KR20130033976A - 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트 - Google Patents

다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트 Download PDF

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아크레이 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, PIK3CA 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, P1～P11'로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브를 제공한다.

Description

다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트{PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY AND REAGENT KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM}
본 발명은, 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트에 관한 것이다.
PIK3CA 유전자는, 종양 형성에 중요한 역할을 담당하는 시그널 경로를 조절하는 PI3 키나아제를 코딩한다. 종양 조직 중에 있어서 PIK3CA 유전자의 변이가 많이 보이는 것이 알려져 있고, 그 중에서도, G1624A(E542K) 변이, G1633A(E545K) 변이 및 A3140G(H1047R) 변이는, 고빈도로 보이는 것이 알려져 있다(예를 들면, Science. (2004) Apr 23; 304(5670) : 554(비특허문헌 1) 및 Oncogene. (2005) Feb 17; 24(8) : 1477-80(비특허문헌 2) 참조).
상기 3개소에 변이가 있을 경우에는, 절제 불능한 대장암의 치료약으로서 이용되고 있는 세툭시맙(cetuximab) 등으로 대표되는 항EGFR 항체약의 효과가 얻어지지 않는 것이 보고되어 있다(예를 들면, Cancer Res. (2009); 69 : (5). March 1, 2009(비특허문헌 3), BMC Cancer. (2011) Mar 25; 11 : 107(비특허문헌 4)).
세툭시맙과 같은 분자 표적약은 매우 고가이며, 또한 간질성 폐렴 등의 심각한 부작용을 발생시킬 가능성이 있다. 그 때문에, 약효에 관한 유전자 변이를 투약 전에 측정해서, 약효를 기대할 수 있는 환자에게 선택적으로 약제를 투여하는 것은 극히 중요하다. 이러한 유전자 변이를 정확하게 또한 단시간, 저비용으로 간편하게 측정하는 방법이 기다려지고 있다.
현재 유전자의 다형을 측정하는 방법으로서는, 변이를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 표적 핵산에 하이브리다이제이션(hybridization)시켜서, 형광 색소의 발광의 감소량을 측정해 융해 곡선 분석의 결과에 근거하여 염기 서열의 변이를 해석하는 방법이 알려져 있다(일본국 특개2002-119291호 공보(특허문헌 1) 참조).
비특허문헌 1 및 비특허문헌 3에서는, PIK3CA의 변이를 다이렉트 시퀀스법으로 검출하고 있다. 그러나, 다이렉트 시퀀스법에서는, PCR를 행한 후, 시퀀스 반응를 행하고, 시퀀서로 전기 영동을 행해야만 하는 등, 시간이나 비용을 요한다. 또한, 증폭 산물을 처리할 필요가 있기 때문에, 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입될 우려가 있다.
비특허문헌 2에서는, PIK3CA의 변이를 PCR-SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)법과 다이렉트 시퀀스법을 조합시켜서 검출하고 있다. 그러나, PCR-SSCP법에서는, PCR를 행한 후에 증폭 산물을 전기 영동할 필요가 있어, 시간이나 비용을 요한다. 또한 증폭 산물을 처리할 필요가 있기 때문에, 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입될 우려가 있다.
비특허문헌 4에서는, PIK3CA의 변이를 QIAGEN의 키트를 이용해서, Scorpion ARMS법에 의해 검출하고 있다. 그러나, Scorpion ARMS법에서는 키트의 구입이 필요해진다. 또한, 키트 외에도 별도 리얼 타임 PCR장치를 필요로 해서, 비용을 요한다. 또한, 변이마다 상이한 시약과 반응 튜브가 필요해서, 시간과 비용을 요한다.
특허문헌 1에서는, 핵산 프로브를 사용하는 방법에 의해, 다형을 검출하고 있다. 그러나, 특허문헌 1에는, 핵산 프로브의 설계에 관해서, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광 프로브가 표적 서열에 하이브리다이제이션했을 때, 말단 부분에 있어서 형성되는 핵산 프로브와 표적 서열의 하이브리드의 복수 염기 쌍이 적어도 하나의 G와 C의 페어를 형성하도록 설계한다는 교시가 있을 뿐이다. 그 때문에, 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 변이형마다 적정한 서열을 갖는 핵산 프로브를 사용할 필요가 있다.
또한, 본 발명자의 검토에 의해, 핵산 프로브의 서열에 있어서, GC의 함량이 지나치게 높으면 소광 프로브가 충분히 기능하지 않는 것도 밝혀졌다.
이들 현상에 입각해서, PIK3CA 유전자 다형 검출을 위한 새로운 기술 개발이 기다려지고 있었다.
본 발명은, PIK3CA 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이것을 사용하는 다형 검출 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 당해 다형 검출 방법을 사용한 약효 판정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 당해 다형 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, PIK3CA 유전자의 다형을 포함하는 특정 영역에 근거하여 소광 프로브를 설계함으로써, 소광 프로브를 사용하는 융해 곡선 분석에 의해 PIK3CA 유전자의 다형을 검출할 수 있다는 지견을 얻었다. 본 발명은, 상기한 지견에 근거하여 달성된 것이다.
본 발명은 이하와 같다.
<1> 하기 P1～P11'로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브;
(P1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P1') 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄(鎖)에 대하여 스트린젠트(stringent)한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P4) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P4') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P5) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P5') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P8) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P8') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P9) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P9') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P10) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P10') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P11) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및
(P11') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
<2> 하기 P1-1～P11'-1로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 <1>에 기재된 다형 검출용 프로브;
(P1-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P1'-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P2-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P2'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P3-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P3'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P4-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P4'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P5-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P5'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P6-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P6'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P7-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P7'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P8-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P8'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P9-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P9'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P10-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P10'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
(P11-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P11'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
<3> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 226번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 139번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 165번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P4 또는 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 167번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P5 또는 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 164번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P6 또는 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 163번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P7 또는 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 161번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P8 또는 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 160번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P9 또는 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 144번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
상기 P10 또는 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 148번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고, 또는
상기 P11 또는 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 151번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖는 <1> 또는 <2>에 기재된 다형 검출용 프로브.
<4> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 226번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 139번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 165번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
상기 P4 또는 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 167번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P5 또는 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 164번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P6 또는 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 163번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P7 또는 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 161번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P8 또는 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 160번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
상기 P9 또는 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 144번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
상기 P10 또는 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 148번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고, 또는
상기 P11 또는 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 151번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는 <1>～<3> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.
<5> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비해서, 감소하거나 또는 증가하는 <1>～<4> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.
<6> 상기 프로브가, 융해 곡선 분석용 프로브인 <1>～<5> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.
<7> 상기 프로브가, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 염기 서열을 갖는 <1>～<6> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.
<8> <1>～<7> 중 어느 하나에 기재된 프로브를 사용함으로써 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.
<9> (I) <1>～<7> 중 어느 하나에 기재된 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,
(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 근거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,
(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 근거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과,
(Ⅳ) 상기 Tm값에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, PIK3CA 유전자의 다형의 존재를 검출하는 것을 포함하는 <8>에 기재된 다형 검출 방법.
<10> (V) 상기 다형의 존재에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것을 더 포함하는 <9>에 기재된 다형 검출 방법.
<11> 상기 (I)의 하이브리드를 얻기 전 또는 상기 (I)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 공정을 더 포함하는 <9> 또는 <10>에 기재된 다형 검출 방법.
<12> <8>～<11> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 방법에 의해, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 근거하여 항암제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 항암제의 약효 판정 방법.
<13> <1>～<7> 중 어느 하나에 기재된 프로브를 포함하는, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 다형 검출용 시약 키트.
<14> 상기 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 <13>에 기재된 다형 검출용 시약 키트.
본 발명에 의하면, PIK3CA 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이것을 사용하는 다형 검출 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 당해 다형 검출 방법을 사용한 약효 판정 방법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명은, 당해 다형 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공할 수 있다.
도 1의 (A)는, 핵산 혼합물의 융해 곡선의 일례이고, (B)는 미분 융해 곡선의 일례.
도 2의 (A)～(N)은, 본 발명의 실시예 1에 관한 시료의 미분 융해 곡선.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 관한 시료의 미분 융해 곡선.
도 4의 (A)～(H)는, 본 발명의 비교예 1에 관한 시료의 미분 융해 곡선.
본 발명에 관한 PIK3CA 유전자의 다형 검출용 프로브(이하, 간단히 「다형 검출용 프로브」라고 하는 경우가 있음)는, 하기 P1～P11'로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브이다:
(P1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P1') 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P4) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P4') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P5) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P5') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P6') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P7') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P8) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P8') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P9) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P9') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P10) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P10') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P11) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및
(P11') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
본 발명에 관한 PIK3CA 유전자 다형 검출 방법은, 상기 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 사용해서 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명에 관한 약제의 약효 판정 방법은, 상기 PIK3CA 유전자 다형 검출 방법에 의해 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 근거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브를 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서의 「PIK3CA 유전자」는, 이미 공지이며, 그 염기 서열은, NCBI의 액세션 No. NG 012113의 50001～91190의 서열을 의미한다.
PIK3CA 유전자는, 세포의 분화, 발달, 증식, 유지의 조절에 중요한 역할을 갖는 PI3 키나아제-Akt 시그널 경로의 PI3 키나아제를 코딩하고 있다.
서열 번호 1의 염기 서열은, NCBI의 dbSNP의 액세션 No. NG 012113의 74541～74960의 염기 서열이며, PIK3CA 유전자의 엑손 9에 해당하는 핵산의 염기 서열의 일부에 상당한다.
서열 번호 2의 염기 서열은, 서열 번호 1에 나타내는 232번째 염기 G(구아닌)가 A(아데닌)으로 변이한 염기 서열이다(이하, 「G1624A」라고도 함).
서열 번호 3의 염기 서열은, 서열 번호 1에 나타내는 241번째 염기 G가 A로 변이한 염기 서열이다(이하, 「G1633A」라고도 함).
서열 번호 4의 염기 서열은, NCBI의 dbSNP의 액세션 No. NG 012113의 90621～90920의 염기 서열이며, PIK3CA 유전자의 엑손 20에 해당하는 핵산의 염기 서열의 일부에 상당한다.
서열 번호 5의 염기 서열은, 서열 번호 4에 나타내는 155번째 염기A가 G로 변이한 염기 서열이다(이하, 「A3140G」라고도 함).
본 발명에 있어서, 검출 대상이 되는 시료 중의 시료 핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관해서, 이들 서로의 상보적인 관계에 근거하여 기술된 사항은, 특별한 언급이 없는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대하여 상보적인 서열에 대하여도 적용된다. 각 서열에 대하여 상보적인 당해 서열에 대하여 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 대체해 적용하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)이며, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 도달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양 쇄 사이의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리해서 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이것에 의해 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. Tm값은, 이 현상에 근거하여 설정된다. 본 발명에 있어서의 Tm값은, 특별한 언급이 없는 한, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도를 말한다.
본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 서열에 관해서 「3' 말단으로부터 세어서 1～3번째」라는 경우는, 올리고뉴클레오티드 쇄의 3' 말단을 1번째로서 센다. 마찬가지로 「5' 말단으로부터 세어서 1～3번째」라고 하는 경우에는, 올리고뉴클레오티드 쇄의 5' 말단을 1번째로서 센다.
본 명세서에 있어서 「공정」이라는 단어는, 독립된 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없을 경우이더라도 본 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.
또한, 본 발명에 있어서 「～」을 사용해서 나타낸 수치 범위는, 「～」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
또한, 본 발명에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재할 경우에는, 특별한 언급이 없는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.
본 명세서에 있어서 변이란, 야생형의 염기 서열 중 일부의 염기가 치환, 결실, 중복 또는 삽입됨으로써 발생하는 새로운 염기 서열을 의미한다. 또한, 다형이란, 변이에 의해 발생하는 염기 서열의 다형을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 설명한다.
<PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브>
본 발명의 PIK3CA 유전자의 다형 검출용 프로브(이하, 간단히 「다형 검출용 프로브」라고도 함)는, 상기 P1～P11'로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브이다.
본 발명에 있어서의 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 상동성이 인정되는 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 본 발명에 있어서의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 포함된다.
구체적으로는, 본 발명에 있어서 상동성이 인정되는 형광 표지 올리고뉴클레오티드란, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등한 정도의 작용을 나타내면 되고, 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타낸다.
또한, 검출 감도의 관점에서, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성을 나타내도 된다. 80% 이상의 동일성을 나타냄으로써, 변이형의 PIK3CA 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 높은 등의 이점이 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등한 정도의 작용을 나타내는 것이면, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 상보쇄와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 본 발명에 있어서의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 포함된다.
하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등을 따라서 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.
스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM～약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM～약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH 8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl2 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 그 외, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염 농도 등을 변화시킴으로써, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 염기가 삽입, 결실 또는 치환된 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 본 발명에 있어서의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 포함된다.
당해 염기가 삽입, 결실 또는 치환된 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등한 정도의 작용을 나타내면 되고, 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있을 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는 특별히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환된 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드 전체의 길이에 따라 달라지지만, 예를 들면 1염기～10염기, 바람직하게는 1염기～5염기를 들 수 있다.
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의, 올리고뉴클레오티드로서는, 올리고뉴클레오티드 외에, 수식된 올리고뉴클레오티드도 포함된다.
상기 올리고뉴클레오티드의 구성 단위로서는, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 인공 핵산 등을 들 수 있다. 상기 인공 핵산으로서는, DNA, RNA, RNA 아날로그인 LNA(Locked Nucleic Acid); 펩티드 핵산인 PNA(Peptide Nucleic Acid);가교화 핵산인 BNA(Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수있다.
상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 구성 단위 중, 1종류로 구성되어도 되고, 복수 종류로 구성되어도 된다.
상기 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서는, 형광 표지된 염기가, 올리고뉴클레오티드의 말단으로부터 세어서 1～3번째 중 어느 하나의 위치에 존재하는 것이 바람직하며, 올리고뉴클레오티드의 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 이에 의해, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상된다. 또한, P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 생산성 좋게 얻을 수 있다.
이하, 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드부터 차례로, 본 발명에 관한 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 상세에 대하여 설명한다.
본 발명에 있어서의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다.
PIK3CA 유전자의 야생형에서는, 서열 번호 1에 나타나는 서열 중 232번째에 대응되는 염기는, G(구아닌)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이되어 있고(이하, 「G1624A」라고도 함), 당해 염기는, PIK3CA 유전자의 1624번째 염기에 해당한다.
PIK3CA 유전자의 야생형에서는, 서열 번호 1에 나타나는 서열 중 241번째에 대응하는 염기는, G(구아닌)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이되어 있고(이하, 「G1633A」라고도 함), 당해 염기는, PIK3CA 유전자의 1633번째 염기에 해당한다.
본 발명에 있어서의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 226번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
검출 감도의 관점에서, 본 발명에 있어서의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성을 나타내도 된다. 동일성이 80%보다 낮을 경우에는, 변이형의 PIK3CA 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 낮아진다.
또한, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열의 241번째 염기에 있어서의 다형 검출의 관점에서, P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～241번째 염기를 포함하는, 염기 길이 16～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열인 태양도 들 수 있다.
검출 감도의 관점에서, P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～241번째 염기를 포함하는 염기 길이 16～50의 염기 서열에 대하여, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성을 나타내도 된다. 80% 이상의 동일성을 나타냄으로써, 변이형의 PIK3CA 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 높은 등의 이점이 있다.
본 발명에 있어서의 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 226번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
하이브리다이제이션이나, 스트린젠트한 조건에 대하여는 기술(旣述)한 사항을 적용한다. 이하 마찬가지이다.
또한, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열의 241번째 염기에 있어서의 다형 검출의 관점에서, P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1～서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열 중 226번째～241번째 염기를 포함하는, 염기 길이 16～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 염기 서열인 태양이 보다 바람직하다.
본 발명의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는, 7mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 7mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하된다.
또한, 본 발명의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는, 10mer～40mer, 14mer～30mer, 또는 16mer～25mer로 할 수 있다. 10mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기 길이를 변화시킴으로써, 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 상보쇄(표적 서열)와 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을, 원하는 값으로 조정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 1에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다. 또, 표 중에 있어서, 대문자는 다형을 나타내는 염기를 표시한다. 이하 마찬가지이다.
또한, 표 1 중, 밑줄을 친 시토신은, 서열 번호 1～3에 나타내는 염기 서열 중, 226번째의 시토신을 나타낸다.
Figure pat00001
또한, 본 발명의 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 226번째의 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비교해서, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비해서, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다.
이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브로 불리고 있으며, 소위 Q Probe(등록상표)로서 알려져 있다. 그 중에서도, 3' 말단 혹은 5' 말단이 시토신(C)이 되도록 설계되고, 그 말단의 C가 구아닌(G)에 근접하면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드인 것을 들 수 있다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
또, Q Probe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법, Hybridization Probe법, Moleculer Beacon법 또는 MGB Probe법 등을 들 수 있다.
상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면, Pacific Blue, BODIPY FL, FluorePrime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.
형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 따라 적의(適宜) 결정할 수 있다. 예를 들면, Pacific Blue는 검출 파장 445㎚～480㎚, TAMRA는 검출 파장 585㎚～700㎚, BODIPY FL은 검출 파장 520㎚～555㎚로 검출할 수 있다.
이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에 대한 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본국 특개 2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
또한 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜둠으로써, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 억제할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 그 때, 3' 말단에 인산기가 부가된 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 이것을 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다.
또한, 3' 말단에 전술한 바와 같은 표지화 물질(형광 색소)을 부가함에 의해서도, 동일한 효과가 얻어진다.
상기 P1 및 P1' 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 PIK3CA 유전자에 있어서의 다형, 특히 G1624A 및 G1633A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다형 중 적어도 한쪽의 다형을 검출하는 PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브로서 사용할 수 있다.
또한, PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용 프로브로서 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 관한 상기 P1 및 P1' 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이고, 226번째 염기에 대응하는 시토신이 형광 색소로 표지된 염기를 사용하는 이외는, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서 알려져 있는 공지의 방법, 예를 들면 일본국 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법을 따라서 제작할 수 있다.
상기 P1 및 P1' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P1-1 및 P1'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P1-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P1'-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
또, 「서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는」이란, 「서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 나타내는 염기에 결합하는」과 같은 의미이다.
이하, 상기 P2～상기 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대하여 설명하지만, 상술한 상기 P1 및 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대한 설명과 중복되는 부분에 대하여는, 상술한 설명을 인용하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서의 상기 P2, P2', P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열의 155번째 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다.
PIK3CA 유전자의 야생형에서는, 서열 번호 4에 나타나는 서열 중 155번째에 대응하는 염기는 A이지만, 변이형에 있어서는 G로 변이되어 있고(이하, 「A3140G」라고도 함), 당해 염기는, PIK3CA 유전자의 3140번째 염기에 해당한다.
본 발명에 있어서의 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 139번째 염기에 대응하는 염기는 시토신이다. 동일성에 대하여는, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 설명을 인용하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서의 상기 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 139번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 165번째 염기에 대응하는 염기는 시토신이다. 동일성에 대하여는, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 설명을 인용하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서의 상기 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 165번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
본 발명의 상기 P2 및 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 17mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P2 및 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 17mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P2 및 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는, 17mer～40mer, 17mer～30mer, 18mer～25mer로 할 수 있다. 17mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 더욱 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 11mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 11mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 11mer～40mer, 12mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 11mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
상기 P2, P2', P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기 길이를 변화시킴으로써, 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 표적 서열과 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 원하는 값으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서의 상기 P2, P2', P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 2에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
또한, 표 2의 서열 번호 8 중, 밑줄을 친 시토신은, 서열 번호 4 또는 5에 나타내는 염기 서열 중, 139번째의 시토신을 나타낸다. 표 2의 서열 번호 9 및 10중, 밑줄을 친 시토신은, 서열 번호 4 또는 5에 나타내는 염기 서열 중, 165번째의 시토신을 나타낸다.
Figure pat00002
본 발명의 상기 P2 및 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 139번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 165번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
상기 P2, P2', P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 PIK3CA 유전자에 있어서의 다형, 특히 A3140G 변이를 검출하는 PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브로서 사용할 수 있다.
또한, PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용 프로브로서 사용할 수 있다.
상기 P2 및 P2' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P2-1 및 P2'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P2-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P2'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P3 및 P3' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P3-1 및 P3'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P3-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및,
(P3'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
본 발명에 있어서의 상기 P4～상기 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이며, 특히 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열의 155번째 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서의 상기 P4의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 167번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다. 동일성에 대하여는, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 설명을 인용하는 것으로 한다. 이하 마찬가지이다.
본 발명에 있어서의 상기 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 167번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P5의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 164번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 164번째 염기에 대응하는 염기는 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P6의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신인 것을 요한다.
본 발명에 있어서의 상기 P7의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P8의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P9의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P10의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P11의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는다. 또, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명에 있어서의 상기 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열 중 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다. 또, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이다.
본 발명의 상기 P4 및 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 13mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P4 및 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 13mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P4 및 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 13mer～40mer, 13mer～30mer, 14mer～25mer로 할 수 있다. 13mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P5 및 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 10mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P5 및 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 10mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P5 및 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 10mer～40mer, 12mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 10mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P6 및 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 9mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P6 및 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 9mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P6 및 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 9mer～40mer, 11mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 9mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P7 및 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 7mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P7 및 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 7mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P7 및 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 7mer～40mer, 10mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 7mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P8 및 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 6mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P8 및 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 6mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P8 및 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 7mer～40mer, 10mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 7mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P9 및 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 12mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P9 및 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 12mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P9 및 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 12mer～40mer, 12mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 12mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향 있다.
본 발명의 상기 P10 및 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 8mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P10 및 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 8mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P10 및 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 8mer～40mer, 11mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 8mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
본 발명의 상기 P11 및 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 5mer～50mer인 것을 요한다. 상기 P11 및 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이가 5mer 미만이거나, 50mer보다 길 경우에는, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 저하되게 되어 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 상기 P11 및 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 7mer～40mer, 10mer～30mer, 13mer～25mer로 할 수 있다. 7mer～40mer라는 범위로 함으로써, 예를 들면 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
상기 P4～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기 길이를 변화시킴으로써, 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 표적 서열과 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 원하는 값으로 할 수 있다.
본 발명의 P1～P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 야생형의 시료 핵산과 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값과, 변이형의 시료 핵산과 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값의 차이는, 1.5℃ 이상, 2.0℃ 이상, 5.0℃ 이상, 9.0℃ 이상으로 할 수 있다.
상기 Tm값의 차를 크게 하는 방법으로서는, 예를 들면 프로브가 하이브리다이즈하는 영역에 대응하는 염기 서열에 대하여, 미스 매치가 되는 염기를 당해 프로브에 포함시키는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, NatureBiotech(1997) vol 15 p.331-335 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 상기 P4～상기 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 3에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
또한, 표 3에 있어서, 밑줄을 친 시토신은, 서열 번호 4 또는 5에 나타내는 염기 서열 중, 이하에 나타내는 염기 번호에 해당하는 시토신을 나타낸다. 서열 번호 11은 167번째, 서열 번호 12는 164번째, 서열 번호 13은 163번째, 서열 번호 14는 161번째, 서열 번호 15는 161번째, 서열 번호 16은 160번째, 서열 번호 17은 144번째, 서열 번호 18은 148번째, 서열 번호 19는 151번째, 서열 번호 20은 144번째 및 161번째, 서열 번호 21은 148번째 및 164번째, 서열 번호 22는 163번째의 시토신을 나타낸다.
Figure pat00003
본 발명의 상기 P4 및 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 167번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P5 및 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 164번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P6 및 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 163번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P7 및 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 161번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P8 및 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 160번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P9 및 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 144번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P10 및 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 148번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
본 발명의 상기 P11 및 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 151번째 염기(시토신)가 형광 색소로 표지되어 있는 것을 요한다.
상기 P4～상기 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 PIK3CA 유전자에 있어서의 다형, 특히 A3140G 변이를 검출하는 PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브로서 사용할 수 있다.
또한, PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용 프로브로서 사용할 수 있다.
상기 P4 및 P4' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P4-1 및 P4'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P4-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P4'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P5 및 P5' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P5-1 및 P5'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P5-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P5'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P6 및 P6' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P6-1 및 P6'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P6-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P6'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P7 및 P7' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P7-1 및 P7'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P7-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P7'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P8 및 P8' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P8-1 및 P8'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P8-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P8'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P9 및 P9' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P9-1 및 P9'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P9-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P9'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P10 및 P10' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P10-1 및 P10'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P10-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P10'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
상기 P11 및 P11' 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 보다 바람직한 태양으로서는, 이하의 P11-1 및 P11'-1 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
(P11-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
(P11'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
<프라이머>
후술하는 PIK3CA 유전자 다형 검출 방법에서는, 검출 대상이 되는 PIK3CA 유전자 다형을 포함하는 서열을 PCR법에 의해 증폭할 경우에는, 프라이머가 사용된다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 프라이머는, 목적으로 하는 검출 대상이 되는 PIK3CA 유전자의 다형의 부위인, G1624A 변이, G1633A 변이 및 A3140G 변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다형 중 적어도 1개의 다형을 나타내는 염기를 포함하는 핵산을 증폭 가능하면 특별히 제한되지 않는다.
PCR법에 적용하는 프라이머는, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 서열 번호 1～서열 번호 5로 나타나는 염기 서열로부터, 당업자라면 적의 설계할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 12mer～40mer 및 40℃～70℃, 또는 16mer～30mer 및 55℃～60℃로 할 수 있다.
또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양 프라이머의 Tm값은 거의 동일(또는, Tm값의 양 프라이머에서의 차가 5℃ 이내)인 것을 들 수 있다.
이하에 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서의 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 예를 나타낸다. 또, 이들은 예시이며, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 표 4에 있어서, Y는 C 또는 T를 나타낸다.
Figure pat00004
본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭할 때에는, 감도 및 효율의 관점에서, 표 4에 나타내는 각 올리고뉴클레오티드 중, PIK3CA ex9F 및 PIK3CA ex9R와, PIK3CA A3140G F 및 PIK3CA A3140G R를, 각각 한 쌍의 프라이머 세트로서 사용하는 것을 들 수 있다.
다형의 검출 방법은 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 다형 검출 방법의 일례로서, Tm 해석을 이용한 다형 검출 방법에 대하여, 이하에 설명한다.
<다형 검출 방법>
본 발명에 관한 PIK3CA 유전자 다형 검출 방법은, 상기 PIK3CA 유전자 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 사용해서, PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 것을 포함하는 PIK3CA 유전자 다형 검출 방법이다.
본 발명에 관한 다형 검출 방법에 의하면, 상기 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 포함함으로써, PIK3CA 유전자의 다형을 간편히, 감도 좋게 검출 가능하게 한다.
또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법이며, 하기 공정 (I)～공정 (Ⅳ)을 포함할 수 있고, 하기 공정 (V)을 포함하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징이며, 그 외의 구성이나 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다.
(I) 상기 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것.
(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 근거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것.
(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 근거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것.
(Ⅳ) 상기 Tm값에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, PIK3CA 유전자의 다형의 존재를 검출하는 것.
(V) 상기 다형의 존재에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것.
또한 본 발명에 있어서는, 상기 공정 (I)～ (Ⅳ) 또는 상기 공정 (I)～ (V)에 부가해서, 공정 (I)의 하이브리드를 얻기 전 또는 공정 (I)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하고 있어도 된다.
또, (Ⅲ)에서 Tm값을 측정하는 것에는, 하이브리드의 해리 온도를 측정하는 것뿐만 아니라, 하이브리드 형성체의 융해 시에 온도에 따라 변동하는 형광 시그널의 미분값의 크기를 측정하는 것을 포함해도 된다.
본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되고 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 핵산이 2본쇄 핵산인 경우에는, 예를 들면, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 것에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중 2본쇄 핵산을 융해(해리)시켜서 1본쇄 핵산으로 하는 것을 포함하는 것을 들 수 있다. 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리함으로써, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈가 가능해진다.
본 발명에 있어서, 검출 대상인 시료에 포함되는 핵산은, 예를 들면, 생체 시료에 원래 포함되는 핵산이어도 되지만, 검출 정도(精度)를 향상할 수 있는 점에서, 생체 시료에 원래 포함되어 있는 핵산을 주형으로 해서 PCR 등에 의해 PIK3CA 유전자의 변이된 부위를 포함하는 영역을 증폭시킨 증폭 산물인 것을 들 수 있다. 증폭 산물의 길이는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50mer～1000mer, 또는 80mer～200mer로 할 수 있다. 또한, 시료 중의 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 유래의 RNA(토탈 RNA, mRNA 등)로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA이어도 된다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은 특별히 제한되지 않는다. 시료 중의 DNA에 대하여 예를 들면 1배 이하를 들 수 있다. 또한, 충분한 검출 시그널 확보의 관점에서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 0.1배 이하로 할 수 있다.
여기에서, 시료 중의 핵산이란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생되어 있는 검출 대상 핵산과 상기 다형이 발생되어 있지 않은 비검출 대상 핵산의 합계이어도 되고, 검출 목적의 다형이 발생되어 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생되어 있지 않은 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계이어도 된다. 또, 시료 중의 핵산에 있어서의 상기 검출 대상 핵산의 비율은, 통상 불명하지만, 결과적으로, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 10배 이하로 할 수 있다. 또한, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여, 5배 이하, 또는 3배 이하로 할 수 있다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는 0.1배 이상으로 할 수 있다.
상기 DNA에 대한 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비이어도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비이어도 된다.
본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 따르는 시그널 변동의 측정은, 상기한 바와 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 상기 다형 검출용 프로브에 부가한 표지의 시그널에 근거하는 시그널로서, 1본쇄 DNA와 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것을 들 수 있다. 이 때문에, 상기 다형 검출용 프로브로서, 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 들 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비해서, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비해서, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.
전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 형광 시그널을 나타내지 않거나 형광 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 해리되면 형광 시그널을 나타내게 되거나, 형광 시그널이 증가한다.
또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 형광 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 해리되면 형광 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 형광 표지에 근거하는 형광 시그널의 변화를 형광 표지 특유의 조건(형광 파장 등)으로 검출함으로써, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대하여, 형광 색소에 근거하는 시그널의 변화를 검출하는 방법에 대하여 구체적 예를 들어서 설명한다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정이나 조건에 대하여는 어떠한 제한도 없다.
핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산, 특히 PIK3CA 유전자를 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대장이나 폐 등의 조직, 백혈구 세포 등의 혈구, 전혈, 혈장, 객담, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 유(乳), 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위 세정액, 오줌, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 또, 시료의 채취 방법, 핵산을 포함하는 시료의 조제 방법 등은 제한되지 않으며, 모두 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 핵산은, 상기 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로,혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해서 전처리한 후에 사용할 수 있다.
예를 들면, 전혈을 시료로 할 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리(單離)는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상 품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE 헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.
다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다형 검출용 프로브를 첨가한다.
상기 다형 검출용 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가해도 되고, 적당한 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.
상기 다형 검출용 프로브의 첨가 타이밍은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 후술하는 PCR 등의 증폭 처리를 행할 경우, 증폭 처리 후에 증폭 산물에 대하여 첨가해도 되고, 증폭 처리 전에 첨가해도 된다.
이렇게 PCR 등에 의한 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가할 경우에는, 예를 들면, 상기한 바와 같이, 그 3' 말단에 형광 색소를 부가하거나 인산기를 부가하거나 하는 것을 들 수 있다.
핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 예로서는, PCR법, ICAN법, LAMP법, NASBA법 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭할 경우에는, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것을 들 수 있다. 사용하는 프로브 및 폴리머라제에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 따라, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석하는 것만으로 다형의 유무를 판정할 수 있으므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요가 없어, 자동화도 용이하다.
또한 PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용되는 DNA 폴리머라제를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(닛폰진사제), Prime STAR Max DNA Polymerase(타카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.
폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용할 경우, 예를 들면, 반응 용액량 50㎕에 대하여 0.01U～100U의 농도로 할 수 있다. 이에 따라, PIK3CA 유전자 다형의 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.
또한 PCR법은, 통상 사용되는 조건을 적의 선택함으로써 행할 수 있다.
또, 증폭 시, 리얼 타임 PCR에 의해 증폭을 모니터링해서, 시료에 포함되는 DNA(검출 대상 서열)의 카피 수를 조사할 수도 있다. 즉, PCR에 의한 DNA(검출 대상 서열)의 증폭을 따라서 하이브리드를 형성하는 프로브의 비율이 늘어나므로 형광 강도가 변동한다. 이것을 모니터링함으로써, 시료에 포함되는 검출 대상 서열(정상 DNA 또는 변이 DNA)의 카피 수나 존재비를 검출할 수 있다.
본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 양자를 하이브리다이즈시킨다. 시료 중의 1본쇄 핵산은, 예를 들면, 상기한 바와 같이 해서 얻어진 PCR 증폭 산물을 해리함으로써 조제할 수 있다.
상기 PCR 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃～95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않는다. 가열 시간은, 예를 들면 1초～10분, 또는 1초～5분으로 할 수 있다.
또한, 해리한 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면 40℃～50℃이다.
하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 DNA의 농도는, 예를 들면, 0.01μM～1μM, 또는 0.1μM～0.5μM으로 할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 농도는, 예를 들면, 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족시키는 범위이며, 예를 들면, 0.001μM～10μM, 또는 0.001μM～1μM로 할 수 있다.
그리고, 얻어진 상기 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드를 서서히 가열해서, 온도 상승에 따르는 형광 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, QProbe를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비해서 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)되어 있는 하이브리드를 서서히 가열해서, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온～85℃, 또는 25℃～70℃로 할 수 있다. 종료 온도는, 예를 들면 40℃～105℃로 할 수 있다. 또한, 온도의 상승 속도는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초～20℃/초, 또는 0.3℃/초～5℃/초로 할 수 있다.
다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석해서 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d형광 강도/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아닌, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
또한, 본 발명에 있어서는, 상기한 바와 같이, 하이브리드를 가열해서, 온도 상승에 따르는 형광 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때의 상기 온도 강하에 따르는 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.
구체적인 예로서, QProbe를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열된 시료의 온도를 서서히 강하해서, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.
한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광되지만), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하해서, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
<약효 판정 방법>
본 발명의 약효 판정 방법은, 상술한 다형 검출 방법에 의해 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 것, 및 상기 검출 결과에 근거하여 항암제에 대한 내성 또는 항암제의 약효를 판정하는 것을 포함한다.
상술한 다형 검출 방법에서는, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 프로브를 사용해서, 감도 좋게 또한 간편하게 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하므로, PIK3CA 유전자에 있어서의 이 다형에 근거하여 항암제의 판정을 감도 좋게 또한 간편하게 행할 수 있다.
또한, 다형의 유무나 변이 서열과 정상 서열의 존재비에 근거하여 항암제에 대한 내성이나 항암제의 약효를 판정할 수 있다. 그리고, 본 발명의 항암제의 약효 판정 방법은, 변이의 유무나 변이 서열의 존재비에 근거하여, 항암제의 투여량의 증가, 다른 항암제로의 변경 등으로의 전환 등의 질병의 치료 방침을 결정하는데도 유용하다.
또한, 판정 대상이 되는 항암제로서는, 구체적으로는, 세툭시맙, 파니투무맙(panitumumab) 등을 들 수 있다.
<다형 검출용 시약 키트>
본 발명의 PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 PIK3CA 유전자 다형 검출용 시약 키트는, 상기한 다형 검출용 프로브를 포함한다.
이 다형 검출용 시약 키트에는, PIK3CA 유전자 중, G1624A 변이, G1633A 변이 및 A3140G 변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다형 중 적어도 하나의 다형을 간편하고 또한 감도 좋게 검출하는 것이 가능한 기술의 다형 검출용 프로브 중 적어도 1종을 포함함으로써, 예를 들면 PIK3CA 유전자의 다형의 검출을 보다 간편하게 행할 수 있는 등의 경향이 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 상술한 검출 대상이 되는 PIK3CA 유전자 다형을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다. 이에 따라, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 정도(精度) 좋게 PIK3CA 유전자의 다형의 검출을 행할 수 있다.
또, 다형 검출용 시약 키트에 포함될 수 있는 프로브 및 프라이머에 대하여는, 전술한 사항을 그대로 적용할 수 있다.
다형 검출용 프로브로서 2종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함할 경우, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 혼합된 상태로 포함되어 있어도, 별개로 포함되어 있어도 된다.
2종 이상의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 발광 파장이 서로 다른 형광 색소로 표지화되어 있어도 된다.
이렇게 형광 색소의 종류를 다르게 함으로써 같은 반응계이어도, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대한 검출을 동시에 행하는 것도 가능해진다.
또한, 본 발명에 있어서의 검출용 시약 키트는, 상기 프로브 및 상기 프라이머 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데에 필요한 시약류를 더 포함하고 있어도 된다. 또한, 프로브, 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.
또, 「별개로 수용」이란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있게 구분된 것이면 되며, 반드시 독립해서 취급 가능한 개별 용기에 수용될 필요는 없다.
다형 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함함으로써, 예를 들면, 보다 고감도로 다형을 검출할 수 있다.
또한 본 발명의 다형 검출용 시약 키트는, 상기 다형 검출용 프로브를 사용해서, 검출 대상인 핵산을 포함하는 시료에 대하여 미분 융해 곡선을 작성하고, 그 Tm값 해석을 행해서, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것이 기재된 취급 설명서, 또는 검출용 시약 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종 시약에 대하여 기재된 사용 설명서를 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 그들에 하등 한정되는 것이 아니다.
[실시예 1]
전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 5에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용해서 Tm 해석을 행해서, 표 6에 기재한 각 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 다형 검출용 프로브의 성능을 확인했다. 또, 프로브 중의 3' 말단의 괄호 안은 형광 색소의 종류를 나타낸다. 또한, 표 중에 있어서, 대문자는 다형을 나타내는 염기를 나타낸다. 이하 마찬가지이다.
주형으로서는, 표 7에 기재한 주형(올리고 DNA)을 사용했다.
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도 1℃/3초로 40℃～80℃까지 온도를 상승시켜, 그 동안의 경시적(經時的)인 형광 강도의 변화를 측정했다. 형광 색소로서 TAMRA를 사용했으므로, 여기 파장은 520㎚～555㎚이고, 검출 파장은 585㎚～700㎚이다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.
Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타내는 도 2를 얻었다. 도면 중, 세로 축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 가로 축은 온도(℃)를 각각 나타낸다. 도면 중, 마름모형으로 나타나는 패턴은, 주형으로서, 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째 염기(Y)가 T인, 서열 번호 35에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과와, 155번째 염기(Y)가 T에 상보적인 A인 서열 번호 37에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다. 도면 중, 사각으로 나타나는 패턴은, 주형으로서, 155번째 염기(Y)가 C인, 서열 번호 36에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과와, 155번째 염기(Y)가 C에 상보적인 G인 서열 번호 38에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
또한, 도 2 중 (A)는 서열 번호 8에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (B)는 서열 번호 9에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (C)는 서열 번호 10에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (D)는 서열 번호 14에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (E)는 서열 번호 11에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (F)는 서열 번호 12에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (G)는 서열 번호 13에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (H)는 서열 번호 16에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (I)는 서열 번호 17에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (J)는 서열 번호 18에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (K)는 서열 번호 19에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (L)은 서열 번호 20에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (M)은 서열 번호 21에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (N)은 서열 번호 22에 나타내는 본 발명에 관한 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 2의 결과로부터, 본 발명에 관한 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용함으로써, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째 염기의 다형을 검출할 수 있는 것이 명확해졌다.
[실시예 2]
샘플로서 표 8에 나타내는 핵산 혼합액(4㎕/반응액) 또는 정제 인간 게놈(100카피/반응액)을 사용해서 자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용해서 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 반응액의 처방을 표 9에 나타낸다.
Figure pat00008
Figure pat00009
PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 58℃에서 30초를 1사이클로 해서, 50사이클 되풀이했다.
Tm 해석은, PCR 후, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃～75℃까지 온도를 상승시켜, 그 동안의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다.
다형 검출용 프로브 및 프라이머는 표 10에 나타낸다.
Figure pat00010
형광 색소 Pacific Blue의 여기 파장은 365㎚～415㎚이며, 검출 파장은 445㎚～480㎚이다. 형광 색소 BODIPY FL의 여기 파장은 420㎚～485㎚이며, 검출 파장은 520～555㎚이다. 형광 색소 TAMRA의 여기 파장은 520㎚～555㎚이며, 검출 파장은 585㎚～700㎚이다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.
Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타낸 도 3을 얻었다.
도면 중, 세로 축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 가로 축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.
A3140G는 야생형일 때(Wt 샘플)는 45℃ 부근에 하나의 피크가 보였지만, 변이형을 포함할 경우(Mt 샘플 (1) 및 Mt 샘플 (2))는 57℃에서도 피크가 보였다. G1624A와 G1633A는 야생형일 때(Wt 샘플)는 48℃ 부근에 하나의 피크가 보였지만, 변이형을 포함할 경우(Mt 샘플 (1) 및 Mt 샘플 (2))는 55℃ 부근에서도 피크가 보였다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 프로브를 사용함으로써 PIK3CA 유전자의 다형을 검출할 수 있는 것이 명확해졌다.
[비교예 1]
전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)와, 하기 표 11에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용해서 Tm 해석을 행해, 표 12에 기재한 각 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 다형 검출용 프로브의 성능을 확인했다. 또, 프로브 중 3' 말단의 괄호 안은 형광 색소의 종류를 나타낸다.
주형으로서는, 표 13에 기재한 주형(올리고 DNA)을 사용했다.
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃～80℃까지 온도를 상승시켜서, 그 동안의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 형광 색소로서 TAMRA를 사용했으므로, 여기 파장은 520㎚～555㎚이고, 검출 파장은 585㎚～700㎚이다. 각각의 파장에 의해, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.
Tm 해석에 의해, 프로브의 형광값의 변화량을 나타내는 도 4를 얻었다. 도면 중, 세로 축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)을 나타내고, 가로 축은 온도(℃)를 각각 나타낸다.
도면 중, 마름모형으로 나타나는 패턴은, 주형으로서, 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째 염기(Y)가 T인, 서열 번호 35에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과와, 155번째 염기(Y)가 T에 상보적인 A인 서열 번호 37에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도면 중, 사각으로 나타나는 패턴은, 주형으로서, 155번째 염기(Y)가 C인, 서열 번호 36에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과와, 155번째 염기(Y)가 C에 상보적인 G인 서열 번호 38에 나타내는 인공 올리고 서열을 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
또한, 도 4 중 (A)는 서열 번호 27에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (B)는 서열 번호 28에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (C)는 서열 번호 29에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (D)는 서열 번호 30에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (E)는 서열 번호 31에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (F)는 서열 번호 32에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (G)는 서열 번호 33에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타내고, (H)는 서열 번호 34에 나타내는 프로브를 사용했을 경우의 결과를 나타낸다.
도 4의 결과로부터, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하지 않을 경우에는, 적어도 한쪽의 피크가 불명료하거나, 또는 피크 사이의 온도 차이가 작기 때문에 야생형과 변이형을 구별짓는 것이 곤란한 등의 이유로, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출할 수 없는 것이 밝혀졌다. 또, 비교예 1에서 사용한 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 수많이 존재하는 검출 불가능한 프로브의 대표예를 나타낸 것에 지나지 않는다.
이상과 같으므로, 본 발명에 의하면, 높은 감도로, 간편하게 PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 것이 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY AND REAGENT KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM <130> P1442A <150> JP 2011-211373 <151> 2011-09-27 <150> JP 2012-194290 <151> 2012-09-04 <160> 38 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 1 <400> 1 tgcaatgaaa ataaattatt ttacaacagt taattagcaa tgtaaaattt attgaaaatg 60 tatttgcttt ttctgtaaat catctgtgaa tccagagggg aaaaatatga caaagaaagc 120 tatataagat attattttat tttacagagt aacagactag ctagagacaa tgaattaagg 180 gaaaatgaca aagaacagct caaagcaatt tctacacgag atcctctctc tgaaatcact 240 gagcaggaga aagattttct atggagtcac aggtaagtgc taaaatggag attctctgtt 300 tctttttctt tattacagaa aaaataactg aatttggctg atctcagcat gtttttacca 360 tacctattgg aataaataaa gcagaattta catgattttt aaactataaa cattgccttt 420 <210> 2 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 2 <400> 2 tgcaatgaaa ataaattatt ttacaacagt taattagcaa tgtaaaattt attgaaaatg 60 tatttgcttt ttctgtaaat catctgtgaa tccagagggg aaaaatatga caaagaaagc 120 tatataagat attattttat tttacagagt aacagactag ctagagacaa tgaattaagg 180 gaaaatgaca aagaacagct caaagcaatt tctacacgag atcctctctc taaaatcact 240 gagcaggaga aagattttct atggagtcac aggtaagtgc taaaatggag attctctgtt 300 tctttttctt tattacagaa aaaataactg aatttggctg atctcagcat gtttttacca 360 tacctattgg aataaataaa gcagaattta catgattttt aaactataaa cattgccttt 420 <210> 3 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ3 <400> 3 tgcaatgaaa ataaattatt ttacaacagt taattagcaa tgtaaaattt attgaaaatg 60 tatttgcttt ttctgtaaat catctgtgaa tccagagggg aaaaatatga caaagaaagc 120 tatataagat attattttat tttacagagt aacagactag ctagagacaa tgaattaagg 180 gaaaatgaca aagaacagct caaagcaatt tctacacgag atcctctctc tgaaatcact 240 aagcaggaga aagattttct atggagtcac aggtaagtgc taaaatggag attctctgtt 300 tctttttctt tattacagaa aaaataactg aatttggctg atctcagcat gtttttacca 360 tacctattgg aataaataaa gcagaattta catgattttt aaactataaa cattgccttt 420 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 4 <400> 4 aatctcttca taaatctttt ctcaatgatg cttggctctg gaatgccaga actacaatct 60 tttgatgaca ttgcatacat tcgaaagacc ctagccttag ataaaactga gcaagaggct 120 ttggagtatt tcatgaaaca aatgaatgat gcacatcatg gtggctggac aacaaaaatg 180 gattggatct tccacacaat taaacagcat gcattgaact gaaaagataa ctgagaaaat 240 gaaagctcac tctggattcc acactgcact gttaataact ctcagcaggc aaagaccgat 300 <210> 5 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 5 <400> 5 aatctcttca taaatctttt ctcaatgatg cttggctctg gaatgccaga actacaatct 60 tttgatgaca ttgcatacat tcgaaagacc ctagccttag ataaaactga gcaagaggct 120 ttggagtatt tcatgaaaca aatgaatgat gcacgtcatg gtggctggac aacaaaaatg 180 gattggatct tccacacaat taaacagcat gcattgaact gaaaagataa ctgagaaaat 240 gaaagctcac tctggattcc acactgcact gttaataact ctcagcaggc aaagaccgat 300 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 6 <400> 6 ctctctgaaa tcactaagc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 7 <400> 7 ctctctaaaa tcactgagc 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 8 <400> 8 caaatgaatg atgcacatca 20 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 9 <400> 9 atgcacatca tggtggc 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 10 <400> 10 atgcacatca tggtggct 18 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 11 <400> 11 cagccaccat gacgtgc 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 12 <400> 12 ccaccatgac gtgcatca 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 13 <400> 13 caccatgacg tgcatca 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 14 <400> 14 ccatgacgtg catcatt 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 15 <400> 15 ccatgacgtg catcatt 17 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 16 <400> 16 catgacgtgc atcattcat 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 17 <400> 17 accatgacgt gcatcattc 19 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 18 <400> 18 ccaccatgac gtgcatc 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 19 <400> 19 cagccaccat gacgtgc 17 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 20 <400> 20 ccatgacgtg catcattc 18 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 21 <400> 21 ccaccatgac gtgcatc 17 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 22 <400> 22 ccatgacgtg catcattc 18 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 23 <400> 23 gaacagctca aagcaatttc tacacgag 28 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 24 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> y is c or t. <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> y is c or t. <400> 24 cagagaatyt ccattttagc acttacytgt gac 33 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 25 <400> 25 gaggctttgg agtatttcat gaaacaaatg 30 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 26 <400> 26 gcatgctgtt taattgtgtg gaagatccaa tc 32 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 27 <400> 27 cacgtcatgg tggctg 16 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 28 <400> 28 catcatggtg gctggac 17 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 29 <400> 29 catcatggtg gctggacaac 20 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 30 <400> 30 acatcatggt ggctggac 18 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 31 <400> 31 caaatgaatg atgcacatc 19 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 32 <400> 32 catttttgtt gtccagccac catgacg 27 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 33 <400> 33 ccagccacca tgacgtg 17 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 34 <400> 34 acgtgcatca ttcatttgtt tc 22 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 35 <400> 35 tccatttttg ttgtccagcc accatgatgt gcatcattca tttgtttcat gaaatactcc 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 36 <400> 36 tccatttttg ttgtccagcc accatgacgt gcatcattca tttgtttcat gaaatactcc 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 37 <400> 37 ggagtatttc atgaaacaaa tgaatgatgc acatcatggt ggctggacaa caaaaatgga 60 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SEQ 38 <400> 38 ggagtatttc atgaaacaaa tgaatgatgc acgtcatggt ggctggacaa caaaaatgga 60

Claims (14)

  1. 하기 P1～P11'로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 프로브;
    (P1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P1') 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄(鎖)에 대하여 스트린젠트(stringent)한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P2) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P2') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P3) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P3') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P4) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P4') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P5) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P5') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P6) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P6') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P7) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P7') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P8) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P8') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P9) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P9') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P10) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P10') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (P11) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및
    (P11') 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 P1-1～P11'-1로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 다형 검출용 프로브;
    (P1-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P1'-1) 서열 번호 1～서열 번호 3 중 어느 하나에 나타내는 염기 서열에 있어서, 226번째～232번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 226번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 1에 있어서의 232번째 및 241번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P2-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P2'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 139번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 17～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 139번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P3-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P3'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～165번째 염기를 포함하는 염기 길이 11～50의 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 165번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P4-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P4'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～167번째 염기를 포함하는 염기 길이 13～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 167번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P5-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P5'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～164번째 염기를 포함하는 염기 길이 10～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 164번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P6-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P6'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～163번째 염기를 포함하는 염기 길이 9～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 163번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P7-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P7'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～161번째 염기를 포함하는 염기 길이 7～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 161번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P8-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P8'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 155번째～160번째 염기를 포함하는 염기 길이 6～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 160번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P9-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P9'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 144번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 12～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 144번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P10-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P10'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 148번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 8～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 148번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드,
    (P11-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드, 및
    (P11'-1) 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 151번째～155번째 염기를 포함하는 염기 길이 5～50의 염기 서열에 상보적인 염기 서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 151번째 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 당해 시토신이 형광 색소로 표지되어 있고, 또한 서열 번호 4에 있어서의 155번째의 다형을 인식하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 226번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 139번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 165번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P4 또는 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 167번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P5 또는 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 164번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P6 또는 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 163번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P7 또는 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 161번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P8 또는 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 160번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P9 또는 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 144번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고,
    상기 P10 또는 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 148번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖고, 또는
    상기 P11 또는 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 151번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어서 1번째～3번째 위치 중 어느 하나에 갖는 다형 검출용 프로브.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 226번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 139번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 165번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
    상기 P4 또는 P4'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 167번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P5 또는 P5'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 164번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P6 또는 P6'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 163번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P7 또는 P7'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 161번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P8 또는 P8'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 160번째 염기에 대응하는 염기를 5' 말단에 갖고,
    상기 P9 또는 P9'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 144번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
    상기 P10 또는 P10'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 148번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고, 또는
    상기 P11 또는 P11'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 형광 색소로 표지된 상기 151번째 염기에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는 다형 검출용 프로브.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때의 형광 강도가, 하이브리다이즈하지 않을 때의 형광 강도에 비해서, 감소하거나 또는 증가하는 다형 검출용 프로브.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 프로브가, 융해 곡선 분석용 프로브인 다형 검출용 프로브.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 프로브가, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 및 서열 번호 22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 염기 서열을 갖는 다형 검출용 프로브.
  8. 제1항 또는 제2항에 기재된 프로브를 사용함으로써 PIK3CA 유전자의 다형을 검출하는 다형 검출 방법.
  9. (I) 제1항 또는 제2항에 기재된 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,
    (Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 근거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,
    (Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 근거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과,
    (Ⅳ) 상기 Tm값에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, PIK3CA 유전자의 다형의 존재를 검출하는 것을 포함하는 다형 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (V) 상기 다형의 존재에 근거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것을 더 포함하는 다형 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (I)의 하이브리드를 얻기 전 또는 상기 (I)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 공정을 더 포함하는 다형 검출 방법.
  12. 제8항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것, 및 검출된 다형의 유무에 근거하여 항암제의 약효를 판정하는 것을 포함하는 항암제의 약효 판정 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 기재된 프로브를 포함하는, PIK3CA 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 다형 검출용 시약 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 다형 검출용 시약 키트.
KR1020120106567A 2011-09-27 2012-09-25 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 판정 방법 및 다형 검출용 시약 키트 KR20130033976A (ko)

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