본 발명의 표적)를 특이적으로 인식하는 항원/에피토프 특이적 결합 물질을 특징으로 한다. 이러한 항원 또는 에피토프 결합 부위는 바람직하게는 항체/면역글로불린 도메인에 기초한 항원 또는 에피토프 결합 부위이다.
용어 "표적을 특이적으로 인식하는" 또는 "표적에 대한 특이성을 나타내는"은 본 발명에 따라 결합 도메인, 예를 들면, 항체가 본원에 정의된 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있고/있거나 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 표적과 결합 도메인 사이의 상호작용과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "결합한다"는 결합 도메인이 단백질과의 일반적인 회합(즉, 비-특이적 결합)에 비해 통계학적으로 유의한 정도로 표적과 회합한다(예를 들면, 표적과 상호작용하거나 표적과 함께 복합체를 형성한다)는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "결합 도메인"은 표적과 통계적으로 유의하게 회합하거나 결합하는 도메인을 의미하는 것으로도 이해된다.
항원 상호작용 부위와 그의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 상기 부위와 상기 항원의 단순한 결합도 발생시킬 수 있다. 더욱이, 결합 도메인/항원 상호작용 부위와 그의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 대안적으로 예를 들면, 항원의 입체구조의 변화, 항원의 올리고머화 등의 유도로 인한 신호의 개시를 일으킬 수 있다. 본 발명의 "결합 도메인"은 항체, 도메인 항체(dAb), 리포칼린, 아피바디(affibody), 아비머(avimer), 펩티드 앱타머, 마이크로바디(microbody) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 결합 도메인의 바람직한 예는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 보다 바람직하게는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 보다 더 바람직하게는 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 형광 표지된다. 이중특이적 또는 다량체 항체 형식도 예상된다.
결합 도메인(예를 들면, 항체)은 세포 하위세트 및/또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플이 제거되기 전에 및 검출이 수행되기 전에, 즉 검출(고정을 포함함) 전에 및 결과적으로 상기 세포 하위세트 및/또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플의 제거 전에 상기 대상체에게 투여된다. 추가로, "전에"는 결합 도메인의 실제 투여와 세포 하위세트 및/또는 조직 샘플의 실제 제거 사이의 기간이 환경에 따라 결합 도메인이 그의 표적에 결합할 충분한 시간을 갖게 하는 기간임을 의미한다. 상기 기간은 표적, 결합 도메인, 결합 도메인의 결합 특성(표적에 대한 친화성 또는 결합 도메인의 친화력), 대상체 내에서의 결합 도메인의 반감기, 결합 도메인의 혈액 제거(단, 결합 도메인이 정맥내로 투여됨) 등에 의해 좌우된다. 그러나, 당업자는 결합 도메인과 표적의 특이적 결합을 허용하기 위해 어느 정도의 기간이 충분한지를 판단할 수 있다. 이것은 결합 도메인의 양, 투여 경로 등의 경우에도 동일하게 적용된다.
이차 결합 도메인이 제1 결합 도메인(일차 결합 도메인)을 검출하기 위해 사용되는 한, 일차 결합 도메인만이 검출 전에 투여되거나, 또는 둘다, 즉 일차 결합 도메인 및 이차 결합 도메인이 전술된 바와 같이 검출 전에 및 결과적으로 상기 세포 하위세트 및/또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플의 제거 전에 (동시적으로 또는 순차적으로) 투여된다. 일차 결합 도메인 및 이차 결합 도메인은 본원에서 이하에 보다 상세히 설명되어 있다.
일차 결합 도메인이 세포 하위세트 및/또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플의 검출 전에 및 결과적으로 제거 전에 투여되고, 이차 결합 도메인(사용되는 경우)이 상기 세포 하위세트 및/또는 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플의 제거 후에 사용되는 것이 바람직하다.
일차 결합 도메인을 검출하기 위해 일차 결합 도메인만이 사용되고 이차 결합 도메인이 사용되지 않는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 대상체는 상기 세포 하위세트/조직 샘플의 제거 전에 결합 도메인을 투여받는 대상체이다. 대안적으로, 본 발명의 대상체는 상기 조직 샘플/세포 하위세트의 제거 전에 본 발명의 결합 도메인을 제공받는 대상체이다. 본 발명의 대상체가 조직 샘플/세포 하위세트의 제거 전에 본원에 정의된 결합 도메인을 이미 포함하는 것이 예상된다. 본 발명의 대상체는 상기 세포 하위세트 및/또는 표적을 포함하거나 포함하는 것으로 추정된다. "포함하는 것으로 추정된"은 세포 하위세트 및/또는 표적이 존재하는지, 부재하는지, 과발현되는지 아니면 저발현되는지(under-expressed)를 진단하기 위한 것임을 의미한다. 따라서, 관심있는 세포 하위세트 및/또는 표적이 존재하는지, 부재하는지, 과발현되는지 아니면 저발현되는지를 미리 알 필요가 없다. 나아가, 본 발명의 대상체가 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 대상체인 것도 예상된다. 본 발명의 조직 샘플 및/또는 세포 하위세트는 본 발명의 대상체로부터 수득된다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 면역조직화학(IHC) 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 생체외에서 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 세포 하위세트(또는 본원에 기재된 조직 샘플)는 상기 조직 샘플/세포 하위세트의 제거 전에 본 발명의 결합 도메인을 제공받은 대상체로부터 수득된다.
투여 경로는 환경에 의해 좌우되고 경구 투여를 포함하지만, 투여는 바람직하게는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 복강내, 종양내 투여 등이다. 정맥내 투여가 보다 바람직하다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액(식염수 및 완충된 매질을 포함함)을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 함유 링거 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충체(예컨대, 링거 덱스트로스 기제의 보충제) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다.
결합 도메인이 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 것이 예상된다. 용어 "세포 하위세트"는 이 세포 하위세트를 다른 세포로부터 구별하는 데에 기여하는 하나 이상의, 즉 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 심지어 이보다 많은 수의 표적을 특징으로 하고/하거나 이 표적에 의해 확인될 수 있는 관심있는 세포를 의미한다. 상기 표적은 상기 세포 하위세트에 대한 특이성을 나타내거나 나타내는 것으로 추정된다.
표적은 상기 세포 하위세트 상에 또는 내에 특이적으로 존재할 수 있거나(발현), 상기 세포 하위세트 상에서/내에서 특이적으로 상향조절될 수 있거나(과다발현), 상기 세포 하위세트 상에서/내에서 특이적으로 하향조절될 수 있거나(저발현), 또는 예상된 세포 하위세트로부터 특이적으로 부재할 수 있다. 따라서, 표적의 존재 또는 부재뿐만 아니라 표적 발현 수준의 변경(예를 들면, 시간의 경과에 따른 표적 발현 수준의 변경; 자극제 또는 억제제에 반응한 표적 발현 수준의 변경; 또는 비교가능한 대조군 세포의 정상/천연 상태와 비교된 표적 발현 수준의 변경(이때, "비교가능한 대조군 세포의 정상/천연 상태"는 바람직하게는 세포의 하위세트를 형성하는 세포와 동일한 종류의 세포(예를 들면, 둘다 상피세포임)이되 상이한 공급원으로부터 유래된 대조군 세포를 의미함))도 세포 하위세트의 특징이 될 수 있다는 것이 이해될 것이다. "상이한 공급원"은 예를 들면, 건강한 대상체로부터 수득된 세포/조직 샘플, 또는 동일한 대상체의 상이하지만 명백히 건강한 부분으로부터 수득된 세포/조직 샘플을 포함하고, 이때 상기 상이한 부분은 상기 세포 하위세트를 특징으로 하는 질환의 관련된 증상을 갖지 않는 것으로 보인다.
전술된 상태의 혼합으로, 예를 들면, 하나 이상의 표적이 특이적으로 존재하되, 또 다른 표적이 존재하지 않는 것 등으로 세포 하위세트를 정의하는 것도 예상된다.
"관심있는 세포"는 어떤 세포가 관심 있고 어떤 세포가 관심이 없는지를 결정하는 것이 분석의 의도 및 이에 따라 선택된 표적에 좌우된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 일부 종양은 종양 마커, 예컨대, β-HCG, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, CFA, MUC-1, MAGE, p53, ETA, CA-125, CEA, AFP, PSA, PSMA, 4종의 밀접하게 관련된 수용체 티로신 키나제(kinase) 하위패밀리인 ErbB 수용체 패밀리(EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3(ErbB-3) 및 Her 4(ErbB-4)) 등을 과발현한다는 것, 즉 "세포 하위세트"가 이들 종양 마커들 중 하나 이상을 발현/과발현하는 세포(추정컨대, 종양 세포)를 포함할 수 있다는 것이 잘 공지되어 있다. 마찬가지로, 분석의 의도에 따라 전술된 종양 마커들 중 하나 또는 전부를 발현하지 않는 세포 하위세트를 확인하는 것이 가능하다.
세포 하위세트를 형성하는 세포는 동물 세포, 기생충, 예컨대, 벌레의 세포, 진균 세포, 박테리아, 바이러스 또는 원생동물일 수 있다.
용어 "동물 세포"는 예를 들면, 본원에서 이하에 정의되어 있는 "대상체"의 세포를 포함한다. 종양 세포가 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 상기 세포 하위세트는 종양 세포로 구성되거나 종양 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "종양" 또는 "종양 세포"는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 기술한다. 종양의 예는 암종, 림프종, 모세포종(수모세포종 및 망막모세포종을 포함함), 육종(지방육종 및 활액 세포 육종을 포함함), 신경내분비 종양(카르시노이드(carcinoid) 종양, 가스트린종 및 섬세포암을 포함함), 중피종, 슈반세포종(청신경초종을 포함함), 수막종, 선암종 및 흑색종을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "종양 세포"는 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 콩팥암 또는 신장암, 전립선암, 질암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 정소암, 식도암, 담관 종양, 및 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택된 종양을 의미하는 "고형 종양"을 추가로 포함하고, 유방암이 바람직하다.
세포주도 예상된다. 이들 세포주는 "단리된 형태"로 사용될 수 있다. 세포주 자체는 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 의미 내에서 표적을 발현하는 모든 생각될 수 있는 세포가 예상된다. 세포주는 균질할 수 있거나 불균질할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포주는 종양 세포로부터 유래된다.
용어 "원생동물" 또는 원생동물 기생충은 예를 들면, 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica) 또는 아피콤플렉사(Apicomplexa)(특히, 아델레오리나(Adeleorina), 해모스포리다(Haemosporida) 및 에이메리오리나(Eimeriorina)를 포함하는 혈액 유래 아목, 및 플라스모디아(Plasmodia) 속의 종이 바람직함)에 속하는 종, 및/또는 내부기생충을 포함한다.
용어 "진균"은 진균 포자를 포함하는 아스퍼길러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 블라스토마이세스(Blastomyces), 파라콕코이데스(Paracoccoides), 뮤코르(Mucor), 쿠르불라리아(Curvularia), 푸사리움(Fusarium) 등을 포함한다.
용어 "박테리아"는 상호 유사하게 성장하는 종, 예를 들면, 에스케리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 크렙시엘라(Klebsiella), 비브리오(Vibrio), 파스테우렐라(Pasteurella), 보렐리아(Borrelia), 렙토스피라(Leptospira), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema), 리케치아(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia), 마이코플라스마(Mycoplasma), 콕시엘라(Coxiella), 네이세리아(Neisseria), 리스테리아(Listeria), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레기오넬라(Legionella), 슈도모나스(Pseudomonas), 보르데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 바실러스(Bacillus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 노카르디아(Nocardia) 등의 종을 포함한다.
용어 "바이러스"는 예를 들면, 피코르나비리대(Picornaviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae), 레오비리대(Reoviridae), 토가비리대(Togaviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 라브도비리대(Rhabdoviridae), 코르나비리대(Coronaviridae), 번야비리대(Bunyaviridae), 아레나비리대(Arenaviridae), 테로비리대(Rteroviridae), 파르보비리대(Parvoviridae), 파포바비리대(Papovaviridae), 아데노비리대(Adenoviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae) 및 폭스비리대(Poxviridae) 속의 바이러스, HAV, HBV, HCV, HIV, HTLV, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스 바이러스(모든 공지된 하위유형 및 변이체를 포함함)를 포함하고, HBV, HCV 및 HIV가 바람직하다.
이처럼 정의된 세포 하위세트는 그 자체가 균질할 필요는 없다. 즉, 상이한 종류의 세포들(이종 세포들)이 함께 군을 이루는 것이 생각될 수 있는데, 이는 예를 들면, 모든 이들 상이한 세포들이 이들 세포들을 특징짓거나 특징짓는 것으로 추정되는 원하는 표적을 발현하기 때문이다(예를 들면, 종양 마커를 발현하는 세포들, 또는 예컨대, 사이토카인 또는 호르몬 수용체와 같은 수용체를 발현하는 세포들). 그러나, 세포 하위세트가 균질하다는 것, 즉 주로 하나의 동일한 종류의 세포(예를 들면, 상피세포, 섬유모세포 등)로 구성되는 것도 예상된다. 종양은 통상적으로 이 종양과 닮은 세포의 종류에 의해 분류되므로, 종양 세포는 종종 균질하다. 균질한 종양의 일반적인 카테고리의 예는 하기 카테고리를 포함한다: 암종(흔한 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는, 상피세포로부터 유래된 악성 종양); 육종(결합 조직 또는 중간엽세포로부터 유래된 악성 종양); 림프종 및 백혈병(조혈(혈액 형성)세포로부터 유래된 악성물); 생식세포 종양(전능세포로부터 유래된 종양 - 성인에서 정소 및 난소에서 가장 자주 발견되고, 태아, 유아 및 소아에서 신체 중심선, 특히 꼬리등뼈의 정점에서 가장 자주 발견됨); 모세포 종양 또는 모세포종(미성숙 또는 배아 조직을 닮은 종양(통상적으로 악성))(이들 종양의 대다수가 소아에서 가장 흔함). 이들 언급된 종양 모두가 세포 하위세트를 개별적으로 형성할 수 있다. 마찬가지로, 언급된 종양 내에서 보다 한정된 종양 세포 하위세트, 예를 들면, 하나 이상의 표적, 예를 들면, ErbB 수용체 패밀리의 수용체를 발현하고/하거나, 과발현하고/하거나 저발현하는 종양 세포를 정의할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 하위세트는 ErbB 수용체 패밀리의 수용체, 예를 들면, Her2/neu 수용체를 과발현하는 종양 세포이다.
상기 세포 하위세트는 조직 샘플 내에 포함되거나 그 자체가 조직 샘플(예를 들면, 종양으로부터 유래된 종양 세포, 세포 배양물에서 성장된 세포주, 및 원하는 종류의 세포를 풍부하게 하기 위해 단리되고 바람직하게는 정제된 일차 세포)이다. 예를 들면, 종양 세포 및/또는 (미세)전이는 종종 건강한, 즉 비-종양형성 조직에 의해 둘러싸여 있다(즉, 건강한 조직 내의 세포 하위세트를 형성할 수 있음). 이에 따라 조직 샘플은 건강한 세포 하위세트 및 종양형성 세포 하위세트를 포함할 수 있다. 상기 종양 세포 하위세트 내에서 추가 종양 세포 하위세트, 예를 들면, HER2/neu를 발현/과발현하는 종양 세포를 정의할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 또는 다른 병원성 종(박테리아, 원생동물 등)이 조직 샘플 내에 포함되는 것도 예상된다. 이러한 박테리아는 이 조직 샘플 내에서 세포 하위세트를 형성할 수 있거나, 또는 예를 들면, 세포내 박테리아를 포함하는 세포는 조직 샘플 내에서 세포 하위세트를 형성할 수 있다. 전술된 바와 같이, 조직 샘플이 전체적으로 세포 하위세트로 구성되는 것도 예상된다. 용어 "조직", "조직 샘플", "조직 절편" 등은 상호교환가능하게 사용된다는 것이 이해될 것이다. 나아가, 본 발명의 방법을 (조직 샘플 내에 포함될 수 있는) 세포 하위세트를 사용하여 수행할 수 있다는 것도 예상된다.
조직 샘플은 생검, 예컨대, 바늘 생검, 수술 생검, 골수 생검 등을 통해 수득될 수 있다.
용어 "표적" 또는 "상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적"은 결합 도메인에 결합되고 원하는 세포 하위세트에 대한 특이성을 나타내거나 나타내는 것으로 추정되는 모든 구조체/항원/에피토프를 포함한다. "특이성"은 이 표적이 상기 세포 하위세트를 특징짓는다는 것, 즉 상기 표적이 이들 세포 상에서(또는 내에서) 주로 존재하거나, 이들 세포 상에서 또는 내에서 주로 부재하거나, 또는 이들 세포 상에서 또는 내에서 주로 과발현되거나 저발현된다는 것을 의미한다. 여기서, "주로"는 생물학적 시스템에서 원하는 세포 하위세트가 시간의 경과에 따라 변하지 않은 상태로 유지되는 상황을 달성하는 것이 거의 불가능하다는 사실을 반영할 것이다. 상기 표적은 생물학적 상태, 예컨대, 질환 또는 장애 및 병원체의 존재와 관련될 수 있다. 표적이 특정 생물학적 상태"와 관련되어" 있는 경우, 표적의 존재 또는 부재, 또는 특정 양의 표적의 존재 또는 부재는 생물학적 상태를 확인시켜줄 수 있다.
본 발명과 관련하여 "표적"은 구체적으로 단백질, 펩티드, 효소, 핵산, 폴리사카라이드, 지질, 수용체, 세포 표적, 및/또는 종양 항원 또는 임의의 다른 종류의 구조체/항원/에피토프(이의 존재(정성적) 및/또는 양(정량적)은 관심대상이고 세포 하위세트의 특징임)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 표적(그의 존재, 부재 또는 양)은 특정 질환, 바람직하게는 암에 대한 예후 가치를 갖는다.
"세포 표적"은 세포 하위세트를 특징짓는, 바람직하게는 세포 표면 상의 모든 종류의 에피토프/항원/구조체, 예컨대, 수지상세포, 장 상피세포, B 세포 하위세트, NK T 세포 하위세트의 표적화에 사용될 수 있는 CAM, 예컨대, NCAM, ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, L1, CHL1, MAG, 인테그린, 예컨대, αvβ3 및 αvβ5 인테그린, 셀렉틴, CD 항원, 예컨대, CD1d; CD11a, CD11b, CD11c 및 CD11d; 예를 들면, 대식세포의 표적화에 사용될 수 있는 CD14 및 CD16/18; 예를 들면, IgM 또는 IgD를 발현하는 활성화된 성숙 B 세포(특히 맨틀 세포), 활성화된 단핵구/대식세포, T 세포 하위세트, 혈소판, 호산구, 랑게르한스 세포, 여포성 수지상세포 또는 장 상피의 표적화에 사용될 수 있는 CD23; 예를 들면, B 및 T 세포 및 B 세포 전구체, 단핵구, 파골세포, 내피세포, 및 다양한 상피세포의 표적화에 사용될 수 있는 CD54(ICAM-1로도 공지되어 있음); 예를 들면, NK 하위세트, T 세포 하위세트, 신경외배엽 조직, 망막, 뇌, 전립선 및 신장 근위요세관의 세포의 표적화에 사용될 수 있는 CD57; 대식세포/단핵구, 활성화된 과립구, 수지상세포 또는 초기 골수세포를 포함하는 항원제시세포의 표적화에 사용될 수 있는 CD64(Fc 감마 RI로도 지칭됨); 섬유모세포, 수지상세포, 대식세포, 간, 뇌 또는 폐 조직의 표적화에 사용될 수 있는 CD91(저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1)로도 공지되어 있고 알파-2-마크로글로불린 수용체로도 지칭됨); CD-20; 및 CD-45를 포함한다. 나아가, 상기 용어는 항-CD 항체, 상이한 유래(유방, 결장, 폐, 전립선, 난소, 간 및 췌장)의 암 줄기세포에 의해 발현된 항원, 분자 위험 신호, TLR, 박테리아 독소, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/114308호에 기재된 신경세포에 대한 "트래포(trapo)", 또는 전형적으로 수지상세포에 존재하는 DEC-205에 관한 것이다. 또한, 상기 용어는 일부 기관 또는 조직, 예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 피부 또는 심장에 대한 특이성을 나타낼 수 있는 혈관 귀소(homing) 펩티드에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 용어는 문헌[Arap, W. et al. Proc. Natl Acad Sci. U.S.A., 99:1527-1531 (2002)]; 문헌[Rajotte, D. et al., J. Clin Invest., 102:430-437 (1998)]; 문헌[Pasqualini, R., and Ruoslahti, E. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:83]; 문헌[Rajotte, D. and Ruoshlati, E., J. Biol. Chem. 274:11593-11598 (1999)]; 및 문헌[Essler, M., and Ruoshlati, E., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 99:2252-2257 (2002)]에서 언급된 것과 같은 펩티드에 관한 것이다.
용어 "수용체 분자" 또는 "수용체"는 리간드에 결합하여 전형적으로 신호를 변환시키는, 세포막 상의 단백질 또는 세포질 또는 세포핵 내의 단백질, 예컨대, 대사성 수용체, G 단백질-커플링된 수용체, 무스카린성 아세틸콜린 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 수용체, GABA 수용체, 안지오텐신 수용체, 칸나비노이드 수용체, 콜레사이스토키닌 수용체, 도파민 수용체, 글루카곤 수용체, 대사성 글루타메이트 수용체, 히스타민 수용체, 후각 수용체, 오피오이드 수용체, 케모카인 수용체, 칼슘 감지 수용체, 소마토스타틴 수용체, 세로토닌 수용체, 세크레틴 수용체, Fc 수용체 또는 수용체 티로신 키나제(RTK)에 관한 것이다. 수용체 티로신 키나제 패밀리는 많은 폴리펩티드 성장인자, 사이토카인 및 호르몬에 대한 고친화성 세포 표면 수용체들로 구성되고, 특히 에프린 수용체(Eph 수용체 패밀리); RET 수용체 패밀리; 특히 VEGFR1(Flt-1), VEGFR2(Flk-1/KDR) 및 VEGFR4(Flt-4)를 포함하는 VEGF 수용체 패밀리; 및 FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 및 FGFR6에 의해 예시된 섬유모세포 성장인자 수용체 패밀리를 포함한다. 4종의 밀접하게 관련된 수용체 티로신 키나제 하위패밀리인 ErbB 수용체 패밀리, 즉 EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3(ErbB-3) 및 Her 4(ErbB-4)도 포함되고 특히 바람직하다.
용어 "핵산"은 당업자에게 공지된 임의의 핵산, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA, RNA, 단일 가닥 DNA, cDNA, PNA 또는 이의 유도체를 의미한다.
용어 "단백질"은 치료적 활성 단백질, 효소, 마커 단백질 등을 포함하는 관심있는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "펩티드"는 2개 이상의 아미노산(바람직하게는, 알파-아미노산), 즉 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 훨씬 더 많은 최대 30개의 아미노산이 아미드 결합에 의해 연결됨으로써 형성된 분자를 의미한다.
용어 "효소"는 세포 하위세트에 대한 특이성을 나타내거나 나타내는 것으로 추정되는 촉매적 활성 단백질, 예를 들면, 종양 세포에서 빈번하게 과발현되는 메탈로프로테아제(metalloprotease) 등을 포함하기 위한 것이다.
용어 "지질"은 세포 하위세트의 특징이 될 수 있고 단백질, 예컨대, 수용체, 키나제 또는 포스파타제에 결합하여 특정 세포 반응에 대한 지질의 효과를 매개하는 지질 메신저를 포함하는 모든 종류의 지질을 포함하기 위한 것이다.
용어 "폴리사카라이드"는 글리코사이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 반복 유닛(모노사카라이드 또는 다이사카라이드)으로 형성된 중합체성 탄수화물 구조체를 의미하고 세포의 표면 상에 제시된 폴리사카라이드(예를 들면, MUC-1), 박테리아 또는 바이러스 캡슐 또는 외피를 형성하거나 이들의 일부인 폴리사카라이드, 그람 음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS) 등을 포함한다.
"종양 마커"와 교환가능한 용어 "종양 항원"은 종양 특이적 항원 및 종양 관련 항원, 바람직하게는 일차 종양 성장 및 전이의 원인이 되는 종양 관련 항원을 포함한다. "종양 항원"은 β-HCG; CA 15-3; CA 19-9; CA 72-4; CFA; MUC-1; MAGE; ras; p53; ETA; CA-125; CEA; AFP; PSA; PSMA; Ep-CAM; CD33; CD44v6; MCSP; CD30; 4종의 밀접하게 관련된 수용체 티로신 키나제 하위패밀리인 ErbB 수용체 패밀리(EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her 3(ErbB-3) 및 Her 4(ErbB-4)); 안지오포이에틴 및 이의 수용체; VEGF 및 이의 수용체; CD9; CDCP1; CSF1R; CYR61; HER3; HPN(= 헵신(Hepsin)); TDGF1; TROP2; CD44; IGF1R; TWEAK; EGFR; 및 PLGF 및/또는 c-met에 의해 예시된다(그러나 이들로 한정되지 않음).
본원에서 언급된 박테리아, 바이러스 또는 다른 병원성 유기체도 바람직하게는 이들 병원성 유기체가 세포(숙주 세포) 내에 포함되는 경우 표적을 형성할 수 있다. 이로써 상기 숙주 세포는 상기 표적(박테리아, 바이러스)을 특징으로 한다.
세포 하위세트의 표면 상에 제시된 표적이 (단일 표적 또는 이의 조합물로서) 특히 바람직하다.
진단 가치가 있는 표적이 훨씬 더 바람직하다. "진단 가치"는 표적의 상향조절 또는 하향조절의 존재 또는 부재가 특정 질환에 대한 예후 가치를 갖는다는 것이 이미 공지되어 있거나 장래에 공지될 것임을 의미한다(예컨대, 유방암의 경우 HER2/neu).
"시험관내"와 상호교환가능하게 사용되는 용어 "생체외"는 조절된 환경 하에서 세포에 대해 수행된 활동을 의미하다. 본원 및 당업계에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 세포 배양물 중의 세포 또는 기관 배양물 중의 세포를 의미할 수 있는 "배양물 중의"와 종종 상호교환가능하게 사용된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하고/하거나 상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 시험관내에서 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 검출 전에 및/또는 상기 표적의 검출 전에 그의 표적에 결합된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 세포 하위세트는 조직 샘플 내에 포함된다.
본 발명의 결합 도메인은 바람직하게는 표지된다.
본 발명과 관련하여 표지는 분광학적 수단, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다.
표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
"직접적으로"는 표지 그 자체가 신호, 예컨대, 방사성 신호, 발색성 신호 또는 형광 신호를 발생시킨다는 것을 의미한다. 직접적인 표지는 방사성표지; 형광 표지; 전자 조밀 시약 등을 포함한다. 직접적인 표지는 결합된 결합 도메인을 정량하고/하거나 (정성적으로) 검출하는 데에 사용될 수 있는 측정가능한 신호를 갖거나 발생시킨다. 형광 표지가 바람직한 직접적인 표지이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 상기 검출은 직접적인 면역조직화학에 의한 검출이고 상기 (바람직하게는 형광) 표지된 결합 도메인의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 상기 결합 도메인은 보다 바람직하게는 항체이다.
이차 결합 도메인이 사용되지 않는 경우 일차 결합 도메인이 직접적으로 표지된다는 것이 이해될 것이다.
"간접적으로"는 표지가 예를 들면, 그 자체로서 검출될 수 있는 또 다른 물질(검출 물질)에 의해 결합되어 있다는 것을 의미한다. 간접적인 검출 또는 간접적인 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 이차 결합 도메인과 간접적인 표지의 결합을 수반한다. 예를 들면, 본 발명의 결합 도메인의 간접적인 표지는 결합 파트너의 리간드, 예컨대, 스트렙타비딘의 결합 파트너인 바이오틴일 수 있거나, 또는 특이적으로 혼성화될 수 있는 상보적 서열에 대한 결합 파트너인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 따라서, "간접적인 표지부착(labelling)"은 일차 결합 도메인이 이차 결합 도메인(종종 검출 물질로도 지칭됨)(예를 들면, 바이오틴 표지)에 의해 검출될 수 있도록 조작되고, 이때 상기 이차 결합 도메인이 상기 조작에 대한 특이성을 나타낸다는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 결합 도메인은 항체(일차 항체)이고, 상기 검출 물질은 상기 일차 항체(의 표지)와 특이적으로 반응하는 이차 항체이다.
간접적인 표지부착과 직접적인 표지부착이 혼합되는 것도 예상된다. 예를 들면, 직접적인 표지는 이미 신호를 발생시킬 수 있지만(예를 들면, 형광 표지, 예컨대, FITC), 이차 결합 도메인(이것도 예를 들면, 직접적인 표지로 표지되어 있음)은 상기 표지에 특이적으로 결합하거나(항-FITC 항체) 일차 신호의 표지에 결합하여 검출가능한 신호를 증가시킬 수 있다. 이러한 수단 및 방법은 당업자, 특히 면역화학 분야의 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다.
대상체에게 투여되는(또는 대상체 내에 포함되는) 결합 도메인 집단의 10% 이상이 직접적인 표지 또는 간접적인 표지로 표지되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 대상체에게 투여되는 결합 도메인 집단의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 이상이 직접적인 표지 또는 간접적인 표지로 표지된다.
또 다른 실시양태에서, 일차 결합 도메인(예를 들면, 항체)은 그 자체로서 표지되지 않지만 상기 일차 결합 도메인에 결합하는 이차 결합 도메인(검출 물질)에 의해 검출되거나 검출될 수 있다(예를 들면, 마우스에서 발생된 일차 비-표지된 항체는 또 다른 종에서 발생되었고 마우스 항체에 특이적으로 결합하는 이차 표지된 항체(예를 들면, 염소 항-마우스 항체)에 의해 검출됨). 그 다음, 이차 결합 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 이러한 항체 검출 샌드위치는 잘 확립되어 있고 당업자는 이러한 시스템을 발생시키거나 확립하는 데에 문제점을 갖지 않을 것이다.
면역조직화학에 사용되는 가장 흔한 고정제는 약 1% 내지 5%의 파라포름알데하이드를 함유하는 다양한 완충제 형태로 빈번하게 사용되는 파라포름알데하이드이다. 파라포름알데하이드 기제의 특정 완충제는 하기 a) 내지 d)로 예시된다:
a) 0.1 M 포스페이트 완충제 중의 4% 파라포름알데하이드;
b) 0.1 M 포스페이트 완충제 중의 2% 파라포름알데하이드 및 0.2% 피크르산;
c) PLP(파라포름알데하이드, 라이신, 파라포름알데하이드) 고정제, 예를 들면, 0.1 M 포스페이트 완충제 중의 4% 파라포름알데하이드, 0.2% 페리오데이트 및 1.2% 라이신; 및
d) 4% 파라포름알데하이드 및 0.05% 글루타르알데하이드.
이들 완충제들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 조직의 충분한 고정을 달성하기 위해 통상적으로 적용되는 구체적인 조건을 단순히 예시하기 위한 것이다. 표준 고정 시간은 약 5분, 10분, 15분, 20분, 30분 내지 하룻밤 동안의 시간이다. 이처럼 처리된 조직은 빈번하게 후속 파라핀 포매 프로토콜로 처리된 후, 유기 용매 중에서 항온처리(예를 들면, 크실렌 및 에탄올 처리)된다. 그 다음, 통상적으로 샘플을 95%, 70%, 50% 또는 30% 알코올(예를 들면, 에탄올) 중에 각각 수분 동안 넣어둠으로써 상기 샘플을 수화시킨다. 그러나, IHC에 대한 표준 프로토콜은 없다. 즉, 상기 프로토콜은 표적, 조직, 사용된 항체 등에 따라 변경될 것이다. 이들 모두가 당업자에게 공지되어 있고 추가 노력 없이 상용적으로 취급된다. 구체적인 프로토콜은 예를 들면, 인터넷(구글 등과 같은 검색기에서 IHC 프로토콜이라는 문자열로 검색될 수 있음)에 개시되어 있다. 몇몇 항원은 적절한 양의 알데하이드 고정 하에서조차도 생존하지 못할 것이다. 이 조건 하에서, 조직은 종종 액체 질소에서 신선하게 동결되고 냉동미세절단기에 의해 절단된다. 절편은 냉각된 아세톤 또는 알코올에 의해 고정될 때까지 -20℃ 이하의 온도에서 동결된 상태로 보관된다.
따라서, 본 발명과 관련하여 사용되는 표지가 IHC 절차, 예를 들면, 고정, 파라핀 포매, 혼성화 등을 견뎌내는 것이 예상된다. 표지는 이 표지가 IHC 프로토콜로 처리된 후 여전히 검출될 수 있는 경우 "IHC 절차를 견뎌낸다". 예를 들면, 몇몇 표지는 열(파라핀 포매), 유기 용매 또는 고정 완충제 등에 의해 불활성화될 것이고, 신호가 낮아지기 때문에 또는 신호가 더 이상 존재하지 않기 때문에 검출가능한 표지를 더 이상 발생시킬 수 없다. 따라서, 표지의 내성은 이용되는 구체적인 IHC 프로토콜에 의해 좌우될 것이다. 따라서, 한 표지가 한 구체적인 IHC 프로토콜의 과정에서 불활성화되지만 또 다른 IHC 프로토콜을 이용할 때 여전히 사용될 수 있을 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 표지는 고정을 견뎌내고, 보다 바람직하게는 상기 표지는 포르말린을 사용한 알데하이드 고정을 견뎌낸다. 이와 관련하여 "견뎌낸다"는 상기 표지가 상기 절차 후에 여전히 검출될 수 있다는 것, 즉 상기 표지가 바람직하게는 그의 검출 능력의 50% 이상을 상실하지 않는다는 것을 의미한다.
일차 결합 도메인 및 검출 전 이차 결합 도메인(사용되는 경우)도 IHC 절차를 견뎌내는 것이 예상된다.
본원에서 사용된 "형광 표지"는 형광단을 포함하는 분자를 특징짓는다. 종종 형광색소로도 지칭되는 형광단은 특정 파장의 에너지를 흡수하고 상이한 파장에서 에너지를 재방출할 분자 내의 작용기이다. 상기 특정(예정된) 파장과 비교될 때 상기 상이한 파장은 상기 특정(예정된) 파장으로부터 구별될 수 있는 파장에 의해 재방출된다(예를 들면, 보다 긴 파장 또는 보다 짧은 파장에 의해 재방출되나, 후자의 경우 강도가 감소된다). 방출된 에너지의 양 및 파장은 형광단 및 형광단의 화학적 환경 둘다에 의해 좌우된다.
NIR 형광 표지를 포함하는 형광 표지를 커플링시키는 방법은 당업계에서 잘 공지되어 있다. 이들 표지들을 항체에 접합시키는 기법은 지난 수년 동안 상당히 발달되었고 우수한 개요는 문헌[Aslam, M., and Dent, A., Bioconjugation (1998) 216-363, London] 및 문헌[the chapter "Macromolecule conjugation" in Tijssen, P., "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), Elsevier, Amsterdam]에 제공되어 있다.
적절한 커플링 화학기법은 상기 인용된 문헌(상기 아슬람(Aslam)의 문헌)으로부터 공지되어 있다. 형광 표지는 어떤 커플링 모이어티(moiety)가 존재하는지에 따라 수성 매질 또는 유기 매질에서 항체와 직접적으로 반응할 수 있다. 커플링 모이어티는 형광색소 표지를 항체에 화학적으로 커플링시키는 데에 사용되는 반응성 기 또는 활성화된 기이다. 형광색소 표지는 항체에 직접적으로 부착되거나 스페이서를 통해 항체에 연결되어 상기 항체 및 NIR 형광 표지를 포함하는 NIR 형광 표지 접합체를 형성할 수 있다. 사용된 스페이서는 본질적으로 적합하게 긴 생체내 지속성(반감기)을 갖도록 선택될 수 있거나 디자인될 수 있다.
형광 표지는 바람직하게는 양자점 시약, 형광 염료, pH 민감성 형광 염료, 전압 민감성 형광 염료 및 형광 표지된 미세구로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광 염료가 바람직하다.
나노결정으로도 공지되어 있는 "양자점 시약" 또는 "양자점"은 주기율표 II-VI, III-V 또는 IV-VI 족의 물질로 구성된 결정인 반도체로서 공지된 특별한 클래스의 물질이다.
"형광 단백질"은 예를 들면, 증강된 또는 증강되지 않은 녹색 형광 단백질(GFP), CFP, YFP 및 BFP를 포함한다. 추가 형광 단백질은 문헌[Zhang, Nat Rev Mol Cell Biol. 2002, 12, pages 906-18] 또는 문헌[Giepmans, Science. 2006, 312, pages 217-24]에 기재되어 있다.
"형광 염료"는 플루오레세인(이의 모든 유도체, 예를 들면, FITC를 포함함); 로다민(이의 모든 유도체, 예를 들면, 테트라메틸로다민(TAMRA) 및 이의 이소티오시아네이트 유도체(TRITC), 설포로다민 101(및 이의 설포닐 클로라이드 형태 텍사스 레드), 로다민 레드, 및 신규 형광단, 예컨대, 알렉사(Alexa) 546, 알렉사 555, 알렉사 633, 다이라이트(DyLight) 549 및 다이라이트 633을 포함하는 로다민의 다른 유도체를 포함함); 알렉사 플루오르(알렉사 플루오르 패밀리의 형광 염료가 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)에 의해 제조됨); 다이오믹스(Dyomics)에 의해 제조되는 형광 염료 패밀리인 다이라이트 플루오르; 아토-텍 게엠베하(ATTO-TEC GmbH, 독일 지겐 소재)에 의해 제조되는 일련의 형광 표지 및 염료를 대표하는 아토 염료(국제 특허출원 공개 제WO 2007/067978호); 라졸라 블루(LaJolla Blue)(다이아트론(Diatron), 미국 플로리다주 마이애미 소재); 인도시아닌 그린(ICG) 및 이의 유사체(문헌[Licha et al., 1996, SPIE 2927:192-198]; 미국 특허 제5,968,479호(Ito et al.)); 인도트라이카보시아닌(ITC; 국제 특허출원 공개 제WO 98/47538호); 및 킬레이팅된 란타나이드 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 모든 종류의 형광 표지를 포함한다. 형광 란타나이드 금속은 유로퓸 및 테르븀을 포함한다. 근적외선(NIR) 형광 표지도 예상된다. 근적외선 분광에서 여기 파장 및 방출 파장, 즉 640 nm 내지 1300 nm, 바람직하게는 640 nm 내지 1200 nm, 보다 바람직하게는 640 nm 내지 900 nm의 파장을 갖는 NIR 형광 표지가 사용된다. 전자기 분광의 이 부분의 사용은 조직 침투를 최대화하고 생리학적으로 풍부한 흡수제, 예컨대, 헤모글로민(<650 nm) 및 물(>1200 nm)에 의한 흡수를 최소화한다. 생체내 사용을 위한 이상적인 근적외선 형광색소는 (1) 좁은 분광 특성, (2) 높은 민감성(양자 수율), (3) 생체적합성, (4) 탈커플링된 흡수 및 여기 분광, 및 (5) 광안정성을 나타낸다.
다양한 근적외선(NIR) 형광 표지가 상업적으로 입수될 수 있고 본 발명에 따른 형광 물질을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예시적인 NIRF 표지는 하기 표지를 포함한다: Cy5.5, Cy5 및 Cy7(아머샴(Amersham), 미국 일리노이주 아를링톤 하이츠 소재); IRD41 및 IRD700(LI-COR, 네덜란드 린콜른 소재); NIR-I(데진도(Dejindo), 일본 구마모토 소재); 라졸라 블루(디아트론, 미국 플로리다주 마이애미 소재); 인도시아닌 그린(ICG) 및 이의 유사체(문헌[Licha, K., et al., SPIE-The International Society for Optical Engineering 1996; Vol. 2927: 192-198]; 미국 특허 제5,968,479호); 인도트라이카보시아닌(ITC; 국제 특허출원 공개 제WO 98/47538호); 및 킬레이팅된 란타나이드 화합물 및 SF64, 5-29, 5-36 및 5-41(국제 특허출원 공개 제WO 2006/072580호). 형광 란타나이드 금속은 유로퓸 및 테르븀을 포함한다. 란타나이드의 형광 성질은 문헌[Lackowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Kluwer Academic, New York, (1999)]에 기재되어 있다.
"형광 미세구"는 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 2007/067978호에 매우 상세히 기재되어 있다.
형광 염료에 의해 방출된 에너지의 양 및 파장이 형광단 및 형광단의 화학적 환경에 의해 좌우된다는 것이 공지되어 있다. 그 다음, 형광 염료는 pH에 민감하게 또는 전압에 민감하게 반응할 수 있다. 즉, 상기 형광 염료는 화학적 환경의 이러한 변화에 의해 활성화될 수 있다. 추가 활성화가능한 형광 표지는 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2006/0147378 A1호, 미국 특허 제6,592,847호, 미국 특허 제6,083,486호, 국제 특허출원 공개 제WO 2002/056670호 또는 미국 특허출원 공개 제2003/0044353 A1호(이들 모두 본원에 참고로 도입됨)에 매우 상세히 기재되어 있다.
본 발명과 관련하여 형광 염료가 바람직하다. Cy, 알렉사 및 다이라이트 패밀리의 형광 염료가 특히 바람직하다.
본 발명과 관련하여 대상체는 동물이다. 바람직하게는, 상기 대상체는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물이다. 상기 포유동물 대상체는 인간, 원숭이, 예컨대, 사이노몰거스, 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼, 말, 낙타, 개, 고양이, 돼지, 소, 염소 또는 가금류인 것이 보다 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 비-인간 대상체는 특정 질환 또는 장애의 모델을 대표할 수 있다. 본 발명의 대상체가 이종이식편, 바람직하게는 인간 종양 세포를 포함하는 것도 예상된다.
본 발명의 결합 도메인은 에피토프 결합 도메인이거나 에피토프 결합 도메인을 포함한다.
바람직하게는, 상기 에피토프 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
용어 "항체"는 표적에 결합하는 단일클론 또는 다클론 항체(문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988] 참조), 또는 그의 결합 특이성을 보유하거나 본질적으로 보유하는 상기 항체의 유도체를 의미한다. 이러한 항체의 바람직한 유도체는 예를 들면, 마우스 또는 래트 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다. 용어 "항체"는 이작용성(이중특이적) 항체 및 항체 구조체, 예컨대, 단일쇄 Fvs(scFv) 또는 항체 융합 단백질도 포함한다. 용어 "scFv 단편"(단일쇄 Fv 단편)은 당업계에서 잘 공지되어 있고 그의 작은 크기 및 이러한 단편을 재조합적으로 제조할 가능성으로 인해 바람직하다. 상기 항체 또는 항체 결합 부분은 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 본 발명에 따라 용어 "인간화된 항체"는 비-인간 유래의 항체를 의미하고, 이때 가변 영역 내의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대, CDR3, 보다 바람직하게는 모든 6개의 CDR들이 원하는 특이성을 나타내는 인간 유래의 항체의 CDR들로 치환되어 있다. 선택적으로, 항체의 비-인간 불변 영역은 인간 항체의 불변 영역으로 치환되거나 치환되어 있다. 인간화된 항체의 제조 방법은 예를 들면, 유럽 특허출원 공개 제0 239 400 A1호 및 국제 특허출원 공개 제WO 90/07861호에 기재되어 있다. 또한, 용어 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 국제 특허출원 공개 제WO 94/04678호, 제WO 96/34103호, 제WO 97/49805호, 제WO 04/062551호, 제WO 04/041863호, 제WO 04/041865호, 제WO 04/041862호 및 제WO 04/041867호에서 언급되어 있는 중쇄 항체 및 이의 가변 도메인뿐만 아니라; 전통적인 4개 쇄 항체 분자의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 경쇄 가변 도메인(VL)에 기초한 또는 이들로부터 유래된 도메인 항체 또는 "dAb's"도 포함한다(예를 들면, 문헌(Ward et al. 1989 Nature 341, 544-546) 참조).
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 항체의 결합 특이성을 보유하거나 본질적으로 보유하는 본원에서 특정된 항체의 단편, 예컨대, 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2를 의미한다. 항원 결합 단편은 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으나, 둘다를 포함해야 할 필요는 없다. 예를 들면, Fd 단편은 2개의 VH 영역을 갖고 종종 온전한 항원 결합 단편의 항원 결합 기능을 보유한다.
용어 "에피토프 결합 도메인"은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외에 표적에 결합하는(특이적으로 결합하는) 다른 결합 물질을 포함한다. 용어 "에피토프 결합 도메인"은 예를 들면, 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 도메인을 포함하고, 이것은 도메인 항체(dAb), 예를 들면, 인간, 낙타과 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 또는 하기 물질들로 구성된 군으로부터 선택된 스카폴드의 유도체인 도메인일 수 있다: CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A로부터 유래된 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스바디); 앤키린(ankyrin) 반복부 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린(crystallin) 및 인간 유비퀴틴(ubiquitin)(아필린(affilin)); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 스코르피온(scorpion) 독소 쿠니츠(kunitz)형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))(이들은 천연 리간드 이외의 리간드와의 결합을 수득하기 위해 단백질 조작에 의해 조작됨). CTLA-4(세포독성 T 림프구 관련 항원 4)는 주로 CD4+ T 세포 상에서 발현된 CD28 패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인 유사 Ig 폴드(fold)를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 이종 서열로 치환되어 상이한 결합 성질을 부여할 수 있다. 상이한 결합 특이성을 나타내도록 조작된 CTLA-4 분자는 에비바디로도 공지되어 있다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조한다.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대, 스테로이드, 빌린(bilin), 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질 패밀리이다. 리포칼린은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에서 다수의 루프를 갖는 강성 β-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린(Anticalin)은 크기에 있어서 160개 내지 180개의 아미노산을 갖고 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], 미국 특허 제7,250,297B1호 및 미국 특허출원 공개 제20070224633호를 참조한다.
아피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스카폴드이다. 상기 도메인은 약 58개의 아미노산을 갖는 3개의 나선형 다발로 구성된다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 발생되었다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. SeI. 17, 455-462 (2004)] 및 유럽 특허출원 공개 제1641818A1호를 참조한다.
아비머는 A-도메인 스카폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개의 아미노산으로 구성된 천연 도메인은 정해진 이황화 결합에 의해 결합된 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인 패밀리에 의해 나타나는 천연 변이의 셔플링에 의해 발생된다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)] 및 문헌[Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조한다.
트랜스페린은 단량체 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 허용되는 표면 루프 내로의 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스카폴드의 예는 트랜스바디를 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조한다.
디자인된 앤키린 반복부 단백질(DARPins)은 내재성(integral) 막 단백질이 세포골격에 부착되는 것을 매개하는 단백질 패밀리인 앤키린으로부터 유래된다. 단일 앤키린 반복부는 2개의 α-나선 및 β-회전(turn)으로 구성된 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각각의 반복부의 제1 α-나선 및 β-회전 내의 잔기의 무작위화에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 계면은 모듈의 수의 증가에 의해 증가될 수 있다(친화 성숙 방법). 추가 세부사항에 대해서는 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003)), 문헌(PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)], 문헌[J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 미국 특허출원 공개 제20040132028A1호를 참조한다.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스카폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 III형(FN3)의 15개 반복 유닛으로 구성된 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 골격으로 구성된다. β-샌드위치의 한 말단에서 3개의 루프는 애드넥틴이 관심있는 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], 미국 특허출원 공개 제20080139791호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/056764호 및 미국 특허 제6,818,418B1호를 참조한다.
펩티드 앱타머는 불변 스카폴드 단백질, 전형적으로 활성 부위에 삽입된 구속된 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신(TrxA)으로 구성된 조합 인식 분자이다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조한다.
마이크로바디는 길이에 있어서 25개 내지 50개의 아미노산을 갖고 3개 또는 4개의 시스테인 가교를 함유하는 천연 발생 마이크로단백질로부터 유래된다(마이크로단백질의 예는 칼라타BI(KalataBI), 코노톡신(conotoxin) 및 크노틴(knottin)을 포함함). 마이크로단백질은 이 마이크로단백질의 전체 폴드에 영향을 미치지 않으면서 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인의 추가 세부사항에 대해서는 국제 특허출원 공개 제WO 2008/098796호를 참조한다.
다른 에피토프 결합 도메인은 상이한 표적 항원 결합 성질을 갖도록 조작하는 데에 스카폴드로서 사용된 단백질을 포함하고 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠형 도메인, Ras 결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 스코르피온 독소(카리브도톡신(charybdotoxin)) 및 C형 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함하고 문헌[Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)] 및 문헌[Protein Science 15:14-27 (2006)]에서 검토되어 있다. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 이들 대안적인 단백질 도메인들 중 임의의 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있다. 추가 "에피토프 결합 도메인"의 예는 (그들의 리간드에 특이적으로 결합하는) 수용체, (폴리사카라이드에 특이적으로 결합하는) 렉틴, (핵산에 결합하는) 징크 핑거(zinc finger) 및 류신 지퍼, (그들의 기질에 특이적으로 결합하는) 효소, (예를 들면, 그들의 표적 세포에 특이적으로 결합하는) 바이러스 및 박테리아, (서로 특이적으로 혼성화하는) 핵산 등이다.
본 발명의 일부 실시양태에서 상기 결합 도메인이 치료적 활성을 나타내는 것이 예상된다.
"치료적 활성"은 결합 도메인 그 자체가 대상체에서 치료적 효과를 발휘할 수 있거나 발휘할 수 있을 것으로 생각된다는 것을 의미한다(예를 들면, 질환의 증상 또는 원인을 완화하거나, 질환을 치료하거나, 또는 질환의 발병을 예방할 수 있는 치료적으로 효과적인 항체)
몇몇 실시양태에서, 상기 치료적 활성 결합 도메인은 알렘투주마브, 아폴리주마브, 세툭시마브, 에프라투주마브, 갈릭시마브, 젬투주마브, 이필리무마브, 라베투주마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 트라스투주마브, 니모투주마브, 마파투무마브, 마투주마브, rhMab ICR62, rhMab B-Ly1 및 퍼투주마브로 구성된 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 대상체가 상기 조직 샘플 및/또는 세포 하위세트의 제거 전에 치료적 유효 투여량으로 상기 결합 도메인을 제공받는 것, 즉 본 발명의 상기 대상체가 상기 조직 샘플 및/또는 세포 하위세트의 제거 전에 치료적 유효량의 상기 결합 도메인을 이미 포함하는 것도 예상된다. 대안적으로, 본 발명의 대상체는 상기 조직 샘플/세포 하위세트의 제거 전에 치료적 유효 투여량으로 상기 결합 도메인을 제공받은 대상체이다.
본 발명을 통해, 결합 도메인의 2종의 상이한 능력, 즉 (a) IHC 검출 기법을 통해 표적을 검출가능하게 표지하는 그의 능력과 (b) 동일한 시간에서 치료적 활성 방식으로 작용하는 그의 능력을 조합할 수 있다. 따라서, IHC에서 사용될 수 있는 검출가능하게 표지된 마커 및 치료적 활성제는 하나의 동일한 물질일 수 있다. 특히, IHC 셋팅에서 각각의 모든 치료 항체를 사용함으로써 IHC 결과의 신뢰성을 증가시킬 수 있다. 이것은 예를 들면, 종양 마커, 예컨대, HER2/neu의 발현 수준에 따라 일부 종양들을 "등급화하는" 표준이다 - 이러한 측정의 예후 관련성은 상기 측정이 추후에 적용될 (또는 이미 미리 적용된) 치료 항체를 사용함으로써 수행되기 때문에 본 발명의 실시양태에 의해 개선될 수 있다. 이로써 수득된 IHC 측정은 특정 종양 표적(치료 항체에 의해서도 "사용"됨)이 여전히 존재하는지, 및 결과적으로 정확히 동일한 항체를 사용한 후속 요법이 십중팔구 성공할 것이라고 추정할 수 있는지를 보다 정확히 반영한다(예를 들면, 상기 치료 항체에 의해 사용되는 표적이 여전히 존재하는 경우, 정확히 동일한 항체를 사용한 요법이 보다 우수한 성공 기대를 가질 것이라고 추측할 수 있음). 따라서, 2종의 상이한 목적을 위해 동일한 항체를 사용하는 것이 상당히 유리하다. 세포 하위세트/조직 샘플이 고정 절차 등의 대상체가 되기 전에 항체가 그의 표적에 이미 결합되어 있기 때문에 IHC 셋팅에서 사용되는 특이적 항체를 개발할 필요성도 없다. 따라서, 항체-표적의 결합 반응은 실제 상황을 보다 정확하게 반영한다.
또한, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 조직 슬라이드는 IHC 항체를 사용한 최적 염색을 수득하기 위해 특별한 방식으로 처리되어야 한다(예를 들면, 가열 및/또는 특별한 효소와의 항온처리를 통해 항원을 회복/비-차폐시킬 필요가 있음). 이러한 전문화된 처리는 항원성 에피토프가 대상체 또는 세포 배양물 셋팅 내에서 제시되고 결합됨으로써 항원이 고정 절차 동안 차폐되어(이에 따라, 결합 도메인에 의해 검출되지 않거나 오류 검출됨) 해당 표적의 존재, 부재 또는 발현도를 표시하는 에피토프를 잠재적으로 파괴하거나 변경시키는 위험을 방지하거나 감소시키기 때문에 본 발명의 교시를 적용할 때 필요하지 않다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 있어서 본원에 정의된 결합 도메인의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에서 사용될 조성물의 제조를 위한 본원에 정의된 결합 도메인의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 진단 조성물이나, 약학 조성물도 예상된다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에서 사용될 본원에 정의된 결합 도메인에 관한 것이다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 생체외에서 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하는 본 발명의 면역조직화학(IHC) 방법에서 사용될, 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인에 관한 것으로서, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여된다. 또한, 본 발명은 생체외에서 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 세포 하위세트를 검출하는 면역조직화학(IHC) 방법에서 사용될, 상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인에 관한 것으로서, 이때 상기 세포 하위세트(또는 본원에 기재된 조직 샘플)는 상기 조직 샘플/세포 하위세트의 제거 전에 본 발명의 결합 도메인을 제공받은 대상체로부터 수득된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 하위세트는 면역조직화학, 바람직하게는 직접적인 면역조직화학에 의해 검출된다.
면역조직화학(IHC)은 직접적으로 표지되어 있거나(직접적 IHC) 또는 간접적으로 표지되어 있고(간접적 IHC) 특이적 표적-결합 도메인 상호작용을 통해 그의 표적과 반응하는 결합 도메인을 사용하여 조직 절편 내에서 표적(예를 들면, 항원) 및/또는 표적 제시 세포 하위세트의 위치를 확인하는 것이다. 그 후, 상기 상호작용은 전술된 표지에 의해 가시화된다.
조직 내의 항원의 면역조직화학적(IHC) 검출에 이용되는 주요 2종의 방법, 즉 직접적인 방법 및 간접적인 방법이 존재한다. 직접적인 면역조직화학적 염색 방법은 염색될 표적에 직접적으로 결합하는 1개의 직접적으로 표지된 결합 도메인을 사용한다. 따라서, 직접적인 방법은 1-단계 염색 방법이고 예를 들면, 조직 절편 내의 항원과 직접적으로 반응하는 표지된 항체(예를 들면, FITC 접합된 항혈청)를 수반한다. 이 기법은 1개의 항체만을 사용하므로, 절차는 단순하고 신속하다. 이 직접적인 IHC 방법은 본 발명 이전에 이용되었던 것처럼 "통상적인 형식"으로 수행되었을 때 약한 신호 증폭으로 인해 민감성 면에서 문제점을 갖는 것으로 공지되어 있다. 이것은 표적 자체가 고정 단계의 과정에서 이미 변경되고 이것이 "검출가능한" 표적의 양을 급격히 감소시키고 결과적으로 표적에 결합하여 표적을 검출할 결합 도메인의 양도 감소시킨다는 사실에 기인하는 것으로 추정된다. 그러나, 아주 놀랍게도, 본 발명의 교시를 적용함으로써, 즉 검출 전에, 및 이에 따라 조직의 제거 전에 및 조직의 고정 전에 직접적으로 표지된 결합 도메인을 표적과 반응시킴으로써 직접적으로 표지된 일차 결합 도메인을 사용한 경우조차도 표적을 실제로 검출할 수 있다(즉, 일차 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 이차 결합 도메인을 통해 신호를 증폭할 필요가 없음).
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 세포 하위세트는 간접적인 면역조직화학에 의해 검출된다. 간접적인 면역조직화학적 염색 방법은 프로빙될 표적에 대한 일차 결합 도메인, 및 일차 결합 도메인에 대한 표지된 이차 결합 도메인을 사용한다. 상기 결합 도메인이 항체(일차 항체)이고 상기 검출 물질이 일차 항체(의 표지)와 특이적으로 반응하는 이차 항체인 방법이 예상된다.
상기 간접적인 방법은 표적과 반응하는 일차 항체(제1층 - 통상적으로 비-표지됨), 및 일차 결합 도메인과 반응하는 표지된 이차 결합 도메인(제2층)을 수반한다. 이차 결합 도메인은 예를 들면, 일차 항체가 발생된 동물 종의 IgG에 대해 발생된다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서 상기 면역조직화학이 하기 단계를 특징으로 하는 것이 예상된다:
(a) 세포 하위세트를 포함하고/하거나 결합 도메인에 결합된 상기 세포 하위세트를 포함하는 상기 조직 샘플을 포함하는 수단(예를 들면, 슬라이드)을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로 상기 조직 샘플을 고정시키는 단계;
(c) 선택적으로 상기 조직 샘플을 탈수시키는 단계;
(d) 선택적으로 상기 조직 샘플을 파라핀에 포매하는 단계;
(e) 결합 도메인 및 이에 따라 상기 세포 하위세트를 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 단계.
"고정시키는" 또는 "고정"은 후속 IHC 절차를 위해 표적/세포 하위세트/상기 세포 하위세트를 포함하는 조직 샘플을 준비하기에 적합한 고정 절차를 의미한다. "고정"은 특히 조직 구조 및 세포 형태의 보존을 보장하기 위해 수행된다. 적합한 고정 조건은 잘 공지되어 있고 본원에도 개시되어 있다. 대안적으로, 상기 조직/하위세트가 심온(deep) 동결(예를 들면, 액체 질소에서의 동결)에 의해 보존되는 것도 예상된다.
모든 상기 전처리 단계/측정이 용어 "고정"의 범위 내에 있다. 즉, 고정은 구체적으로 고정제(fixing agent), 예컨대, 포름알데하이드, 파라포름알데하이드를 사용한 고정; 및/또는 조직 샘플/세포 하위세트의 심온 동결, 및/또는 선택적으로 파라핀 또는 유사한 시약을 사용한 조직/세포 하위세트의 포매를 포함한다. 본 발명의 요지는 고정 절차가 표적의 양 및/또는 질에 영향을 미쳐 원치 않는 방식으로 결과를 변경시킬 것이기 때문에 표적을 제시하는 조직/하위세트 등이 고정 절차로 처리되기 전에 결합 도메인(예를 들면, 표적에 대한 특이성을 나타내는 일차 항체)이 그의 표적에 결합하게 하는 것이 유리하다는 놀라운 발견에 있다는 것을 이해해야 한다.
조직/하위세트는 (통상적으로 고정 후에) 파라핀에 포매될 수도 있다.
다양한 IHC 프로토콜을 실시하기 위한 수단 및 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고 추가 노력 없이 관심있는 특정 조직/세포 하위세트/표적에 맞게 개조되었거나, 개조될 것이거나 개조될 수 있다. 이들 예시적 프로토콜은 이하에 나열되어 있으나, 이들 프로토콜들은 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
A. 세포주
- 배양된 세포를 멸균 유리 커버 슬립 또는 슬라이드 상에서 밤새 성장시킨다.
- PBS로 짧게 세척한다.
- 원하는 경우 고정시킨다. 가능한 절차는 PBS 중의 10% 포르말린으로 10분 고정시키고(습윤 상태를 유지함), 빙냉 메탄올로 5분 동안 고정시키고 공기 건조하고, 빙냉 아세톤으로 5분 동안 고정시키고 공기 건조하고, PBS로 세척하는 것을 포함한다.
B. 동결된 절편
- 신선한 조직을 액체 질소에서 급속 동결시키거나 액체 질소에서 예비냉각된 이소펜탄에서 급속 동결시키고, O.C.T. 화합물에 포매한다. 동결된 블록을 -80℃에서 저장한다.
- 냉동미세절단기로 약 4 ㎛ 내지 8 ㎛ 두께의 절편으로 절단하고 수퍼프로스트(superfrost) 플러스 슬라이드 또는 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 상에 올려 놓는다. 필요할 때까지 슬라이드를 -80℃에서 저장한다.
- 염색 전에, 슬라이드를 실온에서 30분 동안 가온하고 빙냉 아세톤으로 5분 동안 고정시킨다. 30분 동안 공기 건조한다.
- PBS로 세척한다.
C. 파라핀 절편
- 크실렌에서 절편으로부터 파라핀을 제거한다(2회, 각각 5분).
- 100% 에탄올로 수화시킨다(2회, 각각 3분).
- 95% 에탄올로 수화시킨다(1분).
고정 절차는 다음과 같이 수행되는 것이 바람직하다: 크실렌에서 절편으로부터 파라핀을 제거하고(약 3회, 각각 약 1 분); 100% 에탄올로 수화시키고(약 2회, 각각 약 1분); 90% 에탄올로 수화시키고(약 1분); 80% 에탄올로 수화시키고(약 1분); 70% 에탄올로 수화시키고(약 1분); 약 1분 동안 물로 세척한다.
메이어(Mayer)의 헤마톡실린으로 약 1분 동안 염색하고; 흐르는 물로 약 0.5분 내지 2분 동안 세척하고; 약 10초 동안 물로 세척하고; 0.1% 에오신으로 약 1분 동안 염색한다.
70% 에탄올로 약 5초 동안 수화시키고; 80% 에탄올로 약 10초 동안 수화시키고; 90% 에탄올로 약 10초 동안 수화시키고; 100% 에탄올로 약 10초 동안 수화시키고(현미경 하에 절편을 확인함); 크실렌으로 약 1분 동안 처리한다.
상기 프로토콜에서 용어 "약"은 (시간 간격에 대하여) 100% 이하의 편차를 포함한다. 예를 들면, 2회 수행된다고 기재된 단계가 3회 또는 단지 1회 수행되는 것도 예상된다(당업자는 상기 프로토콜을 어느 정도까지 수정할 수 있다는 것을 잘 인식하고 있음). 상기 프로토콜은 성공적인 고정 절차를 수행하기 위한 지침으로서 제공되는 것일 뿐임을 이해해야 한다.
각각의 절편이 형광 현미경관찰에 의해 검사될 수 있다는 것이 예상된다.
본 발명자들은 50 ㎍의 Cy5 표지된 헤르셉틴, 옴니타르그 및 졸에어를 Calu3(Her2 양성 종양) 보유 마우스에게 주사하였다. 헤르셉틴 및 옴니타르그는 Her2에 대한 치료 항체(양성 대조군)이고, 졸에어는 인간 IgE에 결합하는 항체(음성 대조군)이다. 주사 후 48시간에서 강한 형광 신호가 헤르셉틴-Cy5 및 옴니타르그-Cy5 처리된 마우스의 종양 영역에서 검출될 수 있는 반면, 졸에어-Cy5 처리된 군은 종양에서 형광 신호를 보이지 않았다(도 1의 1a 내지 1c). 생체내 영상화 후, 종양을 외식하였고 포르말린으로 고정시킨 후 탈수하였고 파라핀에 포매하였다. 파라핀에 포매된 조직을 2 ㎛ 슬라이스로 절단하였고 현미경 슬라이드 상에 올려 놓았고 39℃에서 밤새 항온처리하였다. 외식된 종양 조직의 후속 분석은 Her2 특이적 항체가 종양 세포에만 결합하고 뮤린 조직에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 인간 IgE에 대한 대조군 항체인 졸에어에 의해서는 형광 신호가 발생되지 않는다(도 1의 3a 내지 3c).
표지된 항체와 종양 세포의 특이적 결합을 검증하기 위해, 본 발명자들은 1개의 조직 슬라이드로부터 명시야 및 형광 정보를 수득하는 것을 가능하게 하는 새로 개발된 염색 절차를 이용한다. 통상의 염색 절차를 이용하기 위해서는 일련의 2개 조직 슬라이드가 필요하다. 제1 슬라이드는 매우 상세하고 미세한 구조화된 형태학적 개요를 제공하는 헤마톡실린(호염기성 구조체)/에오신(호산성 구조체) 염색을 위한 것이다. 제2 슬라이드는 Cy5 표지된 항체의 형광 신호를 가시화하는 데에 사용된다. 이들 통상의 방법의 단점은 상기 2개의 조직 슬라이드의 형태학적 차이, 및 세포 핵 및 세포 조직의 형광 염색을 위한 추가 준비 시간이다. 본 발명자들의 신규 방법을 이용하여 1개의 조직 슬라이드로부터 이들 정보를 수득할 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 기존 로슈 헤마톡실린/에오신 염색 프로토콜의 농도 및 항온처리 시간을 변경하였다. 헤마톡실린 및 에오신은 본 발명자들이 예컨대, 명시야 측정에서와 거의 동일한 형태학적 세부사항을 가시화할 수 있도록 형광 조건 하에서 활성화를 보인다. 본 발명자들의 특별한 형광 카메라 시스템(누안스(Nuance); CRi)을 이용하여 상이한 형광단들의 형광 분광을 분리할 수 있다. 이들 다중분광 영상화 시스템은 분자 마커들이 단일 조직 절편 내에 함께 위치하는 경우조차도 다중표지 조직 절편 상의 각각의 개별 표지의 선명하고 정확한 영상을 생성함으로써 이용자들이 상기 분자 마커들을 정량할 수 있게 한다. 또한, 이들 시스템들은 누안스 형광 영상에서 자가형광을 분리하고 제거함으로써 신호 대 노이즈(noise)를 급격히 증가시키고 결과의 정확성을 개선하는 강력한 능력을 본 발명자들에게 제공한다. 상기 신규 방법에서, 본 발명자들은 먼저 명시야에서 조직 슬라이드의 최적화된 헤마톡실린/에오신 염색을 측정한다(도 1의 2a 내지 2c). 그 다음, 동일한 슬라이드 면적을 형광도로 전환시키고 헤마톡실린 및 에오신 신호 플러스 Cy5 표지된 항체 신호를 측정한다. 누안스 시스템은 이들 3개의 형광 신호들을 나머지 원치 않는 슬라이드 정보(예를 들면, 자가형광)로부터 분리하고 이들을 1개의 영상에서 합친다(도 1의 3a 내지 3c).
따라서, 본 발명의 방법이 바람직하게는 상기 특정된 바와 같이 수행된다는 것이 예상된다. 특히, (바람직하게는 조직 샘플 내에 포함되어 있는) 세포 하위세트가 헤마톡실린/에오신으로 염색된 후, 상이한 형광단들의 형광 분광을 분리하거나 분리할 수 있는 형광 검출 장치(예를 들면, 형광 카메라 시스템(누안스; CRi)) 또는 올림푸스로부터의 필적할만한 시스템에 의해 분석되는 것이 예상된다. 상기 목적을 위해 사용되거나 디자인된 소프트웨어 등은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
일단 "신호"가 수득되면, 신호가 표적의 분포를 정확히 반영한다는 것을 입증하는 것이 여전히 다소 어려운 일이다. 가장 단순한 음성 대조군은 표적에 대한 RNA가 RNase 보호에 의해 발현되지 않는 것으로 공지되어 있는 조직에서의 발현의 부재, 및 제자리 혼성화에 의해 관찰되었을 때 발현된 RNA를 갖는 표적 조직의 영역으로의 발현의 제한이다. 대안적인 음성 대조군은 결합 도메인과 과량의 펩티드 또는 단백질(상기 결합 도메인이 상기 펩티드 또는 단백질에 대해 발생됨)의 예비항온처리에 의한 신호의 제거이다. 웨스턴 블롯은 1개의 밴드만이 관찰되는 경우 상호작용의 특이성을 암시할 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 웨스턴 블롯을 위한 조건의 최적화가 어렵다는 것은 면역조직화학 반응의 조건이 최적 조건이 아닐 가능성을 입증할 것이다.
본 발명의 방법에서 상기 검출이 제자리 혼성화 기법, 바람직하게는 형광 제자리 혼성화(FISH)를 추가로 포함하는 것이 예상된다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 결합 도메인 및 선택적으로 상기 결합 도메인을 대상체에게 투여하기 위한 수단, 및/또는 본원에 정의된 방법으로 상기 결합 도메인을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 결합 도메인을 사용하는 방법, 특히 본 발명의 방법에서 결합 도메인을 사용하는 방법에 대한 설명서를 포함하는 인쇄물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 키트는 바람직하게는 형광 염료로 표지되어 있는 본원에 기재된 결합 도메인을 포함하고, 투여 수단, 예를 들면, 주사기, 상기 결합 도메인 등을 희석하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체, 및 바람직하게는 당업자가 상기 결합 도메인을 각각의 대상체에게 투여하는 데에 도움을 주는 기술 설명서를 추가로 포함한다(상기 결합 도메인이 조직/세포 하위세트가 제거되기 전에 투여된다는 것이 특히 중요함). 상기 키트는 일단 결합 도메인이 대상체에게 투여되면 상기 대상체로부터 조직 샘플을 제거하기 위한 수단, 및/또는 제거된 조직 샘플을 고정시키는 수단, 예컨대, 제거된 조직 샘플의 고정을 가능하게 하는 완충제 및/또는 후속 형광 현미경관찰을 위한 유리 슬라이드, 및/또는 제거된 조직 샘플을 파라핀에 포매하기 위한 파라핀, 및/또는 상기 파라핀을 제거하기 위한 유기 용매 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 세포 하위세트를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 시험관내에서 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 고정 전에 및/또는 상기 표적의 검출 전에 그의 표적에 결합된다.
또한, 본 발명은 상기 세포 하위세트를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인으로 상기 표적을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 시험관내에서 상기 표적을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 상기 결합 도메인은 상기 세포 하위세트의 고정 전에 및/또는 상기 표적의 검출 전에 그의 표적에 결합된다.
본원에 정의된 "세포 하위세트를 검출하는" 방법은 (i) 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 대상체의 확인(상기 대상체는 바람직하게는 종양으로부터 고통을 받는 대상체임), (ii) 결합 도메인에 기초한 요법, 바람직하게는 항암/종양 요법의 모니터링(즉, 상기 결합 도메인은 치료적 활성을 나타냄), (iii) 생체내에서 표적에 결합할 수 있는 결합 도메인의 확인, (iv) 표적을 특징으로 하는 종양에 대한 치료적 효과를 발휘하는 경향을 보이는 결합 도메인의 선택, 또는 (v) 종양의 유형화를 위해 추가로 또는 대안적으로 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "세포 하위세트를 검출하는"은 언급된 세포 하위세트의 모든(정량적으로) 개별 세포들이 (이들 세포들도 상기 표적을 특징으로 할지라도) 상기 결합 도메인에 의해 결합되는 것은 아닌 상황을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 세포 덩어리, 예컨대, 종양 내에서의 결합 도메인의 축적의 천연 한계로 인해, 세포 하위세트를 정의하는 모든 표적 세포들이 상기 결합 도메인에 의해 결합되는 것은 아닐 가능성이 있으므로 이러한 상황도 예상된다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 요법이 개시되는 시점에서 생체내에서 표적 발현의 검증 및 치료 항체의 결합 입증을 동시에 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자의 등급화에 적용될 수 있다. 보조제 셋팅에서, 환자는 소량의 표지된 치료 항체로 먼저 치료받을 것이다. 그 후, 약 24시간 내지 48시간 후 종양 조직이 수술적으로 제거될 것이고 포르말린에서 고정될 것이고 파라핀에 포매될 것이다. 종양 관련 항원의 발현 및 항체와 종양 세포의 특이적 결합은 근적외선 기초 현미경관찰에 의해 확인될 수 있다. 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 대상체의 확인은 대안적으로 "등급화 의학"으로서 표시될 수 있다. 등급화 의학은 공유된 생물학적 특성(예를 들면, 본원에 정의된 표적 또는 세포 하위세트)을 갖는 환자 군에 대한 최적의 가능한 의학적 결과를 달성하기 위해 분자 진단 시험을 이용하여 가장 최상의 요법을 선택함으로써 상기 환자 군을 관리하는 것이다. 예를 들면, 환자에서 특정 종양을 치료하기 위해 어떤 결합 도메인(예를 들면, 치료적 활성을 나타내거나 나타내는 것으로 추정되는 단일클론 항체)이 환자 군 또는 심지어 특정 환자에 대한 최상의 결합 특성을 갖는지를 특징규명하는 것이 예상된다. 따라서, 본 발명의 실시양태를 이용하여 환자에 대한 최상의 결합 도메인을 발견할 수 있다(개별맞춤 의학). 따라서, 본 발명의 큰 장점은 치료적 활성 결합 도메인(예를 들면, 항체)도 IHC 기초 검출에 사용되어 실제 생체내 상황을 반영하는 결과를 발생시킬 수 있다는 점이다. 생체내 상황은 몇몇 환자들이 항체 A에 대해 보다 유리하게 반응하는 반면, 다른 환자들은 항체 B에 대해 보다 유리하게 반응할 것임을 의미한다(여기서, 상기 두 항체는 동일한 표적, 예를 들면, Her2/neu에 대한 특이성을 나타냄). 따라서, 결합 특성의 차이는 당업자가 주어진 치료 상황(예를 들면, 종양)을 위해 최상의 가능한 결합 도메인을 사용하도록 안내할 수 있다. 따라서, 상기 결합 도메인은 특정 환자를 위해 특이적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 동일한 표적에 결합하는 항체들로 구성된 항체 세트를 제공하는 것, 및 이들 항체들 중 어떤 항체가 각각의 환자에 대해 가장 기대되는 결합 특성을 보이는지를 시험하는 것(개별맞춤 의학)이 예상된다.
"요법의 모니터링"은 주어진 표적 또는 이 표적을 특징으로 하는 세포 하위세트의 존재, 부재, 과발현 또는 저발현을, 상기 표적 및/또는 하위세트를 특징으로 하는 질환의 치료에 이미 사용되거나 사용될 수 있는 치료적 활성 항체로 모니터링할 수 있다는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 환자에서 특이적 항체를 사용하여 종양을 치료할 수 있고 하나의 동일한 항체를 사용하여 요법의 "성공"을 모니터링할 수 있다. 이와 관련하여, 치료 항체가 표지되거나 적어도 부분적으로 표지되고(예를 들면, 총 항체 집단의 10%가 표지되지만, 나머지는 비-표지됨) 생체내 반응이 종종 모니터링되는 것이 예상된다. 생체내 반응을 모니터링하기 위해 치료적으로 효과적인 비-표지된 항체가 표지된 형태의 동일한 항체로 종종 치환되는 것도 예상된다.
"생체내에서 표적에 결합할 수 있는 결합 도메인의 확인"은 (a) 치료적으로 효과적이거나 효과적인 것으로 추정되거나; 또는 (b) 치료적으로 효과적인 결합 도메인을 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 결합 도메인 세트를 제공할 수 있고, 이들 결합 도메인들이 각각의 표적에 결합함으로써 상기 결합 도메인이 일반적인 환자 또는 환자 하위군, 또는 심지어 단지 1명의 환자에서 치료적으로 효과적이라는 것을 표시할 수 있는지를 시험할 수 있다(개별맞춤 확인). 따라서, (상기 표적을 특징으로 하는) 종양에 대해 치료적 효과를 발휘하는 경향을 보이는 결합 도메인을 선택할 수 있다.
"종양의 유형화"는 종양의 상태, 예를 들면, HER2/neu 상태를 평가하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 확인되었을 때 상기 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 환자의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 결합 도메인, 바람직하게는 치료적으로 효과적인 항체, 예를 들면, 알렘투주마브, 아폴리주마브, 세툭시마브, 에프라투주마브, 갈릭시마브, 젬투주마브, 이필리무마브, 라베투주마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 트라스투주마브, 니모투주마브, 마파투무마브, 마투주마브, rhMab ICR62, rhMab B-Ly1 및 퍼투주마브 등(이들의 조합물을 포함함)의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 확인되었을 때 상기 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 환자의 치료에서 사용될 치료적 활성 결합 도메인, 바람직하게는 치료적 활성 항체, 예를 들면, 알렘투주마브, 아폴리주마브, 세툭시마브, 에프라투주마브, 갈릭시마브, 젬투주마브, 이필리무마브, 라베투주마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 트라스투주마브, 니모투주마브, 마파투무마브, 마투주마브, rhMab ICR62, rhMab B-Ly1 및 퍼투주마브 등(이들의 조합물을 포함함)에 관한 것이다.
본 개시내용은 본원에 참고로 도입되는 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다. 나아가, 본 발명 및 이의 많은 장점들은 한정을 위해 제공된 것이 아니라 설명을 위해 제공된 하기 실시예로부터 더 잘 이해될 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것으로서 간주되어서는 안 된다. 하기 실시예는 설명을 위한 목적으로 포함되어 있고 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예 1
이들 신규 방법의 검증을 위해, 본 발명자들은 50 ㎍의 Cy5 표지된 헤르셉틴, 옴니타르그 및 졸에어를 Calu3(Her2 양성 종양) 보유 마우스에게 주사하였다. 헤르셉틴 및 옴니타르그는 Her2에 대한 치료 항체(양성 대조군)이고, 졸에어는 인간 IgE에 결합하는 항체(음성 대조군)이다. 주사 후 48시간에서 강한 형광 신호가 헤르셉틴-Cy5 및 옴니타르그-Cy5 처리된 마우스의 종양 영역에서 검출될 수 있는 반면, 졸에어-Cy5 처리된 군은 종양에서 형광 신호를 보이지 않았다(도 1의 1a 내지 1c). 생체내 영상화 후, 종양을 외식하였고 포르말린으로 고정시킨 후 탈수하였고 파라핀에 포매하였다. 파라핀에 포매된 조직을 2 ㎛ 슬라이스로 절단하였고 현미경 슬라이드 상에 올려 놓았고 39℃에서 밤새 항온처리하였다. 외식된 종양 조직의 후속 분석은 Her2 특이적 항체가 종양 세포에만 결합하고 뮤린 조직에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 인간 IgE에 대한 대조군 항체인 졸에어에 의해서는 형광 신호가 발생되지 않는다(도 1의 3a 내지 3c).
표지된 항체와 종양 세포의 특이적 결합을 검증하기 위해, 본 발명자들은 1개의 조직 슬라이드로부터 명시야 및 형광 정보를 수득하는 것을 가능하게 하는 새로 개발된 염색 절차를 이용하였다. 통상의 염색 절차를 이용하기 위해서는 일련의 2개 조직 슬라이드가 필요하다. 제1 슬라이드는 매우 상세하고 미세한 구조화된 형태학적 개요를 제공하는 헤마톡실린(호염기성 구조체)/에오신(호산성 구조체) 염색을 위한 것이다. 제2 슬라이드는 Cy5 표지된 항체의 형광 신호를 가시화하는 데에 사용된다. 이들 통상의 방법의 단점은 상기 2개의 조직 슬라이드의 형태학적 차이, 및 세포 핵 및 세포 조직의 형광 염색을 위한 추가 준비 시간이다. 본 발명자들의 신규 방법을 이용하여 1개의 조직 슬라이드로부터 이들 정보를 수득할 수 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 기존 로슈 헤마톡실린/에오신 염색 프로토콜의 농도 및 항온처리 시간을 변경하였다. 헤마톡실린 및 에오신은 본 발명자들이 예컨대, 명시야 측정에서 거의 동일한 형태학적 세부사항을 가시화할 수 있도록 형광 조건 하에서 활성화를 보인다. 본 발명자들의 특별한 형광 카메라 시스템(누안스; CRi)을 이용하여 상이한 형광단들의 형광 분광을 분리할 수 있다. 이들 다중분광 영상화 시스템은 분자 마커들이 단일 조직 절편 내에 함께 위치하는 경우조차도 다중표지 조직 절편 상의 각각의 개별 표지의 선명하고 정확한 영상을 생성함으로써 이용자들이 상기 분자 마커들을 정량할 수 있게 한다. 또한, 이들 시스템들은 누안스 형광 영상에서 자가형광을 분리하고 제거함으로써 신호 대 노이즈를 급격히 증가시키고 결과의 정확성을 개선하는 강력한 능력을 본 발명자들에게 제공한다. 상기 신규 방법에서, 본 발명자들은 먼저 명시야에서 조직 슬라이드의 최적화된 헤마톡실린/에오신 염색을 측정하였다(도 1의 2a 내지 2c). 그 다음, 동일한 슬라이드 면적을 형광도로 전환시켰고 헤마톡실린 및 에오신 신호 플러스 Cy5 표지된 항체 신호를 측정하였다. 누안스 시스템은 이들 3개의 형광 신호들을 나머지 원치 않는 슬라이드 정보(예를 들면, 자가형광)로부터 분리하였고 이들을 1개의 영상에서 합쳤다(도 1의 3a 내지 3c).
실시예 2
본 발명자들은 제2 실험에서 상기 실시예 1로부터의 결과를 확인하였다. 이를 위해, 몇몇 추가 Cy5 표지된 항체(에르비툭스, 항-IGF-1R, 항-Her3)를 사용한 점을 제외하고 동일한 실험 셋팅을 이용하였다. 헤르셉틴-Cy5 및 옴니타르그-Cy5로부터의 강한 생체내 신호는 조직 슬라이드에서의 강한 생체외 신호와 상관관계를 갖는다(도 2의 4a, 4b, 6a 및 6b). 다른 한편으로, 에르비툭스-Cy5, 항-IGF-1R-Cy5 및 항-Her3-Cy5는 유의한 생체내 형광 및 생체외 형광을 보이지 않았다. 생체내 영상화 및 생체외 영상화의 결과는 실시예 1로부터 이미 제시된 데이터와 완벽히 일치한다.
실시예 3
후속 연구의 목적은 표지된 항체가 종양 세포에 특이적으로 결합하는지를 입증하는 것이다. 도 1의 1a로부터의 슬라이드를 형광 제자리 혼성화에 사용하였다. 이 분석을 이용하여 포르말린에 의해 고정된 조직 슬라이드에서 Her2 유전자를 검출할 수 있다. 도 3의 7b는 Cy5 표지된 항-Her2 항체(헤르셉틴)가 Her2 유전자를 발현하는 세포에만 결합한다는 것을 입증한다.
본 발명이 상기 설명 및 실시예에 구체적으로 기재된 방식과 다른 방식으로 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 상기 교시에 비추어 볼 때 본 발명의 다수의 변형 및 변경이 가능하므로 이들 변형 및 변경은 첨부된 특허청구범위 내에 포함된다.
본 발명의 배경기술, 상세한 설명 및 실시예에서 인용된 각각의 문헌(특허, 특허출원, 논문, 초록, 연구실 매뉴얼, 책 또는 다른 개시물을 포함함)의 전체 개시내용은 본원에 참고로 도입된다.

Claims (15)

  1. 세포 하위세트(subset)를 특징짓는 표적에 대한 특이성을 나타내는 결합 도메인을 상기 세포 하위세트의 제거 전에 상기 세포 하위세트를 포함하거나 포함하는 것으로 추정되는 대상체에게 투여하여 생체외에서 상기 세포 하위세트를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 결합 도메인을 갖는 세포 하위세트를 검출하기 위한 면역조직화학(IHC) 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    세포 하위세트가 종양 세포로 구성되는, 면역조직화학 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    결합 도메인이 바람직하게는 형광 표지로 표지되는, 면역조직화학 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적이 단백질, 펩티드, 효소, 핵산, 폴리사카라이드, 지질, 수용체, 세포 표적 및/또는 종양 항원인, 면역조직화학 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 도메인이 항체인, 면역조직화학 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 하위세트가 직접적인 면역조직화학에 의해 검출되는, 면역조직화학 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 하위세트가 간접적인 면역조직화학에 의해 검출되는, 면역조직화학 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    직접적인 면역조직화학에 의한 검출이 (형광) 표지된 결합 도메인의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 면역조직화학 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 조직 샘플의 제거 전에 치료적 유효 투여량으로 결합 도메인을 제공받는, 면역조직화학 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 면역조직화학 방법에 있어서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 결합 도메인의 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 면역조직화학 방법에서 사용되는 진단 조성물의 제조를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 결합 도메인의 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 면역조직화학 방법에서 사용되는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 결합 도메인.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 결합 도메인 및 대상체에게 상기 결합 도메인을 투여하기 위한 수단, 및 선택적으로 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 면역조직화학 방법으로 상기 결합 도메인을 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트.
  14. (i) 치료적 활성 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 대상체의 확인,
    (ii) 요법의 모니터링,
    (iii) 생체내에서 표적에 결합할 수 있는 결합 도메인의 확인,
    (iv) 표적을 특징으로 하는 종양에 대한 치료적 활성을 발휘하는 경향을 보이는 결합 도메인의 선택, 또는
    (v) 종양의 유형화
    를 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 면역조직화학 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 면역조직화학 방법에 의해 확인되었을 때 치료적 활성 결합 도메인에 유리하게 반응하는 경향을 보이는 환자의 치료에 사용하기 위한 치료적 활성 결합 도메인, 예를 들면, 알렘투주마브(alemtuzumab), 아폴리주마브(apolizumab), 세툭시마브(cetuximab), 에프라투주마브(epratuzumab), 갈릭시마브(galiximab), 젬투주마브(gemtuzumab), 이필리무마브(ipilimumab), 라베투주마브(labetuzumab), 파니투무마브(panitumumab), 리툭시마브(rituximab), 트라스투주마브(trastuzumab), 니모투주마브(nimotuzumab), 마파투무마브(mapatumumab), 마투주마브(matuzumab), rhMab ICR62, rhMab B-Ly1, 퍼투주마브(pertuzumab) 등 또는 이들의 조합물.
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