KR20130009770A

KR20130009770A - 성능-증강된 프로테아제 변이체

Info

Publication number: KR20130009770A
Application number: KR1020127023767A
Authority: KR
Inventors: 페트라 지게르트; 울리히 슈바네베르크; 모야 로니 마르티네즈; 마리온 메르켈; 아스트리트 슈피츠; 주잔네 비란트; 헨드릭 헬무트; 칼-하인츠 마우러
Original assignee: 헨켈 아게 운트 코. 카게아아
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2013-01-23
Also published as: WO2011110625A1; EP2545169B1; US20130005637A1; EP2545169A1; DE102010002762A1; US9365844B2

Abstract

본 발명에서, 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 인용된 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 SEQ ID NO. 1 에 따른 넘버링에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 갖는 프로테아제, 및 이러한 프로테아제를 포함하는 조성물은 프로테아제-민감성 오염에 대해 매우 양호한 정제 작용을 나타낸다.

Description

성능-증강된 프로테아제 변이체 {PERFORMANCE-ENHANCED PROTEASE VARIANT}

본 발명은 효소 기술 부문의 것이다. 본 발명은 특히, 이의 아미노산 서열이 특히 세척제 및 세정제에서의 용도에 있어서 개질된 프로테아제 및 이의 제조, 상응하는 개질을 갖는 모든 충분히 유사한 프로테아제 및 그를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 프로테아제 및 이를 함유하는 작용제, 특히 세척제 및 세정제의 방법 및 용도에 관한 것이다.

프로테아제는 모든 효소 중 기술적으로 가장 중요한 것이다. 세척제 및 세정제에 대해서 이는 가장 오래 확립된 효소이며, 특히 모든 현대 고성능 세척제 및 세정제에 실제적으로 함유되어 있다. 이는 세정할 물질 상의 단백질-함유 얼룩의 분해를 일으킨다. 이들 중 그 다음으로, 촉매적으로 유효한 아미노산으로 인해 세린 프로테아제 중에 분류되는 서브틸리신 (subtilisin) 유형의 프로테아제 (서브틸라아제, 서브틸로펩티다아제, EC 3.4.21.62) 가 특히 중요하다. 이들은 비특이적 엔도펩티다아제로서 작용하며 펩티드 또는 단백질 내에 위치하는 임의의 산-아미드 결합을 가수분해한다. 이들의 최적 pH 는 통상 현저하게 알칼리 범위 내에 있다. 상기 패밀리의 개괄이, 예를 들어 논문 ["Subtilases: subtilisin-like proteases" by R. Siezen, in "Subtilisin enzymes" pp. 75-95, edited by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996] 에 의해 제공된다. 서브틸라아제는 미생물에 의해 자연적으로 형성되며; 이들 중, 바실러스 (Bacillus) 종에 의해 형성되고 분비된 서브틸리신이 특히 서브틸라아제 내의 가장 유의한 군으로서 언급된다.

세척제 및 세정제에 바람직하게 사용되는 서브틸리신 유형 프로테아제의 예시는 서브틸리신 BPN' 및 Carlsberg, 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 특히 바실러스 렌투스 DSM 5483 으로부터의 프로테아제, 서브틸리신 DY, 및 효소 (그러나, 엄격한 의미에서 서브틸라아제로서 분류되며 더 이상 서브틸리신으로서 분류되지 않는) 테르미타아제, 프로테이나아제 K, 및 프로테아제 TW3 및 TW7, 뿐 아니라 초기 프로테아제에 비해 개질된 아미노산 서열을 나타내는 전술한 프로테아제의 변이체이다. 프로테아제는, 현존 업계에서 알려져 있는 방법을 사용하여 제어 또는 무작위 방식으로 개질되며, 이로써 예를 들어 세척제 및 세정제에 사용하기 위해 최적화된다. 이들은 점 돌연변이유발, 결실 또는 삽입 돌연변이유발, 또는 다른 단백질 또는 단백질 부분과의 융합을 포함한다. 상응하게 최적화된 변이체는 따라서 현존 업계에서 알려져 있는 대부분의 프로테아제에 대해 알려져 있다.

국제 특허 출원 WO 03/054185 는 바실러스 집소니이 (Bacillus gibsonii) (DSM 14391) 로부터의 알칼리 프로테아제를 개시한다 (세척제 또는 세정제에서의 이의 용도 포함). 상기 균주는 1977 년 4 월 28 일의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms) 에 따라 2001 년 3 월 1 일에 지정 표시 ID 01-192 및 기입 번호 DSM 14391 하에 독일 미생물 및 세포배양 콜렉션 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH], Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) 에 기탁되었다. 이들 프로테아제는 상기 인용한 프로테아제에 비해 아미노산 서열에 있어서 필적할만한 차이를 나타내어, 아미노산 서열의 동일성 비교로 80% 미만의 동일성 값이 산출된다. 바실러스 집소니이 (DSM 14391) 로부터의 알칼리 프로테아제에 대해서, 세척제 및 세정제에서 사용하기 위해 최적화된 단지 몇몇의 프로테아제 변이체만이 지금까지 현존 업계에 알려져 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 바실러스 집소니이 DSM 14391 로부터의 알칼리 프로테아제 유형의 프로테아제 및/또는 이와 충분히 동일한 프로테아제 (서열 동일성에 있어서) 를 추가로 개발하고, 세척제 또는 세정제에서 사용하기에 적합하고 유리하게 향상되는 이의 프로테아제 변이체를 수득하는 것이다.

본 발명의 주제는 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 프로테아제이다.

본 발명의 추가의 주제는 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 초기 프로테아제에 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서의 아미노산 치환 I21V 를 도입하는 것을 포함하는, 프로테아제 제조 방법이다.

그러므로, 본 특허 출원의 목적을 위한 "프로테아제" 는 프로테아제 그 자체 및 본 발명에 따른 방법으로 제조된 프로테아제 모두를 포함한다. 따라서, 프로테아제에 관련한 모든 서술은 물질로서의 프로테아제 및 상응하는 방법, 특히 프로테아제 제조 방법 모두를 지칭한다.

본 발명의 추가적인 주제로서 본 발명에 따른 프로테아제 및/또는 본 발명에 따른 프로테아제의 제조 방법과 관련하여, 이는 상기 프로테아제를 코딩하는 핵산, 비-인간 숙주 세포를 함유하는 본 발명에 따른 프로테아제 또는 핵산 뿐 아니라 작용제, 특히 세척제 및 세정제, 세척 및 세정 방법, 및 본 발명에 따른 프로테아제를 통해 정의되는 용도 (본 발명에 따른 프로테아제를 포함) 이다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 개질이 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에서의 위치 21 의 본 발명에 따른 개질이, 이들 개질을 나타내지 않는 상응하는 프로테아제에 비해 세척제 및 세정제에 있어서 개질된 프로테아제 성능의 향상을 야기한다는 것이 발견되었다. 특히 본 발명에 따른 개질된 프로테아제가 현존 업계에서 확립된 추가의 서브틸리신, 예컨대 서브틸리신 309, PB92, 바실러스 렌투스 DSM 5483 으로부터의 알칼리 프로테아제, 또는 BPN' 등과 현저히 상이하기 때문에, 이는 놀라운 것이다. 예를 들어, SEQ ID NO. 1 을 갖는 프로테아제는 서브틸리신 309 에 대해 78.4% 동일하고, PB92 에 대해 78.1% 동일하고, 바실러스 렌투스 DSM 5483 으로부터의 알칼리 프로테아제에 대해 77.7% 동일하고, BPN' 에 대해 55.3% 동일하다 (SEQ ID NO. 1 은 바실러스 집소니이 (DSM 14391) 로부터의 성숙 프로테아제의 서열을 개시함). 그러므로, 바실러스 집소니이 (DSM 14391) 로부터의 알칼리 프로테아제 유형의 프로테아제에 대해서, SEQ ID NO. 1 에 따른 성숙 효소에 관해, 세척제 및 세정제에서 사용하기 위해 향상된 성능을 갖는 프로테아제 변이체가 바실러스 집소니이 (DSM 14391) 로부터의 알칼리 프로테아제의 카운트에 있어서 위치 21 에서의 개질에 의해 수득될 수 있다는 것을 예측할 수 없었다.

본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 구현예는 예를 들어, 상기 목적을 위해 확립된 단백질분해 효소 작용제의 세정 성능, 및 사실상 이를 넘어서는 각종 얼룩에 대한 기여도에 가깝게 충분히 양호한 프로테아제를 함유하는 세척제 또는 세정제의 세정 성능에 기여한다. 본 발명에 따른 프로테아제는 그 결과, 텍스타일 및/또는 경질 표면, 예를 들어 식기류 상의 하나 이상, 바람직하게는 다수의 프로테아제-민감성 얼룩의 향상된 제거를 가능하게 한다. 특히 유리한 세정 성능 효과는 초콜렛- 또는 코코아-함유 얼룩에 대한 본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 구현예에 의해 나타난다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예는 그의 세정 성능이 하나의 얼룩 또는 유사 유형의 다수 얼룩에 관해 특히 유리한 얼룩-특이적 프로테아제를 제공한다. 초콜렛- 또는 코코아-함유 얼룩에 관한 본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 구현예의 스팟 포커스가 결과적으로 향상된다.

본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 구현예는 심지어 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 30℃, 및 10℃ 내지 25℃, 예를 들어 20℃ 의 저온에서도 이러한 유리한 세정 성능을 이미 성취한다.

또한, 본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 구현예는 계면활성제 및/또는 표백제 및/또는 온도 영향, 특히 고온 또는 저온 및/또는 산 또는 알칼리 조건 및/또는 pH 변화 및/또는 변성제 또는 산화제 및/또는 단백질분해적 파괴 및/또는 산화환원 조건에 있어서의 변화에 관해 특이적 안정성을 갖는다.

본 발명에 따른 프로테아제는 특히 세척제 또는 세정제에 있어서 단백질분해 활성을 나타내는데, 즉 이는 폴리펩티드 및/또는 단백질의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 프로테아제는 펩티드 결합을 가수분해할 수 있으며 따라서 펩티드 또는 단백질을 절단할 수 있는 효소이다.

본 발명에 따른 프로테아제는 세척제 및 세정제에서 사용하기 위해, 이의 단백질분해 활성 및/또는 이의 추가적인 특성을 기반으로, 특히 계면활성제 및/또는 표백제 및/또는 이의 온도 프로파일 및/또는 이의 pH 프로파일과 관련하여 적합하다. 그러므로 이는 텍스타일 및/또는 경질 표면, 예를 들어 식기류 상의 하나 이상, 바람직하게는 다수의 프로테아제-민감성 얼룩의 향상된 제거를 가능하게 한다. 특히 유리한 세정 성능 효과는 예를 들어 풀 (grass) 및/또는 계란 (egg) 및/또는 초콜렛 우유 및/또는 카본 블랙 및/또는 코코아 및/또는 혈액 및/또는 우유를 함유하는 얼룩, 예를 들어 하기의 얼룩 상에서 본 발명에 따른 프로테아제에 의해 나타난다:

면직물 상의 풀: Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialen AG [Swiss federal materials and testing agency test materials], St. Gallen, Switzerland 에서 입수가능한 제품 번호 164,

면직물 상의 전란/안료 (전란/카본 블랙): wfk Testgewebe GmbH [Test fabrics], Brueggen-Bracht, Germany 의 제품 번호 10N,

면직물 상의 초콜렛 우유/카본 블랙: CFT (Center For Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-03,

면직물 상의 코코아: Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialen AG, St. Gallen, Switzerland 에서 입수가능한 제품 번호 112,

면직물 상의 혈액-우유/잉크: CFT (Center For Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-05.

본 발명에 따른 프로테아제는 초콜렛- 또는 코코아-함유 얼룩, 예를 들어 상기 인용한 얼룩 C-03 및/또는 EMPA 112 에서 매우 특히 유리하게 효과적이다.

또한 놀랍게도, 심지어 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 30℃, 및 10℃ 내지 25℃, 예를 들어 20℃ 의 저온에서도 이러한 유리한 세정 성능 효과가 성취된다는 것이 발견되었다.

"세정 성능" 은 본 발명의 맥락에 있어서 하나 이상의 얼룩, 특히 세탁물 또는 식기류 상의 증백 성능으로서 이해된다. 본 발명의 맥락에 있어서, 프로테아제를 포함하는 세척제 또는 세정제, 및/또는 상기 작용제로 구성되는 세척조 및/또는 세정조, 및 프로테아제 자체 모두는 각각의 세정 성능을 갖는다. 따라서 효소의 세정 성능은 작용제 및/또는 상기 작용제에 의해 구성된 세척조 또는 세정조의 세정 성능에 기여한다. 세정 성능은 바람직하게는 하기 나타낸 바와 같이 확인된다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99,25%, 매우 특히 바람직하게는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 위치 1 내지 20 및 22 내지 269 에서의 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 매치되는 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타낸다. 이러한 종류의 바람직한 프로테아제는 SEQ ID NO. 2 하에 표시되며, 즉 본 발명에 따른 프로테아제는 바람직하게는 SEQ ID NO. 2 를 포함한다.

놀랍게도, 생성되는 프로테아제의 성능에 있어서의 향상을 수득하기 위해서, 위치 21 에서 존재하는 아미노산을 개질하기 위한 추가의 대안적 가능성이 존재한다는 것이 또한 발견되었다. 기본적으로 중요한 것은, 프로테아제가 상기 위치에서 SEQ ID NO. 1 에 관해 사실상 개질되며, 즉 상기 위치에서 존재하는 아미노산이 또다른 단백질 생성 아미노산, 즉 알라닌 또는 아르기닌 또는 아스파라긴 또는 아스파르트산 또는 시스테인 또는 글루타민 또는 글루탐산 또는 글리신 또는 히스티딘 또는 류신 또는 리신 또는 메티오닌 또는 페닐알라닌 또는 프롤린 또는 세린 또는 트레오닌 또는 트립토판 또는 티로신 또는, 특히, 발린에 의해 대체된다는 것이다. 발린이 전술한 아미노산의 이러한 위치에서 특히 유리하기 때문에, 발린에 관해 보존적인 아미노산이 바람직하며, 즉, (발린이 이러한 아미노산에 의해 대체되는 정도까지) 극성 또는 전하에 있어서 변화를 야기하지 않는 것들, 특히 글리신, 알라닌, 이소류신, 류신 및 메티오닌이 바람직하다.

핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 측정된다. 이러한 서열 비교는 현존 업계에서 확립되며 통상 사용되는 BLAST 알고리즘을 기초로 하고 (예를 들어 Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, 및 Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25, pp. 3389-3402 참조), 원칙적으로는 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에 있어서의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 유사 연속물을 상호적으로 연관시켜 달성된다. 관련 위치의 표로 나타낸 연관을 "정렬" 이라고 지칭한다. 현존 업계에서 이용가능한 추가의 알고리즘은 FASTA 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 특히 다수 서열 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 준비된다. Clustal series (예를 들어 Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500 참조), T-Coffee (예를 들어 Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217 참조), 또는 이들 프로그램 또는 알고리즘을 기초로 하는 프로그램이 종종 사용된다. 본 특허 출원에서, 모든 서열 비교 (정렬) 는 미리 정의된 디폴트 매개변수를 갖는 컴퓨터 프로그램 Vector NTI

Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) 을 사용하여 준비하였다 (서열 비교를 위한 이의 AlignX 모듈은 ClustalW 를 기초로 함).

이러한 종류의 비교는 또한 비교하는 서열의 서로에 대한 유사성에 관한 언급을 허용한다. 이는 통상 동일성 %, 즉 정렬에서 서로에 대해 상응하는 위치에서 및/또는 동일 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율로서 표시된다. 보다 광범위하게 이해되는 용어 "상동성" 은 또한, 아미노산 서열의 맥락에 있어서, 보존된 아미노산 교환, 즉 유사한 화학적 활성을 갖는 아미노산의 고려를 포함하는데, 이는 이들이 통상 단백질 내에서 유사한 화학적 활성을 수행하기 때문이다. 그러므로 비교된 서열의 유사성은 또한 "상동성 %" 또는 "유사성 %" 로서 표시될 수 있다. 동일성 및/또는 상동성의 표시는 전체 폴리펩티드 또는 유전자에 걸쳐, 또는 단지 개별적인 부위에 걸쳐 발생할 수 있다. 따라서, 각종 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 상동의 및/또는 동일한 부위는 서열 내 매치에 의해 정의된다. 이러한 부위는 종종 동일한 기능을 나타낸다. 이는 작을 수 있으며, 단지 몇 안 되는 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 작은 부위는 종종 단백질의 전체 활성에 필수적인 기능을 수행한다. 그러므로, 이는 오직 개별적, 임의로는 작은 부위에 대한 서열 매치를 나타내는데 유용할 수 있다. 그러나, 다르게 표시하지 않는 한, 본 출원에서 동일성 및/또는 상동성의 표시는 각각 표시된 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 전체 길이를 지칭한다.

본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서 상기 프로테아제는, 그의 세정 성능이, 적어도 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에 대해, 및/또는 적어도 SEQ ID NO. 2 에서 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에 대해, 및/또는 적어도 SEQ ID NO. 3 에 따른 프로테아제에 대해 상응하는 것을 특징으로 하며, 상기 세정 성능은 세척조 1 ℓ 당 4.5 내지 7.0 g 의 투여비로 세척제 뿐 아니라 프로테아제를 함유하는 세척 시스템에서 측정되는데, 비교할 프로테아제는 동일-활성 기초로 사용되며 세정 성능은 하기 얼룩 중 하나 이상: 면직물 상의 혈액-우유/잉크, 면직물 상의 초콜렛-우유/카본 블랙, 폴리에스테르/면직물 상의 땅콩 오일-안료/잉크, 및 면직물 상의 풀, 특히 하기 얼룩 중 하나 이상:

면직물 상의 혈액-우유/잉크: CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-05,

면직물 상의 초콜렛-우유/카본 블랙: CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-03,

폴리에스테르/면직물 상의 땅콩 오일-안료/잉크: CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 PC-10,

면직물 상의 풀: Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Switzerland 에서 입수가능한 제품 번호 164

에 대해, 세척된 텍스타일의 백색도를 측정함으로써 측정되며, 세척 절차는 30 분 이상, 임의로는 60 분 동안, 40℃ 의 온도에서 수행되고, 물의 경도는 15.5 내지 16.5°(독일 경도 (German degrees of hardness)) 이다.

이러한 종류의 세척 시스템에 대한 바람직한 액체 세척제는 하기의 조성을 갖는다 (모든 표시는 중량% 임): 0.3 내지 0.5% 잔탄, 0.2 내지 0.4% 소포제, 6 내지 7% 글리세롤, 0.3 내지 0.5% 에탄올, 4 내지 7% FAEOS (지방 알코올 에테르 술페이트), 24 내지 28% 비이온성 계면활성제, 1% 붕산, 1 내지 2% 나트륨 시트레이트 (이수화물), 2 내지 4% 소다, 14 내지 16% 코코넛 지방산, 0.5% HEDP (1-히드록시에탄-(1,1-디포스폰산)), 0 내지 0.4% PVP (폴리비닐피롤리돈), 0 내지 0.05% 광학 증백제, 0 내지 0.001% 염료, 나머지는 탈이온수. 액체 세척제의 투여비는 세척조 1 ℓ 당 바람직하게는 4.5 내지 6.0 g, 예를 들어 세척조 1 ℓ 당 4.7, 4.9 또는 5.9 g 이다. 세척은 바람직하게는 pH 8 내지 pH 10.5, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 9 의 pH 범위 내에서 수행된다.

이러한 종류의 세척 시스템에 대한 바람직한 분말화 세척제는 하기 조성을 갖는다 (모든 표시는 중량% 임): 10% 선형 알킬벤젠술포네이트 (나트륨 염), 1.5% C12 내지 C18 지방 알코올 술페이트 (나트륨 염), 2.0% C12 내지 C18 지방 알코올 (7 EO 를 가짐), 20% 탄산나트륨, 6.5% 탄산수소나트륨, 4.0% 비정질 나트륨 디실리케이트, 17% 나트륨 카르보네이트 퍼옥소히드레이트, 4.0% TAED, 3.0% 폴리아크릴레이트, 1.0% 카르복시메틸 셀룰로오스, 1.0% 포스포네이트, 25% 황산나트륨; 나머지: 거품 저해제, 광학 증백제, 향. 분말화 세척제의 투여비는 세척조 1 ℓ 당 바람직하게는 5.5 내지 7.0 g, 예를 들어 세척조 1 ℓ 당 5.6, 5.9 또는 6.7 g 이다. 세척은 바람직하게는 pH 9 내지 pH 11 의 pH 범위 내에서 수행된다.

40℃ 에서의 세정 성능의 측정은 본 발명의 맥락에 있어서 상기 표시한 고체 세척제를 사용하여 수행된다.

백색도, 즉 얼룩의 증백을, 바람직하게는 광학 측정법을 사용하여, 바람직하게는 광도계적으로, 세척 성능의 표시로서 측정한다. 이를 위해 적합한 장치는 예를 들어 Minolta CM508d 광도계이다. 측정용으로 사용하는 장치는 통상 백색 표준, 바람직하게는 유닛과 함께 제공되는 백색 표준을 사용하여 사전에 교정된다.

각각의 프로테아제의 동일-활성 이용은, 총 단백질에 대한 활성 물질의 비 (특이적 활성에 대한 값) 의 일부 격차가 존재할지라도, 각각의 효소 특성, 즉 예를 들어 특정 얼룩 상의 세정 성능이 비교된다는 것을 확실하게 한다. 이는 일반적으로, 다량의 단백질을 추가함으로써 낮은 특이적 활성이 보상될 수 있는 경우이다. 프로테아제 활성을 측정하는 방법은 효소 기술 분야의 당업자에게 친숙한 것이며, 일상적 근거로 당업자에 의해 적용된다. 이러한 방법은 예를 들어 Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132 에서 개시된다. 대안적으로는, 프로테아제 활성은 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐라이드 기질 (AAPF) 로부터의 파라-니트로아닐린 (pNA) 발색단의 방출을 통해 정량적으로 측정될 수 있다. 프로테아제는 기질을 절단하며 pNA 를 방출시킨다. pNA 의 방출은 410 nm 에서의 흡광에 있어서 증가를 일으키는데, 시간에 걸친 변화는 효소 활성의 표시이다 (Del Mar et al., 1979 참조). 측정은 25℃ 의 온도, pH 8.6, 410 nm 의 파장에서 수행된다. 측정 시간은 5 분이며, 측정 간격은 20 초 내지 60 초이다.

단백질 농도는 알려져 있는 방법, 예를 들어 BCA 방법 (비친초닌산 (bichinchoninic acid); 2,2'-비퀴놀릴-4,4'-디카르복실산) 또는 뷰렛법 (A.G. Gornall, C.S. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766) 의 도움으로 측정될 수 있다. 이와 관련하여, 적합한 불가역성 저해제를 사용하여 (프로테아제에 대해서, 예를 들어, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF)) 활성 중심을 적정하고 잔류 활성을 측정함으로써 (M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913 참조) 활성 단백질 농도를 측정할 수 있다.

프로테아제 활성은 통상 프로테아제 단위 (PU) 로 표시된다. 적합한 프로테아제 활성은, 세척조 1 ㎖ 당 예를 들어 2.5, 5 또는 10 PU 이다. 그러나 프로테아제 활성은 0 이 아니다.

상기 설명한 아미노산 개질에 추가로, 본 발명에 따른 프로테아제는 추가의 아미노산 개질, 특히 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 프로테아제는, 예를 들어, 표적화 유전적 개질에 의해, 즉 돌연변이유발법을 통해 추가로 개발되며, 특정 목적을 위해 또는 특수한 특성과 관련하여 (예를 들어, 이의 촉매적 활성, 안정성 등과 관련하여) 최적화된다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 재조합 제형에 도입될 수 있으며, 따라서 완전히 신규한 프로테아제 또는 다른 폴리펩티드를 생성시키는데 사용될 수 있다.

목적은 치환, 삽입 또는 결실과 같은 표적화 돌연변이를, 예를 들어 본 발명에 따른 효소의 세정 성능을 향상시키기 위해서 알려져 있는 분자에 도입하는 것이다. 이러한 목적을 위해서, 특히, 분자의 표면 전하 및/또는 등전점, 및 이에 따른 기질과의 그의 상호작용을 개질할 수 있다. 예를 들어, 효소의 순 전하는, 특히 세척제 및 세정제에서 사용을 위해 그로써 기질 결합에 영향을 주기 위하여 개질될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 프로테아제의 안정성은 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 통해 증강될 수 있으며, 이로써 이의 세정 성능이 향상될 수 있다. 개별적 돌연변이, 예를 들어 개별적 치환의 유리한 특성은 서로를 보충할 수 있다. 그러므로 특정 특성에 관해, 예를 들어 계면활성제 및/또는 표백제 및/또는 기타 성분에 있어서의 이의 안정성에 관해 이미 최적화된 프로테아제가 본 발명의 맥락에 있어서 추가로 더 개발될 수 있다.

하기의 관례를 사용하여 정확히 하나의 아미노산 위치에 관련되는 치환 (아미노산 교환) 을 기재한다: 먼저, 자연적으로 존재하는 아미노산을 국제적으로 통상적인 단문자 코드의 형태로 지정하고; 이에 관련 서열 위치가 뒤따르고, 마지막으로, 삽입된 아미노산이 뒤따름. 동일한 폴리펩티드 사슬 내 다수의 교환을 사선에 의해 서로 구분한다. 삽입에 대해서, 추가적인 아미노산을 서열 위치 뒤에 명칭 짓는다. 결실에 대해서, 없어지는 아미노산을 기호, 예를 들어 별표 또는 점선에 의해 대체한다. 예를 들어, "A95G" 는 위치 95 에서 알라닌의 글리신으로의 치환을 나타내고; "A95AG" 는 위치 95 에서 아미노산 알라닌 후 글리신의 삽입을 나타내고; "A95*" 는 위치 95 에서 알라닌의 결실을 나타낸다. 이러한 명명법은 효소 기술 업계의 당업자에게 알려져 있다.

그러므로, 본 발명의 추가의 주제는 단일 또는 다수의 보존적 아미노산 치환에 의해 초기 분자로서 상기 기재된 바와 같은 프로테아제로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 프로테아제이며, 상기 프로테아제는 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타낸다. 용어 "보존적 아미노산 치환" 은 또다른 아미노산 잔기에 대한 하나의 아미노산 잔기의 교환 (치환) 을 의미하는데, 상기 교환은 교환된 아미노산의 위치에서의 극성 또는 전하에 있어서의 변화를 일으키지는 않는다 (예를 들어 또다른 비극성 아미노산 잔기에 대한 비극성 아미노산 잔기의 교환). 본 발명의 맥락에 있어서의 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T 를 포함한다.

대안적으로 또는 추가적으로, 상기 프로테아제는 절편화에 의해, 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 초기 분자로서 본 발명에 따른 프로테아제로부터 수득가능한 것을 특징으로 하며, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266 또는 267 의 연속적으로 연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 초기 분자에 매치되는 아미노산 서열을 포함하고, 초기 분자에 포함되는 아미노산 치환 I12V 가 여전히 존재하는 것을 특징으로 한다.

따라서 예를 들어, 결과적으로 단백질분해 활성에 있어서 감소나 손실이 없는 효소 루프 내 또는 말단에서의 개별적 아미노산을 결실시킬 수 있다. 또한 예를 들어, 관련 효소의 알레르기유발성은 또한 이러한 절편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발을 통해 감소될 수 있으므로, 이의 전체 이용성을 향상시킨다. 유리하게는, 효소는 심지어 돌연변이유발 후에도 그의 단백질분해 활성을 보유하는데, 즉, 그의 단백질분해 활성이 적어도 초기 효소에 상응한다. 치환 역시, 유리한 효과를 나타낼 수 있다. 개별적 및 다수의 연속적으로 연결된 아미노산 모두 다른 아미노산에 대해 교환될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 프로테아제는 SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스로부터 프로테아제의 위치 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 및 268 과 정렬에 있어서 연관되는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 초기 분자로서 본 발명에 따른 프로테아제로부터 수득가능한 것을 특징으로 하여, 상기 프로테아제는 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타낸다. 여기서 추가의 아미노산 위치는 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열과 SEQ ID NO. 3 에서 나타낸 바와 같은 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열과의 정렬에 의해 정의된다. 이러한 종류의 정렬을 도 1 에 표시한다. 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제가 새로운 프로테아제 및 아미노산 개질을 기재하기 위한 현존 업계에서의 중요한 참조 분자를 나타내며 여기서 기재된 새로운 프로테아제 (및 따라서 그의 서열 또한) 가 미상의 것이기 때문에, 아미노산 위치의 연관성에 있어서 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제 (SEQ ID NO. 3) 를 참조하는 것이 유리하다. 또한 상기 위치의 연관성은 성숙 단백질로 집중된다. 이러한 연관성은 특히, 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열이 SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제보다 더 큰 수의 아미노산 잔기를 포함하는 경우 또한 이용된다. 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열에 있어서 전술한 위치로부터 기인하여, 본 발명에 따른 프로테아제의 개질 위치는 예를 들어 도 1 에 따른 정렬에서의 이들 위치와 사실상 연관되는 것들이다.

본 발명에 따른 프로테아제의 상동의 위치에 옮겨지는 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제의 서열 개질, 특히 치환에 대한 유리한 위치는 바람직하게는 중요한 것이며 프로테아제에 유리한 기능적 특성을 부여하고, 따라서 SEQ ID NO. 3 과의 정렬에 있어서 위치 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 및 268 과 연관되며 따라서 SEQ ID NO. 3 에 따른 카운트 내에 있다. 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제의 야생형 분자에서의 전술한 위치에 위치한 아미노산 잔기는 하기의 것이다: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, 1102, S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255, 각각 T268.

예를 들어, 치환 3T, 4I, 61A, 99G, 99A, 99S, 99E, 154D, 154E, 211D, 211G 및 211E 이 특히 유리한데, 본 발명에 따른 프로테아제에서의 상응하게 상동인 위치가 이들 바람직한 아미노산 중 하나에 의해 이미 자연적으로 점유되지 않는 정도까지, 특히 유리하다. 분자에 대한 안정화 효과를 통해, 교환 3T 및 4I 는 프로테아제의 세정 성능에 있어서의 향상을 야기하며, 그에 따라 상기 프로테아제를 함유하는 세척제 또는 세정제의 향상된 세정 성능을 야기한다.

개질되는 아미노산의 올바른 연관성, 즉 특히 이들의 기능적 관련성의 추가적 확인이, 정렬을 기초로 하여 서로 연관되는 2 개 위치가 서로 비교되는 프로테아제 모두와 동일한 방식으로 개질되며 둘의 효소적 활성이 동일한 방식으로 개질되는지 여부를 관찰하는 비교 실험에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스로부터의 프로테아제의 특정 위치에서의 아미노산 교환이 효소적 매개변수의 변화, 예를 들어 K_M 값의 상승에 의해 이루어지는 경우, 그리고 효소적 매개변수의 상응하는 변화, 따라서 예를 들어 마찬가지로 K_M 값의 상승이 동일 도입 아미노산을 통해 아미노산 교환이 이루어진 본 발명에 따른 프로테아제 변이체에서 관찰되는 경우, 이는 본 발명의 이러한 양상의 확인으로서 여겨진다.

모든 전술한 면들은 또한 프로테아제 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에 적용가능하다. 그러므로 본 발명에 따른 방법은 하기의 하나 이상의 방법 단계를 추가로 포함한다:

(a) 단일 또는 다수의 보존적 아미노산 치환을 도입하여, 프로테아제가 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 단계;

(b) 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266 또는 267 의 연속적으로 연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 초기 분자에 매치되는 아미노산 서열을 포함하는 방식으로, 절편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 개질하여, 초기 분자에 포함되는 아미노산 치환 I12V 가 여전히 존재하는 단계;

(c) SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스로부터 프로테아제의 위치 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 및 268 과 정렬에 있어서 연관되는 하나 이상의 위치에 단일 또는 다수의 아미노산 치환을 도입하여, 프로테아제가 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 단계.

모든 서술은 또한 본 발명에 따른 방법에 적용된다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 프로테아제 및/또는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 프로테아제는 여전히 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99,25% 또는 99.5% 동일하다. 프로테아제 및/또는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 프로테아제는 아미노산 치환 I21V 를 나타낸다.

본 발명의 추가적인 주제는, 하나 이상의 화학적 개질을 나타내는 것을 특징으로 하는 상기 기재된 바와 같은 프로테아제이다. 이러한 개질을 갖는 프로테아제를 유도체, 즉 프로테아제가 유도체화된 것으로 지칭한다.

본 출원의 목적을 위해서, "유도체"는 따라서 그의 순수 아미노산 사슬이 화학적으로 개질된 이들 단백질로서 이해된다. 이러한 유도체화 공정은 예를 들어 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 생체내 (in vivo) 수행될 수 있다. 지질 또는 올리고당과 같은 저분자량 화합물의 연결이 특히 본 맥락에 있어서 강조된다. 그러나 유도체화는 또한, 예를 들어 아미노산의 측쇄의 화학적 전환, 또는 상이한 화합물의 단백질로의 공유 결합에 의해 시험관내 (in vitro) 실행될 수 있다. 예를 들어, 등전점을 개질하기 위한 효소의 카르복실기에 대한 아민의 연결이 가능하다. 또다른 이러한 화합물은 또한, 예를 들어 본 발명에 따른 단백질에 이관능성 화학적 화합물을 통해 결합하는 추가의 단백질일 수 있다. 마찬가지로, "유도체화" 는 거대분자 담체에 대한 공유 결합으로서, 또는 적합한 거대분자 케이지 구조 내로의 비공유 혼입으로서 이해된다. 유도체화는 예를 들어, 기질에 대한 결합의 기질 특이성 또는 세기에 영향을 줄 수 있거나, 연결된 물질 ( linked-on substance) 이 저해제인 경우 효소적 활성의 일시적 차단을 야기할 수 있다. 이는 예를 들어 저장 기간에 유용할 수 있다. 이러한 종류의 개질은 또한 안정성 또는 효소적 활성에 영향을 줄 수 있다. 이는 또한 단백질의 알레르기유발성 및/또는 면역원성을 감소시킬 수 있어, 예를 들어 이의 피부 화합성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 거대분자 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜에 대한 연결은 안정성 및/또는 피부 적합성에 관해 단백질을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 단백질의 "유도체" 는 또한 상기 단백질의 제조물로서 광범위한 의미로 이해될 수 있다. 회수, 가공 또는 제조에 따라, 단백질은 예를 들어 생성 미생물의 배양물로부터의 다양한 기타 물질과 연관될 수 있다. 단백질은 또한 이에 의도적으로 추가되는 기타 물질을 가져, 예를 들어 이의 저장 안정성을 증강시킬 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 단백질의 모든 제조물은 또한 본 발명에 따른 것이다. 이는 또한 특정 제조물에서의 상기 효소적 활성을 실제로 나타내는지 여부와 관계가 없다. 이는, 저장 동안 약간의 활성을 갖거나 활성을 갖지 않고, 사용시에만 이의 효소적 기능을 수행하는 것이 바람직할 수 있기 때문이다. 이는 예를 들어 상응하는 동반 물질을 통해 제어될 수 있다. 프로테아제 저해제와 함께 프로테아제를 제조하는 것이 특히 유리하다.

상기 기재된 모든 프로테아제 및/또는 프로테아제 변이체 및/또는 유도체에 관련하여, 그의 활성이 적어도 SEQ ID NO. 1 및/또는 SEQ ID NO. 2 및/또는 SEQ ID NO. 3 에 따른 프로테아제에 상응하고/하거나 그의 세정 성능이 적어도 SEQ ID NO. 1 및/또는 SEQ ID NO. 2 및/또는 SEQ ID NO. 3 에 따른 프로테아제에 상응하는 것들이 본 발명의 맥락에 있어서 특히 바람직한데, 상기 세정 성능은 상기 기재된 바와 같은 세척 시스템에서 측정된다.

본 발명의 추가적인 주제는 본 발명에 따른 프로테아제를 코딩하는 핵산 뿐 아니라 상기 핵산을 포함하는 벡터, 특히 카피 벡터 또는 발현 벡터이다.

이들은 DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 이는 개별적 가닥으로서, 상기 개별적 가닥에 대해 상보적인 개벌적 가닥으로서, 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. DNA 분자로는 특히, 모든 3 개의 가능한 판독 프레임에서의 둘 모두의 상보적 가닥의 서열이 각각의 경우 고려된다. 또한 고려되는 것은, 상이한 코돈, 즉 염기 삼중항이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있어, 특정 아미노산 서열이 다수의 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있다는 사실이다. 이러한 유전적 코드의 퇴화의 결과로서, 상기 기재된 프로테아제 중 하나를 인코딩할 수 있는 모든 핵산 서열이 본 발명의 이러한 주제에 포함된다. 숙련자는 이들 핵산 서열을 명백히 측정할 수 있는데, 이는 유전적 코드의 퇴화에도 불구하고, 정의된 아미노산이 개별적 코돈과 연관되기 때문이다. 그러므로 숙련자는 아미노산 서열로부터 기인하여, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 쉽게 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산의 맥락에 있어서, 하나 이상의 코돈은 비슷한 코돈에 의해 대체될 수 있다. 이러한 양상은 특히 본 발명에 따른 효소의 이종 발현을 의미한다. 예를 들어, 모든 유기체, 예를 들어 생성 균주의 숙주 세포는 특이적 코돈 이용도를 갖는다. "코돈 이용도" 는 각각의 유기체에 의한 유전적 코드의 아미노산으로의 번역으로서 이해된다. 핵산 상에 위치하는 코돈이 유기체 내에서 비교적 소수의 로딩된 tRNA 분자와 직면하는 경우, 단백질 생합성에서 병목현상이 발생할 수 있다. 또한 이는 동일한 아미노산을 코딩하는데, 그 결과는 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하는 비슷한 코돈보다 덜 효과적으로 유기체 내에서 번역되는 것이다. 비슷한 코돈에 대한 다수의 tRNA 분자의 존재로 인해, 이는 유기체 내에서 보다 효과적으로 번역될 수 있다.

특히 바람직한 핵산의 예시를 SEQ ID NO. 4 에 나타낸다.

오늘날 흔히 알려져 있는 방법, 예를 들어 분자 생물학 또는 단백질 화학의 표준 방법과 조합한 화학적 합성 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 에 의해, 숙련자는 알려져 있는 DNA 서열 및/또는 아미노산 서열을 기초로 하여, 유전자를 완결하기 위해 상응하는 핵산을 완전히 제조하는 능력을 갖는다. 이러한 방법은 예를 들어, [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Laboratory Press] 로부터 알려져 있다.

"벡터" 는 특징적인 핵산 부위로서 본 발명에 따른 핵산을 포함하는, 핵산으로 이루어지는 요소로서, 본 발명의 목적을 위해 이해된다. 이는 상기 핵산이 여러 세대 또는 세포 분열에 걸쳐 종 또는 세포주에서 안정한 유전적 요소로서 확립되게 할 수 있다. 특히 박테리아에서 사용되는 경우, 벡터는 특이적 플라스미드, 즉 원형의 유전적 요소이다. 본 발명의 맥락에 있어서, 본 발명에 따른 핵산은 벡터 내에 클로닝된다. 벡터 중에 포함되는 것은, 예를 들어, 그의 기원이 박테리아 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지인 것들, 또는 광범위하게 상이한 유래의 요소를 갖는 대부분의 합성 벡터 또는 플라스미드이다. 각각의 경우 존재하는 추가의 유전적 요소를 사용하여, 벡터는 여러 세대에 걸쳐 관련 숙주 세포 내에서 안정한 단위로서 스스로 확립될 수 있다. 이는 별개의 단위로서 염색체외 존재할 수 있거나, 염색체 및/또는 염색체 DNA 내에 통합될 수 있다.

발현 벡터는 이를 포함하는 숙주 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 박테리아에서 복제할 수 있으며 포함된 핵산을 발현할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 발현은 특히 전사를 조절하는 프로모터(들) 에 의해 영향받는다. 발현은 원칙적으로 발현될 핵산의 앞에 본래 위치하는 자연적 프로모터에 의해 발생할 수 있을 뿐 아니라, 발현 벡터 상에 제공되는 숙주 세포 프로모터에 의해, 또는 또다른 유기체 또는 또다른 숙주 세포의 개질된, 또는 전체가 상이한 프로모터에 의해 발생할 수 있다. 본 경우에서, 본 발명에 따른 핵산의 발현을 위한 하나 이상의 프로모터가 이용가능해지며 이의 발현에 사용된다. 발현 벡터는 또한, 예를 들어 배양 조건에서의 변화를 통해, 또는 이를 포함하는 숙주 세포가 특정 세포 밀도에 도달하는 경우, 또는 특정 물질, 특히 유전자 발현 활성화제의 추가에 의해 조절가능할 수 있다. 이러한 물질의 한 예시는 갈락토오스 유도체 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 인데, 이는 박테리아 락토오스 오페론 (lac 오페론) 의 활성화제로서 사용된다. 발현 벡터와 반대로, 포함된 핵산은 클로닝 벡터에서 발현되지 않는다.

본 발명의 추가적인 주제는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하거나, 본 발명에 따른 프로테아제를 포함하는, 특히 숙주 세포를 둘러싼 배지 내로 프로테아제를 분비하는 비-인간 숙주 세포이다. 본 발명에 따른 핵산 및/또는 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 미생물 (이는 본 발명에 따른 숙주 세포를 나타냄) 내로 형질전환된다. 대안적으로, 개별적 성분, 즉 핵산 부분 및/또는 본 발명에 따른 핵산의 절편은 또한 이후 발생하는 숙주 세포가 본 발명에 따른 핵산 및/또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 방식으로 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 절차는 특히 숙주 세포가 본 발명에 따른 핵산 및/또는 본 발명에 따른 벡터 중 하나 이상의 구성물을 이미 포함하고, 추가의 구성물이 이후 상응하여 보충되는 경우 특히 적합하다. 세포의 형질전환 방법은 현존 업계에서 확립되어 있으며 숙련자에게 충분히 알려져 있다. 모든 세포가 원칙적으로 숙주 세포로서 적합하다 (즉 원핵 세포 또는 진핵 세포). 유전적으로 유리한 방식으로 조작될 수 있는 이들 숙주 세포 (예를 들어, 형질전환과 관련하여 핵산 또는 벡터 및 이의 안정한 확립물을 사용) 가 바람직하다 (예를 들어, 단일 세포 진균 또는 박테리아). 또한, 바람직한 숙주 세포는 미생물학적 및 생물공학적 조건에 있어서 쉽게 조작되는 것으로 주목할 만하다. 이는 예를 들어, 용이한 배양성, 높은 성장률, 발효 배지에 있어서 낮은 요구성, 및 외래 단백질에 대한 양호한 생성 및 분비율을 의미한다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 (유전자 도입적으로) 발현된 단백질을 숙주 세포를 둘러싼 배지 내로 분비한다. 프로테아제는 또한 그의 제조 후, 그를 생성하는 세포에 의해, 예를 들어 당 분자의 추가, 포르밀화, 아미노화 등에 의해 개질될 수 있다. 이러한 종류의 번역-후 개질은 프로테아제에 기능적으로 영향을 줄 수 있다.

추가로 바람직한 구현예를, 숙주 세포의 활성이 예를 들어 벡터 상에서 이용가능해지지만 또한 이들 세포에서 선험적으로 존재할 수 있는 유전적 조절 요소를 기초로 하여 조절될 수 있는 이들 숙주 세포에 의해 나타낸다. 이는 예를 들어 활성화제로서 역할하는 화학적 화합물의 제어된 추가에 의해, 배양 조건을 변화시켜, 또는 특정 세포 밀도에 도달하는 경우 발현되도록 자극될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 단백질의 경제적 생성이 가능하게 한다. 이러한 화합물의 한 예시는 전에 기재한 바와 같은 IPTG 이다.

바람직한 숙주 세포는 원핵 세포 또는 박테리아 세포이다. 박테리아는 짧은 세대기 및 배양 조건에 있어서의 적은 요구성으로 주목할 만하다. 그 결과로서, 경제적인 배양 방법 및/또는 제조 방법이 확립될 수 있다. 또한, 숙련자는 발효 기술에서의 박테리아 맥락에 있어서 풍부한 경험을 갖는다. 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아는 개별적 경우에서 실험적으로 확인되는 광범위한 각종 요인, 예컨대 영양원, 생성물 형성률, 시간 필요량 등에 대한 특이적 생성의 경우에 적합할 수 있다.

대장균 (Escherichia coli) 과 같은 그람-음성 박테리아에서, 다수의 단백질이 주변 세포질 공간, 즉 세포를 싸고 있는 2 개 멤브레인 사이의 구획 내로 분비된다. 이는 특정 적용에 유리할 수 있다. 그람-음성 박테리아는 또한 이들이 발현된 단백질을 주변 세포질 공간 내로 뿐 아니라 박테리아를 둘러싼 배지 내로 배출하도록 구성될 수 있다. 한편, 바실러스 또는 악티노마이세테스 (actinomycetes), 또는 악티노마이세탈 (actinomycetals) 의 다른 대표물과 같은 그람-양성 박테리아는 외부 멤브레인을 갖지 않아, 분비된 단백질이 배지, 대체로, 박테리아를 둘러싼 영양 배지 내로 즉시 전달되어, 배지로부터, 발현된 단백질이 정제될 수 있다. 이들은 배지로부터 직접 단리될 수 있거나, 추가로 가공될 수 있다. 또한, 그람-양성 박테리아는 기술적으로 중요한 효소에 대한 대부분의 기원 유기체와 관련되거나 동일하며, 통상 그들 스스로 비슷한 효소를 형성하여, 유사한 코돈 이용도를 가지며 그의 단백질 합성 기관이 물론 상응하게 유도된다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 배양 조건에 대한 그의 요구사항에 있어서 개질될 수 있고, 다른 또는 추가적인 선별 마커를 포함할 수 있거나, 또한 다른 또는 추가적인 단백질을 발현할 수 있다. 이는 특히, 다수의 단백질 또는 효소를 유전자 도입적으로 발현하는 숙주 세포일 수 있다.

본 발명은 원칙적으로 모든 미생물, 특히 모든 발효성 미생물, 특히 바실러스 속에 적용가능하며, 이의 결과는 본 발명에 따른 단백질이 이러한 미생물의 사용에 의해 생성될 수 있다는 것이다. 이러한 미생물은 본 발명의 목적을 위한 숙주 세포를 나타낸다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 대장균 속, 크랩시엘라 (Klebsiella) 속, 바실러스 속, 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 아르트로박터 (Arthrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 속 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 군에서 선택되는 것, 보다 바람직하게는 대장균, 크렙시엘라 플란티콜라 (Klebsiella planticola), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필루스 (Bacillus alcalophilus), 바실러스 글로비기이 (Bacillus globigii), 바실러스 집소니이, 바실러스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스 (Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스 (Arthrobacter oxidans), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코에리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 및 스트렙토마이세스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 의 군에서 선택되는 것이라는 점을 특징으로 한다.

그러나 숙주 세포는 또한, 세포 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 진핵 세포일 수 있다. 그러므로 본 발명의 추가의 주제를, 세포 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에 의해 나타낸다. 원핵 세포와 반대로, 진핵 세포는 형성되는 단백질을 번역-후 개질시킬 수 있다. 이의 예시는 진균 예컨대 악티노마이세테스 또는 효모 예컨대 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 이다. 이는, 예를 들어 단백질이, 그의 합성과 관련하여, 이러한 시스템에 의해 가능해지는 특정 개질을 겪도록 의도되는 경우 특히 유리할 수 있다. 진핵 세포 시스템이 특히 단백질 합성과 함께 실행하는 개질 중에서는, 예를 들어 멤브레인 앵커 또는 올리고당과 같은 저분자량 화합물의 결합을 들 수 있다. 이러한 종류의 올리고당 개질은, 예를 들어 발현된 단백질의 알레르기유발성을 감소시키기 위해 바람직할 수 있다. 이러한 세포에 의해 자연적으로 형성된 효소, 예를 들어 셀룰라아제 또는 리파아제로의 동시 발현이 또한 유리할 수 있다. 예를 들어, 호열성 진균 발현 시스템은 또한 온도-저항성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합할 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 통상적인 방식으로, 예를 들어 불연속 또는 연속 시스템에서 배양되고 발효된다. 불연속 시스템의 경우, 적합한 영양 배지가 숙주 세포에 접종되고, 생성물은 실험적으로 확인되는 시간 후 배지로부터 수확된다. 연속 발효는, 비교적 오랜 시간에 걸쳐, 세포가 일부 사멸하나 또한 일부 재생되는 흐름 평형의 달성으로 주목할 만하며, 형성된 단백질은 배지로부터 동시에 제거될 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하는데 사용된다. 그러므로 본 발명의 추가적인 주제는 하기를 포함하는 프로테아제 제조 방법이다:

a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고,

b) 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리함.

본 발명의 이러한 주제는 바람직하게는 발효 방법을 포함한다. 발효 방법은 현존 업계로부터 알려져 있으며 실제 산업-규모 제조 단계를 나타내며, 제조된 생성물, 예를 들어 본 발명에 따른 프로테아제의 적합한 정제 방법이 일반적으로 뒤따른다. 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하기 위한 상응하는 방법을 기초로 하는 모든 발효 방법은 본 발명의 이러한 주제의 구현예를 상응하여 나타낸다.

유입 전략에 의해 발효가 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 특히 적절하다. 이러한 맥락에 있어서, 연속 배양 동안 소비되는 배지의 구성물이 이에 공급된다. 세포 밀도 및 세포 질량 및/또는 건조 질량 및/또는 주로 관심 프로테아제의 활성에 있어서의 상당한 증가가 이로써 달성될 수 있다. 또한, 발효 공정은 원치 않는 대사 산물이 여과 제거되거나, 완충액 또는 각각 적합한 반대 이온의 추가에 의해 중화되도록 구성될 수 있다.

제조되는 프로테아제는 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 이러한 종류의 발효 방법은 숙주 세포로부터의 프로테아제의 단리 (즉, 세포 덩어리 (건조 질량) 로부터의 생성물 제조) 에 대해 바람직하나, 적합한 숙주 세포, 또는 하나 이상의 적합한 분비 마커 및/또는 메카니즘 및/또는 이동 시스템이 이용가능해져, 숙주 세포가 프로테아제를 발효 배지 내로 분비하는 것을 필요로 한다. 대안적으로는, 분비 없이, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올을 사용하는 침전, 또는 크로마토그래피적 정제에 의해 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리하는 것이 발생할 수 있다 (즉, 세포 덩어리로부터의 이의 정제).

상기 모든 사실들은 본 발명에 따른 프로테아제 제조 방법에 조합될 수 있다.

본 발명의 추가적인 주제는 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제이다. 상기 작용제는 바람직하게는 세척제 또는 세정제이다. 본 발명에 따른 프로테아제가 특히 초콜렛- 또는 코코아-함유 얼룩에 대해 유리한 세정 성능 효과를 나타내기 때문에, 상기 작용제는 특히 이러한 얼룩을 제거하는데 적합하고 유리하다.

본 발명의 이러한 주제에 포함되는 것은, 상업적 규모에서, 세척 기기에서, 또는 손 세탁 및/또는 세정에서 사용하기 위한, 모든 가능한 유형의 세척제 및/또는 세정제, 희석하지 않은 채로 사용되는 작용제 및 농축물 모두이다. 이들 중 포함되는 것은 예를 들어, 이에 대해 용어 "세척제" 가 사용되는, 텍스타일, 카펫 또는 천연 섬유용 세척제이다. 또한 이들 중 포함되는 것은 예를 들어, 이에 대해 용어 "세정제" 가 사용되는, 자동 식기세척기용 식기세척제 또는 수동 식기세척제, 또는 경질 표면 예컨대 금속, 유리, 도자기, 세라믹, 타일, 돌, 페인트칠한 표면, 플라스틱, 나무 또는 가죽용 세정제이다 (즉, 수동 및 자동 식기세척제에 추가로, 예를 들어 또한 정련제, 유리 세정제, 화장실 세정제 등). 본 발명의 맥락에 있어서의 세척제 및 세정제 중에 추가로 포함되는 것은 추가의 효과를 얻기 위해 수동 또는 자동 텍스타일 세탁의 맥락에서 실제 세척제에 제공되는 세척 보조제이다. 또한 본 발명의 맥락에 있어서 세척제 및 세정제 중에 포함되는 것은 텍스타일 전-처리제 및 후-처리제, 즉, 예를 들어 잘 없어지지 않는 얼룩을 풀어주기 위해 실제 세탁 전에 세탁 품목과 접촉시키는 작용제 뿐 아니라 실제 텍스타일 세탁 이후의 단계에서 쾌적한 느낌, 구김 없음 또는 낮은 정전하와 같은 추가의 바람직한 특성을 세척 품목에 부여하는 작용제이다. 다른 것들 중에서, 섬유 유연제는 텍스타일 후-처리제인 작용제 중에 분류된다.

특히 분말화 고체로서, 재압축된 입자 형태로, 균질한 용액 또는 현탁액으로서 존재할 수 있는 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 본 발명에 따른 프로테아제와 함께 이러한 작용제에 있어서 통상 알려져 있는 모든 성분, 작용제에 바람직하게 존재하는 하나 이상의 추가 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 작용제는 특히, 계면활성제, 빌더 (builder), 퍼옥시겐 화합물, 또는 표백 활성화제를 함유할 수 있다. 이들은 수-혼화성 유기 용매, 추가의 효소, 금속이온봉쇄제, 전해질, pH 조절제, 및/또는 추가의 보조제 예컨대 광학 증백제, 항-회색제 (anti-gray agent), 거품 조절제 뿐 아니라 염료 및 향, 뿐 아니라 이의 조합을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제와 작용제의 하나 이상의 추가 성분(들) 과의 조 합이 특히 유리한데, 이러한 작용제가 발생시키는 상승작용으로 인해 향상된 세정 성능을 나타내기 때문이다. 이러한 상승작용은 특히 본 발명에 따른 프로테아제와 계면활성제 및/또는 빌더 (세정력 빌더) 및/또는 퍼옥시겐 화합물 및/또는 표백 활성화제를 조합하여 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 작용제의 유리한 성분은 국제 특허 출원 WO 2009/121725 에서 (5 페이지에서 끝에서 두 번째 단락에서 시작하여, 두 번째 단락 후 13 페이지에서 끝남) 개시되어 있다. 이 문헌에 대해 명백히 참조가 이루어지며, 상기 문헌은 본 특허 출원에 포함된다.

본 발명에 따른 작용제는 작용제 1 g 당 유리하게는 2 ㎍ 내지 20 mg, 바람직하게는 5 ㎍ 내지 17.5 mg, 특히 바람직하게는 20 ㎍ 내지 15 mg, 매우 특히 바람직하게는 50 ㎍ 내지 10 mg 의 양으로 프로테아제를 함유한다. 또한, 작용제에 함유된 프로테아제, 및/또는 작용제의 추가 성분은, 실온에서 또는 물의 부재 하에 효소에 대해 불투과성인 물질로 감싸질 수 있는데, 상기 물질은 작용제의 이용 상태 하에 효소에 대해 투과성이 된다. 본 발명의 이러한 구현예는 따라서 프로테아제가 실온에서 또는 물의 부재 하에 프로테아제에 대해 불투과성인 물질로 감싸지는 것을 특징으로 한다. 또한, 세척제 또는 세정제 자체는 용기, 바람직하게는 공기-투과성 용기 내에 포장될 수 있는데, 상기 용기로부터 사용 직전 또는 세척 공정 동안에 방출된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 작용제는 하기를 특징으로 한다:

(a) 고체 형태, 특히 벌크 중량 300 g/ℓ 내지 1200 g/ℓ, 특히 500 g/ℓ 내지 900 g/ℓ 의 부을 수 있는 분말로서 존재함, 또는

(b) 패스티 (pasty) 또는 액체 형태로 존재함, 및/또는

(c) 1-성분 시스템으로서 존재함, 또는

(d) 다수의 성분에 분포됨.

본 발명의 이들 구현예는 본 발명에 따른 작용제의 모든 고체, 분말화, 액체, 겔화, 또는 패스티 투여 형태를 포함하는데, 이는 임의로는 또한 다중상으로 만들어질 수 있으며 압축 또는 비압축 형태로 존재할 수 있다. 상기 작용제는 특히 벌크 중량 300 g/ℓ 내지 1200 g/ℓ, 특히 500 g/ℓ 내지 900 g/ℓ, 또는 600 g/ℓ 내지 850 g/ℓ 의 부을 수 있는 분말로서 존재할 수 있다. 작용제의 고체 투여 형태 중에 추가로 포함되는 것은 압출물, 과립, 정제 또는 파우치이다. 대안적으로, 작용제는 또한 액체, 겔화 또는 패스티, 예를 들어 비수성 액체 세척제 또는 비수성 페이스트의 형태, 또는 수성 액체 세척제 또는 수화 페이스트의 형태일 수 있다. 작용제는 또한 1-성분 시스템으로서 존재할 수 있다. 이러한 작용제는 하나의 상으로 만들어진다. 대안적으로, 작용제는 또한 다중상으로 만들어질 수 있다. 이러한 종류의 작용제는 따라서 다수의 성분에 분포된다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 본 발명에 따른 프로테아제를 독점적으로 함유할 수 있다. 대안적으로, 이들은 또한 추가의 가수분해 효소 또는 기타 효소를, 작용제의 유효성에 대해 유용한 농도로 함유할 수 있다. 따라서 본 발명의 추가적인 구현예를, 하나 이상의 추가적인 효소를 포함하는 작용제로 나타낸다. 본 발명에 따른 작용제에서 촉매 활성을 나타낼 수 있는 모든 효소는 바람직하게는 추가의 효소, 특히 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 만난아제, 탄나아제, 자일라나아제, 잔타나아제, 자일로글루카나아제, β-글루코시다아제, 펙티나아제, 카라기나아제, 퍼히드롤라아제, 옥시다아제, 산화환원효소, 또는 리파아제 뿐 아니라 이의 혼합물로서 이용가능하다. 추가의 효소는 각각의 경우 활성 단백질을 기준으로 1 x 10^-8 내지 5 중량% 의 양으로 유리하게 작용제 내에 함유된다. 점점 더 바람직하게는, 각 추가의 효소는 활성 단백질을 기준으로 1 x 10^-7 내지 3 중량%, 0.00001 내지 1 중량%, 0.00005 내지 0.5 중량%, 0.0001 내지 0.1 중량%, 특히 바람직하게는 0.0001 내지 0.05 중량% 의 양으로 본 발명에 따른 작용제 내에 함유된다. 특히 바람직하게는, 상기 효소는 특정 얼룩 또는 반점에 관해 상승작용적 세정 성능 효과를 나타내는데, 즉 작용제 조성물 내에 함유된 효소가 그의 세정 성능에 있어서 상호간에 서로 보조한다. 매우 특히 바람직하게는, 이러한 종류의 상승작용은 본 발명에 따라 함유된 프로테아제와 본 발명에 따른 작용제의 추가 효소 사이에, 그 중에서도 특히 상술한 프로테아제와 아밀라아제 및/또는 리파아제 및/또는 만난아제 및/또는 셀룰라아제 및/또는 펙티나아제 사이에 존재한다. 상승작용적 효과는 상이한 효소 사이에서 뿐 아니라 하나 이상의 효소와 본 발명에 따른 작용제의 추가 성분 사이에서 발생할 수 있다.

본 발명의 추가적인 주제는, 하나 이상의 방법 단계에서 본 발명에 따른 작용제가 이용되는 것을 특징으로 하거나; 하나 이상의 방법 단계에서 본 발명에 따른 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제가 촉매적으로 활성인 것을 특징으로 하는, 특히 프로테아제가 이용 당 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g 의 양으로 사용되는 방식으로의 텍스타일 또는 경질 표면 세정 방법이다.

이 중에 포함되는 것은 수동 및 자동 방법 모두이며, 자동 방법이 바람직하다. 텍스타일 세정 방법은 일반적으로, 다수의 방법 단계에서 세정 활성을 갖는 다양한 물질이 세정할 물질에 적용되고 접촉 시간 후에 세척되거나, 세정할 물질이 세척제 또는 용액 및/또는 상기 작용제의 희석물로 또다른 방식으로 처리되는 사실로 주목할 만하다. 텍스타일 외의 다른 모든 물질, 특히 경질 표면을 세정하는 방법에 동일한 것이 상응하여 적용된다. 방법 단계 중 하나 이상에서, 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 이용에 의해, 모든 가능한 세척 또는 세정 방법이 보충될 수 있으며, 이후 본 발명의 구현예를 나타낸다. 본 발명에 따른 프로테아제 및/또는 이를 함유하는 작용제에 대해 기재되는 모든 사실, 주제 및 구현예는 또한 본 발명의 이러한 주제에 적용가능하다. 그러므로, 이때에, 상기 개시에 대해 상응하는 시점에서 참조가 명백히 이루어지며, 상기 개시가 또한 본 발명에 따른 본 방법에 대해 유효하다는 것이 설명된다.

본 발명에 따른 프로테아제가 가수분해 활성을 이미 자연적으로 가지며 달리 세정력을 갖지 않는 배지, 예를 들어 순수 완충액에서도 이를 나타내기 때문에, 이러한 방법의 개별적 및/또는 유일 단계는 이러한 프로테아제를, 세정 활성을 갖는 단독 성분으로서 필요한 경우 바람직하게는 완충 용액 또는 물에서 얼룩과 접촉시키는 것으로 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 이러한 주제의 추가적인 구현예를 나타낸다.

본 발명의 이러한 주제의 대안적 구현예를 또한, 본 발명에 따른 프로테아제가 하나 이상의 방법 단계에서 활성이 되는, 텍스타일 원료 물질을 처리하거나 텍스타일 관리를 위한 방법에 의해 나타낸다. 이들 중 바람직한 것은 텍스타일 원료 물질, 섬유, 또는 천연 성분을 갖는 텍스타일에 대한 방법, 매우 특히 양모 또는 실크를 갖는 것들에 대한 방법이다.

본 발명의 추가적인 주제는, 텍스타일 또는 경질 표면의 세정을 위한 본 발명에 따른 작용제의 용도, 또는 본 발명에 따른 프로테아제의, 또는 본 발명에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제의, 특히 프로테아제가 이용 당 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g 의 양으로 사용되는 방식으로의 텍스타일 또는 경질 표면 세정을 위한 용도이다.

본 발명에 따른 프로테아제 및/또는 이를 함유하는 작용제에 대해 기재되는 모든 사실, 주제 및 구현예는 또한 본 발명의 이러한 주제에 적용가능하다. 그러므로, 이때에, 상기 개시에 대해 상응하는 시점에서 참조가 명백히 이루어지며, 상기 개시가 또한 본 발명에 따른 본 방법에 대해 유효하다는 것이 설명된다.

실시예

모든 분자 생물학적 작업 단계는 예를 들어 [the manual of Fritsch, Sambrook, and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989] 또는 비슷한 관련 작업물에서 나타낸 것들과 같은 표준 방법을 따른다. 각각의 제조사 지시사항에 따라 효소 및 키트를 사용하였다.

실시예 1

SEQ ID NO. 1 에 따른 아미노산 서열을 나타낸 프로테아제에서 기인하여, 본 발명에 따른 프로테아제 변이체를, SeSaM 방법 (Wong, T.S. et al. (2004): Sequence saturation mutagenesis (SeSaM): a novel method for directed evolution. Nucleic Acids Res. 32, 26 ff.) 으로, 프로테아제를 코딩하는 핵산에서의 위치-지정 돌연변이유발에 의해 제조하였다. 여기서, 아미노산 위치 21 에 대한 코돈을 ATA 에서 GTA 로 개질하여, 아미노산 서열을 기준으로, 이소류신 (I) 에서 발린 (V) 으로의 교환을 발생시켰다. 바실러스 서브틸리스 DB 104 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., Vol. 160 (1), pp. 442-444) 를 상응하는 발현 벡터로 형질전환한 후 프로테아제 변이체를 발현하는 형질전환체를 배양하여, 프로테아제 변이체를 당업계에서 통상적인 방법으로 발현시켰다.

실시예 2: 시판되는 분말화 세척제에서 사용되는 경우 세정 성능의 확인

표준화된 오염 텍스타일을 이 실시예에 대해 사용하였다. 하기의 얼룩 및 텍스타일을 사용하였다:

A: 면직물 상의 풀: Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialen AG, St. Gallen, Switzerland 에서 입수가능한 제품 번호 164,

B: 면직물 상의 전란/안료 (전란/카본 블랙): wfk Testgewebe GmbH [Test fabrics], Brueggen-Bracht, Germany 에서 입수가능한 제품 번호 10N,

C: 면직물 상의 초콜렛 우유/카본 블랙: CFT (Center For Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-03,

D: 면직물 상의 코코아: Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialen AG, St. Gallen, Switzerland 에서 입수가능한 제품 번호 112,

E: 면직물 상의 혈액-우유/잉크: CFT (Center For Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Netherlands 에서 입수가능한 제품 번호 C-05.

이러한 시험 물질을 사용하여, 다양한 세척제 제형을 그의 세정 성능에 있어서 조사하였다. 이를 위해, 배치를 60 분 동안 40℃ 의 온도에서 세척하였다. 투여비는 세척조 1 ℓ 당 5.9 g 의 세척제였다. 독일 경도 16 도의 경도를 갖는 수돗물로 세척을 수행하였다.

하기 조성의 기준 세척제 제형을 대조군 세척제로서 사용하였다 (모든 표시는 중량% 임): 10% 선형 알킬벤젠술포네이트 (나트륨 염), 1.5% C12 내지 C18 지방 알코올 술페이트 (나트륨 염), 2.0% C12 내지 C18 지방 알코올 (7 EO 를 가짐), 20% 탄산나트륨, 6.5% 탄산수소나트륨, 4.0% 비정질 나트륨 디실리케이트, 17% 나트륨 카르보네이트 퍼옥소히드레이트, 4.0% TAED, 3.0% 폴리아크릴레이트, 1.0% 카르복시메틸 셀룰로오스, 1.0% 포스포네이트, 25% 황산나트륨, 나머지: 거품 저해제, 광학 증백제, 향. 다양한 일련의 실험에 대해서, 동일-활성 기준으로 (5 PU/㎖ 최종 농도), 하기의 프로테아제를 기준 세척제 제형에 추가하였다: SEQ ID NO. 1 에 따른 아미노산 서열 I21V 를 갖는 본 발명에 따른 프로테아제 변이체 (따라서 SEQ ID NO. 2 에 상응, 이하 배치 1 로 지칭함), 및 아미노산 치환 I21V 를 나타내지 않는 SEQ ID NO. 1 에 따른 상응하는 대조군 프로테아제 (배치 2).

세척 후, 세척된 텍스타일의 백색도를 측정하였다. Minolta CM508d 광도계 (D65 조명, 10°) 에서 측정을 실행하였다. 상기 유닛은 유닛과 함께 제공된 백색 표준을 사용하여 사전에 교정하였다. 수득한 결과는, 프로테아제 함유 세척제를 사용하는 세척 공정과, 동시 수행한 프로테아제를 갖지 않는 세척제를 사용하는 대조군 세척 공정 사이의 반사율 값에서의 차이이다. "STDEV" 는 동시에 실행한 실험 배치에 대한 표준 편차를 나타낸다. 결과를 하기 표 1 에 요약하고, 사용하는 작용제의 세정 성능에 대한 특정 함유 효소에 의해 이루어진 기여에 관해 즉각적으로 결론내렸다.

40℃ 에서 분말화 세척제를 사용한 세척 결과
얼룩	배치 1	STDEV	배치 2	STDEV
A	4.8	0.7	3.0	0.2
B	7.4	0.7	6.9	0.4
C	11.1	0.9	8.6	0.6
D	5.6	0.2	2.0	0.5
E	13.3	1.6	11.4	0.6

본 발명에 따른 프로테아제가 대조군에 비해 더 양호한 세정 성능을 나타낸다는 것이 명백하다. 또한, 본 발명에 따른 프로테아제는 특히 초콜렛- 또는 코코아-함유 얼룩에 대해 매우 양호한 세정 성능 효과를 나타낸다.

[도면의 간단한 설명]

도 1: 표준 매개변수 하에, Vector NTI

Suite 10.3 프로그램 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) 을 사용하여 제조된, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 3 에 따른 서열의 서열 비교 (정렬).

독일 미생물 및 세포배양 콜렉션 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH]

DSM14391

20010301

<110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Leistungsverbesserte Proteasevariante <130> PT018262 (H 08847 PCT) <150> DE 102010002762 <151> 2010-03-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Gln Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Val 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Ile Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Ile Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ala Gln His Ser Asp Leu Thr Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Ser Thr Thr Ala Asp Leu Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Ala Thr Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala 115 120 125 Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Thr Gly Ser Ile Gly 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Arg Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Ser Tyr 195 200 205 Ala Ser Met Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Asn Ala Thr Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Ser Ser Gln 245 250 255 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Asp Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Gln Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro Thr Val 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Val Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Ile Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ala Gln His Ser Asp Leu Thr Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Ser Thr Thr Ala Asp Leu Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Ile 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Ala Thr Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Asp Ala 115 120 125 Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Thr Gly Ser Ile Gly 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Arg Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Ser Tyr 195 200 205 Ala Ser Met Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Asn Ala Thr Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Ser Ser Gln 245 250 255 Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Asp Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 3 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus lentus <400> 3 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 4 <211> 810 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 4 caacaaaccg ttccatgggg tattacacgt gtacaagctc ccactgtgca taatcgtgga 60 gtaacaggat ctggagttaa agtcgctata cttgatacag gtatagctca gcatagtgat 120 ttaaccattc gtgggggagc aagctttgta ccaggagagt caacaacggc tgatctaaat 180 ggtcatggta ctcacgttgc tggaacagtg gccgctctta ataattcaat tggtgtgatc 240 ggtgtggcac caagtgctga cctatacgct gtaaaggtat taggagcaaa tggtagagga 300 agcgtgagtg ggattgctca aggtctagag tgggctgcaa cgaataacat gcatattgca 360 aacatgagtc tcggtagtga tgcacctagc actacattag agcgtgcagt taactatgcg 420 acaagccgtg gagttctcgt cattgcggct actggtaaca atggtactgg ttccattggc 480 tacccagctc gttatgcaaa cgcaatggct gtaggagcga ctgaccaaaa caacagacgt 540 gcgagctttt ctcaatatgg cacaggaatt gatattgttg cacctggtgt tggaattcaa 600 agcacatacc taaataatag ctatgctagt atgcctggaa catcaatggc tacacctcat 660 gttgctggag tagctgcgct tgttaaacaa aaaaatccat cttggaatgc gactcaaatt 720 cgtaatcatt tgaaaaatac tgcgacgaat ctaggaaact catctcaatt tggtagtgga 780 ctagttaatg cagatgcagc aacgcgctaa 810

Claims

그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 프로테아제.
단일 또는 다수의 보존적 아미노산 치환에 의해 초기 분자로서 제 1 항에 따른 프로테아제로부터 수득가능한 프로테아제로서, SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 프로테아제,
및/또는
절편화에 의해, 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 초기 분자로서 제 1 항에 따른 프로테아제로부터 수득가능하며, 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266 또는 267 의 연속적으로 연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 초기 분자에 매치되는 아미노산 서열을 포함하고, 초기 분자에 포함되는 아미노산 치환 I12V 가 여전히 존재하는 프로테아제,
및/또는
SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) 로부터 프로테아제의 위치 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 및 268 과 정렬에 있어서 연관되는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 초기 분자로서 제 1 항에 따른 프로테아제로부터 수득가능하여, SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 프로테아제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 프로테아제.
그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 초기 프로테아제에 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서의 아미노산 치환 I21V 를 도입하는 것을 포함하는, 프로테아제 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 하기 방법 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법:
(a) 단일 또는 다수의 보존적 아미노산 치환을 도입하여, 프로테아제가 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 단계;
(b) 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266 또는 267 의 연속적으로 연결된 아미노산의 길이에 걸쳐 초기 분자에 매치되는 아미노산 서열을 포함하는 방식으로, 절편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 개질하여, 초기 분자에 포함되는 아미노산 치환 I12V 가 여전히 존재하는 단계;
(c) SEQ ID NO. 3 에 따른 바실러스 렌투스로부터 프로테아제의 위치 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 및 268 과 정렬에 있어서 연관되는 하나 이상의 위치에 단일 또는 다수의 아미노산 치환을 도입하여, 프로테아제가 SEQ ID NO. 1 에 따른 카운트에 있어서 아미노산 치환 I21V 를 나타내는 단계.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 프로테아제가 그의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO. 1 에서 나타낸 아미노산 서열에 대해 70% 이상 동일한 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 코딩하는 핵산 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제를 코딩하는 핵산.
제 7 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
제 7 항에 따른 핵산 또는 제 8 항에 따른 벡터를 포함하거나, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 포함하거나, 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제를 포함하는, 특히 숙주 세포를 둘러싼 배지에 프로테아제를 분비하는, 비-인간 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 세포 핵을 갖거나, 바람직하게는 대장균 (Escherichia) 속, 크랩시엘라 (Klebsiella) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 아르트로박터 (Arthrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 속 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 군에서 선택되는 박테리아, 보다 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli), 크렙시엘라 플란티콜라 (Klebsiella planticola), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필루스 (Bacillus alcalophilus), 바실러스 글로비기이 (Bacillus globigii), 바실러스 집소니이 (Bacillus gibsonii), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스 (Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스 (Arthrobacter oxidans), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코에리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 및 스트렙토마이세스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 의 군에서 선택되는 박테리아인 숙주 세포.
하기를 포함하는, 프로테아제 제조 방법:
a) 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 숙주 세포를 배양하고,
b) 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리함.
작용제 1 g 당 특히 2 ㎍ 내지 20 mg, 바람직하게는 5 ㎍ 내지 17.5 mg, 특히 바람직하게는 20 ㎍ 내지 15 mg, 매우 특히 바람직하게는 50 ㎍ 내지 10 mg 의 양으로, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 프로테아제 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제를 함유하고/하거나, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 프로테아제 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제를 함유하며 작용제 중의 프로테아제가 실온에서 또는 물의 부재 하에 프로테아제에 대해 불투과성인 물질로 감싸지는, 작용제, 특히 세척제 또는 세정제.
제 12 항에 있어서,
(a) 고체 형태, 특히 벌크 중량 300 g/ℓ 내지 1200 g/ℓ, 특히 500 g/ℓ 내지 900 g/ℓ 의 부을 수 있는 분말로서 존재하거나,
(b) 패스티 (pasty) 또는 액체 형태로 존재하고/하거나,
(c) 1-성분 시스템으로서 존재하거나,
(d) 다수의 성분에 분포되는 작용제.
하나 이상의 방법 단계에서 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 작용제를 이용하거나; 하나 이상의 방법 단계에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제가 촉매적으로 활성인, 특히 프로테아제가 이용 당 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g 의 양으로 사용되는 방식으로의 텍스타일 또는 경질 표면 세정 방법.
텍스타일 또는 경질 표면의 세정을 위한 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 작용제의 용도, 또는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제의, 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 수득한 프로테아제의, 특히 프로테아제가 이용 당 40 ㎍ 내지 4 g, 바람직하게는 50 ㎍ 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 g, 매우 특히 바람직하게는 200 ㎍ 내지 1 g 의 양으로 사용되는 방식으로의 텍스타일 또는 경질 표면 세정을 위한 용도.