KR20130009884A

KR20130009884A - 병용 요법 및 치료에 대한 내성 평가 방법

Info

Publication number: KR20130009884A
Application number: KR1020127032757A
Authority: KR
Inventors: 존 프레데릭 보이란; 웨이 히
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2010-05-19
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2013-01-23
Also published as: ES2488628T3; KR101718260B1; EP2572198B1; RU2012151434A; CN102893155A; HK1176403A1; CA2798181A1; WO2011144583A1; JP5680744B2; JP2013527454A; US20110287025A1; KR101539138B1; MX2012013305A; RU2587053C2; US8309299B2; EP2572198A1; KR20150065931A; CN102893155B; BR112012027970A2

Abstract

본 발명은 객체로부터 획득된 생물학적 샘플에 존재하는 IL6 및/또는 IL8인 바이오마커의 수준을 측정함으로써, 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'- (2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증식성 장애로 고통받는 환자에게 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드 및 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제를 투여함을 포함하는 병용 요법에 관한 것이다.

Description

병용 요법 및 치료에 대한 내성 평가 방법{COMBINATION THERAPY AND METHOD FOR ASSESSING RESISTANCE TO TREATMENT}

본 발명은 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성을 측정하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증식성 장애로 고통받는 환자에게 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드 및 항-IL6 제제 및 항-IL8 제제 중 적어도 하나를 투여함을 포함하는 상기 환자의 치료를 위한 병용 요법에 관한 것이다.

노치(Notch) 단백질은 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는, 포유류를 비롯한 대부분의 생물체에 존재하는 막 관통 단백질이다. 리간드를 노치의 세포외 도메인에 결합시키면, 노치 단백질은 리간드와의 상호작용을 유지하는 세포외 도메인을 방출하는 종양 괴사 인자 α 전환 효소(TACE)에 의해 막 바로 외부에서 쪼개진다. 이어서, γ세크레타아제는 막 바로 내부에서 단백질을 쪼개어 세포내 도메인을 방출한다(활성 세포내 노치 또는 "ICN"으로서 공지되어 있음). ICN은 세포 핵을 이동시키고 전사 인자 CSL을 활성화시켜, 유전자 전사를 유도한다.

잘못된 노치 신호전달은 증식성 장애를 비롯한 다양한 장애에 연루된 것으로 나타났다. 이와 같이, 노치 신호전달의 억제는 종양학에서 거대한 관심 영역이다. γ세크레타아제 억제는 노치 신호전달 통로를 차단하고, 이로 인하여 γ세크레타아제 억제제는 항-증식성 활성을 가진다.

2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드(본원에서 "화합물 I"로도 지칭됨)는 잠재력 있고 선별적인 γ세크레타아제 억제제로서 종양 세포에서 노치 신호전달을 억제한다. 화합물 I로 처리된 이종이식은 종양 맥관형성을 억제하는 화합물 I의 능력에 일치하는, 맥관 형성과 연관된 유전자 발현의 감소를 나타내는 것으로 공지되어 있다(문헌[Luistro et al., Cancer Research, 69:7672-80 (2009)]). 흥미롭게도, 이러한 연구는 H460a 이종이식에 대한 맥관형성 유전자 프로필에 있어서 변화를 거의 보여주지 않았다.

인터루킨-6(IL6) 및 인터루킨-8(IL8)은 감염 및 면역, 염증, 자가 면역 질환, 및 암과 같은 다양한 장애에서 중요한 역할을 하는 강력한 사이토카인이다. 본 발명자들은 각 IL6 및 IL8의 상승된 발현이 화합물 I에 의한 치료에 대하여 내성을 부여함을 발견하였다.

본 발명은 객체로부터 획득된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 측정함을 포함하되 상기 바이오마커가 IL6 또는 IL8인, 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 IL6 또는 IL8인 바이오마커의 검출용 제제를 포함하는, 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성 측정 보조용 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 증식성 장애로 고통받는 환자에게

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 또는 항-IL8 제제

를 투여함을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 약제, 특히 증식성 장애, 예를 들어 암, 특히 고형 종양, 더욱 특히 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료용 약제로서

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제

의 순차적 또는 동시적 조합에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태는

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 또는 항-IL8 제제

를 포함하는 키트이다.

또한, 본 발명의 추가의 양태는 증식성 장애, 특히 암, 보다 특히 고형 종양, 예컨대 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료용 약제의 제조를 위한

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제

의 조합의 용도에 관한 것이다.

도 1은 NCI-H460a 및 A549 세포 주 상에서 수행된 사이토카인 배열 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 ELISA를 사용하여 다양한 세포 주로부터 측정된 분비된 IL6 및 IL8의 양을 나타낸다.
도 3은 qRT-PCR을 사용하여 다양한 세포 주로부터 측정된 mRNA 암호화 IL6 및 IL8의 양을 나타낸다.
도 4는 ELISA를 사용하여 H460a 세포, A549 부모 세포, A549 대조 세포, A549 IL6 과발현 세포 및 A549 IL8 과발현 세포로부터 측정된 분비된 IL6 및 IL8의 양을 나타낸다.
도 5는 H460a 세포, A549 부모 세포, A549 대조 세포, A549 IL6 과발현 세포, A549 IL8 과발현 세포, 및 A549 IL6 과발현 세포와 A549 IL8 과발현 세포의 1:1 혼합물을 수용한 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 화합물 I에 의한 치료 효과 및 택솔(Taxol, 등록상표)에 의한 치료 효과를 나타낸다.
도 6은 H460a 부모 세포, 조절 벡터를 수용한 H460a 세포, 및 IL8-넉다운 H460a 세포로부터 측정된 mRNA 암호화 IL8의 양 및 분비된 IL8의 양을 나타낸다.
도 7은 H460a 및 IL-8 넉다운 H460a 이종이식 모델에서 측정된 화합물 I 치료의 종양 성장에 대한 효과를 나타낸다.
도 8은 H460a 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 화합물 I에 의한 치료, 항-IL8 항체에 의한 치료, 및 화합물 I 및 IL-8 항체에 의한 병용 요법의 효과를 나타낸다.
도 9는 H460a 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 화합물 I에 의한 치료, 항-IL6 항체에 의한 치료, 및 화합물 I 및 IL-6 항체에 의한 병용 요법의 효과를 나타낸다.
도 10은 qRT-PCR을 사용하여 측정된 다양한 세포 주에서 IL6 및 IL8 암호화 mRNA의 수준을 나타낸다.
도 11은 ELISA를 사용하여 측정된 다양한 세포 주에 의해 분비된 IL6 및 IL8의 수준을 나타낸다.
도 12는 화합물 I에 의한 치료 후 U87MG 및 LOX 세포에서의 HesI mRNA의 하향 조절을 나타낸다.
도 13은 U87MG 및 LOX 세포에서의 종양 성장에 대한 화합물 I에 의한 치료 효과를 나타낸다.
도 14는 H460a 세포, 화합물 I로 처리된 H460a 세포, IL8-넉다운 H460a 세포, 화합물 I로 처리된 IL8-넉다운 H460a 세포, U87MG 세포, 및 화합물 I로 처리된 U87MG 세포에서 ELISA를 사용하여 측정된 분비된 IL6 및 IL8의 양을 나타낸다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 명세서 및 청구항을 비롯한 본원에서 사용된 하기 용어는 하기 주어진 정의를 가진다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문헌에서 명시적으로 달리 설명하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.

본원에서 사용된 "화합물 I"은 γ세크레타아제 억제제로서 유용한 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드를 지칭한다. 화합물 I은 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:

[화학식 I]

용어 "바이오마커"는 생물학적 상태의 지표로서 역할하는 객관적으로 측정가능한 대상을 지칭한다.

용어 "생물학적 샘플"은 바이오마커가 측정될 수 있는 객체로부터 획득된 부분(예컨대, 혈액, 혈청, 조직, 담, 소변, 침)을 지칭한다.

바이오마커와 관련된 용어 "수준"은 농도, 활성, 발현 수준 또는 존재하는 바이오마커의 양의 수치를 지칭한다. 수준은 예를 들어 샘플에 존재하는 바이오마커의 농도 또는 양을 측정함으로써, 또는 관련 있는 세포 집단 또는 조직에서 발현된 바이오마커를 암호화하는 mRNA의 양을 결정함으로써 정량적으로 측정될 수 있다. 대안으로, 수준은 예를 들어 설정된 하기 한계 수준의 이상 또는 이하로서 더욱 정량적으로 측정될 수 있다. 한계 수준은 건강한 객체에서 바이오마커의 평균 또는 중간 값에 상응하거나 질병의 진단이 이루어지는 수준에 상응할 수 있다. 바이오마커는 측정된 수준이 설정된 한계 수준 이상인 경우 "상승된 수준"으로 존재한다고 언급된다.

"객체"는 포유류 및 조류를 포함한다. "포유류"는 인간; 비인간 종족, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 축산 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소 및 돼지; 가축 동물, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 설취류를 비롯한 실험 동물, 예컨대 래트, 마우스 및 기니 피그 등을 비롯한 임의의 포유류 부류의 구성원을 의미하지만, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "객체"는 구체적인 연령 또는 성을 의미하지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 지시된 담체가 치료될 질병 또는 상태 및 각각의 투여 경로를 고려하여, 합리적이고 신중한 의학 종사자들이 환자에게 이의 투여를 회피하도록 하는 성질을 가지지 않음을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "치료학적으로 효과적인"은 예컨대 암성 종양의 성장을 저지하거나 수축을 초래하거나 환자의 수명을 증가시키기 위해 환자에게 투여시 목적하는 치료학적 효과를 나타내는데 효과적인 화합물, 조합 또는 조성물의 양을 의미한다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 증식성 장애는 암이다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식이 특징인 포유류에서의 생리학적 조건을 지칭하거나 기재한다. 암의 예시로는 결장암, 흑색종 및 갑상선암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

"세포 성장 또는 증식 억제"는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%로 세포의 성장 또는 증식을 감소시키는 것을 의미하고, 세포사를 유도하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 문구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당해 분야의 기술자가 두 개의 수치(일반적으로 분자와 관련된 하나의 수치 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 하나의 수치) 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계적인 유의성이 있는 것으로 간주할 수 있도록 충분히 높은 정도의 차이를 지칭한다.

용어 "종양"은 악성 또는 양성의 모든 종양성 신생세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.

내성 측정 방법

본 발명은 객체로부터 획득된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하되 상기 바이오마커가 IL6 또는 IL8인, 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드(본원에서 "화합물 I"로도 지칭됨)에 의한 치료에 대한 객체의 내성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 상기 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준은 상기 바이오마커에 대한 한계 수준과 비교되고, 더 클 경우 상기 객체는 화합물 I에 의한 치료에 대하여 생체 내 내성을 가지는 것으로 간주된다. 청구항에서 포함하는 본원에서의 목적을 위한 "생체 내 내성"은 화합물 I에 의한 치료로 인하여 감소된 생체 내 효과적인 효능을 지칭한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 바이오마커는 IL6이고, IL6에 대한 한계 수준은 약 500 pg/ml이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 바이오마커는 IL8이고, IL8에 대한 한계 수준은 약 50 pg/ml이다.

바이오마커의 수준은 단백질 그 자체의 양 또는 각각의 mRNA의 양에 기초하여 측정될 수 있다.

단백질은 물리적/화학적 기술, 예컨대 젤 전기영동, HPLC, 질량 분광분석 및 프로테오믹 기술; 면역학적 검정 기술, 예컨대 ELISA, 경합 검사, 샌드위치 검사 등; 및 생물학적 활성의 검사(예컨대, 리간드 및/또는 효소로서)에 의해, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 생물학적 샘플 등에서의 활성을 측정함으로써, 두 개의 하이브리드 검사 시스템을 통하여 등으로 직접적으로 측정될 수 있다. 상업적 검사는 상기 언급된 다수의 또는 대부분의 바이오마커가 이용가능하거나 당해 분야에서 기재되어 있다. 적합한 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변 등을 포함한다.

대안으로, 상기 언급된 단백질 바이오마커에 상응하는 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. mRNA 전사 수준의 측정은 노던 블랏; 마이크로검사 기술; RT-PCR, qRT-PCR 및 그 외의 정량 및 반-정량 DAN 및 mRNA 증폭 방법 등에 제한되지 않고 임의의 적합한 정량 또는 반-정량 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR을 수행하기 위해 생물학적 샘플로부터 총 RNA를 추출하고, DNase1로 이를 처리하고, 멀티스크라이브 역전사 효소와 같은 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 전환할 수 있다(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이션(Applied Biosystems Inc.)). 이어서, cDNA "SYBR green" 실제-시간 정량 PCR 검사는 주형으로서 cDNA를 이용하여 수행되고, ABI PRISM 7900 서열 검출기를 이용하여 분석될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 객체는 포유류, 예를 들어 인간이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 측정된 바이오마커는 IL6이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 측정된 바이오마커는 IL8이다.

본 발명의 한 실시양태에서, IL6 및 IL8이 모두 측정된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 바이오마커는 상기 샘플에 존재하는 단백질의 양을 측정함으로서 측정된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 바이오마커는 바이오마커를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정함으로써 측정된다.

내성 측정용 키트

또한, 본 발명은 객체로부터 획득된 생물학적 샘플에서 IL6 또는 IL8인 바이오마커 검출용 제제를 포함하는, 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성 측정 보조용 키트에 관한 것이다.

병용 요법

한 실시양태에서, 본 발명은 환자에게

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 또는 항-IL8 제제

를 투여함을 포함하는, 증식성 장애로 고통받는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 및 항-IL8 제제가 모두 투여된다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 약제, 특히 증식성 장애, 예컨대, 암, 특히 고형 종양, 더욱 특히 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료용 약제로서 사용하기 위한

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제

의 순차적 또는 동시적 조합에 관한 것이다.

증식성 장애의 치료는 상기 장애로 고통받는 환자의 종양 크기를 유지하거나 감소시키고/시키거나, 종양 퇴화(부분적이거나 완전한)를 유도하고/하거나, 종양 성장을 억제하고/하거나 수명을 증가시키는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

또한, 본 발명은

(A) 화합물 I; 및

(B) 항-IL6 또는 항-IL8 제제

를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 키트는 항-IL6 및 항-IL8 제제를 모두 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 증식성 장애는 고형 종양이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 고형 종양은 뇌, 간, 난소, 췌장, 피부, 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 고형 종양은 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 제제는 환자에서 IL6의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 제제는 환자에서 IL8의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 제제는 항-IL6 항체이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 제제는 항-IL8 항체이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 제제는 IL6을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이다. IL6을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산은, 예를 들어 안티센스 RNA일 수 있다. 또한, 핵산은, 예를 들어 shRNA 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 제제는 IL8을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이다. IL8을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산은, 예를 들어 안티센스 RNA일 수 있다. 또한, 핵산은, 예를 들어 shRNA 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 화합물 I은 증식성 장애의 치료에 치료학적으로 효과적인 양으로 투여된다. 투여량은, 예를 들어 약 400 ng-hr/ml 내지 약 9000 ng-hr/ml, 약 1100 ng-hr/ml 내지 약 4100 ng-hr/ml, 또는 약 1380 ng-hr/ml 내지 약 2330 ng-hr/ml일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화합물 I은 최대 약 21 일에 걸쳐 약 400 ng-hr/ml 내지 약 9000 ng-hr/ml의 양으로 투여될 수 있고, 최대 약 21 일에 걸쳐 약 1100 ng-hr/ml 내지 약 4100 ng-hr/ml의 양으로 투여될 수 있으며, 최대 약 21 일에 걸쳐 약 1380 ng-hr/ml 내지 약 2330 ng-hr/ml의 양으로 투여될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화합물 I은 21 일 주기 중의 1, 2, 3, 8, 9 및 10 일째 하루에 1 회 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 21 일 주기 중의 1 일 내지 7 일째 하루에 1 회 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 매일 하루에 1 회 투여될 수 있다.

본 발명의 방법 및 키트의 실시양태에서, 화합물 I은 약학적 경구 단위 투여 형태이다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 환자는 또한 방사선 요법을 받는다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 화합물 I은 21 일 주기 중의 1, 2, 3, 8, 9 및 10 일째 하루에 1 회, 약 400 ng-hr/ml 내지 약 9000 ng-hr/ml의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 화합물 I은 21 일 주기 중의 1 내지 7 일째 하루에 1 회, 약 400 ng-hr/ml 내지 약 9000 ng-hr/ml의 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 항체는 환자에서 IL6의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL6 항체는 1 주일에 2 회, 약 1 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL6 항체는 1 주일에 2 회, 약 1 내지 약 50 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL6 항체는 1 주일에 2 회, 약 10 내지 약 30 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL6 항체는 1 주일에 2 회, 약 20 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 항체는 환자에서 IL8의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL8 항체는 1 주일에 2 회, 약 1 내지 약 100 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL8 항체는 1 주일에 2 회, 약 1 내지 약 50 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL8 항체는 1 주일에 2 회, 약 10 내지 약 30 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 항-IL8 항체는 1 주일에 2 회, 약 20 mg/kg의 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 shRNA는 환자에서 IL6의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 shRNA는 환자에서 IL8의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL6 siRNA는 환자에서 IL6의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL8 siRNA는 환자에서 IL8의 수준을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여된다.

화합물 I, 항-IL6 제제, 및/또는 항-IL8 제제의 투여 수준은 환자의 필요, 및 치료에 대한 환자의 반응에 따라 의사에 의해 본원에서 언급된 것보다 낮거나 높게 변화될 수 있다.

실시예

하기 제조 및 실시예는 당해 분야의 기술자가 본 발명을 더욱 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 제시된 것이다. 이들은 발명의 범주를 제한하는 것이 아니고, 단지 예시적이고 대표적인 것으로서 간주되어야 한다.

실시예 1

본 실시예는 화합물 I에 의한 치료에 대한 다양하고 상이한 이종이식 모델의 반응을 나타낸다.

찰스 리버 레보레토리즈(Charles River Laboratories)(미국 메사츄세츠주 윌밍턴)로부터 획득한 암컷 nu / nu (누드)마우스 또는 암컷 SCID-베이지 마우스(미국 뉴욕주 저먼타운 타코닉)를 생후 약 8 내지 14 주이고 체중 약 23 내지 25 g일 때 사용하였다(10 마우스/군). 모든 동물 실험은 로슈 동물 보호 및 사용 위원회(RACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.

인간 암 세포 주 LOVO,BxPC3, HCT-116, A549, AsPC-1, MiaPaCa-2, 및 Calu-6을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입하였다. H460a 세포 주는 잭 로스(Jack Roth) 박사(엔더슨 메디컬 센터 M.D.)로부터 기증받았다.

이종이식 주입을 위하여, 세포를 0.05% 트립신을 사용하여 수확하고, 세척하고, 배지에서 원심분리하고, 1 mL 당 1.5 내지 5 x 10⁷세포의 농도에서 인산 완충 식염수(PBS) 및 매트리젤(BxPC-3)의 1:1 혼합물 또는 PBS 단독(A549, H460a, LOVO, Calu-6, HCT-116, MiaPaca-2, 및 AsPC-1)중에 재현탁하였다. 마우스 1 마리당 0.2 mL 부피의 세포 현탁액(A549에 대한 7.5 x 10⁶ 세포, H460a에 대한 1 x 10⁷ 세포, Calu-6 및 HCT116에 대한 3 x 10⁶ 세포 및, BxPC3 및 AsPC-1에 대한 5 x 10⁶ 세포, MiaPaca-2에 대한 6 x 10⁶ 세포, 및 LOVO에 대한 5 x 10⁶ 세포)을 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. SCID-베이지 마우스에게 이식된 BxPC3을 제외하고 모든 이종이식 모델을 누드 마우스에 이식하였다. 평균 부피가 약 100 내지 150 mm³에 도달하였을 때 이식 후 8 내지 26 일 동안 종양을 성장하도록 한 후 동물을 치료 군으로 랜덤화하였다.

화합물 I(WO2005/023772에 기재된 절차에 따라 합성됨)을 경구(po) 투여를 위해 0.2% 트윈(Tween, 등록상표)-80으로 물 중의 1.0 % 클루셀(Klucel)에서 현탁액으로서 제형화하였다. 제형화된 화합물 및 비히클을 주 단위로 제조하고 4 ℃에서 저장하였다.

Calu-6 이종이식 모델에서, 화합물 I을 4 주 동안 격주로 매일 60 mg/kg으로 투여하였다. 또 다른 이종 이식모델은 화합물 I을 매일 10 mg/kg으로 투여하였다.

종양 측정 및 마우스 무게를 주당 2 회 측정하였다. 통계학적 분석을 맨-위트니 랭크 섬 시험(Mann-Whitney Rank Sum Test), 1-웨이 ANOVA 및 포스트 hoc 본페로니(Bonferroni) t-시험(미국 캘리포니아주 샌 프란시스코, 잔델 사이언티픽(Jandel Scientific), 버전 2.0, 시그마 스타트(Sigma Stat))에 의해 측정하였다. 군 간 차이는 확률치(p)가 0.05 이하인 경우 유의한 것으로 간주하였다.

종양 성장 억제(TGI%)를 하기 치료를 시작하고 21 일째 측정하였다. 하기 표 1에 결과를 제시한다:

이종이식 모델에서 생체 내 활성
종양 종류	TGI %
LOVO(결장)	83
BxPC3(췌장)	82
HCT-116(결장)	76
A549(NSCLC)	70
AsPC-1(췌장)	58
MiaPaCa-2(췌장)	53
Calu-6(NSCLC)	42
H460a(NSCLC)	8

H460a 이종이식은 화합물 I에 의한 치료 후 매우 적은 양의 종양 성장 억제(8 %)를 나타내었음을 알 수 있다.

실시예 2

실시예 1에서 H460a 이종이식 모델이 화합물 I에 의한 치료 후 매우 적은 양의 종양 성장 억제를 나타낸 것을 확인한 후, H460a 세포 주를 따로 떨어지게 하는 임의의 바이오마커가 존재하는지를 측정하기 위해 H460a 및 A549 NSCLC 세포 주에 대해 사이토카인 배열 분석을 수행하였다.

사이토카인 배열을 레이바이오테크 인코포레이티드(RayBiotech, Inc.)(미국 죠지아주 노크로스)으로부터 구입하고, 제조자의 포로토콜에 따라 사용하였다. 세포를 5 일간 성장시키고, 세포 배지를 수확하고, 분리된 세포를 원심분리에 의해 제거하였다. 4 ml의 배지를 배열을 이용하여 밤새 배양한 후, 다수의 PBS/트윈으로 세척한 후, 신호가 발달하였다.

H460a 세포 주는 A549 또는 혈청 대조군보다 모두 더 높은 수준의 IL6 및 IL8을 발현하는 것이 측정되었다.

실시예 3

이어서, IL6 및 IL8의 발현을, ELISA를 사용하여 분비된 IL6 및 IL8 단백질을 측정함으로써, BxPC3, HCT-116, A549, AsPC-1, MiaPaCa-2, 및 Calu-6 세포 주에서 정량화하였다.

IL6 ELISA 키트를 벤더 메드시스템즈(Bender MedSystems)(BMS213/2 또는 BMS213INST)로부터 구입하였다. IL8 ELISA 키트를 벤더 메드시스템즈(BMS204/3INST) 또는 알엔디 시스템즈(R&D Systems)(D8000C)로부터 구입하였다. 조직 배양 배지에서 분비된 IL6 및 IL8을 측정하기 위해, 세포를 35 mm 플레이트 내 500,000의 밀도에서 시딩하였다. 다음 날, 세포를 2 ml PBS로 세척한 후, 1 ml 신선한 배지로 보충하였다. 24 시간 후, 배지를 수확하고, 즉각 ELISA 분석을 위해 사용하였다.

결과(도 2 참조)로부터 나타난 바와 같이, H460a 세포는 A549 세포와 비교하여 4 배 높은 IL6 단백질 및 10 배 높은 IL8 단백질을 포함하여, 시험된 다른 세포 주보다 더 높은 IL6 및 IL8 단백질의 양을 분비한다.

실시예 4

이어서, qRT-PCR을 사용하여 mRNA의 수준을 측정함으로써, BxPC3, HCT-116, A549, AsPC-1, MiaPaCa-2, 및 Calu-6 세포 주에서 IL6 및 IL8을 정량화하였다. RNA 단리 및 역전사-PCR(RT-PCR)을 표준 실험 기술을 사용하여 수행하였다. 설정된 각 프로브(probe)에 대한 카탈로그 번호는 Hes1(Hs00172878_m1), ACTB (4333762F), IL6(Hs00174131_m1), IL8(Hs00174103_m1) 및 18S(4319413E)이었다.

결과(도 3 참조)로부터 나타난 바와 같이, H460a 세포는 A549 세포와 비교하여 12 배 높은 IL6 mRNA 및 8 배 높은 IL8 mRNA를 포함하여 시험된 다른 세포 주보다 더 높은 IL6 및 IL8 단백질의 양을 발현한다.

실시예 5

IL6 또는 IL8의 발현이 화합물 I 치료의 효능을 조절하는지 시험하기 위해, IL6 또는 IL8을 과발현하는 A549 세포 주를 이종이식 모델을 제조하기 위해 조작하고 사용하여 상기 과발현이 화합물 I 치료에 대한 세포의 민감성을 변경하는지 측정하기 위해 연구하였다.

IL6 및 IL8 플라스미드(미국 마릴랜드주 락빌 소재의 제네코포이아(Genecopoeia)로부터 시판됨)를 각각 사용하여 IL6 및 IL8 렌티바이러스를 제조하였다. A549 세포를 벡터 대조군을 받은 제 1 군, IL6 렌티바이러스로 감염시킨 제 2 군, 및 IL8 렌티바이러스로 감염시킨 제 3 군의 3 개 군으로 분리하였다. 제 2 군 및 제 3 군은 각각 외인성 IL6 및 IL8의 안정한 발현으로 세포 풀을 형성하였다.

IL6 및 IL8 단백질의 과발현을 ELISA에 의해 정량화하였다(도 4 참조). IL6을 과발현하는 A549 세포는 H460a에 비하여 7 배 더 높은 IL6을 분비하였다. IL8을 과발현하는 A549 세포는 H460a 보다 약간 더 적은 IL8 단백질을 분비하였다. IL6 또는 IL8을 과발현하는 A549 세포는 A549 벡터 대조군 세포와 유사한 형태학을 가진다.

이어서, IL6 과발현 A549 세포 및 IL8 과발현 A549 세포의 일부를 상기 세포의 1:1 혼합물을 함유하는 제 4 군을 형성하도록 조합하였다.

벡터 대조군을 받은 A549 세포, IL6을 과발현하는 A549 세포, IL8을 과발현하는 A549 세포, 및 IL6을 과발현하는 A549 세포 및 IL8을 과발현하는 A549 세포의 1:1 혼합물을 6 개의 웰 플레이트 상에 시딩하고, 각각의 군을 0 일째 1 웰 당 약 1 x 10⁵로 웰에 시딩하였다. 4, 6, 10 및 12 일째, 모든 세포를 트립신화하고, 계수한 후, 동일한 희석으로 추가의 증식을 위하여 다시 도말하였다. 대조 세포를100 % 성장률로 임의적으로 설정하였다. 다른 모든 세포 종류의 성장은 대조 세포의 성장에 대한 비율로서 표현되었다. 시험된 모든 세포 주는 유사한 성장률을 보여주었다(표 2 참조).

	1 일	4 일	6 일	10 일	12 일
A549_대조	100±25	100±2	100±1	100±2	100±17
A549 + IL6	90±5	109±6	112±20	98±5	97±6
A549 + IL8	84±12	91±12	118±6	77±6	78±4
A549 + IL6및 IL8	64±14	74±14	72±17	71±1	77±5

화합물 I의 효능에 대한 IL6 및 IL8 과발현의 생체 내 효과를 상기 각 세포 군에 대하여 평가하였다.

상기 언급된 네 개의 군으로부터 얻은 세포 및 부모 A549 및 H460a 세포를 실시예 1에 기재된 절차를 사용하여 이종이식 모델을 제조하도록 사용하였다.

마우스를 상이한 치료 군으로 랜덤화하였다(10 마우스/군): 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 부모 A549 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 부모 A549 마우스, 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 부모 A549 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 벡터 대조 A549 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 벡터 대조 A549 마우스, 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 벡터 대조 A549 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 IL6-과발현 A549 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 IL6-과발현 A549 마우스, 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 IL6-과발현 A549 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 IL8-과발현 A549 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 IL8-과발현 A549 마우스, 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 IL8-과발현 A549 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 IL-6 및 IL-8 과발현 A549 세포의 1:1 이종이식 혼합물을 함유한 A549 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 IL-6 및 IL-8 과발현 A549 세포의 1:1 이종이식 혼합물을 함유한 A549 마우스, 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 IL-6 및 IL-8 과발현 A549 세포의 1:1 이종이식 혼합물을 함유한 A549 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 H460a 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 H460a 마우스, 및 매일 4 회 택솔을 30 mg/kg으로 받은 H460a 마우스.

매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 처리한 H460a(고 수준의 IL6 및 IL8)로부터 얻은 이종이식 종양은 21 일 후 9% TGI를 생산하였다. 상기 내성은 이전의 실험과 일치하는 A549 종양에 대하여 관측된 71% TGI 및 A549 벡터 대조 종양에 대하여 관측된 61% TGI(저 수준의 IL6 및 IL8)와 명확히 대조된다. A549에서 IL6 또는 IL8의 과발현이 TGI를 각각 32 % 및 45 %로 감소시켰다. IL6 또는 IL8을 과발현하는 A549의 1:1 혼합물로 개시된 종양은 부모 H460a 이종이식의 내성에 따라 화합물 I에 대하여 완벽한 내성(8% TGI)을 나타내었다. 택솔은 다양한 모델에 비하여 일정한 TGI를 보여주는 양성 약물 대조로서 포함되었다(도 5 참조).

노치 신호전달 차단의 특징인, 생체 내 화합물 I 치료 후 Hes1 mRNA의 하향조절이 상기 세포에서 적절히 유지되기 때문에, 화합물 I에 대한 IL6 또는 IL8을 과발현하는 A549의 내성은 노치 억제의 손실에 의해 유발되지 않는다.

실시예 6

본 실시예는 IL8 발현이 H460a 세포의 내성을 유지하는데 필요한지 여부를 실험하기 위해 수행된 연구를 기재하고 있다.

pLKO.1에 기초한 항-IL8 shRNA(오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems)로부터 구입함)를 사용하여 렌티바이러스를 제조하고 H460a 세포에서 안정한 넉다운 IL8 발현에 사용하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, shRNA는 H460a 부모 세포와 비교하여 IL8 발현의 75 % 넉다운(mRNA 및 단백질 모두)을 나타내었다. 그러나, 아직도 IL8-넉다운 H460a 세포는 A549 세포에 비하여 2 배 높은 IL8 수준을 가진다.

이어서, 부모 H460a 세포 및 IL8-넉다운 H460a 세포를 실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 마우스에게 이종이식으로서 이식하였다. 그 후, 마우스를 상이한 치료 군으로 랜덤화하였다(10 마우스/군): 매일 1 회 비히클을 받은 H460a 이종이식 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스, 매일 1 회 비히클을 받은 IL8-넉다운 H460a 이종이식 마우스, 및 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 IL8-넉다운 H460a 이종이식 마우스.

도 7에서 나타난 바와 같이, 21 일 동안 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 치료한 경우, IL8-넉다운 H460a 세포로부터 유발된 종양은 부모 H460a 세포로부터 유발된 종양과 비교하여 개선된 반응성을 나타내었다(5 % TGI 대 24 % TGI).

실시예 7

중화 항-IL8 항체를 알엔디 시스템즈로부터 구입하였다(카탈로그 번호: MAB208). 상기 항체를 첫 번째로 생체 외에서 시험하였고, 상기 항체를 이용하여 치료된 H460a 세포로부터 어떠한 성장 억제도 관측되지 않았다.

H460a 이종이식 모델을 실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 제조하였다. 이어서, 마우스를 상이한 치료 군으로 랜덤화하였다(10 마우스/군): 매주 2 회 비히클을 받은 H460a 이종이식 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스, 매주 2 회 항-IL8 항체를 20 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스, 및 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 및 매주 2 회 항-IL8 항체를 20 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스.

화합물 I과 항체의 병용은 화합물 I에 대하여 H460a 종양의 민감성을 개선시켰다(10 % TGI 대 43 % TGI). 이는 IL8 shRNA를 이용한 이전의 데이터와 일치한다(도 8 참조).

실시예 8

본 실시예는 IL6 발현이 H460a 세포의 내성을 유지하는데 필요한지 여부를 실험하기 위해 수행된 연구를 기재하고 있다.

중화 항-IL6 항체를 알엔디 시스템즈로부터 구입하였다(카탈로그 번호: MAB2061). 상기 항체를 첫 번째로 생체 외에서 시험하였고, 상기 항체를 이용하여 치료된 H460a 세포로부터 어떠한 성장 억제도 관측되지 않았다.

H460a 이종이식 모델을 실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 제조하였다. 이어서, 마우스를 상이한 치료 군으로 랜덤화하였다(10 마우스/군): 매주 2 회 비히클을 받은 H460a 이종이식 마우스, 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스, 매주 2 회 항-IL6 항체를 20 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스, 및 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 및 매주 2 회 항-IL6 항체를 20 mg/kg으로 받은 H460a 이종이식 마우스.

화합물 I과 항체의 병용은 화합물 I에 대하여 H460a 종양의 민감성을 개선시켰다(43 % TGI 대 47 % TGI)(도 9 참조).

실시예 9

임의의 반응 마커의 중요한 측면은 성공적이고 예측적으로 응답자 및 비-응답자의 종양 종류를 식별하는 능력이다. 본 실시예에서, IL6 및/또는 IL8의 고 발현 수준을 가지는지 측정하기 위해 다양한 세포 주를 분석하였다. 이어서, 고 수준의 IL6 및 IL8을 발현하는 세포를 사용하여 이종이식을 제조하였다(결국 화합물 I 치료군에 대하여 비-응답자가 되는 것으로 예측됨). 고 수준의 IL6 및 IL8이 치료의 효능에 대해 임의의 효과를 가지는지를 보기 위해 이종이식 모델을 화합물 I로 처리하였다.

다수의 종양 종류에 대하여 약 100 개의 세포 주를 qRT-PCR에 의해 IL6 및 IL8 발현에 대하여 스크리닝하였다. 약 13 %의 세포 주는 A549 보다 최소한 10 배 더 높은 IL6 또는 IL8 발현을 가졌다. A549에 비해 높은 수준의 IL6(A549 보다 35 배 높은 IL6 mRNA) 및 IL8(A549 보다 50 배 높은 IL8 mRNA)을 발현하는 U87MG(교아세포종), 및 높은 수준의 IL8(A549 보다 50 배 높은 IL8 mRNA) 및 IL6(A549 보다 2 배 높은 IL6 mRNA)을 발현하는 LOX(흑색종)의 두 개의 세포 주를 추가적인 연구를 위해 선택하였다. 상기 두 개의 세포 주로부터의 IL6 및/또는 IL8의 더 높은 발현이 추가적으로 ELISA에 의해 확인되었다(도 11).

인간 암 세포 주 U87MG 및 LOX를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 구입하였다.

이어서, 이종이식 모델을 U87MG 및 LOX를 이용하여 제조하였다.

생후 약 8 내지 14 주이고 체중 약 23 내지 25 g일 때 찰스 리버 레보레토리즈(미국 메사추세츠주 윌밍턴)로부터 획득한 암컷 nu / nu (누드)마우스에게 이종이식을 주입하였다. 모든 동물 실험은 로슈 동물 보호 및 사용 위원회(RACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.

이종이식 주입을 위하여, 세포를 0.05% 트립신을 사용하여 수확하고, 세척하고, 배양 배지에서 원심분리하고, 1 mL 당 1.5 내지 5 x 10⁷세포의 농도에서 인산 완충 식염수(PBS) 및 매트리젤(U87MG)의 1:1 혼합물 또는 PBS 단독(LOX)중에 재현탁하였다. 마우스 1 마리당 0.2 mL 부피의 세포 현탁액(U87MG)에 대한 5 x 10⁶ 세포, LOX에 대한 2 x 10⁶ 세포)을 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 평균 부피가 약 100 내지 150 mm³에 도달하였을 때 이식 후 8 내지 26 일 동안 종양을 성장하도록 한 후 동물을 치료 군으로 랜덤화하였다: 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 U87MG 이종이식 마우스, 21 일 동안 매일 1 회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 U87MG 이종이식 마우스, 매일 1 회 비히클(클루셀 및 트윈)을 받은 LOX 이종이식 마우스, 및 11 일 동안 매일 1회 화합물 I을 10 mg/kg으로 받은 LOX 이종이식 마우스.

U87 MG 종양에 대하여 -17 % TGI 및 LOX 종양에 대하여 15 % TGI를 가짐으로써, U87MG 및 LOX 모델 모두 예측한 바와 같이 화합물 I에 의한 치료에 대하여 내성임을 증명하였다(도 12 참조).

노치 신호전달 차단의 특징인, 생체 내 화합물 I 치료 후 Hes1 mRNA의 하향조절이 상기 세포에서 적절히 유지되기 때문에, 화합물 I에 대한 U87MG 및 LOX 세포의 내성은 노치 억제의 손실에 의해 유발되지 않는다(도 13 참조).

실시예 10

이종 이식 모델에서 IL6 및 IL8의 혈청 수준을, 배양 배지로부터 생체 외 관측된 발현 차이를 반영하는지 여부를 결정하기 위해 측정하였다. 결과 데이터는 혈청 콜렉션이 환자의 IL6 및 IL8의 종양 수준을 모니터링하기 위해 임상학적으로 성공할 수 있는 접근법이 될 수 있음을 제안하였다.

하기 이종 이식 모델을 사용하여 종양을 견디는 마우스로부터 마우스 혈청을 수집하였다: A549, H460a, IL8-넉다운 H460a, U87MG 및 LOX(상기 기재된 방법을 이용하여 모델을 제조하였다). 상기 수집은 BD 마이크로테이너 혈청 분리 튜브(미국 뉴저지주 프랜클린 레이크 소재의 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson), 카탈로그 번호 365956)에서 레트로-오비탈 출혈 또는 심장 천자에 의해 수행되었다. 최소 10 분 동안 혈액이 응고되고, 마이크로원심분리기에서 10 분 동안 9000 rpm으로 회전하도록 하였다. 혈청을 수집하고, 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 위치시키고 -80 ℃에서 저장하였다.

A549 종양으로부터 마우스 혈청에서 분비된 인간 IL6 및 IL8은 ELISA에 의해 검출되기에는 너무 낮았다. 그러나, H460a, LOX 및 U87MG 이종이식 모델로부터 기원한 인간 IL6 및 IL8은 ELISA를 이용하여 혈청에서 용이하게 검출되었다(도 14). 게다가, IL8-넉다운 H460a 모델과 H460a 모델 사이에서 분비된 IL8 혈청 수준의 예상된 변화가 관측되었다.

일반적으로, 혈청에서 생체 내 관측된 IL6 및 IL8의 수준은 세포 배양으로부터 생체 외 관측된 양을 반영하였다. 그러나, 본 발명자들은 마우스 혈청으로부터 측정된 IL6 및 IL8과 세포 배양으로부터 측정된 것 사이에 약간의 차이가 있음을 관측하였다. 예를 들어, U87MG는 플라스틱 상에서 동일한 수의 세포에서 시딩하는 경우 H460a 보다 5 내지 6 배의 고 수준의 IL6 및 IL8을 분비하지만, 이는 마우스 혈청에서는 반영되지 않았다.

Claims

객체로부터 획득된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 측정함을 포함하되 상기 바이오마커가 인터루킨-6(IL6) 또는 인터루킨-8(IL8)인, 화합물 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성을 측정하는 방법.
제 1 항에 있어서,
객체가 포유류인, 방법.
제 1 항에 있어서,
객체가 인간인, 방법.
제 1 항에 있어서,
바이오마커가 IL6인 방법.
제 1 항에 있어서,
바이오마커가 IL8인 방법.
제 1 항에 있어서,
IL6 및 IL8 둘 다의 수준을 측정하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
생물학적 샘플이 혈액인, 방법.
제 1 항에 있어서,
생물학적 샘플이 혈청인, 방법.
제 1 항에 있어서,
생물학적 샘플이 소변인, 방법.
제 1 항에 있어서,
바이오마커가 샘플에 존재하는 단백질의 양을 측정함으로써 측정되는, 방법.
제 1 항에 있어서,
바이오마커가 상기 바이오마커를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정함으로써 측정되는, 방법.
제 1 항에 있어서,
샘플에 존재하는 바이오마커의 수준이 상기 바이오마커에 대한 한계 수준과 비교되고, 더 클 경우 상기 객체는 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대하여 생체 내 내성을 가지는 것으로 간주되는 방법.
제 12 항에 있어서,
바이오마커가 IL6이고, IL6에 대한 한계 수준이 약 500 pg/ml인, 방법.
제 12 항에 있어서,
바이오마커가 IL8이고, IL8에 대한 한계 수준이 약 50 pg/ml인, 방법.
객체로부터 획득된 생물학적 샘플에서 IL6 또는 IL8인 바이오마커의 검출용 제제를 포함하는, 화합물 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드에 의한 치료에 대한 객체의 내성 측정 보조용 키트.
약제, 특히 암과 같은 증식성 장애의 치료용 약제로서 사용하기 위한,
(A) 화합물 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드; 및
(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제
의 순차적 또는 동시적 조합.
제 16 항에 있어서,
항-IL6 및 항-IL8 제제 모두를 포함하는, 조합.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
항-IL6 제제가 항-IL6 항체인, 조합.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
항-IL8 제제가 항-IL8 항체인, 조합.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
항-IL6 제제가 IL6을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산인, 조합.
제 20 항에 있어서,
IL6을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이 안티센스 RNA인, 조합.
제 20 항에 있어서,
IL6을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이 shRNA 또는 siRNA인, 조합.
제 16 항, 제 17 항 및 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
항-IL8 제제가 IL8을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산인, 조합.
제 23 항에 있어서,
IL8을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이 안티센스 RNA인, 조합.
제 23 항에 있어서,
IL8을 암호화하는 핵산의 발현을 저지하는 핵산이 shRNA 또는 siRNA인, 조합.
(A) 화합물 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드; 및
(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제
를 포함하는 키트.
증식성 장애, 특히 암 치료용 약제의 제조를 위한,
(A) 화합물 2,2-다이메틸-N-((S)-6-옥소-6,7-다이하이드로-5H-다이벤조[b,d]아제핀-7-일)-N'-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-프로필)-말론아미드; 및
(B) 항-IL6 및/또는 항-IL8 제제
의 조합의 용도.
본원에 실질적으로 기재된 신규 방법, 조합, 용도 및 키트.