KR101656233B1 - Use of o s d w 1 gene from oryza sativa as regulator of yield and drought stress - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to uses of an Oryza sativa drought response WD domain 1 (OsDW1) gene derived from Oryza sativa as a regulator of yields and drought stress and, more specifically, to a method for increasing yields of a drought-resistant plant which comprises a step of overexpressing the OsDW1 gene by transforming a recombinant vector containing the Oryza sativa-derived OsDW1 gene into plant cells; to a method for producing the drought-resistant plant with increased yields using the recombinant vector containing the same gene; to the transgenic drought-resistant plant produced by the same method and seeds thereof; and to a composition for increasing yields of the plant containing the Oryza sativa-derived OsDW1 gene and having enhanced drought resistance. According to the present invention, the plant transformed with the Oryza sativa-derived OsDW1 gene is effective in enhancing drought resistance and increasing productivity compared with a wild type plant, thereby being effective in developing plants which can grow strongly even in drought resulting from lack of rainfall and dry condition, increasing production of crops, and being able to be useful in establishment of a platform for developing environmental stress-resistant crops.

Description

벼 유래의 ＯｓＤＷ１ 유전자의 수확량 및 한발 스트레스 조절자로서의 용도{Use of ＯｓＤＷ１ gene from Oryza sativa as regulator of yield and drought stress}The yield of OsDW1 gene derived from rice and its use as a one-way stress regulator [0031] {Use of OsDW1 gene from Oryza sativa as regulator of yield and drought stress}

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래의 OsDW1(Oryza sativa Drought response WD domain 1) 유전자의 수확량 및 한발 스트레스(drought stress) 조절자로서의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벼 유래의 OsDW1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsDW1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 내한발성 식물의 수확량을 증가시키는 방법, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 수확량이 증가된 내한발성 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 내한발성 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsDW1 유전자를 함유하는 내한발성이 증진된 식물체의 수확량 증가용 조성물에 관한 것이다.
The present invention is rice (Oryza sativa) derived OsDW1 (Oryza sativa Drought response WD domain 1) yield and drought stress (drought stress) relates to the use as modulators, more particularly, to overexpress OsDW1 gene by transforming a recombinant vector comprising a OsDW1 gene of rice originating from the plant cell the gene A method for increasing the yield of a cold-tolerant plant including the step of cultivating the plant, a method for producing a cold-tolerant plant having an increased yield using a recombinant vector containing the gene, a cold-resistant transgenic plant produced by the method, And OsDW1 gene derived from rice, and to a composition for increasing the yield of a plant having enhanced cold tolerance.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후 변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간 한해(drought disaster), 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상 재해 면적이 연평균 162.8천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하가 심각한 수준에 이른 것으로 확인되었다.As the population grows, food production continues to be demanded, but agricultural and agricultural land is declining. Korea is in a temperate climate, but due to global climate change, unusual droughts such as drought and high temperature are frequently occurred, and the area of meteorological disasters caused by drought disaster, flood and cold weather over the past 10 years is 162.8 thousand ha , Which corresponds to 8.87% of the total area of 1,836 thousand ha in Korea. Thus, it has been confirmed that agricultural productivity deterioration due to natural disasters has reached a serious level.

고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 한발(가뭄, 건조), 염해, 냉해, 중금속 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인으로 작용하여 수확량에 큰 차이를 가져 오게 되며, 특히 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 식물의 형태학적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등을 야기하여 작물생산 감소를 초래하는 가장 심각한 주요 환경 요인 중 하나로 꼽히고 있다. 식물은 단기적 또는 장기적인 물부족에 대한 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킨다. 이러한 한발 스트레스(drought stress)에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다(Shinozaki & Yamaguchi-shinozaki, 2007, J Exp Bot . 58(2):221-227). 지금까지 한발 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되었으며, 한국등록특허 제1427180호에는 '식물의 가뭄 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCTR1 유전자 및 이의 용도'가, 한국등록특허 제1354035호에는 '식물체의 한발 스트레스 저항성을 증가시키는 OsbHLH148 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있다. Higher plants are unable to migrate, so they face stresses such as diarrhea (drought, dryness), salinity, cold weather, heavy metals and ozone during their lifetime. These abiotic stresses act as a limiting factor for the growth and development of crops, resulting in a large difference in yield. Especially, among these stresses, lack of water is not only a morphological change of the plant but also a decrease of photosynthetic rate and photo respiration rate, And plant hormones, and changes in gene expression, which are considered to be one of the most serious environmental factors that lead to a decrease in crop production. Plants operate a variety of defensive strategies, such as regulating signaling pathways or inducing stress-responsive genes to increase resistance to short- or long-term water shortages. The mechanism of cellular or genetic defense against such drought stress is well known (Shinozaki & Yamaguchi-shinozaki, 2007, J Exp Bot . 58 (2): 221-227). In the Korean Patent No. 1427180, the OsCTR1 gene derived from rice, which increases resistance to drought stress in plants, and its use, and Korean Patent No. 1354035, &Quot; OsbHLH148 gene and its use ", which increases the stress resistance of a plant, is disclosed.

한편, 식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써, 불량환경에서도 작물의 수확량을 향상시키기 위한 내재해성 작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 한국공개특허 제2009-0119884호에는 '향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법'이, 한국공개특허 제2009-0027219호에는 'ＮＡＣ 전사인자의 발현 조절로 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법'이, 그리고 한국등록특허 제1295524호에는 '벼 유래의 dhar 유전자의 수확량 및 환경 스트레스 조절자로서의 용도'가 개시되어 있다.On the other hand, as the development of plant transgenic technology has enabled the expression of foreign genes far away from the flexible relationship, the introduction of genes resistant to poor environments into susceptible plants has led to the development of indigenous crops to improve crop yields in poor environments It is actively being done. Korean Patent Laid-Open No. 2009-0119884 discloses a plant having an improved yield related trait and its preparation method, Korean Patent Publication No. 2009-0027219 discloses a plant having an improved yield related trait by controlling the expression of NAC transcription factor, And Korean Patent No. 1295524 disclose 'yields of dhar genes derived from rice and their use as environmental stress modifiers'.

그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 절실히 요구되고 있다.
Yet, knowledge of the biological functions of stress-related genes involved in stress tolerance and sensitivity in higher plants is still lacking. Therefore, functional studies on stress response genes are urgently needed to increase crop productivity.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 환경 스트레스, 특히 한발 스트레스 하에서도 작물의 수확량을 증가시키기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼 유래의 OsDW1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 벼 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 벼 식물체가 야생형 식물체에 비해 가뭄 저항성 증진에 효과가 있고 매우 우수한 생산성 증대 효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Under these circumstances, the inventors of the present invention have made intensive efforts to develop a method for increasing the yield of crops under environmental stress, particularly, one-shot stress. As a result, they have produced a rice plant transformed with a recombinant vector containing OsDW1 gene derived from rice , The present inventors have completed the present invention by confirming that the transgenic rice plants have an effect of enhancing drought resistance as compared with wild type plants and exhibit a very high productivity increase effect.

본 발명의 목적은 한발 스트레스(drought stress)에 대한 저항성을 증진시켜 수확량이 향상된 작물을 개발하기 위하여, 벼(Oryza sativa) 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsDW1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 내한발성 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.For purposes of the present invention to improve the resistance to drought stress (drought stress) to develop the yield improved crop, rice (Oryza The present invention is to provide a method for increasing the yield of hygroscopic plants including a step of overexpressing the OsDW1 gene by transforming a plant cell with a recombinant vector containing OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from S. sativa .

본 발명의 다른 목적은 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 이용한 수확량이 증가된 내한발성 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 내한발성 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공하기 위한 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing a cold tolerant plant having an increased yield using OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice, a cold tolerant transgenic plant having an increased yield, .

본 발명의 또 다른 목적은 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 함유하는, 내한발성이 증진된 식물체의 수확량 증가용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
Yet another object of the present invention is to provide a composition for increasing the yield of a plant having enhanced cold tolerance, which contains rice-derived OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Oryza sativa Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsDW1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는, 내한발성 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공한다.
As one embodiment for achieving the above object, the present invention provides a rice-derived OsDW1 ( Oryza sativa Drought response WD domain 1) transforming a recombinant vector comprising a gene into a plant cell to over-express the OsDW1 gene.

상기 "OsDW1 유전자"는 876개의 아미노산을 코드하며 N-말단 부위에 WD 도메인(domain)을, C-말단 부위에 카타닌(katanin)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 OsDW1 유전자 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
The "OsDW1 gene" may encode 876 amino acids and may include a WD domain at the N-terminal region and katanin at the C-terminal region, preferably an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 But is not limited to, coding for the protein made. Also, mutants of the OsDW1 gene sequence are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >

본 발명에서 용어 "내한발성(drought resistance)"이란 식물이 한해(drought damage)에 견뎌낼 수 있는 성질, 즉 가뭄을 견디는 성질로서 내건성 또는 한발저항성이라고도 한다.The term " drought resistance "in the present invention refers to a property of a plant to withstand drought damage, that is, a property to withstand drought, which is also referred to as weather resistance or shear resistance.

본 발명의 방법에서, 식물의 수확량 증가는 이삭수(spikelet number) 또는 분얼수(tiller number)의 증가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method of the present invention, the increase in the yield of the plant may be, but is not limited to, an increase in the spikelet number or the tiller number.

상기 식물은 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The plant may be a monocotyledon, preferably rice ( Oryza sativa ) plants.

바람직한 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과(Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과(Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
Preferred monocotyledonous plants are alismataceae (Alismataceae), hydrocharitaceae (Hydrocharitaceae), juncaginaceae (Juncaginaceae), Zhang chaegwa (Scheuchzeriaceae), potamogetonaceae (Potamogetonaceae), Najas graminea and (Najadaceae), zosteraceae (Zosteraceae), lilies (Liliaceae), jimogwa (Haemodoraceae), agave and (Agavaceae), Amaryllidaceae (Amaryllidaceae), magwa (Dioscoreaceae), pontederiaceae (Pontederiaceae), Iridaceae (Iridaceae), Berman excess (Burmanniaceae), rushes and (Juncaceae), commelinaceae (Commelinaceae) , eriocaulaceae (Eriocaulaceae), hwabongwa (Poaceae, Gramineae, Poaceae), Araceae (Araceae), duckweed and (Lemnaceae), Sparganium erectum and (Sparganiaceae), units and (Typhaceae), cyperaceae (cyperaceae), musaceae (Musaceae), may be a ginger (Zingiberaceae), canna (Cannaceae) or Orchidaceae (Orchidaceae), are not limited.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 벼 유래 OsDW1 유전자가 도입된 OsDW1 과발현 형질전환 벼 식물체가 한발 스트레스 하에서 대조 품종인 동진벼에 비해 내한발성이 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 3의 B). In one embodiment of the present invention, the OsDW1 overexpressed transgenic rice plants transfected with the rice-derived OsDW1 gene of the present invention were found to have increased cold tolerance compared to the control varieties of Dongjinbye under one stress (Fig. 3B).

또한, 본 발명의 OsDW1 유전자가 도입된 OsDW1 과발현 형질전환 벼의 이삭 수와 이삭의 무게 및 등숙(곡물이 잘 익은 것)율이 대조 품종인 동진벼에 비하여 현저하게 증가됨을 확인함으로써, 본 발명의 OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼가 매우 우수한 생산성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 7, 도 8 및 표 2).
Further, it was confirmed that the weight and ripeness (grain matured) of the number of eggs and ear of OsDW1 transgenic rice transfected with the OsDW1 gene of the present invention were significantly increased compared with that of Dongjin rice, which is a control strain, It was confirmed that the gene-overexpressing transgenic rice had a very high productivity (Fig. 7, Fig. 8 and Table 2).

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. The term "recombinant" as used herein refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a polypeptide encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments that are not found in the wild-type form of the cells, either in sense or antisense form. In addition, recombinant cells can express genes found in wild-type cells, but these genes have been modified and reintroduced intracellularly by artificial means.

본 발명에서, 상기 OsDW1 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.In the present invention, the OsDW1 gene sequence can be inserted into a recombinant vector. The term "vector" of the present invention is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The recombinant vector means a bacterial plasmid, a phage, a yeast plasmid, a plant cell virus, a mammalian cell viral vector, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used if it can replicate and stabilize within the host. An important characteristic of the expression vector is that it has a replication origin, a promoter, a marker gene and a translation control element.

OsDW1 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.Expression vectors containing the respective sequences of the OsDW1 gene and appropriate transcription / translation control signals can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of the recombinant vector of the present invention is a Ti-plasmid vector capable of transferring a so-called T-region to a plant cell when present in a suitable host, such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences to plant cells or protoplasts in which new plants capable of properly inserting hybrid DNA into the plant's genome can be produced have. A particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and U.S. Patent No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into the plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The recombinant vector may preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, hygromycin, chloramphenicol, G418, Bleomycin, Resistant gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be, but is not limited to, the promoters suitable for transformation, preferably the CaMV 35S promoter, the actin promoter, the ubiquitin promoter, the pEMU promoter, the MAS promoter, the histone promoter or the Clp promoter. The term "promoter" of the present invention means a region above the DNA from the structural gene, and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selectivity.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다. In the recombinant vector of the present invention, a conventional terminator can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, Agrobacterium tumefaciens Octopine gene A phaseoline terminator of Escherichia coli, and an rrnB1 / B2 terminator of Escherichia coli, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for a terminator, it is generally known that the terminator region increases the certainty and efficiency of gene transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. Any host cell known in the art may be used as the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable and prokaryotic cell, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1 , E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus tulifene, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas species And enterobacteria and strains such as the species.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포일 수 있다.
When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae), and the like insect cells, human cells (e.g., CHO cells (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cell may be used. The host cell may preferably be a plant cell.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자 도입에 의해 형질전환된 식물의 내한발성이 증가되고, 상기 내한발성 식물의 수확량이 증가되는 것을 의미한다. The term "transformation" in the present invention means genetically changing the traits of an individual or a cell by DNA, which is a genetic material given from the outside. In the present invention, the term " It means that the cold tolerance of the plant transformed by the introduction of OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice is increased and the yield of the cold tolerant plant is increased.

본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
In the present invention, transformation with the recombinant vector of the present invention can be carried out by a transformation technique known to a person skilled in the art. For example, microprojectile bombardment, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, PEG-mediated fusion PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method), or Agrobacterium sp.) mediated method, and the like, but the present invention is not limited thereto.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 수확량이 증가된 내한발성 식물체의 제조 방법을 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a method for producing a plant cell, which comprises transforming a plant cell with a recombinant vector comprising OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice as shown in SEQ ID NO: 1, Which comprises the step of regenerating a plant having an increased yield.

상기 "서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자"는 전술한 바와 같이, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있고, 상기 단백질은 WD 도메인(domain) 및 카타닌(katanin)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 OsDW1 유전자 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
As described above, the "OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene" of SEQ ID NO: 1 may preferably be a protein coding for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the protein may be WD But are not limited to, a domain and katanin. Also, mutants of the OsDW1 gene sequence are included within the scope of the present invention.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 벼 유래 OsDW1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시킴에 의해 식물의 한발 스트레스에 대한 내성이 대조 품종인 동진벼에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
In one embodiment of the present invention, overexpression of the recombinant vector containing the rice-derived OsDW1 gene of the present invention in plant cells resulted in an increase in tolerance to one-shot stress compared with that of the control variant, 3, B).

본 발명의 식물체의 제조 방법에서, 상기 수확량 증가는 이삭수(spikelet number) 또는 분얼수(tiller number)의 증가일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
In the method for producing a plant of the present invention, the increase in yield may be an increase in spikelet number or tiller number, but is not limited thereto. In addition, the plant may be a monocotyledonous plant, preferably rice ( Oryza sativa ) plants.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 OsDW1 유전자가 도입된 OsDW1 과발현 형질전환 벼의 이삭 수와 이삭의 무게 및 등숙(곡물이 잘 익은 것)율이 대조 품종인 동진벼에 비하여 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다(도 7, 도 8 및 표 2).
In one embodiment of the present invention, the weight and ripening (grain ripe) of the Osadw1 overexpressed transgenic rice plants transfected with the OsDW1 gene of the present invention were significantly increased compared to the control cultivar Dongjinbang (Fig. 7, Fig. 8 and Table 2).

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 미생물에 의해 매개되는 것이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다. 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다.
The method of the present invention comprises transforming a plant cell with a recombinant vector according to the present invention, wherein the transformation is preferably mediated by a microorganism, and the microorganism is Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus The present invention relates to a method for the treatment and / or prophylaxis of a disease or condition selected from the group consisting of subtilis , Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis , Staphylococcus and Agrobacterium tumefaciens ). More preferably, it may be mediated by Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefiaciens).

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens) LBA4404을 사용하였다(실시예 1-2).
Specifically, in one embodiment of the present invention Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefiaciens LBA4404 (Example 1-2).

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.In addition, the method of the present invention comprises regenerating a transgenic plant from the transformed plant cell. Any of the methods known in the art can be used for regeneration of transgenic plants from transgenic plant cells.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
Transformed plant cells must be regenerated into whole plants. Technology for the regeneration of mature plants from callus or protoplast culture are well known in the art for a number of different species (Handbook of Plant Cell Culture , Vol. 1-5, 1983-1989 Momillan, NY).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수확량이 증가된 내한발성 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
In yet another embodiment, the present invention provides a cold-tolerant transgenic plant and seeds thereof produced by the above method with increased yield.

본 발명에서 용어 "식물체"란 식물이 지닌 유형의 몸으로, 본 발명의 형질전환 식물체는 상기 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함한 재조합 벡터를 숙주에 도입함에 의하여 제조된 형질전환 식물의 전체, 식물의 일부, 종자 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있고, WD 도메인(domain) 및 카타닌(katanin)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 OsDW1 유전자 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. In the present invention, the term "plant" refers to a plant type body, and the transgenic plant of the present invention introduces a recombinant vector containing OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice as shown in SEQ ID NO: 1 into the host Plant parts, seeds or plant cells of the transgenic plants produced by the method of the present invention. The gene may preferably encode a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and may include, but is not limited to, the WD domain and katanin. Also, mutants of the OsDW1 gene sequence are included within the scope of the present invention.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 식물의 한발 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 기능을 가지는 형질전환용 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환 식물체를 제조할 경우, 상기 형질전환 식물체는 내한발성이 강하고, 수확량이 증가된 단자엽 식물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이삭 수와 이삭의 무게 및 등숙(곡물이 잘 익은 것)율이 증가된 내한발성 벼(Oryza sativa) 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
A transgenic recombinant vector having the function of increasing the tolerance to the stress of a plant containing OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice of SEQ ID NO: 1 of the present invention is introduced into a host, The transgenic plant may be a monocotyledon having a strong cold tolerance and an increased yield, more preferably a cold tolerant plant which has increased the weight and ripeness of grains (ripe grains) But are not limited to, rice ( Oryza sativa ) plants.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 벼 유래 OsDW1 유전자가 도입된 OsDW1 과발현 형질전환 벼 식물체가 한발 스트레스 하에서 대조 품종인 동진벼에 비해 내한발성이 증가되고(도 3의 B), 이삭 수와 이삭의 무게 및 등숙(곡물이 잘 익은 것)율이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다(도 7, 도 8 및 표 2).
In one embodiment of the present invention, the OsDW1 overexpressed transgenic rice plants transfected with the rice-derived OsDW1 gene of the present invention have increased cold tolerance (Fig. 3B) compared to the control varieties of Dongjin rice under one stress And that the weight and ripeness of grain (grain ripe) were significantly increased (Figs. 7, 8 and Table 2).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 함유하는, 내한발성이 증진된 식물체의 수확량 증가용 조성물을 제공한다. In another embodiment, the present invention provides a composition for increasing the yield of a plant having enhanced cold tolerance, which contains OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice as shown in SEQ ID NO: 1.

상기 유전자는 876개의 아미노산을 코드하며 N-말단 부위에 WD 도메인(domain)을, C-말단 부위에 카타닌(katanin)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 OsDW1 유전자 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. The gene may encode 876 amino acids and may include a WD domain at the N-terminal region and katanin at the C-terminal region, preferably a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 But is not limited to, Also, mutants of the OsDW1 gene sequence are included within the scope of the present invention.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환함으로써 식물체의 한발 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 뿐만 아니라 수확량 또한 증가시킬 수 있는 것이다.
The above composition contains an OsDW1 gene derived from rice as an active ingredient, which is represented by SEQ. ID. NO. 1, and by transforming the gene into a plant, it is possible to increase not only the tolerance to the stress of the plant but also the yield.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsDW1 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 가뭄 저항성 증진에 효과가 있고 매우 우수한 생산성 증대 효과를 나타내므로, 이를 이용하면 강수부족에 따른 가뭄 및 건조 조건에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.
According to the present invention, plants transformed with rice-derived OsDW1 gene are more effective in enhancing drought resistance than wild-type plants and exhibit a very high productivity-enhancing effect. Therefore, when they are used in drought and drying conditions due to lack of precipitation, It is effective for plant development and crop productivity improvement, and it can be useful for building environment stress tolerance crop development platform.

도 1은 본 발명의 OsDW1 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸 도이다. 빨간색은 OsDW1 단백질의 WD 도메인이며, 파란색은 OsDW1 단백질의 katanin 도메인이다.
도 2는 본 발명의 OsDW1 유전자를 과발현하는 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 OsDW1 유전자 도입 과발현 형질전환체의 OsDW1 유전자의 발현 정도를 분석한 결과(A)와 OsDW1 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼의 한발 스트레스에 대한 저항성을 확인한 결과(B)를 나타낸 도이다. 이때, 사용한 대조군은 동진벼이다.
도 4는 다양한 스트레스(앱시스산(ABA, abscisic acid), 만니톨(mannitol), 염(NaCl), 저온(cold))에 대한, 본 발명의 OsDW1 유전자의 시간에 따른 발현 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 5는 벼의 다양한 조직에서 본 발명의 OsDW1 유전자의 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 벼 원형질체를 이용하여 본 발명의 OsDW1 유전자의 세포내 위치를 확인한 결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 7은 GMO 포장에서 본 발명의 OsDW1 형질전환체를 세대진전한 모습(A) 및 본 발명의 OsDW1 과발현 벼(OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-11, OsDW1-22)와 동진벼(대조군)의 농업적 특성을 평가·비교(B)한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 동진벼(대조군)와 본 발명의 OsDW1 과발현 벼(OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-11, OsDW1-22)의 수량 구성 요소를 분석하여 나타낸 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an amino acid sequence encoded by the OsDW1 gene of the present invention. FIG. The red is the WD domain of the OsDW1 protein and the blue is the katanin domain of the OsDW1 protein.
FIG. 2 is a schematic diagram of a recombinant expression vector overexpressing the OsDW1 gene of the present invention. FIG.
FIG. 3 is a graph showing the results (A) of the OsDW1 gene expression of OsDW1 transgenic overexpressed transgenic plants of the present invention and (B) the results of confirming the resistance of rice transgenic plants overexpressing OsDW1 gene to be. At this time, the control group used was Dong Jinbin.
4 is a graph showing an expression pattern of the OsDW1 gene of the present invention over time with respect to various stresses (ABA, abscisic acid, mannitol, salt (NaCl), cold).
FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the expression pattern of the OsDW1 gene of the present invention in various tissues of rice. FIG.
6 is a photomicrograph showing the results of confirming the intracellular position of the OsDW1 gene of the present invention using a rice protoplast.
FIG. 7 is a graph showing the progression of the OsDW1 transformant of the present invention (A) and OsDW1 overexpressed rice (OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-11, OsDW1-22) (B) of the agricultural characteristics of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing the yield components of the OsDW1 overexpressed rice (OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-11, OsDW1-22) of Dongjinbye (control group) and the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 벼 유래  1: derived from rice OsDW1OsDW1 (( OryzaOryza sativasativa DroughtDrought responseresponse WDWD domaindomain 1) 유전자 과발현 벡터 및 형질전환체 제작 1) Generation of gene overexpression vector and transformant

환경 스트레스 하에서 작물의 생산성을 증진시키기 위하여, 단백질 분해기작에 관련된 유비퀴티네이션 E3 효소 기질 수용체(ubiquitination E3 ligase substrate receptor)와 DDB1(DNA damage binding protein 1) 단백질과 결합하는 WD 도메인을 지닌 유전자의 기능을 분석하여 실용성 있는 유전자를 벼에서 개발하고자 벼의 wd 도메인 유전자인, 876개의 아미노산을 코드하며 N-말단 부위에 WD 도메인(domain)을, C-말단 부위에 카타닌(katanin)을 가지는 OsDW1 유전자를 선발하여, 환경 스트레스 하에서도 생산성이 우수한 형질전환 벼를 제조하기 위한 OsDW1 유전자 과발현 벡터를 제작하고, 벼에 상기 벡터를 삽입하여 환경 스트레스 하에서도 생산성이 우수한 형질전환 벼를 제작하였다.
In order to improve crop productivity under environmental stress, the function of the gene having the WD domain binding to the ubiquitination E3 ligase substrate receptor and the DNA damage binding protein 1 (DDB1) protein involved in the proteolytic mechanism (OsDW1 gene) which encodes 876 amino acids of the wd domain gene of rice and has a WD domain at the N-terminal region and katanin at the C-terminal region in order to develop a practical gene in rice , OsDW1 gene overexpression vector for producing transgenic rice having excellent productivity under environmental stress was prepared and transgenic rice having excellent productivity under environmental stress was prepared by inserting the vector into rice.

실시예Example 1-1: 벼 유래  1-1: Origin of rice OsDW1OsDW1 유전자 과발현 벡터 제작 Gene overexpression vector production

OsDW1 유전자(LOC_Os10g35200)가 상시 발현될 수 있도록 유비키틴 프로모터(ubiquitin promoter)의 조절을 받고, 바스타(Basta)로 형질전환체를 선발할 수 있는 벡터 OsDW1/pGA2897를 제작하였다(도 2).A vector OsDW1 / pGA2897, which can regulate the ubiquitin promoter and select transformants with Basta, was constructed to allow the OsDW1 gene (LOC_Os10g35200) to be expressed at all times (FIG. 2).

구체적으로, pGA2897벡터에 OsDW1 유전자를 도입하기 위해 OsDW1 유전자에 대해 특정한 프라이머(OsDW1-1-F: 5'-CAC CAT GGC CAC CAA GCG CGC GTA C-3'(서열번호 3), OsDW1-1-R: 5'-CTA TCT GCT TGT CAG CTG AAA GAT ATC CTG-3'(서열번호 4))를 제작하였다. 동진벼로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하고 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 Qiagen사의 Gel extraction kit를 사용하여 정제하였고, 정제된 PCR 산물은 Invitrogen사의 pENTR-D TOPO 벡터에 서브클로닝(subcloning)하였다. pENTR-D TOPO 벡터에 서브클로닝된 OsDW1 유전자를 식물 형질전환용 벡터인 pGA2897에 도입하기 위해 Invitrogen사의 LR clonase를 이용하여 반응을 수행하였다. 최종적으로 OsDW1 유전자가 pGA2897에 도입됨을 확인하기 위해 pGA2897벡터가 가지고 있는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 및 nosT에 특이적인 프라이머(nosT-F: 5'-GAT GCT CAC CCT GTT GTT TGG TGT-3'(서열번호 5), nosT-R: 5'-TAA TCA TCG CAA GAC CGG CAA CAG-3'(서열번호 6))를 이용하여 시퀀싱을 통해 OsDW1 유전자의 도입 여부를 확인하였다.
Specifically, in order to introduce the OsDW1 gene into the pGA2897 vector, a primer specific to OsDW1 gene (OsDW1-1-F: 5'-CAC CAT GGC CAC CAA GCG CGC GTA C-3 ' R: 5'-CTA TCT GCT TGT CAG CTG AAA GAT ATC CTG-3 '(SEQ ID NO: 4)). PCR was performed using the synthesized cDNA from Dongjinbashi as a template and primers prepared. The PCR product was purified using Qiagen's gel extraction kit and the purified PCR product was subcloned into the pENTR-D TOPO vector from Invitrogen. The OsDW1 gene subcloned into the pENTR-D TOPO vector was reacted with Invitrogen's LR clonase to introduce the gene into pGA2897, a plant transformation vector. Finally, to confirm that the OsDW1 gene was introduced into pGA2897, the ubiquitin promoter and the nosT-specific primer (nosT-F: 5'-GAT GCT CAC CCT GTT GTT TGG TGT-3 ' 5), nosT-R: 5'-TAA TCA TCG CAA GAC CGG CAA CAG-3 '(SEQ ID NO: 6)) was used to confirm the introduction of OsDW1 gene through sequencing.

실시예Example 1-2:  1-2: OsDW1OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체 제작 Generation of overexpressed rice plant transformants

상기 실시예 1-1에서 제작한 OsDW1 유전자 과발현 벡터를 아그로박테리움에 형질전환 한 다음 이를 벼에 형질전환하여 OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체를 제작하였다.The OsDW1 gene overexpression vector prepared in Example 1-1 was transformed into Agrobacterium and then transformed into rice to prepare OsDW1 gene overexpressing rice transformants.

구체적으로, OsDW1 유전자가 상시 발현될 수 있도록 제작한 OsDW1/pGA2897 벡터를 아그로박테리아균(A. tumefaciens LBA4404)에 형질전환하기 위하여 동결과 해동(freeze and thaw)을 2 내지 3번 반복한 후, 37℃의 열 충격(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g/1L)에서 이틀 동안 배양하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO4·7H2O 6g, KCl 3g, CaCl2·2H2O 0.265g, FeSO4·7H2O 50mg/1L, Glucose 5g/1L)에서 배양하였다. Specifically, the OsDW1 / pGA2897 vector prepared so that the OsDW1 gene can be normally expressed was transformed into A. tumefaciens LBA4404), followed by freeze and thaw 2 to 3 times and then transformed by heat shock at 37 ° C. Then, YEP medium (Yeast 10 g, NaCl 5 g, peptone 10 g, Agar 15 g / 1 L) for two days to confirm colonies. Colony transformed by colony PCR was transformed into AB medium (AB buffer (K 2 HPO 4 60 g, NaH 2 PO 4 20 g / 1 L), AB Salts (NH 4 Cl 60 g, MgSO 4 .7H 2 O, 3 g of KCl, 0.265 g of CaCl 2 .2H 2 O, 50 mg / l of FeSO 4 .7H 2 O, and 5 g / l of glucose).

그런 다음 볍씨(동진벼)의 껍질을 벗긴 현미를 70% 에탄올에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 함유한 물에서 40분간 소독하였다. 이때 락스 30 mL당 10 uL 트윈 20을 떨어뜨려 사용하였다. 소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 하였다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만들어 사용하였다(Hiel et al., Plant J., 1994). 즉 N6 배지(Chu et al., Scin Sin, 1975, 18:659-668)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4 g/L와 30 g/L 수크로오스, 0.5 g/L 프롤린(proline), 0.5 g/L 글루타민(glutamine), 0.3 g/L 카사미노산(casamino acids), 0.01 g/L 마이오-이노시톨(myo-inositol), 2 mg/L 2,4-D, 4 g/L 파이타겔(phytagel)이 첨가된 고체 배지(pH 5.8)를 사용하였다. 배양 온도를 28℃로 유지하고 암처리를 하였다. 2N6 배지에서 5일간 배양하고, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하였으며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다. Then, the brown rice, which had been peeled off from rice cedar (Dong Jinbin), was immersed in 70% ethanol for 1 minute and then disinfected in water containing 50% of lactose for 40 minutes. At this time, 10 uL Tween 20 per 30 mL of lactose was used by dropping. After disinfecting all the disinfectants, the rice seeds were washed 5 times with sterilized water. When the disinfectant solution was well washed, the water was removed from the rice seed using a filter paper, and rice seed was applied to the 2N6 medium. At this time, rice seeds were put into the medium to make contact with the medium well, and the seeds were turned upward. The 2N6 medium was used as a medium modified in the literature (Hiel et al., Plant J. , 1994). N6 medium (Chu et al., Scin Sin, 1975, 18: massive elements, trace elements, a mixture 4 g / L and 30 g / L sucrose, 0.5 g / L proline, vitamins of 659-668) (proline), 0.5 g / L glutamine (glutamine) , 0.3 g / L casamino acids, 0.01 g / L myo-inositol, 2 mg / L 2,4-D, 4 g / L phytagel (pH 5.8) was used. The incubation temperature was maintained at 28 占 폚 and treated with cancer. 2N6 medium for 5 days, and when the callus was induced, the endosperm was removed. The endosperm was carefully removed with tweezers to prevent damage to the callus, and cotyledons and roots were left intact to prevent callus from being damaged.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하였으며 먼저 OD595=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD595=0.01이 되도록 만들었다. Agrobacterium was prepared by inserting the desired gene into AB solid medium for 3 days, and then collected in an AAM liquid medium to prepare a suspension. The concentration of the suspension was measured using a light absorptometer. First, OD 595 was adjusted to 0.1 and then diluted 10 times with AAM to obtain OD 595 = 0.01.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하였으며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주었다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버렸으며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하였으며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의하였다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양하였으며, 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L 글루코오스와 100 uM 아세토시린곤(acetosyringone)을 추가하여 만든 배지로서 pH 5.2로 조정하여 사용하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓았다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것으로, 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양을 하였다. The callus, from which the ending oil was removed, was immersed in the suspension for 2 minutes to inoculate Agrobacterium, and the solution was gently shaken for 2 minutes. At the end of the inoculation, only the suspension was discarded in the callus, and the filtrate was removed using filter paper. This work was done quickly and care was taken to ensure that the callus was not overly dried on the filter paper. The callus was transferred to 2N6-AS medium and co-cultured. The 2N6-AS medium was prepared by adding 10 g / L glucose and 100 uM acetosyringone to 2N6 medium and adjusting the pH to 5.2. The filter paper was placed on the medium in advance, so that the media components were sufficiently impregnated, and then the inoculated callus was placed on the filter paper. The filter paper was used to prevent agglutination of callus by overgrowing Agrobacterium during the co-cultivation period, and the co-cultivation was carried out by incubation at 25 ° C for 7 days.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거하였다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 카르베니실린(carbenicillin)을 500 mg을 넣은 용액으로 수행하였으며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 세포탁심(cefotaxime) 200 mg/L, 하이그로마이신(Hygromycin) 40 mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮겼다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하였으며 캘러스는 2 내지 3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양하였다. 배양온도는 28℃로 유지하였으며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다.After co-cultivation, Agrobacterium, which was responsible for inserting useful genes into the callus, was no longer needed and was removed by washing. Washing was performed with 1 L of sterilized distilled water and 500 mg of carbenicillin as an antibiotic. The callus was washed three times and then all of the filtrate was removed using a filter paper. The callus was transferred to 2N6-medium supplemented with 200 mg / L of cefotaxime, 40 mg / L of hygromycin, which is an antibiotic, in 2N6 medium. At this time, cotyledons and roots were removed by using tweezers, and callus was divided into 2 to 3 pieces and cultured by maximizing the contact area with the medium. The incubation temperature was maintained at 28 ° C and the transformed callus was induced by culturing in a cancer incubator for 14 days.

그런 다음, 14일 후에 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다. MSR 재분화 배지에서 성장한 유 식물체는 수도용 상토로 옮겨 온실에서 생육하였다. Then, 14 days later, in the 2N6-CH medium supplemented with the hygromycin, which is an antibiotic, the transformed callus grew while dividing, and subcultured with MSR medium, which is a regeneration medium capable of inducing shoots and roots. The distinction of the transformed callus was judged by the presence of newly differentiated callus masses, and the callus that was killed by the browning was discarded. The seedlings grown in the MSR regeneration medium were transferred to the soil and grown in the greenhouse.

그 결과, OsDW1 유전자가 형질전환된 29종의 클론을 얻었다.
As a result, the OsDW1 gene 29 cloned transformants were obtained.

실시예Example 2:  2: OsDW1OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 분자생물학적 검정 및 내한발성(가뭄 저항성) 검정 Molecular biology and hypothesis testing (drought resistance) of transgenic rice overexpressing genes

상기 실시예 1에서 수득한 OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체에 OsDW1 유전자 과발현 벡터가 삽입되어 상기 유전자가 제대로 발현되고 있는지를 확인하기 위한 분자생물학적 검정 및 상기 벼 형질전환체의 환경 스트레스, 특히 가뭄 스트레스(drought stress)에 대한 저항성 정도를 파악하기 위한 내한발성 검정시험을 실시하였다.
The OsDW1 gene overexpressing vector was inserted into the OsDW1 gene overexpressing rice transgenic vector obtained in Example 1 to confirm whether the gene was properly expressed and the environmental stress of the rice transformant, drought stress test was conducted to determine the degree of resistance to drought stress.

실시예Example 2-1:  2-1: OsDW1OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 삽입 유전자 발현 분석 Analysis of Embryonic Gene Expression in Rice Transgenic Overexpressing Gene

OsDW1 유전자를 삽입하여 과발현시킨 벼 형질전환체를 대상으로 삽입된 OsDW1 유전자의 발현 여부를 확인하고자 동량의 total RNA를 취하여 노던 블랏(Northern blot)을 실시하여 mRNA 전사체(transcript) 발현 정도를 분석하였다To confirm the expression of the inserted OsDW1 gene in rice transgenic plants transfected with the OsDW1 gene overexpressed, the same amount of total RNA was harvested and subjected to northern blotting to analyze the expression level of the mRNA transcript

구체적으로, 동진벼와 OsDW1 과발현 벼 형질전환체로부터 total RNA를 분리하였고, 분리된 RNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량한 후 20 ㎍의 RNA를 1.2% 아가로스 겔(formaldehyde 18.5 ml, 10X Mops buffer 9 ml)상에서 전기영동 하였다. 전기영동한 겔은 멸균수에 30분간 2번, 10X SSC buffer(Tri-sodium citrate 8.8g, NaCl 17.5g/L, pH7 내지 8)에 30분간 1번 세척한 후, 10X SSC 버퍼를 트렌스퍼(transfer) 버퍼로 capillary transfer 방법을 통해 HybondN+ 멤브레인(membrane)으로 옮겼다. 옮긴 RNA는 UV-crosslinker로 멤브레인에 고정시켰고, 65℃에서 15분간 혼성(hybridization) 버퍼(1% BAS, 1mM EDTA, 7% SDS, 0.5M NaHPO4 pH7.2)로 전-혼성 처리를 하였다. 전-혼성 버퍼를 제거한 후, 혼성은 65℃에서 하루 동안 32P로 표지된 OsDW1유전자에 특이적인 프로브(probe)가 포함된 혼성 버퍼에서 수행되었다. 멤브레인은 0.1% SDS가 포함된 2X SSC 버퍼로 65℃에서 10분간 세척하고, 0.1% SDS가 포함된 1X SSC 버퍼로 65℃에서 10분간 2번 반복하여 세척하였다. 세척된 멤브레인은 BAS 필름을 이용하여 1일 감광시킨 후 현상하였다. Specifically, total RNA was isolated from Dongjinbird and OsDW1 overexpressing rice transformants. The separated RNA was quantitated using a spectrophotometer, and then 20 μg of RNA was diluted with 1.2% agarose gel (formaldehyde 18.5 ml, 10 × Mops buffer 9 ml). The electrophoresis gel was washed once in sterilized water for 30 minutes twice for 30 minutes in 10 × SSC buffer (8.8 g of tri-sodium citrate, 17.5 g / L of NaCl, pH 7-8), and then 10 × SSC buffer was added transfer buffer to a HybondN + membrane via a capillary transfer method. The transferred RNA was immobilized on a membrane with a UV-crosslinker and pre-hybridized with hybridization buffer (1% BAS, 1 mM EDTA, 7% SDS, 0.5 M NaHPO 4, pH 7.2) for 15 min at 65 ° C. After removal of the pre-hybrid buffer, hybridization was performed in hybrid buffer containing a probe specific for the OsDW1 gene labeled at 32 ° C for one day at 65 ° C. The membrane was washed with 2X SSC buffer containing 0.1% SDS for 10 minutes at 65 ° C and washed twice with 1X SSC buffer containing 0.1% SDS at 65 ° C for 10 minutes. The washed membrane was developed for 1 day by BAS film.

그 결과, 대조군인 동진벼에 비해 OsDW1 유전자가 형질전환된 벼 식물체에서 OsDW1 유전자가 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었으며, 특히 #1 및 #16 라인에서 OsDW1 유전자의 발현량이 높은 것을 확인하였다(도 3의 A)
As a result, it was confirmed that the OsDW1 gene was stably expressed in the rice plants transformed with the OsDW1 gene as compared with the control group, Dongjinbye. In particular, it was confirmed that OsDW1 gene expression was high in lines # 1 and # 16 )

실시예Example 2-2:  2-2: OsDW1OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 내한발성(가뭄 저항성) 검정 Hygroscopicity (resistance to drought) of transgenic rice overexpressing genes

비생물학적 스트레스 중 하나인 한발 스트레스(drought stress)에 대한 OsDW1 과발현 벼 형질전환체의 표현형을 조사하고자, OsDW1 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체의 유묘를 이용하여 한발 스트레스에 대한 내한발성 검정시험을 실시하였다. To investigate the phenotypes of OsDW1 overexpressing rice transgenic plants against drought stress, one of the abiotic stresses, we conducted a cold tolerance test on the one-shot stress using seedlings of OsDW1 transgenic overexpressed rice transgenic plants .

구체적으로, OsDW1 과발현 형질전환 벼를 하이그로마이신(hygromycin)이 첨가된 배지에서 34일간 배양하여 하이그로마이신에 저항성을 보이는 개체들을 선별하였고 선별된 개체들만을 대상으로 이식(transplanting)을 실시하였다. 온실조건에서 OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼 OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-10, OsDW1-11, OsDW1-20, OsDW1-22 및 OsDW1-30 라인 및 대조군인 동진벼를 4주간 키운 후 가뭄 저항성을 조사하였다. Specifically, OsDW1 overexpressed transgenic rice plants were cultured in medium supplemented with hygromycin for 34 days to select hygromycin resistant individuals, and transplantation was performed on selected individuals only. OsdW1-1, OsDW1-4, OsDW1-10, OsDW1-11, OsDW1-20, OsDW1-22, OsDW1-30 lines and control group, Dongjinbyeon were grown for 4 weeks in the greenhouse condition and examined for drought resistance Respectively.

그 결과, OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼 OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-10, OsDW1-11, OsDW1-20, OsDW1-22 및 OsDW1-30 라인에서 가뭄 저항성이 대조군인 동진벼에 비해 높게 나타났다. 또한 대조군과 OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 외형적인 농업적 특성들은 거의 유사하게 나타났으며 잎의 형태와 크기도 거의 유사함을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
As a result, the resistance to drought in OsDW1-1, OsDW1-4, OsDW1-10, OsDW1-11, OsDW1-20, OsDW1-22 and OsDW1-30 lines over OsDW1 transgenic rice transgenic rice lines was higher than that of Dongjinbang, which is the control group. In addition, the agricultural characteristics of the control and OsDW1 gene overexpressing rice plants were almost similar, and the leaf shape and size were almost similar (FIG. 3B).

실시예Example 3: 다양한 스트레스에 대한  3: for various stresses OsDW1OsDW1 유전자의 발현 패턴 분석 Analysis of expression patterns of genes

OsDW1 유저자 발현이 다양한 환경 스트레스 처리에 반응하는 정도를 분석하기 위해 식물체에 생물학적 및 비생물학적 스트레스인 앱시스산(100 μM ABA, abscisic acid), 만니톨(200 mM mannitol), 염(150 mM NaCl) 및 저온(4℃, cold) 처리 후 0, 3, 6, 12, 24, 48인 시간대별로 샘플링을 하였다. (100 μM ABA, abscisic acid), mannitol (200 mM mannitol), salt (150 mM NaCl), and saline were added to the plants to analyze the extent to which OsDW1 user expression responded to various environmental stress treatments Sampling was performed at 0, 3, 6, 12, 24, and 48 hours after cold (4 ℃, cold) treatment.

다양한 스트레스가 처리된 샘플로부터 분리된 RNA를 이용하여 Clontech사의 cDNA EcoDry Premix kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고, OsDW1 유전자에 대해 특이적인 프라이머(OsDW1-2-F: 5'-ACT CTC AAT GCC TGC TTC AA-3'(서열번호 7), OsDW1-2-R: 5'-AAT CTG TCT GCC TCT TCT GG-3'(서열번호 8)) 및 내재 유전자 대조군인 유비퀴틴5(ubiquitin5)에 특이적인 프라이머(Ubi5-1-F: 5'-CGC CGT GCT CCA GTT CTA CAA GG-3'(서열번호 9), Ubi5-1-R: 5'-TCC TTC CTT ACT TCC GCC CCC A-3'(서열번호 10))를 사용하여 Real Time-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 시킨 후, 95℃에서 10초, 58℃에서 20초, 72℃에서 30초의 반응 시간을 주어 총 40 사이클(cycle)을 반복하고 마지막으로 변성곡선(melting curve) 분석을 위해 65℃ 내지 95℃에서 반응시켰다. 데이터 분석은 상대정량 방법에 기초하였고, Bio-Rad사의 MyiQ real time-PCR로 Ct 값을 산출하였으며, 내재 유전자 대조군(endogenous control)인 유비퀴틴5(ubiquitin5)를 이용하여 ΔCt값을 구하고 이를 통해 데이터를 분석하였다. CDNAs were synthesized using Clontech cDNA EcoDry Premix kit using RNA isolated from various stressed samples. Using the synthesized cDNA as a template, a primer (OsDW1-2-F: 5'-ACT CTC AAT GCC TGC TTC AA-3 '(SEQ ID NO: 7), OsDW1-2-R: 5'- (Ubi5-1-F: 5'-CGC CGT GCT CCA GTT CTA CAA GG-3 '(SEQ ID NO: 8) specific to AAT CTG TCT GCC TCT TCT GG- (SEQ ID NO: 9), Ubi5-1-R: 5'-TCC TTC CTT ACT TCC GCC CCC A-3 '(SEQ ID NO: 10)). The PCR conditions were denaturation at 95 ° C. for 2 minutes and then a total of 40 cycles were repeated at 95 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. Finally, the denaturation curve melting curve analysis at < RTI ID = 0.0 > 65 C < / RTI > Data analysis was based on the relative quantification method and Ct value was calculated by MyiQ real time-PCR from Bio-Rad, and the ΔCt value was obtained by using the endogenous control ubiquitin 5 (ubiquitin 5) Respectively.

분석 결과, 다양한 스트레스 처리에 대한 OsDW1 유전자의 특이적인 발현 유도는 관찰되지 않았으나, 앱시스산(ABA), 만니톨(mannitol) 및 염(NaCl) 처리 후 3시간대에서 OsDW1 유전자의 발현이 무처리(0시간대)에 비해 다소 증가됨을 확인할 수 있었다(도 4).
The expression of OsDW1 gene was not observed in various stress treatments, but the expression of OsDW1 gene was not treated in the 3 hours after treatment with abscisic acid (ABA), mannitol and salt (NaCl) ) (Fig. 4).

실시예Example 4:  4: OsDW1OsDW1 유전자의 조직별 발현 특성 분석 Characterization of gene expression by tissue

OsDW1 유전자의 조직별 발현 패턴을 분석하기 위하여 벼의 잎 초(Sheath), 잎 몸(Blade), 마디(Node), 분얼(Tiller), 꽃(Flower) 및 뿌리(Root) 조직으로부터 total RNA를 분리하였다.To analyze the expression patterns of the OsDW1 gene, total RNA was isolated from rice sheath, Blade, Node, Tiller, Flower and Root tissues. Respectively.

구체적으로, 각 기관으로부터 분리된 RNA를 이용하여 Clontech사의 cDNA EcoDry Premix kit를 이용하여 cDNA을 합성하였다. 각 기관별로 합성된 cDNA을 주형으로 하고, OsDW1 유전자에 대해 특이적인 프라이머(OsDW1-3-F: 5'-CAC GGC GGA TTG ATG TGC TTA-3'(서열번호 11), OsDW1-3-R: 5'-CCA CGA CCC ATA TTC CAG CAC-3'(서열번호 12)) 및 내재 유전자 대조군인 유비퀴틴5(ubiquitin5)에 특이적인 프라이머(Ubi5-2-F: 5'-CCT CGG ACA CCA TCG ACA ACG TG-3'(서열번호 13), Ubi5-2-R: 5'-CGC CCC CAA AGA ACA GGA GCC TA-3'(서열번호 14))를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응 시간을 주어 총 28 사이클(cycle)을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 반응된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 발현 여부를 확인하였다. Specifically, cDNA was synthesized using Clontech cDNA EcoDry Premix kit using RNA isolated from each organ. (OsDW1-3-F: 5'-CAC GGC GGA TTG ATG TGC TTA-3 '(SEQ ID NO: 11) and OsDW1-3-R: (Ubi5-2-F: 5'-CCT CGG ACA CCA TCG ACA ACG (SEQ ID NO: 12)) specific for the ubiquitin 5 that is an internal gene control and 5'-CCA CGA CCC ATA TTC CAG CAC- TG-3 '(SEQ ID NO: 13), Ubi5-2-R: 5'-CGC CCC CAA AGA ACA GGA GCC TA-3' (SEQ ID NO: 14)). The PCR conditions were denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by a total of 28 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and finally at 72 ° C The reaction was carried out for 10 minutes. The PCR products were analyzed by electrophoresis on 0.8% agarose gel.

그 결과, 벼의 잎 초(Sheath), 잎 몸(Blade), 마디(Node), 분얼(Tiller), 꽃(Flower) 및 뿌리(Root) 조직에서 OsDW1 유전자가 발현됨을 확인하였다(도 5).
As a result, it was confirmed that the OsDW1 gene was expressed in rice sheath, blade, node, tiller, flower and root tissues (FIG. 5).

실시예Example 5:  5: OsDW1OsDW1 유전자의  Gene 세포내Intracellular 발현 위치 분석 Analysis of expression position

OsDW1 단백질의 세포내 발현 위치를 조사하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 형질전환 방법(Jin et al, 2001, Plant Cell, 146: 623-635)을 이용하여 벼 원형질체에 녹색형광단백질(GFP, green fluorescent protein)을 도입하여 OsDW1 유전자의 세포 내 발현 위치를 분석하였다.Transformation method using polyethylene glycol (PEG) to investigate the intracellular expression position of OsDW1 protein (Jin et al , 2001, Plant Cell , 146: 623-635) was used to introduce the green fluorescent protein (GFP) into the protoplasm of rice, and the expression position of the OsDW1 gene in the cell was analyzed.

구체적으로, 종결 코돈이 없는 OsDW1 cDNA 단편의 코딩 서열을 중합효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction)으로 증폭한 후, 이를 pMDC83-GFP 벡터의 GFP 코딩 영역의 N 말단 바로 앞에 삽입되도록 하여 GFP 융합물을 제작하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 2분간 변성(denaturation)시킨 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분의 반응 시간을 주어 총 30 사이클(cycle)을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시키는 조건으로 수행하였으며, OsDW1 유전자에 대해 특이적인 프라이머(OsDW1-1-F: 5'-CAC CAT GGC CAC CAA GCG CGC GTA C-3'(서열번호 3), OsDW1-4-R: 5'-TCT GCT TGT CAG CTG AAA GAT ATC CTG-3'(서열번호 15))를 이용하여 수행하였다.Specifically, the coding sequence of the OsDW1 cDNA fragment without the termination codon was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into the GFP coding region immediately before the N-terminus of the pMDC83-GFP vector to obtain a GFP fusion product Respectively. At this time, the PCR reaction was denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of reaction at 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, (OsDW1-1-F: 5'-CAC CAT GGC CAC CAA GCG CGC GTA C-3 '(SEQ ID NO: 3), OsDW1-4 -R: 5'-TCT GCT TGT CAG CTG AAA GAT ATC CTG-3 '(SEQ ID NO: 15)).

다음으로, 원형질체 분리를 위해 표면 살균된 벼 종자를 1/2MS 배지(MS 염(salt) 2.2g, 수크로오스(sucrose) 0.4g, 0.4% 피타겔(phytagel), pH5.8)에서 7일 동안 28℃에서 암조건으로 배양한 후, 2일 동안 28℃의 동일한 온도 조건에서 명배양 하였다. 상기 조건으로 배양된 식물체를 잘게 썬 후, 효소액(enzyme solution; 1.5% 셀룰로오스(cellulose) R-10, 0.75% 마세로자임(macerozyme) R-10, 500mM 만니톨(mannitol), 3.4mM 염화칼슘(CaCl2), 5mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 우혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin), 10mM MES(2-(N-Morpholino)-ethanesulfonic acid), pH5.6)에 넣고 4시간 동안 처리하여 원형질체를 분리하였다. Next, the surface-sterilized rice seeds for 28 days for 28 days were cultured in 1 / 2MS medium (2.2 g MS salt, 0.4 g sucrose, 0.4% phytagel, pH 5.8) for 7 days for protoplast isolation. And incubated at 28 ℃ for 2 days. Plants cultivated under the above conditions were finely chopped and then the enzyme solution (1.5% cellulose R-10, 0.75% macerozyme R-10, 500 mM mannitol, 3.4 mM calcium chloride (CaCl 2 ), 5 mM? -Mercaptoethanol, 1% bovine serum albumin, 10 mM MES (2- (N-Morpholino) -ethanesulfonic acid), pH 5.6) Lt; / RTI > to isolate the protoplasts.

상기 제작한 GFP 구축물(15㎍)은 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 이용한 형질전환 방법을 이용하여 벼 원형질체에 도입하였고, 벼 원형질체에 도입된 GFP 형광은 Zeiss AxioCam MRC CCD 카메라(camera)를 이용하여 관찰하였다. The GFP construct (15 μg) was introduced into a rice protoplast using a transformation method using polyethylene glycol (PEG), and the GFP fluorescence introduced into the rice protoplasm was observed using a Zeiss AxioCam MRC CCD camera .

이에 따라, 벼 원형질체를 이용하여 OsDW1 유전자에 대한 세포내 위치조사를 수행한 결과, OsDW1 유전자가 핵에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다(도 6).
As a result, an intracellular location of the OsDW1 gene was examined using the rice protoplasm, and it was confirmed that the OsDW1 gene was located in the nucleus (FIG. 6).

실시예Example 6:  6: OsDW1OsDW1 유전자에 의해 조절되는 하위 유전자의 발현 양상 분석 Analysis of gene expression-regulated sub-genes

OsDW1 유전자 과발현 벼 형질전환체에서 OsDW1 유전자에 의해 조절되는 하위 유전자의 발현 양상을 탐색하기 위해 건조 처리된 동진벼와 OsDW1 유전자 과발현 형질전환체로부터 mRNA를 분리하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 실시하였다. To investigate the expression pattern of OsDW1 gene - regulated sub - genes in OsDW1 - overexpressing rice transgenic plants, mRNA was isolated from dried transformed Dong - Jin - jin and OsDW1 gene - over transformants and microarray analysis was performed.

구체적으로, 대조군인 동진벼와 OsDW1 유전자 과발현 형질전환체로부터 RNA 분리하고 분리된 RNA를 이용하여 Invitrogen사의 Superscript Double-Stranded cDNA Synthesis kit을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 이중 가닥(double-stranded)의 cDNA는 Qiagen사의 MinElute Reaction Cleanup kit를 이용하여 정제하였다. 정제된 이중 가닥의 cDNA는 Sigma-Aldrich사의 Cy3-9mer 프라이머(primer)와 반응시켜 Cy3-labeled DNA 단편(fragment)을 합성하였다. 합성된 Cy3-labeled DNA 단편은 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량한 후, 10㎍의 DNA를 마이크로어레이(135K 3'-tilling Microarray) 혼성(hybridization)에 사용하였다. 혼성은 Biomicro사의 MAUI 챔버(chamber)를 이용하여 42℃에서 16 내지 18시간 수행되었다. 혼성 반응 후 마이크로어레이는 Nimblegen사의 세척 버퍼(wash buffer)로 세척하였고, 세척 후 500g에서 1분 동안 원심분리를 이용하여 건조하였다. 건조된 마이크로어레이는 Axon사의 GenePix scanner 4000B를 이용하여 스캔하였으며, 데이터(data)는 NimbleScan v2.5 소프트웨어(software)를 이용하여 분석하였다. Specifically, cDNA was synthesized using Invitrogen's Superscript Double-Stranded cDNA synthesis kit using RNA isolated from Dongjinbio and OsDW1 overexpressed transformants. The synthesized double-stranded cDNA was purified using Qiagen's MinElute Reaction Cleanup kit. The purified double-stranded cDNA was reacted with a Cy3-9mer primer from Sigma-Aldrich to synthesize a Cy3-labeled DNA fragment. The synthesized Cy3-labeled DNA fragment was quantitated using a spectrophotometer, and 10 μg of DNA was used for hybridization in a microarray (135K 3'-tilling Microarray). Hybridization was carried out at 42 캜 for 16-18 hours using a MAUI chamber of Biomicro. After hybridization, the microarray was washed with Nimblegen's wash buffer, and then washed and centrifuged at 500 g for 1 minute. The dried microarray was scanned using Axon's GenePix scanner 4000B and the data was analyzed using NimbleScan v2.5 software.

분석 결과, OsDW1 유전자 과발현 형질전환체에서 일부 스트레스에 관련되어 있는 유전자의 발현이 대조군인 동진벼에 비해 2배 이상 증가됨을 확인할 수 있었다(표 1).
As a result of the analysis, it was confirmed that the expression of genes related to some stress in the OsDW1 gene-overexpressing transformant was more than twice as much as that of the control group, Dongjinbyeong (Table 1).

Figure 112015026334457-pat00001
Figure 112015026334457-pat00001

실시예Example 7:  7: OsDW1OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼의 농업적 특성 평가 Evaluation of Agricultural Characteristics of Transgenic Transgenic Rice

OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼의 우수성을 검정하기 위하여, 생산성 검정 실험을 수행하였다.In order to test the superiority of transgenic rice transgenic overexpressing OsDW1 gene, a productivity test was conducted.

구체적으로, OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼의 수량 구성요소를 분석하기 위해 T3 세대의 4개의 독립적인 OsDW1 과발현 형질전환 벼 및 대조군인 동진벼를 대상으로 서울대학교 GMO 격리 포장(경기도 수원 소재)에서 농업적 특성을 조사하였다. 상기 T3 세대의 4개의 독립적인 OsDW1 과발현 형질전환체 라인(line)들은 하이크로마이신(40㎍/ml)이 첨가된 배지에서 항생제 발아테스트를 거친 후 라인 당 20개의 식물체를 선발하였다. 상기 선발한 식물체를 3주 동안 모내기용 포트에 이식하여 온실조건에서 생장을 유도하였다. 이들 식물체 중에서 다시 최종적으로 10개의 식물체를 선별하여 GMO 격리포장(8m×10m)에 이식 후 재배하였다. 약 130일 후에 식물체들의 성숙이 이루어지고 알곡이 익었을 때, OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼와 대조군인 동진벼의 식물체 수확이 이루어졌다. 대조군인 동진벼를 포함하여 4개의 과발현 형질전환체 라인 당 8개의 독립적인 식물체들을 수확하였고 각각의 식물체들을 대상으로 식물체의 길이, 이삭의 무게, 이삭의 길이, 식물체 당 이삭의 수, 이삭 당 알곡의 수, 식물체 당 총 알곡의 수, 등숙율 등의 수량 구성요소 분석을 실시하였다.Specifically, in order to analyze the yield components of OsDW1 transgenic transgenic rice, four independent OsDW1 overexpressed transgenic rice plants of T 3 generation and Dongjinbyeo, a control group, were cultivated in Seoul National University GMO isolation packaging (Suwon, Gyeonggi Province) Characteristics were investigated. Four independent OsDW1 over-transfectant lines of the T 3 generation were tested for antibiotic germination in a medium supplemented with hiochromycin (40 μg / ml) and then 20 plants per line were selected. The selected plants were transplanted into a pot for 3 weeks to induce growth under greenhouse conditions. Finally, 10 plants were finally selected from these plants and transplanted into GMO isolation packages (8m × 10m). After about 130 days of maturation and ripeness of the plants, OsDW1 gene transgenic rice plants and control plants, Dongjinbyeon, were harvested. Eight independent plants were harvested per line of four overexpressed transgenic lines, including the control group, Dongjinbei. The length of each plant, the weight of the ears, the length of the ears, the number of ears per plant, Number of total grain per plant, maturation rate, etc.

그 결과, OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼는 키와 이삭 길이에 대해서는 대조 품종인 동진벼와 유의적인 차이가 없었으나, 이삭수와 이삭의 무게 및 등숙율이 대조군인 동진벼에 비하여 현저하게 증가되었으므로 수량이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 7, 도 8 및 표 2).
As a result, the transgenic rice transgenic overexpressing OsDW1 gene showed no significant difference in height and length between Dongjinbyeon, the control cultivar, but the weight and maturity ratio of rice and ear were significantly increased compared with Dongjinbyeon, which is the control, (Fig. 7, Fig. 8 and Table 2).

Figure 112015026334457-pat00002
Figure 112015026334457-pat00002

이를 통해, 본 발명의 OsDW1 유전자 과발현 형질전환 벼는 매우 우수한 생산성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
As a result, it was found that the OsDW1 gene-overexpressing transgenic rice of the present invention had excellent productivity.

LB: left T-DNA border
T7 T: T7 terminator
Hg: hygromycin
35S Pro: Cauliflower Mosaic Virus(CaMV) 35S promotor
pUbi: Ubiquitin promotor
OsDW1: Oryza sativa Drought response WD domain 1 gene
nosT: nopaline synthase terminator
RB: right T-DNA borderLB: left T-DNA border
T7 T: T7 terminator
Hg: hygromycin
35S Pro: Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promotor
pUbi: Ubiquitin promotor
OsDW1: Oryza sativa Drought response WD domain 1 gene
nosT: nopaline synthase terminator
RB: right T-DNA border

<110> Republic of Korea <120> Use of OsDW1 gene from Oryza sativa as regulator of yield and drought stress <130> P15R12D0166 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2628 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1 gene sequence <400> 1 atggccacca agcgcgcgta caagctccag gagtttgttg cgcatgcttc cgatgtcaac 60 tgtgccaagt ttgggaggaa gacatcaaga atcctcatca ctggtgagga ggaccaaaag 120 gtcaatcttt gggccatagg gaaacccagt tccatcttga gcctgtcagg ccttacgagt 180 ccagttgagt cagtgagctt tgactcatct gaagctatga taggtgctgg agcatcaagt 240 gggacaataa agatatggga tgtagatgaa gcaaaagtcg ctcgtacttt tactggacat 300 agatcgagtt gtgcgtccct tgatttccat ccttttggag aattcttcgc ttctgggtct 360 tcagacacta acatgaaaat atgggatatg cggaaaaagg gatgcattca cacatataaa 420 ggtcacacac ggcggattga tgtgcttaga ttcactcctg atggccggtg gattgtctct 480 ggtggatctg ataactctgt aaagatctgg gatttgacag ctggaaagct cttgcatgac 540 tttaggaatc atgaaggccc aattaactgc ttagattttc acccccatga gttcttattg 600 gctacaggtt cagctgataa gacagttaag ttttgggacc ttgaaacttt tgagttgatt 660 ggttcttctg gacctgagaa tagccgggaa tactttgtgc cagctagtgt agttcggtct 720 atgacattca acaaagatgg taaatcactt ttttgcggat tacatgaaag tttgaaggtt 780 ctttcctggg aacccatcat atgccatgat gtggttgatg ttggctggtc cacattaggg 840 gatctaattg ttcatgaggg aaaacttctt ggttgctcat ataaccagag ttgtgctgga 900 atatgggtcg tggacttgat gaaaattgaa ccgtatgctg ttagcattgc tgaagcacat 960 ttgaatgaaa gcgtaaataa gtcaatacag gctgataata gcatatcatc agtgttggga 1020 aggttatcag tttccagaag cccagccaag gaagcatctt ccgatacttt gcttaaactc 1080 tcaatgcctg cttcaaaaga agttcctgtt ccagcttctt ctgcagtgac aaagaaacta 1140 ccaaaagaac ctacaacaag caatattcgg ctcacaagat ctgattctct accagttgtt 1200 tctcctaggg ttagattgaa cccaaagttc tctgatgacc agaagaggca gacagattat 1260 gctgtgccta taacaactcc aagaattcgc tccaaagtgg atctctctat aggtgctaga 1320 gcattccatc gtaactcagt accatcggtt gctcccacaa atagatccag gtccaaaata 1380 tctgcatata gtagtgaagg atcgtcgttc atccctgttg ttgtccctag gcatatccct 1440 aaagtggatt ctggtcccaa tctcagtaaa gttctcacta ctgatttaac aattgtcgag 1500 cctcaagaca tagaacgagg tggtctggct gtggattgtg gagaagatga taaattggtg 1560 tgtgtgattg attcaaggag ctcaaatatg ggtgtacaaa atggccgtag aagaaaagcc 1620 ggtgatatta ttacacataa agaaacccca gagactgctt tgacagttaa tatggatcgt 1680 gacttcagaa gaaaggctcc tgaaactgaa agtatgcaac aggacatatt tcattcagag 1740 cccattagtt caaaatgtaa atatattaaa gaaacttcag gtgctggaga cattaacttg 1800 tctgggtcag ccattactga aagtgtcaag tctaatgaag gtggtgactg gtataatgca 1860 tcttcttttg taaaaccaaa tttgactgtt ggaaggaatc cagagacttc atacatcaac 1920 agaagaacaa tgtttggatt gagacattca acggattcaa gtgaaaaaca cgctgttgaa 1980 catgggcctt ccaatttgtc tgcaagttat gagagaaatc agtatgcacc aacactacat 2040 aacttgagga ggcgctcttc ggttgctaga gaacagagtg catcagctgg tgatgaagat 2100 gatattgctg atctgatgga aaaccatcaa gaattcattc atgcagtgaa gtctcggcta 2160 acaaaactag aggtggttta caggtgttgg cacaataacg atgtaaaggg atctattgat 2220 gctacacgca ggattcagga tcttgatgtt accgccgata taattagtgt tctgatggag 2280 aatgataatt ctatcacact agatatttgt acttgtgtct tacctcttgc ctccagtgtt 2340 cttgaaaaaa gcagctatga caggcacctg aaagttgcct tggagatgat ccttaagctt 2400 gtgaaaagct ttggttctac aatatcttca gctgtgtcat ctactccacc agttggtgta 2460 gacattgagg cagaacagag gctcaatcgg tgcaatttgt gctttctaga gctgataaaa 2520 gttcacagcg ttctctttgc cctgacacgg cggcaaggcg aggttggaag atctgcacag 2580 gagctaagcc tctttcttca ggatatcttt cagctgacaa gcagatag 2628 <210> 2 <211> 875 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1 amino acid sequence <400> 2 Met Ala Thr Lys Arg Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Phe Val Ala His Ala 1 5 10 15 Ser Asp Val Asn Cys Ala Lys Phe Gly Arg Lys Thr Ser Arg Ile Leu 20 25 30 Ile Thr Gly Glu Glu Asp Gln Lys Val Asn Leu Trp Ala Ile Gly Lys 35 40 45 Pro Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ser Gly Leu Thr Ser Pro Val Glu Ser 50 55 60 Val Ser Phe Asp Ser Ser Glu Ala Met Ile Gly Ala Gly Ala Ser Ser 65 70 75 80 Gly Thr Ile Lys Ile Trp Asp Val Asp Glu Ala Lys Val Ala Arg Thr 85 90 95 Phe Thr Gly His Arg Ser Ser Cys Ala Ser Leu Asp Phe His Pro Phe 100 105 110 Gly Glu Phe Phe Ala Ser Gly Ser Ser Asp Thr Asn Met Lys Ile Trp 115 120 125 Asp Met Arg Lys Lys Gly Cys Ile His Thr Tyr Lys Gly His Thr Arg 130 135 140 Arg Ile Asp Val Leu Arg Phe Thr Pro Asp Gly Arg Trp Ile Val Ser 145 150 155 160 Gly Gly Ser Asp Asn Ser Val Lys Ile Trp Asp Leu Thr Ala Gly Lys 165 170 175 Leu Leu His Asp Phe Arg Asn His Glu Gly Pro Ile Asn Cys Leu Asp 180 185 190 Phe His Pro His Glu Phe Leu Leu Ala Thr Gly Ser Ala Asp Lys Thr 195 200 205 Val Lys Phe Trp Asp Leu Glu Thr Phe Glu Leu Ile Gly Ser Ser Gly 210 215 220 Pro Glu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Val Pro Ala Ser Val Val Arg Ser 225 230 235 240 Met Thr Phe Asn Lys Asp Gly Lys Ser Leu Phe Cys Gly Leu His Glu 245 250 255 Ser Leu Lys Val Leu Ser Trp Glu Pro Ile Ile Cys His Asp Val Val 260 265 270 Asp Val Gly Trp Ser Thr Leu Gly Asp Leu Ile Val His Glu Gly Lys 275 280 285 Leu Leu Gly Cys Ser Tyr Asn Gln Ser Cys Ala Gly Ile Trp Val Val 290 295 300 Asp Leu Met Lys Ile Glu Pro Tyr Ala Val Ser Ile Ala Glu Ala His 305 310 315 320 Leu Asn Glu Ser Val Asn Lys Ser Ile Gln Ala Asp Asn Ser Ile Ser 325 330 335 Ser Val Leu Gly Arg Leu Ser Val Ser Arg Ser Pro Ala Lys Glu Ala 340 345 350 Ser Ser Asp Thr Leu Leu Lys Leu Ser Met Pro Ala Ser Lys Glu Val 355 360 365 Pro Val Pro Ala Ser Ser Ala Val Thr Lys Lys Leu Pro Lys Glu Pro 370 375 380 Thr Thr Ser Asn Ile Arg Leu Thr Arg Ser Asp Ser Leu Pro Val Val 385 390 395 400 Ser Pro Arg Val Arg Leu Asn Pro Lys Phe Ser Asp Asp Gln Lys Arg 405 410 415 Gln Thr Asp Tyr Ala Val Pro Ile Thr Thr Pro Arg Ile Arg Ser Lys 420 425 430 Val Asp Leu Ser Ile Gly Ala Arg Ala Phe His Arg Asn Ser Val Pro 435 440 445 Ser Val Ala Pro Thr Asn Arg Ser Arg Ser Lys Ile Ser Ala Tyr Ser 450 455 460 Ser Glu Gly Ser Ser Phe Ile Pro Val Val Val Pro Arg His Ile Pro 465 470 475 480 Lys Val Asp Ser Gly Pro Asn Leu Ser Lys Val Leu Thr Thr Asp Leu 485 490 495 Thr Ile Val Glu Pro Gln Asp Ile Glu Arg Gly Gly Leu Ala Val Asp 500 505 510 Cys Gly Glu Asp Asp Lys Leu Val Cys Val Ile Asp Ser Arg Ser Ser 515 520 525 Asn Met Gly Val Gln Asn Gly Arg Arg Arg Lys Ala Gly Asp Ile Ile 530 535 540 Thr His Lys Glu Thr Pro Glu Thr Ala Leu Thr Val Asn Met Asp Arg 545 550 555 560 Asp Phe Arg Arg Lys Ala Pro Glu Thr Glu Ser Met Gln Gln Asp Ile 565 570 575 Phe His Ser Glu Pro Ile Ser Ser Lys Cys Lys Tyr Ile Lys Glu Thr 580 585 590 Ser Gly Ala Gly Asp Ile Asn Leu Ser Gly Ser Ala Ile Thr Glu Ser 595 600 605 Val Lys Ser Asn Glu Gly Gly Asp Trp Tyr Asn Ala Ser Ser Phe Val 610 615 620 Lys Pro Asn Leu Thr Val Gly Arg Asn Pro Glu Thr Ser Tyr Ile Asn 625 630 635 640 Arg Arg Thr Met Phe Gly Leu Arg His Ser Thr Asp Ser Ser Glu Lys 645 650 655 His Ala Val Glu His Gly Pro Ser Asn Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Arg 660 665 670 Asn Gln Tyr Ala Pro Thr Leu His Asn Leu Arg Arg Arg Ser Ser Val 675 680 685 Ala Arg Glu Gln Ser Ala Ser Ala Gly Asp Glu Asp Asp Ile Ala Asp 690 695 700 Leu Met Glu Asn His Gln Glu Phe Ile His Ala Val Lys Ser Arg Leu 705 710 715 720 Thr Lys Leu Glu Val Val Tyr Arg Cys Trp His Asn Asn Asp Val Lys 725 730 735 Gly Ser Ile Asp Ala Thr Arg Arg Ile Gln Asp Leu Asp Val Thr Ala 740 745 750 Asp Ile Ile Ser Val Leu Met Glu Asn Asp Asn Ser Ile Thr Leu Asp 755 760 765 Ile Cys Thr Cys Val Leu Pro Leu Ala Ser Ser Val Leu Glu Lys Ser 770 775 780 Ser Tyr Asp Arg His Leu Lys Val Ala Leu Glu Met Ile Leu Lys Leu 785 790 795 800 Val Lys Ser Phe Gly Ser Thr Ile Ser Ser Ala Val Ser Ser Thr Pro 805 810 815 Pro Val Gly Val Asp Ile Glu Ala Glu Gln Arg Leu Asn Arg Cys Asn 820 825 830 Leu Cys Phe Leu Glu Leu Ile Lys Val His Ser Val Leu Phe Ala Leu 835 840 845 Thr Arg Arg Gln Gly Glu Val Gly Arg Ser Ala Gln Glu Leu Ser Leu 850 855 860 Phe Leu Gln Asp Ile Phe Gln Leu Thr Ser Arg 865 870 875 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-1-F <400> 3 caccatggcc accaagcgcg cgtac 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-1-R <400> 4 ctatctgctt gtcagctgaa agatatcctg 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nosT-F <400> 5 gatgctcacc ctgttgtttg gtgt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nosT-R <400> 6 taatcatcgc aagaccggca acag 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-2-F <400> 7 actctcaatg cctgcttcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-2-R <400> 8 aatctgtctg cctcttctgg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-1-F <400> 9 cgccgtgctc cagttctaca agg 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-1-R <400> 10 tccttcctta cttccgcccc ca 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-3-F <400> 11 cacggcggat tgatgtgctt a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-3-R <400> 12 ccacgaccca tattccagca c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-2-F <400> 13 cctcggacac catcgacaac gtg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-2-R <400> 14 cgcccccaaa gaacaggagc cta 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-4-R <400> 15 tctgcttgtc agctgaaaga tatcctg 27 <110> Republic of Korea <120> Use of OsDW1 gene from Oryza sativa as regulator of yield and          drought stress <130> P15R12D0166 <160> 15 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 2628 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1 gene sequence <400> 1 atggccacca agcgcgcgta caagctccag gagtttgttg cgcatgcttc cgatgtcaac 60 tgtgccaagt ttgggaggaa gacatcaaga atcctcatca ctggtgagga ggaccaaaag 120 gtcaatcttt gggccatagg gaaacccagt tccatcttga gcctgtcagg ccttacgagt 180 ccagttgagt cagtgagctt tgactcatct gaagctatga taggtgctgg agcatcaagt 240 gggacaataa agatatggga tgtagatgaa gcaaaagtcg ctcgtacttt tactggacat 300 agatcgagtt gtgcgtccct tgatttccat ccttttggag aattcttcgc ttctgggtct 360 tcagacacta acatgaaaat atgggatatg cggaaaaagg gatgcattca cacatataaa 420 ggtcacacac ggcggattga tgtgcttaga ttcactcctg atggccggtg gattgtctct 480 ggtggatctg ataactctgt aaagatctgg gatttgacag ctggaaagct cttgcatgac 540 tttaggaatc atgaaggccc aattaactgc ttagattttc acccccatga gttcttattg 600 gctacaggtt cagctgataa gacagttaag ttttgggacc ttgaaacttt tgagttgatt 660 ggttcttctg gacctgagaa tagccgggaa tactttgtgc cagctagtgt agttcggtct 720 atgacattca acaaagatgg taaatcactt ttttgcggat tacatgaaag tttgaaggtt 780 ccttcctggg aacccatcat atgccatgat gtggttgatg ttggctggtc cacattaggg 840 gatctaattg ttcatgaggg aaaacttctt ggttgctcat ataaccagag ttgtgctgga 900 atatgggtcg tggacttgat gaaaattgaa ccgtatgctg ttagcattgc tgaagcacat 960 ttgaatgaaa gcgtaaataa gtcaatacag gctgataata gcatatcatc agtgttggga 1020 aggttatcag tttccagaag cccagccaag gaagcatctt ccgatacttt gcttaaactc 1080 tcaatgcctg cttcaaaaga agttcctgtt ccagcttctt ctgcagtgac aaagaaacta 1140 ccaaaagaac ctacaacaag caatattcgg ctcacaagat ctgattctct accagttgtt 1200 tctcctaggg ttagattgaa cccaaagttc tctgatgacc agaagaggca gacagattat 1260 gctgtgccta taacaactcc aagaattcgc tccaaagtgg atctctctat aggtgctaga 1320 gcattccatc gtaactcagt accatcggtt gctcccacaa atagatccag gtccaaaata 1380 tctgcatata gtagtgaagg atcgtcgttc atccctgttg ttgtccctag gcatatccct 1440 aaagtggatt ctggtcccaa tctcagtaaa gttctcacta ctgatttaac aattgtcgag 1500 cctcaagaca tagaacgagg tggtctggct gtggattgtg gagaagatga taaattggtg 1560 tgtgtgattg attcaaggag ctcaaatatg ggtgtacaaa atggccgtag aagaaaagcc 1620 ggtgatatta ttacacataa agaaacccca gagactgctt tgacagttaa tatggatcgt 1680 gacttcagaa gaaaggctcc tgaaactgaa agtatgcaac aggacatatt tcattcagag 1740 cccattagtt caaaatgtaa atatattaaa gaaacttcag gtgctggaga cattaacttg 1800 tctgggtcag ccattactga aagtgtcaag tctaatgaag gtggtgactg gtataatgca 1860 tcttcttttg taaaaccaaa tttgactgtt ggaaggaatc cagagacttc atacatcaac 1920 agaagaacaa tgtttggatt gagacattca acggattcaa gtgaaaaaca cgctgttgaa 1980 catgggcctt ccaatttgtc tgcaagttat gagagaaatc agtatgcacc aacactacat 2040 aacttgagga ggcgctcttc ggttgctaga gaacagagtg catcagctgg tgatgaagat 2100 gatattgctg atctgatgga aaaccatcaa gaattcattc atgcagtgaa gtctcggcta 2160 acaaaactag aggtggttta caggtgttgg cacaataacg atgtaaaggg atctattgat 2220 gctacacgca ggattcagga tcttgatgtt accgccgata taattagtgt tctgatggag 2280 aatgataatt ctatcacact agatatttgt acttgtgtct tacctcttgc ctccagtgtt 2340 cttgaaaaaa gcagctatga caggcacctg aaagttgcct tggagatgat ccttaagctt 2400 gtgaaaagct ttggttctac aatatcttca gctgtgtcat ctactccacc agttggtgta 2460 gacattgagg cagaacagag gctcaatcgg tgcaatttgt gctttctaga gctgataaaa 2520 gttcacagcg ttctctttgc cctgacacgg cggcaaggcg aggttggaag atctgcacag 2580 gagctaagcc tctttcttca ggatatcttt cagctgacaa gcagatag 2628 <210> 2 <211> 875 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1 amino acid sequence <400> 2 Met Ala Thr Lys Arg Ala Tyr Lys Leu Gln Glu Phe Val Ala His Ala   1 5 10 15 Ser Asp Val Asn Cys Ala Lys Phe Gly Arg Lys Thr Ser Arg Ile Leu              20 25 30 Ile Thr Gly Glu Glu Asp Gln Lys Val Asn Leu Trp Ala Ile Gly Lys          35 40 45 Pro Ser Ser Leu Ser Leu Ser Gly Leu Thr Ser Pro Val Glu Ser      50 55 60 Val Ser Phe Asp Ser Ser Glu Ala Met Ile Gly Ala Gly Ala Ser Ser  65 70 75 80 Gly Thr Ile Lys Ile Trp Asp Val Asp Glu Ala Lys Val Ala Arg Thr                  85 90 95 Phe Thr Gly His Arg Ser Ser Cys Ala Ser Leu Asp Phe His Pro Phe             100 105 110 Gly Glu Phe Phe Ala Ser Gly Ser Ser Asp Thr Asn Met Lys Ile Trp         115 120 125 Asp Met Arg Lys Lys Gly Cys Ile His Thr Tyr Lys Gly His Thr Arg     130 135 140 Arg Ile Asp Val Leu Arg Phe Thr Pro Asp Gly Arg Trp Ile Val Ser 145 150 155 160 Gly Gly Ser Asp Asn Ser Val Lys Ile Trp Asp Leu Thr Ala Gly Lys                 165 170 175 Leu Leu His Asp Phe Arg Asn His Glu Gly Pro Ile Asn Cys Leu Asp             180 185 190 Phe His Pro His Glu Phe Leu Leu Ala Thr Gly Ser Ala Asp Lys Thr         195 200 205 Val Lys Phe Trp Asp Leu Glu Thr Phe Glu Leu Ile Gly Ser Ser Gly     210 215 220 Pro Glu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Val Pro Ala Ser Val Val Arg Ser 225 230 235 240 Met Thr Phe Asn Lys Asp Gly Lys Ser Leu Phe Cys Gly Leu His Glu                 245 250 255 Ser Leu Lys Val Leu Ser Trp Glu Pro Ile Ile Cys His Asp Val Val             260 265 270 Asp Val Gly Trp Ser Thr Leu Gly Asp Leu Ile Val His Glu Gly Lys         275 280 285 Leu Leu Gly Cys Ser Tyr Asn Gln Ser Cys Ala Gly Ile Trp Val Val     290 295 300 Asp Leu Met Lys Ile Glu Pro Tyr Ala Val Ser Ile Ala Glu Ala His 305 310 315 320 Leu Asn Glu Ser Val Asn Lys Ser Ile Gln Ala Asp Ser Ser Ile Ser                 325 330 335 Ser Val Leu Gly Arg Leu Ser Val Ser Ser Ser Ser Ala Lys Glu Ala             340 345 350 Ser Ser Asp Thr Leu Leu Lys Leu Ser Met Pro Ala Ser Lys Glu Val         355 360 365 Pro Val Pro Ala Ser Ser Ala Val Thr Lys Lys Leu Pro Lys Glu Pro     370 375 380 Thr Thr Ser Asn Ile Arg Leu Thr Arg Ser Asp Ser Leu Pro Val Val 385 390 395 400 Ser Pro Arg Val Val Arg Leu Asn Pro Lys Phe Ser Asp Asp Gln Lys Arg                 405 410 415 Gln Thr Asp Tyr Ala Val Pro Ile Thr Thr Pro Arg Ile Arg Ser Lys             420 425 430 Val Asp Leu Ser Ile Gly Ala Arg Ala Phe His Arg Asn Ser Val Pro         435 440 445 Ser Val Ala Pro Thr Asn Arg Ser Ser Arg Ser Ser Ala Tyr Ser     450 455 460 Ser Glu Ser Ser Phe Ile Pro Val Val Val Pro Arg His Ile Pro 465 470 475 480 Lys Val Asp Ser Gly Pro Asn Leu Ser Lys Val Leu Thr Thr Asp Leu                 485 490 495 Thr Ile Val Glu Pro Gln Asp Ile Glu Arg Gly Gly Leu Ala Val Asp             500 505 510 Cys Gly Glu Asp Asp Lys Leu Val Cys Val Ile Asp Ser Arg Ser Ser         515 520 525 Asn Met Gly Val Gln Asn Gly Arg Arg Arg Lys Ala Gly Asp Ile Ile     530 535 540 Thr His Lys Glu Thr Pro Glu Thr Ala Leu Thr Val Asn Met Asp Arg 545 550 555 560 Asp Phe Arg Arg Lys Ala Pro Glu Thr Glu Ser Met Gln Gln Asp Ile                 565 570 575 Phe His Ser Glu Pro Ile Ser Ser Lys Cys Lys Tyr Ile Lys Glu Thr             580 585 590 Ser Gly Ala Gly Asp Ile Asn Leu Ser Gly Ser Ala Ile Thr Glu Ser         595 600 605 Val Lys Ser Asn Glu Gly Gly Asp Trp Tyr Asn Ala Ser Ser Phe Val     610 615 620 Lys Pro Asn Leu Thr Val Gly Arg Asn Pro Glu Thr Ser Tyr Ile Asn 625 630 635 640 Arg Arg Thr Met Phe Gly Leu Arg His Ser Thr Asp Ser Ser Glu Lys                 645 650 655 His Ala Val Glu His Gly Pro Ser Asn Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Arg             660 665 670 Asn Gln Tyr Ala Pro Thr Leu His Asn Leu Arg Arg Arg Ser Ser Val         675 680 685 Ala Arg Glu Gln Ser Ala Ser Ala Gly Asp Glu Asp Asp Ile Ala Asp     690 695 700 Leu Met Glu Asn His Gln Glu Phe Ile His Ala Val Lys Ser Arg Leu 705 710 715 720 Thr Lys Leu Glu Val Val Tyr Arg Cys Trp His Asn Asn Asp Val Lys                 725 730 735 Gly Ser Ile Asp Ala Thr Arg Arg Ile Gln Asp Leu Asp Val Thr Ala             740 745 750 Asp Ile Ile Ser Val Leu Met Glu Asn Asp Asn Ser Ile Thr Leu Asp         755 760 765 Ile Cys Thr Cys Val Leu Pro Leu Ala Ser Ser Val Leu Glu Lys Ser     770 775 780 Ser Tyr Asp Arg His Leu Lys Val Ala Leu Glu Met Ile Leu Lys Leu 785 790 795 800 Val Lys Ser Phe Gly Ser Thr Ile Ser Ser Ala Val Ser Ser Thr Pro                 805 810 815 Pro Val Gly Val Asp Ile Glu Ala Glu Gln Arg Leu Asn Arg Cys Asn             820 825 830 Leu Cys Phe Leu Glu Leu Ile Lys Val His Ser Val Leu Phe Ala Leu         835 840 845 Thr Arg Glu Gly Glu Val Gly Arg Ser Ala Gln Glu Leu Ser Leu     850 855 860 Phe Leu Gln Asp Ile Phe Gln Leu Thr Ser Arg 865 870 875 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-1-F <400> 3 caccatggcc accaagcgcg cgtac 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-1-R <400> 4 ctatctgctt gtcagctgaa agatatcctg 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nosT-F <400> 5 gatgctcacc ctgttgtttg gtgt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nosT-R <400> 6 taatcatcgc aagaccggca acag 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-2-F <400> 7 actctcaatg cctgcttcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-2-R <400> 8 aatctgtctg cctcttctgg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-1-F <400> 9 cgccgtgctc cagttctaca agg 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-1-R <400> 10 tccttcctta cttccgcccc ca 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-3-F <400> 11 cacggcggat tgatgtgctt a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-3-R <400> 12 ccacgaccca tattccagca c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-2-F <400> 13 cctcggacac catcgacaac gtg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi5-2-R <400> 14 cgcccccaaa gaacaggagc cta 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDW1-4-R <400> 15 tctgcttgtc agctgaaaga tatcctg 27

Claims (9)

서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물세포에 형질전환시켜 OsDW1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는, 대조구 벼 식물에 비해 벼 식물의 내한발성을 증진시키거나 또는 수확량을 증가시키는 방법.
The present invention provides a method for producing a recombinant vector comprising the step of overexpressing the OsDW1 gene by transforming a rice plant cell with a recombinant vector comprising OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice ( Oryza sativa ) A method of promoting cold tolerance of rice plants or increasing yield.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the gene encodes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
제2항에 있어서, 상기 단백질은 WD 도메인(domain) 및 카타닌(Katanin)을 포함하는 것인 방법.
3. The method of claim 2, wherein the protein comprises a WD domain and a katanin.
삭제delete 삭제delete 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 벼 식물세포로부터 벼 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 내한발성을 증진시키거나 또는 수확량이 증가된 벼 식물체의 제조 방법.
Transforming rice plant cells with a recombinant vector comprising OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice represented by SEQ ID NO: 1; And
And regenerating rice plants from the transgenic rice plant cells. 2. The method according to claim 1, wherein the plant is a plant.
제6항의 방법에 의해 제조된, 내한발성이 증진되거나 또는 수확량이 증가된 형질전환 벼 식물체.
A transgenic rice plant produced by the method of claim 6 which has increased cold tolerance or increased yield.
제7항에 따른 벼 식물체의 형질전환된 종자.
A transformed seed of a rice plant according to claim 7.
서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsDW1(Drought response WD domain 1) 유전자를 함유하는, 내한발성이 증진된 벼 식물체의 수확량 증가용 조성물.A composition for increasing the yield of a rice plant having enhanced cold tolerance, which contains the OsDW1 (Drought response WD domain 1) gene derived from rice, which is represented by SEQ ID NO: 1.
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