KR20130033033A - Salt and drought stress tolerant gene, ossdt1 and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 내염성 또는 내한발성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 조절하여 식물의 내염성 또는 내한발성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.
The present invention relates to a salt-tolerant or cold-tolerant gene and a use thereof, and more particularly, to a method for enhancing the salt-tolerant or cold-tolerant resistance of a plant by regulating intracellular levels of a polypeptide having a specific amino acid sequence, a plant prepared according to the method, and It's about seeds.
농업은 타 산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성이 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물의 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다. Agriculture has its own risks and instabilities that are not seen in other industries. Agriculture is not only uncertain because of the large losses caused by disasters, but also the high price of agricultural commodities and the relatively low price of agricultural commodities relative to the purchase price of production materials. Agriculture is a natural danger that is more prone to damage than any other industry due to drought, flooding, frost or hail. This is because it is closely connected to the land of agricultural production and the land which cannot be moved, and because the object of production is flora and fauna, it is largely dominated by natural conditions due to the limitations of life.
한발은 강수부족으로 수량손실을 야기하거나 일정한 강수기간이 없어 관개수에 의존하여 작물을 재배하는 것으로 한발은 재배기간 중 어느 때라도 발생할 수 있고 지역에 따라서는 연중 발생하기도 한다. 생육초기에는 이앙시점이나 파종이 지연되고 중기에 발생한 한발이 지속되면 개화시기의 지연으로 수량에 치명적인 영향을 미친다. 우리나라는 연 강수량이 1,250 mm 정도로 풍부하지만 7-8월에 편중되어 있어 봄, 가을에는 반 건조성 기후의 성격을 띠고 있다. 따라서 봄, 가을은 상습적으로 한발이 일어나고 때에 따라서는 7-8월에도 강우가 부족하여 한해(旱害)를 입기도 한다.A drought causes crop loss due to lack of precipitation, or there is no constant precipitation period, and crops are cultivated depending on irrigation water. Drought can occur at any time during the growing season and may occur year round depending on the region. In the early stage of growth, delayed seeding time or seeding, and the mid-term drought lasting, have a fatal effect on the yield due to the delay of flowering time. Korea has abundant annual rainfall of 1,250 mm, but is concentrated in July-August, so it has a semi-dry climate in spring and autumn. Therefore, spring and autumn usually occur in pairs, and sometimes even in July-August, there is a shortage of rainfall, which leads to a year.
작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.The salt damage of crops occurs when growing crops in salt and sodium soils. It may also appear as a result of splashes of sea water caused by breezes or blue waves. In Korea, three sides are surrounded by the sea, and most of them consist of coasts, and there are many salt spots. Salt salt is a land where plants are impeded to grow because salt concentration increases due to brine intrusion or evaporation of soil moisture. Some areas have been used as salt fields, and since 1960, a large part has been converted into reclaimed land. Many of these areas have been matured to increase the yield of rice, but in the case of new land reclamation projects that have been recently reclaimed, they are often damaged by salt.
식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염해에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다. With the development of plant transformation technology, it is possible to express foreign genes that are far from flexible, and thus, it is possible to develop a tolerant crop by introducing genes tolerant to poor environments. Therefore, the isolation and development of genes to withstand cold and drought and salt is an essential requirement for the development of such crops.
특히, 염해와 한발은 작물의 삼투압에 의한 수분부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등도 야기한다.In particular, salt and drought cause water deprivation due to osmotic pressure of crops, resulting in morphological and metabolic changes in plants, and the detailed mechanisms thereof have not been fully understood. This lack of water causes not only morphological changes in plants, but also pore closure, decreased photosynthetic and photorespiratory rates, increased small molecules and plant hormones, and altered gene expression.
현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836 천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.
As the population grows, food production continues to increase, but agricultural water and farmland are decreasing. In addition, because crops have a fixed life, when the surrounding environment changes, a lot of stress occurs during the growing season, which brings a large difference in yield. Although Korea is one of temperate climates, unexpected weather events such as droughts and high temperatures are occurring frequently due to global climate change. It is thousand ha, which is 8.87% of the total land area of 1,836 thousand ha. As such, deterioration of agricultural productivity due to natural disaster is a serious level, and it is absolutely necessary for food production to develop crops that withstand such poor environment.
이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 염(salt) 및/또는 한발(drought) 저항성 유전자를 이용하여 식물의 이러한 비생물적 스트레스 저항성을 향상시키는 방법, 이러한 유전자를 이용하여 염 및 한발 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 염 및 한발 저항성이 향상된 형질전환 식물을 제공하는데에 있다.
Accordingly, the problem to be solved by the present invention is a method of improving the abiotic stress resistance of plants using salt and / or drought resistance genes, and plants having improved salt and drought resistance using such genes. To provide a method for producing a, and a transgenic plant with improved salt and drought resistance prepared by such a method.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 내염성을 증진시키는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for enhancing the flame resistance of plants by increasing the intracellular level of the OsSDT1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 내한발성을 증진시키는 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for enhancing the cold resistance of plants by increasing the intracellular level of the OsSDT1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 내염성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) preparing an expression vector overexpressing the OsSDT1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2; And (b) it provides a method for producing a flame resistance enhanced plant comprising the step of transforming the plant with the expression vector of step (a).
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 내한발성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) preparing an expression vector overexpressing the OsSDT1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2; And (b) transforming the plant with the expression vector of step (a).
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 식물을 제공한다.In order to achieve the other object of the present invention, the present invention provides a plant produced by the above production method.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a plant seed (seed) obtained from the plant.
즉, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포내 수준(level)을 증가시켜 식물의 내염성 또는 내한발성을 향상시키는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 식물의 내염성 또는 내한발성을 향상시키는 방법을 제공한다. That is, the present invention is a method of improving the salt resistance or cold resistance of plants by increasing the intracellular level of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, more preferably having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Provided is a method of overexpressing a polypeptide to enhance the tolerability or cold tolerance of a plant.
또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 식물에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 내염성 또는 내한발성 식물 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a salt tolerant or cold-resistant plant, characterized in that the plant is transformed with a recombinant expression vector in which a gene encoding a polypeptide having a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is linked to a promoter.
또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터, 및 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 내염성 또는 내한발성이 향상된 형질전환체 및 이의 종자를 제공한다.
The present invention also provides a recombinant expression vector linking a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 to a promoter, and a transformant having improved salt resistance or cold resistance by transforming with the recombinant expression vector and seeds thereof. To provide.
상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(이하, OsSDT1 폴리펩티드도 동일한 의미로 칭한다)에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 염 또는 한발에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OsSDT1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsSDT1 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 폴리펩티드과 융합으로 만들어진 융합 폴리펩티드 등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편(fragment)으로서 야생형의 OsSDT1 폴리펩티드과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 OsSDT1 폴리펩티드의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 폴리펩티드의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 기전을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테아제를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.
Polypeptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (hereinafter also referred to as OsSDT1 polypeptides) include functional equivalents thereof. The term "functional equivalent" is at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid. Preferably, it refers to a polypeptide having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. "Substantially homogeneous physiological activity" means activity that enhances resistance to salt or drought in a plant. Substitution of the amino acid is preferably a conservative substitution. Examples of conservative substitutions of amino acids present in the wild type are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). The deletion of the amino acid is preferably located at a portion not directly involved in the physiological activity of the OsSDT1 polypeptide. The functional equivalent range also includes polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of OsSDT1 polypeptide and its physiological activity. For example, fusion polypeptides made by fusion with other polypeptides, such as GFP, while maintaining structural alterations and physiological activities to alter the stability, storage, volatility or solubility of the polypeptides of the present invention. In addition, polypeptides having a bioactivity substantially equivalent to that of the wild type OsSDT1 polypeptide as a fragment of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 form another preferred group of functional equivalents of the wild type OsSDT1 polypeptide. The "fragment" refers to an amino acid sequence corresponding to a part of a polypeptide, which has a common element of origin, structure, and mechanism of action within the scope of the present invention, which is present in the wild type, is cleaved using a protease, or chemically. All cuts are included.
상기 OsSDT1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 상기 염기 서열은 야생형 폴리펩티드과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 OsSDT1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.
The base sequence of the gene encoding the OsSDT1 polypeptide may include all gDNA, cDNA and RNA. The base sequence includes both base sequences encoding wild type polypeptides and functional equivalents thereof and sequences that hybridize with these sequences under high stringent conditions. High-tension conditions are as described in known literature (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Preferably, OsSDT1 according to the present invention Genes encoding polypeptides may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and sequence variants thereof. Specifically, the sequence variant is a base having at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 Sequences may be included.
본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
As used herein, the term “homology” is intended to indicate a degree of similarity between the amino acid sequence of a wild type polypeptide or a nucleotide sequence encoding the same, and the amino acid sequence or the nucleotide sequence of the present invention and the percentage or more as described above. Include sequences with identical sequences. This homology comparison can be performed by using a comparison program that is easy to see with the naked eye. Commercially available computer programs can calculate the percent homology between two or more sequences, and the percent homology can be calculated for adjacent sequences.
상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 목적 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 목적 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 폴리펩티드 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 목적 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 목적 폴리펩티드의 안정성을 증진하는 방법 또는 폴리펩티드의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. The "intracellular level" refers to the amount present in a cell, which can be controlled by various methods known to those skilled in the art. For example, intracellular levels can be regulated through, but not limited to, regulation at the transcriptional stage or at the post-transcriptional stage. Modulation at the transcriptional stage is a method for enhancing the expression of a gene known to those skilled in the art, for example, a method for enhancing the expression of the gene by preparing a recombinant expression vector linking a target gene or a variant thereof to a promoter or the target gene. Or a method of inserting an expression control sequence such that the expression of the gene is enhanced around the variant thereof. Modulation at the post-transcriptional stage is a method for enhancing polypeptide expression known to those skilled in the art, for example, to enhance the stability of mRNA transcribed into a gene of interest or a variant thereof, to enhance the stability of the polypeptide of interest, or It can be carried out by a method for enhancing the activity of the polypeptide.
바람직하게, 본 발명에서 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포 내 수준 증가는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가를 위해서 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 이를 형질전환함으로써 발현을 증진시킬 수 있다.
Preferably, in the present invention, the increase in the intracellular level of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or a functional equivalent thereof may be performed by a method of increasing the expression of the gene encoding the polypeptide. For this increase, a method known to those skilled in the art can be used. For example, a recombinant expression vector is prepared by linking a gene having a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 to a promoter or a gene encoding a functional equivalent thereof. By transformation, expression can be enhanced.
본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 116,718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, the term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a polypeptide encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in the wild-type form of the cell in either the sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in wild-type cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means. The term "vector" in the present invention is used when referring to DNA fragment (s), nucleic acid molecules that are delivered into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. As used herein, the term “recombinant expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable base sequence necessary for expressing the coding sequence operably linked in a particular host organism. In addition, it may further comprise any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. The recombinant vector is preferably a recombinant plant expression vector. Preferred examples of plant expression vectors are Ti-plasmid vectors which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens, can transfer part of themselves, the so-called T-region, into plant cells. Another type of Ti-plasmid vector (see EP 116,718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which plant cells or new plants can be produced which properly insert hybrid DNA into the genome of the plant. Preferred forms of Ti-plasmid vectors are so-called binary vectors. Other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into the plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors can be advantageous, especially when it is difficult to properly transform a plant host. Suitable recombinant expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control sequences such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, and enhancers (promoter), and are prepared as desired. Can be. The recombinant expression vector also includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable recombinant expression vector, a replication origin. The selection marker is a nucleotide sequence having properties that can be selected by a conventional chemical method, which corresponds to all genes that can distinguish the transformed cells from non-transformed cells. For example, there are herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, chloramphenicol It is not limited to this.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 단자엽 식물용 Maize Ubiquitine promoter이나, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 유전체(genome)을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기, 조건에 목적 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 RD29A 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게, 환경 스트레스 유도성 프로모터, 더 더욱 바람직하게 염 또는 한발 스트레스 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 감자 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. In the recombinant expression vector according to the present invention, the promoter may be a Maize Ubiquitine promoter for monocotyledonous plants, but may be, but is not limited to,
바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 프로모터의 하류에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자의 발현을 가능하게 연결한 것이다.Preferably, the recombinant expression vector provided by the present invention may be capable of linking a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 downstream of a promoter. will be.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 내염성 및 또는 내한발성이 향상된 형질전환체를 제공한다. The present invention provides a transformant having improved salt tolerant and / or cold tolerance transformed with the recombinant expression vector.
본 발명에서의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.Transformation in the present invention can be carried out by a variety of transformation techniques known to those skilled in the art. Preferably microprojectile bombardment, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, PEG-mediated fusion (PEG) mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method), Agrobacteria spraying method (Agrobacteria spraying method) can be used.
또한, 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, transformants include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis, Staphylococcus and Agrobacterium tumefaciens is possible, but is not limited to this.
또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 식물은 콩, 감자, 배추, 무, 고추 등 쌍자엽 식물일 수 있으나, 벼, 밀, 보리, 옥수수 등의 단자엽 식물이 보다 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서 재조합 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 벼 캘러스와 재조합 발현 벡터가 아그로박테리움 투메파시엔스를 공동배양하여 형질전환체를 제작하였다. In addition, the transformant may be a plant or a plant cell, but is not limited thereto. Plants include whole plants, parts of plants, callus, plant tissues, plant cells and plant seeds. The plant may be a dicotyledonous plant such as beans, potatoes, cabbages, radishes, peppers, but more preferably monocotyledonous plants such as rice, wheat, barley, corn, and the like. In one embodiment of the present invention, the recombinant expression vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens, and the rice callus and the recombinant expression vector were co-cultured with Agrobacterium tumefaciens to prepare a transformant.
본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 OsSDT1 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 이를 벼에 형질전환시켜 OsSDT1의 세포내 발현 수준을 증가시켰다. 그리고 OsSDT1의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, OsSDT1의 과발현이 염 및 한발에 대한 저항성을 향상시킴을 확인할 수 있었다.The present inventors prepared a recombinant expression vector comprising the OsSDT1 gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and transformed it into rice to increase the intracellular expression level of OsSDT1. As a result of examining the characteristics of the overexpressing transformant of OsSDT1, it was confirmed that the overexpression of OsSDT1 improved the resistance to salt and drought.
아울러, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공하여, 식물 종자를 수득하기 위한 재배 방법으로는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 사용할 수 있다.
In addition, the present invention provides a plant seed (seed) obtained from the plant, as a cultivation method for obtaining plant seeds can be used a method well known to those skilled in the art.
본 발명에 따른 염 및/또는 한발 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 내염성 및/또는 내한발성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.
Plants transformed with the genes resistant to salt and / or drought stress according to the present invention can be grown into flame-resistant and / or cold-resistant varieties, thereby providing stable agricultural products without being affected by productivity even under sudden climate change such as global warming. This is possible.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 OsSDT1 유전자를 과발현하는 재조합 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 3에 따른 벼 형질전환체의 검정 실험으로 Genomic PCR 이용한 과발현 검정 전기영동 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 벼 형질전환체의 검정 실험으로 RT-PCR을 이용한 과 발현 검정 전기영동 결과이다.
도 4는 염 처리 또는 한발 처리가 형질되기 전의 품종인 동진 벼(흰색 포트의 가운데)와 형질전환체(흰색 포트의 왼쪽 및 오른쪽)의 생육에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 도 4에서 도 4a는 무처리 대조구이며, 도 4b는 한발 처리구의 사진과 한발 처리시 생존 잎 수를 정량화와 수분 상실율의 대표적인 그래프이며, 도 4c는 염 처리구의 사진과 염 처리시 식물체 당 죽은 잎의 비율이다.
도 5는 고 삼투압 스트레스 처리가 본 발명의 형질전환체에 미치는 영향을 평가한 결과이다.1 is a schematic diagram of a recombinant expression vector overexpressing the OsSDT1 gene according to Example 1 of the present invention.
Figure 2 is a result of overexpression assay electrophoresis using Genomic PCR in the assay of the rice transformant according to Example 3 of the present invention.
3 is a result of overexpression assay electrophoresis using RT-PCR in the assay of the rice transformant according to an embodiment of the present invention.
4 is a result of evaluating the effect on the growth of Dongjin rice (middle of white pot) and transformants (left and right side of white pot), which are varieties before salt treatment or drought treatment. 4A to 4A are untreated controls, and FIG. 4B is a representative graph of quantification and water loss rate of the medicated leaves and the number of surviving leaves during drought treatment, and FIG. Ratio.
5 is a result of evaluating the effect of the high osmotic stress treatment on the transformant of the present invention.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred examples and comparative examples are presented to aid in understanding the present invention. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto.
<실시예 1> OsSDT1 과발현 형질전환용 벡터 및 이를 포함한 아그로박테리아의 제작 Example 1 Construction of OsSDT1 Overexpressing Transformation Vector and Agro Bacteria Containing the Same
본 실험에 사용된 벼 품종은 동진벼이며, 멸균된 현미종자는 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)에서 장일조건으로 2주간 생육 하였다. 이들 식물체로부터 Trizol을 이용하여 전 RNA를 분리 후 역전사 효소를 이용하여 5의 RNA로부터 30의 cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA로부터 A30 유전자의 coding 지역은 Forward primer-CACC ATG GTG GAG GTG GGA GGA GGA G, Reverse primer-CCG GTC GAG GGG CTC GGT를 이용하여 PCR을 통하여 중폭되었다. pENTR/D-Topo kit를 이용하여 PCR 산물로 Entry clone이 제작 되였으며, 유전자의 과발현을 위하여 LR 반응에 의하여 ubiquitin promotor를 가지고 박테리아 마커 유전자로서 테트라사이클린을, 식물체 마커 유전자로서 하이그로마이신을 사용할 수 있는 binary vector인 pGA2897 vector로 cloning 되었다. 시퀀싱을 통해 유전자의 삽입과 프레임이 확인된 pGA2897-OsSDT1은 벼형질전환을 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)-LBA4404(마커로 리팜피신과 스트렙토마이신을 가지는 균주)로 먼저 형질 전환되었다. 100㎕의 아그로박테리움에 pGA2897-OsSDT1 DNA를 2㎕넣은 후 얼음에 둔다. 이를 큐벳에 넣은 후 1.25kV의 전기충격을 가한 직후 YEP배지 1ml을 넣어 15ml 튜브로 옮겨 30℃에서 3시간동안 배양한 한다. 배양액 중 300㎕을 테트라사이클린, 리팜피신, 스트렙토마이신이 들어간 YEP배지에 도말하여 하여 일간 30℃에서 키웠다. 이 중 하나의 콜로니를 선별하여 콜로니PCR을 통하여 유전자 삽입을 확인하고 스탁으로 보관하였다.The rice cultivar used in this experiment was Dongjin rice, and the sterilized brown rice seeds were grown for 2 weeks in solid medium (pH5.8) added 1% Sucrose and 0.4% phytagel at 1 / 2MS for 2 weeks. Total RNA was isolated from these plants using Trizol, and then 30 cDNAs were synthesized from 5 RNAs using reverse transcriptase. The coding region of A30 gene from these cDNA was amplified by PCR using Forward primer-CACC ATG GTG GAG GTG GGA GGA GGA G, Reverse primer-CCG GTC GAG GGG CTC GGT. An entry clone was prepared as a PCR product by using the pENTR / D-Topo kit. For overexpression of the gene, tetracycline was used as a bacterial marker gene and hygromycin as a plant marker gene. It was cloned into the pGA2897 vector, which is a binary vector. PGA2897-OsSDT1, whose gene insertion and frame were identified through sequencing, was first transformed into Agrobacterium tumefaciens-LBA4404 (strain with rifampicin and streptomycin as a marker) for rice transformation. 2μl of pGA2897-OsSDT1 DNA is added to 100μl of Agrobacterium and placed on ice. After putting it in a cuvette, immediately after applying 1.25kV electric shock, 1ml of YEP medium was transferred to a 15ml tube and incubated at 30 ° C. for 3 hours. 300 µl of the culture solution was plated on YEP medium containing tetracycline, rifampicin and streptomycin, and grown at 30 ° C for one day. One of these colonies was selected to confirm gene insertion through colony PCR and stored in stock.
실시예 1에서 제조된 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.
A schematic diagram of the vector prepared in Example 1 is shown in FIG. 1.
<실시예 2> 벼 형질전환체의 제작Example 2 Preparation of Rice Transformant
벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% ethanol에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 소독한 용액에서 40분간 소독하였다. 이때 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 사용하는 것이 더 바람직하다. Rice seed used for rice transformation was made from brown rice, peeled. Soybean seeds were soaked in 70% ethanol for 1 minute and then sterilized for 40 minutes in 50% solution. At this time, it is more preferable to use
소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척한다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 한다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만든다 (문헌 [Hiel et al., 1994]). 즉 N6 배지 (Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양온도는 28℃이며 암처리한다.After disinfecting the disinfectant solution, wash the
2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다. Incubated for 5 days at 2N6, the embryo was removed when callus is induced. The drainage was carefully removed using tweezers to prevent the callus from being damaged, and the cotyledons and roots were left intact to prevent the callus from being damaged.
아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD595=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD595=0.01이 되도록 만들었다.Agrobacterium was prepared by inserting the gene of interest, incubated in AB solid medium for 3 days, and then collected in AAM liquid medium to make a suspension. The concentration of the suspension was measured using an absorbance machine. First, the suspension was made to be OD 595 = 0.1, and then diluted 10-fold with AAM to make OD 595 = 0.01.
현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주는 것이 바람직하다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의한다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양하였다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓는다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양 하였다. It is preferable to inoculate Agrobacterium by immersing the callus from which the oil is removed in the suspension for 2 minutes and gently shaking the solution for 2 minutes. At the end of the inoculation, only the suspension was poured from the callus and the filtrate was removed using filter paper. This is a rapid process and care should be taken not to allow the callus to dry too long on filter paper. Callus was co-cultured by transferring to 2N6-AS medium. 2N6-AS medium was adjusted to pH5.2 by adding 10g / L glucose and 100uM acetosyringone to 2N6 medium. Place filter paper one by one on the medium in advance so that the medium is sufficiently infiltrated, and then place the inoculated callus on the filter paper. The filter paper is intended to prevent excessive growth of Agrobacterium during the co-culture and the callus receding. Co-culture was incubated for 7 days at 25 ℃.
공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거 한다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮긴다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2-3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양한다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다. At the end of the coculture, the Agrobacterium, which was responsible for inserting useful genes into the callus, is no longer needed. The washing was performed with a solution containing 500 mg of antibiotic carbenicillin in 1 L of sterile distilled water. After washing the callus about three times, all of the filtrate was removed using a filter paper. When using the Agrobacterium LBA4404 strain, it is more preferable not to perform the above washing operation because no excessive growth of Agrobacterium was achieved during the coculture period. Callus is transferred to 2N6-CH medium in which antibiotics cefotaxime 200mg / L and Hygromycin 40mg / L are added to 2N6 medium. At this time, the cotyledons and roots are removed using tweezers, and the callus is divided into 2-3 pieces so that the contact area with the medium is maximized and cultured. The culture temperature of 28 ℃ was appropriate and incubated for 14 days in the cancer incubator to induce transformed callus.
14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다.
After 14 days, when the transformed callus was split and grown in 2N6-CH medium to which the antibiotic hygromycin was added, it was passaged to MSR medium, which is a regeneration medium capable of inducing chute and root. The distinction of transformed callus was judged by the presence of newly differentiated callus mass, and the browned and dead callus was discarded.
<실시예 3> 벼 형질전환체 검정 및 RT-PCR을 이용한 과발현 검정Example 3 Rice Transformant Assay and Overexpression Assay Using RT-PCR
형질전환체임을 확인하기 위하여 한 달간 키운 벼를 동결건조시켜 파쇄한 후 이로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 Genomic DNA를 분리하였다. Genomic DNA를 이용하여 다음의 하이그로마이신 유전자 프라이머 Forward primer-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC GCG, Reverse primer- CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT로 PCR을 통해 OsSDT1유전자와 함께 삽입된 하이그로마이신 유전자의 삽입을 확인함으로써 OsSDT1 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. 또한, 확인된 벼 형질전환체의 total RNA를 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였고 이 RNA로부터 SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 다음의 OsSDT 유전자 프라이머 Forward primer- CCG TCC ACC TGG TTT GGT CT, Reverse primer- GGC TCG GTT TGG TCC TTG AC와 인터널 컨트롤로서 액틴 유전자 프라이머 Forward primer- TGC TCT GTA CGT CGC CAT CCA G, Reverse primer AAT GAG TAA CCA CGC TCC GTC A로 RT-PCR를 통해 OsSDT1 유전자의 과 발현을 확인하였다. 벼 형질전환체 검정 및 RT-PCR을 이용한 과발현 검정 결과를 각각 도 2 및 3에 나타내었다.
To confirm that the transformants were lyophilized rice cultivated for one month, and then genomic DNA was isolated from the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). The following hygromycin gene primers were identified using genomic DNA. By confirming the insertion was confirmed whether the insertion of the OsSDT1 gene. In addition, the total RNA of the identified rice transformant was isolated using RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), and cDNA was synthesized from the RNA using SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Using the synthesized cDNA, the following OsSDT gene primers Forward primer- CCG TCC ACC TGG TTT GGT CT, Reverse primer- GGC TCG GTT TGG TCC TTG AC Actin gene primer Forward primer- TGC TCT GTA CGT CGC CAT CCA G, Reverse primer AAT GAG TAA CCA CGC TCC GTC A overexpression of OsSDT1 gene was confirmed by RT-PCR. The results of the rice transformant assay and the overexpression assay using RT-PCR are shown in FIGS. 2 and 3, respectively.
<실시예 4> 내한발성 및 내염성 평가Example 4 Evaluation of Cold Resistance and Flame Resistance
과발현 형질전환체의 내한발성 검정을 위하여 4주간 온실에서 생육한 벼에 4일간 물 공급을 중단 후 급수를 재개 후 3주 후의 식물체 생육을 검사하였으며, 과발현 형질전환체의 내염성 검정을 위하여 4주간 온실에서 생육한 벼에 250mM NaCl로 처리하여 8일 후의 식물체 생육을 검정하였다. 그 결과를 도 4에 종합적으로 나타내었다. For the cold-resistance test of overexpressing transformants, the rice grown in the greenhouse for 4 weeks was stopped for 4 days, and the plant growth was examined 3 weeks after the water supply was resumed. For 4 weeks, the plant was tested for flame resistance of the overexpressing transformants. Plant growth after 8 days was assayed by treating with 250 mM NaCl in rice grown at. The results are collectively shown in FIG.
도 4에 나타나는 바와 같이, 한발 조건 및 고염 조건 하에서 과발현체의 생육이 대조구인 동진 벼에 비하여 양호하거나 높은 생존율을 나타내었다. water loss assay는 하이그로마이신 배지에서 선별된 벼 종자들을 토양으로 옮겨 5주간 키운 후 각 과발현체에서 가장 상위의 잎을 잘라 여과지에 놓고 30분 간격으로 7시간 동안 수분 상실률을 소수점 넷째자리 까지 측정하였다. 그래프는 초기 무게에 대한 수분 상실률을 백분율로 표시하였다. 염 처리는 하이그로마이신 배지에서 선별된 형질 전환체들을 대조군인 동진 벼와 함께 흰 사각 포트에 있는 토양으로 옮겨 4주간 키운 후 250mM의 염을 8일간 처리 하였다. 그 후 형질전환체 각각에 대해 하나의 개체에 있는 잎 수에 대한 죽은 잎의 수를 조사함으로서 그래프를 나타내었다. droght 처리 또한 염처리와 같은 방법으로 벼를 키운 후 이를 4일간 가뭄 처리 하였고 다시 물을 주고 23일간 키워 생존한 잎의 수를 조사함으로서 그래프를 나타내었다.
As shown in Figure 4, under the conditions of drought and high salt conditions, the overexpression growth was better or higher than that of the control rice Dongjin rice. In the water loss assay, the rice seeds selected from the hygromycin medium were transferred to the soil, grown for 5 weeks, and the top leaves of each overexpression were cut and placed on a filter paper. . The graph shows the percentage of water loss relative to initial weight. In the salt treatment, the transformants selected from the hygromycin medium were transferred to the soil in the white square pot along with the control of Dongjin rice and grown for 4 weeks, and then treated with 250 mM salt for 8 days. The graph was then shown by examining the number of dead leaves against the number of leaves in one individual for each transformant. Droght treatment also showed the graph by growing the rice by drought treatment in the same way as the salt treatment, drought it for 4 days, watering again and growing for 23 days.
<실시예 5> 고삼투 저항성의 평가Example 5 Evaluation of High Osmotic Resistance
3일간 1/2 MS에서 발아시킨 벼를 고 삼투압 스트레스 처리를 위하여 400mM mannitol이 첨가된 1/2MS media로 옮긴 후 7일간 후 생육 상태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.Rice germinated at 1/2 MS for 3 days was transferred to 1 / 2MS media to which 400 mM mannitol was added for high osmotic stress treatment, and growth state was observed after 7 days, and the results are shown in FIG. 5.
도 5에 나타나는 바와 같이, 동진은 shoot 부위가 죽어가는 것을 볼 수 있으나, 본 발명에 따른 과발현 형질전환체에서는 이러한 모습이 발견되지 않았다. 또한, 고 삼투압 배지에서 과발현 형질전환체의 생육이 증가하는 현상은 보이지 않고, 오히려 억제되는 현상을 보였다.As shown in Figure 5, Dongjin can be seen that the shoot site is dying, this was not found in the overexpressing transformant according to the present invention. In addition, the growth of overexpressing transformants in the high osmotic medium was not seen, but rather suppressed.
<110> Rural development administration <120> Salt and drought stress tolerant gene, OsSDT1 and use thereof <130> P11-141 (2011-00139-10-A) <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 615 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggtggagg tgggaggagg agcggcggag gcggcggcgg ggaggaggtg gcggctggcg 60 gacgagaggt gcgacctgcg cgcggcggag acggagtacg tgaggcggtt ccaccgccac 120 gagccccgcg accaccagtg ctcctccgcc gtcgccaagc acatcaaggc ccccgtccac 180 ctggtttggt ctctggtgag gcgttttgat cagccacagc ttttcaagcc atttgtgagc 240 cggtgtgaga tgaaagggaa cattgagatt ggcagtgtaa gggaggttaa tgttaagtct 300 ggcctgcctg ccacaagaag cactgagagg ctggagctgt tagatgacaa tgagcacata 360 ctcagtgtca ggttcgtggg aggtgatcat aggctcaaga attactcctc catcctgacc 420 gtccacccgg aggtgatcga cggccggccc gggacgctgg tgatcgagtc gttcgtcgtc 480 gacgtcccgg aggggaacac caaggatgag acatgctact tcgtggaggc cctgctgaaa 540 tgcaacctga aatctcttgc agaggtttct gaacgcctgg ttgtcaagga ccaaaccgag 600 cccctcgacc ggtga 615 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Val Glu Val Gly Gly Gly Ala Ala Glu Ala Ala Ala Gly Arg Arg 1 5 10 15 Trp Arg Leu Ala Asp Glu Arg Cys Asp Leu Arg Ala Ala Glu Thr Glu 20 25 30 Tyr Val Arg Arg Phe His Arg His Glu Pro Arg Asp His Gln Cys Ser 35 40 45 Ser Ala Val Ala Lys His Ile Lys Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser 50 55 60 Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Leu Phe Lys Pro Phe Val Ser 65 70 75 80 Arg Cys Glu Met Lys Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ser Val Arg Glu Val 85 90 95 Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu Glu 100 105 110 Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu Ser Val Arg Phe Val Gly Gly 115 120 125 Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Leu Thr Val His Pro Glu 130 135 140 Val Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu Val Ile Glu Ser Phe Val Val 145 150 155 160 Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu 165 170 175 Ala Leu Leu Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Glu Val Ser Glu Arg 180 185 190 Leu Val Val Lys Asp Gln Thr Glu Pro Leu Asp Arg 195 200 <110> Rural development administration <120> Salt and drought stress tolerant gene, OsSDT1 and use <130> P11-141 (2011-00139-10-A) <160> 2 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 615 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggtggagg tgggaggagg agcggcggag gcggcggcgg ggaggaggtg gcggctggcg 60 gacgagaggt gcgacctgcg cgcggcggag acggagtacg tgaggcggtt ccaccgccac 120 gagccccgcg accaccagtg ctcctccgcc gtcgccaagc acatcaaggc ccccgtccac 180 ctggtttggt ctctggtgag gcgttttgat cagccacagc ttttcaagcc atttgtgagc 240 cggtgtgaga tgaaagggaa cattgagatt ggcagtgtaa gggaggttaa tgttaagtct 300 ggcctgcctg ccacaagaag cactgagagg ctggagctgt tagatgacaa tgagcacata 360 ctcagtgtca ggttcgtggg aggtgatcat aggctcaaga attactcctc catcctgacc 420 gtccacccgg aggtgatcga cggccggccc gggacgctgg tgatcgagtc gttcgtcgtc 480 gacgtcccgg aggggaacac caaggatgag acatgctact tcgtggaggc cctgctgaaa 540 tgcaacctga aatctcttgc agaggtttct gaacgcctgg ttgtcaagga ccaaaccgag 600 cccctcgacc ggtga 615 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Val Glu Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Arg Arg 1 5 10 15 Trp Arg Leu Ala Asp Glu Arg Cys Asp Leu Arg Ala Ala Glu Thr Glu 20 25 30 Tyr Val Arg Arg Phe His Arg His Glu Pro Arg Asp His Gln Cys Ser 35 40 45 Ser Ala Val Ala Lys His Ile Lys Ala Pro Val His Leu Val Trp Ser 50 55 60 Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro Gln Leu Phe Lys Pro Phe Val Ser 65 70 75 80 Arg Cys Glu Met Lys Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ser Val Arg Glu Val 85 90 95 Asn Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu Glu 100 105 110 Leu Leu Asp Asp Asn Glu His Ile Leu Ser Val Arg Phe Val Gly Gly 115 120 125 Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Leu Thr Val His Pro Glu 130 135 140 Val Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu Val Ile Glu Ser Phe Val Val 145 150 155 160 Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val Glu 165 170 175 Ala Leu Leu Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Glu Val Ser Glu Arg 180 185 190 Leu Val Val Lys Asp Gln Thr Glu Pro Leu Asp Arg 195 200
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