JP6460626B2 - プローブ作製方法、プローブセット、及び表現型決定遺伝子検出方法 - Google Patents
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Description
ジェノタイプ検査は、体内で増殖しているHIV のenv領域の遺伝子解析を行い、得られた塩基配列をデータベースや一定のアルゴリズムと照合して感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
フェノタイプ検査は、感染者ウイルス由来のenv領域を増幅させ、この増幅した領域の遺伝子を有する感染性ウイルスを再構築し、CCR5阻害薬存在下でのHIV由来のプロテアーゼ活性を測定することにより、感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
ここで、env領域とは、ウイルスを覆う殻となるタンパク質をコードする領域であり、該タンパク質は、宿主細胞表面の受容体に結合し、宿主細胞へウイルスの侵入を可能にする役割を有する。
(2)本発明の一実施態様におけるプローブセットは、先に記載のプローブ作製方法を用いて得られたことを特徴とする。
(3)本発明の一実施態様におけるプローブセットは、配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号3で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号4で表される塩基配列からなるDNAとを含むことを特徴とする。
[第1実施形態]
HIV−1(human immunodeficiency virus type1)は、宿主細胞内へ侵入する際に、CCR5に選択的に結合するCCR5指向性ウイルス(以下、R5ウイルスともいう。)か、CXCR4に選択的に結合するCXCR4指向性ウイルス(以下、X4ウイルスともいう。)かに大別される。
係る細胞指向性を規定する遺伝子群(以下、表現型決定遺伝子群ともいう。)としては、外被糖タンパク質の可変領域、特に第3可変領域(V3領域)が挙げられる。V3領域は、上述したenv領域に含まれる遺伝領域である。HIVは、非常に変異しやすいウイルスであり、遺伝子変異によってもたらされるV3領域内のアミノ酸の変化は、ウイルスの細胞指向性などの表現型に影響を与える。従って、感染者の細胞内に存在するV3領域は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群といえる。
本実施形態では、RNAウイルスの細胞指向性、特にヒト免疫不全ウイルスの細胞指向性を決定する遺伝子を検出対象とする。
本実施形態のプローブ作成方法は、断片設定工程と、プローブ選択工程とを含む。
断片設定工程は、特定の表現型決定遺伝子中の断片Aと、他の表現型決定遺伝子中の当該断片Aに対応する断片Bとを含む断片セットを、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する。ここで、特定の表現型決定遺伝子とは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子である。この一例においては、特定の表現型決定遺伝子とは、R5ウイルスの表現型決定遺伝子である。また断片Aとは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子の断片であり、この一例においては、R5ウイルスの表現型決定遺伝子の断片である。また、他の表現型決定遺伝子とは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子以外の表現型決定遺伝子である。この一例においては、他の表現型決定遺伝子とは、X4ウイルスの表現型決定遺伝子である。また断片Bとは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子以外の表現型決定遺伝子の断片であり、この一例においては、X4ウイルスの表現型決定遺伝子の断片である。また、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報とは、表現型決定遺伝子群に含まれる塩基対の配列情報であって、遺伝子データベース等に予め記憶されている配列情報である。この一例においては、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報とは、HIVシーケンスデータベースに記憶されているHIV−1の遺伝子配列情報である。
このプローブ選択工程における具体的な手順について説明する。プローブ選択工程において、まず、ある断片AのTm値(第1のTm値)と、この断片Aに対応する断片BとのTm値(第2のTm値)との差を求める。ここで、ある断片Aに対応する断片Bとは、複数の断片Bのうち、ある断片Aが示すV3領域の塩基対の位置と同じ位置の塩基対を示す断片Bである。一例として、V3領域に100対の塩基対が含まれる場合に、V3領域の一端の塩基対を塩基対1とし、他端の塩基対を塩基対100とする。この場合において、ある断片Aが、塩基対18から塩基対45までの領域を示す断片であるとき、この断片Aに対応する断片Bとは、複数の断片Bのうちの塩基対18から塩基対45までの領域を示す断片Bである。以下の説明において、ある断片のV3領域における塩基対の領域のうち小さい番号を有する塩基対の位置を、ある断片の開始位置と記載する。一例として、ある断片が、塩基対18から塩基対45までの領域を示す断片であるとき、塩基対18を、この断片の開始位置と記載する。また、ある断片が、塩基対18から塩基対45までの領域を示す断片であるとき、この断片を、開始位置が塩基対18である断片とも記載する。
すなわち、プローブ選択工程において、複数の断片セットのうち、ある断片セットに含まれる断片AのTm値と、断片BのTm値との差を、複数の断片セットについてそれぞれ求める工程と、複数の断片セットのうち、ある断片セットについて、当該断片セットの5’末端からの位置を第1軸に、当該断片セットについてのTm値の差を第2軸にそれぞれプロットした場合に、Tm値の差の極大値を示す断片セットを選択する工程とを含む。
一例として、上述のようにして選択した複数の断片セットのそれぞれについて、相関係数のp値を求め、求めた相関係数のp値が低い方から所定数の断片セットを選択する。この相関係数のp値は、HIV−1検体を第1群(ここでは、X4ウイルス株の群)と第2群(ここでは、R5ウイルス株の群)とに判別する際の正判別率を示す値であり、p値が低いほど正判別率が高い。したがって、相関係数のp値が低い断片セットを用いれば、ある検体を高い正判別率によってX4ウイルス株の群と、R5ウイルス株の群とのいずれの群に属するかを判別することができる。また、検体が属する群を判別する際の断片セットが少ないほど、迅速かつ安価に判別することができる。
一例として、Tm値の差が極大値をとる断片セットが20セットあり、その中から4セットの断片セットを選択する場合には、選択した20セットの断片セットのそれぞれについて、相関係数のp値を求め、求めた相関係数のp値が低い方から4セットの断片セットを選択する。
本実施形態のプローブ作製方法は、上述したHIV以外のウイルスの型判定に用いられる方法である。
本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、HPV(Human papillomavirus)においては、例えば、発癌性リスク決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、HPV感染者の感染ウイルスは、HPV6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81,CP6108型等の低リスク型であるのか、 HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,82型等の高リスク型であるのかを判別することができる。
また、本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、HCV(hepatitis C virus)においては、例えば、インターフェロン(IFN)感受性決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、IFN治療の効果予測をすることができる。HCVの遺伝子型としては、1a型、1b型、1c型、2a型、2b型、2c型、3a型、3b型、4型、5a型、6b型が挙げられ、遺伝子型が1bの場合は完全緩解率が50%、1b以外では80から90%に及ぶと判定されている。
本実施形態のプローブ作製方法は、リボソームの小サブユニットrRNA系統解析を利用したものである。本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、細菌等の原核生物においては、16SrRNAであり、真菌等の真核生物においては、18SrRNAである。
本実施形態に係る表現型とは、例えば敗血症等の感染症起因性をいう。本実施形態によれば、特定の感染症起因性を有する菌を特異的に検出するプローブを作製できる。
本実施形態のプローブ作製方法は、HLA(Human Leukocyte Antigen)のタイピングに用いられる方法である。
本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、例えば、疾患発症リスク決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、被験者のHLAが糖尿病になりやすい型(B54、DQB1*04:01、DRB1*04:05等)であるのか、腫瘍性大腸炎を発症しやすい型(DRB1*09:01、DR2、B52等)、ベーチェット病にかかりやすい型(B51)であるのか等を判別することができる。
[第1実施形態]
本実施形態の表現型決定遺伝子検出方法は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出する方法である。
以下、一例として、HIV−1感染者のサンプル中に存在する細胞指向性を規定する遺伝子群から、R5ウイルス決定遺伝子を特異的に検出する方法における各工程について説明する。
R5ウイルス決定遺伝子由来の核酸としては、RNA鎖であっても、一本鎖DNAであってもよい。先ず、RNA鎖の合成方法について説明する。
本実施形態において、先ず、試料から二本鎖DNAを抽出する。試料としては、例えば血清、リンパ球、喀痰、尿、髄液、胸液、腹水等が挙げられ、一例としてHIV−1由来の二本鎖DNAを抽出する観点からはリンパ球が好ましい。
例えば、血清から二本鎖DNAを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。血清試料に緩衝液を加え、50℃で一昼夜反応させた後、SDS(Sodium dodecyl sulfate)で細胞を溶解するとともに、RNaseでRNAを消化する。次いで、タンパク質をプロテイナーゼKで消化し、抽出液中のタンパク質をフェノール抽出で除去する。残液にエタノールを加え、DNAを沈殿として回収する。
また、例えば、リンパ球から二本鎖DNAを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。Ficoll−paque法でリンパ球分画を得たのちに、フェノール・クロロホルム法でDNAを抽出する。赤血球の混入の多い検体は、10倍量のTE緩衝液を加えて溶血させ、10,000回転で10分間遠心する。この操作を2回行い、ペレット試料とした後にDNAを抽出する。
また、例えば、喀痰から二本鎖DNAを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。 1N NaOHを等量の試料に加えて室温で10分間混和した後、そのまま、あるいは1M NaH2PO4を加えて、10000回転で10分間遠心を行う。PBSで2回洗浄後、得られた残渣を40〜100μLのリゾチーム溶液で溶解する。その後、37℃で30分から2時間ほど反応させ、さらにプロテイナーゼKを200μg/mlの濃度で加えて37℃で一昼夜反応させる。試料中には細胞や夾雑物を多く含むため、DNAの抽出は一例としてフェノール・クロロホルム法を用いて行うことが好ましい。
また、例えば、尿、髄液、胸液、腹水から二本鎖DNAを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。遠心操作で細胞成分をペレットにして試料とするか、または何ら濃縮操作をせずに直接PCR検体としてもよい。赤血球の混入の多い試料は、例えば溶血操作を行う。これら試料からのDNA抽出法は一例としてフェノール・クロロホルム法を用いて行う。
二本鎖DNAから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、プロモーターを付加する工程は同時に行われてもよい。即ち、二本鎖DNAから標的遺伝子を含む断片を増幅する際に、プロモーター配列を有するプライマーを用いて増幅反応を行ってもよい。
次いで、R5ウイルス決定遺伝子由来の核酸の合成方法として、一本鎖DNAの合成方法について説明する。
本実施形態では、逆転写反応により、(RNA鎖の合成方法)で得られた前記RNA鎖から当該RNAに相補するDNAを合成し、該DNAと前記RNAとの複合体を形成させる(図3参照)。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素等が挙げられる。逆転写されたDNAはRNAとの複合体を形成する。
RNaseとしては、RNaseA、RNaseH、RNaseI、RNaseIII、RNaseL、RNaseP、RNasePhyM、RNaseT1、RNaseT2 、RNaseU2i、RNaseV1等が挙げられ、一例として汎用性の観点からRNaseAが好ましい。更に、例えば、安価であることから、ウシ膵臓由来RNaseAが好ましい。
また、前記一本鎖DNA鎖を合成する工程は、上述したRNase処理工程に代えて、前記複合体をアルカリ処理する工程を有していてもよい。
アルカリ処理に用いられるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物;水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム等のアルカリ土類金属水酸化物;炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩等が挙げられ、例えばアルカリ金属水酸化物であり、一例として水酸化ナトリウムである。
用いられる水酸化ナトリウムの濃度としては、例えば1mM〜100mM、5mM〜50mM、10mMである。アルカリ処理におけるpHは、例えば10〜14、12〜14である。アルカリ処理における温度は、例えば50〜80℃、60〜70℃である。アルカリ処理における反応時間は、例えば5〜120分、10〜30分である。
当該工程を経ることにより、逆転写反応において未反応のRNAやRNA誘導体等の不純物を容易に取り除くことができ、表現型決定遺伝子由来の核酸として、RNA鎖に相補する一本鎖DNA鎖を得ることができる。
また、一本鎖DNAの合成方法としては、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が挙げられる。一例として図5に示されるように、試料から抽出した二本鎖DNAを鋳型として用いてPCRを行う。この鋳型DNAの特定領域をPCR反応で増幅可能な一対のプライマーセットにおいて、一方のプライマーをビオチンで修飾する。係るプライマーセットを用いて反応させて得られた増幅産物である二本鎖のうち、ビオチン修飾プライマーが伸長してなる一方の鎖は5’末端にビオチンを有している。そのため、アビジン修飾磁気ビーズを用いることにより、ビオチン修飾一本鎖DNAのみを容易に回収することができる。また、一方のプライマーをアビジンで修飾し、ビオチン修飾磁気ビーズを用いてもよい。
また、当該合成方法においては、アビジン−ビオチン結合を利用することに限定されず、一方のプライマーをアミノ基、アルデヒド基、SH基、などの官能基で修飾し、ビーズをアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを用いてもよい。
また、一本鎖DNAの合成方法としては、非対称PCRを利用した方法が挙げられる。一例として図6に示されるように、試料から抽出した二本鎖DNAを鋳型として用いてPCRを行う。この鋳型DNAの特定領域をPCR反応で増幅可能な一対のプライマーセット(プライマーA及びプライマーB)において、プライマーの分子数比に大差をつける。係るプライマーセットを用いて反応させて得られた増幅産物において、分子数の少ないプライマー(プライマーB)が伸長してなる一本鎖と、該一本鎖に対応して、分子数の多いプライマー(プライマーA)が伸長してなる一本鎖と、が二本鎖を形成する。しかし、プライマーBの分子数を超えて増幅したプライマーAが伸長してなる鎖は、一本鎖のままで存在する。
蛍光色素を用いる工程として、一例として、二本鎖DNAに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン、SYTO9等の色素を用いる方法と、蛍光物質を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。蛍光物質としては、FAM(カルボキシフルオレセイン)、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ2’ ,7’−ジメトキシフルオレセイン)、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、TET(テトラクロロフルオレセイン)、HEX(5'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−CEホスホロアミダイト)、Cy3、Cy5、Alexa568等が挙げられる。
分光学的手法を用いた検出工程は、蛍光色素を用いる必要がないため、蛍光色素の影響を排除することができる。また、プローブを蛍光色素で修飾する必要がないため測定が容易である点で優れている。
米国ロスアラモス国立研究所のHIVデータベースであるHIVシークエンスデータベース(Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database)からHIV−1subtypeBの指向性が既に示されているV3領域の配列情報(612検体由来のR5ウイルス株及び47検体由来のX4ウイルス株のV3領域の塩基配列情報)を取得した。
次いで、取得した塩基配列情報において、各塩基配列の5’末端から16〜26塩基の断片を設定し、各検体由来のウイルスにおいて対応する断片のTm値を、最近接塩基法により、下記式(1)を用いて算出した。
図7のグラフにおいて、20種類の断片セットが極大値を示し、これらの断片セットをプローブ候補とした。
算出したp値のうち、最も低いp値をとる4種類の断片セットをHIV指向性検査用プローブ(X18、X33、X75、X80)として選出した。
X18は以下の配列を表す。
CAATACAAGAAAAAGTATACATATAGG(配列番号1:27mer)
X33は以下の配列を表す。
AAGTATACATATAGGACCAGGG(配列番号2:22mer)
X75は以下の配列を表す。
TGCAACAGGAGAAATAATAG(配列番号3:20mer)
X80は以下の配列を表す。
CAGGAGAAATAATAGGAGATATAAG(配列番号4:25mer)
Ficoll−Paque PLUS(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にHIV患者(36検体)の血液を重層し、室温、1500rpmで40分遠心分離をし、リンパ球層を採取した。
採取したリンパ球に、2%FCS(ウシ胎児血清;Fetal calf serum)含有PBS(phosphate buffered saline)10mLを加え、室温、1200rpmで10分遠心分離をし、上清を除いた。沈澱を2%FCS含有PBS5mLに溶解したのち、室温、1000rpmで10分遠心分離をし、上清を除いた。
次いで、QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて沈澱からGenomic DNAを抽出した。詳細には、沈澱を200μL PBSに懸濁し、20μL QIAGEN protease及び、200μL Buffer ALを加え、56℃で10分インキュベートしリンパ球を溶解した。これに、200μLエタノールを加えた後、溶液全量をスピンカラムに移し、8000rpmで1分間遠心した。スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに500μL BufferAW1を加え、8000rpmで1分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに500μL BufferAW2を加え、8000rpmで1分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、14000rpmで1分間遠心した。スピンカラムを1.5mLチューブに移した後、このカラムに200μL TE bufferを加え、室温で1分間インキュベートし、8000rpmで1分間遠心し、Genomic DNA溶解液を回収した。
HIV−1のC2V3領域約420bp(7377−6955)をPCRにより増幅した。反応液を表1に記載の組成となるように調製し、94℃で1分間保持した後、94℃10秒、48℃10秒、72℃30秒の3ステップPCRを5サイクル行い、94℃5秒、52℃10秒、72℃30秒の3ステップPCRを25サイクル行い、72℃で1分間保持した後、4℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
(1)env6955−F (21mer、20μM)
[配列:5’−CAGTACAATGYACACATGGAA−3’](配列番号5)
(2)env7377L−R (26mer、20μM)
[配列:5’−TAGAAAAATTCCCCTCYACAATTAAA−3’](配列番号6)
1stPCRで得られた反応液1μLを用いて、HIV−1のC2V3領域約330bp(7337−7005)をPCRにより増幅した。2ndPCR用の反応液を表2に記載の組成となるように調製し、1stPCRで得られた反応液1μLを添加し、94℃で1分間保持した後、94℃5秒、48℃10秒、72℃30秒の3ステップPCRを5サイクル行い、94℃5秒、60℃10秒、72℃30秒の3ステップPCRを30サイクル行い、72℃で1分間保持した後、4℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
(3)env7005−F (20mer、20μM)
[配列:5’−TTAAATGGCAGTCTAGCAGA−3’](配列番号7)
(4)env7337B−R (20mer、20μM)
[配列:5’−AATTTCTGGGTCCCCTCCTG−3’](配列番号8)
(5)env7337E−R (20mer、20μM)
[配列:5’−AATTTCTAGATCTCCTCCTG−3’](配列番号9)
2ndPCRで得られた反応液50μLを、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、50μLの溶解液を得た。この溶解液を水で10倍希釈した後、3rdPCR用の反応液を表3に記載の組成となるように調製し、上記10倍希釈した溶解液10μLを添加し、94℃で1分間保持した後、94℃5秒、60℃10秒、72℃15秒の3ステップPCRを30サイクル行い、72℃で1分間保持した後、4℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。(6)env−bridge−F (30mer、20μM)
[配列:5’−ATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAA−3’](配列番号10)
(7)env−T7−R(40mer、20μM)
[配列:5’−TAATACGACTCACTATAGGGATGTTACAATGTGCTTGTCT−3’](配列番号11)
3rdPCRにより得られたDNAからRiboMAX(商標名)Large Scale RNA Production Systems(プロメガ社製)を用いて、RNAを合成した。
先ず表4に記載の組成となるように反応液を調製した後、37℃で2時間反応させた。
合成したRNAを用いて、表5に記載の組成となるように反応液を調製した後、StepOnePlus(商標名)リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて融解曲線の測定を行った。Run methodは、65℃15分/Melt curve stage/20℃1分/95℃15秒であった。尚、20℃から95℃までの昇温を90分かけて行った。
また、図13に基づき、各プローブを用いた場合の鋳型RNAの変異数と上記Tm値の差(ΔTm)との関係を示したグラフを図14〜17に示す。図14〜17に示すように、各グラフにおける相関係数は−0.87、−0.83、−0.75、−0.77であり、鋳型RNAの変異数とΔTmの間に相関があることが確認された。尚、N.D.の場合のΔTmを−25℃と仮定した。
また、同様に、各プローブにおける水素結合数とΔTmとの関係を示したグラフを図18〜21に示す。図18〜21に示すように、各グラフにおける相関係数は−0.85、−0.82、−0.78、−0.87であり、水素結合数とΔTmの間に相関があることが確認された。尚、N.D.の場合のΔTmを−25℃と仮定した。
各上記Tm値を用い、前記式(2)で表されるマハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて、前記式(3)、式(4)で表されるZ値を算出した。線形判別結果を図22に示す。図22中、横軸はサンプル番号を示し、縦軸はZ値を示す。図22に示すように、R5ウイルスとX5ウイルスが精度よく判別されることが確認された。
また、指向性を識別するアルゴリズムGeno2pheno(g2pともいう)による判別結果との対比を図23に示す。図23に示すように、マハラビノスの汎距離による線形判別は、Geno2phenoによる判別結果とほぼ同じ結果を示すことが確認された。
上記[RNAの合成]で得られたRNAを用いて、表6に記載の組成となるように反応液を調製した後、65℃で5分間保持した後、氷上に2分おいた。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
(8)env−bridge−F (30mer、20μM)
[配列:5’−ATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAA−3’](配列番号10)
上記DNA−RNAハイブリッドを用いて、表7に記載の組成となるように反応液を調製した後、94℃で5秒加熱した後、37℃15分保持した。反応液のうち10μについて、2%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、反応液中のRNAが分解されていることを確認した。結果を図24に示す。
図24の右端のレーンに示されるように、DNA−RNAハイブリッドにRNaseを加え、94℃で5秒加熱した後、37℃15分保持することによりRNAが分解されていることが確認された。
上記[一本鎖DNAの合成1(RNase処理)]で得られた一本鎖核酸がDNA(プラス鎖)であることを確認するために、表8に記載の組成となるように反応液を調製した後、94℃で1分間保持した後、94℃5秒、60℃10秒、72℃15秒の3ステップPCRを1サイクル行い、72℃で1分間保持した後、4℃で冷却した。反応液のうち20μLについて、2%アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図25に示す。
尚、表8中の2μM Primerは下記のいずれかの配列を示す。
(9)env−bridge−F (30mer、2μM)
[配列:5’−ATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAA−3’](配列番号10)
(10)env−bridge−R(31mer、2μM)
[配列:5’−TTGCTCTACTAATGTTACAATGTGCTTGTCT−3’](配列番号12)
図25の右端のレーンに示されるように、プライマー(env−bridge−R)を加えた反応産物からバンドが検出されたことから、[一本鎖DNAの合成1(RNase処理)]で得られた一本鎖核酸がDNA(プラス鎖)であることが確認された。
上記DNA−RNAハイブリッドに、終濃度10mM NaOH、終濃度2mM MgCl2を加え、60℃で15分反応させ、反応液について、2%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、反応液中の一本鎖がDNAであることを確認した。結果を図26に示す。
図26に示されるように、左端のレーンに見られたバンドが、DNase処理により消失したことから、アルカリ処理により得られた一本鎖核酸はDNAであることが確認された。
合成した一本鎖DNAを用いて、表9に記載の組成となるように反応液を調製した後、StepOnePlus(商標名)リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて融解曲線の測定を行った。Run methodは、65℃15分/Melt curve stage/20℃1分/95℃15秒であった。尚、20℃から95℃までの昇温を90分かけて行った。
合成したmRNA、及び一本鎖DNAをそれぞれ用いて、分光光度計(日本分光社製;V−650 spectrophotometer)を用いて融解曲線の測定を行った。測定条件を以下に示す。
目標温度 60〜70℃(予想されるTm値によって変更)
勾配 2.0℃/min
データ取込間隔 0.3℃
測定開始条件 10sec間設定温度±0.1℃以内になった時
スターラー 0rpm
測光モード Abs
UV/Vis バンド幅 2.0 nm
レスポンス Medium
測定波長 260 nm
光源切換 350 nm
光源 D2/WI
Claims (18)
- 二種類の表現型を識別するプローブの作製方法であって、
一方の表現型を有するウイルスにおける前記表現型を規定する表現型決定遺伝子中の断片Aと、他方の表現型を有するウイルスにおける前記表現型決定遺伝子に対応する表現型決定遺伝子中の前記断片Aの位置に対応する位置の断片Bと、を含む断片セットを、前記表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する断片設定工程と、
前記断片Aおよび前記断片BのTm値を用いて複数の前記断片セットからプローブ候補の前記断片セットを選択するプローブ選択工程と、
を含み、
前記プローブ選択工程は
複数の前記断片セットのそれぞれについて、断片AのTm値と、断片BのTm値との差を求める工程と、
複数の前記断片セットのそれぞれについて、当該断片セットの5’末端の、前記表現型決定遺伝子の5’末端からの位置を第1軸に、前記Tm値の差を第2軸にそれぞれプロットした場合に、前記Tm値の差の極大値を示す前記断片セットを複数選択する工程と、
選択した前記断片セットのそれぞれについて、前記Tm値を用いて、マハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて相関係数p値を求め、前記相関係数p値が相対的に低い前記断片セットを前記プローブ候補として選択する工程と、
を含むことを特徴とするプローブ作製方法。 - 前記断片Aおよび前記断片BのTm値を換算するTm値換算工程を含むことを特徴とする請求項1に記載のプローブ作製方法。
- 前記表現型は、RNAウイルスの細胞指向性であることを特徴とする請求項1または2に記載のプローブ作製方法。
- 前記RNAウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求項3に記載のプローブ作製方法。
- 前記表現型決定遺伝子はenv遺伝子であり、前記断片Aおよび断片BはV3領域の一部である、請求項4に記載のプローブ作製方法。
- 前記断片A及び前記断片Bの塩基数は10〜30であることを特徴とする請求項1〜5の何れか一項に記載のプローブ作製方法。
- 前記Tm値は最近接塩基対法により求められることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載のプローブ作製方法。
- 配列番号1〜4のいずれかで表される塩基配列からなるDNAを含むヒト免疫不全ウイルスの細胞指向性を識別するプローブ。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号2で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号3で表される塩基配列からなるDNAと、配列番号4で表される塩基配列からなるDNAとを含むことを特徴とするヒト免疫不全ウイルスの細胞指向性を識別するプローブセット。
- RNAウイルスの細胞指向性を検出する方法であって、
前記RNAウイルスの細胞指向性を規定する表現型決定遺伝子を含む核酸と、請求項1〜7のいずれか一項に記載のプローブ作製方法を用いて得られるプローブまたは請求項8に記載のプローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸を検出する検出工程を有することを特徴とする表現型決定遺伝子検出方法。 - 前記検出工程において蛍光色素を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項10に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
- 前記検出工程において、分光学的手法を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項10に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
- 前記検出工程は、融解曲線を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項10〜12のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
- 請求項13に記載の表現型決定遺伝子検出方法において、前記融解曲線から算出される前記二本鎖核酸のTm値と、前記二本鎖核酸の形成に用いられたプローブのTm値との差を算出する工程と、
算出されたTm値の差と、マハラノビスの汎距離による線形判別式とに基づいて、特定の表現型決定遺伝子と、その他の表現型決定遺伝子を判別する工程と、
を含むことを特徴とする表現型決定遺伝子検出方法。 - 前記表現型決定遺伝子を含む核酸は、
試料から二本鎖DNAを抽出する工程と、
前記二本鎖DNAから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、
前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程と、
前記プロモーターを付加された断片から、前記表現型決定遺伝子由来の核酸としてRNA鎖を合成する工程と、
により合成されたRNA鎖であることを特徴とする請求項10〜14のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。 - 前記表現型決定遺伝子を含む核酸は、
試料から二本鎖DNAを抽出する工程と、
前記二本鎖DNAから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、
前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程と、
前記プロモーターを付加された断片から、RNA鎖を合成する工程と、
逆転写反応により、前記RNA鎖から当該mRNAに相補するDNAと前記RNAとの複合体を合成する工程と、
前記複合体から前記表現型決定遺伝子由来の核酸として一本鎖DNA鎖を合成する工程と、
により合成された一本鎖DNA鎖であることを特徴とする請求項10〜14のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。 - 前記一本鎖DNA鎖を合成する工程は、前記複合体を熱処理して、RNase処理する工程を有する請求項16に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
- 前記一本鎖DNA鎖を合成する工程は、前記複合体をアルカリ処理する工程を有する請求項16に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
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